JP2022537154A - 細胞治療のための環状ｒｎａ - Google Patents

細胞治療のための環状ｒｎａ Download PDF

Info

Publication number
JP2022537154A
JP2022537154A JP2021573738A JP2021573738A JP2022537154A JP 2022537154 A JP2022537154 A JP 2022537154A JP 2021573738 A JP2021573738 A JP 2021573738A JP 2021573738 A JP2021573738 A JP 2021573738A JP 2022537154 A JP2022537154 A JP 2022537154A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
protein
isolated
polyribonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021573738A
Other languages
English (en)
Inventor
ブール，アレクサンドラ・ソフィー デ
ウェインステイン，エリカ・ガブリエル
プルギス，ニコラス・マッカートニー
シフエンテス－ロハス，キャサリン
スチュアート，モラグ・ヘレン
カーベジアン，アバク
Original Assignee
フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー filed Critical フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー
Publication of JP2022537154A publication Critical patent/JP2022537154A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Abstract

本発明は、概して、環状ポリリボヌクレオチドの医薬組成物及び調製並びに細胞治療におけるその使用に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８６１，８０５号明細書及び２０２０年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／９６７，５３７号明細書に対する優先権及びそれらからの利益を主張するものであり、これらの各々の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
特定の環状ポリリボヌクレオチドは、健常人の組織及び細胞を含むヒト組織及び細胞中に遍在的に存在する。
本開示は、概して、哺乳動物、例えばヒトにおける細胞治療のための、単離された細胞及び細胞調製物を含む組成物並びにこうした細胞及び細胞調製物を使用する方法に関する。この組成物及び方法は、環状ポリリボヌクレオチドであって、（ａ）少なくとも１つの結合部位を含むか、（ｂ）タンパク質をコードするか、又は（ａ）と（ｂ）との両方である環状ポリリボヌクレオチドを含む単離された細胞（例えば、外因性の合成の環状ＲＮＡを含む単離された哺乳動物細胞）を含み且つ使用する。これらの細胞（例えば、単離された哺乳動物細胞）は、特に、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞など）、マクロファージ、樹状細胞、赤血球、網状赤血球、骨髄系前駆細胞及び巨核球から選択することができる。タンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質であり得る。細胞治療の方法は、それを必要とする対象（例えばヒト）に、単離された細胞又は調製物を投与することを含むことができる。
一態様において、本発明は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド、コードされるタンパク質又はそれらの組み合わせとを含む医薬組成物を特徴とする。この態様の一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）分泌タンパク質若しくは細胞内タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせである。この態様の別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）膜タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであり、ここで、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体融合タンパク質ではない。この態様の別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位を含み、且つタンパク質をコードし、ここで、タンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質である。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド、コードされるタンパク質又はそれらの組み合わせを含む、単離された細胞又はこうした細胞の調製物を特徴とし、ここで、単離された細胞は、対象に投与される。この態様の一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）分泌タンパク質若しくは細胞内タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせである。この態様の別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）膜タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであり、ここで、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体融合タンパク質ではない。この態様の別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位を含み、且つタンパク質をコードし、ここで、タンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡテール、複製要素又はその両方を欠いている。
いくつかの実施形態において、細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、細胞増殖、細胞分化及び／又は細胞の標的への局在化を促進する。いくつかの実施形態において、細胞内タンパク質、膜タンパク質及び／又は分泌タンパク質は、結合活性又は転写調節活性を有する。
いくつかの実施形態において、タンパク質は、膜タンパク質であり、及び細胞は、非免疫細胞である。
いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、膜貫通タンパク質又は細胞外基質タンパク質である。いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、少なくとも１つの治療特性を細胞に与える。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、核酸局在化を細胞又は単離された細胞に与える。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、細胞又は単離された細胞において核酸活性を与える。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、アプタマーである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、タンパク質結合部位、ＤＮＡ結合部位又はＲＮＡ結合部位である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、細胞の表面上の細胞受容体に結合する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位が細胞の表面上の細胞受容体に結合した後、細胞に内部移行される。
いくつかの実施形態において、細胞は、真核細胞、動物細胞、哺乳動物細胞又はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、末梢血単核球、末梢血リンパ球又はリンパ球である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、γδＴ細胞、αβＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞）、Ｂ細胞又はナチュラルキラー細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、複製能力がない。
本明細書に記載されるいずれかの態様のいくつかの実施形態において、医薬組成物は、複数の細胞又は細胞の調製物を含み、ここで、調製物又は複数は、少なくとも１０５細胞、例えば少なくとも１０６、若しくは少なくとも１０７、若しくは少なくとも１０８、若しくは少なくとも１０９、若しくは少なくとも１０１０、若しくは少なくとも１０１１細胞、例えば５×１０５細胞～１×１０７細胞を含むか又はそれである。いくつかの実施形態において、複数は、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、標的対象のための単位用量である複数の細胞又は細胞の調製物を含む。例えば、医薬組成物は、１０５～１０９細胞／ｋｇ（標的対象）、例えば１０６～１０８細胞／ｋｇ（標的対象）を含む。例えば、５０ｋｇの体重の標的対象のための単位用量は、５×１０７～２．５×１０１０細胞、例えば５×１０７～２．５×１０９細胞、例えば５×１０８～５×１０９細胞を含む医薬組成物であり得る。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、対象への投与のためのものである。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト又は非ヒト動物である。ヒトは、若年者、若年成人（１８～２５歳）、成人又は新生児であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、疾患又は障害を有する。いくつかの実施形態において、対象は、過剰増殖性疾患又は癌を有する。いくつかの実施形態において、細胞又は単離された細胞は、治療される対象と同種である。いくつかの実施形態において、細胞又は単離された細胞は、治療される対象にとって自己由来である。
いくつかの実施形態において、単離された細胞は、薬学的に許容される賦形剤（例えば、希釈剤）と共に製剤化される。
第３の態様において、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードし、且つ少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含む医薬組成物を提供する。
第４の態様において、本発明は、キメラ抗原受容体をコードし、且つ少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む単離された細胞であって、投与（例えば、対象への静脈内投与）のためのものである、単離された細胞を提供する。
第５の態様において、本発明は、（ａ）環状ポリリボヌクレオチドであって、ｉ）抗原に結合する抗原結合タンパク質をコードする少なくとも１つの標的結合配列、又はｉｉ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードし、且つ任意選択的に少なくとも１つの結合部位を含む配列を含む環状ポリリボヌクレオチドと；（ｂ）タンパク質であって、そのタンパク質の発現は、抗原結合タンパク質への抗原の結合時に活性化される、タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列とを含む細胞を提供する。
第６の態様において、本発明は、抗原に対する親和性を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする環状ポリリボヌクレオチドと、二重特異性抗体をコードする環状ポリリボヌクレオチドとを含む細胞であって、細胞の表面上にＴＣＲ及び二重特異性抗体を発現する細胞を提供する。
本明細書に記載されるいずれかの態様のいくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、膜貫通ドメインに連結され、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインに連結されて、キメラ抗原受容体を生成する。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、寛容原若しくは病原抗原に結合するか、又は抗原は、腫瘍抗原若しくは病原抗原である。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体又はその抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ）である。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、第１のエピトープと結合する第１の免疫グロブリン可変ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の免疫グロブリン可変ドメインとを有する。いくつかの実施形態において、第１のエピトープと第２のエピトープとは、同じである。いくつかの実施形態において、第１のエピトープと第２のエピトープとは、異なる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結させる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジタンパク質（例えば、免疫グロブリンヒンジ）、ポリペプチドリンカー（例えば、ＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、ＣＤ８ａヒンジ又はスペーサーである
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２又はそれらの任意の組み合わせの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
いくつかの実施形態において、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子又は活性化ＮＫ細胞受容体タンパク質の少なくとも１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＲＡＮＫＬ、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ１６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、Ｂ７－Ｈ３又はＣＤ８３に結合するリガンドの少なくとも１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡテール、複製要素又はそれらの組み合わせを欠いている。
いくつかの実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞（例えば、αβＴ細胞若しくはγδＴ細胞）又はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、同種の細胞又は自己由来の細胞である。いくつかの実施形態において、抗原は、腫瘍又は癌から発現される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）又は共刺激リガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ若しくは４－１ＢＢＬ）である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、分泌タンパク質である。
第７の態様において、本発明は、１×１０５～９×１０１１細胞、例えば１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞の調製物であって、対象への非経口送達のために構成され、本明細書に記載される複数（例えば、調製物中の細胞の少なくとも１％）の細胞又は単離された細胞を含む調製物を提供する。例えば、調製物中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。この態様のいくつかの実施形態において、調製物は、本明細書に記載される単位用量形態である。この態様のいくつかの実施形態において、送達は、注射又は注入（例えば、ＩＶ注射又は注入）である。
第８の態様において、本発明は、懸濁液中の複数の細胞（例えば、調製物中の少なくとも１％の細胞）が、本明細書に記載されるいずれかの細胞又は単離された細胞である、単離された細胞の懸濁液を含む点滴静注バッグ又は他の注入製品を提供する。いくつかの実施形態において、懸濁液は、１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含み、ＩＶバッグは、対象への非経口送達のために構成される。いくつかの実施形態において、懸濁液中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。この態様のいくつかの実施形態において、ＩＶバッグは、本明細書に記載される単位用量の細胞を含む。
第９の態様において、本発明は、複数の細胞、例えば１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含む医療機器であって、対象への植込みのために構成され、医療機器中の少なくとも４０％の細胞は、本明細書に記載される細胞又は単離された細胞である、医療機器を提供する。例えば、医療機器中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。
第１０の態様において、本発明は、複数の細胞を含む生体適合性マトリックスであって、対象への植込みのために構成される生体適合性マトリックスを提供する。生体適合性マトリックスは、１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含むことができ、ここで、生体適合性マトリックス中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。例えば、生体適合性マトリックスは、Ａｆｉｂｒｏｍｅｒ（商標）マトリックスである。例えば、生体適合性マトリックスは、参照により本明細書に援用されるＢｏｓｅ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ．２０２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０２０－０５３８－５に記載されているものであり得る。
第１１の態様において、本発明は、複数の細胞、例えば１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含むバイオリアクターであって、バイオリアクター中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である、バイオリアクターを提供する。この態様のいくつかの実施形態において、バイオリアクターは、二次元細胞培養を含む。この態様のいくつかの実施形態において、バイオリアクターは、三次元細胞培養を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医療機器又は生体適合性マトリックスは、対象に植込まれた場合に複数の細胞を生成及び放出するように構成されている。
上の態様のいくつかの実施形態において、対象は、ヒト又は非ヒト動物である。
いくつかの実施形態において、複数の細胞は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に製剤化される。
第１２の態様において、本発明は、細胞又は複数の細胞を生成する方法であって、単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供することと、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの調製物を提供することと、この環状ポリリボヌクレオチドを、単離された細胞又は複数の単離された細胞に接触させることであって、単離された細胞又は複数の単離された細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを発現することが可能である、接触させることとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞に接触される環状ポリリボヌクレオチドの調製物は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ又は２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態において、細胞に接触される環状ポリリボヌクレオチドの調製物は、医薬中の総リボヌクレオチド分子に対して少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子を含む。実施形態において、調製物中の総リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ）は、環状ポリリボヌクレオチド分子である。この態様のいくつかの実施形態において、接触後の単離された細胞又は複数の単離された細胞の生存率は、正規化された接触されていない単離された細胞又は複数の正規化された接触されていない単離された細胞と比較して少なくとも４０％である。この態様のいくつかの実施形態において、この方法は、接触後の細胞又は複数の細胞を対象に投与することをさらに含む。
第１３の態様において、本発明は、対象への投与のための細胞を生成する方法であって、ａ）単離された細胞を提供することと、ｂ）単離された細胞を、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドに接触させることとを含み、それにより対象への投与のための細胞を生成する方法を提供する。この態様の一実施形態において、細胞中の環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与前に分解される。
第１４の態様において、本発明は、本明細書に記載される医薬組成物、細胞、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器中の複数の細胞、生体適合性マトリックス中の複数の細胞又はバイオリアクターからの複数の細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、細胞治療の方法を提供する。いくつかの実施形態において、投与される医薬組成物、複数の細胞、細胞調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器中の複数の細胞又は生体適合性マトリックス中の複数の細胞は、対象のための単位用量を含み、例えば１０５～１０９細胞／ｋｇ（対象）、例えば１０６～１０８細胞／ｋｇ（対象）を含む。例えば、５０ｋｇの体重の標的対象のための単位用量は、５×１０７～２．５×１０１０細胞、例えば５×１０７～２．５×１０９細胞、例えば５×１０８～５×１０９細胞を含む医薬組成物であり得る。
この態様のいくつかの実施形態において、医薬組成物、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ、医療機器又は生体適合性マトリックスは、例えば、１×１０５～９×１０１１細胞、例えば１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞の用量を含み、ここで、少なくとも１％の細胞は、本明細書に記載される細胞又は単離された細胞である。例えば、複数のもの、細胞調製物、点滴静注バッグ、医療機器又は生体適合性マトリックス中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。この態様のいくつかの実施形態において、この方法は、１×１０５～９×１０１１細胞、例えば１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量の医薬組成物、複数の細胞又は調製物を投与することを含む。この態様のいくつかの実施形態において、この方法は、複数の投与又は用量で医薬組成物、複数の細胞又は調製物を投与することを含む。この態様のいくつかの実施形態において、複数のもの、例えば２つの後続の用量は、少なくとも約１週、２週、２８日、３５日、４２日又は６０日以上の間隔を空けて投与される。
別の態様において、本発明は、単離された細胞又は複数の単離された細胞の核酸を編集する方法であって、ａ）単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供すること；ｂ）単離された細胞又は複数の単離された細胞を、ヌクレアーゼをコードし、且つ／又はガイド核酸を含む環状ポリリボヌクレオチドに接触させることを含み、それにより対象への投与のための編集細胞又は複数の編集細胞を生成する方法を提供する。この態様のいくつかの実施形態において、この方法は、編集細胞又は複数の編集細胞を、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することをさらに含む。この態様のいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ又はＣａｓタンパク質である。この態様のいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１４タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの結合部位を含むか、タンパク質をコードするか、又はそれらの組み合わせである環状ポリリボヌクレオチドを含む、細胞治療に使用するための単離された細胞を提供する。この態様の一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）分泌タンパク質若しくは細胞内タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせである。この態様の一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）膜タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであり、ここで、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体融合タンパク質ではない。この態様の一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位を含み、且つタンパク質をコードし、ここで、タンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質である。
本発明は、非経口投与に適した賦形剤と共に製剤化される、１×１０６～１×１０１１ヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）、例えば１×１０７～５×１０１０ヒト細胞、例えば１×１０８～１×１０９ヒト細胞の調製物であって、調製物の細胞の少なくとも５０％（例えば、５０％～７０％）は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する外因性の環状ＲＮＡを含み、且つヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器中にある調製物を提供する。本発明は、癌、例えば白血病又はリンパ腫（例えば、急性リンパ芽球性白血病又は再発又は難治性のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）と診断されたヒト対象を治療する方法であって、非経口投与に適した賦形剤と共に製剤化される自己由来Ｔ細胞の調製物であって、調製物の細胞の少なくとも５０％（例えば、５０％～７０％）は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する外因性の環状ＲＮＡを含み、調製物は、ヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器を介して１×１０５～１×１０９細胞／ｋｇ（対象）の用量で投与される、調製物を対象に投与することを含む方法も提供する。
本発明は、非経口投与に適した賦形剤と共に製剤化される、１×１０６～１×１０１１ヒト細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞又はＨＳＣ、例えばＮＫ細胞）、例えば１×１０７～５×１０１０ヒト細胞、例えば１×１０８～１×１０９ヒト細胞の調製物であって、調製物の細胞の少なくとも５０％（例えば、５０％～７０％）は、サラセミア若しくは鎌状赤血球症の治療のためのヘモグロビンサブユニットベータ（ベータグロビン若しくはヘモグロビンベータ鎖若しくはＨＢＢ）を発現するか、又は大脳型副腎白質ジストロフィーの治療のためのＡＢＣトランスポーターを発現する外因性の環状ＲＮＡを含み、且つ調製物はヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器中にあり、且つ調製物は、ヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器を介して１×１０５～１×１０９細胞／ｋｇ（対象）の用量で投与される、調製物も提供する。
本発明は、非経口投与に適した賦形剤と共に製剤化される、１×１０６～１×１０１１ヒト細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞又はＨＳＣ、例えばＮＫ細胞）、例えば１×１０７～５×１０１０ヒト細胞、例えば１×１０８～１×１０９ヒト細胞の調製物であって、調製物の細胞の少なくとも５０％（例えば、５０％～７０％）は、（ａ）サラセミア若しくは鎌状赤血球症の治療のためのヘモグロビンサブユニットベータ（ベータグロビン若しくはヘモグロビンベータ鎖若しくはＨＢＢ）、又は（ｂ）大脳型副腎白質ジストロフィーの治療のためのＡＢＣトランスポーター、又は（ｃ）ＡＤＡ－ＳＣＩＤの治療のためのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、又は（ｄ）ウィスコット・アルドリッチの治療のためのＷＡＳタンパク質、又は（ｅ）Ｘ連鎖慢性肉芽腫症の治療のためのＣＹＢＢタンパク質、又は（ｆ）異染性白質ジストロフィーの治療のためのＡＲＳＡ、又は（ｇ）ＭＰＳ－Ｉの治療のためのα－Ｌ－イズロニダーゼ、又は（ｈ）ＭＰＳ－ＩＩＩＡの治療のためのＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、又は（ｉ）ＭＰＳ－ＩＩＩＢの治療のためのＮ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼを発現する外因性の環状ＲＮＡを含み、且つ調製物は、ヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器中にあり、且つ調製物は、ヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器を介して１×１０５～１×１０９細胞／ｋｇ（対象）の用量で投与される、調製物も提供する。いくつかの実施形態において、投与は、例えば、１００万～５００万細胞のＩＶ投与、例えば単回ＩＶ投与である。
定義
本発明は、特定の実施形態に関して及び特定の図を参照して説明されるが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。これ以降に記載される用語は、一般に、特に示されない限り、それらの一般的な意味で理解されるべきである。
本明細書において使用される際、「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）」又は「環状ポリリボヌクレオチド」又は「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ）」という用語は、同義的に使用され、遊離末端を有さない（すなわち遊離３’及び／又は５’末端がない）構造を有するポリリボヌクレオチド分子、例えば共有結合又は非共有結合を介して環状又はエンドレス構造を形成するポリリボヌクレオチド分子を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「アプタマー配列」は、標的分子に特異的に結合する、非天然起源の又は合成のオリゴヌクレオチドである。典型的には、アプタマーは、２０～５００ヌクレオチドである。典型的には、アプタマーは、配列相同性ではなく二次構造を通してその標的に結合する。
本明細書で使用する場合、用語「治療特性」は、環状ＲＮＡなどの治療用分子の細胞への送達又は細胞上の治療用分子の効果を促進することを含めて、状態又は疾患の経過に有益な影響を与えるあらゆる特性である。
本明細書で使用する場合、「単離された細胞」は、対象の組織又は体液から得られる及び分離される細胞を意味する。単離された細胞は、対象の組織又は体液から得られた及び分離された細胞であるか、又は対象の組織又は体液から得られた及び分離された細胞の子孫細胞である。例えば、単離された細胞は、インビトロ若しくはエクスビボ培養に置かれている対象由来の初代細胞、こうした細胞の子孫又は細胞株由来の細胞であり得る。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、対象自身の細胞から得られる（自家移植のために）か、又は治療される対象以外の対象から得られる（同種移植のために）。
本明細書において使用される際、「エンクリプトゲン」という用語は、免疫細胞による検出を低下させ、避け、且つ／若しくは回避し、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答の誘導を低下させるのに役立つ環状ポリリボヌクレオチドの核酸配列又は構造である。
本明細書において使用される際、「発現配列」という用語は、産物、例えばペプチド若しくはポリペプチド又は調節核酸をコードする核酸配列である。ペプチド又はポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数のヌクレオチド三つ組を含み、これらは、それぞれアミノ酸をコードし、「コドン」と呼ばれる。
本明細書で使用する場合、用語「外因性の」は、生体分子（環状ＲＮＡなど）に関して使用される場合、生体分子が人の手によって宿主ゲノム、細胞又は生物に導入されたことを意味する。例えば、組換えＤＮＡ技術及び／又は生体分子を細胞に内部移行させるための方法を使用して、既存のゲノム、細胞、組織又は対象に追加される環状ＲＮＡは、その既存の核酸配列、細胞、組織又は対象及びその生体分子を保持する核酸配列、細胞、組織又は対象のあらゆる子孫に対して外因性である。
本明細書において使用される際、「免疫タンパク質結合部位」という用語は、免疫タンパク質に結合するヌクレオチド配列である。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、外因性であるものとして環状ポリリボヌクレオチドをマスクするのに役立ち、例えば、免疫タンパク質結合部位は、環状ポリリボヌクレオチドが免疫タンパク質によって認識及び結合されることを防ぐタンパク質（例えば、競合阻害剤）によって結合され、それにより環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を低下させるか又は回避する。
本明細書において使用される際、「免疫タンパク質」という用語は、例えば、免疫原、例えば環状ポリリボヌクレオチドなどに対する免疫応答に関連する任意のタンパク質又はペプチドである。免疫タンパク質の非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体（免疫グロブリン）、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、補体タンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「修飾リボヌクレオチド」は、天然の非修飾ヌクレオチド：アデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）などの修飾されていない天然のリボヌクレオチドの、化学的組成物への１つ以上の化学修飾を有する、あらゆるリボヌクレオチド類似体又は誘導体を意味する。いくつかの実施形態において、修飾リボヌクレオチドの化学修飾は、糖、核酸塩基又はヌクレオシド間連結などの、リボヌクレオチドのいずれか１つ以上の官能基に対する（例えば、連結しているリン酸に対する／ホスホジエステル結合に対する／ホスホジエステル骨格に対する）修飾である。
本明細書において使用される際、「疑似らせん構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部がらせん構造に折り畳まれる。
本明細書において使用される際、「疑似二本鎖二次構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部が内部二本鎖を形成する。
本明細書において使用される際、「調節要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する核酸配列などの部分である。
本明細書において使用される際、「反復ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのストレッチ内又はゲノム全体にわたる反復核酸配列である。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＴＧ（ＵＧ）配列を含む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリー中の反復される配列を含む。
本明細書において使用される際、「複製要素」という用語は、複製に必要若しくは有用であるか、又は環状ポリリボヌクレオチドの転写を開始させる配列及び／又はモチーフである。
本明細書において使用される際、「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導するヌクレオチド配列などの部分である。ある実施形態において、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。ある実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
本明細書において使用される際、「実質的に抵抗性」という用語は、対照と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の抵抗性を有するものを意味する。
本明細書において使用される際、「化学量論的翻訳」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された発現産物の実質的に同等の生成を意味する。例えば、２つの発現配列を有する環状ポリリボヌクレオチドでは、環状ポリリボヌクレオチドの化学量論的翻訳は、２つの発現配列の発現産物が実質的に等しい量を有し得ること、例えば２つの発現配列間の量の差（例えば、モルの差）が約０又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％若しくは２０％未満であり得ることを意味し得る。
本明細書において使用される際、「翻訳開始配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を開始させる核酸配列である。
本明細書において使用される際、「終止要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を停止させる核酸配列などの部分である。
本明細書において使用される際、「翻訳効率」という用語は、リボヌクレオチド転写産物からのタンパク質又はペプチド生成の速度又は量を意味する。ある実施形態において、翻訳効率は、例えば、所与の翻訳系、例えばウサギ網状赤血球溶解物のようなインビトロ翻訳系において又は真核細胞若しくは原核細胞のようなインビボ翻訳系において、例えば所与の期間で、タンパク質又はペプチドをコードする所与の量の１転写産物当たりで生成されるタンパク質又はペプチドの量として表され得る。
本明細書において使用される際、「環状化効率」という用語は、得られる環状ポリリボヌクレオチドの、その出発材料と比べた測定値である。
本明細書において使用される際、「免疫原性」という用語は、物質に対する免疫応答を誘導する可能性である。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が誘導され得る。「非免疫原性」という用語は、物質に対する検出可能な閾値を超える免疫応答の欠如又は非存在である。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が非免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が検出されない。ある実施形態において、本明細書において提供される非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原性アッセイによって測定される際に所定の閾値を超える免疫応答を誘導しない。例えば、免疫原性アッセイを用いて、環状ポリリボヌクレオチド）に対して自然免疫応答を測定する（例えば、炎症マーカーを測定する）際、本明細書において提供される非免疫原性ポリリボヌクレオチドは、所定の閾値より低いレベルで自然免疫応答の生成をもたらし得る。所定の閾値は、例えば、対照参照に対する自然免疫応答によって生じるマーカーのレベルの１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍以下であり得る。
本明細書で使用する場合、用語「線状同等物」は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％又はこれらの間のあらゆるパーセンテージの配列類似性）を有する、且つ２つのつながれていない端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化されたポリリボヌクレオチドの非環状化型（及びそのフラグメント））である。いくつかの実施形態において、線状同等物（例えば、あらかじめ環状化された型）は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％又はこれらの間のあらゆるパーセンテージの配列類似性）並びに環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似の核酸修飾を有する、且つ２つのつながれていない端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化されたポリリボヌクレオチドの非環状化型（及びそのフラグメント））である。いくつかの実施形態において、線状同等物（例えば、あらかじめ環状化された型）は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％又はこれらの間のあらゆるパーセンテージの配列類似性）並びに環状ポリリボヌクレオチドと異なる核酸修飾を有する又は核酸修飾を有しない、且つ２つのつながれていない端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化されたポリリボヌクレオチドの非環状化型（及びそのフラグメント））である。いくつかの実施形態において、線状同等物であるポリリボヌクレオチド分子のフラグメントは、線状同等物ポリリボヌクレオチド分子より短い、線状同等物ポリリボヌクレオチド分子のいずれかの部分である。いくつかの実施形態において、線状同等物は、５’キャップをさらに含む。いくつかの実施形態において、線状同等物は、ポリアデノシンテールをさらに含む。いくつかの実施形態において、線状同等物は、３’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、線状同等物は、５’ＵＴＲをさらに含む。
本明細書において使用される際、「担体」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドの共有結合修飾によって、部分的に若しくは完全に封入剤によって、又はそれらの組合せで、細胞内への組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の輸送又は送達を容易にする化合物、組成物、試薬、又は分子を意味する。担体の非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲン型材料）、ナノ粒子（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを封入するか若しくはそれに共有結合されるナノ粒子）、リポソーム、フソソーム、エクスビボ分化された網状赤血球、エキソソーム、タンパク質担体（例えば、環状ポリリボヌクレオチドに共有結合されるタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー若しくはトランスフェクション試薬）が挙げられる。
本明細書において使用される際、「ネイキッド送達（ｎａｋｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」という用語は、担体を用いず、且つ細胞への送達を助ける部分への共有結合修飾を有さない、細胞への送達のための製剤を意味する。ネイキッド送達製剤は、任意のトランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体を含まない。例えば、環状ポリリボヌクレオチドのネイキッド送達製剤は、共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドを含み、且つ担体を含まない製剤である。
「希釈剤」という用語は、本明細書に記載される組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物）が希釈又は溶解され得る不活性溶媒を含むビヒクルを意味する。希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、等張剤、又はそれらの混合物であり得る。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。液体希釈剤の非限定的な例としては、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及び１，３－ブタンジオールが挙げられる。固体希釈剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、又は粉砂糖が挙げられる。
参照による援用
本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個別に参照により援用されていることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読んだときによりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、本明細書で例示される実施形態が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な構成及び手段に限定されないことが理解されるべきである。
環状ポリリボヌクレオチド（「エンドレスＲＮＡ」）によってコードされるＧＦＰタンパク質の発現が、線状ポリリボヌクレオチド同等物（「線状ＲＮＡ」）によってコードされるＧＦＰタンパク質の発現より長い間、電気穿孔後に細胞中で存続することを示す実験データを示す。 ＣＡＲタンパク質をコードする環状（「Ｃ」）又は線状（「Ｌ」）ポリリボヌクレオチドの、細胞への導入後の、ＣＡＲタンパク質の表面発現を示す実験データを示す。 ヌクレオチドの量の関数としての、ＨｅＬａ細胞における様々な環状ポリリボヌクレオチドコンストラクト又は線状ポリリボヌクレオチドコンストラクトによってコードされるガウシア（ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼの発現を示す実験データを示す。 ＣＤ１９ ＣＡＲ配列をコードする環状ＲＮＡコンストラクト又はＣＤ１９ ＣＡＲ配列をコードする線状ＲＮＡコンストラクトで電気穿孔を行った初代ヒトＴ細胞上で、ＣＤ１９ ＣＡＲが発現されたことを示す。ビヒクル単独で電気穿孔を行った初代ヒトＴ細胞（陰性対照）からの発現は認められなかった。 腫瘍死滅アッセイにおける、ＣＤ１９ ＣＡＲ配列をコードする環状ＲＮＡコンストラクトによりＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞を概略的に示すものである。 ＣＤ１９ ＣＡＲ配列をコードする環状ＲＮＡコンストラクトによるＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞が、腫瘍細胞を死滅させることを示す。 環状ポリリボヌクレオチドから細胞中で発現されたＰＡＨタンパク質のウエスタンブロットを示す。 試験された両方の環状ＲＮＡによって細胞中で発現されたＰＡＨタンパク質が、機能性であり、フェニルアラニンをチロシンに変換することができたことを示す。 線状ポリリボヌクレオチド（「ＧＬｕｃ－線状」及び「ＧＬｕｃ－線状－修飾－グロビン」）と比較した場合の、環状ポリリボヌクレオチド（「ＧＬｕｃ－環状」）の経時的な安定性を示す実験データを示す。 線状ポリリボヌクレオチド（「ＧＬｕｃ－線状」）又はトランスフェクション試薬陰性対照（「リポフェクタミン（－）ＲＮＡ」）と比較した場合の、経時的な環状ポリリボヌクレオチド（「ＧＬｕｃ－環状」）の毒性の低下を示す実験データを示す。 環状ＲＮＡの概略図を示す。左下の概略図は、トランスフェリン受容体と結合するＣ２ｍｉｎアプタマー配列を含む環状ＲＮＡを示す。下中央の概略図は、トランスフェリン受容体と結合する３６ａアプタマー配列を含む環状ＲＮＡを示す。右下の概略図は、トランスフェリン受容体と結合しない非結合配列を含む環状ＲＮＡを示す。３つの環状ＲＮＡは全て、ＡＦ４８８標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合する配列（アニーリング配列）も含む。 トランスフェリン受容体と結合するアプタマー配列（Ｃ２．ｍｉｎ又は３６ａ）を含む環状ポリリボヌクレオチドが、トランスフェリン受容体を発現する細胞に内部移行されたことを、蛍光に基づいて示す。蛍光に基づくと、非結合アプタマーを含む環状ポリリボヌクレオチドは、トランスフェリン受容体を発現する細胞に内部移行されなかった。 一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド及び環状ＲＮＡの概略図を示す。一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、アプタマー配列と、環状ポリリボヌクレオチドに結合する配列（結合モチーフ）とを含む。環状ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド内の結合配列に結合する配列を含む。左下概略図は、トランスフェリン受容体と結合するＣ２ｍｉｎアプタマー配列と、環状ポリリボヌクレオチドに結合する配列とを含む、環状ポリリボヌクレオチドに結合される一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを示す。下中央の概略図は、トランスフェリン受容体と結合する３６ａアプタマー配列と、環状ポリリボヌクレオチドに結合する配列とを含む、環状ポリリボヌクレオチドに結合される一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを示す。右下の概略図は、トランスフェリン受容体に対して非結合であるアプタマー配列と、環状ポリリボヌクレオチドに結合する配列とを含む、環状ポリリボヌクレオチドに結合される一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを示す。 例示的精製プロセス後の例示的環状ＲＮＡを示す、変性ＰＡＧＥゲル画像である。 線状及び環状ＲＮＡの両方を捕捉したプライマーを用いた細胞への送達の２４時間後の線状及び環状ＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。 環状ＲＮＡに対して特異的なプライマーを用いた線状及び環状ＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。 環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。 ローリングサークル型翻訳によって環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡからの発現産物のタンパク質ブロットを示す画像である。 線状対照と比較した場合の、分裂細胞における環状ＲＮＡの、より高い安定性を示す実験データを示す。 線状対照と比較した場合の、例示的環状ＲＮＡのトランスフェクトされた細胞に対する毒性の低下を示す実験データを示す。 開始コドン、ＧＦＰをコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、スタガー要素（２Ａ）、エンクリプトゲン及びＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位を含有する環状ＲＮＡの例示的インビトロ生成プロセスの概略図を示す。 環状ＲＮＡの例示的インビボ生成プロセスの概略図を示す。 開始コドン、ＧＦＰをコードするＯＲＦ、スタガー要素（２Ａ）及びエンクリプトゲンを含む例示的環状ＲＮＡの設計を示す。 図２４Ａおよび図２４Ｂは、２つの異なる環状ＲＮＡのインビボでの化学量論的タンパク質発現を示す概略図である。 図２４Ａおよび図２４Ｂは、２つの異なる環状ＲＮＡのインビボでの化学量論的タンパク質発現を示す概略図である。
本開示は、概して、細胞治療のための組成物及びこの組成物を細胞治療において使用する方法に関する。この組成物及び方法は、少なくとも１つの結合部位を含むか、タンパク質をコードするか、又はそれらの組み合わせである、外因性の環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞（例えば、単離された細胞）を含み且つ使用する。タンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡテール、複製要素又はそれらの組み合わせを欠いている。細胞治療の方法は、単離された細胞を、それを必要とする対象に投与することを含むことができる。
本開示は、外因性の環状ポリリボヌクレオチドを含む単離された細胞に関する。いくつかの実施形態において、医薬組成物、調製物、懸濁液、医療機器又は生体適合性マトリックスは、細胞治療に使用するための単離された細胞を含む。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、細胞治療に使用するための単離された細胞を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、環状ポリリボヌクレオチドに細胞局在化を与える。いくつかの態様において、単離された細胞は、編集細胞である。
本開示は、さらに、細胞治療のための単離された細胞を生成することに関する。一実施形態において、細胞又は複数の細胞を生成する方法は、本明細書に記載される単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供することと；本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを提供することと、環状ポリリボヌクレオチドを、単離された細胞又は複数の単離された細胞に接触させることとを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、接触後の細胞又は複数の細胞を対象に投与することをさらに含む。
本開示は、さらに、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドを含む単離された細胞を投与することに関する。一実施形態において、細胞治療の方法は、単離された細胞、複数の単離された細胞、単離された細胞を含む調製物、点滴静注バッグ中の複数の単離された細胞、バイオリアクターからの複数の単離された細胞を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与すること又は複数の単離された細胞を含む医療機器若しくは生体適合性マトリックスを対象に植込むことを含む。
本開示は、さらに、単離された細胞又は複数の単離された細胞の核酸を編集する方法であってａ）単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供することと；ｂ）単離された細胞又は複数の単離された細胞を、ヌクレアーゼをコードする及び／又はガイド核酸を含む環状ポリリボヌクレオチドに接触させることとを含み、それにより対象への投与のための編集細胞又は複数の編集細胞を生成する方法に関する。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ又はＣａｓタンパク質である。
いくつかの態様において、本発明は、細胞を含む細胞治療であって、細胞が、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）をコードする少なくとも１つの発現配列を含む外因性の環状ポリリボヌクレオチドを含む、細胞治療に関する。いくつかの実施形態において、細胞は、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）及び環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質をコードする少なくとも１つの発現配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、治療用細胞であり、ここで、治療用細胞は、タンパク質及び環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞に少なくとも１つの治療特性を与えるタンパク質をコードする少なくとも１つの発現配列を含む。細胞は、エクスビボ細胞（例えば、単離された細胞）であり得る。細胞は、単離された細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞治療は、医薬組成物であり、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。
本明細書に記載される細胞は、細胞治療の方法に使用することができる。細胞治療の方法は、環状ポリリボヌクレオチド、例えば、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドのいずれか又はその組成物を提供することと、環状ポリリボヌクレオチドをエクスビボで細胞（例えば、単離された細胞）に接触させることとを含むことができる。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含むことができる。１つ以上の発現配列の発現産物は、タンパク質、例えば、治療用タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、細胞治療の方法は、それを必要とする対象、例えばヒト対象に細胞を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、細胞治療の方法は、１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを提供することと、その環状ポリリボヌクレオチドをエクスビボで細胞（例えば、単離された細胞）に接触させることとを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の発現配列の発現産物は、それを必要とする対象を治療するためのタンパク質を含む。さらなる態様において、本発明は、本明細書に開示される細胞又は治療用細胞又はその医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、細胞治療の方法に関する。
細胞治療のための細胞
いくつかの態様において、細胞治療は、細胞（例えば、単離された細胞）を含み、ここで、細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、（ａ）少なくとも１つの結合部位を含むか、（ｂ）タンパク質をコードするか、又は（ａ）と（ｂ）の両方である。環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）、少なくとも１つの結合部位又はそれらの組み合わせをコードする少なくとも１つの発現配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞は、治療用細胞であり、ここで、治療用細胞は、タンパク質及び環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞に少なくとも１つの治療特性を与えるタンパク質をコードする少なくとも１つの発現配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、治療用細胞であり、ここで、治療用細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞に少なくとも１つの治療特性を与える少なくとも１つの結合部位を含む。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞に接触される。その細胞は、単離された細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞（例えば、単離された細胞）は、外因性の合成の環状ポリリボヌクレオチドを含む単離された哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞（例えば、単離された細胞）は、少なくとも１つの結合部位を含む外因性の合成の環状ポリリボヌクレオチド、コードされるタンパク質又はそれらの組み合わせを含み、ここで、細胞は、対象に投与される。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）分泌タンパク質若しくは細胞内タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせである。実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）膜タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであり、ここで、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体融合タンパク質ではない。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位を含み、且つタンパク質をコードし、ここで、タンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質である。
いくつかの実施形態において、細胞治療のための細胞は、本明細書に記載される外因性の環状ポリリボヌクレオチドによってコードされるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。例えば、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードし、且つ少なくとも１つの結合部位を含む、環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、キメラ抗原受容体をコードし、且つ少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、単離された細胞は、投与（例えば、対象への静脈内投与）のためのものである。
いくつかの実施形態において、細胞は、（ａ）ｉ）抗原に結合する抗原結合タンパク質をコードする少なくとも１つの標的結合配列、又はｉｉ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列、を含む環状ポリリボヌクレオチドと；（ｂ）その発現が抗原結合タンパク質への抗原の結合時に活性化されるタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の配列は、少なくとも１つの結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、分泌タンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）又は共刺激リガンド（例えば、ＣＤ４０若しくは４－１ＢＢＬ）である。
特定の実施形態において、細胞治療のための細胞は、改変Ｔ細胞である。例えば、細胞は、抗原に対する親和性を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする環状ポリリボヌクレオチドと、二重特異性抗体をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、細胞は、細胞の表面上にＴＣＲ及び二重特異性抗体を発現する。
細胞型
いくつかの実施形態において、細胞（例えば、単離された細胞）は、真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ、クマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞であるか、又はヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞又は非有糸分裂細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞（例えば、単離された細胞）は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、非免疫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、末梢血単核球である。いくつかの実施形態において、細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態において、細胞は、神経学的細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、心臓病学的細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、脂肪細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、肝臓細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、β細胞である。細胞は、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、γδＴ細胞、αβＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、赤血球、網状赤血球、骨髄系前駆細胞及び巨核球からなる群から選択される細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞（例えば、単離された細胞は、間葉系幹細胞、胎生幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、胎児幹細胞（ｆｅｔａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、胎盤由来幹細胞、人工多能性幹細胞、脂肪幹細胞、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、皮膚幹細胞、成体幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、臍帯幹細胞、角膜縁（ｃｏｒｎｅａｌ ｌｉｍｂａｌ）幹細胞、前駆幹細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）及び神経幹細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、細胞（例えば、単離された細胞）は、末梢血リンパ球である。いくつかの実施形態において、細胞は、線維芽細胞である。細胞は、軟骨細胞であり得る。細胞は、心筋細胞であり得る。細胞は、ドーパミン作動性神経であり得る。細胞は、ミクログリアであり得る。細胞は、乏突起膠細胞であり得る。細胞は、腸神経細胞であり得る。細胞は、肝細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞（例えば、単離された細胞）は、複製能力がない、例えば、細胞は、有糸分裂後であるか、又はマイトジェン若しくは放射線照射で処理されている。
細胞（例えば、単離された細胞）は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、対象（例えば、動物）から取り出すことができる。いくつかの実施形態において、細胞は、対象からの器官、組織、血液又はリンパから取り出される。いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロで増加又は培養された、取り出された又は単離された細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞株、例えば、不死化された実験用細胞株からのものである。細胞は、対象にとって自己由来であり得る。細胞は、対象と同種であり得る。細胞は、対象において免疫原性であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、対象において免疫原性ではない。いくつかの実施形態において、複数の細胞（例えば、複数の単離された細胞）は、同種の細胞集団である。いくつかの実施形態において、複数の細胞（例えば、複数の単離された細胞）は、異種の集団である。異種の集団は、例えば、免疫細胞の異種集団である。
いくつかの実施形態において、細胞は、臓器移植のために使用されることとなる、対象から取り出された組織又は器官中にある。例えば、細胞は、肝臓、心臓、腎臓、皮膚、角膜、脂肪、膵臓、肺、腸、中耳、骨、骨髄、心臓弁、結合組織又は血管柄付き複合組織同種移植片（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ａｌｌｏｇｒａｆｔ）（例えば、皮膚、骨、筋肉、血管、神経及び結合組織などのいくつかの組織の複合体）中にある。
環状ポリリボヌクレオチド
いくつかの態様において、本明細書に記載される細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、外因性の合成の環状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、細胞治療は、細胞を含み、ここで、細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）分泌タンパク質若しくは細胞内タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせである。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）膜タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであり、ここで、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体融合タンパク質ではない。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位を含み、且つタンパク質をコードし、ここで、タンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質である。
環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）又は少なくとも１つの結合部位をコードする少なくとも１つの発現配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞は、治療用細胞であり、ここで、治療用細胞は、タンパク質及び環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞に少なくとも１つの治療特性を与えるタンパク質をコードする少なくとも１つの発現配列を含む。細胞は、エクスビボ細胞（例えば、単離された細胞）であり得る。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載される細胞に接触される。
タンパク質
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質をコードする。タンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞中で翻訳時に発現産物を生成する発現配列をコードする。発現配列は、治療用タンパク質などのタンパク質をコードすることができる。発現配列は、細胞に少なくとも１つの治療特性を与えるタンパク質をコードすることができる。環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質又は治療用タンパク質をコードする１つ以上の発現配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列のペプチド又はポリペプチド、例えば、細胞治療としての治療のための治療用タンパク質をコードする発現配列を含む。このタンパク質は、それを必要とする対象における疾患を治療することができる。いくつかの実施形態において、発現配列のペプチド又はポリペプチドは、細胞に治療特性を与える、例えば、細胞増殖、細胞不死化、細胞分化及び／又は細胞の標的への局在化を促進する、あらゆるペプチド又はポリペプチドである。治療用タンパク質は、それを必要とする対象において、変異タンパク質、低発現タンパク質又は存在しないタンパク質を補うことができる。治療用タンパク質は、それを必要とする対象において、細胞、組織又はウイルスを標的にするか、これらと相互作用するか又は結合することができる。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、そのうちのそれぞれがポリペプチドをコードすることができる１つ以上のＲＮＡ発現配列を含む。ポリペプチドは、かなりの量で生成され得る。したがって、ポリペプチドは、生成され得る任意のタンパク質分子であり得る。
ポリペプチドは、細胞から分泌されるか、又は細胞の細胞質、核若しくは膜区画に限局され得るポリペプチドであり得る。いくつかのポリペプチドとしては、限定はされないが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも一部、代謝調節酵素（例えば、脂質又はステロイド生成を調節する）、抗原、寛容原、サイトカイン、毒素、非存在が疾患に関連する酵素、及び切断されるまで動物内（例えば、動物の腸内）で活性でないポリペプチド、及びホルモンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、細胞中の欠乏（例えば、変異タンパク質、欠陥タンパク質、発現不十分なタンパク質又は存在しないタンパク質）を補うタンパク質又は治療用タンパク質である。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得るタンパク質又は治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合活性、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性、寛容原性活性又は輸送活性を有する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、分子機能調節因子である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、タンパク質タグとして機能する。タンパク質又は治療用タンパク質のいくつかの例としては、限定はされないが、酵素補充タンパク質、補充用のタンパク質、タンパク質ワクチン接種、抗原（例えば腫瘍抗原、ウイルス、細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば、癌）、リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、調節された死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素用の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質フラグメント若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体、Ｃａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲシステム若しくはその構成要素が挙げられる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７又はＣＤ２４などの免疫寛容誘導因子である。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされ、細胞中で任意選択的に発現されるタンパク質又は治療用タンパク質は、細胞内タンパク質又は細胞質タンパク質である。タンパク質又は治療用タンパク質は、例えば、フェニルアラニン水酸化酵素、Ｇ－タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、キメラ抗原受容体、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質、転写活性化因子様タンパク質ヌクレアーゼ又はＣａｓタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１４又はＣａｓ１３である。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされ、細胞中で任意選択的に発現されるタンパク質又は治療用タンパク質は、膜タンパク質である。いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、膜貫通タンパク質である。いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、細胞外基質タンパク質である。タンパク質又は治療用タンパク質は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、膜貫通受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、抗原受容体、イオンチャネル又は膜輸送体であり得る。
いくつかの実施形態において、タンパク質又は治療用タンパク質は、膜タンパク質である。いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、細胞外基質タンパク質である。いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、タンパク質又は治療用タンパク質は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは膜貫通ドメインに連結され、膜貫通ドメインは細胞内シグナル伝達ドメインに連結されて、ＣＡＲを生じる。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、寛容原若しくは病原と結合するか、又は抗原は、腫瘍抗原若しくは病原抗原である。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体又はその抗体フラグメントである。例えば、抗原結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、可変領域フラグメント又はＦａｂである。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、第１のエピトープと結合する第１の免疫グロブリン可変ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の免疫グロブリン可変ドメインを有する。いくつかの実施形態において、第１のエピトープと第２のエピトープは、同じものである。いくつかの実施形態において、第１のエピトープと第２のエピトープは、異なる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結させる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジタンパク質（例えば、免疫グロブリンヒンジ）、ポリペプチドリンカー（例えば、ＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、ＣＤ８ａヒンジ又はスペーサーである。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも一部を含む。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２の少なくとも一部又はそれらのあらゆる組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子又は活性化ＮＫ細胞受容体タンパク質の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＲＡＮＫＬ、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ１６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、Ｂ７－Ｈ３又はＣＤ８３に結合するリガンドの少なくとも１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体、ＴＡＡ特異的キメラ抗原受容体、ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体、ＨＥＲ２特異的キメラ抗原受容体、ＣＤ２特異的キメラ抗原受容体、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的キメラ抗原受容体、ＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体、メソセリン特異的キメラ抗原受容体、ＥＢＶ特異的キメラ抗原受容体又はＣＤ３３特異的キメラ抗原受容体である。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされ、細胞中で任意選択的に発現されるタンパク質又は治療用タンパク質は、分泌タンパク質である。分泌タンパク質は、例えば、エリスロポエチン、サイトカイン、インスリン、オキシトシン、分泌酵素、ホルモン又は神経伝達物質であり得る。
いくつかの実施形態において、タンパク質又は治療用タンパク質は、活性を有することができる。例えば、活性は、酸化防止活性、結合活性、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性又は輸送活性であり得る。いくつかの実施形態において、この活性は、細胞に特性（例えば、不死化、細胞分化、標的部位への局在化、増殖及び／又は複製増加）を与えることができる。いくつかの実施形態において、細胞分化のためのタンパク質又は治療用タンパク質は、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、これらのタンパク質は、細胞を初期化するために、例えば人工多能性幹細胞を生成するために使用される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現させることができる例示的タンパク質としては、ヒトタンパク質、例えば、受容体結合タンパク質、ホルモン、成長因子、成長因子受容体モジュレーター及び再生タンパク質（例えば、増殖及び分化に関与しているタンパク質、例えば、創傷治癒のための治療用タンパク質）が挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、ＥＧＦ（上皮成長因子）が挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、酵素、例えばオキシドレダクターゼ酵素、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素及びデサチュラーゼが挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、細胞内タンパク質又は細胞質タンパク質が挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼを発現する。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、分泌タンパク質、例えば分泌酵素が挙げられる。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エリスロポエチンを発現する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）を発現する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、血液中で治療効果のある短い半減期を有し得る分泌タンパク質を発現するか、又は細胞内局在化シグナルを有するタンパク質、若しくは分泌シグナルペプチドを有するタンパク質であり得る。
いくつかの実施形態において、タンパク質又は治療用タンパク質は、抗原と特異的に結合する。例えば、本明細書に記載される発明において有用なペプチドとしては、抗原結合ペプチド、例えば、抗原結合抗体又は抗体様フラグメント、例えば単鎖抗体、ナノボディが挙げられる（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｇ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６－１１３を参照されたい）。こうした抗原結合ペプチドは、細胞質抗原、核抗原、細胞内小器官抗原と結合することができる。いくつかの実施形態において、抗原は、腫瘍抗原、トレラゲン又は病原抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は、腫瘍又は癌により発現される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドによって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプのものであり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の一部、例えば軽鎖、重鎖、Ｆｃフラグメント、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖフラグメント、又はＦａｂフラグメント、そのさらなる部分を発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、これらは、それぞれ抗体の一部を発現し、これらの集合が抗体を構成し得る。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列、及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列を含む。環状ポリリボヌクレオチドが細胞で発現される場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、折り畳み、又は機能的抗体を形成する他の翻訳後修飾に供され得る。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体、例えば、完全長抗体、抗体フラグメント又はその部分を発現する。
ペプチドには、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス又は微生物粒子、合成分子及びそのアゴニスト又はアンタゴニストが含まれ得る。
ポリペプチドは、直鎖又は分枝であり得る。ポリペプチドは、約５～約４０，０００アミノ酸、約１５～約３５，０００アミノ酸、約２０～約３０，０００アミノ酸、約２５～約２５，０００アミノ酸、約５０～約２０，０００アミノ酸、約１００～約１５，０００アミノ酸、約２００～約１０，０００アミノ酸、約５００～約５，０００アミノ酸、約１，０００～約２，５００アミノ酸又はこれらの間のあらゆる範囲の長さを有することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、約４０，０００未満のアミノ酸、約３５，０００未満のアミノ酸、約３０，０００未満のアミノ酸、約２５，０００未満のアミノ酸、約２０，０００未満のアミノ酸、約１５，０００未満のアミノ酸、約１０，０００未満のアミノ酸、約９，０００未満のアミノ酸、約８，０００未満のアミノ酸、約７，０００未満のアミノ酸、約６，０００未満のアミノ酸、約５，０００未満のアミノ酸、約４，０００未満のアミノ酸、約３，０００未満のアミノ酸、約２，５００未満のアミノ酸、約２，０００未満のアミノ酸、約１，５００未満のアミノ酸、約１，０００未満のアミノ酸、約９００未満のアミノ酸、約８００未満のアミノ酸、約７００未満のアミノ酸、約６００未満のアミノ酸、約５００未満のアミノ酸、約４００未満のアミノ酸、約３００未満のアミノ酸の長さを有するか又はそれより短いものが有用であり得る。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドからのタンパク質（例えば、治療用タンパク質又は治療特性を与えるタンパク質）の発現は、一過性又は長期のものである。発現は、細胞上で、細胞中で又は細胞の治療効果をもたらすことができる。ある種の実施形態において、治療効果は、少なくとも約１時間～約３０日又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、６０日若しくはそれを超えて又はこれらの間のあらゆる時間、存続する。ある種の実施形態において、治療効果は、約３０分～約７日以下又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日、５日、６日、７日以下又はこれらの間のあらゆる時間、存続する。
いくつかの実施形態において、１つ以上の発現配列は、細胞中で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、細胞中で線状同等物より少なくとも１．５倍多い発現産物を生成する。いくつかの実施形態において、細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多く変化することはないレベルに維持される。いくつかの実施形態において、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたる、細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、且つインビボでの対象の細胞における持続的発現のために構成されている。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、より後の時点での細胞中での１つ以上の発現配列のタンパク質発現が、より前の時点と等しい又はより前の時点より高いように構成されている。こうした実施形態において、１つ以上の発現配列のタンパク質発現は、比較的安定なレベルに維持することができるか又は時間と共に増大させることができる。発現配列のタンパク質発現は、長期間、比較的安定であり得る。例えば、ある場合には、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日以上の期間にわたる、細胞中の１つ以上の発現配列のタンパク質発現は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％低下することはない。ある場合には、細胞中の１つ以上の発現配列のタンパク質発現は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日以上の間、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％より大きく変化しないレベルに維持される。
本発明は、本明細書で提供される環状ポリリボヌクレオチドの少なくともある領域を翻訳させることを含む、ペプチド又はポリペプチドの発現、タンパク質発現を含む。タンパク質発現は、タンパク質（例えば、治療用タンパク質又は治療用細胞に治療特性を与えるタンパク質）をコードする本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドにより起こり得る。タンパク質発現は、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた後に起こり得る。タンパク質発現は、細胞、例えばエクスビボ細胞（例えば、単離された細胞）において起こり得る。タンパク質発現は、それを必要とする対象への細胞の投与後、その細胞において起こり得る。
いくつかの実施形態において、タンパク質発現のための方法は、環状ポリリボヌクレオチドの全長の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の、ポリペプチドへの翻訳を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質発現のための方法は、環状ポリリボヌクレオチドの、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも７００アミノ酸、少なくとも８００アミノ酸、少なくとも９００アミノ酸又は少なくとも１０００アミノ酸のポリペプチドへの翻訳を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質発現のための方法は、環状ポリリボヌクレオチドの、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０アミノ酸、約３００アミノ酸、約４００アミノ酸、約５００アミノ酸、約６００アミノ酸、約７００アミノ酸、約８００アミノ酸、約９００アミノ酸又は約１０００アミノ酸のポリペプチドへの翻訳を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、環状ポリリボヌクレオチドの、本明細書で提供される連続的ポリペプチド、本明細書で提供される不連続のポリペプチド又はその両方への翻訳を含む。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくともある領域の翻訳は、インビボで、例えば、真核細胞のトランスフェクション又は細菌などの原核細胞の形質転換後又はエクスビボ細胞（例えば、単離された細胞）などの細胞を環状ポリリボヌクレオチドに接触させた後に起こる。
いくつかの実施形態において、タンパク質発現のための方法は、翻訳産物の修飾、フォールディング又は他の翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質発現のための方法は、インビボでの又はエクスビボ細胞における、例えば細胞機構を介する翻訳後修飾を含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質発現は、細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質の生成をもたらす。
いくつかの実施形態において、１つ以上の発現配列は、ある量の、全ポリペプチドと比較した場合に不連続のポリペプチドを生成し、ここで、この量は、ポリペプチドのモルによるポリペプチドの総量の、あるパーセントである。ポリペプチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成させることができる。不連続のポリペプチドのそれぞれは、単一の発現配列から生成することができる。いくつかの実施形態において、不連続のポリペプチドの量は、全ポリペプチドの、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％又は少なくとも９８％（モル／モル）である。いくつかの実施形態において、不連続のポリペプチドの量は、全ポリペプチドの、１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％又は６０％～９８％（モル／モル）である。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチド同等物より多い量の発現産物を生成する発現配列を含む。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、線状ポリリボヌクレオチド同等物の量より、少なくとも１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍又は少なくとも２５倍多い。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、線状ポリリボヌクレオチド同等物の量より、１．５倍～１．６倍、１．６倍～１．７倍、１．７倍～１．８倍、１．８倍～１．９倍、１．９倍～２倍、２倍～２．５倍、２．５倍～３倍、３倍～３．５倍、３．５倍～４倍、４倍～４．５倍、４．５倍～５倍、５倍～６倍、６倍～７倍、７倍～８倍、８倍～９倍、９倍～１０倍、１０倍～１５倍、１５倍～２０倍、２０倍～２５倍、２倍～５倍、２倍～６倍、２倍～７倍、２倍～１０倍、２倍～２０倍、４倍～５倍、４倍～６倍、４倍～７倍、４倍～１０倍、４倍～２０倍、５倍～６倍、５倍～７倍、５倍～１０倍、５倍～２０倍又は１０倍～２０倍多い。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１２日、少なくとも約１４日、少なくとも約１６日、少なくとも約１８日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約４０日又は少なくとも約５０日間、細胞中で生成される。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、１日～２日、２日～３日、３日～４日、４日～５日、５日～６日、６日～７日、７日～８日、８日～９日、９日～１０日、１０日～１２日、１２日～１４日、１４日～１６日、１６日～１８日、１８日～２０日、２０日～２５日、２５日～３０日、３０日～４０日、４０日～５０日、１日～１４日、１日～３０日、７日～１４日、７日～３０日又は１４日～３０日間、細胞中で生成される。
いくつかの実施形態において、１つ以上の発現配列は、細胞中で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、細胞中で線状同等物より少なくとも１．５倍多い発現産物を生成する。いくつかの実施形態において、その期間は、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた１日後に開始する。いくつかの実施形態において、細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多く変化することはないレベルに維持される。いくつかの実施形態において、その期間は、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた１日後に開始する。いくつかの実施形態において、維持される発現のレベルは、その期間の開始時の発現のレベル、例えば、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた１日後の発現のレベルである。いくつかの実施形態において、維持される発現のレベルは、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた１日後の最も高い発現のレベルである。いくつかの実施形態において、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたる、細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない。いくつかの実施形態において、その期間は、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた１日後に開始する。いくつかの実施形態において、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない発現のレベルは、その期間の開始時の発現のレベルである。いくつかの実施形態において、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない発現のレベルは、その期間の開始時の最も高い発現のレベル、例えば、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた１日後の発現のレベルである。いくつかの実施形態において、発現のレベルは、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた１日後の最も高い発現のレベルと比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない。
翻訳後、タンパク質は、細胞中で又は分泌タンパク質として検出することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、６０日以上の期間にわたって、細胞中で検出される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、６０日以上の期間にわたって、細胞の表面上に検出される。いくつかの実施形態において、分泌タンパク質が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、６０日以上の期間にわたって検出される。いくつかの実施形態において、その期間は、細胞を、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドと接触させた１日後に開始する。タンパク質は、タンパク質検出のための当技術分野で公知の任意の技術を使用して、例えばフローサイトメトリーによって検出することができる。
ペプチドとしては、限定はされないが、低分子ペプチド、ペプチドミメティック（例えば、ペプトイド）、アミノ酸及びアミノ酸類似体を挙げることができる。ペプチドは、直鎖又は分枝であり得る。こうしたペプチドは、１モルあたり約５，０００グラム未満の分子量、１モルあたり約２，０００グラム未満の分子量、１モルあたり約１，０００グラム未満の分子量、１モルあたり約５００グラム未満の分子量並びにこうした化合物の塩、エステル及び他の薬学的に許容される形態を有することができる。ペプチドは、治療用ペプチドであり得る。
結合部位
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位をコードする。少なくとも１つの結合部位は、タンパク質、ＲＮＡ又はＤＮＡなどの標的と結合することができる。少なくとも１つの結合部位は、タンパク質結合部位、ＲＮＡ結合部位又はＤＮＡ結合部位であり得る。少なくとも１つの結合部位は、細胞に少なくとも１つの治療特性を与える。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、細胞に、核酸（例えば、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド）の局在化を与える。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞に、核酸活性を与える（例えば、ｍｉＲＮＡを含む細胞における核酸分解をもたらすｍｉＲＮＡ結合部位である）。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、細胞の表面上の細胞受容体に結合する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位が細胞の表面上の細胞受容体に結合した場合、本明細書に記載される細胞に内部移行される。いくつかの実施形態において、少なくとも結合部位は、環状ポリリボヌクレオチドの細胞への内部移行を助ける線状ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。例えば、線状ポリヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１つの結合部位とハイブリダイズする領域と、細胞の表面上の細胞受容体に結合する領域とを含む。いくつかの実施形態において、細胞受容体に結合する線状ポリリボヌクレオチドの領域は、結合後の環状ポリリボヌクレオチドとハイブリダイズされた線状ポリリボヌクレオチドの内部移行をもたらす。
いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、１つの結合部位を含む。結合部位は、アプタマーを含むことができる。ある場合において、環状ＲＮＡは、少なくとも２つの結合部位を含む。例えば、環状ＲＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される環状ＲＮＡは、１つ以上の標的又は１つ以上の標的の１つ以上の結合部分と結合する分子足場である。各標的は、限定はされないが、異なる又は同じ核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬物）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、そのあらゆるフラグメント及びそれらのあらゆる組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合部位は、同じ標的に結合する。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合部位は、同じ標的の１つ以上の結合部分に結合する。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合部位は、１つ以上の異なる標的に結合する。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合部位は、異なる標的の１つ以上の結合部分に結合する。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的の１つ以上の結合のための足場として働く。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分のための足場として働く。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的に特異的に結合することによって細胞過程を調節する。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分に特異的に結合することによって細胞過程を調節する。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的に特異的に結合することによって細胞過程を調節する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される環状ＲＮＡは、対象となる１つ以上の特異的な標的のための結合部位を含む。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、対象となる各標的のための複数の結合部位又は結合部位の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、対象となる各結合部分のための複数の結合部位又は結合部位の組み合わせを含む。例えば、環状ＲＮＡは、ポリペプチド標的のための１つ以上の結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｍＲＮＡ標的、ｒＲＮＡ標的、ｔＲＮＡ標的又はゲノムＤＮＡ標的などのポリヌクレオチド標的のための１つ以上の結合部位を含む。
いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、抗体のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ウイルス粒子のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、小分子のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、細胞中で又は細胞上で結合する結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、メチル化ポリヌクレオチドのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、非メチル化ポリヌクレオチドのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、アプタマーのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ポリペプチドのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、タグ化タンパク質、抗体、抗体フラグメント、小分子、ウイルス粒子（例えば、膜貫通タンパク質を含むウイルス粒子）又は細胞のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡ上の結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、抗体における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ウイルス粒子における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、小分子における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、細胞内又は細胞における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、メチル化ポリヌクレオチドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、非メチル化ポリヌクレオチドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、アプタマーにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ポリペプチドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、タグ化タンパク質、抗体、抗体フラグメント、小分子、ウイルス粒子（例えば、膜貫通タンパクを含むウイルス粒子）、又は細胞における結合部分のための結合部位を含む。
いくつかの実施形態において、結合部位は、少なくとも２つのアミド結合を含む標的の一部に結合する。ある場合において、結合部位は、ホスホジエステル結合を含む標的の一部に結合しない。ある場合において、標的の一部は、ＤＮＡ又はＲＮＡではない。ある場合において、結合部分は、少なくとも２つのアミド結合を含む。ある場合において、結合部分は、ホスホジエステル結合を含まない。ある場合において、結合部分は、ＤＮＡ又はＲＮＡでない。
本明細書において提供される環状ＲＮＡは、複合体における結合部分のための１つ以上の結合部位を含み得る。本明細書において提供される環状ＲＮＡは、複合体を形成するために、標的のための１つ以上の結合部位を含み得る。例えば、本明細書において提供される環状ＲＮＡは、環状ＲＮＡと標的との間に複合体を形成するための足場としての役割を果たし得る。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、単一の標的と複合体を形成する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、２つの標的と複合体を形成する。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、３つの標的との複合体を形成する。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、４つの標的との複合体を形成する。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、５つ以上の標的との複合体を形成する。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、２つ以上の標的の複合体との複合体を形成する。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、３つ以上の標的の複合体との複合体を形成する。いくつかの実施形態において、２つ以上の環状ＲＮＡは、単一の標的との複合体を形成する。ある実施形態において、２つ以上の環状ＲＮＡは、２つ以上の標的と複合体を形成する。ある実施形態において、第１の環状ＲＮＡは、第１の標的の第１の結合部分及び第２の標的の第２の異なる結合部分と複合体を形成する。ある実施形態において、第１の環状ＲＮＡは、第１の標的の第１の結合部分と複合体を形成し、第２の環状ＲＮＡは、第２の標的の第２の結合部分と複合体を形成する。
いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の抗体－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ＤＮＡ複合体、ポリペプチド－ＲＮＡ複合体、ポリペプチド－アプタマー複合体、ウイルス粒子－抗体複合体、ウイルス粒子－ポリペプチド複合体、ウイルス粒子－ＤＮＡ複合体、ウイルス粒子－ＲＮＡ複合体、ウイルス粒子－アプタマー複合体、細胞－抗体複合体、細胞－ポリペプチド複合体、細胞－ＤＮＡ複合体、細胞－ＲＮＡ複合体、細胞－アプタマー複合体、小分子－ポリペプチド複合体、小分子－ＤＮＡ複合体、小分子－アプタマー複合体、小分子－細胞複合体、小分子－ウイルス粒子複合体及びそれらの組み合わせのための結合部位を含むことができる。
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の抗体－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ＤＮＡ複合体、ポリペプチド－ＲＮＡ複合体、ポリペプチド－アプタマー複合体、ウイルス粒子－抗体複合体、ウイルス粒子－ポリペプチド複合体、ウイルス粒子－ＤＮＡ複合体、ウイルス粒子－ＲＮＡ複合体、ウイルス粒子－アプタマー複合体、細胞－抗体複合体、細胞－ポリペプチド複合体、細胞－ＤＮＡ複合体、細胞－ＲＮＡ複合体、細胞－アプタマー複合体、小分子－ポリペプチド複合体、小分子－ＤＮＡ複合体、小分子－アプタマー複合体、小分子－細胞複合体、小分子－ウイルス粒子複合体、及びそれらの組合せにおける１つ以上の結合部分のための結合部位を含み得る。
いくつかの実施形態において、結合部位は、ポリペプチド、タンパク質又はそのフラグメントに結合する。いくつかの実施形態において、結合部位は、標的のポリペプチド、タンパク質又はそのフラグメントの、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。例えば、結合部位は、単離されたポリペプチド、細胞のポリペプチド、精製されたポリペプチド又は組換え型ポリペプチドの、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。例えば、結合部位は、抗体又はそのフラグメントの、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。例えば、結合部位は、転写因子の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。例えば、結合部位は、受容体の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。例えば、結合部位は、膜貫通受容体の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。結合部位は、単離された、精製された及び／又は組換え型のポリペプチドの、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合することができる。結合部位は、分析物（例えば、溶解物）の混合物の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合することができる。例えば、結合部位は、複数の細胞又は単一の細胞の溶解物からのドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合することができる。結合部位は、標的の結合部分に結合することができる。いくつかの実施形態において、結合部分は、ポリペプチド、タンパク質、又はそのフラグメント上にある。ある実施形態において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又はポリペプチド、タンパク質、若しくはそのフラグメントの一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は単離ポリペプチド、細胞のポリペプチド、精製ポリペプチド、若しくは組み換えポリペプチドの一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は抗体若しくはそのフラグメントの一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は転写因子の一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は受容体の一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は膜貫通受容体の一部を含む。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は単離、精製、及び／若しくは組み換えポリペプチドの一部の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は分析物（例えば、溶解物）の混合物の一部の上にある結合部分又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は複数の細胞に由来するか若しくは単一細胞の溶解物に由来する部分上にあるか又はそれらを含む。
いくつかの実施形態において、結合部位は、化学的化合物（例えば、小分子）の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。例えば、結合は、薬物の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。例えば、結合部位は、化合物の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。例えば、結合部位は、有機化合物の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。ある場合において、結合部位は、９００ダルトン以下の分子量を有する小分子の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。ある場合において、結合部位は、５００ダルトン以上の分子量を有する小分子の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。結合部位が結合する小分子の部分は、例えば、コンビナトリアル手段を通して生成される化合物のライブラリー、すなわち化合物多様性コンビナトリアルライブラリーを含めた、天然起源の又は合成の分子のライブラリーから得ることができる。コンビナトリアルライブラリー並びにその生成及びスクリーニングのための方法は、当技術分野で公知であり、その開示が参照により本明細書に援用される米国特許第５，７４１，７１３号明細書；同第５，７３４，０１８号明細書；同第５，７３１，４２３号明細書；同第５，７２１，０９９号明細書；同第５，７０８，１５３号明細書；同第５，６９８，６７３号明細書；同第５，６８８，９９７号明細書；同第５，６８８，６９６号明細書；同第５，６８４，７１１号明細書；同第５，６４１，８６２号明細書；同第５，６３９，６０３号明細書；同第５，５９３，８５３号明細書；同第５，５７４，６５６号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，５６５，３２４号明細書；同第５，５４９，９７４号明細書；同第５，５４５，５６８号明細書；同第５，５４１，０６１号明細書；同第５，５２５，７３５号明細書；同第５，４６３，５６４号明細書；同第５，４４０，０１６号明細書；同第５，４３８，１１９号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書に記載されている。結合部位は、小分子の結合部分に結合することができる。ある場合において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは小分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは薬剤の一部の上にあるか又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは化合物の一部の上にあるか又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは有機化合物の一部の上にあるか又はそれらを含む。ある場合において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は９００ダルトン以下の分子量を有する小分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。ある場合において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは５００ダルトン以上の分子量を有する小分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。結合部分は、例えば、組合せ手段によって生成される化合物のライブラリー、すなわち、化合物多様性コンビナトリアルライブラリーを含む、天然又は合成分子のライブラリーから得られる。コンビナトリアルライブラリー、並びにそれらの生成及びスクリーニングのための方法は、当技術分野において公知であり、米国特許第５，７４１，７１３号明細書；同第５，７３４，０１８号明細書；同第５，７３１，４２３号明細書；同第５，７２１，０９９号明細書；同第５，７０８，１５３号明細書；同第５，６９８，６７３号明細書；同第５，６８８，９９７号明細書；同第５，６８８，６９６号明細書；同第５，６８４，７１１号明細書；同第５，６４１，８６２号明細書；同第５，６３９，６０３号明細書；同第５，５９３，８５３号明細書；同第５，５７４，６５６号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，５６５，３２４号明細書；同第５，５４９，９７４号明細書；同第５，５４５，５６８号明細書；同第５，５４１，０６１号明細書；同第５，５２５，７３５号明細書；同第５，４６３，５６４号明細書；同第５，４４０，０１６号明細書；同第５，４３８，１１９号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書に記載されており、これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される。
結合部位は、特異的な結合対（例えば、リガンド）のメンバーの、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合することができる。結合部位は、一価又は多価（ポリエピトープ）のものの、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合することができる。結合部位は、標的の抗原又はハプテン部分に結合することができる。結合部位は、少なくとも１つの共通のエピトープ又は決定基を共に有する単一の分子又は複数の分子の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合することができる。結合部位は、細胞（例えば、細菌細胞、植物細胞又は動物細胞）の一部の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合することができる。結合部位は、天然の環境にある標的（例えば、組織）、培養細胞又は微生物（例えば、細菌、真菌、原生動物又はウイルス）又は溶解細胞に結合することができる。結合部位は、（例えば化学的に）修飾されて１つ以上のさらなる結合部位（例えば、限定はされないが、染料（例えば、蛍光染料）、ポリペプチド修飾部分、例えば、リン酸基、炭水化物基など、又はポリヌクレオチド修飾部分、例えば、メチル基など）を提供する、標的の部分に結合することができる。結合部位は、特異的な結合対のメンバーの結合部分に結合することができる。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは特異的結合対のメンバー（例えば、リガンド）の一部の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は１価（モノエピトープ（ｍｏｎｏｅｐｉｔｏｐｉｃ））若しくは多価（ポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ））の部分の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、抗原性又はハプテン性であり得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は少なくとも１つの共通のエピトープ若しくは決定基を共有する単一の分子若しくは複数の分子の部分の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は細胞（例えば、細菌細胞、植物細胞、若しくは動物細胞）の部分の一部の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、自然な環境（例えば、組織）、培養細胞、又は微生物（例えば、細菌、真菌、原生動物、若しくはウイルス）、又は溶解細胞中のいずれかにあり得る。結合部分は、（例えば、化学的に）修飾されて、限定はされないが、色素（例えば、蛍光色素）、リン酸基、炭水化物基などのポリペプチド修飾部分、又はメチル基などのポリヌクレオチド修飾部分などの１つ以上のさらなる結合部位を提供し得る。
ある場合において、結合部位は、宿主からの試料中に見られる分子の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。結合部位は、宿主からの試料中に見られる分子の結合部分に結合することができる。ある場合において、結合部分は、宿主由来のサンプルに見られる、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。宿主由来のサンプルは、体液（例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、唾液、脳脊髄液、涙液、粘液など）を含む。サンプルは、直接調べられ得、又は結合部分をより容易に検出可能にするように前処理されてもよい。サンプルは、生物又は元生物に由来するある量の物質を含む。サンプルは、天然、組み換え、合成、又は非天然であり得る。結合部位は、細胞溶解物若しくは細胞培養培地、インビトロで翻訳された試料又は試料（例えば、細胞溶解物）からの免疫沈殿中で、細胞から自然に又は組換えによって発現される、上述のもののいずれかに結合することができる。結合部分は、細胞溶解物又は細胞培養培地、インビトロ翻訳サンプル、又はサンプル（例えば、細胞溶解物）由来の免疫沈降において、自然に又は組み換えにより細胞から発現される上記のいずれかであり得る。
ある場合において、結合部位は、無細胞系において又はインビトロで発現された標的に結合することができる。例えば、結合部位は、細胞抽出物中の標的に結合する。ある場合において、結合部位は、ＤＮＡ鋳型及び転写及び翻訳のための試薬と共に、細胞抽出物中の標的に結合する。結合部位は、無細胞系において又はインビトロで発現された標的の結合部分に結合することができる。ある場合において、標的の結合部分は、無細胞系又はインビトロで発現される。例えば、標的の結合部分は、細胞抽出物中にある。ある場合において、標的の結合部分は、ＤＮＡ鋳型、並びに転写及び翻訳用の試薬と共に細胞抽出物中にある。使用され得る細胞抽出物の例示的な供給源としては、小麦胚芽、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ウサギ網状赤血球、超好熱菌、ハイブリドーマ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）が挙げられる。標的ポリペプチドを発現させる（例えば、アレイ上に標的ポリペプチドを生成する）のに使用され得る例示的な無細胞方法としては、タンパク質インサイチュアレイ（ＰＩＳＡ）、複数スポッティング技術（ＭＩＳＴ）、自己集合ｍＲＮＡ翻訳、核酸プログラム可能タンパク質アレイ（ＮＡＰＰＡ）、ナノウェルＮＡＰＰＡ、ＤＮＡアレイからタンパク質アレイ（ＤＡＰＡ）、膜フリーＤＡＰＡ、ナノウェルコピー及びμＩＰ－マイクロインタリオプリント（ｍｉｃｒｏｉｎｔａｇｌｉｏ ｐｒｉｎｔｉｎｇ）、及びｐＭＡＣ－タンパク質マイクロアレイコピーが挙げられる（Ｋｉｌｂ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１４，１４，３５２－３６４を参照されたい）。
ある場合において、結合部位は、インサイチュで（例えば、アレイの固体基材上で）ＤＮＡ鋳型から合成される標的に結合する。結合部位は、インサイチュで合成される標的の結合部分に結合することができる。ある場合において、標的の結合部分は、ＤＮＡ鋳型からインサイチュで（例えば、並んだ固体基質上で）合成される。ある場合において、複数の結合部分は、並行して又は単一の反応において、複数の対応するＤＮＡ鋳型からインサイチュで合成される。インサイチュの標的ポリペプチド発現のための例示的な方法としては、Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ８（９）：Ｒ１７７－Ｒ１８５（２０００）；Ｋａｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：１５０－６．（２００５）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１）：４－９．（２００８）；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（５６８０）：８６－９０．（２００４）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１５）：Ｅ７３－３（２００１）；Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５（９）：１６５８－６６（２００６）；Ｔａｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４（１０）：１２５３－４（２００６）；Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６（７）：１８４４－９（２００４）；Ｋｉｎｐａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６（２）：１４９－５４（２００４）；Ｔａｋｕｌａｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（８）：４３８２－９１（２０１２）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５（２）：１７５－７（２００８）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ａｎｄ Ｊ．ＬａＢａｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７（４）：３３４－３３６（２００６）；Ｈｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ ２４（４）：３７５－８０（２００７）；及びＨｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７４（１－２）：２６５－７０（２００３）に記載されるものが挙げられる。
ある場合において、結合部位は、少なくとも６個の長さのヌクレオチド、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０又は１００個のヌクレオチドを含む核酸標的に結合する。ある場合において、結合部位は、連続的配列のヌクレオチドを含むタンパク質標的に結合する。ある場合において、結合部位は、非連続的配列のヌクレオチドを含むタンパク質標的に結合する。ある場合において、結合部位は、核酸配列中のヌクレオチドの、欠失、付加、交換（ｓｗａｐ）又は切断を含めた変異又は機能的変異の部位を含む核酸標的に結合する。結合部位は、核酸標的の結合部分に結合することができる。ある場合において、核酸標的の結合部分は、少なくとも６ヌクレオチド、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００ヌクレオチドの範囲を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、ヌクレオチドの連続した区間を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、ヌクレオチドの不連続の区間を含む。ある場合において、核酸標的の結合部分は、核酸配列中のヌクレオチドの欠失、付加、交換（ｓｗａｐ）、又は切断を含む、突然変異又は機能的突然変異の部位を含む。
ある場合において、結合部位は、少なくとも６個の長さのアミノ酸、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０又は１００個のアミノ酸を含むタンパク質標的に結合する。ある場合において、結合部位は、連続的配列のアミノ酸を含むタンパク質標的に結合する。ある場合において、結合部位は、非連続的配列のアミノ酸を含むタンパク質標的に結合する。ある場合において、結合部位は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の、欠失、付加、交換又は切断を含めた変異又は機能的変異の部位を含むタンパク質標的に結合する。結合部位は、タンパク質標的の結合部分に結合することができる。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、少なくとも６アミノ酸、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００アミノ酸の範囲を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、アミノ酸の連続した区間を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、アミノ酸の不連続の区間を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の欠失、付加、交換、又は切断を含む、突然変異又は機能的突然変異の部位を含む。
ある実施形態において、結合部分は、膜結合タンパク質のドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は一部に結合する。結合部分は、膜結合タンパク質の結合部分に結合することができる。ある実施形態において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは膜結合タンパク質の一部の上にあるか又はそれらを含む。例示的な膜結合タンパク質としては、限定はされないが、ＧＰＣＲ（例えば、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ニューロテンシン受容体、ガラニン受容体、ドーパミン受容体、オピオイド受容体、セロトニン受容体、ソマトスタチン受容体など）、イオンチャネル（例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体、ナトリウムチャネル、カリウムチャネルなど）、非興奮性及び興奮性チャネル、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリン／トレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、成長因子及びホルモン受容体（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体）並びにその他が挙げられる。結合部位は、膜結合タンパク質の変異体又は修飾されたバリアントの、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合することができる。結合部位は、膜結合タンパク質の変異体又は修飾されたバリアントの、結合部分に結合することができる。結合部分はまた、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は膜結合タンパク質の突然変異体若しくは修飾変異体の一部の上にあるか又はそれらを含み得る。例えば、ＧＰＣＲのある１つ又は複数の点突然変異は、機能を保持し、疾患に関与する（例えば、Ｓｔａｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １８：４３０－３７を参照されたい）。
結合部位は、例えば、ユビキチンリガーゼの、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。結合部位は、例えば、ユビキチンアダプター、プロテアソームアダプター又はプロテアソームタンパク質の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。結合部位は、例えば、エンドサイトーシス、食作用、リソソーム経路、オートファジー経路、マクロオートファジー、ミクロオートファジー、シャペロン介在性オートファジー、多胞体経路又はそれらの組み合わせに関与するタンパク質の、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域又は部分に結合する。
ＲＮＡ結合部位
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内在性遺伝子及び／又は外来性遺伝子の発現を調節するＲＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、宿主遺伝子の発現を調節する。ＲＮＡ結合部位は、内在性遺伝子にハイブリダイズする配列（例えば、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡのための配列）、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの外因性核酸にハイブリダイズする配列、ＲＮＡにハイブリダイズする配列、遺伝子転写に干渉する配列、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列、ＲＮＡを安定させるか若しくは分解を標的にすることなどによってＲＮＡを不安定にする配列、又はＤＮＡ－又はＲＮＡ結合因子を調節する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡに結合するアプタマー配列を含む。アプタマー配列は、内在性遺伝子（例えば、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡに対する配列）、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの外因性の核酸、ＲＮＡ、遺伝子転写を抑制する配列、ＲＮＡ翻訳を抑制する配列、ＲＮＡを安定化するか若しくはＲＮＡを不安定化する（分解のためのターゲティングを介するものなど）配列又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ結合因子を調節する配列に結合することができる。アプタマー配列の二次構造が、ＲＮＡに結合することができる。環状ＲＮＡは、ＲＮＡへのアプタマー配列の結合によってＲＮＡとの複合体を形成することができる。
ある実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡ結合部位のうちの１つであり得る。ＲＮＡ結合部位は、当業者に周知である。
特定のＲＮＡ結合部位が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害することができる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、典型的に１５～５０塩基対（約１８～２５塩基対など）を有し、且つ細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）若しくはほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を有するＲＮＡｉ分子を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定はされないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロ二本鎖（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）、及びダイサー基質（ｄｉｃｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）が挙げられる。
ある実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡ遺伝子のプロセシング経路中の中間体に類似している。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することができ、逆も同様である。ｓｉＲＮＡのようなマイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣを用いて、標的遺伝子を下方制御するが、ｓｉＲＮＡと異なり、ほとんどの動物ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを切断しない。代わりに、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制又はポリＡ除去及びｍＲＮＡ分解によってタンパク質出力を減少させる。公知のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡ ３’－ＵＴＲ内にあり；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端からのヌクレオチド２～８に対してほぼ完全な相補性を有する部位を標的にするようである。この領域は、シード領域として知られている。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、置き換え可能であるため、外因性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとのシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御することができる。３’－ＵＴＲ内の複数の標的部位は、より強い下方制御を与えることができる。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’－ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方制御する短鎖ノンコーディングＲＮＡである。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列、ｍｉＲＮＡ配列、又はｍｉＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、任意のｍｉＲＮＡに対応し得る。
ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位の領域中の配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対するワトソン・クリック相補性を有する。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８又は２～７位を含み得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、７個のヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、６個のヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。
ｍｉＲＮＡシードの塩基は、標的配列と実質的に相補性であり得る。ｍｉＲＮＡ標的配列を環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって検出され得、調節された分解、又は調節された翻訳を有し得る。このプロセスは、環状ポリリボヌクレオチド送達時のオフターゲット効果の危険を低下させる。
環状ポリリボヌクレオチドは、標的遺伝子の約５～約２５連続ヌクレオチドと同一のｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡを標的にし、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０％～７０％、約３０％～６０％、約４０％～６０％、又は約４５％～５５％のＧＣ－含量を含み、例えば標準的なＢＬＡＳＴ検索によって決定した際、それが導入されるべきである哺乳動物のゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列との高いパーセンテージの同一性を有さない。
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を調節するために、環状ポリリボヌクレオチドから出るように操作され得る（すなわち、そのような環状ポリリボヌクレオチドから除去され得る）。複数の組織における発現の調節は、導入若しくは除去又は１つ若しくはいくつかのｍｉＲＮＡ結合部位を通して行われ得る（例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位は、細胞における核酸活性を与える）。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによってタンパク質発現を調節することが知られている組織の例としては、限定はされないが、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－ｌｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられる。ＭｉＲＮＡは、血管新生（ｍｉＲ－１３２）などの複雑な生物学的プロセスも調節し得る。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドにおいて、このようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡの結合部位は、生物学的に関連する細胞型に対して又は関連する生物学的プロセスに関連して、環状ポリリボヌクレオチドからの発現を調整するために除去又は導入され得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、ｍｉＲ－７を含む。
様々な細胞型のｍｉＲＮＡの発現パターンの理解により、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、特定の細胞型で又は特定の生物学的条件下のみでのより標的化された発現のために操作され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入により、環状ポリリボヌクレオチドは、組織において又は生物学的条件に関連して最適なタンパク質発現のために設計され得る。
さらに、ｍｉＲＮＡシード部位は、環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれて、生物学的改善をもたらす、特定の細胞における発現を調節することができる。この例は、ｍｉＲ－１４２部位の組み込みである。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドへのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節し得るだけではなく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を低下させるか又はなくすこともできる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、又はそれ以上を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ヌクレオチド配列のいずれか１つ又は標的配列に対して相補的な配列との少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するｍｉＲＮＡを含む。
公知のｍｉＲＮＡ配列の一覧は、調査機関、例えば、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって維持されているデータベースにおいて見られる。ＲＮＡｉ分子は、当技術分野において公知の技術によって容易に設計及び生成され得る。さらに、コンピューターによる手段を用いて、有効及び特定の配列モチーフを決定することができる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、長鎖ノンコーディングＲＮＡを含む。長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、１００ヌクレオチドより長い非タンパク質コード転写産物を含む。より長い長さは、ｌｎｃＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及び他の短鎖ＲＮＡなどの小分子調節ＲＮＡと区別する。一般に、大部分（約７８％）のｌｎｃＲＮＡは、組織特異的であると特徴付けられる。近傍のタンパク質コード遺伝子（哺乳動物ゲノム中の全ｌｎｃＲＮＡの約２０％というかなりの割合を占める）と反対方向に転写される分岐ｌｎｃＲＮＡが、近傍の遺伝子の転写を調節し得る。
ＲＮＡ結合部位の長さは、約５～３０ヌクレオチド、約１０～３０ヌクレオチド、又は約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、若しくはそれ以上のヌクレオチドであり得る。対象とする標的とのＲＮＡ結合部位の同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％であり得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の大きい遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）結合部位を含む。ＬｉｎｃＲＮＡは、長鎖ノンコーディングＲＮＡの大部分を構成する。ＬｉｎｃＲＮＡは、ノンコーディング転写産物であり、ある実施形態において、約２００ヌクレオチドを超える長さである。ある実施形態において、ｌｉｎｃＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子と類似のエクソン－イントロン－エクソン構造を有するが、オープンリーディングフレームを包含せず、タンパク質をコードしない。ＬｉｎｃＲＮＡ発現は、コード遺伝子と比較して著しく組織特異的であり得る。ＬｉｎｃＲＮＡは、隣接するタンパク質コード遺伝子の対のものと同程度にではあるが、典型的にそれらの隣接する遺伝子と共発現される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状化ｌｉｎｃＲＮＡを含む。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のｌｉｎｃＲＮＡ、例えば、ＦＩＲＲＥ、ＬＩＮＣ００９６９、ＰＶＴ１、ＬＩＮＣ０１６０８、ＪＰＸ、ＬＩＮＣ０１５７２、ＬＩＮＣ００３５５、Ｃ１ｏｒｆ１３２、Ｃ３ｏｒｆ３５、ＲＰ１１－７３４、ＬＩＮＣ０１６０８、ＣＣ－４９９Ｂ１５．５、ＣＡＳＣ１５、ＬＩＮＣ００９３７、及びＲＰ１１－１９１を含む。
公知のｌｉｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡ配列の一覧は、調査機関、例えば、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｄｉａｍａｎｔｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、Ｇｈｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、及びＳｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって維持されているデータベースにおいて見られる。ＬｉｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡ分子は、当技術分野において公知の技術によって容易に設計及び生成され得る。さらに、コンピューターによる手段を用いて、有効及び特定の配列モチーフを決定することができる。
ＲＮＡ結合部位は、内在性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全て又はフラグメントに対して実質的に相補的又は完全に相補的である配列を含むことができる。相補的配列は、特異的な遺伝子の新たに生成された核内ＲＮＡ転写物の転写のためのｍＲＮＡへの成熟を防止するために、イントロンとエクソンとの間の境界の配列を補完することができる。相補的配列は、遺伝子に対するｍＲＮＡとハイブリダイズすることにより、その遺伝子に対して特異的であり得、その翻訳を防止することができる。ＲＮＡ結合部位は、内在性遺伝子又は遺伝子産物、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はその誘導体若しくはハイブリッドなどの全て又はフラグメントに対してアンチセンス又は実質的にアンチセンスである配列を含むことができる。
ＲＮＡ結合部位は、内在性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全て又はフラグメントに対して実質的に相補的な又は完全に相補的な配列を含み得る。相補的な配列は、イントロンとエクソンとの間の境界にある配列を補完して、転写のためのｍＲＮＡへの、特定の遺伝子の新たに生成された核ＲＮＡ転写産物の成熟を防止し得る。相補的な配列は、その遺伝子のためのｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって遺伝子に特異的であり得、その翻訳を防止し得る。ＲＮＡ結合部位は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドなどの、内在性遺伝子又は遺伝子産物の全て又はフラグメントに対してアンチセンス又は実質的にアンチセンスである配列を含み得る。
ＲＮＡ結合部位は、線状ポリリボヌクレオチドの領域に対して実質的に相補的又は完全に相補的である配列を含むことができる。相補的配列は、環状ポリリボヌクレオチドの線状ポリリボヌクレオチドへのハイブリダイゼーションのための線状ポリリボヌクレオチドの領域に対して特異的であり得る。いくつかの実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドは、細胞上の受容体などのタンパク質への結合のための領域も含む。いくつかの実施形態において、細胞受容体に結合する線状ポリリボヌクレオチドの領域は、環状ポリリボヌクレオチドとハイブリダイズされた線状ポリリボヌクレオチドの、結合後の細胞への内部移行をもたらす。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、典型的に、約５～５０００塩基対（特定のＲＮＡ構造に応じて、例えば、ｍｉＲＮＡ５～３０ｂｐ、ｌｎｃＲＮＡ２００～５００ｂｐ）のＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を有し、細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ結合部位を含む。
ＤＮＡ結合部位
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のための配列などのＤＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ配列に対する相補体を含む。ｇＲＮＡ短鎖合成ＲＮＡは、不完全なエフェクター部分に結合するのに必要な「足場」配列及びゲノム標的のためのユーザー定義の約２０ヌクレオチド標的化配列から構成される。ガイドＲＮＡ配列は、１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）の長さを有し、標的化核酸配列に対して相補的であり得る。カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用され得る。遺伝子編集は、天然ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のために標的化される配列にヌクレアーゼをガイドするため）の両方を含有する改変された（合成）単一ＲＮＡ分子であるキメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いて行われ得る。化学修飾されたｓｇＲＮＡは、ゲノム編集に有効であり得る。
ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、若しくはリプレッサーに隣接するか又はそれらの中にある配列）を認識し得る。
ある実施形態において、ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲシステムの一部である。遺伝子編集のために、環状ポリリボヌクレオチドは、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計され得る。ｇＲＮＡ配列は、ＤＮＡを切断するために、Ｃａｓ９又は他のエキソヌクレアーゼとの相互作用のために、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上のヌクレオチドを含み得、例えば、Ｃｐｆ１が、検出可能なＤＮＡ切断のために、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドと相互作用する。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡに結合することができるアプタマー配列を含む。アプタマー配列の二次構造は、ＤＮＡに結合することができる。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡへのアプタマー配列の結合によってＤＮＡとの複合体を形成する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡにおける主溝に結合する配列を含む。１つのこのような場合、環状ポリリボヌクレオチド及び二本鎖ＤＮＡによって生じる三つ組構造の特異性及び安定性は、フーグスティーン型水素結合によって得られ、これは、二本鎖ＤＮＡにおける古典的なワトソン・クリック塩基対合において形成されるものと異なる。一例において、環状ポリリボヌクレオチドは、主溝を介して標的二本鎖のプリンリッチ鎖に結合する。
ある実施形態において、三つ組形成は、標的二本鎖のプリンリッチ鎖と比べて、環状ポリリボヌクレオチドの配向によって区別される２つのモチーフにおいて起こる。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中のポリピリミジン配列区間が、平行に（すなわち、二本鎖のプリンリッチ鎖と同じ５’から３’の配向で）フーグスティーン型水素結合を介して二本鎖ＤＮＡのポリプリン配列区間に結合する一方、ポリプリン区間（Ｒ）は、逆フーグスティーン型水素結合を介して二本鎖のプリン鎖に逆平行に結合する。逆平行において、プリンモチーフは、Ｇ：Ｇ－Ｃ、Ａ：Ａ－Ｔ、又はＴ：Ａ－Ｔの三つ組を含む一方；平行において、ピリミジンモチーフは、Ｃ＋：Ｇ－Ｃ又はＴ：Ａ－Ｔ三つ組（ここで、Ｃ＋が、Ｎ３位におけるプロトン化シトシンを表す）の標準的な三つ組を含む。環状ポリリボヌクレオチド中の逆平行ＧＡ及びＧＴ配列は、中性ｐＨで安定した三つ組を形成し得る一方、環状ポリリボヌクレオチド中の平行ＣＴ配列は、酸性ｐＨで結合し得る。環状ポリリボヌクレオチド中のシトシンにおけるＮ３は、プロトン化され得る。５－メチル－ＣによるＣの置換は、５－メチル－Ｃがシトシンより高いｐＫを有するため、生理的ｐＨで、環状ポリリボヌクレオチド中のＣＴ配列の結合を可能にし得る。少なくとも１０塩基対のプリン及びピリミジンモチーフの両方について、連続したホモプリン－ホモピリミジン配列区間は、二本鎖ＤＮＡへの環状ポリリボヌクレオチドの結合を補助するが、これは、より短い三つ組は、生理的条件下で不安定であり得、配列の中断は、三つ組構造を不安定にし得るためである。ある実施形態において、三つ組形成のためのＤＮＡ二本鎖標的は、１つの鎖中に連続したプリン塩基を含む。ある実施形態において、三つ組形成のための標的は、ＤＮＡ二本鎖の１つの鎖中にホモプリン配列及び相補鎖中にホモピリミジン配列を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドを含む三つ組は、安定した構造である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドを含む三つ組は、例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上増加される、増加した半減期、例えば、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって持続性を示す。
タンパク質結合部位
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のタンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、タンパク質結合部位は、アプタマー配列を含む。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば、タンパク質結合部位、例えば、線状ＲＮＡを欠いた環状ポリリボヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主からの免疫応答を低下させるタンパク質結合部位を含む。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームに結合する１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を、環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解、又は調節された翻訳を有し得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の免疫系の構成要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクする、例えば、ＣＴＬ応答を回避するために、少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを非内在性であるものとしてマスクするのに役立つヌクレオチド配列である。
線状ＲＮＡへのリボソームのかみ合いの従来の機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端に結合するリボソームを含む。５’末端から、リボソームが開始コドンに移動すると直ちに第１のペプチド結合が形成される。本発明によれば、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳の内部の開始（すなわちキャップ非依存的）は、遊離末端又はキャップされた末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、開始コドンにおけるポリペプチド伸長を開始する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば開始コドンを含む１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列を含む。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、環状ポリリボヌクレオチドを標的にするか又はそれを特定の標的に限局する。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、２つ以上のタンパク質をごく近くに近づけるための足場として働く、それぞれが標的タンパク質と結合する１つ以上のタンパク質結合部位を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、それぞれが標的タンパク質と結合し、それにより標的タンパク質をごく近くに近づける、２つのタンパク質結合部位を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、それぞれが標的タンパク質と結合し、それにより３つの標的タンパク質をごく近くに近づける、３つのタンパク質結合部位を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、それぞれが標的タンパク質と結合し、それにより４つの標的タンパク質をごく近くに近づける、４つのタンパク質結合部位を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、それぞれが標的タンパク質と結合し、それにより５つ以上の標的タンパク質をごく近くに近づける、５つ以上のタンパク質結合部位を含む。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、同じである。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、異なる。いくつかの実施形態において、標的タンパク質をごく近くに近づけることは、タンパク質複合体の形成を促進する。例えば、本開示の環状ポリリボヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上の標的タンパク質を含む複合体の形成を促進するための足場として働くことができる。いくつかの実施形態において、２つ以上の標的タンパク質をごく近くに近づけることは、２つ以上の標的タンパク質の相互作用を促進する。いくつかの実施形態において、２つ以上の標的タンパク質をごく近くに近づけることは、酵素反応を調節、促進又は阻害する。いくつかの実施形態において、２つ以上の標的タンパク質をごく近くに近づけることは、シグナル伝達経路を調節、促進又は阻害する。
ある実施形態において、タンパク質結合部位としては、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ｐ５３、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＦＯＸ３、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１、及びＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
いくつかの実施形態において、タンパク質結合部位は、タンパク質に結合する核酸配列、例えば、転写因子、エンハンサー、リプレッサー、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ヒストン又はＤＮＡと結合する他のあらゆるタンパク質と結合することができる配列である。いくつかの実施形態において、タンパク質結合部位は、タンパク質に結合するアプタマー配列である。いくつかの実施形態において、アプタマー配列の二次構造は、タンパク質と結合する。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、アプタマー配列のタンパク質への結合によってタンパク質との複合体を形成する。
いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、小分子又はその部分にコンジュゲートされ、ここで、この小分子又はその部分は、タンパク質などの標的に結合する。小分子は、例えばクリックケミストリーにより、修飾されたヌクレオチドを介して環状ＲＮＡにコンジュゲートすることができる。タンパク質に結合することができる小分子の例としては、限定はされないが、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）、ＡＣ２２０、アファチニブ、アミノピラゾール類似体、ＡＲアンタゴニスト、ＢＩ－７２７３、ボスチニブ、セリチニブ、クロロアルカン、ダサチニブ、フォレチニブ、ゲフィチニブ、ＨＩＦ－１α誘導（Ｒ）－ヒドロキシプロリン、ＨＪＢ９７、ヒドロキシプロリンベースのリガンド、ＩＡＣＳ－７ｅ、イブルチニブ、イブルチニブ誘導体、ＪＱ１、ラパチニブ、ＬＣＬ１６１誘導体、レナリドミド、ヌトリン小分子、ＯＴＸ０１５、ＰＤＥ４阻害剤、ポマリドミド、ｒｉｐｋ２阻害剤、ＲＮ４８６、Ｓｉｒｔ２阻害剤３ｂ、ＳＮＳ－０３２、造血幹細胞因子（Ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ）、ＴＢＫ１阻害剤、サリドマイド、サリドマイド誘導体、チアゾリジンジオンベースのリガンド、ＶＨ０３２誘導体、ＶＨＬリガンド２、ＶＨＬ－１、ＶＬ－２６９及びその誘導体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、２個以上の小分子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の小分子にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、２個以上の異なる小分子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異なる小分子にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡにコンジュゲートされた２個以上の小分子は、そのそれぞれの標的タンパク質を、標的タンパク質間の相互作用及び／又は他の分子及び細胞変化をもたらすことができる近距離に動員するように構成されている。例えば、環状ＲＮＡを、ＪＱ１とサリドマイド又はその誘導体との両方にコンジュゲートすることができ、したがって、これは、ＪＱ１の標的タンパク質、例えば、ＢＥＴファミリータンパク質と、サリドマイドの標的タンパク質、例えば、Ｅ３リガーゼを動員することができる。ある場合には、ＪＱ１及びサリドマイドとコンジュゲートされた環状ＲＮＡは、ＪＱ１又はその誘導体を介してＢＥＴファミリータンパク質を動員し、ＢＥＴファミリータンパク質を、サリドマイド又はその誘導体を通して動員されるＥ３リガーゼによってユビキチンでタグ付けし、このようにして、タグ化ＢＥＴファミリータンパク質の分解をもたらす。
他の結合部位
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非ＲＮＡ又は非ＤＮＡ標的への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、結合部位は、小分子、アプタマー、脂質、炭水化物、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、又はその任意のフラグメント結合部位のうちの１つであり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、脂質への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、炭水化物への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、炭水化物への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、膜への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、多成分複合体、例えば、リボソーム、ヌクレオソーム、転写機構などへの１つ以上の結合部位を含む。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタマー配列を含む。アプタマー配列は、本明細書に記載されるあらゆる標的（例えば、核酸分子、小分子、タンパク質、炭水化物、脂質など）に結合することができる。アプタマー配列は、標的と結合することができる二次構造を有する。いくつかの実施形態において、アプタマー配列は、標的と結合することができる三次構造を有する。いくつかの実施形態において、アプタマー配列は、標的と結合することができる四次構造を有する。環状ポリリボヌクレオチドは、アプタマー配列を介して標的に結合し、複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、複合体は、少なくとも５日間、検出可能である。いくつかの実施形態において、複合体は、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日間、検出可能である。
標的
少なくとも１つの結合部位が、標的に結合することができる。少なくとも１つの結合部位は、標的に結合する少なくとも１つのアプタマー配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的のための１つ以上の結合部位を含む。標的としては、限定はされないが、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬物、フルオロフォア、代謝産物）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、小器官、細胞、他の細胞部分、そのあらゆるフラグメント及びそれらのあらゆる組み合わせが挙げられる（例えば、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：４７３－７７；Ｇｕｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（２００４）ＰＮＡＳ，１０１：８４２０－２４を参照されたい）。例えば、標的は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ（１つ以上の二本鎖領域及び１つ以上の一本鎖領域を含む）、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド、小分子、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、抗体フラグメント、抗体の混合物、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、そのあらゆるフラグメント又はそれらのあらゆる組み合わせである。
いくつかの実施形態において、標的は、ポリペプチド、タンパク質又はそのあらゆるフラグメントである。例えば、標的は、精製されたポリペプチド、単離されたポリペプチド、融合タグ化ポリペプチド、細胞若しくはウイルス若しくはビリオンの膜に付着した若しくはこれらに広がるポリペプチド、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、キナーゼ、チロシンキナーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、ホスファターゼ、アロマターゼ、ホスホジエステラーゼ、シクラーゼ、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、細胞外基質タンパク質、リガーゼ、ユビキチンリガーゼ、翻訳後修飾に影響を与えるあらゆるリガーゼ、イオン輸送体、チャネル、細孔（ｐｏｒｅ）、アポトーシスタンパク質、細胞接着タンパク質、病原性タンパク質、異常発現タンパク質、転写因子、転写調節因子、翻訳タンパク質、エピジェネティック因子、エピジェネティック調節因子、クロマチン調節因子、シャペロン、分泌タンパク質、リガンド、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、核タンパク質、受容体、膜貫通受容体、受容体型チロシンキナーゼ、Ｇタンパク質共役受容体、成長因子受容体、核内受容体、ホルモン受容体、シグナル伝達因子、抗体、膜タンパク質、内在性膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞壁タンパク質、球状タンパク質、繊維状タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、染色体タンパク質、癌原遺伝子、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、そのあらゆるフラグメント又はそれらのあらゆる組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、標的は、異種ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、標的は、トランスフェクションなどの分子技術を使用して、細胞中で過剰発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態において、標的は、組換え型ポリペプチドである。例えば、標的は、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母、哺乳動物又は昆虫細胞から生成される試料（例えば、生物によって過剰発現されるタンパク質）中にある。いくつかの実施形態において、標的は、変異、挿入、欠失又は多型を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、標的は、細胞（例えば、健康な細胞又は疾患又は条件と関連する細胞）によって自然に発現されるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、標的は、抗原、例えば、生物に免疫を与えるために又は生物における免疫応答をもたらすために、例えば抗体生成のために使用されるポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、標的は、抗体である。抗体は、別の分子の特定の空間的及び極性機構に特異的に結合することができる。抗体は、モノクローナル、ポリクローナル又は組換え抗体であり得、宿主の免疫化及び血清（ポリクローナル）の収集などの当技術分野で周知の技術により、又は連続継代性ハイブリッド細胞株を調製し、分泌タンパク質（モノクローナル）を収集することにより、又は天然の抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列若しくはその突然変異形態をクローニング及び発現させることにより調製することができる。天然起源の抗体は、ジスルフィド結合によって相互に連結される少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質であり得る。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域から構成され得る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むことができる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域を含むことができる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含むことができる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存性の高い領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高度可変領域にさらに細かく分けることができる。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へと並ぶ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され得る。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１の成分（Ｃ１ ｑ）を含めた宿主組織又は因子への、免疫グロブリンの結合を媒介することができる。抗体は、完全な免疫グロブリン又はそのフラグメントを含み得る。抗体は、あらゆるアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ｌｇＡ１及びｌｇＡ２）、サブクラス又はその修飾形態のものであり得る。抗体には、完全な免疫グロブリン又はそのフラグメントが含まれ得る。抗体フラグメントは、抗原などの結合部分に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指すことができる。さらに、特定の分子に対する結合親和性が維持される限り、免疫グロブリン又はそのフラグメントの凝集体、ポリマー及びコンジュゲートも含まれる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２本のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－４６）；並びに単離されたＣＤＲ及びＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価の分子を形成する一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：５８７９－８３を参照されたい）が挙げられる。したがって、抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂなどが挙げられる。２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別の遺伝子によってコードされるが、これらは、単一のタンパク質鎖として作製するのを可能にする人工ペプチドリンカーにより、組換え方法を使用して結合させることができる。こうした一本鎖抗体は、１つ以上の抗原結合部分を含む。抗体は、多価の抗体、例えば、二価、三価、四価、五価、六価、七価又は八価の抗体であり得る。抗体は、多特異性抗体であり得る。例えば、例えば任意の２つ以上の抗原結合剤（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＩｇＧ）の組み合わせを組換えによって結合させることにより、二重特異性、三重特異性、四重特異性、五重特異性、六重特異性、七重特異性又は八重特異性の抗体を生成することができる。多特異性抗体を使用して、２つ以上の標的、例えば、分解させるための分解機構と標的基質又はユビキチン化させるためのユビキチンリガーゼと基質を、ごく近くに近づけることができる。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用して得ることができ、また、フラグメントは、インタクト抗体と同じように、有用性についてスクリーニングすることができる。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、単離された、イヌ、ネコ、ロバ、ヒツジ、あらゆる植物、動物又は哺乳動物であり得る。
いくつかの実施形態において、標的は、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン若しくはシトシン）のポリマー形態、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。ＤＮＡには、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド標的は、一本鎖、二本鎖、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、染色体、遺伝子、ノンコーディングゲノム配列、ゲノムＤＮＡ（例えば、断片化ゲノムＤＮＡ）、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチド、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド、転写因子結合部位、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、真核生物ポリヌクレオチド、原核生物ポリヌクレオチド、合成されたポリヌクレオチド、連結されたポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、核酸類似体を含有するポリヌクレオチド、メチル化ポリヌクレオチド、脱メチル化ポリヌクレオチド、そのあらゆるフラグメント又はそれらのあらゆる組み合わせである。いくつかの実施形態において、標的は、組換えポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的は、異種のポリヌクレオチドである。例えば、標的は、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母、哺乳動物又は昆虫細胞から生成されるポリヌクレオチド（例えば、生物に対して異種のポリヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、標的は、変異、挿入、欠失又は多型を有するポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、標的は、アプタマーである。アプタマーは、高い特異性且つ親和性でタンパク質などの結合部分又は標的分子に結合する、単離された核酸分子である。アプタマーは、その所与の標的と特異的に結合するための化学的接触を提供するある種の立体構造中に保持される三次元構造である。アプタマーは、核酸ベースの分子であるが、アプタマーと、遺伝子及びｍＲＮＡなどの他の核酸分子との間には根本的な相違がある。後者では、核酸構造は、その線状の塩基配列を介して情報をコードし、したがって、この配列は、情報蓄積の機能にとって重要である。まったく対照的に、標的分子の特異的結合に基づくアプタマー機能は、保存される線状の塩基配列（ノンコーディング配列）に完全に依存するわけではなく、特定の二次／三次／四次構造に依存する。アプタマーが有し得るいかなるコーディングポテンシャルも偶発的であり、アプタマーのその同族標的への結合において役割を果たすとは考えられない。アプタマーは、ある種のタンパク質に結合する天然起源の核酸配列と区別される。これらの後者の配列は、天然起源の核酸（例えば、核酸結合タンパク質）の転写、翻訳及び輸送に関与する特殊化されたタンパク質のサブグループに結合する、生物のゲノム内に埋め込まれた天然起源の配列である。一方で、アプタマーは、非天然起源の核酸分子である。核酸結合タンパク質と結合するアプタマーを特定することができるが、大抵の場合、こうしたアプタマーは、天然の核酸結合タンパク質によって認識される配列に対する配列同一性をほとんど又は全く有さない。さらに重要なことに、アプタマーは、（核酸結合タンパク質だけでなく）実質的にあらゆるタンパク質並びに小分子、炭水化物、ペプチドなどを含めた該当するほとんどあらゆるパートナーと結合することができる。大抵のパートナーについて、タンパク質でさえ、それが結合する天然起源の核酸配列は存在しない。こうした配列を確かに有するパートナー、例えば核酸結合タンパク質については、しっかりと結合するアプタマーと比較すると比較的低い、天然に使用される結合親和性の結果として、こうした配列は、アプタマーとは異なることとなる。アプタマーは、選択されたパートナーに特異的に結合し、パートナーの活性又は結合相互作用を調節することが可能であり、例えば、結合を介して、アプタマーは、そのパートナーが機能する能力を妨げることができる。パートナーへの特異的結合の機能特性は、アプタマーに固有の特性である。アプタマーは、６～３５ｋＤａであり得る。アプタマーは、２０～５００ヌクレオチドであり得る。アプタマーは、マイクロモル濃度からナノモル濃度以下の親和性でそのパートナーと結合することができ、密接に関連する標的を区別することができる（例えば、アプタマーは、同じ遺伝子ファミリーからの関連タンパク質と選択的に結合することができる）。ある場合には、アプタマーは、１つの分子と結合するに過ぎない。ある場合には、アプタマーは、該当する分子のファミリーメンバーと結合する。アプタマーは、ある場合には、複数の異なる分子に結合する。アプタマーは、特定のパートナーと結合するために、水素結合、静電相補性、疎水性接触及び立体排除などの一般的に見られる分子間相互作用を使用することが可能である。アプタマーは、高い特異性及び親和性、低い免疫原性、生物学的有効性及び優れた薬物動態特性を含めた、治療剤及び診断剤として使用するためのいくつかの望ましい特性を有する。アプタマーは、共有結合される相補的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションから形成される分子ステム及びループ構造（例えば、ヘアピンループ構造）を含むことができる。ステムは、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドを含み、ループは、２つの相補的なポリヌクレオチドと共有結合する領域である。アプタマーは、アプタマー配列を含む線状リボ核酸（例えば、線状アプタマー）又はアプタマー配列（例えば、環状アプタマー）を含む環状ポリリボ核酸であり得る。
いくつかの実施形態において、標的は、小分子である。例えば、小分子は、大環状分子、阻害剤、薬剤又は化学的化合物であり得る。いくつかの実施形態において、小分子は、５個以下の水素結合供与体を含有する。いくつかの実施形態において、小分子は、１０個以下の水素結合受容体を含有する。いくつかの実施形態において、小分子は、５００ダルトン以下の分子量を有する。いくつかの実施形態において、小分子は、約１８０～５００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態において、小分子は、５以下のオクタノール－水分配係数ｌｏｐ Ｐを含む。いくつかの実施形態において、小分子は、－０．４～５．６の分配係数ｌｏｇ Ｐを含む。いくつかの実施形態において、小分子は、４０～１３０のモル屈折率を有する。いくつかの実施形態において、小分子は、約２０～約７０個の原子を含有する。いくつかの実施形態において、小分子は、１４０オングストローム２以下の極性表面積を有する。
いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡは、単一の標的又は複数の（例えば、２つ以上の）標的に対する結合部位を含む。一実施形態において、単一の環状ＲＮＡは、単一の標的のための、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える異なる結合部位を含む。一実施形態において、単一の環状ＲＮＡは、単一の標的のための、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える同じ結合部位を含む。一実施形態において、単一の環状ＲＮＡは、１つ以上の異なる標的のための、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える異なる結合部位を含む。一実施形態において、２つ以上標的は、標的の混合物又はライブラリーなどの試料中にあり、この試料は、２つ以上の標的に結合する２つ以上の結合部位を含む環状ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、単一の標的又は複数の（例えば、２つ以上の）標的は、複数の結合部分を有する。一実施形態において、単一の標的は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える結合部分を有することができる。一実施形態において、２つ以上標的は、標的の混合物又はライブラリーなどの試料中にあり、この試料は、２つ以上の結合部位を含む。いくつかの実施形態において、単一の標的又は複数の標的は、複数の異なる結合部分を含む。例えば、複数には、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００又は３０，０００個の結合部分が含まれ得る。
標的は、少なくとも２つの異なる結合部分を含む複数の結合部分を含むことができる。例えば、結合部分は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００又は２５，０００個の異なる結合部分を含む複数の結合部分を含むことができる。
環状ポリリボヌクレオチド要素
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）及び／又は少なくとも１つの結合部位をコードする配列を含む他に、本明細書に記載される要素の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡテールを欠いている。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製要素を欠いている。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳを欠いている。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いている。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットに開示されているあらゆる特徴又は特徴のあらゆる組み合わせを含む。
例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、上に開示されたものに加えて、１つ以上のポリペプチド又はペプチドをコードする配列を含む。いくつかの例としては、限定はされないが、蛍光タグ又はマーカー、抗原、ペプチド治療薬、天然に生物活性のあるペプチドに由来する合成の若しくは類似体のペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗菌ペプチド、孔形成ペプチド、二環式ペプチド、ターゲティング若しくは細胞毒性ペプチド、分解若しくは自壊性ペプチド及び複数の分解若しくは自壊性ペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載されるさらなる治療用タンパク質をコードする発現配列をさらに含む。調節要素のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０１５１］～［０１５３］段落に記載されている。
例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を変える配列を含む。調節要素には、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列が含まれ得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結させることができる。調節要素は、発現される産物の量を、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して増大させることができる。さらに、１つの調節要素が、タンデムに付着された複数の発現配列について、発現される産物の量を増大させることができる。したがって、１つの調節要素が、１つ以上の発現配列の発現を促進することができる。例えば、異なる発現配列の発現を差次的に調節するために、複数の調節要素を使用することもできる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される調節要素には、選択的翻訳配列が含まれ得る。本明細書で使用する場合、用語「選択的翻訳配列」は、環状ポリリボヌクレオチド、例えばある種のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始又は活性化させる核酸配列を指す。調節要素には、選択的分解配列も含まれ得る。本明細書で使用する場合、用語「選択的分解配列」は、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指す。いくつかの実施形態において、調節要素は、翻訳モジュレーターである。翻訳モジュレーターは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節することができる。翻訳モジュレーターは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。いくつかの実施形態において、翻訳開始配列は、調節要素として機能することができる。調節要素のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０１５４］～［０１６１］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）及び／又は少なくとも１つの結合部位をコードする配列を含み、且つ翻訳開始配列、例えば開始コドンを含む。いくつかの実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えばコザック配列を含む。いくつかの実施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。いくつかの実施形態において、翻訳開始配列、例えばコザック配列は、各発現配列の片側又は両側に存在し、発現産物の分離をもたらす。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。いくつかの実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドに立体構造柔軟性を与える。いくつかの実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖の領域内にある。翻訳開始配列のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０１６３］～［０１６５］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。環状ポリリボヌクレオチド内に含めるのに適したＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームと連動することが可能なＲＮＡ配列であり得る。ＩＲＥＳのさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０１６６］～［０１６８］段落に記載されている。
環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列（例えば、治療用タンパク質）を含むことができ、各発現配列は、終止要素を有していてもいなくてもよい。終止要素のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０１６９］～［０１７０］段落に記載されている。
本開示の環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含むことができる。用語「スタガー要素」は、翻訳中のリボソームの休止を誘導する、ヌクレオチド配列などの部分を指す。いくつかの実施形態において、スタガー要素は、強いαヘリックス性質を有するアミノ酸の非保存配列、それに続くコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸）である。いくつかの実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸又はそれらのあらゆる組み合わせなどの化学的部分を含むことができる。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つのスタガー要素を含む。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接するスタガー要素を含む。いくつかの実施形態において、スタガー要素は、各発現配列の片側又は両側に存在し、発現産物、例えばペプチド及び／又はポリペプチドの分離をもたらす。いくつかの実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部である。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチド上のスタガー要素によって後続の発現配列と隔てられる。いくつかの実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳からの、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの、単一のポリペプチドの生成を防止する。いくつかの実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列とは離れた配列である。いくつかの実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む。
スタガー要素のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０１７２］～［０１７５］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の調節性の核酸配列を含むか、又は調節性の核酸、例えば内在性遺伝子及び／又は外因性の遺伝子の発現を変える核酸をコードする１つ以上の発現配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される環状ポリリボヌクレオチドの発現配列は、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ及びｈｎＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡのような調節性の核酸に対してアンチセンスである配列を含むことができる。
例示的な調節性の核酸は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０１７７］～［０１９４］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率は、基準、例えば、線状同等物、線状発現配列又は線状環状ポリリボヌクレオチドより高い。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される環状ポリリボヌクレオチドは、基準の翻訳効率より少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％又はそれを超える高い翻訳効率を有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物の翻訳効率より１０％高い翻訳効率を有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物の翻訳効率より３００％高い翻訳効率を有する。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、化学量論比の発現産物を生成する。ローリングサークル型翻訳は、実質的に等しい比率で発現産物を連続して連続的に生成する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物が実質的に等しい比率で生成されるような化学量論的翻訳効率を有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複数の発現産物、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個又はそれを超える発現配列からの産物の化学量論的翻訳効率を有する。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離れることはない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。いくつかの実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくとも２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回又は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離れることはない。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの２回以上の翻訳から翻訳されたポリペプチド産物（「連続した」発現産物）の生成をもたらす。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成されるポリペプチド産物（「不連続の」発現産物）の生成をもたらす。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチドの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％（モル／モル）が不連続のポリペプチドであるように構成されている。いくつかの実施形態において、全ポリペプチドにわたる不連続の産物の量比が、インビトロ翻訳系において試験される。いくつかの実施形態において、量比の試験のために使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。いくつかの実施形態において、量比は、真核細胞若しくは原核細胞、培養細胞又は生物内の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されない。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のためのあるＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと、同じであるか、又は連続的であるか、又は重複している。いくつかの実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。いくつかの実施形態において、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えばＺＫＳＣＡＮ１である。
例示的な非翻訳領域は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０１９７］～［２０１］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含むことができる。例示的なポリＡ配列は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０２０２］～［０２０５］段落に記載されている。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のリボスイッチを含む。例示的なリボスイッチは、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０２３２］～［０２５２］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムを含む。例示的なアプタザイムは、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０２５３］～［０２５９］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することにより、遺伝子発現を下方調節する短鎖ノンコーディングＲＮＡである。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列又はマイクロＲＮＡシードを含むことができる。こうした配列は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書及び米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書に教示されるものなどの、あらゆる公知のマイクロＲＮＡに該当し得る。ＲＮＡ結合部位のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０２０６］～［０２１５］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えばリボソームがＲＮＡ配列中の内部部位に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０２１８］～［０２２１］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を低下させるか、逃れるか又は回避するためにエンクリプトゲンを含む。一態様において、本明細書で提供されるのは、細胞に送達（例えば、接触）された場合、参照化合物、例えば記載された環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いている環状ポリリボヌクレオチドによって誘発される応答と比較して、宿主による免疫応答の低下をもたらす、環状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲンを欠いている同等物より低い免疫原性を有する。
いくつかの実施形態において、エンクリプトゲンは、安定性を向上させる。核酸分子及び翻訳の安定性に関してＵＴＲが果たす調節的役割についての証拠が相次いでいる。ＵＴＲの調節性の特徴を、環状ポリリボヌクレオチドの安定性を向上させるために、エンクリプトゲンに含めることができる。
いくつかの実施形態において、５’又は３’ＵＴＲは、環状ポリリボヌクレオチド中のエンクリプトゲンを構成することができる。例えば、ＵＴＲ ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の除去又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するために有用であり得る。
いくつかの実施形態において、発現配列、例えば翻訳可能領域におけるＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の修飾の除去は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するために有用であり得る。
いくつかの実施形態において、エンクリプトゲンは、ｍｉＲＮＡ結合部位又は他のあらゆるノンコーディングＲＮＡに対する結合部位を含む。例えば、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドへのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節するだけでなく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を低下させる又は消失させることができる。
いくつかの実施形態において、エンクリプトゲンは、タンパク質、例えば免疫タンパク質がＲＮＡ配列に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。環状ポリリボヌクレオチドにタンパク質結合部位を操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系の成分から環状ポリリボヌクレオチドを隠すことにより、宿主の免疫系を逃れる若しくは宿主の免疫系による検出の低下を受けるか又は分解調節を受ける、翻訳調節を受けることができる。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を逃れるために、少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。いくつかの実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、且つ外因性のものとしての環状ポリリボヌクレオチドを隠すのを助ける、ヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態において、エンクリプトゲンは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。例示的な修飾には、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、連結しているリン酸に対する／ホスホジエステル結合に対する／ホスホジエステル骨格に対する）あらゆる修飾及び環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を防ぐ又は低下させることができるそれらのあらゆる組み合わせが含まれ得る。本明細書で提供される例示的な修飾のいくつかを、以下で詳細に説明する。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば、修飾を欠いている環状ポリリボヌクレオチドによって誘発される応答と比較して、宿主からの免疫応答を低下させるために、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む。特に、１つ以上のイノシンの付加は、ウイルスに対して、内在性のものとしてのＲＮＡを区別することが示されている。例えば、参照によりその全体が援用されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたい。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡのための１つ以上の発現配列又はｓｉＲＮＡにプロセシングされ得るＲＮＡ配列を含み、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、ＲＩＧ－Ｉを標的にし、ＲＩＧ－Ｉの発現を低下させる。ＲＩＧ－Ｉは、外来性環状ＲＮＡを感知することができ、外来性環状ＲＮＡの分解をもたらす。したがって、ＲＩＧ－ＩターゲティングｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は任意の他の調節性の核酸のための配列を有する環状ポリヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫、例えば宿主細胞免疫を低下させることができる。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドが細胞の自然免疫応答を低下させるか、逃れるか又は回避することを促進する配列、要素又は構造を欠いている。いくつかのこうした実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列、５’末端、３’末端、リン酸基、ヒドロキシル基又はそれらのあらゆる組み合わせを欠き得る。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチドの要素を、スペーサー配列又はリンカーによって互いに隔てることができる。例示的なスペーサー配列は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０２９３］～［０３０２］段落に記載されている。
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、非核酸リンカーを含むこともできる。例示的な非核酸リンカーは、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０３０３］～［０３０７］段落に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、別の核酸配列をさらに含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸を含む他の配列を含み得る。他の配列としては、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又は他のＲＮＡｉ分子をコードする、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は配列が挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと同じ遺伝子発現産物の異なる遺伝子座を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチド中に存在する遺伝子発現産物と異なる遺伝子発現産物を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ－Ａ配列を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いていることは、環状ポリリボヌクレオチドが、例えば、エキソヌクレアーゼによって分解されないか、又はエキソヌクレアーゼの非存在下と同等又は同様の限られた程度にエキソヌクレアーゼの存在下でのみ分解されることを意味し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによって分解されない。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝されたときに減少した分解を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠いている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ－Ａ配列を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列の１つ以上を含む：１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ以上の複製タンパク質をコードする配列、外来性遺伝子をコードする配列、治療薬をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレーター、例えば翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内在性遺伝子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）を標的にする１つ以上の調節核酸、及び治療用ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列。
環状ポリリボヌクレオチドは、その環状化の結果として、これを線状ＲＮＡと区別するある種の特性を含むことができる。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡと比較した場合、エキソヌクレアーゼによる分解に対する感受性がより低い。したがって、環状ポリリボヌクレオチドは、特にエキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートされた場合、線状ＲＮＡより安定であり得る。線状ＲＮＡと比較した環状ポリリボヌクレオチドの安定性増大により、環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチド（例えば、抗体応答を誘発するための抗原及び／又はエピトープ）を生成するための細胞形質転換試薬としてより有用になり得る。線状ＲＮＡと比較した環状ポリリボヌクレオチドの安定性増大により、環状ポリリボヌクレオチドが、線状ＲＮＡより容易に長期間貯蔵できるようになる。エキソヌクレアーゼで処理された環状ポリリボヌクレオチドの安定性は、ＲＮＡ分解が発生したどうかを決定する、当技術分野で標準の方法を使用して（例えば、ゲル電気泳動によって）試験することができる。
さらに、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡと異なり、その環状ポリリボヌクレオチドが、仔牛小腸由来ホスファターゼなどのホスファターゼと共にインキュベートされた場合、脱リン酸化に対する感受性がより低い可能性がある。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、特定の配列特性を含む。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、特定のヌクレオチド組成物を含むことができる。いくつかのこうした実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のプリン（アデニン又はグアノシン）リッチ領域を含むことができる。いくつかのこうした実施形態において、いくつかのこうした実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、プリンが乏しい１つ以上の領域を含むことができる。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＡＵリッチ領域又は要素（ＡＲＥ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のアデニンリッチ領域を含むことができる。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の反復要素を含むことができる。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む。
環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列に対する１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失及び共有結合修飾を含むことができる。例えば、親ポリリボヌクレオチドに対して１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失及び共有結合修飾を有する環状ポリリボヌクレオチドが、本開示の範囲内に含まれる。例示的な修飾は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０３１０］～［０３２５］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、高次構造、例えば、二次又は三次構造を含む。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの相補的セグメントは、折り畳まれて、対、例えばＡ－Ｕ及びＣ－Ｇの間の水素結合で共に結び付けられた二本鎖セグメントになる。いくつかの実施形態において、末端ループに接続された二本鎖セグメントを有する、ステムとしても公知のヘリックスが、分子内で形成される。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、二本鎖領域に対する実質的に一本の鎖を含む。いくつかの実施形態において、二本鎖に対する一本鎖の比率は、環状ポリリボヌクレオチドの官能性に影響を与える可能性がある。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、実質的に一本鎖である。いくつかの実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列には、タンパク質又はＲＮＡ結合部位が含まれ得る。いくつかの実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドは、相互作用の増大を可能にするために、立体構造的に柔軟であり得る。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、結合する又はタンパク質若しくは核酸結合を増大させるためのこうした二次構造を含めるために、目的を持って操作される。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド配列は、実質的に二本鎖である。いくつかの実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列には、立体構造認識部位、例えば、リボスイッチ又はアプタザイムが含まれ得る。いくつかの実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチドは、立体構造的に強固であり得る。いくつかのこうした場合、立体構造的に強固な配列は、環状ポリリボヌクレオチドにタンパク質又は核酸が結合されるのを立体的に妨害することができる。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、タンパク質若しくは核酸結合を回避又は低下させるためのこうした二次構造を含めるために、目的を持って操作される。
１６種の可能な塩基対合が存在するが、これらのうち、６種（ＡＵ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＵＧ、ＣＧ）が、実際の塩基対を形成することができる。残りはミスマッチと呼ばれ、ヘリックス中に非常に低い頻度で存在する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの構造は、その機能への影響及び致命的な結果なしでは容易に破壊することはできず、二次構造を維持するための選択を提供する。いくつかの実施形態において、ステムの一次構造（すなわち、そのヌクレオチド配列）は、ヘリックス領域を依然として維持しながら、変わり得る。塩基の性質は、高次構造に二次的なものであり、二次構造を保つ限り、置換が可能である。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｕリッチ若しくはＡリッチ配列又はそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、Ｕリッチ及び／又はＡリッチ配列は、三重疑似らせん構造をもたらすように配列される。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６個又はそれを超える）を有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列は、三重疑似らせん構造をもたらすように配列される。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、安定化を助ける分子内三重疑似らせん構造を有する。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、その末端の塩基対がスタッキングし、疑似らせん構造が同一線上となり、「同軸的にスタッキングされた」部分構造がもたらされるように、（例えば、ホスホジエステル結合によって隔てられた）２つの疑似らせん構造を有する。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のモチーフ、例えば、シュードノット、グアニン四重鎖、ヘリックス及び同軸的スタッキングを有する三次構造を含む。
本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドの構造のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０３２６］～［０３３３］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソームのための結合部位に適応するのに十分なサイズのものであり得る。当業者は、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズが、環状ポリリボヌクレオチドを生成する及び／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用する技術的制約の範囲内である程度の大きさであり得ることを理解することができる。理論によって制約されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントが、ＤＮＡ並びにＲＮＡの「糸」をもたらすようにアニールされたその５’及び３’遊離末端（これは、最終的に、１つの５’遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残る場合に環状化することができる）から生成することができることが可能である。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングする及び標的に送達する能力によって制限され得る。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって、少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチドの長さが有用であり得る。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、胚細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらのあらゆる組み合わせにおいて複製することが可能であるか又は複製する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含み、ここで、細胞は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ、クマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらのあらゆる組み合わせである。
安定性及び半減期
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される環状ポリリボヌクレオチドは、基準、例えば、同じヌクレオチド配列を有するが環状されていない線状ポリリボヌクレオチド（線状同等物）より増大した半減期を有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼ分解に対して実質的に抵抗性である。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己分解に対して抵抗性である。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、酵素切断部位、例えばダイサー切断部位を欠いている。本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドの安定性及び半減期のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０３０８］～［０３０９］段落に記載されている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも、線状同等物、例えば線状発現配列又は線状環状ポリリボヌクレオチドの半減期を有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より増大した半減期を有する。いくつかの実施形態において、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％又はそれを超えて増大する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間～約３０日又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、６０日間若しくはそれを超えて又はこれらの間のあらゆる時間、細胞中での半減期又は持続性を有する。ある種の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分～約７日以下又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日、５日、６日、７日以下又はこれらの間のあらゆる時間、細胞中での半減期又は持続性を有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞が分割している間、細胞中での半減期又は持続性を有する。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分割後の細胞中での半減期又は持続性を有する。ある種の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分～約３０日又は少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、６０日を超える間若しくはそれを超えて又はこれらの間のあらゆる時間、分裂細胞内での半減期又は持続性を有する。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、細胞中で存続する。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物、例えばヒトにおいて非免疫原性である。
生成の方法
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然であり、組み換え技術（例えば、ＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得られる）、化学合成又はそれらの組み合わせを用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。
ＲＮＡ環を生成するのに使用されるＤＮＡ分子が、天然の元の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾形態又は自然界で通常見られない合成ポリペプチド（例えば、複数の抗原及び／又はエピトープを含む融合タンパク質などのキメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含む得ることは、本開示の範囲内である。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーション並びにそれらの組合せなど、古典的な突然変異誘発技術及び組み換え技術を含む様々な技術を用いて修飾され得る。
環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、化学合成及び酵素的合成を含む任意の利用可能な技術に従って調製され得る。ある実施形態において、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡは、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。環状化又はコンカテマー化の機構は、限定はされないが、化学的、酵素的、スプリントライゲーション）又はリボザイム触媒方法などの方法によって行われ得る。新たに形成される５’－／３’－結合は、分子内結合又は分子間結合であり得る。
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ＆Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ＆Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
環状ポリリボヌクレオチドを合成する様々な方法は、当技術分野でも記載されている（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、米国特許第５７６６９０３号明細書、米国特許第５７１２１２８号明細書、米国特許第５４２６１８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号パンフレット及び国際公開第２０１００８４３７１号パンフレットを参照されたい）。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、精製され、例えば遊離リボ核酸、線状又はニックＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などが除去される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、当技術分野において一般的に使用される任意の公知の方法によって精製され得る。非限定的な精製方法の例としては、カラムクロマトグラフィー、ゲル排除、サイズ排除などが挙げられる。
環状化
いくつかの実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、環状化又はコンカテマー化させることができる。いくつかの実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び／又は送達の前に、インビトロで環状化させることができる。いくつかの実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で環状化させることができる。
細胞外環状化
いくつかの実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、化学的方法を使用して環状化又はコンカテマー化されて、環状ポリリボヌクレオチドを形成する。いくつかの化学的方法では、核酸（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端は、化学的に反応性の基を含み、これらは、互いに近づいた場合、分子の５’末端と３’末端との間に新たな共有結合を形成することができる。５’末端は、ＮＨＳエステル反応性の基を含有することができ、３’末端は、３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有することができ、その結果、有機溶媒中で、線状ＲＮＡ分子の３’末端上の３’－アミノ末端ヌクレオチドが、５’－ＮＨＳ－エステル部分上での求核攻撃を受けることとなり、新たな５’－／３’－アミド結合が形成される。
いくつかの実施形態において、５’－リン酸化核酸分子（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）を、核酸（例えば、線状核酸）の３’－ヒドロキシル基に酵素的に連結させて、新たなホスホロジエステル結合を形成するために、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを使用することができる。反応例では、線状環状ポリリボヌクレオチドを、製造業者のプロトコルに従って、１～１０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）と共に３７℃で１時間インキュベートする。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するための近位の５’領域と３’領域の両方と塩基対形成することが可能な線状核酸の存在下で起こり得る。いくつかの実施形態において、ライゲーションは、スプリントライゲーションである。例えば、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼのようなスプリントリガーゼを、スプリントライゲーションのために使用することができる。スプリントライゲーションについては、一本鎖ＲＮＡのような一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）を、一本鎖スプリントとのハイブリダイゼーション時に２つの末端を近接させることができるように、線状ポリリボヌクレオチドの両末端とハイブリダイズするように設計することができる。したがって、スプリントリガーゼは、線状ポリリボヌクレオチドの近接された２つの末端のライゲーションを触媒して、環状ポリリボヌクレオチドを生成することができる。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリヌクレオチドの合成に使用することができる。非限定的な例として、リガーゼは、ｃｉｒｃリガーゼ又は環状リガーゼであり得る。
いくつかの実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’又は３’末端のいずれかは、インビトロ転写中、生じた線状環状ポリリボヌクレオチドが、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端を、線状環状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートすることが可能な活性なリボザイム配列を含むように、リガーゼリボザイム配列をコードすることができる。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン型リボザイムに由来し得るか、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０～３７℃の温度で１～２４時間を要する可能性がある。
いくつかの実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの非核酸部分を使用することによって環状化又はコンカテマー化させることができる。一態様において、少なくとも１つの非核酸部分を、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化させるために、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端の近く及び／又は３’末端の近くの領域又は特徴と反応させることができる。別の態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に位置するか、又はこれらに連結されるか、又はこれらの近傍にあることができる。企図される非核酸部分は、同種又は異種であり得る。非限定的な例として、非核酸部分は、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は切断可能な結合などの結合であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、本明細書に記載されるアプタマー又は非核酸リンカーなどの、オリゴヌクレオチド又はペプチド部分であり得る。
いくつかの実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドを、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端での、又はこれらの近くの、又はこれらに連結された、原子間、分子表面間の吸引力をもたらす非核酸部分により、環状化又はコンカテマー化させることができる。非限定的な例として、１つ以上の線状環状ポリリボヌクレオチドを、分子間力又は分子内力によって環状化又はコンカテマー化させることができる。分子間力の非限定的な例としては、双極子－双極子力、双極子－誘起双極子力、誘起双極子－誘起双極子力、ファン・デル・ワールス力及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結合（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｏｎｄ）、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。
いくつかの実施形態において、線状環状は、５’末端の近く及び３’末端の近くにリボザイムＲＮＡ配列を含むことができる。リボザイムＲＮＡ配列は、この配列がリボザイムの残部に曝露された場合、ペプチドに共有結合することができる。一態様において、５’末端及び３’末端の近くでリボザイムＲＮＡ配列に共有結合されたペプチドは、互いに会合して、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化させることができる。別の態様において、５’末端及び３’末端の近くでリボザイムＲＮＡに共有結合されたペプチドは、限定はされないがタンパク質ライゲーションなどの、当技術分野において公知の様々な方法を使用するライゲーションにかけた後、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを環状化又はコンカテマー化させることができる。本発明の線状一次構築物若しくは線状ＲＮＡに使用するためのリボザイムの非限定的な例又はペプチドを組み込む及び／又は共有結合させるための方法の非網羅的な一覧は、米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、例えば５’三リン酸をＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることによって５’一リン酸に変換される、核酸の５’三リン酸を含むことができる。代わりに、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’三リン酸を５’一リン酸に変換することは、（ａ）線状環状ポリリボヌクレオチドの５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、アンタークティック（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ）ホスファターゼ、エビのアルカリホスファターゼ又は仔牛小腸由来ホスファターゼ）と接触させて、全ての三リン酸を除去することと；（ｂ）工程（ａ）の後の５’ヌクレオチドを、単一のリン酸を付加するキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）と接触させることとを含む、２工程反応によって行うことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は１００％である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約４０％である。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスプライシング要素を含む。例示的なスプライシング要素は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０２７０］～［０２７５］段落に記載されている。
他の環状化方法
いくつかの実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン内の又は隣接イントロンにわたる、反復又は非反復核酸配列を含めた、相補的配列を含むことができる。反復核酸配列は、修飾環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント中の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、ハイブリダイズされたセグメントは、内部二本鎖を形成する。いくつかの実施形態において、２つの別の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列と相補的な反復核酸配列とがハイブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセグメントは、内部二本鎖を形成する。いくつかの実施形態において、相補的配列は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端に見られる。いくつかの実施形態において、相補的配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個又はそれを超える、対合されるヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドを生成するために、環状化の化学的方法を使用することができる。こうした方法には、限定はされないが、クリックケミストリー（例えば、アルキン及びアジドに基づく方法又はクリック反応可能な塩基）、オレフィンメタセシス、ホスホロアミド酸ライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾及びそれらのあらゆる組み合わせが含まれ得る。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドを生成するために、環状化の酵素的方法を使用することができる。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレアーゼ若しくは相補体の鋳型、環状ポリリボヌクレアーゼの相補鎖又は環状ポリリボヌクレアーゼを生成するために、ライゲーション酵素、例えばＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを使用することができる。
環状ポリリボヌクレオチドの環状化は、当技術分野で公知の方法、例えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１５，４３（４）：２４５４－２４６５からの、Ｐｅｔｋｏｖｉｃ及びＭｕｌｌｅｒによる、“ＲＮＡ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”及びＲＮＡ Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８－１０２７からの、Ｍｕｌｌｅｒ及びＡｐｐｅｌによる、“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ”に記載されているものによって実現することができる。
環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードすることができる。例示的な複製要素には、ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位が含まれる。他の種類の複製要素は、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの［０２８０］～［０２８６］段落に記載されている。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、複製要素を欠いている、例えば、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を欠いている。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列及び複製要素を欠いている。
対象への投与のための組成物
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞は、対象への投与のための、様々な組成物、調製物、懸濁液又は医療機器に含めることができる。
例えば、本明細書に記載される細胞（例えば、単離された細胞）は、対象への投与のための医薬組成物中にある。本発明は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物を含む。
薬学的に許容される賦形剤は、非担体賦形剤であり得る。非担体賦形剤は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドなどの組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドなどの組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤の非限定的な例としては、溶媒、水性の溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、滑沢剤、油及びその混合物が挙げられる。非担体賦形剤は、細胞透過作用を示さない、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって承認され、且つ不活性成分データベースに列挙された、不活性成分のいずれか一つであり得る。医薬組成物は、１つ以上のさらなる活性物質、例えば治療的及び／又は予防的に活性な物質を任意選択的に含むことができる。本発明の医薬組成物は、滅菌されている及び／又はパイロジェンフリーであり得る。医薬品の製剤及び／又は製造における概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に援用される）において参照することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される医薬組成物（例えば、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞）は、非ヒト動物である対象への投与に適している、例えば、獣医学的使用に適している。この組成物を種々の動物への投与に適したものにするための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても単に通常の実験のみを用いてこうした改変を設計及び／又は実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象としては、限定はされないが、あらゆる動物、例えばヒト及び／又は他の霊長類など；商業的に関連する哺乳動物を含めた哺乳動物、例えば、ペット及び家畜、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラットなど；及び／又は商業的に関連する鳥類を含めた鳥類、例えば家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウ及び／又はシチメンチョウなど；動物園の動物、例えば、ネコ科動物；非哺乳動物、例えば、爬虫類、魚、両生類などが挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知である又は今後開発されるあらゆる方法によって調製することができる。一般に、こうした調製方法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の補助成分と組み合わせる工程と、次いで、必要ならば及び／又は望ましいならば、生成物を分割、成形及び／又は包装する工程を含む。
本明細書に記載される細胞組成物は、医薬組成物として使用又は投与することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含む。医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体又は賦形剤は、糖（例えば、スクロース、ラクトース、マンニトール、マルトース、ソルビトール若しくはフルクトース）、中性塩（例えば、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、リン酸カリウム又は酢酸ナトリウム）、酸性成分（例えば、フマル酸、マレイン酸、アジピン酸、クエン酸若しくはアスコルビン酸）、アルカリ性成分（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、メグルミン、ナトリウム若しくはカリウムの三塩基若しくは二塩基リン酸塩）又はアミノ酸（例えば、グリシン若しくはアルギニン）である。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、複数の細胞又は細胞の調製物を含み、ここで、調製物又は複数は、少なくとも１０５細胞、例えば少なくとも１０６若しくは少なくとも１０７若しくは少なくとも１０８若しくは少なくとも１０９若しくは少なくとも１０１０若しくは少なくとも１０１１細胞、例えば、５×１０５細胞～１×１０７細胞を含むか又はそれである。いくつかの実施形態において、複数は、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、標的対象のための単位用量である複数の細胞又は細胞の調製物を含む。例えば、医薬組成物は、１０５～１０９細胞／ｋｇ（標的対象）、例えば、１０６～１０８細胞／ｋｇ（対象）（例えば、それを必要とする対象などの標的対象）を含む。例えば、５０ｋｇの体重の標的対象のための単位用量は、５×１０７～２．５×１０１０細胞、例えば、５×１０７～２．５×１０９細胞、例えば、５×１０８～５×１０９細胞を含む医薬組成物であり得る。
別の例として、本明細書に記載される細胞治療のための細胞（例えば、単離された細胞）は、調製物中にある。調製物は、１×１０５～９×１０１１細胞、例えば、１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば、５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含むことができ、調製物は、対象への非経口送達のために構成され、ここで、調製物は、本明細書に記載される複数（例えば、調製物中の細胞の少なくとも１％）の細胞又は単離された細胞を含む。例えば、調製物中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば、５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。いくつかの実施形態において、調製物は、本明細書に記載される単位用量形態である。いくつかの実施形態において、送達は、注射又は注入（例えば、ＩＶ注射又は注入）である。調製物は、対象への送達（例えば、静脈内投与）のために構成された本明細書に開示される５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、調製物は、本明細書に開示される、５×１０５細胞～１×１０７細胞、５×１０５細胞～１×１０８細胞、５×１０５細胞～１×１０９細胞、５×１０５細胞～１×１０１０細胞、５×１０５細胞～１×１０１１細胞、５×１０５細胞～２×１０１１細胞、５×１０５細胞～３×１０１１細胞、５×１０５細胞～４×１０１１細胞、１×１０６細胞～１×１０７細胞、１×１０６細胞～１×１０８細胞、１×１０６細胞～１×１０９細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１１細胞、１×１０６細胞～２×１０１１細胞、１×１０６細胞～３×１０１１細胞、１×１０６細胞～４×１０１１細胞、１×１０７細胞～１×１０８細胞、１×１０７細胞～１×１０９細胞、１×１０７細胞～１×１０１０細胞、１×１０７細胞～１×１０１１細胞、１×１０７細胞～２×１０１１細胞、１×１０７細胞～３×１０１１細胞、１×１０７細胞～４×１０１１細胞、１×１０８細胞～１×１０９細胞、１×１０８細胞～１×１０１０細胞、１×１０８細胞～１×１０１１細胞、１×１０８細胞～２×１０１１細胞、１×１０８細胞～３×１０１１細胞、１×１０８細胞～４×１０１１細胞又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞を含む。いくつかの実施形態において、調製物は、注射又は注入のために構成されている。いくつかの実施形態において、調製物は、本明細書に開示される、５×１０５細胞～１×１０７細胞、５×１０５細胞～１×１０８細胞、５×１０５細胞～１×１０９細胞、５×１０５細胞～１×１０１０細胞、５×１０５細胞～１×１０１１細胞、５×１０５細胞～２×１０１１細胞、５×１０５細胞～３×１０１１細胞、５×１０５細胞～４×１０１１細胞、１×１０６細胞～１×１０７細胞、１×１０６細胞～１×１０８細胞、１×１０６細胞～１×１０９細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１１細胞、１×１０６細胞～２×１０１１細胞、１×１０６細胞～３×１０１１細胞、１×１０６細胞～４×１０１１細胞、１×１０７細胞～１×１０８細胞、１×１０７細胞～１×１０９細胞、１×１０７細胞～１×１０１０細胞、１×１０７細胞～１×１０１１細胞、１×１０７細胞～２×１０１１細胞、１×１０７細胞～３×１０１１細胞、１×１０７細胞～４×１０１１細胞、１×１０８細胞～１×１０９細胞、１×１０８細胞～１×１０１０細胞、１×１０８細胞～１×１０１１細胞、１×１０８細胞～２×１０１１細胞、１×１０８細胞～３×１０１１細胞、１×１０８細胞～４×１０１１、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞の単位用量形態である。いくつかの実施形態において、調製物は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量を含む。いくつかの実施形態において、調製物は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの用量を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞治療のための細胞は、点滴静注バッグ又は注入製品中にある。点滴静注バッグ又は他の注入製品は、懸濁液中の複数の細胞（例えば、調製物中の少なくとも１％の細胞）が、本明細書に記載されるいずれかの細胞又は単離された細胞である、単離された細胞の懸濁液を含むことができる。実施形態において、懸濁液は、１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば、５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含み、ＩＶバッグは、対象への非経口送達のために構成されている。いくつかの実施形態において、懸濁液中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば、５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＶバッグは、本明細書に記載される単位用量の細胞を含む。点滴静注バッグ又は注入製品は、対象への送達のために構成された本明細書に開示される５×１０５細胞～１×１０７細胞を含む、本明細書に記載される細胞の懸濁液を含むことができる。いくつかの実施形態において、懸濁液は、本明細書に開示される１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞の懸濁液は、本明細書に開示される、５×１０５細胞～１×１０７細胞、５×１０５細胞～１×１０８細胞、５×１０５細胞～１×１０９細胞、５×１０５細胞～１×１０１０細胞、５×１０５細胞～１×１０１１細胞、５×１０５細胞～２×１０１１細胞、５×１０５細胞～３×１０１１細胞、５×１０５細胞～４×１０１１細胞、１×１０６細胞～１×１０７細胞、１×１０６細胞～１×１０８細胞、１×１０６細胞～１×１０９細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１１細胞、１×１０６細胞～２×１０１１細胞、１×１０６細胞～３×１０１１細胞、１×１０６細胞～４×１０１１細胞、１×１０７細胞～１×１０８細胞、１×１０７細胞～１×１０９細胞、１×１０７細胞～１×１０１０細胞、１×１０７細胞～１×１０１１細胞、１×１０７細胞～２×１０１１細胞、１×１０７細胞～３×１０１１細胞、１×１０７細胞～４×１０１１細胞、１×１０８細胞～１×１０９細胞、１×１０８細胞～１×１０１０細胞、１×１０８細胞～１×１０１１細胞、１×１０８細胞～２×１０１１細胞、１×１０８細胞～３×１０１１細胞、１×１０８細胞～４×１０１１、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞を含む。いくつかの実施形態において、懸濁液は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量を含む。いくつかの実施形態において、懸濁液は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの用量を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞治療のための細胞（例えば、単離された細胞）は、医療機器中にある。医療機器は、複数の細胞、例えば、１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば、５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含むことができ、医療機器は、対象への植込みのために構成されており、ここで、医療機器中の少なくとも４０％の細胞は、本明細書に記載される細胞又は単離された細胞である。例えば、医療機器中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば、５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。医療機器は、対象への植込みのために構成された、本明細書に開示される細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、医療機器は、本明細書に開示される５×１０５細胞～１×１０７細胞を含む。いくつかの実施形態において、医療機器は、本明細書に開示される１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含む。いくつかの実施形態において、医療機器は、本明細書に開示される、５×１０５細胞～１×１０７細胞、５×１０５細胞～１×１０８細胞、５×１０５細胞～１×１０９細胞、５×１０５細胞～１×１０１０細胞、５×１０５細胞～１×１０１１細胞、５×１０５細胞～２×１０１１細胞、５×１０５細胞～３×１０１１細胞、５×１０５細胞～４×１０１１細胞、１×１０６細胞～１×１０７細胞、１×１０６細胞～１×１０８細胞、１×１０６細胞～１×１０９細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１１細胞、１×１０６細胞～２×１０１１細胞、１×１０６細胞～３×１０１１細胞、１×１０６細胞～４×１０１１細胞、１×１０７細胞～１×１０８細胞、１×１０７細胞～１×１０９細胞、１×１０７細胞～１×１０１０細胞、１×１０７細胞～１×１０１１細胞、１×１０７細胞～２×１０１１細胞、１×１０７細胞～３×１０１１細胞、１×１０７細胞～４×１０１１細胞、１×１０８細胞～１×１０９細胞、１×１０８細胞～１×１０１０細胞、１×１０８細胞～１×１０１１細胞、１×１０８細胞～２×１０１１細胞、１×１０８細胞～３×１０１１細胞、１×１０８細胞～４×１０１１、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞を含む。いくつかの実施形態において、医療機器は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量を含む。いくつかの実施形態において、医療機器は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの用量を含む。いくつかの実施形態において、医療機器は、対象に植込まれた場合に複数の細胞を生成及び放出するように構成されている。いくつかの実施形態において、医療機器は、対象に植込まれた場合にタンパク質（例えば、分泌タンパク質又は切断可能タンパク質）を生成及び放出するように構成されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞治療のための細胞（例えば、単離された細胞）は、生体適合性マトリックス中にある。生体適合性マトリックスは、複数の細胞を含むことができ、ここで、生体適合性マトリックスは、対象への植込みのために構成されている。生体適合性マトリックスは、１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば、５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含むことができ、ここで、生体適合性マトリックス中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば、５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。例えば、生体適合性マトリックスは、Ａｆｉｂｒｏｍｅｒ（商標）マトリックスである。例えば、生体適合性マトリックスは、参照により本明細書に援用されるＢｏｓｅ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ．２０２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０２０－０５３８－５に記載されているものであり得る。生体適合性マトリックスは、対象への植込みのために構成された、本明細書に開示される細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、生体適合性マトリックスは、本明細書に開示される５×１０５細胞～１×１０７細胞を含む。いくつかの実施形態において、生体適合性マトリックスは、本明細書に開示される１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含む。いくつかの実施形態において、生体適合性マトリックスは、本明細書に開示される、５×１０５細胞～１×１０７細胞、５×１０５細胞～１×１０８細胞、５×１０５細胞～１×１０９細胞、５×１０５細胞～１×１０１０細胞、５×１０５細胞～１×１０１１細胞、５×１０５細胞～２×１０１１細胞、５×１０５細胞～３×１０１１細胞、５×１０５細胞～４×１０１１細胞、１×１０６細胞～１×１０７細胞、１×１０６細胞～１×１０８細胞、１×１０６細胞～１×１０９細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１１細胞、１×１０６細胞～２×１０１１細胞、１×１０６細胞～３×１０１１細胞、１×１０６細胞～４×１０１１細胞、１×１０７細胞～１×１０８細胞、１×１０７細胞～１×１０９細胞、１×１０７細胞～１×１０１０細胞、１×１０７細胞～１×１０１１細胞、１×１０７細胞～２×１０１１細胞、１×１０７細胞～３×１０１１細胞、１×１０７細胞～４×１０１１細胞、１×１０８細胞～１×１０９細胞、１×１０８細胞～１×１０１０細胞、１×１０８細胞～１×１０１１細胞、１×１０８細胞～２×１０１１細胞、１×１０８細胞～３×１０１１細胞、１×１０８細胞～４×１０１１、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞を含む。いくつかの実施形態において、生体適合性マトリックスは、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量を含む。いくつかの実施形態において、生体適合性マトリックスは、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの用量を含む。いくつかの実施形態において、生体適合性マトリックスは、対象に植込まれた場合に複数の細胞を生成及び放出するように構成されている。いくつかの実施形態において、生体適合性マトリックスは、対象に植込まれた場合にタンパク質（例えば、分泌タンパク質又は切断可能タンパク質）を生成及び放出するように構成されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞治療のための細胞（例えば、単離された細胞）は、対象への投与の前に、バイオリアクター中にある。バイオリアクターは、複数の細胞、例えば、１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば、５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞を含むことができ、ここで、バイオリアクター中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば、５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。バイオリアクターは、培養液中に、本明細書に記載される細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、二次元細胞培養を含む。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、三次元細胞培養を含む。いくつかの実施形態において、バイオリアクターからの細胞は、対象への投与のための医薬組成物中にあり、医薬組成物は、本明細書に開示される、５×１０５細胞～１×１０７細胞、５×１０５細胞～１×１０８細胞、５×１０５細胞～１×１０９細胞、５×１０５細胞～１×１０１０細胞、５×１０５細胞～１×１０１１細胞、５×１０５細胞～２×１０１１細胞、５×１０５細胞～３×１０１１細胞、５×１０５細胞～４×１０１１細胞、１×１０６細胞～１×１０７細胞、１×１０６細胞～１×１０８細胞、１×１０６細胞～１×１０９細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１１細胞、１×１０６細胞～２×１０１１細胞、１×１０６細胞～３×１０１１細胞、１×１０６細胞～４×１０１１細胞、１×１０７細胞～１×１０８細胞、１×１０７細胞～１×１０９細胞、１×１０７細胞～１×１０１０細胞、１×１０７細胞～１×１０１１細胞、１×１０７細胞～２×１０１１細胞、１×１０７細胞～３×１０１１細胞、１×１０７細胞～４×１０１１細胞、１×１０８細胞～１×１０９細胞、１×１０８細胞～１×１０１０細胞、１×１０８細胞～１×１０１１細胞、１×１０８細胞～２×１０１１細胞、１×１０８細胞～３×１０１１細胞、１×１０８細胞～４×１０１１、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞を含む。いくつかの実施形態において、バイオリアクターからの細胞は、対象への投与のための医薬組成物中にあり、医薬組成物は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量を含む。いくつかの実施形態において、バイオリアクターからの細胞は、対象への投与のための医薬組成物中にあり、医薬組成物は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの用量を含む。
いくつかの実施形態において、細胞治療のための細胞は、タンパク質及び／環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１つの結合部位と関連する表現型又は遺伝子型を呈する細胞である。例えば、細胞は、タンパク質（例えば、ＣＡＲ）を発現するか、環状ポリリボヌクレオチドの結合部位への結合による細胞中の標的隔離に起因して薬物に対して感作されるか、又は細胞は、編集細胞である。例えば、本明細書に記載される細胞は、細胞中で核酸を編集することが可能であるヌクレアーゼをコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、単離された細胞又は複数の単離された細胞の核酸を編集する方法は、単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供することと、単離された細胞又は複数の単離された細胞を、ヌクレアーゼをコードする及び／又はガイド核酸を含む環状ポリリボヌクレオチドに接触させることとを含み、それにより対象への投与のための編集細胞又は複数の編集細胞を生成する。ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ又はＣａｓタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１４タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、標的配列を編集し、ここで、標的配列は、単離された細胞中にある。いくつかの実施形態において、ガイド核酸は、標的配列に対して相補的である配列を有する第１の領域と、ヌクレアーゼとハイブリダイズする第２の領域とを含む。単離された細胞又は複数の単離された細胞は、本明細書に記載されるあらゆる細胞であり得る。いくつかの実施形態において、この方法は、編集細胞又は複数の編集細胞を、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、編集細胞又は複数の編集細胞を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、本明細書に開示される５×１０５細胞～１×１０７細胞、５×１０５細胞～１×１０８細胞、５×１０５細胞～１×１０９細胞、５×１０５細胞～１×１０１０細胞、５×１０５細胞～１×１０１１細胞、５×１０５細胞～２×１０１１細胞、５×１０５細胞～３×１０１１細胞、５×１０５細胞～４×１０１１細胞、１×１０６細胞～１×１０７細胞、１×１０６細胞～１×１０８細胞、１×１０６細胞～１×１０９細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１１細胞、１×１０６細胞～２×１０１１細胞、１×１０６細胞～３×１０１１細胞、１×１０６細胞～４×１０１１細胞、１×１０７細胞～１×１０８細胞、１×１０７細胞～１×１０９細胞、１×１０７細胞～１×１０１０細胞、１×１０７細胞～１×１０１１細胞、１×１０７細胞～２×１０１１細胞、１×１０７細胞～３×１０１１細胞、１×１０７細胞～４×１０１１細胞、１×１０８細胞～１×１０９細胞、１×１０８細胞～１×１０１０細胞、１×１０８細胞～１×１０１１細胞、１×１０８細胞～２×１０１１細胞、１×１０８細胞～３×１０１１細胞、１×１０８細胞～４×１０１１、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞の用量の複数の編集細胞を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの用量の複数の編集細胞を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、２つの後続の用量において５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの用量の複数の編集細胞を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、２つの後続の用量は、少なくとも約２８日、３５日、４２日若しくは６０日又はこれらの間のあらゆる日数の間隔を空けて投与される。別の例として、本明細書に記載される細胞は、細胞中で初期化を行う（例えば、人工多能性幹細胞を生成するために初期化を行う）ことが可能である、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ又はそれらの組み合わせなどの転写因子をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、単離された細胞又は複数の単離された細胞の核酸を初期化する方法は、単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供することと、単離された細胞又は複数の単離された細胞を、転写因子をコードする環状ポリリボヌクレオチドに接触させることとを含み、それにより対象への投与のための初期化された細胞又は複数の初期化された細胞を生成する。転写因子は、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２又はｃＭｙｃであり得る。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の転写因子をコードする。いくつかの実施形態において、転写因子は、別の環状ポリリボヌクレオチドよってそれぞれコードされ、これらの環状ポリリボヌクレオチド（例えば、複数の環状ポリリボヌクレオチド）を、単離された細胞又は複数の単離された細胞と接触させる。単離された細胞又は複数の単離された細胞は、本明細書に記載されるあらゆる細胞であり得る。いくつかの実施形態において、この方法は、初期化された細胞又は複数の初期化された細胞を、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、初期化された細胞又は複数の初期化された細胞を、対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、初期化された細胞又は複数の分化された細胞を、細胞型（例えば、β細胞、造血幹細胞など）に分化させて、分化された細胞又は複数の分化された細胞を生成することと、次いで、分化された細胞又は複数の分化された細胞を対象に投与することとをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、本明細書に開示される５×１０５細胞～１×１０７細胞、５×１０５細胞～１×１０８細胞、５×１０５細胞～１×１０９細胞、５×１０５細胞～１×１０１０細胞、５×１０５細胞～１×１０１１細胞、５×１０５細胞～２×１０１１細胞、５×１０５細胞～３×１０１１細胞、５×１０５細胞～４×１０１１細胞、１×１０６細胞～１×１０７細胞、１×１０６細胞～１×１０８細胞、１×１０６細胞～１×１０９細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１１細胞、１×１０６細胞～２×１０１１細胞、１×１０６細胞～３×１０１１細胞、１×１０６細胞～４×１０１１細胞、１×１０７細胞～１×１０８細胞、１×１０７細胞～１×１０９細胞、１×１０７細胞～１×１０１０細胞、１×１０７細胞～１×１０１１細胞、１×１０７細胞～２×１０１１細胞、１×１０７細胞～３×１０１１細胞、１×１０７細胞～４×１０１１細胞、１×１０８細胞～１×１０９細胞、１×１０８細胞～１×１０１０細胞、１×１０８細胞～１×１０１１細胞、１×１０８細胞～２×１０１１細胞、１×１０８細胞～３×１０１１細胞、１×１０８細胞～４×１０１１、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞の用量の複数の初期化された細胞又は複数の分化された細胞を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの用量の複数の初期化された細胞又は複数の分化された細胞を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、２つの後続の用量において５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの用量の複数の編集細胞を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、２つの後続の用量は、少なくとも約２８日、３５日、４２日若しくは６０日又はこれらの間のあらゆる日数の間隔である。対象は、本明細書に記載されるあらゆる対象であり得る。
細胞治療を生成及び投与する方法
細胞治療のための細胞は、本明細書に記載される単離された細胞又は複数の単離された細胞を、本明細書に記載される複数の環状ポリリボヌクレオチドに、環状ポリリボヌクレオチドが単離された細胞又は複数に内部移行される条件下で接触させることによって生成することができる。いくつかの実施形態において、細胞を生成する方法は、本明細書に記載される単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供することと、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを提供することと、環状ポリリボヌクレオチドを、単離された細胞又は複数の単離された細胞に接触させることとを含む。いくつかの実施形態において、細胞又は複数の細胞を生成する方法は、単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供することと；本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの調製物を提供することと、この環状ポリリボヌクレオチドを、環状ポリリボヌクレオチドを発現することが可能である単離された細胞又は複数の単離された細胞に接触させることとを含む。いくつかの実施形態において、細胞に接触される環状ポリリボヌクレオチドの調製物は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ又は２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態において、細胞に接触される環状ポリリボヌクレオチドの調製物は、環状ポリリボヌクレオチドの調製物（例えば、医薬調製物）中の総リボヌクレオチド分子に対して少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態において、調製物中の総リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ）は、環状ポリリボヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態において、接触後の、単離された細胞又は複数の単離された細胞の生存率は、正規化された接触されていない単離された細胞又は複数の正規化された接触されていない単離された細胞と比較して、少なくとも４０％である。いくつかの実施形態において、この方法は、接触後の細胞又は複数の細胞を対象に投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、単離された細胞又は複数の単離された細胞の生存率は、正規化された接触されていない単離された細胞又は複数の正規化された接触されていない単離された細胞と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％である。いくつかの実施形態において、移植のための細胞又は複数の細胞を生成する方法は、移植のための組織又は器官中の細胞又は複数の細胞を提供することと、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを提供することと、その環状ポリリボヌクレオチドを、移植のための組織又は器官中の細胞又は複数の細胞に接触させ、それにより移植のための細胞又は複数の細胞を生成することとを含む。いくつかの実施形態において、移植のための組織又は器官は、対象から取り出される。例えば、接触前に、外科的に取り出される。いくつかの実施形態において、接触後、この方法は、移植のための細胞又は複数の細胞を、対象に移植することを含む。いくつかの実施形態において、移植のための組織又は器官は、ある対象から取り出され、その対象に移植して戻される。いくつかの実施形態において、移植のための組織又は器官は、ある対象から取り出され、別の対象に移植される。
いくつかの実施形態において、細胞治療のための細胞は、対象における非経口投与のために、例えば、注入製品又は注射製品として、（例えば、医療機器中で）構成されている又はこれに適している。注入製品を製造する方法は、複数の細胞から、ある細胞型を濃縮することと、その細胞型を増加させることと、その細胞型の複数の細胞を、環状ポリリボヌクレオチドを複数の細胞に内部移行させるのに十分な複数の環状ポリリボヌクレオチド（ここで、複数の環状ポリリボヌクレオチドは、細胞に少なくとも１つの治療特性を与えるタンパク質をコードする少なくとも１つの発現配列、細胞に少なくとも１つの治療特性を与える少なくとも１つの結合部位又はそれらの組み合わせを含む）に接触させることと、接触された複数の細胞を注入製品として提供することとを含むことができる。注射製品を製造する方法は、複数の細胞から、ある細胞型を濃縮することと、その細胞型を増加させることと、その細胞型の複数の細胞を、環状ポリリボヌクレオチドを複数の細胞に内部移行させるのに十分な複数の環状ポリリボヌクレオチド（ここで、複数の環状ポリリボヌクレオチドは、細胞に少なくとも１つの治療特性を与えるタンパク質をコードする少なくとも１つの発現配列、細胞に少なくとも１つの治療特性を与える少なくとも１つの結合部位又はそれらの組み合わせを含む）に接触させることと、接触された複数の細胞を注射製品として提供することとを含むことができる。いくつかの実施形態において、注射製品を製造する方法は、単離された細胞を増加させて、複数の単離された細胞を生成することと、この複数の単離された細胞を、複数の環状ポリリボヌクレオチド（ここで、複数の環状ポリリボヌクレオチドは、細胞に少なくとも１つの治療特性を与えるタンパク質をコードする少なくとも１つの発現配列、細胞に少なくとも１つの治療特性を与える少なくとも１つの結合部位又はそれらの組み合わせを含む）に接触させることと、接触された複数の細胞を注射製品として提供することとを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位の治療特性は、単離された細胞において、核酸活性を与える（例えば、少なくとも１つの結合部位は、ｍｉＲＮＡを含む細胞における核酸分解をもたらすｍｉＲＮＡ結合部位である）。
次いで、細胞治療のための生成された細胞を、それを必要とする対象に、細胞治療として投与することができる。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ある期間の後、（例えば、分解又は複製の欠如によって）生成された細胞中に存在せず、この生成された細胞は、対象に投与される。例えば、調製物中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば、５０～７０％の生成された細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞である。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、生成された細胞中に存在し、この生成された細胞は、対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞治療は、環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含む。いくつかの態様において、細胞治療は、細胞を含み、ここで、この細胞は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む。細胞治療は、それを必要とする対象を治療する方法として又は治療の方法として使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞治療の方法は、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドを提供することと、この環状ポリリボヌクレオチドをエクスビボ細胞（例えば、単離された細胞）に接触させることとを含む。いくつかの実施形態において、細胞治療の方法は、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドを含む本明細書に開示される細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、それを必要とする対象を治療する方法は、本明細書に開示される細胞を提供することと、エクスビボでこの細胞（例えば、単離された細胞）を、１つ以上の発現配列（ここで、この１つ以上の発現配列の発現産物は、対象を治療するためのタンパク質を含む）を含む本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、治療の方法は、本明細書に開示される細胞を提供することと、エクスビボでこの細胞（例えば、単離された細胞）を、１つ以上の発現配列（ここで、この１つ以上の発現配列の少なくとも１つは、それを必要とする対象を治療するためのタンパク質をコードする）を含む本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドに接触させることを含む。さらなる実施形態において、細胞は、接触後、それを必要とする対象に投与される。
接触
いくつかの実施形態において、接触は、本明細書に記載される単離された細胞又は複数の単離された細胞を、本明細書に記載される複数の環状ポリリボヌクレオチドに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、接触は、エクスビボで細胞（例えば、単離された細胞）を、環状ポリリボヌクレオチドに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、接触は、エクスビボで細胞（例えば、単離された細胞）を、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドを細胞に内部移行させるのに十分な方式で、環状ポリリボヌクレオチドに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、接触させることは、カチオン性脂質、電気穿孔、ネイキッド環状ＲＮＡ、アプタマー、カチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ポリブレン、ＤＥＡＥ－デキストラン）、ウイルス様粒子（例えば、ＨＰＶ由来のＬ１、ポリオーマウイルス由来のＶＰ１）、エキソソーム；ナノ構造化リン酸カルシウム；ペプチド形質導入ドメイン（例えば、ＴＡＴ、ｐｏｌｙＲ、ＳＰ、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ１など）；エキソソーム；小胞（例えば、ＶＳＶ－Ｇ、ＴＡＭＥＬ）；細胞スクイージング；ナノ粒子；マグネトフェクション；又はそれらのあらゆる組み合わせ；又は細胞に生体分子を内部移行させるあらゆる方法を使用することを含む。
いくつかの実施形態において、接触後の細胞の生存率は、正規化された接触されていない細胞と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％である
環状ポリリボヌクレオチドは、接触後に細胞中で存続することができる。環状ポリリボヌクレオチドは、接触後、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１２日、少なくとも約１４日、少なくとも約１６日、少なくとも約１８日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約４０日又は少なくとも約５０日間、存続することができる。環状ポリリボヌクレオチドは、接触後、１日～２日、２日～３日、３日～４日、４日～５日、５日～６日、６日～７日、７日～８日、８日～９日、９日～１０日、１０日～１２日、１２日～１４日、１４日～１６日、１６日～１８日、１８日～２０日、２０日～２５日、２５日～３０日、３０日～４０日、４０日～５０日、１日～１４日、１日～３０日、７日～１４日、７日～３０日又は１４日～３０日
間、存続することができる。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％は、接触後、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、細胞中で存続する。
いくつかの実施形態において、存続することは、接触の直後のポリリボヌクレオチドの量と比較した場合、ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％を維持することを含む。いくつかの実施形態において、存続することは、接触の直後のポリリボヌクレオチドの量と比較した場合、ポリリボヌクレオチドの量の１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％又は６０％～９８％を維持することを含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の発現配列は、ある量の、全ポリペプチドと比較した場合に不連続のポリペプチドを生成し、ここで、この量は、ポリペプチドのモルによるポリペプチドの総量の、あるパーセントである。ポリペプチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成させることができる。不連続のポリペプチドのそれぞれは、単一の発現配列から生成することができる。いくつかの実施形態において、不連続のポリペプチドの量は、全ポリペプチドの、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％又は少なくとも９８％（モル／モル）である。いくつかの実施形態において、不連続のポリペプチドの量は、全ポリペプチドの、１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％又は６０％～９８％（モル／モル）である。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチド同等物より多い量の発現産物を生成する発現配列を含む。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、線状ポリリボヌクレオチド同等物の量より、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍又は少なくとも２５倍多い。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、線状ポリリボヌクレオチド同等物の量より、１．５倍～１．６倍、１．６倍～１．７倍、１．７倍～１．８倍、１．８倍～１．９倍、１．９倍～２倍、２倍～２．５倍、２．５倍～３倍、３倍～３．５倍、３．５倍～４倍、４倍～４．５倍、４．５倍～５倍、５倍～６倍、６倍～７倍、７倍～８倍、８倍～９倍、９倍～１０倍、１０倍～１５倍、１５倍～２０倍、２０倍～２５倍、２倍～５倍、２倍～６倍、２倍～７倍、２倍～１０倍、２倍～２０倍、４倍～５倍、４倍～６倍、４倍～７倍、４倍～１０倍、４倍～２０倍、５倍～６倍、５倍～７倍、５倍～１０倍、５倍～２０倍又は１０倍～２０倍多い。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、接触後、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１２日、少なくとも約１４日、少なくとも約１６日、少なくとも約１８日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約４０日又は少なくとも約５０日間、細胞中で生成される。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、接触後、１日～２日、２日～３日、３日～４日、４日～５日、５日～６日、６日～７日、７日～８日、８日～９日、９日～１０日、１０日～１２日、１２日～１４日、１４日～１６日、１６日～１８日、１８日～２０日、２０日～２５日、２５日～３０日、３０日～４０日、４０日～５０日、１日～１４日、１日～３０日、７日～１４日、７日～３０日又は１４日～３０日間、細胞中で生成される。
環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を発現することができ、ここで、１つ以上の発現配列の発現レベルは、接触後、ある期間にわたって維持される。いくつかの実施形態において、発現は、その期間にわたって、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％より大きく変化しないレベルに維持される。いくつかの実施形態において、発現は、その期間にわたって、５％～１０％、１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％又は６０％～９８％より大きく変化しないレベルに維持される。いくつかの実施形態において、発現が維持される期間は、接触後、最大１日、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１２日、少なくとも約１４日、少なくとも約１６日、少なくとも約１８日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約４０日又は少なくとも約５０日である。いくつかの実施形態において、発現が維持される期間は、接触後、１日～２日、２日～３日、３日～４日、４日～５日、５日～６日、６日～７日、７日～８日、８日～９日、９日～１０日、１０日～１２日、１２日～１４日、１４日～１６日、１６日～１８日、１８日～２０日、２０日～２５日、２５日～３０日、３０日～４０日、４０日～５０日、１日～１４日、１日～３０日、７日～１４日、７日～３０日又は１４日～３０日である。いくつかの実施形態において、この期間は、投与の１日後に開始する。
いくつかの実施形態において、発現は、その期間にわたって、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％より大きく低下することはない。いくつかの実施形態において、その期間は、接触の１日後である。いくつかの実施形態において、発現は、その期間にわたって、５％～１０％、１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％又は６０％～９８％より大きく低下することはない。いくつかの実施形態において、その期間は、接触の１日後である。
いくつかの実施形態において、１つ以上の発現配列は、接触後、細胞中で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、細胞中で線状同等物より少なくとも１．５倍多い発現産物を生成する。いくつかの実施形態において、細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多く変化することはないレベルに維持される。いくつかの実施形態において、維持される発現のレベルは、接触の１日後の発現のレベルである。いくつかの実施形態において、維持される発現のレベルは、接触の１日後の最も高い発現のレベルである。いくつかの実施形態において、細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたって、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない。いくつかの実施形態において、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない発現のレベルは、接触の１日後の発現のレベルである。いくつかの実施形態において、発現のレベルは、細胞を環状ポリリボヌクレオチドと接触させた１日後の最も高い発現のレベルと比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない。
翻訳後、タンパク質は、細胞中で（例えば、細胞の膜内も含まれる）又は細胞外で（例えば、分泌タンパク質として）検出することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、接触後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、６０日以上の期間にわたって、細胞中で検出される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、接触後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、６０日以上の期間にわたって、細胞の表面上に検出される。いくつかの実施形態において、分泌タンパク質が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、６０日以上の期間にわたって検出される。いくつかの実施形態において、その期間は、細胞を、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドと接触させた１日後に開始する。タンパク質は、タンパク質検出のための当技術分野で公知の任意の技術を使用して、例えばフローサイトメトリーによって検出することができる。
環状ポリリボヌクレオチド組成物
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを、本明細書に記載される細胞を接触させるための組成物に含めることができる。この組成物は、医薬組成物であり得る。医薬組成物は、いずれの担体も含まなくてもよい。医薬組成物は、担体を含むことができる。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はその医薬組成物は、ネイキッド送達製剤として細胞（例えば、単離された細胞）に（例えば、接触させることによって）送達される。ネイキッド送達製剤は、担体の助けを借りず、且つ共有結合修飾又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入を用いずに、環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達する。
ネイキッド送達製剤は、担体を含まない製剤であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を助ける部分と結合する共有結合修飾を有しないか、又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入を用いない。いくつかの実施形態において、細胞への送達を助ける部分に結合される共有結合修飾を有しない環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を助けるタンパク質、小分子、粒子、ポリマー又はバイオポリマーに共有結合されない。細胞への送達を助ける部分に結合されない非修飾環状ポリリボヌクレオチドは、修飾リン酸基を含有しない可能性がある。例えば、細胞への送達を助ける部分に結合されない環状ポリリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎａｔｅ）、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミド酸、ホスホロジアミド酸、ホスホン酸アルキル若しくはアリール又はホスホトリエステルを含有しない可能性がある。
いくつかの実施形態において、ネイキッド送達製剤は、トランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体又はタンパク質担体のうちのいずれか又は全てを含まなくてもよい。例えば、ネイキッド送達製剤は、オクテニルコハク酸フィトグリコーゲン（ｐｈｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ ｏｃｔｅｎｙｌ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリン、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－ｂ－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリメタクリル酸（２－ジメチルアミノ）エチル、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、塩化Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、塩化１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウム（ＤＯＴＩＭ）、トリフルオロ酢酸２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、臭化Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、臭化Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、塩化Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）又はグロブリンを含まなくてもよい。
ネイキッド送達製剤は、非担体賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、非担体賦形剤は、不活性成分を含むことができる。いくつかの実施形態において、非担体賦形剤は、緩衝液、例えばＰＢＳを含むことができる。いくつかの実施形態において、非担体賦形剤は、溶媒、非水性溶媒、希釈剤、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、滑沢剤又は油であり得る。
いくつかの実施形態において、ネイキッド送達製剤は、希釈剤を含むことができる。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。いくつかの実施形態において、希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液又は等張剤であり得る。ＲＮＡ可溶化剤の例としては、水、エタノール、メタノール、アセトン、ホルムアミド及び２－プロパノールが挙げられる。緩衝液の例としては、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス－トリス、２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス、トリシン、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ビシン又はリン酸塩が挙げられる。等張剤の例としては、グリセリン、マンニトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース又はスクロースが挙げられる。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はその医薬組成物は、担体を用いて、細胞（例えば、単離された細胞）に送達することができる。本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、医薬担体などの担体、例えば、膜、脂質二重層及び／又はポリマー担体、例えばリポソーム又は粒子、例えばナノ粒子、例えば脂質ナノ粒子を含むように製剤化し、環状ポリリボヌクレオチドの部分的又は完全な封入を介するものなどの公知の方法により、それを必要とする対象（例えば、ヒト又は非ヒト農業用動物又は家畜、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に使用するための細胞に送達することができる。こうした方法としては、限定はされないが、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）；ウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、ｆｕｇｅｎｅ、プロトプラスト融合、エキソソーム媒介性移動、脂質ナノ粒子媒介性移動及びそれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。タンパク質のカチオン性脂質媒介性送達は、インビトロ及びインビボでの効率的なタンパク質ベースのゲノム編集を可能にする。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０。送達の方法は、例えば、Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５、２６（７）：４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．にも記載されている。
送達のさらなる方法には、電気穿孔（例えば、フローエレクトロポレーション装置を使用する）又は他の膜破壊の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、マイクロインジェクション、微粒子銃（「遺伝子銃」）、直接音波負荷、細胞スクイージング、光学的トランスフェクション、インペールフェクション、マグネトフェクション及びそれらのあらゆる組み合わせが含まれる。フローエレクトロポレーション装置は、例えば、本明細書に記載される細胞（例えば、単離された細胞）などの電気穿孔されることとなる細胞の懸濁液を含有するためのチャンバーであって、逆に荷電可能な電極によって少なくともある程度定義されるチャンバーを含み、ここで、チャンバーの熱抵抗は、およそ１１０℃／ワット未満である。
細胞及び小胞ベースの担体
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを、本明細書に記載される細胞を接触させるための組成物に含めることができ、ここで、組成物（例えば、医薬組成物）は、小胞又は他の膜ベースの担体を含む。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド、その組成物又はその医薬組成物は、細胞、小胞又は他の膜ベースの担体中で又はこれらを介して、本明細書に記載される細胞に（例えば、接触させることによって）送達される。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド、その組成物又はその医薬組成物は、リポソーム又は他の同様の小胞中で製剤化される。リポソームは、内部の水性区画を囲む単層若しくは多層の脂質二重層と、比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層とから構成される球形の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性、非毒性であり、親水性薬物分子と親油性薬物分子の両方を送達することができ、その積荷を血漿酵素による分解から保護し、生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を横切ってその荷物を輸送することができる（概説については、例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
小胞は、いくつかの異なる種類の脂質から作製することができる。しかし、薬物担体としてリポソームを生成するために、リン脂質が最も一般的に使用される。多層の小胞脂質の調製のための方法は、当技術分野で公知である（例えば、多層の小胞脂質調製に関するその教示が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照されたい）。小胞形成は、脂質膜が水溶液と混合される時に、自然発生的であり得るが、小胞形成を、ホモジナイザー、ソニケーター又は押し出し装置を使用することによる振盪の形で力を加えることによって促進することもできる（概説については、例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。押し出された脂質は、押し出された脂質調製に関するその教示が参照により本明細書に援用される、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７に記載されている通りに、サイズを低下させるフィルターを通して押し出すことによって調製することができる。
脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド又はその医薬組成物のために生体適合性及び生分解性送達系を提供する、担体の別の例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特性を保持し、且つ薬物安定性及び積載容量を向上させ、且つ薬物漏出を妨げる、改質された固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬物送達の重要な構成要素である。これらのナノ粒子は、薬剤送達を特定の標的に効率的に方向付け、薬物安定性及び薬物放出制御を向上させることができる。脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）、すなわち、リポソームとポリマーを組み合わせる新たな型の担体も用いることができる。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの補完的な利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアは、安定な構造を提供し、リン脂質シェルは、良好な生体適合性を提供する。したがって、これらの２つの構成成分が、薬物封入効率を増大させ、表面改質を促進し、水溶性薬物の漏出を妨げる。概説については、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
担体のさらなる非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲン型材料）、タンパク質担体（例えば、環状ポリリボヌクレオチドに共有結合されるタンパク質）又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー若しくはトランスフェクション試薬）が挙げられる。炭水化物担体の非限定的な例としては、コハク酸フィトグリコーゲンオクテニル、フィトグリコーゲンβ－デキストリン及び無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリンが挙げられる。カチオン性担体の非限定的な例としては、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－β－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、メタクリル酸ポリ（２－ジメチルアミノ）エチル、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、塩化Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、塩化１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウム（ＤＯＴＩＭ）、トリフルオロ酢酸２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、臭化Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、臭化Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）及び塩化Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ）が挙げられる。タンパク質担体の非限定的な例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）又はグロブリンが挙げられる。
エキソソームも、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド又はその医薬組成物のための薬物送達ビヒクルとして使用することができる。概説については、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－２９６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
エクスビボで分化させた赤血球も、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド又はその医薬組成物のための担体として使用することができる。例えば、国際公開第２０１５０７３５８７号パンフレット；国際公開第２０１７１２３６４６号パンフレット；国際公開第２０１７１２３６４４号パンフレット；国際公開第２０１８１０２７４０号パンフレット；国際公開第２０１６１８３４８２号パンフレット；国際公開第２０１５１５３１０２号パンフレット；国際公開第２０１８１５１８２９号パンフレット；国際公開第２０１８００９８３８号パンフレット；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６；米国特許第９，６４４，１８０号明細書；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：４２３；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６を参照されたい。
例えば、国際公開第２０１８２０８７２８号パンフレットに記載されているフソソーム組成物も、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド又はその医薬組成物を送達するための担体として使用することができる。
ビロソーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド又はその医薬組成物を、細胞（例えば、単離された細胞）に送達するための担体として使用することができる。
本発明は、さらに、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む宿主又は宿主細胞を対象とする。いくつかの実施形態において、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）又は他の生物若しくは細胞である。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主中で非免疫原性である。いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば、記載した環状ポリリボヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いている環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによって誘発される応答と比較した場合、宿主の免疫系による応答が低下される又は応答をもたらすことができない。いくつかの免疫応答としては、限定はされないが、液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の生成）及び細胞媒介性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、宿主又は宿主細胞を、環状ポリリボヌクレオチドと接触させる（例えば、送達又は投与される）。いくつかの実施形態において、宿主は、ヒトなどの哺乳動物である。宿主中の環状ポリリボヌクレオチド、発現産物又はその両方の量は、投与後の任意の時点で測定することができる。ある種の実施形態において、培養物中の宿主成長の時間経過が決定される。この成長が、環状ポリリボヌクレオチドの存在下で増大又は低下されるならば、その環状ポリリボヌクレオチド又は発現産物又はその両方は、宿主の成長を増大又は低下させるのに有効であると特定される。
投与
いくつかの実施形態において、接触後の細胞の、それを必要とする対象への投与は、本明細書に記載される任意の送達方法を使用して実施される。いくつかの実施形態において、細胞は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、静脈内注射を介して対象に投与される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞の投与としては、限定はされないが、出産前投与、新生児期投与、出生後投与、経口、注入によるもの（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下及び筋肉内）、眼内投与及び鼻腔内投与によるものが挙げられる。いくつかの実施形態において、送達は、本明細書に記載される細胞、本明細書に記載される複数の細胞、本明細書に記載される細胞の医薬組成物、本明細書に記載される細胞の調製物の、本明細書に記載される細胞を含む医療機器による、本明細書に記載される細胞を含む生体適合性マトリックスによる又はバイオリアクターからの本明細書に記載される細胞の投与である。
いくつかの実施形態において、細胞治療の方法は、本明細書に記載される細胞、本明細書に記載される複数の細胞、本明細書に記載される細胞の医薬組成物、本明細書に記載される細胞の調製物を投与すること、本明細書に記載される細胞を含む医療機器を植込むこと、本明細書に記載される細胞を含む生体適合性マトリックスを植込むこと又はバイオリアクターからの本明細書に記載される細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞治療の方法は、本明細書に記載される医薬組成物、細胞、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器中の複数の細胞、生体適合性マトリックス中の複数の細胞又はバイオリアクターからの複数の細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、投与される医薬組成物、複数の細胞、細胞調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器中の複数の細胞又は生体適合性マトリックス中の複数の細胞は、対象のための単位用量を含む、例えば、１０５～１０９細胞／ｋｇ（対象）、例えば、１０６～１０８細胞／ｋｇ（対象）を含む。例えば、５０ｋｇの体重の標的対象のための単位用量は、５×１０７～２．５×１０１０細胞、例えば、５×１０７～２．５×１０９細胞、例えば、５×１０８～５×１０９細胞を含む医薬組成物であり得る。
いくつかの実施形態において、医薬組成物、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ、医療機器又は生体適合性マトリックスは、例えば、１×１０５～９×１０１１細胞、例えば、１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞の用量を含み、ここで、少なくとも１％の細胞は、本明細書に記載される細胞又は単離された細胞である。例えば、複数のもの、細胞調製物、点滴静注バッグ、医療機器又は生体適合性マトリックス中の少なくとも５０％の細胞、少なくとも６０％の細胞、例えば、５０～７０％の細胞は、本明細書に記載される合成の外因性の環状ＲＮＡを含む細胞である。いくつかの実施形態において、この方法は、１×１０５～９×１０１１細胞、例えば、１×１０５～９×１０５細胞、１×１０６～９×１０６細胞、１×１０７～９×１０７細胞、１×１０８～９×１０８細胞、１×１０９～９×１０９細胞、１×１０１０～９×１０１０細胞、１×１０１１～９×１０１１細胞、例えば、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量の、医薬組成物、複数の細胞又は調製物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、複数の投与又は用量で、医薬組成物、複数の細胞又は調製物を投与することを含む。この態様のいくつかの実施形態において、複数のもの、例えば、２つの後続の用量は、少なくとも約７日、１４週、２８日、３５日、４２日若しくは６０日以上又はこれらの間のあらゆる日数の間隔を空けて投与される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器、又は生体適合性マトリックス、又はバイオリアクターからの複数の細胞は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器、又は生体適合性マトリックス、又はバイオリアクターからの複数の細胞は、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの用量を含む。いくつかの実施形態において、細胞治療の方法は、２つの後続の用量において５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量の、医薬組成物、複数の細胞又は調製物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞治療の方法は、２つの後続の用量において５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ～６×１０９細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０７細胞／ｋｇ又はこれらの間のあらゆる範囲の細胞／ｋｇの、医薬組成物、複数の細胞又は調製物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、２つの後続の用量は、少なくとも約７日、１４週、２８日、３５日、４２日若しくは６０日以上又はこれらの間のあらゆる日数の間隔を空けて投与される。
環状ポリリボヌクレオチドは、投与後、細胞中で存続することができる。環状ポリリボヌクレオチドは、投与後、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１２日、少なくとも約１４日、少なくとも約１６日、少なくとも約１８日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約４０日又は少なくとも約５０日間、存続することができる。環状ポリリボヌクレオチドは、投与後、１日～２日、２日～３日、３日～４日、４日～５日、５日～６日、６日～７日、７日～８日、８日～９日、９日～１０日、１０日～１２日、１２日～１４日、１４日～１６日、１６日～１８日、１８日～２０日、２０日～２５日、２５日～３０日、３０日～４０日、４０日～５０日、１日～１４日、１日～３０日、７日～１４日、７日～３０日又は１４日～３０日の間、存続することができる。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％は、投与後、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、細胞中で存続する。
いくつかの実施形態において、存続することは、接触の直後のポリリボヌクレオチドの量と比較した場合、ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％を維持することを含む。いくつかの実施形態において、存続することは、投与の直後のポリリボヌクレオチドの量と比較した場合、ポリリボヌクレオチドの量の１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％又は６０％～９８％を維持することを含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の発現配列は、ある量の、全ポリペプチドと比較した場合に不連続のポリペプチドを生成し、ここで、この量は、ポリペプチドのモルによるポリペプチドの総量の、あるパーセントである。ポリペプチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成させることができる。不連続のポリペプチドのそれぞれは、単一の発現配列から生成することができる。いくつかの実施形態において、不連続のポリペプチドの量は、全ポリペプチドの、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％又は少なくとも９８％（モル／モル）である。いくつかの実施形態において、不連続のポリペプチドの量は、全ポリペプチドの、１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％又は６０％～９８％（モル／モル）である。
いくつかの実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載される細胞中に、線状ポリリボヌクレオチド同等物より多い量の発現産物を生成する発現配列を含む。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、細胞中で、線状ポリリボヌクレオチド同等物の量より、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍又は少なくとも２５倍多い。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、細胞中で、線状ポリリボヌクレオチド同等物の量より、１．５倍～１．６倍、１．６倍～１．７倍、１．７倍～１．８倍、１．８倍～１．９倍、１．９倍～２倍、２倍～２．５倍、２．５倍～３倍、３倍～３．５倍、３．５倍～４倍、４倍～４．５倍、４．５倍～５倍、５倍～６倍、６倍～７倍、７倍～８倍、８倍～９倍、９倍～１０倍、１０倍～１５倍、１５倍～２０倍、２０倍～２５倍、２倍～５倍、２倍～６倍、２倍～７倍、２倍～１０倍、２倍～２０倍、４倍～５倍、４倍～６倍、４倍～７倍、４倍～１０倍、４倍～２０倍、５倍～６倍、５倍～７倍、５倍～１０倍、５倍～２０倍又は１０倍～２０倍多い。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、接触後、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１２日、少なくとも約１４日、少なくとも約１６日、少なくとも約１８日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約４０日又は少なくとも約５０日間、細胞中で生成される。いくつかの実施形態において、より多い量の発現産物は、投与後、１日～２日、２日～３日、３日～４日、４日～５日、５日～６日、６日～７日、７日～８日、８日～９日、９日～１０日、１０日～１２日、１２日～１４日、１４日～１６日、１６日～１８日、１８日～２０日、２０日～２５日、２５日～３０日、３０日～４０日、４０日～５０日、１日～１４日、１日～３０日、７日～１４日、７日～３０日又は１４日～３０日間、細胞中で生成される。
環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を発現することができ、ここで、１つ以上の発現配列の発現レベルは、本明細書に記載される細胞への接触後及び細胞を投与した後、ある期間にわたって維持される。いくつかの実施形態において、発現は、その期間にわたって、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％より大きく変化しないレベルに維持される。いくつかの実施形態において、発現は、その期間にわたって、５％～１０％、１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％又は６０％～９８％より大きく変化しないレベルに維持される。いくつかの実施形態において、発現が維持される期間は、投与後、最大１日、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１２日、少なくとも約１４日、少なくとも約１６日、少なくとも約１８日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約４０日又は少なくとも約５０日である。いくつかの実施形態において、発現が維持される期間は、投与後、１日～２日、２日～３日、３日～４日、４日～５日、５日～６日、６日～７日、７日～８日、８日～９日、９日～１０日、１０日～１２日、１２日～１４日、１４日～１６日、１６日～１８日、１８日～２０日、２０日～２５日、２５日～３０日、３０日～４０日、４０日～５０日、１日～１４日、１日～３０日、７日～１４日、７日～３０日又は１４日～３０日である。いくつかの実施形態において、この期間は、投与の１日後に開始する。
いくつかの実施形態において、発現は、ある期間にわたって、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％より大きく低下することはない。いくつかの実施形態において、この期間は、投与の１日後である。いくつかの実施形態において、発現は、その期間にわたって、５％～１０％、１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％又は６０％～９８％より大きく低下することはない。いくつかの実施形態において、この期間は、投与の１日後である。
いくつかの実施形態において、１つ以上の発現配列は、投与後、細胞中で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、細胞中で線状同等物より少なくとも１．５倍多い発現産物を生成する。いくつかの実施形態において、細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、投与後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多く変化することはないレベルに維持される。いくつかの実施形態において、その期間は、細胞を投与した１日後に開始する。いくつかの実施形態において、維持される発現のレベルは、投与の１日後の発現のレベルである。いくつかの実施形態において、維持される発現のレベルは、投与の１日後の最も高い発現のレベルである。いくつかの実施形態において、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたる、細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、投与後、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない。いくつかの実施形態において、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない発現のレベルは、投与の１日後の発現のレベルである。いくつかの実施形態において、発現のレベルは、投与の１日後の最も高い発現のレベルと比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない。
翻訳後、タンパク質は、細胞中で又は分泌タンパク質として検出することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、投与後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、６０日以上の期間にわたって、細胞中で検出される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、投与後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、６０日以上の期間にわたって、細胞の表面上に検出される。いくつかの実施形態において、分泌タンパク質が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、６０日以上の期間にわたって検出される。いくつかの実施形態において、分泌タンパク質が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、６０日以上の期間にわたって検出される。いくつかの実施形態において、その期間は、タンパク質を発現している細胞を投与した１日後に開始する。タンパク質は、タンパク質検出のための当技術分野で公知の任意の技術を使用して、例えばフローサイトメトリーによって検出することができる。
対象
それを必要とする対象は、ヒト又は非ヒト動物であり得る。ヒトは、若年者、若年成人（１８～２５歳）、成人又は新生児であり得る。
それを必要とする対象は、疾患又は障害を有し得る。いくつかの実施形態において、対象は、過剰増殖性疾患を有する。いくつかの実施形態において、対象は、癌を有する。いくつかの実施形態において、対象は、神経変性疾患を有する。いくつかの実施形態において、対象は、代謝性疾患を有する。いくつかの実施形態において、対象は、代謝性疾患を有する。いくつかの実施形態において、対象は、炎症性疾患を有する。いくつかの実施形態において、対象は、自己免疫疾患を有する。いくつかの実施形態において、対象は、感染症を有する。いくつかの実施形態において、対象は、遺伝性疾患を有する。
いくつかの実施形態において、細胞治療のための細胞と、細胞を投与される対象は、同種である。いくつかの実施形態において、細胞治療のための細胞と、細胞を投与される対象は、自己由来である。
例示的細胞治療
細胞治療は、それを必要とする対象の治療のための、本明細書に記載される細胞、組成物又は方法の組み合わせであり得る。例示的細胞治療は、非経口投与に適した賦形剤と共に製剤化される、１×１０６～１×１０１１ヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）、例えば、１×１０７～５×１０１０ヒト細胞、例えば、１×１０８～１×１０９ヒト細胞の調製物であって、調製物の細胞の少なくとも５０％（例えば、５０％～７０％）が、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する外因性の環状ＲＮＡを含み、且つヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器中にある調製物を含む。細胞治療は、癌、例えば、白血病又はリンパ腫（例えば、急性リンパ芽球性白血病又は再発又は難治性のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）と診断されたヒト対象を治療する方法であって、非経口投与に適した賦形剤と共に製剤化される自己由来Ｔ細胞の調製物であって、調製物の細胞の少なくとも５０％（例えば、５０％～７０％）が、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する外因性の環状ＲＮＡを含み、調製物はヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器を介して１×１０５～１×１０９細胞／ｋｇ（対象）の用量で投与される調製物を対象に投与することを含む方法をさらに含む。
第２の例示的細胞治療は、非経口投与に適した賦形剤と共に製剤化される、１×１０６～１×１０１１ヒト細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞又はＨＳＣ、例えば、ＮＫ細胞）、例えば、１×１０７～５×１０１０ヒト細胞、例えば、１×１０８～１×１０９ヒト細胞の調製物であって、調製物の細胞の少なくとも５０％（例えば、５０％～７０％）は、サラセミア若しくは鎌状赤血球症の治療のためのヘモグロビンサブユニットベータ（ベータグロビン若しくはヘモグロビンベータ鎖若しくはＨＢＢ）を発現するか、又は大脳型副腎白質ジストロフィーの治療のためのＡＢＣトランスポーターを発現する外因性の環状ＲＮＡを含み、且つ調製物はヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器中にあり、且つ調製物はヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器を介して１×１０５～１×１０９細胞／ｋｇ（対象）の用量で投与される調製物を含む。
別の例示的細胞治療は、非経口投与に適した賦形剤と共に製剤化される、１×１０６～１×１０１１ヒト細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞又はＨＳＣ、例えば、ＮＫ細胞）、例えば、１×１０７～５×１０１０ヒト細胞、例えば、１×１０８～１×１０９ヒト細胞の調製物であって、調製物の細胞の少なくとも５０％（例えば、５０％～７０％）は、（ａ）サラセミア若しくは鎌状赤血球症の治療のためのヘモグロビンサブユニットベータ（ベータグロビン若しくはヘモグロビンベータ鎖若しくはＨＢＢ）、又は（ｂ）大脳型副腎白質ジストロフィーの治療のためのＡＢＣトランスポーター、又は（ｃ）ＡＤＡ－ＳＣＩＤの治療のためのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、又は（ｄ）ウィスコット・アルドリッチの治療のためのＷＡＳタンパク質、又は（ｅ）Ｘ連鎖慢性肉芽腫症の治療のためのＣＹＢＢタンパク質、又は（ｆ）異染性白質ジストロフィーの治療のためのＡＲＳＡ、又は（ｇ）ＭＰＳ－Ｉの治療のためのα－Ｌ－イズロニダーゼ、又は（ｈ）ＭＰＳ－ＩＩＩＡの治療のためのＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、又は（ｉ）ＭＰＳ－ＩＩＩＢの治療のためのＮ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼを発現する外因性の環状ＲＮＡを含み、且つ調製物はヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器中にあり、且つ調製物はヒトへの非経口送達のために構成されている注入バッグなどの医療機器を介して１×１０５～１×１０９細胞／ｋｇ（対象）の用量で投与される調製物を含む。いくつかの実施形態において、投与は、例えば１００万～５００万細胞の、ＩＶ投与、例えば、単回ＩＶ投与である。
本明細書に引用される全ての参考文献及び刊行物を、参照により本明細書に援用する。上に記載した実施形態を組み合わせて、前述の機能特性を達成することができる。
番号付けされた実施形態番号１
［１］治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞。
［２］治療用タンパク質と、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む細胞。
［３］タンパク質と、少なくとも１つの治療特性を細胞に与えるタンパク質をコードする少なくとも１つの発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む治療用細胞。
［４］少なくとも１つの治療特性を細胞に与える少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む治療用細胞。
［５］少なくとも１つの治療特性を細胞に与える少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む治療用細胞。
［６］治療用細胞である、実施形態［１］～［５］のいずれか１つに記載の細胞。
［７］エクスビボ細胞である、実施形態［１］～［６］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［８］真核細胞である、実施形態［１］～［７］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［９］動物細胞である、実施形態［１］～［８］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［１０］哺乳動物細胞である、実施形態［１］～［９］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［１１］ヒト細胞である、実施形態［１］～［１０］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［１２］免疫細胞、癌細胞、前駆細胞又は幹細胞である、実施形態［１］～［１１］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［１３］末梢血単核球である、実施形態［１］～［１２］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［１４］リンパ球である、実施形態［１］～［１３］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［１５］末梢血リンパ球である、実施形態［１］～［１４］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［１６］Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、赤血球、網状赤血球、骨髄系前駆細胞及び巨核球からなる群から選択される、実施形態［１］～［１５］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［１７］間葉系幹細胞、胎生幹細胞、胎児幹細胞、胎盤由来幹細胞、人工多能性幹細胞、脂肪幹細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、成体幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、臍帯幹細胞、角膜縁幹細胞、前駆幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選択される、実施形態［１］～［１６］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［１８］線維芽細胞である、実施形態［１］～［１７］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［１９］軟骨細胞である、実施形態［１］～［１８］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［２０］タンパク質は、治療用タンパク質である、実施形態［１］～［１９］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［２１］タンパク質は、細胞増殖、細胞不死化及び／又は細胞の標的への局在化を促進するタンパク質である、実施形態［１］～［２０］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［２２］タンパク質又は治療用タンパク質は、細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質である、実施形態［１］～［２１］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［２３］タンパク質又は治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性又は輸送活性を有する、実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［２４］治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体である、実施形態［１］～［２３］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［２５］キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体、ＴＡＡ特異的キメラ抗原受容体、ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体、ＨＥＲ２特異的キメラ抗原受容体、ＣＤ２特異的キメラ抗原受容体、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的キメラ抗原受容体、ＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体、メソセリン特異的キメラ抗原受容体、ＥＢＶ特異的キメラ抗原受容体又はＣＤ３３特異的キメラ抗原受容体である、実施形態［１］～［２４］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［２６］治療用タンパク質は、上皮成長因子、エリスロポエチン又はフェニルアラニン水酸化酵素である、実施形態［１］～［２５］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［２７］タンパク質又は治療用タンパク質は、抗原に特異的に結合する、実施形態［１］～［２６］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［２８］タンパク質又は治療用タンパク質は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたって細胞中で検出される、実施形態［１］～［２７］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［２９］タンパク質又は治療用タンパク質は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたって細胞の表面上に検出される、実施形態［１］～［２８］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［３０］タンパク質又は治療用タンパク質は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたって検出される分泌タンパク質である、実施形態［１］～［２９］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［３１］少なくとも１つの結合部位は、アプタマーである、実施形態［１］～［３０］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［３２］少なくとも１つの結合部位は、細胞の表面上の細胞受容体に結合する、実施形態［１］～［３１］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［３３］環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位が細胞の表面上の細胞受容体に結合された場合に細胞に内部移行される、実施形態［１］～［３２］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［３４］環状ポリリボヌクレオチドは、治療用タンパク質と少なくとも１つの結合部位とをコードする少なくとも１つの発現配列を含む、実施形態［１］～［３３］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［３５］環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力があり、且つ終止要素を欠いている、実施形態［１］～［３４］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［３６］環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列の３’末端にスタガー要素をさらに含み、且つ終止要素を欠いている、実施形態［１］～［３５］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［３７］スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させる、実施形態［３６］に記載の細胞又は治療用細胞。
［３８］スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、実施形態［３６］又は［３７］に記載の細胞又は治療用細胞。
［３９］環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ、内部リボソーム進入部位、ポリＡテール、複製要素又はその両方を欠いている、実施形態［１］～［３８］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［４０］１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、実施形態［１］～［３９］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［４１］環状ポリリボヌクレオチドは、
（ａ）エンクリプトゲン；
（ｂ）調節要素；
（ｃ）複製要素；及び
（ｄ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素をさらに含む、実施形態［１］～［４０］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［４２］環状ポリリボヌクレオチドは、
（ｉ）線状同等物より高い翻訳効率；
（ｉｉ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
（ｉｉｉ）エンクリプトゲンを欠く同等物より低い免疫原性；
（ｉｖ）線状同等物より増大した半減期；及び
（ｖ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、実施形態［１］～［４１］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［４３］終止要素は、終止コドンを含む、実施形態［３３］～［４２］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［４４］環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの自己複製を媒介するように構成された複製ドメインをさらに含む、実施形態［１］～［４３］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［４５］環状ポリリボヌクレオチドは、細胞分裂中に存続する、実施形態［１］～［４４］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［４６］環状ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、細胞中で存続する、実施形態［１］～［４５］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［４７］１つ以上の発現配列を発現させることは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の不連続のポリペプチドを生成し、且つ不連続のポリペプチドのそれぞれは、単一の発現配列から生成される、実施形態［１］～［４６］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［４８］１つ以上の発現配列は、細胞中で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、細胞中で線状同等物より少なくとも１．５倍多い発現産物を生成する、実施形態［１］～［４７］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［４９］細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多く変化することはないレベルに維持される、実施形態［１］～［４８］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［５０］少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたる、細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない、実施形態［１］～［４９］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞。
［５１］実施形態［１］～［５０］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞と；
薬学的に許容される担体又は賦形剤と
を含む医薬組成物。
［５２］実施形態［１］～［５１］のいずれか１つに記載の細胞又は治療用細胞又は実施形態［４８］に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、細胞治療の方法。
［５３］１つ以上の発現配列、少なくとも１つの結合部位又はそれらの組み合わせを含む環状ポリリボヌクレオチドを提供することと、
この環状ポリリボヌクレオチドを細胞にエクスビボで接触させることと
を含む、細胞治療の方法。
［５４］それを必要とする対象を治療する方法であって、
細胞を提供することと、
この細胞を、１つ以上の発現配列、少なくとも１つの結合部位又はそれらの組み合わせを含む環状ポリリボヌクレオチドに、エクスビボで接触させることと
を含む方法であって、１つ以上の発現配列の発現産物は、対象を治療するためのタンパク質を含む、方法。
［５５］細胞を提供することと；
この細胞を、１つ以上の発現配列、少なくとも１つの結合部位又はそれらの組み合わせを含む環状ポリリボヌクレオチドに、エクスビボで接触させることと
を含む、治療の方法であって、１つ以上の発現配列の少なくとも１つは、それを必要とする対象を治療するためのタンパク質をコードする、治療の方法。
［５６］それを必要とする対象に接触させた後、細胞を投与することをさらに含む、実施形態［１］～［５５］のいずれか１つに記載の方法。
［５７］接触させることは、環状ポリリボヌクレオチドを内部移行する細胞をさらに含む、実施形態［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［５８］接触させることは、カチオン性脂質、電気穿孔（例えば、フローエレクトロポレーション装置を使用する）、ネイキッド環状ＲＮＡ、アプタマー、カチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ポリブレン、ＤＥＡＥ－デキストラン）、ウイルス様粒子（例えば、ＨＰＶ由来のＬ１、ポリオーマウイルス由来のＶＰ１）、エキソソーム；ナノ構造化リン酸カルシウム；ペプチド形質導入ドメイン（例えば、ＴＡＴ、ｐｏｌｙＲ、ＳＰ、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ１など）；小胞（例えば、ＶＳＶ－Ｇ、ＴＡＭＥＬ）；エキソソーム；細胞スクイージング；ナノ粒子；マグネトフェクション又はそれらのあらゆる組み合わせを使用することを含む、実施形態［１］～［５７］のいずれか１つに記載の方法。
［５９］接触後の細胞の生存率は、正規化された接触されていない細胞と比較して少なくとも４０％である、実施形態［１］～［５８］のいずれか１つに記載の方法。
［６０］それを必要とする対象は、疾患又は障害を有する、実施形態［１］～［５９］のいずれか１つに記載の方法。
［６１］それを必要とする対象は、過剰増殖性疾患を有する、実施形態［１］～［６０］のいずれか１つに記載の方法。
［６２］それを必要とする対象は、癌を有する、実施形態［１］～［６１］のいずれか１つに記載の方法。
［６３］それを必要とする対象は、神経変性疾患を有する、実施形態［１］～［６２］のいずれか１つに記載の方法。
［６４］それを必要とする対象は、代謝性疾患を有する、実施形態［１］～［６３］のいずれか１つに記載の方法。
［６５］それを必要とする対象は、炎症性疾患を有する、実施形態［１］～［６４］のいずれか１つに記載の方法。
［６６］それを必要とする対象は、自己免疫疾患を有する、実施形態［１］～［６５］のいずれか１つに記載の方法。
［６７］それを必要とする対象は、感染症を有する、実施形態［１］～［６６］のいずれか１つに記載の方法。
［６８］それを必要とする対象は、遺伝性疾患を有する、実施形態［１］～［６７］のいずれか１つに記載の方法。
［６９］環状ポリリボヌクレオチドは、細胞分裂中に存続する、実施形態［１］～［６８］のいずれか１つに記載の方法。
［７０］環状ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％は、接触後、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間、細胞中で存続する、実施形態［１］～［６９］のいずれか１つに記載の方法。
［７１］環状ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％は、投与後、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間、細胞中で存続する、実施形態［１］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７２］１つ以上の発現配列を発現させることは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の不連続のポリペプチドを生成し、且つ不連続のポリペプチドのそれぞれは、単一の発現配列から生成される、実施形態［１］～［７１］のいずれか１つに記載の方法。
［７３］１つ以上の発現配列は、接触後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日目に、細胞中で線状同等物より少なくとも１．５倍多い発現産物を生成する、実施形態［１］～［７２］のいずれか１つに記載の方法。
［７４］１つ以上の発現配列は、投与後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日目に、細胞中で線状同等物より少なくとも１．５倍多い発現産物を生成する、実施形態［１］～［７３］のいずれか１つに記載の方法。
［７５］細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多く変化することはないレベルに維持される、実施形態［１］～［７４］のいずれか１つに記載の方法。
［７６］約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく変化することはないレベルは、投与の１日後の１つ以上の発現配列の発現のレベルである、実施形態６９に記載の方法。
［７７］約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく変化することはないレベルは、接触の１日後の１つ以上の発現配列の発現のレベルである、実施形態６９に記載の方法。
［７８］少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたる、細胞中の１つ以上の発現配列の発現は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より大きく低下することはない、実施形態［１］～［７７］のいずれか１つに記載の方法。
［７９］少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日という期間は、接触の１日後に開始する、実施形態［７８］に記載の方法。
［８０］少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日という期間は、投与の１日後に開始する、実施形態［７８］に記載の方法。
［８１］細胞は、治療用細胞である、実施形態［１］～［８０］のいずれか１つに記載の方法。
［８２］細胞は、真核細胞である、実施形態［１］～［８１］のいずれか１つに記載の方法。
［８３］細胞は、動物細胞である、実施形態［１］～［８２］のいずれか１つに記載の方法。
［８４］細胞は、哺乳動物細胞である、実施形態［１］～［８３］のいずれか１つに記載の方法。
［８５］細胞は、ヒト細胞である、実施形態［１］～［８４］のいずれか１つに記載の方法。
［８６］細胞は、免疫細胞、癌細胞、前駆細胞又は幹細胞である、実施形態［１］～［８５］のいずれか１つに記載の方法。
［８７］細胞は、末梢血単核球である、実施形態［１］～［８６］のいずれか１つに記載の方法。
［８８］細胞は、リンパ球である、実施形態［１］～［８７］のいずれか１つに記載の方法。
［８９］細胞は、末梢血リンパ球である、実施形態［１］～［８８］のいずれか１つに記載の方法。
［９０］細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、巨核球、赤血球 網状赤血球及び骨髄系前駆細胞からなる群から選択される、実施形態［１］～［８９］のいずれか１つに記載の方法。
［９１］細胞は、間葉系幹細胞、胎生幹細胞、胎児幹細胞、胎盤由来幹細胞、人工多能性幹細胞、脂肪幹細胞、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、皮膚幹細胞、成体幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、臍帯幹細胞、角膜縁幹細胞、前駆幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選択される、実施形態［１］～［９０］のいずれか１つに記載の方法又は実施形態［１］～［９０］のいずれか１つに記載の細胞。
［９２］細胞は、線維芽細胞である、実施形態［１］～［９１］のいずれか１つに記載の方法。
［９３］細胞は、軟骨細胞である、実施形態［１］～［９２］のいずれか１つに記載の方法。
［９４］細胞は、対象にとって自己由来である、実施形態［１］～［９３］のいずれか１つに記載の方法。
［９５］細胞は、対象と同種である、実施形態［１］～［９４］のいずれか１つに記載の方法。
［９６］１つ以上の発現配列の発現産物は、細胞に治療特性を与える治療用タンパク質又はタンパク質を含む、実施形態［１］～［９５］のいずれか１つに記載の方法。
［９７］タンパク質は、細胞増殖、細胞不死化及び／又は細胞の標的への局在化を促進する、実施形態［１］～［９６］のいずれか１つに記載の方法。
［９８］タンパク質又は治療用タンパク質は、細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質である、実施形態［１］～［９７］のいずれか１つに記載の方法。
［９９］タンパク質又は治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性又は輸送活性を有する、実施形態［１］～［９８］のいずれか１つに記載の方法。
［１００］治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体である、実施形態［１］～［９９］のいずれか１つに記載の方法。
［１０１］キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体、ＴＡＡ特異的キメラ抗原受容体、ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体、ＨＥＲ２特異的キメラ抗原受容体、ＣＤ２特異的キメラ抗原受容体、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的キメラ抗原受容体、ＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体、メソセリン特異的キメラ抗原受容体、ＥＢＶ特異的キメラ抗原受容体又はＣＤ３３特異的キメラ抗原受容体である、実施形態［１］～［１００］のいずれか１つに記載の方法又は実施形態［１］～［１００］のいずれか１つに記載の細胞。
［１０２］治療用タンパク質は、エリスロポエチン、上皮成長因子、フェニルアラニン水酸化酵素又はキメラ抗原受容体である、実施形態［１］～［１０１］のいずれか１つに記載の方法。
［１０３］タンパク質又は治療用タンパク質は、抗原に特異的に結合する、実施形態［１］～［１０２］のいずれか１つに記載の方法。
［１０４］タンパク質又は治療用タンパク質は、接触後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたって細胞中で検出される、実施形態［１］～［１０３］のいずれか１つに記載の方法。
［１０５］タンパク質又は治療用タンパク質は、接触後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたって細胞の表面上に検出される、実施形態［１］～［１０４］のいずれか１つに記載の方法。
［１０６］タンパク質又は治療用タンパク質は、接触後、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６日の期間にわたって検出される分泌タンパク質である、実施形態［１］～［１０５］のいずれか１つに記載の方法。
［１０７］少なくとも１つの結合部位は、アプタマーである、実施形態［１］～［１０６］のいずれか１つに記載の方法。
［１０８］少なくとも１つの結合部位は、細胞の表面上の細胞受容体に結合する、実施形態［１］～［１０７］のいずれか１つに記載の方法。
［１０９］環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位が細胞の表面上の細胞受容体に結合された場合に細胞に内部移行される、実施形態［１］～［１０８］のいずれか１つに記載の方法。
［１１０］環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力があり、且つ終止要素を欠いている、実施形態［１］～［１０９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１１］環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列の３’末端にスタガー要素をさらに含み、且つ終止要素を欠いている、実施形態［１］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１１２］スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させる、実施形態［１１１］に記載の方法。
［１１３］スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、実施形態［１１１］又は［１１２］に記載の方法。
［１１４］環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている、実施形態［１］～［１１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１１５］１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、実施形態［１］～［１１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１１６］環状ポリリボヌクレオチドは、
（ａ）エンクリプトゲン；
（ｂ）調節要素；
（ｃ）複製要素；及び
（ｄ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素をさらに含む、実施形態［１］～［１１５］のいずれか１つに記載の方法。
［１１７］環状ポリリボヌクレオチドは、
（ｉ）線状同等物より高い翻訳効率；
（ｉｉ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
（ｉｉｉ）エンクリプトゲンを欠く同等物より低い免疫原性；
（ｉｖ）線状同等物より増大した半減期；及び
（ｖ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、実施形態［１］～［１１６］のいずれか１つに記載の方法。
［１１８］終止要素は、終止コドンを含む、実施形態［１１０］～［１１７］のいずれか１つに記載の方法。
［１１９］環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの自己複製を媒介するように構成された複製ドメインをさらに含む、実施形態［１］～［１１８］のいずれか１つに記載の方法。
番号付けされた実施形態番号２
［１］ａ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と；
ｂ）（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）分泌タンパク質若しくは細胞内タンパク質であるタンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせである環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞と
を含む医薬組成物。
［２］ａ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と；
ｂ）（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）膜タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせである環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞（ここで、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体融合タンパク質ではないか、又は細胞は、免疫細胞ではない）と
を含む医薬組成物。
［３］ａ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と；
ｂ）少なくとも１つの結合部位を含み、且つ分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質であるタンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞と
を含む医薬組成物。
［４］（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）分泌タンパク質若しくは細胞内タンパク質であるタンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせである環状ポリリボヌクレオチドを含む単離された細胞であって、対象に投与される単離された細胞。
［５］（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）膜タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせである環状ポリリボヌクレオチドを含む単離された細胞又は調製物であって、膜タンパク質は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体融合タンパク質ではないか、又は単離された細胞は、免疫細胞ではなく、且つ単離された細胞は、対象に投与される、単離された細胞又は調製物。
［６］少なくとも１つの結合部位を含み、且つ分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質であるタンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む単離された細胞であって、対象に投与される単離された細胞。
［７］タンパク質は、膜タンパク質であり、且つ細胞は、非免疫細胞である、実施形態［１］に記載の医薬組成物又は実施形態［４］に記載の単離された細胞。
［８］細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、治療用タンパク質である、実施形態［１］～［７］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［９］膜タンパク質は、膜貫通タンパク質である、実施形態［１］～［８］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［１０］膜タンパク質は、細胞外基質タンパク質である、実施形態［１］～［９］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［１１］細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、細胞増殖、細胞分化、細胞不死化及び／又は細胞の標的への局在化を促進する、実施形態［１］～［１０］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［１２］細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、酸化防止活性、結合活性、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性、免疫寛容誘導活性又は輸送活性を有する、実施形態［１］～［１１］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［１３］細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、タンパク質タグとして機能する、実施形態［１］～［１２］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［１４］細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、分子機能調節剤である、実施形態［１］～［１３］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［１５］細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、免疫寛容誘導因子（例えば、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７又はＣＤ２４）である、実施形態［１］～［１４］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［１６］細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、上皮成長因子、エリスロポエチン、フェニルアラニン水酸化酵素、キメラ抗原受容体、ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ又はＣａｓタンパク質である、実施形態［１］～［１５］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［１７］少なくとも１つの結合部位は、細胞に少なくとも１つの治療特性を与える、実施形態［１］～［１６］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［１８］少なくとも１つの結合部位は、細胞又は単離された細胞に核酸局在化を与える、実施形態［１］～［１７］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［１９］少なくとも１つの結合部位は、アプタマーである、実施形態［１］～［１８］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［２０］少なくとも１つの結合部位は、タンパク質結合部位、ＤＮＡ結合部位又はＲＮＡ結合部位である、実施形態［１］～［１９］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［２１］少なくとも１つの結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位である、実施形態［１］～［２０］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［２２］少なくとも１つの結合部位は、細胞の表面上の細胞受容体に結合する、実施形態［１］～［２１］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［２３］環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位が細胞の表面上の細胞受容体に結合された後に細胞に内部移行される、実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［２４］細胞又は単離された細胞は、真核細胞、動物細胞、哺乳動物細胞又はヒト細胞である、実施形態［１］～［２３］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［２５］細胞又は単離された細胞は、免疫細胞、前駆細胞、幹細胞、神経学的細胞、心臓病学的細胞、脂肪細胞、肝臓細胞又はβ細胞である、実施形態［１］～［２４］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［２６］細胞又は単離された細胞は、末梢血単核球、末梢血リンパ球又はリンパ球である、実施形態［１］～［２５］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［２７］細胞又は単離された細胞は、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、γδＴ細胞、αβＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、赤血球、網状赤血球、骨髄系前駆細胞及び巨核球からなる群から選択される、実施形態［１］～［２６］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［２８］細胞又は単離された細胞は、間葉系幹細胞、胎生幹細胞、胎児幹細胞、胎盤由来幹細胞、人工多能性幹細胞、脂肪幹細胞、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、皮膚幹細胞、成体幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、臍帯幹細胞、角膜縁幹細胞、前駆幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選択される、実施形態［１］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［２９］細胞又は単離された細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、ドーパミン作動性神経、ミクログリア、乏突起膠細胞、腸神経細胞及び肝細胞からなる群から選択される、実施形態［１］～［２８］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［３０］細胞又は単離された細胞は、複製能力がない、実施形態［１］～［２９］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［３１］複数の細胞を含む（ここで、複数は５×１０５細胞～１×１０７細胞である）、実施形態［１］～［３０］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［３２］実施形態［１］～［３１］のいずれか１つに記載の複数の単離された細胞（例えば、複数の単離された細胞を含む調製物）を含む（ここで、複数は５×１０５細胞～１×１０７細胞である）、実施形態［１］～［３１］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［３３］複数の細胞又は単離された細胞を含む（ここで、複数は１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞である）、実施形態［１］～［３２］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［３４］実施形態［１］～［３３］のいずれか１つに記載の複数の単離された細胞を含む（ここで、複数は１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞である）、実施形態［１］～［３３］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［３５］対象への（例えば、静脈内投与による）投与のための、実施形態［１］～［３４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［３６］対象は、ヒト又は非ヒト動物である、実施形態［１］～［３５］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［３７］対象は、疾患又は障害を有する、実施形態［１］～［３６］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［３８］対象は、過剰増殖性疾患、癌、神経変性疾患、代謝性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症又は遺伝性疾患を有する、実施形態［１］～［３７］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［３９］対象及び細胞又は単離された細胞は、同種又は自己由来である、実施形態［１］～［３８］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［４０］環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ、内部リボソーム進入部位、ポリＡテール、複製要素又はそれらの組み合わせを欠いている、実施形態［１］～［３９］のいずれか１つに記載の医薬組成物又は単離された細胞。
［４１］薬学的に許容される賦形剤（例えば、希釈剤）と共に製剤化される、実施形態［１］～［４０］のいずれか１つに記載の単離された細胞。
［４２］抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含み、且つ少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含む医薬組成物。
［４３］キメラ抗原受容体をコードする配列を含み、且つ少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む単離された細胞であって、対象への投与（例えば、静脈内投与）のためのものである単離された細胞。
［４４］ａ）ｉ）抗原に結合する抗原結合タンパク質をコードする少なくとも１つの標的結合配列、又は
ｉｉ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードし、且つ少なくとも１つの結合部位を任意選択的に含む配列
を含む環状ポリリボヌクレオチドと；
ｂ）その発現が抗原結合タンパク質への抗原の結合時に活性化されるタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列と
を含む細胞。
［４５］抗原に対する親和性を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする環状ポリリボヌクレオチドと、二重特異性抗体をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞であって、細胞の表面上にＴＣＲ及び二重特異性抗体を発現する細胞。
［４６］キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む、実施形態［４３］に記載の単離された細胞。
［４７］抗原結合タンパク質は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態［４４］に記載の細胞。
［４８］抗原結合ドメインは膜貫通ドメインに連結され、膜貫通ドメインは細胞内シグナル伝達ドメインに連結されて、キメラ抗原受容体を生成する、実施形態［４２］に記載の医薬組成物、実施形態［４６］に記載の単離された細胞又は実施形態［４４］若しくは［４７］に記載の細胞。
［４９］抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、寛容原若しくは病原抗原に結合されるか、又は抗原は、腫瘍抗原若しくは病原抗原である、実施形態［４２］若しくは［４８］に記載の医薬組成物、実施形態［４６］若しくは［４８］に記載の単離された細胞又は実施形態［４４］若しくは［４７］～［４８］に記載の細胞。
［５０］抗原結合ドメインは、抗体又はその抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ）である、実施形態［４２］若しくは［４８］～［４９］のいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態［４６］若しくは［４８］～［４９］のいずれか１つに記載の単離された細胞又は実施形態［４４］若しくは［４７］～［４９］に記載の細胞。
［５１］抗原結合ドメインは、二重特異性抗体である、実施形態［４２］若しくは［４８］～［５０］のいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態［４６］若しくは［４８］～［５０］のいずれか１つに記載の単離された細胞又は実施形態［４４］若しくは［４７］～［５０］に記載の細胞。
［５２］二重特異性抗体は、第１のエピトープと結合する第１の免疫グロブリン可変ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の免疫グロブリン可変ドメインを有する、実施形態［４５］に記載の細胞又は実施形態［５１］に記載の医薬組成物、細胞若しくは単離された細胞。
［５３］第１のエピトープと第２のエピトープは、同じものである、実施形態［５２］に記載の医薬組成物、細胞若しくは単離された細胞。
［５４］第１のエピトープと第２のエピトープは、異なる、実施形態［５２］に記載の医薬組成物、細胞若しくは単離された細胞。
［５５］膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結させる、実施形態［４２］若しくは［４８］～［５４］のいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態［４６］若しくは［４８］～［５４］のいずれか１つに記載の単離された細胞又は実施形態［４４］若しくは［４７］～［５４］に記載の細胞。
［５６］膜貫通ドメインは、ヒンジタンパク質（例えば、免疫グロブリンヒンジ）、ポリペプチドリンカー（例えば、ＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、ＣＤ８ａヒンジ又はスペーサーである、実施形態［４２］若しくは［４８］～［５５］のいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態［４６］若しくは［４８］～［５５］のいずれか１つに記載の単離された細胞又は実施形態［４４］若しくは［４７］～［５５］に記載の細胞。
［５７］細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも一部を含む、実施形態［４２］若しくは［４８］～［５６］のいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態［４６］若しくは［４８］～［５６］のいずれか１つに記載の単離された細胞又は実施形態［４４］若しくは［４７］～［５６］に記載の細胞。
［５８］細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフを含む、実施形態［４２］若しくは［４８］～［５７］のいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態［４６］若しくは［４８］～［５７］のいずれか１つに記載の単離された細胞又は実施形態［４４］若しくは［４７］～［５７］に記載の細胞。
［５９］細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２の少なくとも一部又はそれらのあらゆる組み合わせを含む、実施形態［４２］若しくは［４８］～［５８］のいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態［４６］若しくは［４８］～［５８］のいずれか１つに記載の単離された細胞又は実施形態［４４］若しくは［４７］～［５８］に記載の細胞。
［６０］細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態［４２］若しくは［４８］～［５９］のいずれか１つに記載の医薬組成物、実施形態［４６］若しくは［４８］～［５９］のいずれか１つに記載の単離された細胞又は実施形態［４４］若しくは［４７］～［５９］に記載の細胞。
［６１］共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子又は活性化ＮＫ細胞受容体タンパク質の少なくとも１つを含む、実施形態［６０］のいずれか１つに記載の医薬組成物、細胞又は単離された細胞。
［６２］共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＲＡＮＫＬ、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ１６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、Ｂ７－Ｈ３又はＣＤ８３に結合するリガンドの少なくとも１つ以上を含む、実施形態［６０］又は［６１］に記載の医薬組成物、細胞又は単離された細胞。
［６３］環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ、内部リボソーム進入部位、ポリＡテール、複製要素又はそれらの組み合わせを欠いている、実施形態［４２］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬組成物、細胞又は単離された細胞。
［６４］細胞は、免疫エフェクター細胞である、実施形態［４２］～［６３］のいずれか１つに記載の医薬組成物、細胞又は単離された細胞。
［６５］細胞又は単離された細胞は、Ｔ細胞（例えば、αβＴ細胞若しくはγδＴ細胞）又はＮＫ細胞である、実施形態［４２］～［６４］のいずれか１つに記載の医薬組成物、細胞又は単離された細胞。
［６６］細胞又は単離された細胞は、同種細胞又は自己由来細胞である、実施形態［４２］～［６５］のいずれか１つに記載の医薬組成物、細胞又は単離された細胞。
［６７］抗原は、腫瘍又は癌から発現される、実施形態［４４］、［４５］又は［４７］～［６６］のいずれか１つに記載の細胞。
［６８］タンパク質は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）又は共刺激リガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ若しくは４－１ＢＢＬ）である、実施形態［４４］又は［４７］～［６７］のいずれか１つに記載の細胞。
［６９］タンパク質は、分泌タンパク質である、実施形態［４４］又は［４７］～［６８］のいずれか１つに記載の細胞。
［７０］実施形態［１］～［６９］のいずれか１つに記載の５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞の細胞は、細胞又は単離された細胞である、対象への送達（例えば注射又は注入による）のために構成された５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞の調製物であって；任意選択的に単位用量形態である調製物。
［７１］対象への送達（例えば注射又は注入による）のために構成された複数の細胞の懸濁液を含む点滴静注バッグ又は注入製品であって、複数の細胞は、実施形態［１］～［７０］のいずれか１つに記載の細胞又は単離された細胞である点滴静注バッグ又は注入製品。
［７２］実施形態［１］～［７１］のいずれか１つに記載の細胞又は単離された細胞である複数の細胞を含む医療機器であって、対象への植込みのために構成された医療機器。
［７３］実施形態［１］～［７２］のいずれか１つに記載の細胞又は単離された細胞である複数の細胞を含む生体適合性マトリックスであって、対象への植込みのために構成された生体適合性マトリックス。
［７４］実施形態［１］～［７３］のいずれか１つに記載の細胞又は単離された細胞である複数の細胞を含むバイオリアクター。
［７５］バイオリアクターは、二次元細胞培養を含む、実施形態［１］～［７４］のいずれか１つに記載のバイオリアクター。
［７６］バイオリアクターは、三次元細胞培養を含む、実施形態［１］～［７５］のいずれか１つに記載のバイオリアクター。
［７７］対象に植込まれた場合に複数の細胞を生成及び放出するように構成された、実施形態［７２］に記載の医療機器又は実施形態［７３］に記載の生体適合性マトリックス。
［７８］対象に植込まれた場合にタンパク質（例えば、分泌タンパク質又は切断可能タンパク質）を生成及び放出するように構成された、実施形態［７２］に記載の医療機器又は実施形態［７３］に記載の生体適合性マトリックス。
［７９］対象は、ヒト又は非ヒト動物である、実施形態［７０］～［７３］又は［７７］～［７８］のいずれか１つに記載の調製物、点滴静注バッグ、医療機器又は生体適合性マトリックス。
［８０］複数の細胞は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に製剤化される、実施形態［７０］～［７９］のいずれか１つに記載の調製物、点滴静注バッグ、医療機器、生体適合性マトリックス又はバイオリアクター。
［８１］細胞又は複数の細胞を生成する方法であって、
単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供することと；
実施形態［１］～［８０］のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドを提供することと；
環状ポリリボヌクレオチドを、単離された細胞又は複数の単離された細胞に接触させることと
を含む方法。
［８２］接触後の単離された細胞又は複数の単離された細胞の生存率は、正規化された接触されていない単離された細胞又は複数の正規化された接触されていない単離された細胞と比較して少なくとも４０％である、実施形態［１］～［８１］のいずれか１つに記載の方法。
［８３］接触後の細胞又は複数の細胞を対象に投与することをさらに含む、実施形態［８１］又は［８２］のいずれか１つに記載の方法。
［８４］対象への投与のための細胞を生成する方法であって、
ａ）単離された細胞を提供することと、
ｂ）単離された細胞を、実施形態［１］～［８３］のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドに接触させることと
を含み、それにより対象への投与のための細胞を生成する方法。
［８５］細胞中の環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与の前に分解される、実施形態［８４］に記載の方法。
［８６］注入製品を製造する方法であって、
ａ）複数の細胞から、ある細胞型を濃縮することと；
ｂ）その細胞型を増加させることと；
ｃ）その細胞型の複数の細胞を複数の環状ポリリボヌクレオチド（ここで、複数の環状ポリリボヌクレオチドは、実施形態［１］～［８５］のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドである）と接触させることと；
ｄ）懸濁液中の接触された複数の細胞を注入製品として提供することと
を含む方法。
［８７］注射製品を製造する方法であって、
ａ）複数の細胞から、ある細胞型を濃縮することと；
ｂ）その細胞型を増加させることと；
ｃ）その細胞型の複数の細胞を複数の環状ポリリボヌクレオチド（ここで、複数の環状ポリリボヌクレオチドは、実施形態［１］～［８６］のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドである）と接触させることと；
ｄ）懸濁液中の接触された複数の細胞を注射製品として提供することと
を含む方法。
［８８］実施形態［１］～［８７］のいずれか１つに記載の、医薬組成物、細胞、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器中の複数の細胞、生体適合性マトリックス中の複数の細胞又はバイオリアクターからの複数の 細胞を、対象に投与することを含む、細胞治療の方法。
［８９］医薬組成物、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器中の複数の細胞、生体適合性マトリックス中の複数の細胞又はバイオリアクターからの複数の細胞は、５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞の用量を含む、実施形態［８８］に記載の方法。
［９０］５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量の、医薬組成物、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器中の複数の細胞、生体適合性マトリックス中の複数の細胞又はバイオリアクターからの複数の細胞を投与することを含む、実施形態［８８］又は［８９］に記載の方法。
［９１］２つの後続の用量において５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量の、医薬組成物、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器中の複数の細胞、生体適合性マトリックス中の複数の細胞又はバイオリアクターからの複数の細胞を投与することを含む、実施形態［８８］～［９０］のいずれか１つに記載の方法。
［９２］２つの後続の用量は、少なくとも約２８日、３５日、４２日又は６０日の間隔を空けて投与される、実施形態［９１］に記載の方法。
［９３］単離された細胞又は複数の単離された細胞の核酸を編集する方法であって
ａ）単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供することと；
ｂ）単離された細胞又は複数の単離された細胞を、ヌクレアーゼをコードする及び／又はガイド核酸を含む環状ポリリボヌクレオチドに接触させることと
を含み、それにより対象への投与のための編集細胞又は複数の編集細胞を生成する方法。
［９４］編集細胞又は複数の編集細胞を、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することをさらに含む、実施形態［９３］に記載の方法。
［９５］編集細胞又は複数の編集細胞を対象に投与することをさらに含む、実施形態［９３］又は［９４］に記載の方法。
［９６］５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量の複数の編集細胞を投与することをさらに含む、実施形態［９３］～［９５］のいずれか１つに記載の方法。
［９７］２つの後続の用量において５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量の複数の編集細胞を投与することをさらに含む、実施形態［９３］～［９６］のいずれか１つに記載の方法。
［９８］２つの後続の用量は、少なくとも約２８日、３５日、４２日又は６０日の間隔を空けて投与される、実施形態［９７］に記載の方法。
［９９］ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ又はＣａｓタンパク質である、実施形態［９３］～［９８］のいずれか１つに記載の方法。
［１００］ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１４タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、実施形態［９３］～［９９］のいずれか１つに記載の方法。
［１０１］ヌクレアーゼは、標的配列を編集する、実施形態［９３］～［１００］のいずれか１つに記載の方法。
［１０２］ガイド核酸は、標的配列に対して相補的である配列を有する第１の領域と、ヌクレアーゼとハイブリダイズする第２の領域とを含む、実施形態［９３］～［１０１］のいずれか１つに記載の方法。
［１０３］標的配列は、単離された細胞又は複数の単離された細胞の配列である、実施形態［１０１］に記載の方法。
［１０４］単離された細胞は、真核細胞、動物細胞、哺乳動物細胞又はヒト細胞である、実施形態［９３］～［１０３］のいずれか１つに記載の方法。
［１０５］単離された細胞は、免疫細胞、前駆細胞、幹細胞、神経学的細胞、心臓病学的細胞、肝臓細胞又はβ細胞である、実施形態［９３］～［１０４］のいずれか１つに記載の方法。
［１０６］単離された細胞は、末梢血単核球、末梢血リンパ球又はリンパ球である、実施形態［９３］～［１０５］のいずれか１つに記載の方法。
［１０７］単離された細胞は、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、γδＴ細胞、αβＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、赤血球、網状赤血球、骨髄系前駆細胞及び巨核球からなる群から選択される、実施形態［９３］～［１０６］のいずれか１つに記載の方法。
［１０８］単離された細胞は、間葉系幹細胞、胎生幹細胞、胎児幹細胞、胎盤由来幹細胞、人工多能性幹細胞、脂肪幹細胞、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、皮膚幹細胞、成体幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、臍帯幹細胞、角膜縁幹細胞、前駆幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選択される、実施形態［９３］～［１０４］のいずれか１つに記載の方法。
［１０９］単離された細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、ドーパミン作動性神経、ミクログリア、乏突起膠細胞、腸神経細胞及び肝細胞からなる群から選択される、実施形態［９３］～［１０４］のいずれか１つに記載の方法。
［１１０］単離された細胞は、複製能力がない、実施形態［９３］～［１０９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１１］複数の編集細胞は、５×１０５細胞～１×１０７細胞である、実施形態［９３］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１１２］複数の編集細胞は、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞である、実施形態［９３］～［１１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１１３］対象は、ヒト又は非ヒト動物である、実施形態［８３］～［８５］又は［８８］～［１１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１１４］細胞又は単離された細胞は、対象（例えば、治療される対象又はそれを必要とする対象）にとって自己由来であるか、又は細胞又は単離された細胞は、対象（例えば、治療される対象又はそれを必要とする対象）と同種である、実施形態［８３］～［８５］又は［８８］～［１１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１１５］対象は、疾患又は障害を有する、実施形態［８３］～［８５］又は［８８］～［１１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１１６］対象は、過剰増殖性疾患、癌、神経変性疾患、代謝性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症又は遺伝性疾患を有する、実施形態［８３］～［８５］又は［８８］～［１１５］のいずれか１つに記載の方法。
以下の実施例は、本発明のある実施形態をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図されておらず；それらの例示的な性質により、当業者に公知の他の手順、方法又は技術が代わりに使用され得ることが理解されるであろう。
実施例１：細胞中の環状ＲＮＡからの細胞内タンパク質の発現
この実施例は、細胞中の環状ＲＮＡの細胞内タンパク質の発現のインビトロ評価を示す。
この実施例では、ＩＲＥＳと、ＧＦＰをコードするＯＲＦを含むように、環状ＲＮＡを設計した。環状ＲＮＡは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を使用して、スプリント媒介性のライゲーションを介してインビトロで生成した。初代ヒトＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用して（Ｔｃｅｌｌ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ培地中で３日間）活性化した。ビーズ除去後、活性化されたＴ細胞を、電気穿孔システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、０．６ピコモル（約２５０ｎｇ）の環状ＲＮＡで電気穿孔を行った。
電気穿孔後２４時間で開始する各時点で、Ｔ細胞を再懸濁し、試料の一部分をフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について定量した。手短に言うと、細胞をペレット化し（３００ｇ、５分 ＲＴ）、暗所で５分間、Ｄａｐｉ（１：１０００希釈）を含有するフロー緩衝液（Ｆｌｏｗ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ＋５％ ＦＢＳ）に再懸濁した。フロー緩衝液中で２回洗浄した後、試料をフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に流して、ＧＦＰ発現について定量した。死細胞及びダブレットは、ＧＦＰ発現測定の前に、標的集団から取り除いた。
図１に示す通り、環状ＲＮＡと線状ＲＮＡの両方からのＧＦＰ発現が、電気穿孔後１日で検出された（約９０％ ＧＦＰ＋細胞）。ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージは、線状ｍＲＮＡ電気穿孔細胞と環状ｍＲＮＡ電気穿孔細胞の両方について、投与後２日では維持された。しかし、線状ｍＲＮＡで電気穿孔を行ったＧＦＰ＋細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、２日目までに、およそ５４％低下したのに対して、環状ｍＲＮＡ電気穿孔細胞は、約１６％のみ低下した。３、６及び１０日目では、線状ＲＮＡ発現は減少したが、環状ＲＮＡ発現は、安定したままであった（３日目では環状９２％に対して線状８１％、６日目では環状８０％に対して線状５３％、１０日目では環状７２％に対して線状３６％）。
全体として、結果は、環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＴ細胞が、線状ＲＮＡで処理された細胞と比較した、細胞内タンパク質の発現の延長を示すことを実証する。これらの結果は、線状ＲＮＡと比較した、環状ＲＮＡの毒性低下をさらに実証する。
実施例２：細胞上の環状ＲＮＡからの治療用膜タンパク質の発現
この実施例は、細胞中の環状ＲＮＡからの膜タンパク質の発現のインビトロ評価を示す。
この実施例では、ＩＲＥＳと、ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＯＲＦを含むように、環状ＲＮＡを設計した。環状ＲＮＡは、イントロンの自己スプライシングを介して、インビトロで生成した。初代ヒトＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して、Ｔ Ｃｅｌｌ培地中で３日間、活性化し、０．６ピコモル（約４００ｎｇ）の環状ＲＮＡで電気穿孔を行った。電気穿孔後２４時間で開始する各時点で、Ｔ細胞を再懸濁し、細胞の一部分をフローサイトメトリーによってＣＤ１９ ＣＡＲ表面発現並びに標的抗原結合について定量した。手短に言うと、ＣＤ１９ ＣＡＲの発現を、最初に細胞をビオチン標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１：１０００ 希釈、暗所で室温で１時間）で染色することによって検出し、２回洗浄し、次いで、ストレプトアビジン－ＡＰＣ二次抗（１：５００ 希釈、暗所で室温において１時間）と共にインキュベートした。フロー緩衝液中で２回洗浄した後、試料をフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に流して、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現及び抗原結合について定量した。死細胞及びダブレットは、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現測定の前に、標的集団から取り除いた。
図２に示す通り、環状（Ｃ）ＲＮＡと線状（Ｌ）ＲＮＡの両方からのＣＤ１９ ＣＡＲ発現が、電気穿孔後１日で検出された（それぞれ９７％及び９５％）。ＣＤ１９ ＣＡＲ 表面発現の強度は、環状ＲＮＡ電気穿孔細胞では、線状ＲＮＡ電気穿孔細胞より約３倍高かった。
全体として、この結果は、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞が、膜タンパク質の発現を示すことを実証する。
実施例３：細胞における分泌タンパク質の環状ＲＮＡ発現
この実施例は、細胞に送達された場合に分泌タンパク質を発現する環状ＲＮＡの、線状ＲＮＡと比較した半減期増大を実証する。
非天然起源の環状ＲＮＡを、細胞中で生物学的に活性な分泌タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示す通り、環状ＲＮＡからのタンパク質発現は、同じタンパク質をコードする線状ＲＮＡからの発現と比較して、より高いレベルで存在しており、これは、細胞中での環状ＲＮＡの、より長い半減期を示していた。
この実施例では、ＩＲＥＳと、ガウシアルシフェラーゼをコードするＯＲＦと、ＩＲＥＳ－ＯＲＦと隣接する２つのスペーサー要素を含むように、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを設計した。環状ＲＮＡは、インビトロで、次の通りに生成した：非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムで再び精製した。スプリントでライゲーションされた環状ＲＮＡは、転写された線状ＲＮＡとＤＮＡスプリントの、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）での処理によって生成した。
環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を、４％変性ＰＡＧＥ上で分離させ、環状ＲＮＡと線状ＲＮＡのそれぞれに該当するＲＮＡバンドを切り出した。線状ＲＮＡは、同じ４％変性ＰＡＧＥゲルを使用して精製した。切り出されたＲＮＡのゲル断片（線状又は環状）を、粉砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間、ゲル溶離緩衝液（０．５Ｍ ＮａＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ ＳＤＳ）で溶離した。上清を回収し、粉砕されたゲルにゲル溶離緩衝液を添加することによってＲＮＡを再度溶離し、１時間インキュベートした。遠心フィルターによってゲルデブリを除去し、エタノールでＲＮＡを沈殿させた。
細胞中でのＲＮＡからのタンパク質の発現をモニタリングするために、５×１０３細胞を、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２ｎＭの線状又は環状ＲＮＡを用いて、成功裏にリバーストランスフェクションさせた。発現の尺度として、ガウシアルシフェラーゼ活性を、ガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイキット（Ｆｌａｓｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）を使用し、且つ製造業者の説明に従って、細胞培養上清において、最大１４日間、毎日モニタリングした。
図３は、ＨｅＬａ細胞における、９日間よりも長い間の、線状ＲＮＡの４～６日と比較して、より長い間の環状ＲＮＡからの分泌タンパク質発現を示す。
実施例４：ヒト初代Ｔ細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする環状及び線状ＲＮＡコンストラクトから、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現した
この実施例は、環状ＲＮＡが、ヒト初代Ｔ細胞中で膜タンパク質として機能性のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する能力を実証する。
この実施例では、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）のｐｒｅ－ｔＲＮＡから得られた自己スプライシングモチーフが上流及び下流に隣接するＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＯＲＦと共に、ＩＲＥＳを含むように、環状ＲＮＡを設計した。環状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロ転写によって生成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製した。ＧＴＰ（最終濃度：２ｍＭ）及びＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（ＮＥＢ、Ｃａｔ＃ Ｂ７００４Ｓ）を含有する自己スプライシング反応物を、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を使用して精製した。残った線状ＲＮＡを除去するために、試料をＲＮａｓｅ Ｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ＲＮＲ０７２５０）で処理した。環状ＲＮＡを、尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶出し、エタノール沈殿させ、ＲＮａｓｅ保存溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）に再懸濁した。ＲＮＡを、使用前に、１ピコモル／μＬの濃度に希釈した。さらに、線状ＲＮＡ同等物を生成し、それぞれヒトαグロビン５’及び３’ＵＴＲが上流及び下流に隣接する同じＣＤ１９ ＣＡＲ ＯＲＦを含んでいた。
初代ヒトＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃ １１１３２Ｄ）を使用して、Ｔｃｅｌｌ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃ Ａ１０４８５０１）中で３日間活性化した。ビーズ除去後、活性化されたＴ細胞（１００，０００細胞）を、ネオン電気穿孔システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、０．６５ピコモル（約５００ｎｇ）の環状又は線状ＲＮＡで電気穿孔を行った。ビヒクルのみの対照として、ＲＮＡ保存溶液を単独で使用した。
電気穿孔後２４時間の時点で、Ｔ細胞を再懸濁し、試料の一部分をフローサイトメトリーによってＣＤ１９ ＣＡＲ表面発現について定量した。手短に言うと、細胞を、ＦＩＴＣ結合組換えＣＤ１９（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ ＣＤ９－ＨＦ２Ｈ２）で染色し、フロー緩衝液（ＰＢＳ＋５％ ＦＢＳ）に再懸濁し、暗所で１時間、４℃でインキュベートした。細胞を、フロー緩衝液中で２回洗浄し、暗所で５分間、Ｄａｐｉ（フロー緩衝液で１：１０００希釈）で染色した。フロー緩衝液中での最終の洗浄後、試料をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に流して、ＣＤ１９－ＦＩＴＣ結合について測定した。細胞デブリ、ダブレット及び死細胞は、ＣＤ１９結合測定の前に、標的集団から取り除いた。
図４に示す通り、環状ＲＮＡと線状ＲＮＡのどちらからのＣＤ１９ ＣＡＲ発現も、電気穿孔後２４時間の時点で検出され、ビヒクルのみの対照より高いことが観察された。環状ＲＮＡ電気穿孔細胞からのＣＤ１９ ＣＡＲ発現は、線状ＲＮＡ電気穿孔細胞よりおよそ３倍高いことが観察された。
この実施例は、ＣＤ１９ ＣＡＲが、ＣＤ１９ ＣＡＲタンパク質をコードする環状及び線状ＲＮＡコンストラクトで電気穿孔を行った初代ヒトＴ細胞上で膜タンパク質として成功裏に発現されたことを実証した。
実施例５：環状ＲＮＡコンストラクトからＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞は、腫瘍細胞を死滅させることができる
この実施例は、環状ＲＮＡが、ヒト初代Ｔ細胞中で膜タンパク質として機能性のキメラ抗原受容体を発現する能力を実証する。
この実施例では、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）のｐｒｅ－ｔＲＮＡから得られた自己スプライシングモチーフが上流及び下流に隣接するＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＯＲＦと共に、ＩＲＥＳを含むように、環状ＲＮＡを設計した。環状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロ転写によって生成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製した。ＧＴＰ（最終濃度：２ｍＭ）及びＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（ＮＥＢ、Ｃａｔ＃ Ｂ７００４Ｓ）を含有する自己スプライシング反応物を、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を使用して精製した。残った線状ＲＮＡを除去するために、試料をＲＮａｓｅ Ｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ＲＮＲ０７２５０）で処理した。環状ＲＮＡを、尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶出し、エタノール沈殿させ、ＲＮａｓｅ保存溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）に再懸濁した。ＲＮＡを、使用前に、１ピコモル／μＬの濃度に希釈した。
初代ヒトＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃ １１１３２Ｄ）を使用して、Ｔｃｅｌｌ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃ Ａ１０４８５０１）中で３日間活性化した。ビーズ除去後、活性化されたＴ細胞（１００，０００細胞）を、ネオン電気穿孔システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、０．６５ピコモル（約５００ｎｇ）の環状ＲＮＡで電気穿孔を行った。ビヒクルのみの対照として、ＲＮＡ保存溶液を単独で使用した。
ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞が腫瘍細胞を死滅させる能力を、腫瘍細胞死滅アッセイによって決定した（図５）。簡単に言うと、ＣＤ１９表面抗原を発現するＲａｊｉ腫瘍細胞を、製造業者の説明に従って膜染料ＰＨＫ２６（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃ ＭＩＮＩ２６）で染色し、次いで、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現Ｔ細胞と共に、１：１～２０：１の範囲のエフェクター－標的比で、３７℃で１８時間、インキュベートした。その後、細胞懸濁液を、暗所で５分間、Ｄａｐｉ（フロー緩衝液で１：１０００希釈）で染色した。細胞懸濁液を、ＦＡＣＳチューブに直接移し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に流して、ダブルポジティブ（ＰＫＨ＋、Ｄａｐｉ＋）細胞に対してゲート設定する（これは、全細胞集団中の死んだＲａｊｉ（腫瘍細胞）の％を表す）ことによって腫瘍細胞死滅を測定した。細胞デブリ及びダブレットは、腫瘍細胞死滅アッセイ測定の前に、標的集団から取り除いた。
図６に示す通り、トランスフェクトされた環状ＲＮＡから得られた、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ビヒクルのみの対照と比較して、より大きいＲａｊｉ腫瘍細胞死滅能力を呈した。これは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の、ＣＤ１９ ＣＡＲ依存性の死滅を示唆する。
この実施例は、機能性のＣＤ１９ ＣＡＲが、ＣＤ１９ ＣＡＲ配列をコードする環状ＲＮＡコンストラクトで電気穿孔を行った初代ヒトＴ細胞上で膜タンパク質として成功裏に発現されることを実証した。これは、治療的意義を有する電気穿孔を行ったＴ細胞の、ＣＤ１９ ＣＡＲ依存性の下流エフェクター機能をさらに実証した。環状ＲＮＡから発現されたＣＤ１９ ＣＡＲを有するＴ細胞は、腫瘍細胞を死滅させることが可能であった。
実施例６：ヒト網膜細胞株への、担体を用いる環状ＲＮＡ又は修飾線状ＲＮＡの送達及びタンパク質への翻訳
この実施例は、非修飾環状ＲＮＡの、ヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ－１９への送達を実証する。
この実施例では、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡは、購入し（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌ－７２０１）、環状ＲＮＡ鋳型とは異なるコドン最適化されたｅＧＦＰ ＯＲＦを含有している。このｍＲＮＡは、最適なキャップ依存性翻訳に必要な従来の修飾 （５’及び３’ヒトベータグロビンＵＴＲ、５’キャップ、３’ポリ（Ａ）テール、１００％のメトキシ－シュードウリジンヌクレオチド置換）を含有していた。
この実施例では、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する環状ＲＮＡを設計した。
この環状ＲＮＡは、インビトロで生成した。非修飾線状ＲＮＡは、上に列挙したすべてのモチーフ並びに転写を駆動するためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、ＤＮＡ鋳型から、インビトロで転写させた（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＡＳＦ３５０７）。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、同じ種類のＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（５’－ＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴ－３’）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、滅菌状態下で水中に再懸濁させた。
ＲＮＡを、水で希釈して４５ｇ／Ｌ（１μＭ）の濃度とし、次いで、１０μＬの総体積のリポフェクタミン担体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＬＭＲＮＡ００３）と複合体形成させた。合計０．１ピコモルのＲＮＡを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が添加された３７℃のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）：Ｆ１２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、３０－２００６）に蒔かれた５，０００個のＡＲＰＥ－１９細胞にトランスフェクトさせた。すべての試薬は、混合する前に室温に戻し、また、混合物は、製造業者の説明に従って、使用の直前に調製した。陰性対照として、処理されていない対照（担体なし且つＲＮＡなし）を使用した。
細胞中のＲＮＡ翻訳持続性を決定するために、培養皿を、ＥＶＯＳ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍ７０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することにより、緑色蛍光について毎日分析した。培養物の画像を、４×、１０×及び２０×倍率で、明視野（可視波長）及び緑色蛍光（「ＧＦＰチャネル」、５１０ｎｍ）で撮影した。蛍光シグナルは、明視野からの画像としてのインタクト細胞と蛍光を共存させると重なる場合にポジティブであると考えられた。
ｅＧＦＰによる蛍光シグナルを、環状ＲＮＡでのトランスフェクション後、また修飾ｍＲＮＡでのトランスフェクション後、１６時間の時点で、細胞中で検出した。
この実施例は、環状ＲＮＡが、担体の存在下でのトランスフェクションを介して、成功裏に送達され、且つヒト網膜細胞培養物、ＡＲＰＥ－１９細胞において効率的に翻訳されることを実証した。
実施例７：フェニルアラニンをチロシンに変換する、細胞中の機能性のフェニルアラニン水酸化酵素の環状ＲＮＡ発現
この実施例は、細胞中で、環状ＲＮＡが、治療効果を有する機能性の酵素を発現する能力を実証する。
フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）は、フェニルアラニンのヒドロキシル化を触媒してチロシンを生成する酵素である。ヒトにおけるフェニルアラニンの主要供給源は、摂取されたタンパク質であり、そのうちの大部分は、その後、ＰＡＨによって異化されてチロシンを形成し、その後、これは、後続の異化ステップで分解される可能性がある。ＰＡＨをコードする遺伝子の変異は、深刻な代謝障害であるフェニルケトン尿症をもたらす可能性があり、ここではフェニルアラニンレベルが体内で上昇している。疾患における機能性のＰＡＨの発現は、体内のフェニルアラニンレベルを低下させることができ、したがって、治療的利益を有する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳと、マウスフェニルアラニンヒドロリアーゼ（ｍＰＡＨ）をコードするＯＲＦと、スペーサー（ＩＳ又はＥ１Ｅ２）を含むように設計した。環状ＲＮＡを生成するために、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって線状ＲＮＡを生成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製カラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡカラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、Ｔ２０５０）で再び精製した。ＲｐｐＨ処理された線状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＩＳについては５’－ＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’、Ｅ１Ｅ２については５’－ＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＧＣＧＴＣＴＣ－３’）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化させた。環状ＲＮＡを、尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶出し、エタノール沈殿させ、ＲＮＡ保存溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ７０００）に再懸濁した。
次いで、各環状ＲＮＡを、製造業者の説明に従ってＭａｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトさせた。１００万個の細胞をトランスフェクトするために、２ピコモルの環状ＲＮＡを使用し、６ウェルプレートにプレーティングした。陰性対照については、ビヒクルのみを使用した。
下流解析のための細胞抽出物を調製するために、２４及び７２時間後にこすり取り、且つ遠心分離によるペレット化により、トランスフェクトされた細胞を収集した。細胞ペレットを、５０ｍＭスクロース、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、７８４３０）を含む、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。微細針（２０×）を通過させることによって細胞を均質化させた。次いで、スクロース濃度を０．２５Ｍに上昇させ、遠心分離（１４０００ｇ、１０分、４℃）によって抽出物を清澄化させた。ＢＣＡタンパク質アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、タンパク質濃度を正規化した。
ＰＡＨレベルを、ウエスタンブロットによって評価した。簡単に言うと、ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１．５μｇのタンパク質を、１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、ｉＢｌｏｔ２ ｄｒｙｉｎｇ ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍによってニトロセルロース膜に転写した。タンパク質は、一次抗体としてのＰＡＨに対するウサギ抗体（Ａｂｃａｍ）及びβアクチン（Ａｂｃａｍ、ローディングコントロール）及び二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ免疫グロブリンＧを用いて検出した。膜結合型抗体は、イメージングシステム（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用する高感度ケミルミネッセンス法（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検出した。ＰＡＨタンパク質を、ウエスタンブロットによって観察し、試験された両方の環状ＲＮＡを使用する細胞中で、ビヒクルのみの対照より大きい程度まで発現していた（図７）。
ＰＡＨ活性を測定するために、１０μｇの細胞溶解物を、１ｍＭのＬ－フェニルアラニン及び１ｍｇ／ｍｌのカタラーゼ（１００ｍＭ Ｎａ－ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）中）と共に、５分間（３０℃）プレインキュベートした。硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）を、１００μＭの最終濃度まで添加し、１分間インキュベートした。ＢＨ４（最終濃度７５μＭ）及びＤＴＴ（最終濃度２ｍＭ）を添加することによって反応を開始し、３０℃で２時間インキュベートした。試料を９５℃で１０分間インキュベートすることによって反応を停止させ、遠心分離（１４０００ｇ、３分）によって清澄化させた。反応中にＰＡＨによってフェニルアラニンから変換されたチロシンレベルを、製造業者の説明に従うチロシン定量キット（Ｓｉｇｍａ、ＭＡＫ２０１９）によって測定した。
図８に示す通り、試験された両方の環状ＲＮＡによって細胞中で発現されたＰＡＨタンパク質は、機能性であり、フェニルアラニンをチロシンに変換することができた。環状ＲＮＡで処理された細胞中のチロシンレベルは、ヒクルのみの対照で処理された細胞中のチロシンレベルより高かった。ＰＡＨ ＯＲＦを有する環状ＲＮＡから発現されたＰＡＨは、ビヒクルのみの対照に対しておよそ１０倍高い、有意な酵素活性を示した。インビトロ定量によって示される酵素活性は、ＰＡＨタンパク質の発現と相関しており、最大３日保持された。
この実施例は、環状ＲＮＡからの、ＨＥＫ２９３細胞における機能性タンパク質の成功裏の発現を実証した。
実施例８：環状ＲＮＡは、細胞中で、線状ＲＮＡより安定である
この実施例は、細胞に送達された場合に分泌タンパク質を発現する環状ＲＮＡの、線状ＲＮＡと比較した半減期増大を実証する。
非天然起源の環状ＲＮＡを、細胞中で生物学的に活性な分泌タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示す通り、環状ＲＮＡは、同じタンパク質をコードする線状ＲＮＡと比較して、長い間検出され、これは、細胞中での環状ＲＮＡの、より長い半減期を示していた。
この実施例では、ＩＲＥＳと、ガウシアルシフェラーゼをコードするＯＲＦと、ＩＲＥＳ－ＯＲＦと隣接する２つのスペーサー要素を含むように、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを設計した。環状ＲＮＡは、インビトロで、次の通りに生成した：非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムで再び精製した。スプリントでライゲーションされた環状ＲＮＡは、転写された線状ＲＮＡとＤＮＡスプリントの、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）での処理によって生成した。
環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を、４％変性ＰＡＧＥ上で分離させ、環状ＲＮＡと線状ＲＮＡのそれぞれに該当するＲＮＡバンドを切り出した。線状ＲＮＡは、同じ４％変性ＰＡＧＥゲルを使用して精製した。切り出されたＲＮＡのゲル断片（線状又は環状）を、粉砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間、ゲル溶離緩衝液（０．５Ｍ ＮａＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ ＳＤＳ）で溶離した。上清を回収し、粉砕されたゲルにゲル溶離緩衝液を添加することによってＲＮＡを再度溶離し、１時間インキュベートした。遠心フィルターによってゲルデブリを除去し、エタノールでＲＮＡを沈殿させた。
細胞中でのＲＮＡ安定性をモニタリングするために、５×１０３細胞を、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２ｎＭの線状又は環状ＲＮＡを用いて、成功裏にリバーストランスフェクションさせた。細胞溶解物を収集して、定量ＲＴ－ＰＣＲによってＲＮＡレベルをモニタリングした。環状ＲＮＡレベルは、トランスフェクション後６時間及び１～４日の時点で、ＧＬｕｃ特異的Ｑ－ＰＣＲによって分析した。簡単に言うと、ｃＤＮＡを、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｔ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ４４０２９５３）を使用し、製造業者の説明に従うランダムプライミングによって細胞溶解物から生成した。変化の倍数を、ハウスキーピング遺伝子としてβ－アクチンを使用して、Ｐｆａｆｆｌ方法を使用して算出した。
図９は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡの２日と比較して、ＨｅＬａ細胞では、４日（１２０時間）よりも長く安定であることを示す。
実施例９：環状ＲＮＡは、細胞中で、線状ＲＮＡより免疫原性が低い
この実施例は、細胞に送達された場合に分泌タンパク質を発現する環状ＲＮＡによって誘発される、線状ＲＮＡと比較した低い免疫原性応答を実証する。
非天然起源の環状ＲＮＡを、細胞中で生物学的に活性な分泌タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示す通り、環状ＲＮＡは、同じタンパク質をコードする線状ＲＮＡと比較して、免疫応答遺伝子ＲＩＧＩ及びＭＤＡ５の、より低い発現を誘発し、これは、細胞中での環状ＲＮＡによる、より低い免疫原性を示していた。
この実施例では、ＩＲＥＳと、ガウシアルシフェラーゼをコードするＯＲＦと、ＩＲＥＳ－ＯＲＦと隣接する２つのスペーサー要素を含むように、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを設計した。環状ＲＮＡは、インビトロで、次の通りに生成した：非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムで再び精製した。スプリントでライゲーションされた環状ＲＮＡは、転写された線状ＲＮＡとＤＮＡスプリントの、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）での処理によって生成した。
環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を、４％変性ＰＡＧＥ上で分離させ、環状ＲＮＡと線状ＲＮＡのそれぞれに該当するＲＮＡバンドを切り出した。線状ＲＮＡは、同じ４％変性ＰＡＧＥゲルを使用して精製した。切り出されたＲＮＡのゲル断片（線状又は環状）を、粉砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間、ゲル溶離緩衝液（０．５Ｍ ＮａＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ ＳＤＳ）で溶離した。上清を回収し、粉砕されたゲルにゲル溶離緩衝液を添加することによってＲＮＡを再度溶離し、１時間インキュベートした。遠心フィルターによってゲルデブリを除去し、エタノールでＲＮＡを沈殿させた。
細胞中でのＲＮＡ安定性をモニタリングするために、５×１０３細胞を、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２ｎＭの線状又は環状ＲＮＡを用いて、成功裏にリバーストランスフェクションさせた。細胞溶解物を収集して、定量ＲＴ－ＰＣＲによってＲＮＡレベルをモニタリングした。環状ＲＮＡレベルは、トランスフェクション後６時間及び１～４日の時点で、ＧＬｕｃ特異的Ｑ－ＰＣＲによって分析した。簡単に言うと、ｃＤＮＡを、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｔ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ４４０２９５３）を使用し、製造業者の説明に従うランダムプライミングによって細胞溶解物から生成した。変化の倍数を、ハウスキーピング遺伝子としてβ－アクチンを使用して、Ｐｆａｆｆｌ方法を使用して算出した。
結果は、ＨｅＬａ細胞における、環状ＲＮＡによる、線状ＲＮＡと比較して、細胞中でのより低い免疫原性を示した。
実施例１０：環状ＲＮＡは、細胞中で、線状ＲＮＡより毒性が低い
この実施例は、細胞に送達された場合に分泌タンパク質を発現する環状ＲＮＡによって誘発される、線状ＲＮＡと比較した低い細胞毒性を実証する。
非天然起源の環状ＲＮＡを、細胞中で生物学的に活性な分泌タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示す通り、細胞増殖は、細胞が環状ＲＮＡでトランスフェクトされた場合、同じタンパク質をコードする線状ＲＮＡと比較した場合により低い影響を受け、これは、細胞中での環状ＲＮＡによる、より低い細胞毒性を示していた。
この実施例では、ＩＲＥＳと、ガウシアルシフェラーゼをコードするＯＲＦと、ＩＲＥＳ－ＯＲＦと隣接する２つのスペーサー要素を含むように、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを設計した。環状ＲＮＡは、インビトロで、次の通りに生成した：非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムで再び精製した。スプリントでライゲーションされた環状ＲＮＡは、転写された線状ＲＮＡとＤＮＡスプリントの、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）での処理によって生成した。
環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を、４％変性ＰＡＧＥ上で分離させ、環状ＲＮＡと線状ＲＮＡのそれぞれに該当するＲＮＡバンドを切り出した。線状ＲＮＡは、同じ４％変性ＰＡＧＥゲルを使用して精製した。切り出されたＲＮＡのゲル断片（線状又は環状）を、粉砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間、ゲル溶離緩衝液（０．５Ｍ ＮａＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ ＳＤＳ）で溶離した。上清を回収し、粉砕されたゲルにゲル溶離緩衝液を添加することによってＲＮＡを再度溶離し、１時間インキュベートした。遠心フィルターによってゲルデブリを除去し、エタノールでＲＮＡを沈殿させた。
細胞中での細胞毒性をモニタリングするために、５×１０３細胞を、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２ｎＭの線状又は環状ＲＮＡを用いて、成功裏にリバーストランスフェクションさせた。細胞毒性の直接的尺度として、細胞生存率を使用した。明視野イメージング並びにＡＴＰ生成を使用して、細胞生存率をモニタリングした。細胞を培養状態で画像化し、細胞溶解物を収集してＣｅｌｌＴｉｔｅ－Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰレベルをモニタリングし、製造業者の説明に従って発光を測定した。
図１０は、環状ＲＮＡによる、線状ＲＮＡと比較して、細胞中でのより低い毒性を示す。
実施例１１：環状ＲＮＡは、直接的に特定の細胞型への送達を媒介した
この実施例は、環状ＲＮＡ内に含有されるＲＮＡアプタマー配列を介する、環状ＲＮＡを標的細胞上の治療関連タンパク質にターゲティングする能力を実証する。
この実施例については、環状ＲＮＡは、ヒトトランスフェリン受容体（５’－ＧＧＧ ＧＧＡ ＵＣＡ ＡＵＣ ＣＡＡ ＧＧＧ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＡＡ ＣＧＣ ＵＣＣ ＣＵＵ ＡＣＡ ＣＣＣ Ｃ－３’）に競合的に結合することが公知のＣ２ｍｉｎアプタマー配列；又はヒトトランスフェリン受容体に非競合的に結合することが公知の３６ａ（５’－ＧＧＧ ＵＧＡ ＡＵＧ ＧＵＵ ＣＵＡ ＣＧＡ ＵＡＡ ＡＣＧ ＵＵＡ ＡＵＧ ＡＣＣ ＡＧＣ ＵＵＡ ＵＧＧ ＣＵＧ ＧＣＡ ＧＵＵ ＣＣＵ ＡＵＡ ＧＣＡ ＣＣＣ－３’）アプタマー配列のいずれかを含んでいた。環状ＲＮＡは、可視化のための蛍光一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためのスペーサー領域を含むように設計した。ヒトトランスフェリン受容体に結合しないことが予測されるアプタマー配列を含む、対照環状ＲＮＡも使用した。これらの環状ＲＮＡの概略図を、図１１に示す。
この環状ＲＮＡは、インビトロで生成した。非修飾線状ＲＮＡは、上に列挙したすべてのモチーフ並びに転写を駆動するためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、ＤＮＡ鋳型から、インビトロで転写させた。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理された線状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＧＴＴ ＧＧＴ－３’又は５’－ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＴＧ ＧＴＴ ＧＧＴ－３’）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａｓｅ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁させた。
細胞内の可視化のために、アプタマーを標識するために、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を伴う短い一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用した（５’－ＡＦ４８８－ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＧＴＴ ＧＧＴ－３’又は５’－ＡＦ４８８－ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＴＧ ＧＴＴ ＧＧＴ－３’、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ）。蛍光ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを、環状ＲＮＡに対して３×モル過剰で添加し、６０℃で１０分間インキュベートし、続いて、１５０ｍＭ ＫＣＬの存在下で室温において２０分のインキュベーションを行った。ＲＮＡ緩衝液を、マイクロバイオスピン（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓｐｉｎ）カラム（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、ＰＢＳに交換した。
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングさせた環状ＲＮＡを、１００μＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中の０．１μＭの最終濃度で、ＨｅＬａ細胞に添加した。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ＤＡＰＩ溶液を含むＦｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅに移した。細胞を、Ｅｖｏｓセルイメージャー（ｃｅｌｌ ｉｍａｇｅｒ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して画像化した。
ヒトトランスフェリンへの環状ＲＮＡ結合を、蛍光顕微鏡検査によって評価した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８活性は、ＨｅＬａ細胞内部で、Ｃ２ｍｉｎ及び３６ａアプタマーが環状ＲＮＡ中に含有された場合の点状の蛍光シグナルとして検出した（図１２）。対照的に、非結合アプタマー配列を含有する対照の環状ＲＮＡについては、蛍光シグナルは観察されなかった。これは、環状ＲＮＡ内に含有されるアプタマー配列が、トランスフェリン受容体結合を介する内部移行を担うことを示す。
この実施例は、環状ＲＮＡ内にコードされるＲＮＡアプタマー配列が、標的タンパク質と結合し、特定の表面受容体との相互作用を介して哺乳動物細胞への取り込みを増大させることができることを実証した。
実施例１２：ＲＮＡアプタマー配列を含有する一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした環状ＲＮＡは、表面タンパク質を標的にすることができ、環状ＲＮＡの取り込みが可能になる。
この実施例は、環状ＲＮＡとハイブリダイズする一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドに含有されるＲＮＡアプタマー配列を介する、環状ＲＮＡの、標的細胞上の治療関連へのターゲティングを記載する。
この実施例では、線状一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒトトランスフェリン受容体（５’－ＧＧＧ ＧＧＡ ＵＣＡ ＡＵＣ ＣＡＡ ＧＧＧ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＡＡ ＣＧＣ ＵＣＣ ＣＵＵ ＡＣＡ ＣＣＣ Ｃ－３’）に競合的に結合することが公知のＣ２ｍｉｎアプタマー配列；又はヒトトランスフェリン受容体に非競合的に結合することが公知の３６ａ（５’－ＧＧＧ ＵＧＡ ＡＵＧ ＧＵＵ ＣＵＡ ＣＧＡ ＵＡＡ ＡＣＧ ＵＵＡ ＡＵＧ ＡＣＣ ＡＧＣ ＵＵＡ ＵＧＧ ＣＵＧ ＧＣＡ ＧＵＵ ＣＣＵ ＡＵＡ ＧＣＡ ＣＣＣ－３’）アプタマー配列のいずれかを含む。この線状一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、環状ＲＮＡへのハイブリダイゼーションのための結合モチーフも含む。環状ＲＮＡは、アプタマー含有一本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための相補的結合領域並びにＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）ＯＲＦを含む。ヒトトランスフェリン受容体に結合しないことが予測されるアプタマー配列を含む、一本鎖線状ＲＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする、上に記載したものと同じ環状ＲＮＡを使用して、対照の複合体を生成する。これらの実体の概略図を、図１３に示す。
この環状ＲＮＡは、インビトロで生成する。非修飾線状ＲＮＡは、上に列挙したすべてのモチーフ並びに転写を駆動するためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、ＤＮＡ鋳型から、インビトロで転写させる。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムで再び精製する。ＲｐｐＨ処理された線状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＧＴＴ ＧＧＴ－３’又は５’－ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＴＧ ＧＴＴ ＧＧＴ－３’）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化させる。環状ＲＮＡを、尿素－ＰＡＧＥ精製し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶出し、エタノール沈殿させ、ＲＮａｓｅ保存溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）に再懸濁する。
この実施例では、線状一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によってカスタム合成され、上述のアプタマー配列及び結合モチーフを含有する。
この線状一本鎖ＲＮＡ オリゴヌクレオチドは、（１）非修飾である；又は（２）Ｋｒａｔｓｃｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．２７（６）：３３５－３４４に記載されている５’－フルオロ修飾を含有する；又は（３）５’－ヒドロキシル部分又は２’－Ｏ－メチル修飾などの修飾を含むように修飾されている。
一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、環状に対して３×モル過剰で添加し、６０℃で１０分間インキュベートし、次いで、１５０ｍＭ ＫＣＬの存在下で室温まで徐々に冷却する。ＲＮＡ緩衝液を、マイクロバイオスピン（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓｐｉｎ）カラム（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、ＰＢＳに交換する。アニーリングを、アガロースゲル電気泳動によって確認する。
アプタマー含有ＲＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングさせた環状ＲＮＡを、１００μＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中の０．１μＭの最終濃度で、ＨｅＬａ細胞に添加する。複数の時点で研究が行われる。３７℃でのインキュベーションの１時間、６時間、１２時間、２４時間及び４８時間後に細胞を回収する。
各コンストラクトについての送達の効率を、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定する。回収後、溶解細胞にＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｃｅｌｌ ｔｏ Ｃｔ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃ ４４０２９５３）を使用し、製造業者の説明に従って逆転写させる。ＧＬｕｃ特異的プライマー（フォワード；ＣＣＴＧＡＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧ リバース；ＣＴＴＣＴＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡ）及びｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ＲＡＤ、ｃａｔ＃ １７２５１２０）を用いてｑＲＴ－ＰＣＲが実施され、リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－ＲＡＤ）によってモニタリングされることとなる。
実施例１３：環状ＲＮＡの単離及び精製
この実施例は、環状ＲＮＡ精製を実証する。
ある種の実施形態において、先の実施例において記載した環状ＲＮＡを、コードされるタンパク質産物の発現の前に、単離及び精製することができる。この実施例は、尿素ゲル分離を使用する単離を実証する。以下の実施例に示す通りに、環状ＲＮＡを単離及び精製した。
環状ＲＮＡ１を、終止コドン（２６４ｎｔ）なしで三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。それは、翻訳開始のために開始コドンにおいてコザック配列（配列番号１１）を有する。環状ＲＮＡ２は、それが終止要素（三重終止コドン）（２７３ｎｔ、配列番号１２）を有することを除いて、環状ＲＮＡ１と同一の配列を有する。環状ＲＮＡ３を、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号２８）なしで、スタガー要素（２Ａ配列）によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。環状ＲＮＡ４は、それが終止要素（三重終止コドン）（３３９ｎｔ）を有することを除いて、環状ＲＮＡ３と同一の配列を有する。環状ＲＮＡ５を、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号２９）をコードするように設計した。環状ＲＮＡ６は、ナノルシフェラーゼ配列（７６２ｎｔ、配列番号３０）の末端において、ＥＧＦ及びナノルシフェラーゼ遺伝子及び終止要素（三重終止コドン）間に終止要素（三重終止コドン）を含んでいたことを除いて、環状ＲＮＡ５と同一の配列を有する。ＣｉｒｃＲＮＡ１、ＣｉｒｃＲＮＡ２、ＣｉｒｃＲＮＡ３、ＣｉｒｃＲＮＡ４、ＣｉｒｃＲＮＡ５及びＣｉｒｃＲＮＡ６を、本明細書に記載した通りに単離した。
この実施例において、線状及び環状ＲＮＡを記載されるように生成した。環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を６％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグメントを破砕し、ＲＮＡを８００μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破片を遠心分離フィルターによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。溶離された環状ＲＮＡを６％の変性ＰＡＧＥによって分析した（図１４を参照されたい）。
単一のバンドを、可変サイズを有する環状ＲＮＡについてＰＡＧＥによって視覚化した。
実施例１４：環状ＲＮＡは、細胞内における線状ＲＮＡより長い半減期を実証した
この実施例は、環状ＲＮＡが細胞内に送達され、線状ＲＮＡと比較して細胞内での増加した半減期を有することを実証する。
非天然環状ＲＮＡを、生物活性治療用タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較してより高いレベルで存在し、これは、環状ＲＮＡのより長い半減期を実証している。
この実施例において、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、コザック、２Ａによって隣接されるＥＧＦ、終止又は非終止配列（配列番号９～１２）をコードするように設計した。細胞中のＲＮＡの半減期を監視するために、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。プライマー配列は、以下のとおりであった：線状又は環状ＲＮＡについてのプライマー、Ｆ：ＡＣＧＡＣＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＴＧＴＡＴ、Ｒ：ＴＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣ；環状ＲＮＡについてのプライマー、Ｆ：ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＴ、Ｒ：ＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣ。
環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。２４時間後、保持された環状及び線状ＲＮＡを、ｑＰＣＲを用いて測定した。図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して細胞内におけるより長い半減期を有することが示された。
実施例１５：合成環状ＲＮＡは、細胞内における低下した免疫原性遺伝子発現を実証した
この実施例は、環状ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有するように操作されることを実証する。
治療用タンパク質をコードした環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、レシピエント細胞内での免疫原性関連遺伝子（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＡ及びＩＦＮ－β）の低下した誘導を示した。ＲＩＧ－Ｉは、短い５’トリホスフェート非キャップ二本鎖又は一本鎖ＲＮＡを認識し得る一方、ＭＤＡ５は、より長いｄｓＲＮＡを認識し得る。ＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ５の両方は、ＭＡＶＳを活性化し、抗ウイルス応答を引き起こすことに関与し得る。ＰＫＲは、ｄｓＲＮＡによって活性化され、ＩＦＮ－βなどのインターフェロンによって誘導され得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、ｑ－ＰＣＲによるＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの発現によって評価した際、類似した線状ＲＮＡより、２９３Ｔ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された。
環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、（１）コザック、終止要素（配列番号９）を有さない３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列；（２）コザック、終止要素（終止コドン）（配列番号２１）によって隣接された３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ；（３）コザック、２Ａ配列（配列番号１０）によって隣接された３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ；又は（４）コザック、２Ａ配列によって隣接された３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列、続いて終止要素（終止コドン）（配列番号１１）のいずれかをコードするように設計した。
この実施例において、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養することにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
使用されるプライマー配列：ＧＡＰＤＨについてのプライマー、Ｆ：ＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴ、Ｒ：ＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡ；ＲＩＧ－Ｉ、Ｆ：ＴＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡ、Ｒ：ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＧＣ；ＭＤＡ５、Ｆ：ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴＴ、Ｒ：ＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧ；ＰＫＲ、Ｆ：ＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＧ、Ｒ：ＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ；ＩＦＮ－β、Ｆ：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣ、Ｒ：ＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧ。
図１６に示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの減少を示した。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少された。
実施例１６：細胞内におけるローリングサークル型翻訳による合成環状ＲＮＡからの増加した発現
この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳からの増加した発現を実証する。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）なしで、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照遺伝子と共にＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号１３）；ｎＬＵＣ ｓｔｏｐ（配列番号１４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３×ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣスタガー（配列番号１５）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３×ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図１７に示されるように、両方の環状ＲＮＡは、機能的ルシフェラーゼ活性を有する翻訳産物を生成した。
この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図１７に示す通り、どちらの環状ＲＮＡも、細胞中でタンパク質を発現した。しかし、終止要素（終止コドン）を欠いている、スタガー要素（例えば２Ａ配列）を有する環状ＲＮＡは、終止要素（終止コドン）を有する環状ＲＮＡより高いレベルの、機能性ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質産物をもたらした。
実施例１７：環状ＲＮＡから発現される増加したタンパク質
この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この実施例は、環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量のより多い発現産物を生成したことを示す。
線状及び環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）と共にナノルシフェラーゼ遺伝子を含むように設計した。細胞を、ビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎＬＵＣ（配列番号１４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３×ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）；又は環状ｎＬＵＣ（配列番号１４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３×ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）でトランスフェクトした。図１８に示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、適切な分子量を有する、より多いレベルのタンパク質を生成した。
２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
図１８に示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でタンパク質に翻訳された。特に、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較して、適切な分子量を有するより高いレベルのタンパク質を生成した。
実施例１８：細胞分裂中の環状ＲＮＡの持続性
この実施例は、細胞分裂中の環状ポリリボヌクレオチドの持続性を実証する。１つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡは、分解されずに細胞分裂を通して細胞内で持続し得る。以下の実施例に示されるように、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を発現する環状ＲＮＡをＨｅＬａ細胞内で７２時間にわたって監視した。
この実施例において、１３０７ｎｔの環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
細胞分裂にわたる環状ＲＮＡの持続性をＨｅＬａ細胞内で監視した。９６ウェルプレート中の５０００個の細胞／ウェルは、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた懸濁液であった。Ｂｒｉｇｈｔ細胞イメージングをＡｖｏｓ ｉｍａｇｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において行い、細胞計数を、０時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間の時点で発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ガウシアルシフェラーゼ酵素活性をタンパク質発現の指標として毎日監視し、ｇＬｕｃ発現を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、２４時間ごとにウェルから除去された上清中で毎日監視した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
環状ＲＮＡからのタンパク質の発現は、分裂細胞内で線状ＲＮＡより高いレベルで検出された（図１９）。環状ＲＮＡを有する細胞は、測定される全ての時点において、線状ＲＮＡと比較してより高い細胞分裂速度を有していた。この実施例は、その線状ＲＮＡ同等物より、細胞分裂中の環状ＲＮＡの増加した検出を実証する。
実施例１９：環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、低下された毒性を示す
この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡより低い毒性であることを実証する。
この実施例については、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＮａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦ（３×ＦＬＡＧタグを伴い、両側にスタガー要素（２Ａ）が隣接する）及び終止要素（終止コドン）を含む。環状ＲＮＡは、インビトロで生成し、本明細書に記載される通りに精製した。この実施例で使用される線状ＲＮＡは、グロビンＵＴＲを伴う、ｎＬｕｃをコードする、キャップ－修飾－ポリＡテールＲＮＡ又はキャップ－非修飾－ポリＡテールＲＮＡであった。
細胞中のＲＮＡの毒性をモニタリングするために、ＢＪヒト線維芽細胞を、９６ウェルプレートの各ウェル上に蒔いた。０、４８及び７２時間後、５０ｎｇの環状ＲＮＡ又はキャップ－修飾－ポリＡテール線状ＲＮＡを、製造業者の推奨に従って脂質ベースのトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してトランスフェクトさせた。９６時間の時点で、Ａｖｏｓイメージャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において、ブライトセル（Ｂｒｉｇｈｔ ｃｅｌｌ）イメージングを実施した。条件あたりの全細胞を、ＩｍａｇｅＪを使用して解析した。
図２０に示す通り、環状ＲＮＡのトランスフェクションは、線状ＲＮＡと比較して低下された毒性を示した。
実施例２０：非ウイルス性環状ＲＮＡ細胞治療のための自己由来細胞を得ること
この実施例では、非ウイルス性環状ＲＮＡ細胞治療のために、細胞が得られる。ＣＡＲ発現を使用する治療用細胞治療は、自己由来Ｔ細胞を使用して実証されている。この実施例は、非ウイルス性環状ＲＮＡ細胞治療のための自己由来Ｔ細胞を得ることを示す。
ＣＡＲ Ｔ細胞治療に適格な患者を特定し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、白血球アフェレーシス手順を介して収集する。次いで、このＰＢＭＣを、Ｔ細胞操作及び増殖のためのＧＭＰ条件下で培養する。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を、免疫磁気細胞分離手順でネガティブセレクションを使用して、ＰＢＭＣから単離する。次いで、患者Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用して（Ｔｃｅｌｌ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ培地中で３日間）活性化し、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡを用いる電気穿孔及びその後の患者への注入のための準備が完了する。
実施例２１：非ウイルス性環状ＲＮＡ細胞治療のための同種細胞を得ること
この実施例では、非ウイルス性環状ＲＮＡ細胞治療のために、細胞が得られる。ＣＡＲ発現を使用する治療用細胞治療は、同種ＮＫ細胞で実証されている。この実施例は、非ウイルス性環状ＲＮＡ細胞治療のための同種ＮＫ細胞を得ることを示す。
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ドナーから、白血球アフェレーシス手順を介して収集する。次いで、このＰＢＭＣを、標準の方法（例えば、Ｓｈｉｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２；１４：８３０－８４０ Ａ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ａｄａｐｔａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｂ－ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）を使用して、ＮＫ細胞操作及び増殖のためのＧＭＰ条件下で培養する。その後、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡを用いる電気穿孔及びその後の患者への注入のための、同種ＮＫ細胞の準備が完了する。
実施例２２：インビトロ環状ＲＮＡ生成
この実施例は、環状ＲＮＡのインビトロ生成を記載する。
図２１に示される、開始コドン（配列番号１）、ＯＲＦ（配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＩＲＥＳ（配列番号５）を有する環状ＲＮＡを設計する。環状化は、ローリングサークル型翻訳、個別のＯＲＦ発現及び制御されたタンパク質化学量論のための選択的スタガー要素を有する複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＲＮＡ免疫原性を減弱又は軽減させるためのエンクリプトゲン及びポリＡ配列を用いないリボソーム進入のためのＲＮＡを標的にする任意選択のＩＲＥＳを可能にする。
この実施例では、環状ＲＮＡは、次の通りに生成する：非修飾線状ＲＮＡを、５’－及び３’－ＺＫＳＣＡＮ１イントロン及び２Ａ配列に連結されるＧＦＰをコードするＯＲＦを有するＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって合成する。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってアルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）で処理し、ＲＮＡ精製システムで再び精製する。
スプリントライゲーション環状ＲＮＡは、転写された線状ＲＮＡとＤＮＡスプリントの、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）を使用する処理によって生成し、この環状ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｒ処理での濃縮後に単離する。ＲＮＡの質は、アガロースゲルによって又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を通して評価する。
実施例２３：インビボ環状ＲＮＡ生成、細胞培養
この実施例は、環状ＲＮＡのインビボ生成を記載する。
ＧＦＰ（配列番号２）を、発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ａｄｄｇｅｎｅ）（配列番号６）にクローニングする。このベクターは、細胞中で環状ＲＮＡ生成を誘導するように変異導入され（配列番号６及びＫｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５により記載）、これを図２２に示す。
ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎児血清を添加されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（高グルコース）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、３７℃及び５％ ＣＯ２で増殖させる。１マイクログラムの上に記載した発現プラスミドを、脂質トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞からの全ＲＮＡを、トランスフェクションの１時間～２０日後、製造業者の説明の通りにフェノールベースのＲＮＡ単離試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離する。
ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定するために、ランダムヘキサマーを使用するｑＰＣＲ逆転写を実施する。手短に言うと、ＲＴ－ｑＰＣＲについては、ＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡと、同じ起源からのＲＮａｓｅ Ｒ消化ＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲのための鋳型として使用する。ＧＦＰ ｍＲＮＡ及び環状ＧＦＰ ＲＮＡのｃＤＮＡを調製するために、製造業者の説明に従って逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ－Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ：ＲＮａｓｅ Ｈ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びランダムヘキサマーを用いて、逆転写反応を実施する。増幅されたＰＣＲ産物を、６％ ＰＡＧＥを使用して分析し、臭化エチジウム染色によって可視化する。濃縮率を推定するために、ＰＣＲ産物を、デンシトメトリー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって定量化し、全ＲＮＡ試料の濃度をＵＶ吸光度によって測定する。
さらなるＲＮＡ測定を、ノーザンブロット解析を用いて実施する。簡単に言うと、全細胞抽出物を、フェノールベースの試薬（ＴＲＩｚｏｌ）を使用して得たか、核及び細胞質タンパク質抽出物を、市販のキット（ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＮｕＣＬＥＡＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｓｉｇｍａ）を用いる細胞の分別によって得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写を阻害するために、細胞を、３７℃で０～６時間、フラボピリドール（最終濃度１ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）で処理する。ＲＮａｓｅ Ｒ処理については、１０ｍｇの全ＲＮＡを、３７℃で１時間、２０ＵのＲＮａｓｅ Ｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理する。
オリゴヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットは、次の通りに実施する。オリゴヌクレオチドプローブ、ＰＣＲプライマーは、標準のプライマー設計ツールを使用して設計する。Ｔ７プロモーター配列を、リバースプライマーに付加して、インビトロ転写反応におけるアンチセンスプローブを得る。インビトロ転写は、製造業者の説明に従って、ＤＩＧ－ＲＮＡラベリングミックスと共に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して実施する。ＤＮＡ鋳型は、ＤＮＡ Ｉ消化によって除去し、ＲＮＡプローブは、フェノールクロロホルム抽出及びそれに続く沈殿によって精製する。プローブは５０ｎｇ／ｍｌで使用する。全ＲＮＡ（２μｇ～１０μｇ）を、Ｇｌｙｏｘａｌロード染料（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して変性させ、ＭＯＰＳ緩衝液中の１．２％アガロースゲル上で分離させる。ゲルは、１×ＴＢＥに２０分間浸し、セミドライ式ブロッティングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、１時間（１５Ｖ）、Ｈｙｂｏｎｄ－Ｎ＋膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写させる。膜を乾燥させ、１×１２０，０００μＪ ｃｍ２で（２６５ｎｍで）ＵＶ架橋させる。プレハイブリダイゼーションを、６８℃で１時間行い、 ＤＩＧ標識インビトロ転写ＲＮＡプローブを、一晩ハイブリダイズさせる。膜を、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ（６８℃）中で、３０分間、３回洗浄し、それに続いて、０．２× ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ（６８℃）中での３回の３０分の洗浄を行う。アルカリホスファターゼ抗体と直接的に結合させた抗ＤＩＧを用いて、免疫検出を実施する。免疫反応性のバンドを、化学発光アルカリホスファターゼ基質（ＣＤＰ ｓｔａｒ試薬）並びに画像検出及び定量化（ＬＡＳ－４０００検出システム）を使用して可視化する。
実施例２４：環状ＲＮＡの調製及びインビトロ翻訳
この実施例は、環状ＲＮＡからの遺伝子発現及び遺伝子産物検出を記載する。
この実施例では、開始コドン（配列番号１）、ＧＦＰ ＯＲＦ（配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、ヒト由来の（－ｄｅｒｉｖｅｄ）エンクリプトゲン（配列番号４）を有し、ＩＲＥＳ（配列番号５）を有する又は有しない、環状ＲＮＡを設計する（図２３を参照されたい）。この実施例では、環状ＲＮＡは、実施例２２及び２３に記載した通り、インビトロで又は細胞中で生成させる。
環状ＲＮＡを、ウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ、ＷＩ、ＵＳＡ）中で、３０℃で、５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終組成物は、７０％ウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭメチオニン及びロイシン、２０μＭアミノ酸（メチオニン及びロイシン以外）及び０．８Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔｏｙｏｂｏ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を含む。この混合物から一定分量を取り、１０～２０％グラジエントのポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（Ａｔｔｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）上で分離させる。上清を除去し、ペレットを、７０℃で１５分間、２×ＳＤＳサンプルバッファー（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ ＳＤＳ、３０％グリセロール、５％ ２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）に溶解する。ヘモグロビンタンパク質は、このプロセス中に除去されるが、ヘモグロビン以外のタンパク質は濃縮される。
１，４００×ｇでの５分間の遠心分離後、上清を、１０～２０％グラジエントのポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販品として入手可能な標準物質（ＢｉｏＲａｄ）を、サイズマーカーとして使用する。セミドライ方法を使用してフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写させた後、ブロットを、化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を使用して可視化する。
実施例２５：環状ＲＮＡからの化学量論的タンパク質発現
この実施例は、環状ＲＮＡが、タンパク質を化学量論的に発現する能力を記載する。
この実施例では、一方の環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）並びにＧＦＰ及びＲＦＰのＯＲＦと隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に、ＧＦＰ（配列番号２）をコードするＯＲＦ及びＲＦＰ（配列番号７）をコードするＯＲＦを含むように設計する（図２４Ａを参照されたい）。もう一方の環状ＲＮＡも、同様に設計するが、隣接する２Ａ配列の代わりに、ＧＦＰのＯＲＦとＲＦＰのＯＲＦの間に終止コドン及び開始コドンを有することとなる（図２４Ｂを参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例２２及び２３に記載した通り、インビトロで又は細胞中で生成させる。
環状ＲＮＡを、ウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ、ＷＩ、ＵＳＡ）中で、３０℃で、５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終組成物は、７０％ウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭメチオニン及びロイシン、２０μＭアミノ酸（メチオニン及びロイシン以外）及び０．８Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔｏｙｏｂｏ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を含む。この混合物から一定分量を取り、１０～２０％グラジエントのポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（Ａｔｔｏ、Ｔｏｋｙｏ、，Ｊａｐａｎ）上で分離させる。上清を除去し、ペレットを、７０℃で１５分間、２×ＳＤＳサンプルバッファー（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ ＳＤＳ、３０％グリセロール、５％ ２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）に溶解する。ヘモグロビンタンパク質は、このプロセス中に除去されるが、ヘモグロビン以外のタンパク質は濃縮される。
１，４００×ｇでの５分間の遠心分離後、上清を、１０～２０％グラジエントのポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販品として入手可能な標準物質（ＢｉｏＲａｄ）を、サイズマーカーとして使用する。セミドライ方法を使用してフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写させた後、ブロットを、化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を使用して可視化する。
終止及び開始コドンによって隔てられていないＧＦＰ及びＲＦＰのＯＲＦを有する環状ＲＮＡは、等しい量のいずれかのタンパク質を有することとなるのに対して、ＯＲＦの間に開始コドン及び終止コドンを含む環状ＲＮＡで処理された細胞は、異なる量のいずれかのタンパク質を有することとなることが予測される。
配列表
配列番号１（開始コドン）
ＡＵＧ
配列番号２（ＧＦＰ）
ＥＧＦＰ：
Figure 2022537154000002
配列番号３（スタガー要素）
Ｐ２Ａ：ｇｃｔａｃｔａａｃｔｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇａａｇｃａｇｇｃｔｇｇｃｇａｃｇｔｇｇａｇｇａｇａａｃｃｃｔｇｇａｃｃｔ
Ｔ２Ａ：ｇａｇｇｇｃａｇｇｇｇａａｇｔｃｔａｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｇｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｔｃｃｃｇｇｃｃｃａ
Ｅ２Ａ：ｃａｇｔｇｔａｃｔａａｔｔａｔｇｃｔｃｔｃｔｔｇａａａｔｔｇｇｃｔｇｇａｇａｔｇｔｔｇａｇａｇｃａａｃｃｃａｇｇｔｃｃｃ
その他：Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ
配列番号４ ＺＫＳＣＡＮイントロン
Figure 2022537154000003
配列番号５（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）：
Figure 2022537154000004
配列番号６（ａｄｄｇｅｎｅ ｐ３．１ラッカーゼ）
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ラッカーゼ２ ＭＣＳエクソンベクター配列６９２６ｂｐ
Figure 2022537154000005
Figure 2022537154000006
Figure 2022537154000007
Figure 2022537154000008
配列番号７（ＲＦＰ）
ｍＣｈｅｒｒｙ：
Figure 2022537154000009
配列番号９
コザック３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
Figure 2022537154000010
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号１０
コザック３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
Figure 2022537154000011
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～３２８：Ｐ２Ａ
配列番号１１
コザック３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
Figure 2022537154000012
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号１２
コザック３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
Figure 2022537154000013
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～２７１：三重終止コドン
配列番号１３
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ Ｔ２Ａ ３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（９５４ｂｐ）
Figure 2022537154000014
 ５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～８８６：３ＸＦＡＬＧ－ＥＧＦ
８８７～９５２：Ｐ２Ａ
配列番号１４
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３×ＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｓｔｏｐ（１３１４ｎｔ）
Figure 2022537154000015
 ５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～１２３７：３×ＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ
１２３８～１３０３：Ｐ２Ａ
１３０４～１３１２：三重終止コドン
配列番号１５
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３×ＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（１３０５ｎｔ）
Figure 2022537154000016
 ５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～１２３７：３×ＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ
１２３８～１３０３：Ｐ２Ａ
配列番号１６
ＣＤ１９ ＣＡＲ ＯＲＦ：
Figure 2022537154000017
配列番号１７
ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ：
Figure 2022537154000018
配列番号１８
ヒトアルファグロビン５’ＵＴＲ：
ＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＣ
配列番号１９
ヒトアルファグロビン３’ＵＴＲ：
ＧＣＴＧＧＡＧＣＣＴＣＧＧＴＡＧＣＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＴＣＴＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡ
配列番号２０
アニーリング領域を有するＣ２ｍｉｎ配列
５’－ＣＡＣＡＣＡＡＣＡ ＧＧＧＧＧＡＵＣＡＡＵＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡＣＧＣＵＣＣＣＵＵＡＣＡＣＣＣＣ ＡＣＣＡＡＣＣＡＡ－３’
配列番号２１
アニーリング領域を有する非結合配列
５’－ＣＡＣＡＣＡＡＣＡ ＧＧＣＧＵＡＧＵＧＡＵＵＡＵＧＡＡＵＣＧＵＧＵＧＣＵＡＡＵＡＣＡＣＧＣＣ ＡＣＣＡＡＣＣＡＡ－３’
配列番号２２
アニーリング領域を有する３６ａ配列
５’－ＧＡＣＡＣＡＡＣＡ
ＧＧＧＵＧＡＡＵＧＧＵＵＣＵＡＣＧＡＵＡＡＡＣＧＵＵＡＡＵＧＡＣＣＡＧＣＵＵＡＵＧＧＣＵＧＧＣＡＧＵＵＣＣＵＡＵＡＧＣＡＣＣＣ ＡＣＣＡＡＣＣＡＡ－３’
配列番号２３
高感度緑色蛍光タンパク質ＤＮＡ鋳型
Figure 2022537154000019
配列番号２４
ＣＶＢ３ ｍＰＡＨ ＩＳ
Figure 2022537154000020
配列番号２５
ＣＶＢ３ ｍＰＡＨ Ｅ１Ｅ２
Figure 2022537154000021
配列番号２６
ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ
Figure 2022537154000022
配列番号２７
ｍＰＡＨ（フェニルアラニン水酸化酵素、マウス）
Figure 2022537154000023
配列番号２８
コザック３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐｓ）
Figure 2022537154000024
 ５－１３：コザック配列
１４－２６２：３×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３－３２８：Ｐ２Ａ
配列番号２９
コザック１×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｔ２Ａ １×ＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（８７３ｂｐｓ）
Figure 2022537154000025
 ５－１３：コザック配列
１４－２０２：１×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３－２６５：Ｔ２Ａ
２６６－８０５：１×ＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
８０６－８７１：Ｐ２Ａ
配列番号３０
コザック１×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ １×ＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ ｓｔｏｐ（７６２ｂｐｓ）
Figure 2022537154000026
 ５－１３：コザック配列
１４－２０２：１×ＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３－２１１：三重終止コドン
２１２－７５１：１×ＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
７５２－７６０：三重終止コドン

Claims (59)

  1. ａ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と；
    ｂ）環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞と
    を含む医薬組成物であって、前記環状ポリリボヌクレオチドは、
    （ｉ）（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）分泌タンパク質若しくは細胞内タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであるか；
    （ｉｉ）（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）膜タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであって、前記膜タンパク質は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体融合タンパク質ではない、組み合わせであるか；又は
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの結合部位を含み、且つ分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質であるタンパク質コードする、医薬組成物。
  2. 環状ポリリボヌクレオチドを含む、単離された細胞又は前記細胞の調製物であって、前記環状ポリリボヌクレオチドは、
    （ｉ）（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）分泌タンパク質若しくは細胞内タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであるか；
    （ｉｉ）（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）膜タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであって、前記膜タンパク質は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体融合タンパク質ではない、組み合わせであるか；又は
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの結合部位を含み、且つ分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質であるタンパク質コードし、
    前記単離された細胞は、対象に投与される、単離された細胞又は前記細胞の調製物。
  3. 前記タンパク質は、膜タンパク質であり、及び前記細胞は、非免疫細胞である、請求項１に記載の医薬組成物又は請求項２に記載の単離された細胞。
  4. 前記細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、治療用タンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  5. 前記膜タンパク質は、膜貫通タンパク質又は細胞外基質タンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  6. 前記細胞内タンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質は、
    （ｉ）細胞増殖、細胞分化及び／又は前記細胞の標的への局在化を促進し；及び／又は
    （ｉｉ）結合活性又は転写調節活性を有し；及び／又は
    （ｉｉｉ）キメラ抗原受容体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  7. 前記少なくとも１つの結合部位は、
    （ｉ）前記細胞に少なくとも１つの治療特性を与え；及び／又は
    （ｉｉ）前記細胞又は単離された細胞に核酸局在化を与え；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記細胞又は単離された細胞において核酸活性を与える、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  8. 前記少なくとも１つの結合部位は、
    （ｉ）アプタマー；及び／又は
    （ｉｉ）タンパク質結合部位、ＤＮＡ結合部位又はＲＮＡ結合部位；及び／又は
    （ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位
    である、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  9. 前記少なくとも１つの結合部位は、前記細胞の表面上の細胞受容体に結合し、任意選択的に、前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記少なくとも１つの結合部位が前記細胞の前記表面上の細胞受容体に結合した後、前記細胞に内部移行される、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  10. 前記細胞又は単離された細胞は、
    （ｉ）真核細胞、動物細胞、哺乳動物細胞又はヒト細胞；及び／又は
    （ｉｉ）免疫細胞；及び／又は
    （ｉｉｉ）末梢血単核球、末梢血リンパ球又はリンパ球；及び／又は
    （ｉｖ）Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、γδＴ細胞、αβＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞）、Ｂ細胞又はナチュラルキラー細胞
    である、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  11. 前記細胞又は単離された細胞は、複製能力がない、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  12. 複数の前記細胞若しくは単離された細胞又は前記細胞若しくは単離された細胞の調製物を含み、前記複数は、５×１０５細胞～１×１０７細胞である、請求項１又は３～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 複数の前記細胞又は単離された細胞を含み、前記複数は、１２．５×１０５細胞～４．４×１０１１細胞である、請求項１又は３～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  14. 対象への投与のための、請求項１又は３～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. 前記対象は、ヒト又は非ヒト動物であり；任意選択的に、前記ヒトは、若年者、若年成人（例えば、１８～２５歳）、成人又は新生児である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  16. 前記対象は、疾患又は障害を有し、任意選択的に、前記対象は、過剰増殖性疾患又は癌を有する、請求項１５に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  17. 前記細胞若しくは前記単離された細胞は、前記対象（例えば、治療される対象）と同種であるか、又は前記細胞若しくは前記単離された細胞は、前記対象（例えば、治療される対象）にとって自己由来である、請求項１又は３～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  18. 前記環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡテール、複製要素又は両方を欠いている、請求項１～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物又は単離された細胞。
  19. 薬学的に許容される賦形剤（例えば、希釈剤）と共に製剤化される、請求項２～１１、１５、１６又は１８のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  20. 細胞を含む医薬組成物であって、前記細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードし、且つ少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む、医薬組成物。
  21. キメラ抗原受容体をコードし、且つ少なくとも１つの結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む単離された細胞であって、対象への投与（例えば、静脈内投与）のためのものである、単離された細胞。
  22. ａ）環状ポリリボヌクレオチドであって、
    （ｉ）抗原に結合する抗原結合タンパク質をコードする少なくとも１つの標的結合配列、又は
    （ｉｉ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードし、且つ任意選択的に少なくとも１つの結合部位を含む配列
    を含む環状ポリリボヌクレオチドと；
    ｂ）タンパク質であって、前記タンパク質の発現は、前記抗原結合タンパク質への前記抗原の結合時に活性化される、タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列と
    を含む細胞。
  23. 抗原に対する親和性を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする環状ポリリボヌクレオチドと、二重特異性抗体をコードする環状ポリリボヌクレオチドとを含む細胞であって、前記細胞の表面上にＴＣＲ及び二重特異性抗体を発現する細胞。
  24. 前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項２１に記載の単離された細胞。
  25. 前記抗原結合タンパク質は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項２２に記載の細胞。
  26. 前記抗原結合ドメインは、前記膜貫通ドメインに連結され、前記膜貫通ドメインは、前記細胞内シグナル伝達ドメインに連結されて、キメラ抗原受容体を生成する、請求項２０に記載の医薬組成物、請求項２４に記載の単離された細胞又は請求項２５に記載の細胞。
  27. 前記抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、寛容原若しくは病原抗原に結合するか、又は前記抗原は、腫瘍抗原若しくは病原抗原である、請求項２０若しくは２６に記載の医薬組成物、請求項２２、２３、２５若しくは２６のいずれか一項に記載の細胞又は請求項２４若しくは２６に記載の単離された細胞。
  28. 前記抗原結合ドメインは、
    （ｉ）抗体又はその抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ）；又は
    （ｉｉ）二重特異性抗体
    である、請求項２０、２６若しくは２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２２若しくは２５～２７のいずれか一項に記載の細胞或いは請求項２４又は２６若しくは２７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  29. 前記二重特異性抗体は、第１のエピトープと結合する第１の免疫グロブリン可変ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の免疫グロブリン可変ドメインとを有する、請求項２３に記載の細胞又は請求項２８に記載の医薬組成物、細胞若しくは単離された細胞。
  30. （ｉ）前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとは、同じであるか；又は
    （ｉｉ）前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとは、異なる、請求項２９に記載の医薬組成物、細胞又は単離された細胞。
  31. （ｉ）前記膜貫通ドメインは、前記抗原結合ドメインと前記細胞内シグナル伝達ドメインとを連結させ；及び／又は
    （ｉｉ）前記膜貫通ドメインは、ヒンジタンパク質（例えば、免疫グロブリンヒンジ）、ポリペプチドリンカー（例えば、ＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、ＣＤ８ａヒンジ又はスペーサーである、請求項２０若しくは２６～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２２若しくは２５～３０のいずれか一項に記載の細胞又は請求項２４若しくは２６～３０のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  32. （ｉ）前記細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも一部を含み；及び／又は
    （ｉｉ）前記細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフを含み；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２又はそれらの任意の組み合わせの少なくとも一部を含み；及び／又は
    （ｉｖ）前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項２０若しくは２６～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２２若しくは２５～３１のいずれか一項に記載の細胞又は請求項２４若しくは２６～３１のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  33. 前記共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、
    （ｉ）ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子又は活性化ＮＫ細胞受容体タンパク質の少なくとも１つ以上；及び／又は
    （ｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＲＡＮＫＬ、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ１６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、Ｂ７－Ｈ３又はＣＤ８３に結合するリガンドの少なくとも１つ以上
    を含む、請求項３２に記載の医薬組成物、細胞又は単離された細胞。
  34. 前記環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡテール、複製要素又は両方を欠いている、請求項２０若しくは２６～３３のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２２若しくは２５～３３のいずれか一項に記載の細胞又は請求項２１、２４若しくは２６～３３のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  35. 前記細胞又は単離された細胞は、
    （ｉ）免疫エフェクター細胞；及び／又は
    （ｉｉ）Ｔ細胞（例えば、αβＴ細胞若しくはγδＴ細胞）又はＮＫ細胞；及び／又は
    （ｉｉｉ）（例えば、それを必要とする対象に対して）同種の細胞又は自己由来の細胞
    である、請求項２０若しくは２６～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２２若しくは２５～３４のいずれか一項に記載の細胞又は請求項２１、２４若しくは２６～３４のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  36. 前記抗原は、腫瘍又は癌から発現される、請求項２２、２３又は２５～３５のいずれか一項に記載の細胞。
  37. 前記タンパク質は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）又は共刺激リガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ若しくは４－１ＢＢＬ）である、請求項２２又は２５～３６のいずれか一項に記載の細胞。
  38. 前記タンパク質は、分泌タンパク質である、請求項２２又は２５～３７のいずれか一項に記載の細胞。
  39. １×１０５細胞～９×１０１１細胞の調製物であって、対象への（例えば、注射又は注入による）非経口送達のために構成され、請求項１～３８のいずれか一項に記載の複数の細胞又は単離された細胞を含み、任意選択的に単位用量形態であり；及び／又は任意選択的に、調製物中の細胞の少なくとも１％は、前記複数の細胞又は単離された細胞である、調製物。
  40. 対象への（例えば、注射又は注入による）送達のために構成された複数の細胞の懸濁液を含む点滴静注バッグ又は注入製品であって、前記複数の細胞は、請求項１～３９のいずれか一項に記載の細胞又は単離された細胞であり；任意選択的に、前記懸濁液中の細胞の少なくとも１％は、前記複数の細胞又は単離された細胞であり；及び／又は任意選択的に、前記懸濁液は、１×１０５～９×１０１１の前記複数の細胞又は単離された細胞を含む、点滴静注バッグ又は注入製品。
  41. 複数の細胞を含む医療機器であって、前記複数の細胞は、請求項１～４０のいずれか一項に記載のいずれかの細胞又は単離された細胞であり、前記医療機器は、対象への植込みのために構成され、任意選択的に、前記医療機器は、複数の１×１０５～９×１０１１細胞を含み、及び／又は任意選択的に、前記医療機器中の細胞の少なくとも４０％は、前記複数の細胞又は単離された細胞である、医療機器。
  42. 複数の細胞を含む生体適合性マトリックスであって、前記複数の細胞は、請求項１～４１のいずれか一項に記載の細胞又は単離された細胞であり、前記生体適合性マトリックスは、前記対象への植込みのために構成され、任意選択的に、前記生体適合性マトリックスは、複数の１×１０５～９×１０１１細胞を含み、及び／又は任意選択的に、前記医療機器中の細胞の少なくとも５０％は、前記複数の細胞又は単離された細胞である、生体適合性マトリックス。
  43. 複数の細胞を含むバイオリアクターであって、前記複数の細胞は、請求項１～４２のいずれか一項に記載の細胞又は単離された細胞であり、任意選択的に、前記バイオリアクターは、複数の１×１０５～９×１０１１細胞を含み、任意選択的に、前記医療機器中の細胞の少なくとも５０％は、前記複数の細胞又は単離された細胞である、バイオリアクター。
  44. （ｉ）二次元細胞培養；又は
    （ｉｉ）三次元細胞培養
    を含む、請求項４３に記載のバイオリアクター。
  45. 前記対象に植込まれた場合に前記複数の細胞を生成及び放出するように構成されている、請求項４１に記載の医療機器又は請求項４２に記載の生体適合性マトリックス。
  46. 前記対象は、ヒト又は非ヒト動物である、請求項３９～４２又は４５のいずれか一項に記載の調製物、点滴静注バッグ、医療機器又は生体適合性マトリックス。
  47. 前記複数の細胞は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に製剤化される、請求項３９～４６のいずれか一項に記載の調製物、点滴静注バッグ、医療機器、生体適合性マトリックス又はバイオリアクター。
  48. 細胞又は複数の細胞を生成する方法であって、
    ａ）単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供することと、
    ｂ）請求項１～４７のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチドの調製物を提供することと、
    ｃ）前記環状ポリリボヌクレオチドを、前記単離された細胞又は前記複数の単離された細胞に接触させることであって、前記単離された細胞又は複数の単離された細胞は、前記環状ポリリボヌクレオチドを発現することが可能である、接触させることと
    を含む方法。
  49. 前記単離された細胞又は複数の単離された細胞に接触される前記環状ポリリボヌクレオチドの調製物は、
    ａ）１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ又は２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子；
    ｂ）前記環状ポリリボヌクレオチドの調製物中の総リボヌクレオチド分子に対して少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子
    を含むか；又は
    ｃ）前記調製物中の総リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ）は、環状ポリリボヌクレオチド分子である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記接触後の前記単離された細胞又は複数の単離された細胞の生存率は、正規化された接触されていない単離された細胞又は複数の正規化された接触されていない単離された細胞と比較して少なくとも４０％である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記接触後の前記細胞又は複数の細胞を対象に投与することをさらに含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
  52. 対象への投与のための細胞を生成する方法であって、
    ａ）単離された細胞を提供することと、
    ｂ）前記単離された細胞を、請求項１～５１のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチドに接触させることと
    を含み、それにより前記対象への投与のための前記細胞を生成する方法。
  53. 前記細胞中の前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記対象への投与前に分解される、請求項５２に記載の方法。
  54. 請求項１～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物、細胞、複数の細胞、調製物、点滴静注バッグ中の複数の細胞、医療機器中の複数の細胞、生体適合性マトリックス中の複数の細胞又はバイオリアクターからの複数の細胞を前記対象に投与することを含む、細胞治療の方法。
  55. 前記医薬組成物、複数の細胞、調製物、前記点滴静注バッグ中の前記複数の細胞、前記医療機器中の前記複数の細胞、前記生体適合性マトリックス中の前記複数の細胞又は前記バイオリアクターからの前記複数の細胞は、
    ａ）１０５～１０９細胞／ｋｇの単位用量；又は
    ｂ）１×１０５～９×１０１１細胞の用量
    を含み、前記医薬組成物、複数の細胞、調製物、前記点滴静注バッグ中の前記複数の細胞、前記医療機器中の前記複数の細胞、前記生体適合性マトリックス中の前記複数の細胞又は前記バイオリアクターからの前記複数の細胞の少なくとも１％は、前記細胞又は単離された細胞である、請求項５４に記載の方法。
  56. （ｉ）１×１０５～９×１０１１細胞の用量；
    （ｉｉ）５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量；又は
    （ｉｉ）２つの後続の用量における１×１０５～９×１０１１細胞又は５×１０５細胞／ｋｇ～６×１０８細胞／ｋｇの用量であって、任意選択的に、前記２つの後続の用量は、少なくとも約７日、１４日、２８日、３５日、４２日又は６０日の間隔を空けて投与される、用量
    において、前記医薬組成物、複数の細胞、調製物、前記点滴静注バッグ中の前記複数の細胞、前記医療機器中の前記複数の細胞、前記生体適合性マトリックス中の前記複数の細胞又は前記バイオリアクターからの前記複数の細胞を投与することを含む、請求項５４又は５５に記載の方法。
  57. 単離された細胞又は複数の単離された細胞の核酸を編集する方法であって、
    ａ）単離された細胞又は複数の単離された細胞を提供すること；
    ｂ）前記単離された細胞又は前記複数の単離された細胞を、ヌクレアーゼをコードし、且つ／又はガイド核酸を含む環状ポリリボヌクレオチドに接触させること
    を含み、それにより対象への投与のための編集細胞又は複数の編集細胞を生成する方法。
  58. 前記ヌクレアーゼは、
    （ｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ又はＣａｓタンパク質；又は
    （ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１４タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質
    である、請求項５７に記載の方法。
  59. 環状ポリリボヌクレオチドを含む、細胞治療に使用するための単離された細胞であって、前記環状ポリリボヌクレオチドは、
    （ｉ）（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）分泌タンパク質若しくは細胞内タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであるか；
    （ｉｉ）（１）少なくとも１つの結合部位を含むか、（２）膜タンパク質をコードするか、又は（３）（１）と（２）との組み合わせであって、前記膜タンパク質は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体融合タンパク質ではない、組み合わせであるか；又は
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの結合部位を含み、且つ分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質であるタンパク質コードする、単離された細胞。
JP2021573738A 2019-06-14 2020-06-14 細胞治療のための環状ｒｎａ Pending JP2022537154A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962861805P 2019-06-14 2019-06-14
US62/861,805 2019-06-14
US202062967537P 2020-01-29 2020-01-29
US62/967,537 2020-01-29
PCT/US2020/037670 WO2020252436A1 (en) 2019-06-14 2020-06-14 Circular rnas for cellular therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022537154A true JP2022537154A (ja) 2022-08-24

Family

ID=71950801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021573738A Pending JP2022537154A (ja) 2019-06-14 2020-06-14 細胞治療のための環状ｒｎａ

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220257794A1 (ja)
EP (1) EP3983539A1 (ja)
JP (1) JP2022537154A (ja)
CN (1) CN114007655A (ja)
AU (1) AU2020292427A1 (ja)
CA (1) CA3140205A1 (ja)
WO (1) WO2020252436A1 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA51155A (fr) 2017-12-15 2020-10-21 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Compositions comprenant des polyribonucléotides circulaires et leurs utilisations
CN112399860A (zh) 2018-06-06 2021-02-23 麻省理工学院 用于在真核细胞中翻译的环状rna
CA3139032A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Robert Alexander WESSELHOEFT Circular rna compositions and methods
EP3920976B1 (en) 2019-12-04 2023-07-19 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2022232291A1 (en) * 2021-04-27 2022-11-03 Factor Bioscience Inc. Circular rna
WO2023288288A1 (en) 2021-07-15 2023-01-19 Turn Biotechnologies, Inc. Synthetic, persistent rna constructs with on/off mechanism for controlled expression and methods of use
WO2023288287A2 (en) 2021-07-15 2023-01-19 Turn Biotechnologies, Inc. Synthetic, persistent rna constructs and methods of use for cell rejuvenation and for treatment
AR128002A1 (es) 2021-12-17 2024-03-20 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Métodos de enriquecimiento de rna circular en condiciones desnaturalizantes

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5266684A (en) 1988-05-02 1993-11-30 The Reagents Of The University Of California Peptide mixtures
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0542874A4 (en) 1990-07-25 1994-05-11 Syngene Inc Circular extension for generating multiple nucleic acid complements
US5426180A (en) 1991-03-27 1995-06-20 Research Corporation Technologies, Inc. Methods of making single-stranded circular oligonucleotides
US5639603A (en) 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
AU669489B2 (en) 1991-09-18 1996-06-13 Affymax Technologies N.V. Method of synthesizing diverse collections of oligomers
AU683011B2 (en) 1992-01-13 1997-10-30 Duke University Enzymatic RNA molecules
US5541061A (en) 1992-04-29 1996-07-30 Affymax Technologies N.V. Methods for screening factorial chemical libraries
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5721099A (en) 1992-10-01 1998-02-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5773244A (en) 1993-05-19 1998-06-30 Regents Of The University Of California Methods of making circular RNA
US5440016A (en) 1993-06-18 1995-08-08 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Peptides of the formula (KFmoc) ZZZ and their uses
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5688997A (en) 1994-05-06 1997-11-18 Pharmacopeia, Inc. Process for preparing intermediates for a combinatorial dihydrobenzopyran library
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5463564A (en) 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US5688696A (en) 1994-12-12 1997-11-18 Selectide Corporation Combinatorial libraries having a predetermined frequency of each species of test compound
JPH11509086A (ja) 1995-06-21 1999-08-17 マーテック・バイオサイエンシズ・コーポレイション 標識生化学化合物の組合わせライブラリーとその作成方法
US5766903A (en) 1995-08-23 1998-06-16 University Technology Corporation Circular RNA and uses thereof
US5731423A (en) 1996-03-21 1998-03-24 Transcell Technologies, Inc. Process for preparing sulfoxides
US6429301B1 (en) 1998-04-17 2002-08-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides
US6693086B1 (en) 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
US6210931B1 (en) 1998-11-30 2001-04-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Ribozyme-mediated synthesis of circular RNA
EP2428571B1 (en) 2001-09-28 2018-07-18 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. MicroRNA molecules
CA2533701A1 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
JP5296328B2 (ja) 2007-05-09 2013-09-25 独立行政法人理化学研究所 １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法
WO2010084371A1 (en) 2009-01-26 2010-07-29 Mitoprod Novel circular interfering rna molecules
WO2015073587A2 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Rubius Therapeutics, Inc. Synthetic membrane-receiver complexes
EP3125927B1 (en) 2014-04-01 2021-01-27 Rubius Therapeutics, Inc. Methods and compositions for immunomodulation
US20180135012A1 (en) 2015-05-13 2018-05-17 Rubius Therapeutics, Inc. Membrane-receiver complex therapeutics
CN108778298A (zh) 2016-01-11 2018-11-09 鲁比厄斯治疗法股份有限公司 与免疫适应症的多模式治疗性细胞体系有关的组合物和方法
BR112019000195A2 (pt) 2016-07-07 2019-04-24 Rubius Therapeutics, Inc. composições e métodos relacionados a sistemas celulares terapêuticos que expressam rna exógeno
KR20190091497A (ko) 2016-12-02 2019-08-06 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨. 고형 종양으로의 침투를 위한 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법
EP3583202A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Rubius Therapeutics, Inc. Functionalized erythroid cells
EP3610035A4 (en) * 2017-04-14 2021-06-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR TEMPORARY GENE THERAPY WITH IMPROVED STABILITY
JP7395355B2 (ja) 2017-05-08 2023-12-11 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド 膜融合を促進するための組成物およびその使用
MA51155A (fr) * 2017-12-15 2020-10-21 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Compositions comprenant des polyribonucléotides circulaires et leurs utilisations
WO2019222275A2 (en) * 2018-05-14 2019-11-21 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using inducible fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
US20220257794A1 (en) 2022-08-18
WO2020252436A1 (en) 2020-12-17
CN114007655A (zh) 2022-02-01
CA3140205A1 (en) 2020-12-17
AU2020292427A1 (en) 2022-01-06
EP3983539A1 (en) 2022-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220257794A1 (en) Circular rnas for cellular therapy
US20220177540A1 (en) Circular rna compositions and methods
US20230226096A1 (en) Circular rna compositions and methods
US20220143062A1 (en) Circular polyribonucleotides and pharmaceutical compositions thereof
JP2021508490A (ja) 環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用
US20230072532A1 (en) Compositions comprising modified circular polyribonucleotides and uses thereof
JP2023516694A (ja) 宿主防御抑制方法及びゲノムを調節するための組成物
JP2020537545A (ja) ｍＲＮＡの細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子
CN115151275A (zh) 用于向细胞递送核酸的组合物和方法
US20230061936A1 (en) Methods of dosing circular polyribonucleotides
KR102338993B1 (ko) 인위적으로 조작된 조작면역세포
JP2022546592A (ja) ゲノム組込みのための方法および組成物
US20230181620A1 (en) Compositions for translation and methods of use thereof
JP2024503623A (ja) カプセル化ｒｎａポリヌクレオチド及び使用方法
KR20230079367A (ko) 핵산을 세포에 전달하기 위한 조성물 및 방법
EP4096681A1 (en) Delivery of compositions comprising circular polyribonucleotides
US20230141052A1 (en) Methods and compositions for genomic integration
WO2022266538A2 (en) Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
WO2022256448A2 (en) Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
WO2023183906A2 (en) Compositions and methods for enhancing intra-mitochondrial protein translation and oxidative phosphorylation
WO2023167882A1 (en) Composition and methods for transgene insertion
WO2023122789A1 (en) Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
WO2023084522A1 (en) Systems and methods for trans-modulation of immune cells by genetic manipulation of immune regulatory genes
WO2024025908A2 (en) Compositions and methods for genome editing
WO2023225035A2 (en) Compositions and methods for engineering cells

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230607

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20240412

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240417