JPS61502932A - Ｌｔｒベクタ−、製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＬＴＲベクター、製法及び用途 発　明　の　分　野 本発明は絹換えＤＮＡ操作並びに治療法及び分析法におけるウィルスベクターの 使用に関する。より特定的には、本発明は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺 伝子の選択しうる組織での発現を得るためにｒｉ飾された哺乳類の末端長反復配 列（ｌｏｎｇ　ｔｅ「１ｎａ＋ｒｅｐｅａｔ、　ＬＴＲ）ベクターを使用するこ とに関する。

発　明　の　背　景 ウィルスの作用機序、特にレトロウィルスの作用は序を理解しようとする多くの 努力が多年に亘りなされている。答をめていた問題には、このようなウィルスの あるものが他の型の細胞に比べである種の型の細胞に優先的に感染し及び／又は そこで複製づる理由が包含されている。

従来の考えでは、ウィルスがある種の型の細胞に感染し及び／又はそこで？！２ 製’Ｊ−る能力はウィルスゲノム内でウィルスのエンベロープの産生に関係する セグメント（すなわち、エンベロープ（匹）遺伝子）で制御されているとされて いた。にもかかわらず、ウィルスゲノムのＬ　Ｔ　Ｒセグメントが関係するかも しれないといういくつかの示唆もあった［デ　グロセイラーズ。

エル、（Ｄｃｓ　ＧｒｏｓｃｉｌｌＣｒｓ、Ｌ、）、バンプ・ウッド（Ｖａｎｄ ｅ　Ｗｏｕｄｃｌらによる通常は休止している細胞性ＤＮＡ配列（ａ　ｎｏｒａ ＋ａｌｌｙｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ｃ、ｅｌｌｕｌａｒ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃ ｅ）、米国特許第４，４０５，７１２号明細四。又、グルラマン（Ｇｌｕｚｍａ ｎｌら編、エンハンサ−及び真核遺伝子発現（［ｎｈａｎｃｅｒｓ　ａｎｄ　Ｅ ｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、コールド・スプリン グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ）（１９８３）も参照。しかしながら、このような系はＬＴＲの 組織向性エンハンサ−領域を利用していなかった。

発　明　の　要　約 本発明は修飾ＬＴＲベクターを用いる異種遺伝子の組織特異的発現（ｔｉｓｓＬ ｌｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌプロセスに向けられている。

本明細書中に記載した方法を用いてどんなレトロウィルスＬＴＲでもそのエンハ ンサ−領域を合成的に修飾することができ、そうして組織特異性を達成しうる。

又、ＬＴＲベクターの組織特異性を分析又は予測するために有用なアッセイにつ いても記載する。本発明は新規な組織特異性ＬＴＲベクターにも向りられている 。

本発明によると、所望のポリペプチドに対応する異種ＤＮＡセグメント並びにそ の遺伝子の下？Ｒ（３’）のストップコドン及びポリアデニル化配列と共に同じ 配列中に機能するように配置された組織特異性エンハンサ−（？！数でもよい） を用いて組織特異性ベクターが構築される。白菜名には公知の如く、ベクターは 複製起点も含んでいなければならない。

ベクターは少なくともエンハンサ−内でそのエンハンサ−の組織特異性を決定づ るセグメントく以下［組織特異性決定基ｆｔ１ｓｓｕｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔ ｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）Ｊとする）を含んでいる。

ベクターは、好ましくは所望組織に対する組織特異性決定基を含んでいる完全な ウィルスエンハンサ−を含有しているのが好ましい。

ベクターに合まれるプロモーターは、選択した宿主中で所望の産物を発現させる 曙能を有するいかなる公知のプロモーターでムよい。プロモーターはエンパン４ ノーと同じ種類（ｃｌａｓｓ）のウィルスに由来するウィルスプロモーターであ ると好ましい。

好ましい種類のウィルスはレトロウィルスであり、本発明と共に用いるに好まし いウィルスはＡｋｖ、３１３−３及びフレンド（ｒｒｉｅｎｄ）ウィルスである 。

本明細書中及び請求の範［ＩＪｌで使用される「組織特異性」という用語は、通 常の培養条ｆｉ下においてベクターが他の組織中に比し標的組織中で所望産物を より天皇に産生させるように別面することを意味している。組織特異性ベクター は標的組織において他の組織中に比し　１．５〜１０００倍又はそれ以上の発現 産物を産生ずることができる。

組織特異性決定基はプロモーターと同じウィルス由来という意味で同種（ｈｏｍ ｏ　Ｉｏｇｏｕｓ）であってよく、又は、プロモーターと同じウィルス由来のも のではない異種であってもよい。異種組織特異性決定基は他のウィルス系から切 除してもよく、公知の手法を用いて合成してもよい。標的組織に特異的な組織特 異性決定基は複数のアッセイ手法で同定することができ、これらのアッセイでは どのベクターが組織中で有効であるかを決定するためにベクターはインディケー タ−すなわちマーカー化合物、例えばクロラムフエニコールアヒチルトランスフ エラーゼ（ＣＡＴ。

後述のように簡＋１に定量できるインディケータ−〉をコードしている。

所望であれば、組織特異性ベクター由来のエンハンサ−と標的組織に特異的では ないエンハンサ−とのＤＮＡ配列を比較して組織特異性決定基のＤＮＡ配列を決 定することができる。その後、組織特異性決定基を含有するエンハンサ−を、発 現を所望する遺伝子を含有する所望のベクター中に用いることができ、得られた 組織特異性ベクターを用いて選択した組織中で所望産物を発現することができる 。

選択した組織から所望産物を人聞に製造するには組織特異的発現が非常に有利で ある。これは他の組織中での発現を最小限にする。このような手法は、組織を特 性化又は同定するため、他の組織よりある組織の成長を促進するため、夾雑物の 産生量を最少限にするため、及びその他の目的に使用できる。

本発明ベクターはプラスミドの形態又はウィルスベクター、例えばマン（Ｈａｎ ｎｌら、セル（Ｃｏ　ｌ　＋　）、３３：１５３（１９８３）に記載の手順に従 って製造されるものの如きものであってよい。

本発明に従って６％築されるベクターはインビボ（ｉｎ　ＶｉＶＯ）で、例えば ある種の型の細胞が特定の物質を過剰又は破壊的な小で産生ずる遺伝子的又は他 の欠陥による疾患の治療にも利用できる。接菌の場合、例えば過剰産生物質と反 応する醇索又は他の物質をコードする遺伝子を発現させることにより、このよう な過剰な物質を根絶できる。本発明を利用する遺伝子的療法の他の方法について は以下に記載する。

本発明の組織特異性ベクターをインビボで利用する場合、使用するベクターは上 記のウィルスベクターが好ましい。

図１八、ＩＢ、＋ＣｔＪ、Ａｋｖ（ｐＡＵ３ｃ八Ｔ）及びＳ　Ｌ　３−３（ｐＨ ３ｃＡＴ）　ノ１３領域をクロラムフェニコールアセチルミーランスフェラーゼ （ＣＡＴ）遺伝子の５゛に置いたときに作成される同一遺伝子（ｉｓｏｇｅｎｉ ｃ）の椛築体を表わし、 図２（ａ）〜（ｄ）はＡｋｖ及びＳ　Ｌ　３−３の間に見られるＬＴＲ配列ＣＡ Ｔ活性の劇的な差異を表わし、 図３は八ｋｖ　ＬＴＲ［パン・ベベーレン、シー、（Ｖａｎ　ＢｅＶｅｒｅｎ。

ｃ、）ら、ジエー、ビロール、　（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、４１：５４２〜５５６ （１９８２１Ｆ、Ｓ　Ｌ３−３　ＬＴＲ［レンツ、ジｘ−，（Ｌｅｎｚ、Ｊ、） ら、ジエー、ヒロール、　（Ｊ、Ｖｉｒｏに）、４７：３１７〜３２８（１９８ ３）］及びＦｒ−ＨｕＬＶ５７　ＬＴＲ［オリッフ、ニー、アイ、　（Ｏｌｉｆ ｆ、Ａ、Ｉｊら、ジェー、ビロール９（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、３３：４７５〜４ ８６（１９８０１１のタンデム反復領域（ｔａｎｄｏＩＩｌｒｅｐｅａｔ　ｒｅ ｇｉｏｎ）内の配列構成の比較である。Ａｋｖの１つの９９ｂｐ反復エレメント の配列を上部に示す。下方の実線は各々５Ｌ３−３とＦｒ−ＨｕＬＶ５７の７２ ｂｐ反復配列及び６６ｂｐ反復配列中に存在する同一の配列を表わす。カッコで 括った領域の後の数はその配列が何回繰り返されるかを示す。欠失はデルタ記号 で示し、挿入は上向きの矢印で示す。星印の場所の中の実際の配列は（ｂ）に示 す。これらの配列はＡｋｖの反復領域には存在しない。

好ましい実ｍｓ様の詳細な説明 ウィルスに疾患を増強する能力を与えるウィルスゲノムの領一連の組換え体を溝 築した。５Ｌ３−３は八にＲマウスの自然発症下細胞リンパ腫から単離したＮ向 性（ｔｒｏｐｉｃ）で、エコトロピック（ＯＣＯｔｒＯｌｌｉｅ）で、強力な白 血病誘発性のウィルスである。５Ｌ３−３はウィルスゲノム構造と組織培養での 複製特性との両者において内因性のＮ向性Ａｋｖウィルスに類似しているにもが がゎらず、５Ｌ３−３が広範囲の種類のマウス株でＴ細胞白血病を誘発しうるの に対し八ｋＶは白血病非誘発性である。

５Ｌ３−３とＡｋｖの組換えプロウィルスでＮＩＨ３Ｔ３をトランスフェクショ ンした際に産生じたウィルスの疾患誘発能についてテストした。このような絹換 え体の１つ（３１３−３ＬＴＲ配列をフランクにつなげた＾ｋｖ構造遺伝子全体 を含有するウィルス）はマウスのいくつかの株でＴ細胞自白病を誘発した。５Ｌ ３−３　ＬＴＲのヌクレオチド配列分析によって、無毒性へｋｖウィルスのＬＴ ＲからＳＬ３のＬＴＲを区別する唯一の相違は、（ＬＴＲの５゛末端の近くの１ つのヌクレオチド変化を除いては＞　０３領域に存在する反復エレメント内にあ ることが判明した。関連ウィルス中でエンハンザ−ニレメンｉ−として機能する ことが知られているこの反復領域は適当な細胞の情況でウィルス遺伝子の発現を 引き起こすことができる。このため、数種の細胞型で５Ｌ３−３とＡｋｖのＬＴ Ｒ配列が転写エレメントとして鋤く能力をテストした。

マウスの感受性株にネズミ白血病ウィルスの５Ｌ３−３株を接種するとＴ細胞リ ンパ腫が誘発されるが、Ａｋｖ株の注射では誘発されない［レンツ、ジエー、　 （Ｌｃｎｚ、Ｊ、）ら、ジェー、ごロール。

（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　、す：９４３〜９５１　（１９８２）　；ベダーセン、 エフ、ニス。

（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、　Ｆ、Ｓ、　）ら、ネイチｔ　−（Ｎａｔｕｒｅ）、２９ ２：１６７〜１’７０（１９８１）、及びレンツ、ジエー、　（Ｌｃｎｚ、、Ｌ ｌら、ジェー、ビロール、（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　、　４７：３１７〜３２８（ １９８３’）　参照］　。５Ｌ３−３ウイルスの末端長反復配列（ＬＴＲ）と＾ ｋｖウィルスのＩＩＪＬ、　ｔｏｏｌおよびユ遺伝子とを含有する組換えウィル スもト細胞白血病を誘発領域内に位置することを示している。５Ｌ３−３のＬＴ Ｒ領域を右する組換えウィルスは又、感染した動物の胸腺細胞中では高力価で複 製するが、骨髄又は牌臓細胞では複製しない。無毒性ＡｋＶウィルス自身はこれ ら組織のいずれにおいても高力価で複製することはない。

種々のＬＴＲ配列を含有するウィルスで誘発される白血病の細胞型特異性は一部 、適当な細胞環境下でのウィルスの複製能による［デスグロレイラーズ、エル、 （ＤｅｓＧｒｏｓｅｉｌｌｅｒｓ、Ｌ、）ら、ＰＮＡＳ　ＵＳ八、８０　：　４ ２０３〜４２０７（１９８３）　：　カヂス、ピー、ニー。

（Ｃｈａｔｉｓ、Ｐ、　Ａ、　）ら、ＰＮ八へｌＩＳＡ、　８０　：　４４０Ｂ 　〜４４１４（１９８３）参照］。

細胞向性（ｔｒＯＤｉｓｍ）及び白血病誘発能の両者を決定する際にＬ　Ｔ　Ｒ が果たす役割に対づる１つの説明はｌ−Ｔ　Ｒが組織許容性（Ｄｅｒｍｉｓｓｉ ｖｃ）の転写ニレメン１−をコードするということである。

いろいろなネズミの細胞型では５Ｌ３−３とＡｋｖのＬＴＲ配列の転′ｑ活竹が 異なることと、５Ｌ３−３のＬＴＲ中に存在する配列はＴ細胞中で靜ｖ１．ＴＲ の対応する領域と比較してかなり高い転写活性を示ずこととが発見された。この 結果は転写エレメントがこれ１うウィルスの細胞向性及び白血病誘発性の主要な 決定基であることを示唆している。

八ｋＶ及び５Ｌ３−３のｌ−Ｔ　Ｒ配列が様々な細胞環境においてプロモーター ニレメン１へとして動く能力を評価ηるために、ＡｋＶの［３領１４（ρΔ１Ｉ ３ｃＡＴ）及びＳ　ｌ−３−３の１１３領域（ｐｓＵ３ｃＡＴ）をクロラムフ工 二コールアセチルトランスノエラーゼ（ＣＡＴｌ　ｍ伝子に対し５゛に置いた同 一遺伝子１ＭＭ体を作成した［図１８及びゴーマン、シー、］ニエム　（Ｇｏｒ ｍａｎ、Ｃ，Ｈ，）ら、モル、セル、パイオール、　（Ｍｏｌ。

Ｃｃｌｌ、Ｂｉｏｌ、ｌ　、２：１０４４〜＋０５１（１９８２）参照。また、 マニアチス。

ディー　（ＨａｎｉａｔｉＳ、　ｒｊら、「分子クローニング、実験マニュアル （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、八１．ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｈａｎｕ ａｌ）　Ｊ−］−ルド崇スプリング・ハーバ〜・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｃｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＨ１９８２）　参照］。リンＦ ｌｉカルシウム法Ｃつｒｊラ−。

エム、　（Ｗｉｇｌｅｒ、Ｈ，）ら、セル（収旦）　、ｉ４ニア２５〜７３１Ｎ ９７８）参照］又はＤＥＡＥ−デ４−ス１〜ラン法［スタフオード、ディー。

（Ｓｔａｒｆｏｒｄ、Ｊ、　）ら、ネイチｔ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、　３０６ ：７７〜７９（１９８３）参照コを用いて１８養細胞中にこれらのプラスミドを 導入した。

４４〜５０時間の過渡的発現期の後に、細胞抽出物を調製し、Ｃ△ＴＭ素活性の レベルを測定した［ゴーマンｆＧｏｒｍａｎ）ら、上記］。

以前の研究者は、水明ＩＩ青中で用いられている構築体のような構築体、すなわ ちＲＮＡ間始部位を囲む配列は同一であり、出発部位から離れた所にある配列に のみ変化がある構築体［レンツ（Ｌｅｎｚ）ら、ネイチＰ　−（ＮａｔＬｌｒ（ り　、上記］では、インディケータ−遺伝子活性のレベルは転写速度と直接的に 対応すること［例えば、ケラ−、ジエー、エム、　（ＫｃｌｌＣｒ、Ｊ、Ｈ，） ら、セル（Ｃｅｌｌ）　、３６：３８１〜３８９（１９８４）　；ヘレラーエス トレラ、エル。

（ｌｌｅｒｒｃｒａ−Ｅｓｔｒｅｌ　ｌａ、　Ｌ、　）ら、ネイチ１？−（Ｎａ ｔｕｒｅ）、３１０：１１５〜１２０（１９８４）　；　ｖフナイト、ニス、エ ル、　（ＨｃＫｎｉａｈｔ、Ｓ、Ｌ、）ら、セル（収旦）　２５：３８５〜３９ ８（１９８１）；及びスパンディトス、ディー。

ニー、（Ｓｐａｎｄｉｔｌｏｓ、Ｄ、Ａ、ｌら、ＥＨＢＯＪ、、２：Ｎ９３〜Ｎ ９９（１９８３）参照１を示した。

ネズミ細胞でＣΔＴＭ伝子の非特異的及び特異的発現のレベルを各々測定するた めに、真核性プロモーターニレメン１−を含まないプラスミド（ＤＳＶＯＣＡＴ ）　［ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎｌら、上記］又はＣＡＴ３！！仏子に対して５° の位置にあるラウスザルコーマウィルス（７）　３’−１，ＴＲ＠含ム７５スミ ト（ｐＲ３Ｖｃ八Ｔ）　へ［：ｒ−？：／、シー（Ｇｏｒｍａｎ　Ｃ，）ら、Ｐ ＮＡＳ　ｔｌｓΔ、７７　：　６７７７〜６７８１　（１９８２）’Ｊ照］に培 養細胞を露出するトランスフェクション実験を平行して実施しｌこ。

種々のけルラインはトランスフェクトしたＤＮＡを取り込む能力や発現する能力 が５′Ｉ！なる。各実験において、ネズミＬ　Ｔ　Ｒ配列を○イｉするプラスミ ドによって支配されるＣＡＴ活性は、ラウスザルコーマウィルス（ｎｓｖ）の３ ’ＬＴＲを含有するプラスミドの活性にり・１して規格化した。Ｒ８Ｖ３°ＬＴ Ｒの転写エレメントは、広範囲の細胞型において橢能することが示されており、 同様の研究における比較的中立の参照プロモーターとして用いられてきた［ゴー マン（Ｇｏｒｍａｎｌら、上記：及びエム、ディー、ウォーカー（Ｌ　Ｄ、　Ｗ ａｌｋＣｒ）ら、ネイチｔ　（Ｎａｔｌｌｒ（り　、３０６：５５７（＋９８３ ）］、。

ネズミ線組芽細胞中にこれらのプラスミドをトランスフェクトしたときのＣＡＴ 活性のレベルを図２及び表１に示す。Ｎ１１１３Ｔ３細胞にＪ３いては、Ａｋｖ 　１．ＴＲ配列を含イラづるプラスミドのＣ△Ｔ遺伝子発現のレベルはＳ　Ｌ３ −３ウイルスの対応領域をＳ右づるプラスミドのものの３倍である。もう　１つ のネズミ線維芽細胞セルラインであるマウスＬ細胞を用いても同様の結果が得ら れた。これらの結果から、いくつかのネズミ腺維芽細胞では八ｋｖ　１．ＴＲ配 列の方が５ｌ−３−３のｌ−Ｔ　Ｒ配列よりＣＡＴ遺伝子発現をより強力に促進 す゛ると結論される。

ネズミリンパ様細胞セルラインを用いて同様な一連の実験を実施した。線維芽細 胞を用いて観察された結果と非常に対照的に、テストしたＴセルライン全部にお いて、５Ｌ３−３　ＬＴＲ配列を含イテするプラスミドによって支配されるＣＡ Ｔ活性レベルは対応するＡｋＶ配列を含有するものの活性レベルより非１δに高 い（表１１図２８）。転写エレメント活性の５Ｌ３−３／Ａｋｖ比は、線紺芽細 胞では０３〜０．６　、Ｔリンパ球では６〜２０である。

Ｓ　１．３−３に感染したＬ６９１１１１胞（Ｌ６９１．５Ｌ３−３と表わす） にＡ３’＝プる転写エレメント活性の５Ｌ３−３／Ａｋｖ比は非感染Ｌ６９１１ Ｉｌ胞で１２寮されたものと同様なので、ｐＡＵ３ｃＡＴのものに比較してＩ） Ｓ　１１３　ＣＡ　Ｔプラスミドの丁セルラインでの好ましい発現は明らかにウ ィルス感染の結果ではない、、Ｓｌ、３−３１ＴＲ配列の方が優先的であること はＮＦＳ／Ｎマウスの胸腺から溶出されたばかりのに一次細胞調製物（ｐｒｉｍ ａｒｙ　ｃｅｌｌ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）でも観察される（表１）。確立 されたＴセルラインでの３１−３−３１−ＴＲ配列の転写優先性はＴｉｆｌ胞の 一般的特性であることは明らかである。ネズミＢセルライン（Ｍ１２）のトラン スフェクションに際しｐＳυ３ＣＡＴの優先的な発現は観察されず（表１）、こ のことはｐｓＵ３ｃＡＴの優先的な発現は全リンパ球様細胞の一般的特性ではな いことを示唆している。

５Ｌ３−３と八ｋｖのＬＴＲ配列の間の唯一の差違は、ＲＮＡ間始部位から２２ １〜４４３ｂＤに位置するタンデムに皿回繰り返された領域［レンツ（Ｌｅｎｚ ）ら、ネイヂｔ　−（ｎａｔｕｒｅ）　、同上〕にある領域、すなわち他のネズ ミレトロウィルスのエンハンサ−エレメント機能を含有することが示された領域 内に位置している［スパンジドス（Ｓｐａｎｄ　１ｄｏｓ）ら、上記；ブラー、 ディー、ジー。

（Ｂｌａｉｒ、Ｄ、Ｇ、）ら、ＰＮＡＳ　ＵＳ＾、７７　：　３５０４〜３５０ ８（１９８０）　：ブラー。

ディー、ジー、（Ｂｌａｉｒ、Ｄ、Ｇ、）ら、サイエンス（扛旦五射、２１２・ ９４１〜４３（１９８１）　；レビンソン、ビー、　（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、Ｂ、 ）ら、ネイヂｔｙ　−（Ｎａｔｕｒｅ）、２９５：５６８〜５７２（１９８２） 　：レーミンス、エル。

ニー、（Ｌａｉｍｉｎｓ、Ｌ、八、）ら　、　ＰＮ八へ　ＵＳＡ、　７９　：　 ６４５３〜６４５７（１９８２）ニジヨリ−、ディー、ジエー、　（Ｊｏｌｌｙ 、Ｄ、Ｊ、）ら、ヌクレイックアシッズ　レス、（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｃｓ、）　、１１　：　１８５５〜１８７２（１９８３）　：ベールグ、ビ ー、イー、　（Ｂｅｒｇ、Ｐ、Ｅ、）ら、モル、セル。

ビオール、（Ｈｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　、３：１２４Ｇ　〜１２５４（ １９８３）；クリ−グラ−、エム、（にｒｉｅｇｌｅｒ、Ｈ，）ら、モル、セル 、ピオール。

（Ｈｏ１．Ｃｃｌｌ、Ｂｉｏｌ、　）、３：３２５〜３３９（１９８３）　；ウ ッド、Ｔ４−。

ジー、　（ｆｆｏｏｄ、Ｔ、Ｇ、）ら、ジェー、ビロール、（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ）　、４６：７２６〜７３６（１９８３）　；レイミンズ、エル、ニー、（Ｌａ ｉｍｉｎｓ、Ｌ、Ａ、）ら、ジェー、ごロール、（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　、４９ ：１８３〜１８９（１９８４）　：スリニバサン、ニー、　（Ｓｒｉｎｉｖａｓ ａｎ、Ａ、）ら、サイエンス（江口二）、２２３：２８Ｇ〜２８９（１９８４） 　：ソニー。イー、（１−ｉｎｎｅｙ、Ｅ、）ら、ネイチｔ　−（Ｎａｔｕｒｅ ）、３０８：４７０〜４７２（１９８４）　；　コニ＋ラン。

エル、エム、　（Ｃｏｃｏｒａｎ、Ｌ、Ｈ，）ら、セル（劇旦）、３７：１１３ 〜１２２（１９８４）参照］。

この観察から、開始部位から遠くに位置する配列が種々の細胞型でプロモーター エレメントを利用する効率の一次決定基として機能する可能性が示される。この 可能性をテストするために、５Ｌ３−３とＡｋｖのＬＴＲ配列のタンデムに繰り 返されるエレメントを有する１１３領域の部分がネズミＴ細胞内で転写エンハン サ−エレメントとして働く能力を測定した。

開始部位特異性を司るＳＶ４０初期領域プロモーターの部分［ベノイスト、シー 、　（Ｂｅｎｏｉｓｔ、Ｃ，）ら、ネイチｔｙ　−（Ｎａｔｕｒｅ）、２９０： ３０４〜３１０（１９８１）及びフロム、エム、　（ＦｒｏＩＩＩＩ＋＋、Ｈ， ）ら、ジ工−９モル、アブル、ジェネト、（Ｊ、Ｈｏ１．＾［、）、１：４５７ 〜４８１（１９８２）　］　ヲＣＡ　Ｔ　ｉｌｌ伝子（（ｐｓＶＩＸｃＡＴ−Ａ Ｂ３と表わス）ノ５°に配置し、５Ｌ３−３又はＡｋｖのタンデム反復エレメン トを有する領域をＳＶ４０初期開始部位から約２キロ塩基の部位で両方の配向で シスに結合した（図ｉｂ）。これらのプラスミドをネズミ下細胞（へＫＳＬ３セ ルライン）にトランスフェクトし、ｐＲＳＶＣＡＴ及びｐｓＶＩＸｃＡＴ−ＡＢ ３）と比較してＣＡＴ活性のレベルを測定した（図２０、表２）。５Ｌ３−３反 復領域を含有するプラスミドによって支配されるＣＡＴ活性のレベルはネズミＬ ＴＲ配列を持たないＩ）ＳＶＩＸＣＡＴ−ＡＢ３プラスミドのＣＡＴ活性レベル の３０倍以上であった。５Ｌ３−３配列含有プラスミドについて観察されたＣＡ Ｔ活性の顕箸な上昇とは対照的に、＾ｋｖタンデム反復領域配列含有プラスミド についてのＣＡＴ活性のレベルはｐＳＶＩＸＣＡＴ−ＡＢ３に比し２倍上昇する のみである。もう　１つ別のネズミＴセルライン、５Ｌ３Ｂセルラインを用いて も同様の結果が得られたくデータは示さず）。

これらの結果は、■細胞においては５Ｌ３−３　ＬＴＲのタンデム反復エレメン トを有づる領域が転写エンハンサ−エレメントとして動り［パナージ、ジｘ　− 、（Ｂａｎｃｒｊｉ、Ｊ、　）う、ｆｆル（劇１１）、２７：２９９〜３０８（ １９８１）及びワシリク、ビー、　（１４ａｓｙｌｙｋ、Ｂ、）ら、セル（凹） 　、　３２：５０３〜５１４（１９８３）参照］、寸なわら、遠くに位置するヘ テロ特異的なプロモーターエレメントからの増強された活性を配向に依らずに可 能にすることを示ず。従って、Ａｋｖ配列と比較したネズミＴ細胞での５Ｌ３− ３　ＬＴＲ配列の転写活性の増強はｕ３領域内で遠くに位置する配列がコードし ているエンハンサ−エレメント機能の相違によるものでありうる。

ＡｋＶ配列によるものと比べてＴ細胞内で３１３−３　ＬＴＲエレメントによっ て支配されるＣＡＴ遺伝子転写の速度が大きいことにより、５Ｌ３−３　ＬＴＲ 含有ウィルスのＴＩＩ胞向性と白血病誘発能が説明できる。レトロウィルスの複 製は組込まれたプロウィルスからの転写を介して進行する。ここで１１２察され た１０〜６０倍という大きさの転写速度の組織特異的な差異はウィルス複製の程 度に対し大きな作用を持ちうる。何故ならば、このような差異は複製の連続的− 巡に際してべき乗関数として大きくなることが予期されうるからである。このモ デルと一致して、最近の研究はウィルス複製の細胞特異性と、Ｌ、ＴＲ領域内で のみ異なる同一遺伝子のウィルス群で誘導される白血病の型との間に相関がある ことを示している［デスグロセイラーズ（ＤｅｓＧｒｏｓｅｉ　Ｉ　Ｉｅｒｓ） ら、上記、及びヂャティス（Ｃｈａｔｉｓ）ら、上記参照］。従って、適当な細 胞環境での転写を介するウィルス複製はこれらウィルスによる組織特異的疾患の 誘発に主要な役割を演じているかもしれない。

最侵に、最近の研究によると、ネズミ白血病ウィルスは共通の座に隣接してプロ ウィルスが組込まれることによって疾患を１４しえ［ココラン（Ｃｏｃｏｒａｎ ｌら、上記：シクリス、ビー、エフ、　（ｒｓｉｃｈｌｉｓ、Ｐ、Ｎ、）ら、ネ イチｐ　−１ａｔｕｒｅ）、３０２：４４５〜４４９（１９８３）　；ステフェ ン、ディー、　（Ｓｔｃｆｆｃｎ、Ｄ、）、　ＰＮＡＳ　ＵＳ＾・８１　：　２ ０９７〜２１０１（＋９８４）　；及びキュイパース、エイチ、ティー。

（Ｃｕｙｐａｒｓ、　Ｉｌ、　Ｔ、　）ら、セル（Ｃｅｌｌ）　、　３７：１４ １〜１５０（１９８４）参照］、その中のいくつかは公知の腫瘍遺伝子を含有し ている［ココラン（ＣｏｃｏｒａｎＪら、上記及びステフェン（Ｓｔｅｆｆｅｎ ）　、上記］。これらの組込み部位を分析すると、これらの座は隣接するウィル スのＬ　Ｔ　Ｒエンハンサ−エレメントにより転写活性化されうろことが示され る［ココラン（Ｃｏｃｏｒａｎｌら、上記；　ツクリス（Ｔｓｉｃｈｌ　ｉｓｌ ら、上記；ステフェン（Ｓｔｅｒｆｅｎ）　、上記及びキュイバース（ｃｕｙｐ ｃｒｓ）ら、上記］。

本発明名らの推測では、もし同時でなければ追加的な、Ｔｅｌ胞白血病誘発性ウ ィルスのＬ　Ｔ　Ｒの特性が隣接する細胞性座の転写を活性化づるに十分強力な エンハンサ−エレメント灘能を提供するであろう。

Ｎｌ１１３Ｔ３細胞では、Ａｋｖ　ＬＴＲ配列を含有するプラスミドでのＣＡＴ 遺伝子発現のレベルは５Ｌ３−３ウイルスの対応領域を含有するプラスミドによ り観察されたものの３倍である。マウスＬ細胞、すなわちもう　１つ別のネズミ 線帷芽細胞セルラインを用いても同様な結果が得られた。

ネズミリンパ球様細胞セルラインを用いて同様な一連の実験を実施した。ネズミ Ｔリンパ腫から確立したいくつかのＴセルラインを受容体として用いたが、これ にはＳＬ３．１なわらＳ［３−３ウイルスを注射されたへＫＲマウスの未成熟胴 線Ｔ細胞腫瘍由来（Ｄセルラー（ン［ハイニス、　−１’−、エフ、　（ｌｌａ ｙｃ−ｓ、　Ｅ、　Ｆ、　）ら、ジェー、ナトル、キャンザー　インスト（Ｊ、 Ｎａ口、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、）６９　：　１０７７〜１０８２（１９８２ ）　：及びハイニス、イー、エフ、（１ｌａｙｅｓ。

Ｅ、Ｆ、）　ラ、キｐンサー　リス、（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　３７：７２ ６〜７３０（１９７７）参照］　：　八ＫＳＬ３　′ＩｊなわちへＫＩＩＩマウ スの自然発症腫瘍から確立したセルラインであり、これから３１．３−３ウイル スを単離したセルライン［ノウインスキ、アール、シー（Ｎｏｗｉｎｓｋｉ、Ｒ ，Ｃ，）ら、ジェー、ごロール（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、２７：１３〜１８（１９ ７８）　：レイミンズ、エル、ニー、　（Ｌａｉｉｉｎｓ、Ｌ、八）ら、ＰＩＩ ＡＳ　Ｉｔｓ＾、７９：６５４３〜６５４７（１９８２）　；オスカーソン、エ ム、　（Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ、Ｈ，）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　、 ２０７：１２２４〜１２２６（１９８０）　：及びクリ−グラ−。

エム、（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、　Ｈｌ）ら、モレク５セル、パイオール９（Ｈｏｌ ｃｃ、Ｃｃｌｌ、Ｂｉｏｌ、）　３：３２５〜３３９（１９８３）参照］：及び 非感染マウス下セルライン、　Ｌ６９１　［マクグラス、エム、ニス。

（ＨｃＧｒａｔｌ＋、　Ｈ，Ｓ、　）ら、免疫生物学の最近の課題（Ｃｏｎｔｅ ｍｐｏｒａｒｙ丁ｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｔ＋ｎｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　）　Ｖｏ ｌ、ＩＩ、ワーナー、エフ、エル。

（Ｗａｒｎｅｒ、　Ｈ，Ｌ、　）編、１５７〜１８４頁（１９８０）　：及びノ ウインスキー。

アール、シー、　（Ｎｏｗｉｎｓｋｉ、Ｒ，Ｃ，）ら、ピロロジー（Ｌ皿旦■） 、８１：３Ｇ３〜３７０（１９７７）参照］：並びにイン　ビトロ（１ｎｙｉｔ ｒｏ）で３１３−３ウイルスに感染させたＬ６９１（Ｌ６９１．５Ｌ３−３）が 含まれる。

ネズミＢセルライン旧２も受容体として用いた。

線稚芽細胞を用いて観察した結果と非常に対照的に、５Ｌ３−３ＬＴＲ配列を含 有づるプラスミドによって支配されるＣＡＴ活性のレベルは、テストした全ての Ｔセルラインで、対応する＾ｋｖ配列を含有するものの活性レベルより非常に高 かった。活性の５Ｌ３−３／＾ｋｖの比は、線維芽細胞では０．３〜０．６　、 　Ｔリンパ球では６〜２０である。これらの結果は、線紺芽細胞と比較して、Ｔ 細胞における５Ｌ３−３と＾ｋｖのＬＴＲ配列の礪能は劇的に異なることを示し ている。

本発明によりｌ’ｌられるもう　１つの実質的な利点はこの組織特異性決定基は ウィルスがコードしているいかなる遺伝子産物の産生にも依存しないという事実 に基づくものであり、この事実によって効率的でコンパクトなベクターの設計に おけるこれらニレメン１−の有用性が更に支持される。これらのプラスミドでＮ ＩＨ３Ｔ３線維芽ｉｌｌ胞をトランスフェクションした後のＣＡＴ活性のレベル は表１に要約しである。平行した実験では、ＣＡＴ遺伝子の５゛に位置する、Ｓ Ｖ４０のエンハンサ−プロモーター領域（ｐｓＶ２ｃ八丁）とへウスサ／Ｌ／　 ：ｌ−？ウイ／ｌｚスノ１−ＴＲＷ４域（ＤＲ３ＶＣＡＴ）を有するプラスミド にもＩＩＩ　３１３１胞を露出した。これら２つのプラスミドの活性レベルは使 用した全ての細胞型で概同様であり、ネズミＬＴＲ配列を含有するウィルスの活 性はｐＲ３ＶＣＡＴ及びｐｓＶ２ｃＡＴプラスミドによるｌ−ランスフエクショ ン実験で得られたＣＡＴ活性レベルに対して表わされている。

表　１ 種々の細胞型におけるプロモーターエレメントとしてのネズミＬＴＲ配列の相対 活性 線　胞　型 プ。ニー、−線維芽細胞　リンパ球様細胞エレメント　Ｎｌｌ１３Ｔ３　Ｌ　旧 ２　５Ｌ３Ｂ　ＡＫＳＬ３　１６９１　Ｌ６９１゜Ｌ３−３ Ｒ３Ｖ３’ＬＴＲ１，００１，００１，００１，００１，００１，００１，００ なし　０．２　０．０５　０．Ｑｌ　０．０１　０．０１　０．０４　０．０１ Ａｋｖ　０３　４．９４　５．９６　２．７Ｇ　０．７６　０．５１　０．６４ 　０．２２４ＳＬ３−３１３　１．５２　３．７４　１．７５　４．５０　１０ ．４６　４．９０　１．７３ＳＬ３−３／Ａｋｖ　１３活性比 ０．３１　０．６２　０．６４　５．９４２０．５１　６．３９　７．２０各エ レメントの活性は、各セルライン内でのｐＨ５ＶｃＡＴ中のＲＳＶの３’ＬＴＲ の絶対活性に対して規格化する。セルライン毎の各プラスミドについての絶対活 性は、図２に示したような蛋白質４ｏｏｒｇを含有する細胞抽出物についてのＣ ＡＴ酵素アッセイの初期速度の直線の勾配から計粋した。各プラスミドでトラン スフェクトした所与のセルラインでの絶対活性は、イン　ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ）アッセイでの変換率（％）７時間として表わし、ｐｌ？ｓＶｃ＾■でトラ ンスフェクトした同じセルラインの絶対活性値を表中の相対値に掛けることによ り定量的に得られる。

各セルラインでのｐＲ３ＶｃＡＴの絶対活性をカッコ内に示す二ＮＴＨ３Ｔ３　 （２，０６％／時）　、Ｌ（０，６４％／時）　、　）１１２（２，５％／時） 、八ＫＳＬ３これらの結果は、旧１１３Ｔ３　ＩＩ雑芽ｍ飽では、Ａｋｖ　ＬＴ Ｒ配列を含有するプラスミドのＣＡＴ活性レベルは５Ｌ３−３のｕ３配列を含有 するものの約２倍であることを示している。これらの実験は、線維芽細胞ではＣ ＡＴ転写の促進にはＳＬ３　ＬＴＲ配列よりも＾ｋｖのＬＴＲ配列の方が強力で あり、■細胞ではＡｋＶよりもＳＬ３のＬＴＲ配列の方がずっと強力であること を示している。

非急性のネズミ及びトリのレトロウィルスにより誘発される白血病誘発の一段階 は近接のプロウィルスの組込みを介する細胞性腫瘍遺伝子の転写活性化であるこ とが最近の証拠から示されている。利用しうる証拠は、プロウィルスの組込みが 多くの可能な部位で発生し、このプロセスはランダムでありうることを支持して いる。従って、細胞性腫瘍遺伝子の活性化には複製を何度も行うことが必要であ るようである。本明細書に記載したように、ウィルス複製部位と、ＬＴＲ領域内 のみが異なる同一遺伝子のウィルス群で誘導される白血病の型との間に良い相　 ′関があることが発見された。そのために、非急性白血病ウィルスのＴ１８Ｍ向 性と白血病誘発能の両者は、分化した細胞型でウィルスが効率よく複製する能力 を決定する転写エンハンサ−エレメントの特性であることが提起される。

マウスの感受性株に注射すると、ネズミ白血病ウィルスは特徴的な組織特異性、 潜伏期間及び疾患表現型を示す、、最近の知見は、■細胞白血病を誘発する能力 がこれらのウィルスの非−コーディング末端長反復配列（ＬＴＲ）に関係するこ とを示している［レンツ（Ｌ（＋ｎＺ）、上記；カチス、ビー、　ニー、　（Ｃ ｈａｔｉｓ、Ｐ、Ａ、）ら、ＰＮＡＳ　ＩＩｓ＾、８０　：　４４０８（１９ｇ ３）　；及びデグロセイラーズ（ＤｅｓＧｒｏｓｅｉｌｌｅｒｓ）、上記］。Ｌ ＴＲ配列が複製の好ましい臓器部位と疾病表現型を決定するかどうかをテストす るために、ＬＴＲ領域のみが異なる一連の同−遺伝子型の組換えウィルスを構築 した。使用したウィルスはＡｋｖウィルス［ローウェ、ダブリュ。

ビー、　（Ｒｏｗｃ、１４．Ｐ、）ら、Ｄ　−）’ｖ　Ｆ　スフ　１Ｊ　ン）ｊ 　バー　バー　シンプ、クオント、パイオール、（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ。

Ｑｕａｎｔ、　Ｂｔｏｌ、　）　、４４　：　１２６５〜１２６８（１９７９） 　；及びハイス、イー。

エフ、　（ｆｌａｙｓ、Ｅ、Ｆ、）ら、キャンサー　リス、　（Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒａｓ、）、３７：７２６〜７３０（１９７７）］　；　ＡＫＲマウスに内因性 の無毒性株、胸腺白血病ウィルス、５Ｌ３−３　［ベダーセン、エフ、ニス、　 （Ｐｅｄｅｒｓｅｎ。

Ｆ、Ｓ、）ら、ネイチｔ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　（０ンドン）、２９２：１６７ 〜１７０（１９８１）］、及び赤赤白痔病ィルス、フレンド（Ｆｒｉａｎｄ）ヘ ルパー”フィルス（Ｆｒ−ＨｕＬＶ）　［ｔ’Ｊ７．　ニー、　フイ、　（０１ ｉＮ、Ａ、１．）６、シｘ　−、ヒロール、（，１，Ｖｉｒｏｌ、　）　、３５ ：９２４〜９３６（１９８０１１ｆテあった。本明細書中に記載したように、こ れらウィルスが胸腺又は牌臓内で効率よく複製し、胸腺又は赤白血痰を誘発する 能力はＬＴＲ配列で決定される。更に、これらウィルスに感染した動物では組換 えＭＣＦウィルスが検出されないことも発見された。

これらの実験に使用したクローン化した感染性プロウィルスは無毒性へｋｖウィ ルス、３１−３−３、［レンツ（Ｌｅｎｚ）、上記］、及びフレンドウィルス複 合体、Ｆｒ−ＨｕＬＶ５７の非欠損成分であった。

実質的な配列の差はこれらウィルスのｕ３領域で発見された（図３）。特異的な 組織でこれらの差がウィルスの複製にどのように作用するかを調べるために、図 １に示す一連の組換えプロウィルスを構築した。Ｓ１３　ＬＴＲ−Ａｋｖゲノム 組換え体、Ｒ［Ｃへ５１１５はマウスの八にＲ，Ｃ３Ａ、Ｃ２１（、ＳＪＬ及び ＮＦＳ株で慢性白血病を誘発することが既に示されている［レンツ（Ｌｃｎｚ） 、上記］。

Ｆｒ−ＨｕＬＶ５７のＬＴＲ配列が対応するＡｋＶ　ＬＴＲ又は５Ｌ３−３配列 に置き換った組換えプロウィルスも溝築した（図１）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞をプロ ウィルスＤＮＡでトランスフェクトすることによりこれら組換えプロウィルスの 各々から感染性ウィルスを得た［レンツ（Ｌｃｎｚｌ、上記：レンツ（Ｌｅｎｚ ）、上記（１９８２）］。

ウィルスの複製部位を決定するために、ＸＣプラークアッセイで測定して　＋ｘ １０４の感染単位を新生１１ＦＳマウスに注射した［グロス、月し、　（Ｇｒｏ ｓｓ、Ｌ、）、プロ乞ツク、エクスブ、ノ＼イオール、メト、（Ｐｒｏｃ、Ｓｏ ｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｈｅｄ、）、９４：　７６７〜１７１（１９５７）　］ 。マウスのＮＦＳ株はこれらのマウスが内因性Ｍｕ　ＬＶを検出可能なレベルで 発現しないという理由で選択した。

臓’５　カらノ１１′ｌ胞を水洗（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）Ｌ、感染中心、ＸＣアッ セイを用いて感染した細胞数を測定することにより、胸腺、牌臓及び骨髄細胞で のウィルスの複製能を測定した。表２は、２０〜４０遍間の実験期間中、ＡｋＶ に感染した動物の胸腺、牌臓及び骨髄では＾ｋｖウィルスの力価が低いままであ ることを示して（Ｘる。

対照的に、ＲＥＣＡＳ１１５を接種した動物の胸腺でのウィルス力価（よ接種６ 週後まで１〜５ｘ　１０　の範囲で高かった。しかしながら、未満だった。

表　２ ＡＫＶウイルス力価 接種後の週数 マウス　１　２　３　、’１５６　７６　９１０１１　１２胸　腺　ＩＫ　５Ｋ 　ＯＯ０２０００１１５Ｋ　０　０　４０に　０牌　臓　６００　０　０　０　 ０　３００　０３Ｋ　、０　０　１００Ｋ　Ｏ骨　髄　１．４に　１００　１５ ０　０　０　１５０　０　４５０　５０　０　３０Ｋ　ＯＸＣ十感染中心／１０ ７細胞として表わす。

感染した胸腺細胞が成熟皮質群（（ＯｒｔｉＣａｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を 示すかどうかを決定するために、胸腺摘出の１日前にいくつかの動物にアキ４ノ メタゾンを注射した。この処理により感染した胸腺細胞の数が大きく減少し、感 染した胸腺細胞のほとんど全てが皮質起源のものであることを示している（表３ 参照）。

表　３ （ＬＴＲ−ｇａｇ）　５Ｌ３−３　（ｌｏｏｔ　ｅｎｖ　３°）　ＡｋｖＲ−８ 接種後の週数 マウスＮｏ、５　８　８　１２　１２　１２　１２　１２　２０　２０メタシン 　１　２　３４５６７　８　９　１０胸　腺　４Ｋ　１Ｋ　３に　１０に　４Ｋ 　１０Ｋ　２００　０　１００Ｋ　３０に牌　臓　４００　９０　１２０５００ ４００５５　９００　１２０　９００　１．６にｆｔ　ｕ　１４０　１４０３０ ０２８０１４０　−　−　−　９０　１９００ＸＣ十感染中心／１０７細胞とし て表わす。

細胞の表現型も調べた。これらの研究によると、５Ｌ３−３　ＬＴＲ配列を含有 するウィルスに感染した細胞の大部分はナイロンウールにもプラスチックにも接 着せず、θ抗原陽性、ＩｇＧ陰性、しｙ１＋、Ｌｔ２−であった。これら動物の 牌臓中の感染細胞の約２０％はθ陰性でＩＱＧ陽性であり、Ｂ細胞又はＢ細胞前 駆体も感染したかもしれないことを示した。■細胞白血病を誘発するウィルスは 低いが測定できる頻度で８細胞にも感染することを従来の研究が示している。

フレンド組換Ａ臓器向性はＡｋＶ又は３１３−３のＬＴＲ組換え体のものと劇的 に異なっている（表４）。これらのウィルスは牌臓内では高い力価まで複製する が胸腺内では複製しない。ＡｋＶ及びＲＥＣＡＳ１１５と比較するとウィルス力 価は、牌臓では少なくとも２のオーダーの大きさでより大きく、胸腺では約２の オーダーの大きさでより小さい。

表　４ ＲＥＣＡＳ　１１５　（ＬＴＲ５Ｌ３−３）　（ｏａａ　ｐｏｌ　ｅｎｖ　３’ 　八ｋｖ）デキサメタシン　− 接種後週数　４　４　４　６ マウス　１　２　３　４ 胸　腺　６００　２．４ｋ　２　３０に牌　臓　４８　１１０　５２　２５０ 骨　髄　３ｋ　９００　１．８ｋ ＸＣ十感染中心／１０７細胞として表わす。

フレンド−組換えウィルスを接種した動物のあるものでは赤白血痰が起った。こ れらの動物から得Ｉこ牌臓リンパ球は非特異的エステラーゼに対して正に染色さ れ、スーダンブラックでは負に染色された。

表　５ ウィルス（フレンドＬＴＲ）’−（Ｃｌａｇｐｏｔ　ｅｎｖ　３°＾ｋｖ）接種 後週数　４　４　６ 牌臓力価　１１０　４８　２５０ ナイロンウール　２７０　６８　４００プラスチツクのり　１３０　５０　７８ ０θ＋　２１０　５６　４４０ θ＋　４９　２４　１７Ｏ Ｉｑ＋３４　２９　１２０ Ｉ　Ｑ　−１００６１３４０ Ｌ　Ｖ　ｒ　＋　９８　３８　３００ Ｌ　Ｖ　ｒ　−２２１０９０ Ｌ　ｙ　２　＋７４　ａ　１１０ しｙ　２−　９０　４５　２４０ 接種したウィルスと、ＭＣＦエンベロープ遺伝子をコードする細胞性配列との間 の組換え体が、胸腺及び赤白血病ウィルスの両者により誘発された疾患の前白血 病及び白血病状態でしばしば検出される［ティク、エフ。エム、（Ｔｅ１ｃｈ、 　Ｎ、　Ｈ，）ら、セル（収見）　、１２：９３７〜９８２（１９７７）　：コ ッフィン、ジエー。

（Ｃｏｆｆｉｎ、Ｊ、）　、　ＲＮＡ腫瘍ウィルス中の内因性ウィルス（担鋭姐 並姐と■組且辷江」仏Ｊ旦肛コ旦五胚）、コールドスプリング　ハーバ−ラボラ トリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９ ８２）　；ファムラリ、エフ。ジー、　（Ｆａｉｕｌａｒｉ　Ｎ。

Ｇ、）ら、ジエー、ビロール、　（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、４０：９７１〜９７６ （１９８１）］。

ここに記載したウィルスを接種した動物中にＭＣＦウィルスが存在するかどうか を決めるために感染した胸腺又はｌ１ＩＷ４細胞をする昼±曇暑能力［ハートレ イ、ジエー、ダブリュ、　（ｌｌａｒｔｌｅｙ。

し、腎、）ら、ブロク、ナトル、アカデ、サイ、米国（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ）　、７４ニア８９〜７９２（１９７７）］、ミンク の細胞でシンクチア（ｓｙｒｔｃｔ＋ａ）を誘発する能力を調べた（ＩＩＶ−ミ ンクテス１へ）。

感染細胞によるＭＣＦ特異的組挟え抗体の結合も調べた。これらのテストではＭ ＣＦ様ウィルスは検出されなかった。胸腺又は赤白血病が完全に発症し多くの割 合の細胞が感染性ウィルスを産生ｐしている動物でさえも感染細胞内にはＭＣＦ 様糖蛋白質又はウィルスは存在しなかった。

表　６ 接種後週数　３　３　６　８ ウィルス　５Ｆ−２４八２２６　Ａ２２６　へ２２６胸　腺　２２　７００　１ ，５００　５．０００牌　臓　４，８００　２５，０００　７５，０００　１， ０００，０００　”　＋ここに示した結果は、ＮＦＳマウスの胸腺又は稗臓のい ずれかで効率よく複製するウィルスの能力はＬＴＲの特性であって、ウィルスの 匠、匪又はｅｎｖ　Ｗ転子により決定されるのではないことを表わしている。

これらの結果は、ＨｕＬＶウィルスのＬＴＲ領域が主要な組織向性及び疾患表現 型をコードすることを示した以前の研究と一致する［レンツ（Ｌｃｎｚ）、上記 （１９８３）　：カチス（Ｃｈａｔｉｓ）、上記（１９８３）　：デ　グロセイ ラーズ（Ｄｅｓ　Ｇｒｏｓｅｉｌｌｅｒｓ　）　、上記。　クロス（Ｇｒｏｓｓ ）　Ａウィルス３１３−３の疾患表現型はＬＴＲ配列が決定する［デ　グロセイ ラーズ（Ｏｃｓ　Ｇｒｏｓｃｉｌｌｅｒｓ）　、上記］。

モロネイ（Ｈｏｌｏｎｅｙ　）ネズミ白血病ウィルスの胸腺白血病つを含有する 組換えウィルスはＮｏ−ＨｕＬＶのＴ細胞白血病特性を誘発する［カチスＣＣｈ ａｔｉｓ）　、上記、一方、相互的組換え体は（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ｒｅｃ ｏｉｂｉｎａｎｔ）フレンドウィルスの典型的疾患を誘発する。

本明細書でＬＴＲ配列の特性であることを示している特異的組織中で高い力価ま で複製するというウィルスの能力は非急性レトロウィルスによる疾患誘発にとっ ての必須要件である。［ｒ−３Ｌ３組換えウィルスである５Ｆ２４を注射したマ ウスでは、今日までのところ胸腺疾患は起っていない。このこと自身から、適当 なＬＴＲを含有しない５Ｌ３−３のコーティング配列は胸腺疾患を誘導するには 不十分であることが確認される。しかしながら、これらのマウスの少しではＦｒ −ＨｕＬＶ感染に特徴的である赤芽球症を起した。

ここで検討したウィルスの複製の組織特異性はＭＦＣ組換え体の形成によるもの ではない。何故ならばこれらウィルスのいずれについてもＮＦＳマウスの感染時 にこのような組換え体が形成されなかったからである。同じ理由から、胸腺白血 病又は赤白血病の誘導にＭＦＣの形成が必要であるとは信じられない。

＾ｋｖ、　５Ｌ３−３．　Ｆｒ−ＨｕＬＶ及びＨａ−ＭｕＬＶのＬＴＲの配列は 図３に示しである。前述の如く、唯一の点突然変異を除いては、八ｋｖ及び５Ｌ ３−３ウイルスの配列にＡＨノる唯一の差はＬＴＲの０３領域のタンデム反復配 列中にある［レンツ（Ｌｅｎｚ）　、上記］。Ｆｒ−ＨｕＬＶのｕ：＋ｆｉ域の 配列は、同様に配置されているタンデム反復領域中で＾ｋｖ及び５Ｌ３−３のも のと異なっている。

ｒｒ−ＨｕＬＶのＬＴＲの配列もタンデム反復エレメントの３゛領域内で＾ｋｖ 及びＳ　Ｌ　３−３のものと異なる。しかしながら、ｌ−Ｔ　Ｒのこの領域内で は、フレンドＬＴＲの配列は胸腺向性Ｈｏ−ＨｕＬＶのものと非常に類似してい る［コツホ（にｏｃｈ）、１９８３］。従って、これはウィルスの組織向性を決 定するタンデム反復内の配列のトは異種プロモーターの高レベルでの転写を支配 しうる転写エンパン４ノーエレメントとしては能することが示されている［レビ ンソン、ビー、　（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、Ｂ、）ら、ネイチャー（［ａｔｕｒｅ） 、２９５：５６８〜５７２（１９８２）　：レイミンズ（１，ａｉｍｉｎｓ）　 、上記：オスカーソン、エム、　（Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ、Ｈ，）ら、リイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ　）、２９７：１２２４〜１２２６（１９８０）　：及びクレ イグラ−、エム、（Ｋｒｅｉｇｌｃｒ。

Ｈ，）ら、モレク、ｔ！ル、パイオール、（Ｈｏ１ｃｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 ）、３：３２５−−３３９（１９８３）］。従って、タンデム反復エレメントが 転写を促進し、それにより特異的な分化した組織でウィルスの複製を促進Ｊる能 力における差がこれらウィルスの組織向性と病因との両者を決定する。

本発明を以下の実施例により更に説明する。これら実施例は本発明を理解するた めに提示づるものであって、本発明を限定することを意図するものではない。

実　施　例　１ マウスＬＴＲ配列のプロモーターエレメント礪能を評価するために使用したプラ スミドの構築 ＾ｋｖと５Ｌ３−３の５’−ＬＴＲを有するプラスミド　サブクローン（各々ｐ ＬＴＲ−Ａ４及びＤＬＴＲ−３３）はジエー、レンツ（Ｊ、　Ｌｅｎｚ）によっ て提供された。ＬＴＲのＰｓｔｌ−へｖａｌフラグメントは各ウィルスのウィル スＲＮＡ開始部位（＋１と表わす）に対して−４４３〜＋３１に広がる、Ｒｆｆ （域の小画分とＵ３とからなる。このフラグメントは、Ｈｉｎｄ［［［合成リン カ−を用いて天然へｖａ　工部位を１ｌｉｎｄｌ１部位に変換し、天然Ｐｓｔ　 Ｉ部位を平滑末端に変換した各Ｌ　Ｔ　Ｒ４）ブクローンから単離した。

Ｌ　Ｔ　Ｒフラグメントの受容体ベクターとして用いたプラスミドは、７２ｂｐ タンデム反復エレメントのほぼ全体を欠失したＳＶ４０初期領域プロモーター突 然変異体の制御下にあるＣＡＴ遺伝子転子コニット全体［ゴーマン（Ｇｏｒｍａ ｎ）ら、モル、セル、パイオール、（Ｈｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　、同上 ］　（シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のｔ−イントロンとポリアデニル化シ グナルが後続しているＣＡＴコーディング配列）を含有している（ｐＳＶＩＸＣ ＡＴと表わツ、下記参照）。合成Ｘｈｏ　工部位（５゛）と天然旧ｎｄＩ［部位 （３゛）とで区切られたＳＶ４０初１ガ領域プロモーターを、Ｘｈｏ　Ｉ部位が 平滑末端に変換される方法でＸｈｏ　丁、　Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ及び１ｌ ｉｎｄ■酵素で連続的に消化して１）ＳＶＩＸＣＡＴから除去した。ＬＴＲフラ グメントをＣＡＴ遺伝子転写中位を含有しているベクターフラグメントに連結し て、Ｃ△−「遺伝子が八ｋｖ（ｐＡＵ３ｃＡＴ）又は５Ｌ３−３（ｐｓＵ３ｃＡ Ｔ）のＵ３ｉ域内の転写エレメントの制御下にあるプラスミドを作成した。＾ｋ ｖと５Ｌ３−３の０３領域は、八ｋｖに比べ５Ｌ３−３ではヌクレオヂド位置６ ５（星印で示す）に１塩基の挿入があること、及び反復エレメント内の配列（矢 印で示す）を除いては同じである［レンツ（ＬｅｎＺ）ら、ネイヂ１戸−（Ｎａ ｔｌｌｒｅ）　、上記参照］。ＣＡＡＴ、　ＴへＴへ及び開始（＋１と表わず） 配列の相対位置を示１゜ｐＡＵ３ｃＡＴ　及Ｕ　ｐｓｌＩ３ｃＡＴ　ニ使用り、 　ｋ　Ｌ　Ｔ　Ｒ配列（７）　位置トｊＡ　界を典型的なレトロウィルスＬ　Ｔ 　Ｒと対比して示ず。

実　施　例　２ マウスＬＴＲｊのエンハンザ−エレメントと　を　するために使用したプラスミ ドの　築 ５ＶＢ４０初期領域プロモーターの制御下にＣＡＴ遺伝子を担持するプラスミド （ｐＳＶ２ＣＡＴと表わす）［ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、モレク、セル、パ イオール、　［Ｈｏ１ｅｃ、Ｃｃｌｌ、Ｂｉｏｌ暑、上記］をＡＣＣＩとＳｐｈ 　［で消化して７２ｂｔ）反復領域の大部分を除去した。Ｔ４ＤＮＡポリメラー ゼ及びＸｈｏ　Ｉ合成リーダーを用いて天然へＣ工及びＳｐｈ　Ｉ部位をＸｈｏ 　丁部位に変換した。Ｘｈｏ　Ｉで消化し、ＤＮＡリガーゼの存在下で再環化し て得られたプラスミド（ｐｓＶＩＸｃＡＴ）は、（最も５°側の開始部位に対し て）−１２７〜＋６５に広がるＳＶ４０プロモーター配列の制御下にＣＡＴｍ仏 子を含有する［ベノイス１〜（Ｂｃｎｏｉｓｔ）ら、上記］。このプロモーター 欠失変異体の構造を、ｐＳＶ２ＣＡＴで見られる完全なＳＶ４０初期領域プロモ ーターと対比して示す。反復ニレメンｌ−（矢印で示ず）、複製起点（ｏｒｉ） 　、　ＴＡＴ＾エレメント（Ａ／Ｔで示す）及び初期開始部位（＋１で示７１） を承り。１ｌｓＶｌＸｃＡＴ中に存在するＳＶ４０プロモーター配列はエンハン サ−エレメント活性を欠いている。しかしながら、エンハンザ−活性を含イｊＭ る配列をＳＶ４０初期開始部位に対して種々の部位でｐｓＶＩＸｃＡＴに連結す ることによりこの活性は元に戻りうる（未公表の知見）。

この研究のために、ＳＶ４０初期開始部位から２．１キロ塩基以上離れている天 然式ｐａ　Ｉ部位［フイアーズ、ダブリュ（Ｆｉｅｒｓ、Ｗｌら、ネイチャー　 （Ｎａｔｔｌｒ（り、２７３：１１３〜１２０（１９７８）参照］を■４ＯＮλ ポリメラーゼと合成りｏｊ　ＩＩリンカ−とを用いてＢａｊ！　Ｕ部位に変換し ＴＳＶＩＸＣＡＴ　（７）変異体（ｐｓＶ［ＸｃＡＴ−ＡＢ　３．！：呼ぶ）　 をｍ築した。ＬＴＲサブクローン、　Ｉ）ＬＴＲ−Ａ４及びＩＩＬＴＲ−Ｓ３を ５ａｕ３八及びＥｃｏＲｆ　テ消化し、ｕ３領領域列の３３７ｂＤとｐＢＲ３２ ２の５ａｕ３八フラグメントＤの２８３ｂｐとを含有する６２０　ｂｐ　５ａｕ ３Ａフラグメントを中離した。６２０　ｂｐ　５ａｕ３＾フラグメントに存在す るｕ３領領域列は、（図１８のウィルスのＬＴＲ開始部位に対して）　−４４３ 〜−１０６に広がる配列からなり、各ウィルスのタンデム反復領域全体を含有し ている。各ＬＴＲサブクローンからの６２０　ｂｐ　５ａｕ３Ａフラグメントを ｐｓＶＩＸｃＡＴ−八Ｂ３の唯一のＢｇｊ　Ｉ［部位にどちらかの配向で挿入し た。全ての操作は標準的組換えＤＮＡ手法［マニアチス（Ｈａｎｉａｔｉｓｌら 、上記］により行った。

実　施　例　３ 支配されるＣＡＴ活性 Ｊ８養細胞中に平行にトランスフェクトされた、ＣＡＴ″ｉｉ伝子転写ユ転子ト の５°に結合されたＡｋｖ　ｌＪ３領域（＾ｕ３と略す）　、５Ｌ３−３　Ｕ３ １域（ＳＵ３と略ず）、ラウスザルコーマウィルスの３’−ＬＴＲ（Ｒ３νと略 す）のいずれかを含有するか又は真核性プロモーターエレメントを持たない（Ｓ ＶＯと略す）プラスミドについての代表的なＣＡＴアッセイを、Ｎ１１１３Ｔ３ 線雑芽細胞（ａ）及びＡＫＳＬ３　Ｔ細胞（ｂ）について図１（ａ）〜１（Ｃ） に示す。ＣＡＴ遺伝子に結合された、エンハンサ−結合配列を欠（ＳＶ４０プロ モーター配列（ＳＶＩＸ−八Ｂ３と略す）：ＣＡＴ遺伝子転写と同じ及び反対の 転写方向でＳＶ４０初期開始部位から２キロ塩基離れたｈＩＩＴ部位に挿入され たＡｋｖ反復領域（各々ＡＩ’（＋、）　、ＡＥ（−）と略す）、ＣＡＴ遺伝子 転写と同じ及び反対の転写方向でＢａｐ　ｎ部位に挿入された５Ｌ３−３反復領 域（各々ＳＥ（÷）　、５Ｆ（−）と略す）、及びラウスザルコーマウィルスの ３’ＬＴＲ（ＲＳＶと略す）のいずれかを含有し、培養細胞内に平行にトランス フェクトされたプラスミドについてのエンハンサ−エレメント機能の代表的ＣＡ Ｔアッセイを八ＫＳＬ３　Ｔ細胞（Ｃ）について示す。結果は、（ａ）及び（ｂ ）では蛋白質４００埒、（Ｃ）では６００埒を含有する抽出物により１４ｃｍク ロラムフェニコールが１４Ｃ−クロラムフェニコールアセテートに変換されるパ ーセンテージとして表わされている。挿入図は３０分（ａ）、８０分（ｂ）及び ３０分（Ｃ）でのＣＡＴアッセイの典型的オートラジオグラムを示している。上 の２つのスポットは１４Ｇ−クロラムフェニコールモノアセテートの２つの異性 体に対応し、一方、そのスポットは未反応基質、１４Ｃ−クロラムフェニコール である。

トランスフェクションカクテル当り各プラスミドＤＮＡの等ｍで各マウスセルラ インをトランスフェクトした。各実験で使用したＤＮＡｆ！ｌは最適ＣＡＴ活性 の直線範囲内にあった。前述のようにして［ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、上 記］　、ｎｉ＋−＋３ｙ３細胞のトランスフェクションを行った。前述のように して［スタフオード（Ｓｔａｆｆｏｒｄ）ら、上記］、シ細胞とリンパ球様Ｉｌ ｌ胞のトランスフェクションを行った。過渡的な発現期［（ａ）と（ｂ）でのプ ロモーター試験では４４時間；（Ｃ）でのエンハンサ−試験では５０時間］の後 、細胞を冷たい１ｘＰＢＳで洗浄し、ｐｌ＋　７．９の０．２５８トリス−ＨＣ １２００ｐＨに再懸濁した。凍結（−１０℃）−解凍（３７℃）処理のサイクル を３回繰り返し、遠心して細胞抽出物をＷ［Ｌ。

た。

各抽出物アッセイで最終濃度２．４ｍＨのアセチルコエンザイムＡを用いたこと 以外は公表された手順［ゴーマン（ｃｏｒｍａｎ）ら、モル、セル、パイオール 、（Ｈｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　、上記］に従ってインビトｏ　（ｉｎ　 ｖｉｔｒｏ）のＣＡＴ酊素アッセイを行った。前述の手順（同上）に従って、イ ンビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）の酵素アッセイの分析と定」を行った。

表　８ 種々の細胞型におけるプロモーターエレメントとしての７９２ＬＴＲ配列の相対 活性９ＳＬ３−３Ａｋｖ プロモーター　ＲＳＶ　ＡｋＶ　０３　５Ｌ３−３１３　０３　ａｍｉｉｉ！エ レメント　且　３°ＬＴＲ肛−Ａ　肛−−１１」Ｌ１細　胞　型 線維芽細胞 ＋＋１　瞥１３Ｔ３　０．０２　１．００　４．９４　１．５２　０．３１Ｌ　 Ｏ，０５１，００５，９＆　３．７４　０．６２九Ｚバ里呈鳳１“ 八ＫＳＬ３　０．０１　１．ＱＯＯ，７６４，５０５，９４３に３８　Ｇ、０１ 　１．００　０．５１　１０．４６　２０．５１Ｌ６０１　０．０４　１．００ 　０．６４　４．０９　６．３９、Ｌ６９１．５Ｌ３−３　０．０１　１．００ 　０．２４　１．７４　７．２ＯＮＦＳ／Ｎ胸腺細胞　０．８５　１．００　０ ．９２　１３．５７　１４．７５８１２　Ｇ、０１　１．８０　２．７Ｇ　１． ７５　０．６４表８で、各プラスミドのＣＡＴ活性は各セルライン内でのセルラ イン毎の各プラスミドについての絶対活性は、４００埒の蛋白質を含有する細胞 抽出物についてのＣＡＴＩＷ素アッセイの初期速度の直線勾配から計算した。各 プラスミドでトランスフェクトした所与のセルラインでの絶対活性は、インごト ロ（Ｌ！！ｖｉｔｒｏ）アッセイで変換率（Ｘ）７時間で表わされ、ｐＲ３Ｖｃ Δ■でトランスフェクトした同じセルラインの絶対活性値を表８の相対値に１１ ）けることにより定量的に得られる。各セルラインでのｐＲ３ＶＣＡＴ　（７） 絶対活性を力ｙコ内に示Ｔ　：　Ｎ１１Ｉ３Ｔ３（２，０６１／ｈｒ）　、Ｌ（ ０，６４％／ｈ４）、　８１２（２，５％／ｈｒ）、　ＡＫＳＬ３（４，８７Ｘ ／ｈｒ）、５Ｌ３Ｂ（２，０４Ｘ／ｈｒ）。

１．６９１（０，８４Ｘ／ｈｒ）、　Ｌ６９１．５Ｌ３−３（２，３７Ｘ／ｈｒ ）及びＮＦＳ／Ｎ胸腺細胞（００３％／ｈｒ）。

これらのデータは少なくとも２つの独立したトランスフェクションの実験の平均 と、４００埒の蛋白質を含有した抽出物を用いて行ったＣＡＴアッセイを反映し ている。特定値を中心とする活性の範囲はその値の３０％以下で変化した。

ｌマウスＴリンパ肝から確立したいくつかのＴセルラインを受容体として使用し た。これには、ＡＫＲマウスの自然発症腫瘍から確立したセルライン、ＡＫＳＬ ３　（Ｓｌ３−３ウイルスを単離した起源のセルライン）［ノウインスキー、ア ール、シー、（Ｎｏｗｉｎｓｋｉ。

Ｒ，Ｃ，）ら、ジエー、ビロール、　（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）２７：　１３〜１８ （１９７８）参照］：予めＳｌ３ウイルスを注射した八にＲマウスの胸腺Ｔ細胞 腫瘍由来のセルライン、５Ｌ３Ｂ　［ヘイス、イー、エフ、　（ｆｌａｙｓ、　 Ｅ、　Ｆ、　）ら、ジエー９ナトル、キャンサー　インスチチュート（Ｊ、Ｎａ ｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　、　６９：　１０７７〜１０８２（１９ ８２）参照］：非非感染マウス上セルラインＬ６９１［ｖフグラス、エム、ニス 、　（ＨｃＧｒａｔｈ。

Ｈ，Ｓ、　）ら、免疫生物学の最近の課題（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ　ＴＯｐ ｉＣ３ｉｎＩｍａ＋ｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ、［、エフ、エル、ワープ −（Ｎ、　１．、　Ｗａｒｎｃｒ１編、プレナムプレス（Ｐｌｃｎｕｍ　Ｐｒｅ ｓｓ）　、　二：ｌ　−Ｅ−り、１５１〜１８４（１９８０）参照］；インビト Ｄ　（ｉｎ　ＶｉｔｒＯ）で５Ｌ３−３ウイルスに感染した１、６９１細胞、Ｌ ６９１．５Ｌ３−３、及びＮＦＳ／Ｎマウスから単離し新たに溶出した一次胸腺 細胞［ノウインスギ−、アール、シー、（Ｈｏｖｉｎｓｋｉ、Ｒ，Ｃ，）ら、ビ ｏｐシイ（柱匹回丑）　、８１：３６３〜３７０（１９７７）参照］が包含され る。マウスＢセルライン、Ｎ１２も受容体として使用した。

表　９ マウス■細胞、八に３１３におけるエンハンサ−エレメントとしてのマウスＬＴ ＲＦｉｉ！列の相対活性プロモーター　ウィルス反復　相対増強エレメント　領 域及び配向　相対活性１　倍率　＊９Ｒ３３’−ＬＴ１　１．０００ ＳＶ４０初期領域変異体　なし　０．０１　１．００ＳＶ４０初期領域変異体　 へｋｖ、同方向　０．０１　１　、００ＳＶ４０初期領域変異体　へｋｖ、反対 方向　０．０２　２．００ＳＶ４０ｉ期領域変異体　５Ｌ３−３．同方向　０． ３７　３７．００ＳＶ４０初期領域変異体　Ｓ　１．３−３　、反対方向　０． ３４　３４．００表９に承りように、各プラスミドのＣＡＴｇ性は、Ｔセルライ ンΔＫＳＬ３内での１ｔｓＶｃＡＴ中の３−ＬＴＲの絶対活性に対して規格化さ れている。絶対活性は表８に示したようにして測定した。ここに示した結果は６ ００乃の蛋白質を含有する抽出物を用いて行った３回のトランスフェクション実 験とＣＡＴアッセイの平均である。特定値を中心とした活性の変化範囲はその値 の３０％を超えなかった。

ウィルスの反復領域を欠いたプラスミドであるＰＳＶＩＸＣＶＡＴ−八８３に対 比して、ウィルスの反復領域を含有するプラスミドの増強倍率を測定した。

実　施　例　４ 組換え　イルスゲツムの構造 （ａ）図１は組換えプラスミド中にあるウィルスの配列を示す。

（ｂ）実線は各組換えゲノムに存在する５Ｌ３−３１ＴＲの領域を示す。

Ｓｌ、３−３　ＬＴＲに対応する領域を黒と斜線で各々示す。組換えゲノムＰＲ −８，ＲＥＣＡＳ　１１５の構築に用いた方法は既述されている［レンツ（Ｌｅ ｎｚ）、（１９８２）、上記］　。ＲＥＣＡＳ　１１５は＾ｋｖウィルスのコー ディング配列と５Ｌ３−３ウイルスの非翻訳リーダー配列の７５ヌクレオヂド及 びＬＴＲを含有ｊノでいる。組換えゲノム５Ｆ２４と＾「２２６はＦｒ−ＨｕＬ Ｖ　０３領域とＲの一部と各々５Ｌ３−３とへｋｖウィルスのコーディング配列 を含有している。Ｕ３領域とＲの一部とを囲む約４ｓｏｂＤ　（７）Ｐｓｔｌ− にｐｎｌフラグメントは八ｋｖ（ＬＴＲ八４へ及び５Ｌ３ＬＴＲ（ＬＴＲ３３） サブクローンから除去した。ｒｒ−ＨｕＬＶ５７の対応領域を包囲づる同様なＰ ｓｔｉ−Ｋｐｎｌフラグメントはプロウィルス性クローン［Ａリフ（Ｏｌｉｌ’ ｆ）ら、上記］から単離し、ｐＬＴＲ−３３及びｐＬＴＲＡ４Ｉナブクローンに 連結した。得られた１ナブクローンをＰＶＩＩＩ４ｃｏＲＩで開裂し、ＬＴＲ配 列のないＡｋｖ及びＳｌ３ゲノムの制限フラクションに連結した。各ＬＴＲに独 特な制限酵素で演化づることにより組換えゲノムの構造を確認した。１つのＬＴ Ｒを含有する組換えゲノムをそのＰｓｔ１部位で直線化し、２つのＬ　Ｔ　Ｒを 含有するコンカテマーを形成するために連結した。感染性ウィルスを得るための 旧１１３Ｔ３細胞中への組換えプロウィルスＤＮＡのトランスフェクションは前 述されている［レンツ（ＬｅｎＺ）ら、（１９８３１上記：及びレンツ（１，ｃ ｎｚｌら、（１９８２）、上記］。

実　施　例　５ 図１０は、Ａｋｖ　［パン　ベベレン（Ｖａｎ　Ｂｅｖｃｒｅｎ）ら、上記］、 ５Ｌ３−３　［レンツ（ＬｃｎｚＪら、［９８３）、上記］及びＦｒ−ＨｕＬＶ ５７　［］ッホ（にｏｃｈ）、（１９８３）、上記］のＬＴＲのタンデム反復領 域内の配列Ｍ４造を比較して示している。頂部にＡｋｖの単一９９ｂ１１反復ニ レメン１−の配列を示す。下の実線は各々５Ｌ３−３及びＦｒ−Ｈｕｌ、ＶＳ２ の７２ｂｐ反復及び６６ｂｐ反復配列中に存在する同じ配列を表わす。

カッコした領域の後の数字は何回その配列が繰り返されるかを示す。星印の部分 内の実際の配列を（ｂ）に示す。これらの配列はＡｋｖの反復領域中には存在し ない。

できる。例えば、１つの実ｍ態様では、二遺転子とＩ−Ｔ　Ｒとの間の本発明の ゲノムの３“領域内に、組織特異性エンハンサ−含有感染性ウィルスベクターを 挿入する。次に、特定組織を標的とするに適するこの修飾Ｌ　Ｔ　Ｒベクターを 含有するウィルスに動物を感染さぜうる。これらの条件下で１感染させると、エ ンハン］ノーを選択Ｊることにより決められる特異的な組織にかなりなレベルで 選択的な感染を起す。例えば、５１−３又はフレンドウィルスを各々用いて成熟 胸腺細胞又は赤芽細胞に遺伝子を選択的に向けることができる。このよ°うにこ の考えは、（１）　ＣＡＴアッセイを用いて他の組織特異性エンハンザ−を決定 すること、及び■適当な組織特異性ＬＴＲベクターを作るために使用することが できる。

本発明のＬＴＲベクターのもう　１つの用途は癌の治療である。

各癌細胞又は癌の各一般型はいろいろなエンハンサ−エレメントが認識しうる様 々な転写特性を有しているー。水引１１１１書中に概説した一般的方法を用いて 、癌細胞の特定の型（ＣＡＴアッセイを用いて決定する）用のエンハンサ−配列 を作成することができる。一度適当なエンハンサ−が同定されると、２つの方法 が使用できる。第一は、工学処理されたエンハンサ−を右するＬＴＲを遺伝子含 有ウィルス上に、又は非複製感染源ウィルス上に作る感染ルートである。どちら の場合でも、特定の癌にかかっている患者に感染させるためにウィルスを使用で き、組織特異性エンハンサ−により、ウィルスは腫瘍細胞に選択的に感染するで あろう。又、癌性細胞を思考の例えば骨髄から取り出し、その侵にウィルスで感 染させ、患者に戻すことができる。ＬＴＲベクター中の遺伝子の性質により、破 壊的産物が発現されえて、それが腫瘍細胞を殺すか、又は、蛋白質が発現されえ て、細胞表面を覆う際にモノクローナル又はポリクローナル抗体の認識部位を提 供しえる。例えば、複製又は非複製細胞のどららの中で、ヘマグルテンｆｌｕ又 はリシンＡ鎖遺伝子を本発明ベクター内に挿入することができる。

本発明の組織特異性ＬＴＲ又はその部分（特に組織特異性決定基）の有用性のも う　１つの表現はこれらの種の最初の製剤学的使用を表わづ。例えば、ウィルス ＬＴＲは哺乳類に対して組織特異性の実体を与えるための適当な製剤担体と組み 合せうる。

さらに、組織特異性ベクターは、フィジシャンズ　デスク　リファレンス（Ｐｈ 　５ｉｃｉａｎ’ｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）　、３８版、メディカル 　エＩＩノミックス社（Ｍｅｄｉｃａｌ　［ｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｃｏ、）　、オ ラデル（Ｏｒａｄｃｌｌ）、Ｎ、Ｊ（１９８／ｌ）に記載されてイルような抗癌 剤又は同様の薬剤を分配するためにも使用できる。上記文献の開示は引用により 本明細書に含まれる。

実験が確立したように、本発明の組ｎ特異性の有効性を得るためには用いるベク ターが何らかのウィルス蛋白質をコードする必要はない。又、組織特異性エンハ ンサ−を用いて所望の蛋白質を発現するために感染組織を利用することは必要で もなく、有利でもない。異種エンハンサ−は、非感染咄乳類組織で組織特異的産 生を提供するために非ウィルスプロモーターと共に有利に使用しうる。

組織特異性ウィルスエンハンサ−が提供され、それらが特異的である組織は、テ ストすべきエンハンサ−配列を有するウィルスを提供し、好ましくは検出できる マーカーを持つウィルスゲノムも提供し、このようなウィルスで吐乳類を感染さ せ、ウィルス及びマーカー産物の存在について種々の哺乳類組織を分析すること により同定しつる。

前述の開示を利用ずれば白菜省が本発明の概念から離れることなく本明細書に記 載された特定の実施＠様の多くの他の使用及び改修、及び新展開をな１−ことが できることは明白である。

結局、本発明は本明細書に記載の生成物及び手法に存在するかまたはそれらが有 する特徴の各々及びあらゆる新しい組み合せを包含すると考えられ、別記請求の 範囲の及ぶ範囲と思想とによってのみ限定される。

を 浄書（内容に変更なし） 浄Ｗ＜内容に変更ない ネヌ゛二４■ｄ身１ｍ　１１’１ ネス電Ｆｌ　矩吃 、筆書（内τ’ｊｌ、：’１．．史７エ１−＞呆ス゛三　Ｈ＃７怠−ニヶ匂ＩＩ 乞 ＮＦＳ／Ｎ 呼関ＣＩＩｆ２ ・ｒｉ書（内ｔｇＩ；変更なし）。

手続ネ甫正書Ｃ方式２ ％式％ 、発明の名称　ＬＴＲベクター、製法及び用途、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ディナーファーバー・キャンサー・、代　理　人　東京都新宿区新宿１ 丁目１番１４号　山田ビル、補正命令の日付　昭和６１年７月３日、補正により 増加する発明の数 、補正の対象　図面の翻訳文 、補正の内容 １）ＦｉａｌＡ、ＩＢ、２Δ、２Ｂ、２Ｇ、２Ｄ及び３Ｂに関する適正な図面の 翻訳文を別紙の通り補充する。

国際調査報告 Ｋ１８１ＡＩ＋ｌ°°°“°“°°“°８°　ＰＣＴ／ＵＳ８５１００９８６

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．組織特異性決定基と、プロモーターと、選択組織内での選択産物の発現をコ ードする異種ＤＮＡフラグメントとからなり、組織特異性決定基が選択組織に特 異的である組織特異性ベクター。
2. ２．ベクターが少なくとも１つのウィルス性エンハンサーを含有し、組織特異性 決定基がウィルス性エンハンサーの１部である請求の範囲１の粗織特異性ベクタ ー。
3. ３．組織特異性決定基がプロモーターに対して異種である請求の範囲１の組織特 異性ベクター。
4. ４．組織特異性決定基がＡｋｖ、ＳＬ３−３又はフレンドウィルス由来のもので ある請求の範囲１の組織特異性ベクター。
5. ５．標準発現条件下でベクターを用いて選択組織中で産生される産物と他の組織 中で産生される産物との比が少なくとも１．５対１である請求の範囲１の組織特 異性ベクター。
6. ６．比が少なくとも５対１である請求の範囲５の組織特異性ベクター。
7. ７．比が少なくとも１０対１である請求の範囲６の組織特異性ベクター。
8. ８．発現ベクターを選択組織に対して特異的にするＤＮＡ配列からなる組織特異 性決定基。
9. ９．産物の発現をコードするＤＮＡ配列を組織特異性決定基含有発現ベクターと 合せ、ベクターを選択組織中にトランスフェクトし、産物を発現させることから なる選択組織中で産物を発現する方法。
10. １０．インディケーター物質の発現をコードするＤＮＡ配列を含有するベクター 内にテストエンハンサーを連結し、選択組織中でベクターを発明させ、選択組織 中でインディケーター物質を発現させるベクターをスクリーニングすることから なる、選択組織に対して特異的な組織特異性エンハンサーを得る方法。
11. １１．インディケーター物質がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー ゼである請求の範囲１０の方法。
12. １２．組織特異性決定基と製薬上許容しうる担体とからなる医薬組成物。