JPH09143095A - ウイルス複製抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 肝臓又はその周辺組織の特定の酵素活性を増
強させることによって、ウイルスの複製を抑制する薬剤
を提供する。 【解決手段】 Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ
ェラーゼIII （以下、ＧｎＴ−III と略記する）、又は
その遺伝子を有効成分とするウイルス複製抑制剤。遺伝
子の例には配列表の配列番号１（配列の長さ１６０
８）、又は配列番号２（配列の長さ１５９３）で表され
る配列を含むもの、あるいはこれらにハイブリダイズ
し、ＧｎＴ−III 活性又はその機能的に同等の活性を有
するポリペプチドをコードするもの、更にそれらがベク
ターに組込まれているものがある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する分野】本発明は、肝臓又はその周辺組織
の特定の酵素活性を増強させることによって、ウイルス
の複製を抑制する薬剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルスはウイルス膜に糖タンパク質や
糖脂質を持っている。糖脂質は宿主細胞の細胞膜由来で
あるが、糖タンパク質のタンパク質部分はウイルス特異
的な遺伝子産物である。糖鎖は宿主細胞のゴルジ装置内
でタンパク質部分に付加されるが、この過程で用いられ
る酵素系はウイルスのものではなく、宿主細胞の持つ酵
素系が用いられる。例えば後天性免疫不全症候群、いわ
ゆるエイズはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれ
る一種のレトロウイルスがＣＤ４分子を発現している細
胞に主に感染し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を激減させる疾患で
あるが、ＨＩＶの感染においてはウイルスエンベロープ
糖タンパク質であるｇｐ１２０分子が重要な役割を果た
している。このｇｐ１２０分子は重量にしてその約半分
が糖鎖によって占められており、これらの糖鎖のＨＩＶ
感染過程における重要性について様々な報告がされてい
る。例えば糖鎖を欠いたｇｐ１２０分子はＣＤ４との結
合能を失うことが示されている。またＨＩＶ感染細胞は
未感染細胞と共に培養すると合胞体が形成されるが、ｇ
ｐ１２０分子の添加はこの合胞体形成を阻害するのに対
し、糖鎖を欠いたｇｐ１２０分子を添加しても阻害は起
こらないことも示されている。ヒトＣ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）のエンベロープを構成していると考えられて
いるＥ１及びＥ２は共に糖タンパク質であり、共にその
糖鎖の末端にシアル酸残基を持たず、末端にＮ−アセチ
ルグルコサミン残基を持つものが少数あることからＨＣ
Ｖが肝実質細胞上のアシアロ糖タンパク質リセプター、
あるいは肝内皮細胞やマクロファージに見出されるマン
ノース結合タンパク質を介して肝臓に感染する可能性が
示されている。更に、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
はその粒子表面にＨＢｓ抗原と呼ばれる糖タンパク質を
有しており、これらのタンパクは２本のアスパラギン結
合型糖鎖を持っている。これらの糖鎖はウイルスの複
製、輸送、分泌の各過程において、重要な役割を果たし
ていることが示されている。現在までに、このようなウ
イルス糖タンパク質の糖鎖に着目した抗ウイルス剤の可
能性が幾つか示されている。例えばツニカマイシン等の
Ｎ−グリコシド型糖鎖プロセッシング酵素の阻害剤の存
在下で培養されたＨＩＶ感染細胞には合胞体形成能やウ
イルス感染能がなくなることが示されている。例えばイ
ミノ糖であるＮ−ブチルデオキシノジリマイシンによっ
てヒトＢ型肝炎ウイルスの分泌を抑制した例が報告され
ている〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ
（Proceedings of the National Academy of Sciences
of the USA）、第９１巻、第２２３５〜２２３９頁（１
９９４）〕。しかしながら、このような糖鎖プロセッシ
ング阻害剤による処理は宿主細胞の糖鎖合成をかく乱さ
せるため、当然宿主細胞の糖タンパク質の糖鎖構造も多
大な影響を受けることになり、安全性の点で決して満足
できるものではない。ところで、本発明者らは細胞表層
糖鎖の構造変化に関する研究過程でこれまでにラット及
びヒトのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラー
ゼIII （以下、ＧｎＴ−III と略す）遺伝子を獲得する
ことに成功している（特開平６−３８７６７号、同６−
６２８６５号各公報）。この酵素はアスパラギン結合型
糖鎖のGlcNAcβ1-4Manβ1 構造、いわゆるバイセクティ
ングGlcNAcを生成する。既に本発明者らは、肝炎及び肝
癌を自然発症するＬＥＣラットを用いた実験系におい
て、肝炎発症時期である第３ステージでＮ−アセチルグ
ルコサミニルトランスフェラーゼＶ（以下、ＧｎＴ−Ｖ
と略す）の活性が、また肝臓に癌組織がマクロ的に観察
される第４ステージでＧｎＴ−III 活性が、コントロー
ルラットであるＬＦＡに比べて著しく上昇することを見
出している。また、このＧｎＴ−III は正常な肝臓には
ほとんど発現していないが、ラット化学発癌過程の癌部
位や前癌病変部位、腹水肝癌由来細胞、胎児肝、再生肝
等において活性が上昇することを見出している。また、
ヒトの肝炎、肝硬変、肝癌組織、あるいはこれら肝疾患
患者の血清中の酵素発現量が上昇することが本発明者ら
によって報告されている〔バイオケミカル アンド バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケイションズ（Bi
ochemical Biophysical Reseach Communications）、第
１５２巻、第１０７〜１１２頁（１９８８）；クリニカ
キミカ アクタ（Clinica Chimica Acta）、第１８５
巻、第３２５〜３３２頁（１９８９）〕。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】既に述べたように、ウ
イルス感染細胞において糖転移酵素の活性が変化するこ
とは知られているが、これらの現象を作用点としてウイ
ルスの複製を抑制し、ウイルス性疾患を治療する方法は
開発されていない。したがって、本発明の目的は、肝臓
又はその周辺組織の特定の酵素活性を増強させることに
よって、ウイルスの複製を抑制する薬剤を提供すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明はウイルス複製抑制剤に関する発明であって、Ｇｎ
Ｔ−III 又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴と
する。

【０００５】本発明者らはウイルスの感染と糖転移酵素
活性との関係について鋭意研究を重ねた結果、従来、肝
疾患のステージの進行度と酵素活性が正の相関を持つと
報告されていたＧｎＴ−III をＢ型肝炎ウイルス感染細
胞に導入すると、意外なことにその細胞におけるＢ型肝
炎ウイルス遺伝子の発現を抑制することができるという
驚くべき事実を発見し、本発明を完成するに至ったもの
である。

【０００６】

【発明の実施の形態】本明細書において、ＧｎＴ−III
活性を有するポリペプチドとは、天然型のＧｎＴ−III
のみならず、ＧｎＴ−III 活性を有する限り天然型のア
ミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、付加、挿
入、置換等によりアミノ酸配列が改変されたポリペプチ
ドをも本発明に含む意味である。また、ここで言う天然
型ＧｎＴ−III としては、例えばヒト又はラット由来の
ものが挙げられるが、本発明においてはこれに限定され
るものではなく、他の動物、植物等の生物体由来のも
の、あるいは細菌類、酵母類、放線菌類、糸状菌類、子
嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のものも含まれる。

【０００７】また、本明細書において、機能的に同等の
活性を有するポリペプチドとは、以下のようなものをい
う。天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺
伝子の多形や変異のほかに、生成後のタンパク質の生体
内及び精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配
列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起
こりうるが、それにも関わらず変異を有しないタンパク
質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあ
ることが知られている。このように構造的に差異があっ
ても、その機能については大きな違いが認められないも
のを機能的に同等の活性を有するポリペプチドと呼ぶ。
人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異
を導入した場合でも同様であり、この場合は更に多種多
様の変異体を作製することが可能であるが、変異を有し
ないものと実質的に同等の生理活性を示す限り、これら
の変異体は機能的に同等の活性を有するポリペプチドと
解釈される。例えば、大腸菌で発現されたタンパク質の
Ｎ末端に存在するメチオニン残基は、多くの場合、メチ
オニンアミノペプチダーゼの作用により除去されるとさ
れているが、タンパク質の種類によってはメチオニン残
基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しか
しながら、このメチオニン残基の有無はタンパク質の活
性に影響を与えない場合が多い。また、ヒトインターロ
イキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステ
イン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロ
イキン２活性を保持することが知られている〔サイエン
ス（Science)、第２２４巻、第１４３１頁（１９８
４）〕。更に、遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う
際には、融合タンパク質として発現させることがしばし
ば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量を増加
させるために、目的のタンパク質のＮ末端に他のタンパ
ク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的のタン
パク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を
付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和性を
持つ担体を使用することにより、目的のタンパク質の精
製を容易にすることなどが行われている。また、遺伝子
上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組合せ）
は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在するこ
とが知られている。したがって、アミノ酸配列をコード
する遺伝子はそのアミノ酸配列にもよるが、多数存在す
ることができる。遺伝子は自然界において決して安定に
存在しているものではなく、その核酸に変異が起こるこ
とはまれではない。遺伝子上に起こった変異がコードさ
れるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント
変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配
列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したが
って、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単
離されても、それを含有する生物が継代されていくうち
に同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができ
ていく可能性は否定できない。

【０００８】更に、同じアミノ酸配列をコードする多種
類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工
学的手法を用いれば困難なことではない。例えば、遺伝
子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク質
をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドン
が、使用している宿主中では使用頻度の低いものであっ
た場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このよ
うな場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を
与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに
人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発
現を図ることが行われている。このように特定のアミノ
酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作製する
ことが可能なことは言うまでもない。したがって、これ
らの人為的に作製された異なるポリペプチドであって
も、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードされてい
る限り、本発明に包含されるものである。更に、目的の
タンパク質のアミノ酸配列に１個若しくは複数個のアミ
ノ酸残基を欠失、付加、挿入、若しくは置換の少なくと
も１つを行ったポリペプチドも目的のタンパク質と機能
的に同等の活性を有する場合が少なくないが、このよう
なポリペプチドをコードする遺伝子も、天然のものであ
れ人為的に作製されたものであれ、本発明に包含され
る。一般に、機能的に同等の活性を有するポリペプチド
は、それをコードする遺伝子が相同性を有することが多
い。したがって、本発明に用いる遺伝子とハイブリダイ
ズすることができ、ＧｎＴ−III 活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子も本発明に含まれる。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいては、Ｂ型肝炎ウイルス感染細胞にＧｎＴ−III を
導入することによってその目的を達成することができ
る。ＧｎＴ−III を導入するには、例えばマイクロイン
ジェクション法などによってＧｎＴ−III を活性を保持
したままでＢ型肝炎ウイルス感染細胞に直接導入しても
よいし、また例えばウイルス等を使ってＧｎＴ−III 遺
伝子をＢ型肝炎ウイルス感染細胞へ導入し、ＧｎＴ−II
Iを発現させることによって本発明の目的を達成するこ
とができる。すなわち、本発明の薬剤を用いればＧｎＴ
−III 又はＧｎＴ−III をコードする遺伝子をウイルス
感染細胞又はその周辺組織に導入することができ、ウイ
ルスの複製を抑制することができる。ＧｎＴ−III 又は
ＧｎＴ−III をコードする遺伝子は組織表面の患部には
直接注入すればよい。また組織内部の患部にも直接注入
することもできるがドラッグデリバリーシステムを応用
してもよい。ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と
しては、ウイルス感染細胞に特異的なシステムであれば
良い。

【００１０】本発明のＧｎＴ−III 又はその遺伝子を有
効成分とする薬剤をウイルス感染細胞又はその周辺組織
に使用する場合、上記薬剤が最も効率よく効果を発揮す
るようにするのは当然のことである。本発明のウイルス
複製抑制剤はＧｎＴ−III 、又はその遺伝子を医薬とし
て許容される範囲で含有していれば良く、通常の遺伝子
治療剤、タンパク質含有剤と同様に製剤化することがで
き、製剤中には担体、賦形剤、安定化剤等が含まれてい
ても良い。本発明のウイルス複製抑制剤として用いられ
るＧｎＴ−III 、又はその遺伝子の用量は年齢、体重等
の患者の状態、患部の程度などを考慮した上で調整すれ
ば良い。本発明のウイルス複製抑制剤に含有されるＧｎ
Ｔ−III 、又はその遺伝子は生体内物質であり、毒性は
ない。

【００１１】本発明で用いられるＧｎＴ−III について
は、既にその詳細な酵素化学的性質が明らかにされてお
り、例えばラット腎臓から表１に示す工程により調製す
ることができる。

【００１２】

【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── 工 程 比活性 n mol ／mg／h ─────────────────────────────────── １．ホモジネート ２．１６ ２．トリトン抽出 ８．９４ ３．ＱＡＥ−セファロース ４２．１ ４．ヒドロキシアパタイト ７４．６ ５．Ｃｕ²⁺−キレーティングセファロース ２４８ ６．ＣｏｎＡセファロース ５７８ ７．Ｃｕ²⁺−キレーティングセファロース ８２０ ８．ＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロース ７，２３０ ９．Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−Ａｓｎセファロース ３３１，０００ ───────────────────────────────────

【００１３】〔表中Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−ＡｓｎはＧｌｃ
ＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２
Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４
ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎの略である。ＧｎＴ−III 活性は
バイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ（Biochimi
ca et Biophysica Acta ）、第１０３５巻、第３号、第
３１３〜３１８頁（１９９０）に記載の方法に準じ、８
０μＭの蛍光基質を用いて測定し、酵素の比活性は、転
移されたＧｌｃＮＡｃ（ｍｏｌ）／タンパク質（ｍｇ）
／時間（ｈ）で表し、ピリジル（−２−）アミノ化Ｇｌ
ｃＮＡｃを標準物質として使用した。タンパク質は血清
アルブミンを標準物質として、ＢＣＡキット（ピアス社
製）を用いて測定した〕

【００１４】また、その遺伝子は、例えばヒト胎児肝ｃ
ＤＮＡライブラリーから井原らの方法〔ジャーナル オ
ブ バイオケミストリー（Journal of Biochemistry
）、第１１３巻、第６９２〜６９８頁（１９９３）〕
によって得ることができる。また、例えばラット腎臓の
ｃＤＮＡライブラリーから西河らの方法〔ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Bio
logical Chemistry ）、第２６７巻、第１８１９９〜１
８２０４頁（１９９２）〕によって得られる遺伝子は、
Ｂ型肝炎ウイルス複製抑制の研究における適切な実験材
料となりうる。また、例えば、ラットＧｎＴ−III につ
いては、特開平６−３８７６７号公報に記載の方法で通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
ているＦＥＲＭ ＢＰ−４３５２を用いて調製すること
ができる。また、例えばヒトＧｎＴ−III については、
特開平６−６２８６５号公報に記載の方法によって調製
することができる。

【００１５】配列表の配列番号１にラットＧｎＴ−III
をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、及びそのアミノ酸配
列を示す。また配列表の配列番号２にヒトＧｎＴ−III
をコードする遺伝子のＤＮＡ配列及びそのアミノ酸配列
を示す。これらの遺伝子をプローブとして用いることに
より、該遺伝子にハイブリダイズし、ＧｎＴ−III 活性
を示すタンパク質をコードする遺伝子を調製することが
できる。また配列表の配列番号１又は２で表される遺伝
子を遺伝子工学的な置換、変異、切断処理等を行うこと
によっても、更には配列表の配列番号１又は２で表され
る遺伝子にハイブリダイズし、かつ、ＧｎＴ−III 活性
を示すタンパク質をコードする遺伝子を調製することが
できる。これらの遺伝子、及び該遺伝子の発現タンパク
質も本発明の薬剤として使用することができる。

【００１６】遺伝子そのものを用いて本発明の薬剤のＧ
ｎＴ−III を細胞に導入する場合、例えばＧｎＴ−III
遺伝子とこれに関係する調節遺伝子を持つ組換えベクタ
ーを使用することで簡単にＧｎＴ−III 遺伝子を導入す
ることができる。このようにＧｎＴ−III そのもののプ
ロモーター以外にも、もちろん他の有効なプロモータ
ー、例えばＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来
ＬＴＲプロモーター、ヒートショックプロモーター、メ
タロチオネインプロモーター、アクチンプロモーター等
を使用することができる。ＧｎＴ−III 遺伝子の導入に
際しては、ウイルスベクターを使って当該遺伝子を含む
ベクターを効率よくＢ型肝炎ウイルス未感染細胞あるい
は感染細胞に導入させることによって本発明の目的を達
成することができる。これらのベクターとしては、従来
から目的のＤＮＡを細胞に輸送することが知られており
かつ感染効率の高いレトロウイルスやワクシニアウイル
ス、更には非増殖性組換えウイルス等を用いることがで
きる。特に、非増殖性組換えウイルスは、目的の細胞等
に導入後、この組換えウイルスは増殖しないため２週間
から２カ月ごとに毎回用いる必要はあるが、その際に量
の調節を行えるという利点もある。また、人工の脂質カ
プセルであるリポソームを用いることができる。

【００１７】本発明の薬剤として望ましいベクターの構
築方法としては次に示すような方法が挙げられる。ヒト
ＧｎＴ−III のｃＤＮＡを熊本大学の山村研一博士から
供与されたｐＣＡＧＧＳベクターのＥｃｏＲＩサイトに
導入し、アクチンプロモーターで制御されるＧｎＴ−II
I の発現ベクターを作製することができる。図１にｐＣ
ＡＧＧＳベクターの制限酵素地図を示す。

【００１８】ウイルスの複製に関しては、例えば処理さ
れた細胞が培地中に産生するウイルス関連抗原であるＨ
Ｂｓ抗原、あるいはＨＢｅ抗原の量を測定することによ
って、その複製の程度を知ることができる。すなわ
ち、、先に述べたＧｎＴ−III の発現ベクターをＳａｌ
Ｉで直線化したＤＮＡとｐＭＥＰ〔インビトロジェン
（Invitrogen）社製、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持
つベクター〕をＢａｍＨＩで直線化したＤＮＡを混合
し、前述のＨｕｈ−６細胞にＨＢＶゲノム遺伝子をタン
デムに組込んだ細胞であるＨＢ６１１細胞〔プロシーデ
ィングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８４巻、第４４
４〜４４８頁（１９８７）〕にエレクトロポレーション
法にて導入する。その後、ハイグロマイシンを含む培地
で培養し耐性細胞株をスクリーニングする。こうして得
られるＧｎＴ−III 活性を発現している細胞株数株を選
び、ＨＢｓ抗原あるいはＨＢｅ抗原の量を測定する。Ｈ
Ｂｓ抗原、ＨＢｅ抗原の量の測定は、例えばラジオイム
ノアッセイ法で本発明者らが報告している方法〔インタ
ーナショナル ジャーナル オブ キャンサー（Intern
ational Journal of Cancer ）、第５２巻、第１３７〜
１４０頁（１９９２）〕に従って測定することができ
る。

【００１９】また、ウイルス関連のメッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）の量を測定することによってもウイルス
の複製に関する情報を得ることができる。すなわち、³²
ＰでラベルしたウイルスｃＤＮＡをプローブとしてノー
ザンブロットハイブリダイゼーション法によりウイルス
関連のメッセンジャーＲＮＡの量を評価することができ
る。

【００２０】以上、本発明者らはＧｎＴ−III 遺伝子を
導入した細胞でのウイルスタンパク質の発現をＧｎＴ−
III 遺伝子を導入していない細胞と比較したところ、Ｈ
ＢＶを組込んだＨＢ６１１細胞にＧｎＴ−III 遺伝子を
導入した細胞では明らかにそのウイルス関連タンパク質
の発現が低下していることを見出し、本発明を完成し
た。本発明の薬剤は、ウイルス性疾患を治療する分野に
おいて有用である。

【００２１】

【実施例】以下に実施例を示して本発明を説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【００２２】実施例１ 〔発現ベクターの構築及び細胞への導入〕ラットＧｎＴ
−III のコーディング領域全長を含むｃＤＮＡクローン
Ｃ４〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー、第２６７巻、第１８１９９〜１８２０４頁（１９９
２）〕をＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化後、ｐＣＡＧ
ＧＳベクター（熊本大学の山村研一博士から供与され
た）のＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。図１にｐ
ＣＡＧＧＳベクターの制限酵素地図を示す。このように
して構築した発現プラスミドをＧｎＴ−III 発現プラス
ミドＡｃｔ−５と命名した。このＧｎＴ−III 発現プラ
スミドＡｃｔ−５において、ＧｎＴ−III の発現はアク
チンプロモーターによる制御を受けることになる。図２
にＧｎＴ−III 発現プラスミドＡｃｔ−５の模式図を示
す。図中、上段の太実線（黒）はラットＧｎＴ−III の
ｃＤＮＡを示し、下段はｐＣＡＧＧＳベクター（図１）
を示す。また、下段の縦縞の入っている箇所はアクチン
プロモーターを、斜線縞の入っている箇所はＳＶ４０ｏ
ｒｉを示す。このＧｎＴ−III 発現プラスミドＡｃｔ−
５とｐＭＥＰベクター（インヴィトロジェン社製、ハイ
グロマイシン耐性遺伝子を持つベクター）をそれぞれＳ
ａｌＩ（宝酒造社製）とＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消
化し直線化した後、ＧｎＴ−III 発現プラスミドＡｃｔ
−５を２０μｇとｐＭＥＰベクター２μｇを混合し、５
×１０⁵ 個のＨＢ６１１細胞にジーンパルサー（バイオ
ラッド社製；電圧、２５０Ｖ／０．４ｃｍ；静電容量、
９６０μＦ）を用いたエレクトロポレーション法によっ
て導入した。なお、ＨＢ６１１細胞はヒト肝芽細胞腫由
来Ｈｕｈ−６細胞にＨＢＶゲノム遺伝子をタンデムに組
込んだ細胞〔プロシーディングズ オブザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳ
Ａ、第８４巻、第４４４〜４４８頁（１９８７）〕であ
り、大阪大学、細胞工学センターの松原謙一博士から供
与された物である。遺伝子導入細胞の選抜はハイグロマ
イシン（５００μｇ／ｍｌ）を含む培地で行い、耐性細
胞株を希釈法によってクローン化した。その結果ＧｎＴ
−III 活性を持つ細胞株を３株、ＧｎＴ−III 活性を持
たない株を３株得た。 ＧｎＴ−III 活性を持つ細胞
（ＧｎＴ−III ポジティブ細胞）株をＨＢ６１１−ＧＮ
Ｔ−III （１）、ＨＢ６１１−ＧＮＴ−III （２）、Ｈ
Ｂ６１１−ＧＮＴ−III （３）と命名し、ＧｎＴ−III
活性を持たない細胞（ＧｎＴ−III ネガティブ細胞）株
をＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ（１）、ＨＢ６１１−ｈｙｇ
ｒｏ（２）、ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ（３）と命名し
た。

【００２３】〔細胞のＧｎＴ−III 及びＧｎＴ−Ｖの酵
素活性〕コンフルエント状態にある細胞約５−１０×１
０⁶ 個を集め、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗
浄した後、同溶液０．２ｍｌに懸濁し、超音波処理を行
った。各酵素活性はこの超音波破砕液を酵素液と、２−
アミノピリジンで蛍光標識された糖鎖を基質として〔ア
ナリチカル バイオケミストリー（Analytical Biochem
istry ）、第１７０巻、第３４９〜３５４頁（１９８
８）、メソッズ イン エンザイモロジー（Methods in
Enzymology ）、第１７９巻、第３９７〜４０８頁（１
９８５）、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミス
トリー、第２６５巻、第６００９〜６０１８頁（１９９
０）〕に記載の方法に従って細胞中のＧｎＴ−III 、Ｇ
ｎＴ−ＩＶ、ＧｎＴ−Ｖの活性を各細胞につき、３回ず
つ測定した。その結果を表２に示す。

【００２４】

【表２】 表 ２ ─────────────────────────────────── 細 胞 ＧｎＴ−III ＧｎＴ−ＩＶ ＧｎＴ−Ｖ ─────────────────────────────────── HB611 9.9 ±3.4 143±30 163±23 HG611-hygro(1) 8.2 ±1.7 138±27 181±30 HG611-hygro(2) 17.0 ±5.1 237±32 209±22 HG611-hygro(3) 13.0 ±2.7 117±4.7 182±11 HG611-GNT-III(1) 98.0 ±17^* 145±40 225±18 HG611-GNT-III(2) 103.0 ±9.2 ^* 146±28 179±18 HG611-GNT-III(3) 81.0 ±9.8 ^* 122±11 200±19 ───────────────────────────────────

【００２５】表中、＊は統計学的処理をステューデンツ
ｔ検定（Student's t test）で行った結果を示してお
り、ＨＢ６１１細胞に対してｐ＜０．０１である。ｐ＜
０．０１とは、ＨＢ６１１に対して同じである可能性が
０．０１以下であることを示している。表２に示すよう
にＧｎＴ−III 活性はＧｎＴ−III ポジティブ細胞で親
株の約８〜１０倍に迄上昇している。ＧｎＴ−ＩＶ及び
ＧｎＴ−Ｖの活性は親株及び形質転換株の間でほとんど
変わらなかった。

【００２６】次に、ＧｎＴ−III のメッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）の量をモレキュラークローニング、ア
ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual）、第２版、Ｔ．マニアティス（T. Man
iatis ）ほか著、第７章、第３９〜５２頁、コールド
スプリングハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行
に記載の方法を用いて、ノーザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行った。その結果を図３に示す。すなわ
ち、図３はＨＢ６１１細胞及び上記で得た細胞における
ＧｎＴ−III のｍＲＮＡの量を示す図である。図３に示
すように、ＧｎＴ−III ポジティブ細胞ではＧｎＴ−II
I は高発現であった。

【００２７】〔ＨＢＶ複製の評価〕ＨＢ６１１細胞にお
けるＨＢＶ関連タンパク質発現量の評価を行うため、培
地中のＨＢｓ抗原量及びＨＢｅ抗原量をラジオイムノア
ッセイキット（大塚アッセイ研究所製）を用いて本発明
者らが既に報告している方法〔インターナショナルジャ
ーナル オブ キャンサー、第５２巻、第１３７〜１４
０頁（１９９２）〕に従って測定した。ＨＢ６１１細胞
及び形質転換細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ
でプレートからはがし、細胞数を計測した。ＨＢｓ抗原
量及びＨＢｅ抗原量は細胞１個当りの相対単位で表し
た。なお、形質転換細胞は、ＧｎＴ−III ポジティブ細
胞（ＨＢ６１１−ＧｎＴ−III ）及びＧｎＴ−III ネガ
ティブ細胞（ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ）で行った。その
結果を表３に示す。

【００２８】

【表３】 表 ３ ─────────────────────────────────── 細 胞 ＨＢｓ抗原量 ＨＢｅ抗原量 ─────────────────────────────────── ＨＢ６１１ ３０．２ １０８．０ ＨＢ６１１−ｈｙｇｒｏ ２４．０±１４．７ ９５．０±１２．９ ＨＢ６１１−ＧＮＴ−III ４．５±３．３^* ２４．４±８．１^* ───────────────────────────────────

【００２９】表中、＊は統計学的処理をステューデンツ
ｔ検定で行った結果を示しており、ＨＢ６１１−ｈｙｇ
ｒｏ細胞に対してｐ＜０．０２である。表３に示すよう
に、ＧｎＴ−III ポジティブ細胞の培地中のＨＢｓ抗原
量及びＨＢｅ抗原量はＧｎＴ−III ネガティブ細胞や親
株に比べて明らかに減少していた。

【００３０】次に、ＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量を³²Ｐ
でラベルしたＨＢＶ全ｃＤＮＡをプローブとして、モレ
キュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュア
ル、第２版、Ｔ．マニアティスほか著、第７章、第３９
〜５２頁、コールド スプリングハーバー ラボラトリ
ー社、１９８９年発行に記載の方法を用いて、ノーザン
ブロットハイブリダイゼーションによって評価した。そ
の結果を図４に示す。すなわち、図４はＨＢＶ関連ｍＲ
ＮＡの発現量を示す図であり、上段にＨＢＶ、中段にβ
−アクチン、下段にリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の量
を示す。図４に示すように、ＧｎＴ−III ポジティブ細
胞はＧｎＴ−III ネガティブ細胞や親株に比べて明らか
にＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量も抑制されていることが
わかった。

【００３１】一方、同様にして、アルファフェトプロテ
イン（ＡＦＰ）、アルブミン、プレアルブミンタンパク
質のｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果を図５に示
す。すなわち、図５はＡＦＰ、アルブミン、プレアルブ
ミンタンパク質のｍＲＮＡの発現量を示す図であり、上
段にＡＦＰ、中段にアルブミン、下段にプレアルブミン
を示す。図５に示すように、どの細胞においてもＡＦ
Ｐ、アルブミン、プレアルブミンタンパク質のｍＲＮＡ
の発現量はＧｎＴ−III 活性のレベルとは相関がなかっ
た。

【００３２】

【発明の効果】本発明によって、ウイルス感染細胞又は
その周囲組織のＧｎＴ−III 活性を増強させる、ＧｎＴ
−III 又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とす
るウイルス複製抑制剤が提供された。該ウイルス複製抑
制剤はウイルス性疾患の治療の分野で有用である。

【００３３】

【配列表】

【００３４】配列番号：1 配列の長さ：1608 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： ATG AGA CGC TAC AAG CTT TTT CTC ATG TTC TGT ATG GCC GGC CTG 45 Met Arg Arg Tyr Lys Leu Phe Leu Met Phe Cys Met Ala Gly Leu 1 5 10 15 TGC CTC ATC TCC TTC CTG CAC TTC TTT AAG ACG TTA TCC TAT GTC 90 Cys Leu Ile Ser Phe Leu His Phe Phe Lys Thr Leu Ser Tyr Val 20 25 30 ACC TTC CCG AGA GAA CTG GCC TCC CTC AGC CCT AAC CTC ATA TCC 135 Thr Phe Pro Arg Glu Leu Ala Ser Leu Ser Pro Asn Leu Ile Ser 35 40 45 AGC TTC TTC TGG AAC AAT GCC CCT GTC ACT CCC CAG GCC AGT CCG 180 Ser Phe Phe Trp Asn Asn Ala Pro Val Thr Pro Gln Ala Ser Pro 50 55 60 GAG CCC GGT GAC CCC GAC TTG TTA CGG ACT CCA CTC TAC TCC CAC 225 Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Leu Arg Thr Pro Leu Tyr Ser His 65 70 75 TCC CCC CTG CTC CAG CCA CTG TCC CCT AGC AAG GCC ACC GAA GAA 270 Ser Pro Leu Leu Gln Pro Leu Ser Pro Ser Lys Ala Thr Glu Glu 80 85 90 CTG CAC CGG GTG GAC TTC GTG TTG CCG GAG GAC ACC ACA GAG TAT 315 Leu His Arg Val Asp Phe Val Leu Pro Glu Asp Thr Thr Glu Tyr 95 100 105 TTT GTG CGC ACC AAA GCT GGC GGT GTG TGC TTC AAA CCA GGT ACC 360 Phe Val Arg Thr Lys Ala Gly Gly Val Cys Phe Lys Pro Gly Thr 110 115 120 AGG ATG CTG GAG AAA CCT TCT CCA GGG CGG ACA GAG GAG AAG ACC 405 Arg Met Leu Glu Lys Pro Ser Pro Gly Arg Thr Glu Glu Lys Thr 125 130 135 AAG GTG GCT GAG GGG TCC TCG GTC CGG GGT CCT GCT CGG AGG CCT 450 Lys Val Ala Glu Gly Ser Ser Val Arg Gly Pro Ala Arg Arg Pro 140 145 150 ATG CGG CAT GTG TTG AGT GCA CGG GAG CGC CTG GGA GGC CGG GGC 495 Met Arg His Val Leu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Gly Gly Arg Gly 155 160 165 ACT AGG CGC AAG TGG GTT GAG TGT GTG TGC CTG CCA GGC TGG CAC 540 Thr Arg Arg Lys Trp Val Glu Cys Val Cys Leu Pro Gly Trp His 170 175 180 GGG CCC AGC TGC GGG GTG CCC ACT GTG GTC CAG TAT TCC AAC CTG 585 Gly Pro Ser Cys Gly Val Pro Thr Val Val Gln Tyr Ser Asn Leu 185 190 195 CCC ACC AAG GAG CGC CTG GTA CCC AGG GAG GTG CCG AGG CGG GTT 630 Pro Thr Lys Glu Arg Leu Val Pro Arg Glu Val Pro Arg Arg Val 200 205 210 ATC AAC GCC ATC AAC ATC AAC CAT GAG TTC GAC CTG CTG GAT GTG 675 Ile Asn Ala Ile Asn Ile Asn His Glu Phe Asp Leu Leu Asp Val 215 220 225 CGC TTC CAT GAG CTG GGC GAT GTT GTG GAC GCC TTT GTG GTC TGC 720 Arg Phe His Glu Leu Gly Asp Val Val Asp Ala Phe Val Val Cys 230 235 240 GAA TCC AAT TTC ACC GCC TAC GGG GAG CCT CGG CCG CTC AAG TTC 765 Glu Ser Asn Phe Thr Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Pro Leu Lys Phe 245 250 255 CGA GAG ATG CTG ACC AAT GGC ACC TTC GAG TAC ATC CGC CAC AAG 810 Arg Glu Met Leu Thr Asn Gly Thr Phe Glu Tyr Ile Arg His Lys 260 265 270 GTG CTC TAC GTC TTC CTG GAC CAC TTC CCA CCT GGT GGC CGT CAG 855 Val Leu Tyr Val Phe Leu Asp His Phe Pro Pro Gly Gly Arg Gln 275 280 285 GAC GGC TGG ATT GCA GAC GAC TAC CTG CGT ACC TTC CTC ACC CAG 900 Asp Gly Trp Ile Ala Asp Asp Tyr Leu Arg Thr Phe Leu Thr Gln 290 295 300 GAT GGT GTC TCC CGC CTG CGC AAC CTG CGA CCT GAT GAC GTC TTT 945 Asp Gly Val Ser Arg Leu Arg Asn Leu Arg Pro Asp Asp Val Phe 305 310 315 ATC ATC GAC GAC GCG GAC GAG ATC CCT GCG CGT GAT GGT GTG CTG 990 Ile Ile Asp Asp Ala Asp Glu Ile Pro Ala Arg Asp Gly Val Leu 320 325 330 TTC CTC AAG CTC TAC GAT GGC TGG ACA GAG CCC TTC GCC TTC CAT 1035 Phe Leu Lys Leu Tyr Asp Gly Trp Thr Glu Pro Phe Ala Phe His 335 340 345 ATG CGC AAG TCC CTG TAT GGT TTC TTT TGG AAG CAA CCA GGC ACA 1080 Met Arg Lys Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Trp Lys Gln Pro Gly Thr 350 355 360 CTG GAG GTG GTG TCA GGC TGC ACC ATT GAC ATG CTG CAG GCT GTG 1125 Leu Glu Val Val Ser Gly Cys Thr Ile Asp Met Leu Gln Ala Val 365 370 375 TAT GGG CTG GAC GGC ATC CGC CTG CGC CGC CGT CAG TAC TAC ACC 1170 Tyr Gly Leu Asp Gly Ile Arg Leu Arg Arg Arg Gln Tyr Tyr Thr 380 385 390 ATG CCC AAC TTT CGA CAG TAT GAG AAC CGC ACC GGC CAC ATC CTA 1215 Met Pro Asn Phe Arg Gln Tyr Glu Asn Arg Thr Gly His Ile Leu 395 400 405 GTG CAG TGG TCT CTC GGC AGC CCC CTG CAC TTC GCG GGC TGG CAC 1260 Val Gln Trp Ser Leu Gly Ser Pro Leu His Phe Ala Gly Trp His 410 415 420 TGC TCC TGG TGC TTC ACA CCC GAG GGC ATC TAC TTC AAA CTC GTG 1305 Cys Ser Trp Cys Phe Thr Pro Glu Gly Ile Tyr Phe Lys Leu Val 425 430 435 TCG GCC CAG AAT GGT GAC TTC CCC CGC TGG GGT GAC TAC GAG GAC 1350 Ser Ala Gln Asn Gly Asp Phe Pro Arg Trp Gly Asp Tyr Glu Asp 440 445 450 AAG AGG GAC CTC AAT TAC ATC CGA AGC TTG ATT CGC ACT GGG GGA 1395 Lys Arg Asp Leu Asn Tyr Ile Arg Ser Leu Ile Arg Thr Gly Gly 455 460 465 TGG TTC GAC GGC ACG CAG CAG GAG TAC CCT CCT GCA GAC CCC AGT 1440 Trp Phe Asp Gly Thr Gln Gln Glu Tyr Pro Pro Ala Asp Pro Ser 470 475 480 GAA CAC ATG TAT GCT CCT AAG TAC CTG CTC AAG AAC TAT GAC CAG 1485 Glu His Met Tyr Ala Pro Lys Tyr Leu Leu Lys Asn Tyr Asp Gln 485 490 495 TTC CGC TAC TTG CTC GAA AAT CCC TAC CGG GAG CCC AAG AGC ACT 1530 Phe Arg Tyr Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Arg Glu Pro Lys Ser Thr 500 505 510 GTA GAG GGT GGG CGC CGG AAC CAG GGC TCA GAC GGA AGG TCA TCT 1575 Val Glu Gly Gly Arg Arg Asn Gln Gly Ser Asp Gly Arg Ser Ser 515 520 525 GCT GTC AGG GGC AAG TTG GAT ACA ACG GAG GGC 1608 Ala Val Arg Gly Lys Leu Asp Thr Thr Glu Gly 530 535

【００３５】配列番号：2 配列の長さ：1593 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： ATG AGA CGC TAC AAG CTC TTT CTC ATG TTC TGT ATG GCC GGC CTG 45 Met Arg Arg Tyr Lys Leu Phe Leu Met Phe Cys Met Ala Gly Leu 1 5 10 15 TGC CTC ATC TCC TTC CTG CAC TTC TTC AAG ACC CTG TCC TAT GTC 90 Cys Leu Ile Ser Phe Leu His Phe Phe Lys Thr Leu Ser Tyr Val 20 25 30 ACC TTC CCC CGA GAA CTG GCC TCC CTC AGC CCT AAC CTG GTG TCC 135 Thr Phe Pro Arg Glu Leu Ala Ser Leu Ser Pro Asn Leu Val Ser 35 40 45 AGC TTT TTC TGG AAC AAT GCC CCG GTC ACG CCC CAG GCC AGC CCC 180 Ser Phe Phe Trp Asn Asn Ala Pro Val Thr Pro Gln Ala Ser Pro 50 55 60 GAG CCA GGA GGC CCT GAC CTG CTG CGT ACC CCA CTC TAC TCC CAC 225 Glu Pro Gly Gly Pro Asp Leu Leu Arg Thr Pro Leu Tyr Ser His 65 70 75 TCG CCC CTG CTG CAG CCG CTG CCG CCC AGC AAG GCG GCC GAG GAG 270 Ser Pro Leu Leu Gln Pro Leu Pro Pro Ser Lys Ala Ala Glu Glu 80 85 90 CTC CAC CGG GTG GAC TTG GTG CTG CCC GAG GAC ACC ACC GAG TAT 315 Leu His Arg Val Asp Leu Val Leu Pro Glu Asp Thr Thr Glu Tyr 95 100 105 TTC GTG CGC ACC AAG GCC GGC GGC GTC TGC TTC AAA CCC GGC ACC 360 Phe Val Arg Thr Lys Ala Gly Gly Val Cys Phe Lys Pro Gly Thr 110 115 120 AAG ATG CTG GAG AGG CCG CCC CCG GGA CGG CCG GAG GAG AAG CCT 405 Lys Met Leu Glu Arg Pro Pro Pro Gly Arg Pro Glu Glu Lys Pro 125 130 135 GAG GGG GCC AAC GGC TCC TCG GCC CGG CGG CCA CCC CGG TAC CTC 450 Glu Gly Ala Asn Gly Ser Ser Ala Arg Arg Pro Pro Arg Tyr Leu 140 145 150 CTG AGC GCC CGG GAG CGC ACG GGG GGC CGA GGC GCC CGG CGC AAG 495 Leu Ser Ala Arg Glu Arg Thr Gly Gly Arg Gly Ala Arg Arg Lys 155 160 165 TGG GTG GAG TGC GTG TGC CTG CCC GGC TGG CAC GGA CCC AGC TGC 540 Trp Val Glu Cys Val Cys Leu Pro Gly Trp His Gly Pro Ser Cys 170 175 180 GGC GTG CCC ACT GTG GTG CAG TAC TCC AAC CTG CCC ACC AAG GAG 585 Gly Val Pro Thr Val Val Gln Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Lys Glu 185 190 195 CGG CTG GTG CCC AGG GAG GTG CCG CGC CGC GTC ATC AAC GCC ATC 630 Arg Leu Val Pro Arg Glu Val Pro Arg Arg Val Ile Asn Ala Ile 200 205 210 AAC GTC AAC CAC GAG TTC GAC CTG CTG GAC GTG CGC TTC CAC GAG 675 Asn Val Asn His Glu Phe Asp Leu Leu Asp Val Arg Phe His Glu 215 220 225 CTG GGC GAC GTG GTG GAC GCC TTT GTG GTG TGC GAG TCC AAC TTC 720 Leu Gly Asp Val Val Asp Ala Phe Val Val Cys Glu Ser Asn Phe 230 235 240 ACG GCT TAT GGG GAG CCG CGG CCG CTC AAG TTC CGG GAG ATG CTG 765 Thr Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Pro Leu Lys Phe Arg Glu Met Leu 245 250 255 ACC AAT GGC ACC TTC GAG TAC ATC CGC CAC AAG GTG CTC TAT GTC 810 Thr Asn Gly Thr Phe Glu Tyr Ile Arg His Lys Val Leu Tyr Val 260 265 270 TTC CTG GAC CAC TTC CCG CCC GGC GGC CGG CAG GAC GGC TGG ATC 855 Phe Leu Asp His Phe Pro Pro Gly Gly Arg Gln Asp Gly Trp Ile 275 280 285 GCC GAC GAC TAC CTG CGC ACC TTC CTC ACC CAG GAC GGC GTC TCG 900 Ala Asp Asp Tyr Leu Arg Thr Phe Leu Thr Gln Asp Gly Val Ser 290 295 300 CGG CTG CGC AAC CTG CGG CCC GAC GAC GTC TTC ATC ATT GAC GAT 945 Arg Leu Arg Asn Leu Arg Pro Asp Asp Val Phe Ile Ile Asp Asp 305 310 315 GCG GAC GAG ATC CCG GCC CGT GAC GGC GTC CTT TTC CTC AAG CTC 990 Ala Asp Glu Ile Pro Ala Arg Asp Gly Val Leu Phe Leu Lys Leu 320 325 330 TAC GAT GGC TGG ACC GAG CCC TTC GCC TTC CAC ATG CGC ACG TCG 1035 Tyr Asp Gly Trp Thr Glu Pro Phe Ala Phe His Met Arg Thr Ser 335 340 345 CTC TAC GGC TTC TTC TGG AAG CAG CCG GGC ACC CTG GAG GTG GTG 1080 Leu Tyr Gly Phe Phe Trp Lys Gln Pro Gly Thr Leu Glu Val Val 350 355 360 TCA GGC TGC ACG GTG GAC ATG CTG CAG GCA GTG TAT GGG CTG GAC 1125 Ser Gly Cys Thr Val Asp Met Leu Gln Ala Val Tyr Gly Leu Asp 365 370 375 GGC ATC CGC CTG CGC CGC CGC CAG TAC TAC ACC ATG CCC AAC TTC 1170 Gly Ile Arg Leu Arg Arg Arg Gln Tyr Tyr Thr Met Pro Asn Phe 380 385 390 AGA CAG TAT GAG AAC CGC ACC GGC CAC ATC CTG GTG CAG TGG TCG 1215 Arg Gln Tyr Glu Asn Arg Thr Gly His Ile Leu Val Gln Trp Ser 395 400 405 CTG GGC AGC CCC CTG CAC TTC GCC GGC TGG CAC TGC TCC TGG TGC 1260 Leu Gly Ser Pro Leu His Phe Ala Gly Trp His Cys Ser Trp Cys 410 415 420 TTC ACG CCC GAG GGC ATC TAC TTC AAG CTC GTG TCC GCC CAG AAT 1305 Phe Thr Pro Glu Gly Ile Tyr Phe Lys Leu Val Ser Ala Gln Asn 425 430 435 GGC GAC TTC CCA CGC TGG GGT GAC TAC GAG GAC AAG CGG GAC CTG 1350 Gly Asp Phe Pro Arg Trp Gly Asp Tyr Glu Asp Lys Arg Asp Leu 440 445 450 AAC TAC ATC CGC GGC CTG ATC CGC ACC GGG GGC TGG TTC GAC GGC 1395 Asn Tyr Ile Arg Gly Leu Ile Arg Thr Gly Gly Trp Phe Asp Gly 455 460 465 ACG CAG CAG GAG TAC CCG CCT GCA GAC CCC AGC GAG CAC ATG TAT 1440 Thr Gln Gln Glu Tyr Pro Pro Ala Asp Pro Ser Glu His Met Tyr 470 475 480 GCG CCC AAG TAC CTG CTG AAG AAC TAC GAC CGG TTC CAC TAC CTG 1485 Ala Pro Lys Tyr Leu Leu Lys Asn Tyr Asp Arg Phe His Tyr Leu 485 490 495 CTG GAC AAC CCC TAC CAG GAG CCC AGG AGC ACG GCG GCG GGC GGG 1530 Leu Asp Asn Pro Tyr Gln Glu Pro Arg Ser Thr Ala Ala Gly Gly 500 505 510 TGG CGC CAC AGG GGT CCC GAG GGA AGG CCG CCC GCC CGG GGC AAA 1575 Trp Arg His Arg Gly Pro Glu Gly Arg Pro Pro Ala Arg Gly Lys 515 520 525 CTG GAC GAG GCG GAA GTC 1593 Leu Asp Glu Ala Glu Val 530

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＣＡＧＧＳベクターの制限酵素地図を示す図
である。

【図２】ＧｎＴ−III 発現プラスミドＡｃｔ−５の模式
図を示す図である。

【図３】各細胞におけるＧｎＴ−III のｍＲＮＡの量を
示す図である。

【図４】各細胞におけるＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量を
示す図である。

【図５】各細胞におけるＡＦＰ、アルブミン、プレアル
ブミンタンパク質のｍＲＮＡの発現量を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年２月９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】次に、ＧｎＴ−ＩＩＩのメッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）の量をモレキュラー クローニング、
ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ）、第２版、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）ほか著、第７章、第３９〜５２頁、コールドスプ
リングハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行に記
載の方法を用いて、ノーザンブロットハイブリダイゼー
ションを行った。ＨＢ６１１細胞及び上記で得た６種類
の細胞におけるＧｎＴ−ＩＩＩのｍＲＮＡの量を比較し
た結果、ＧｎＴ−ＩＩＩポジティブ細胞ではＧｎＴ−Ｉ
ＩＩは高発現であった。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３０】次に、ＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量を^３２
ＰでラベルしたＨＢＶ全ｃＤＮＡをプローブとして、モ
レキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュ
アル、第２版、Ｔ．マニアティスほか著、第７章、第３
９〜５２頁、コールド スプリングハーバー ラボラト
リー社、１９８９年発行に記載の方法を用いて、ノーザ
ンブロットハイブリダイゼーションによって評価した。
ＨＢ６１１細胞及び上記で得た６種類の細胞におけるＨ
ＢＶ関連ｍＲＮＡの発現量を、ＨＢＶ）β−アクチン、
リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の量で比較した結果、Ｇ
ｎＴ−ＩＩＩポジティブ細胞はＧｎＴ−ＩＩＩネガティ
ブ細胞や親株に比べて明らかにＨＢＶ関連ｍＲＮＡの発
現量も抑制されていることがわかった。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３１】一方、同様にして、ＨＢ６１１細胞及び上
記で得た６種類の細胞におけるアルファフェトプロテイ
ン（ＡＦＰ）、アルブミン、プレアルブミンタンパク質
のｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果、どの細胞に
おいてもＡＦＰ）アルブミン、プレアルブミンタンパク
質のｍＲＮＡの発現量はＧｎＴ−ＩＩＩ活性のレベルと
は相関がなかった。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＣＡＧＧＳべクターの制限酵素地図を示す図
である。

【図２】ＧｎＴ−ＩＩＩ発現プラスミドＡｃｔ−５の模
式図を示す図である。

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】削除

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】削除

【手続補正７】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】削除

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ
   ェラーゼIII 又はその遺伝子を有効成分とすることを特
   徴とするウイルス複製抑制剤。
2. 【請求項２】 ウイルスが肝炎ウイルスである請求項１
   記載のウイルス複製抑制剤。
3. 【請求項３】 ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである
   請求項１記載のウイルス複製抑制剤。
4. 【請求項４】 肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである
   請求項２記載のウイルス複製抑制剤。
5. 【請求項５】 肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである
   請求項２記載のウイルス複製抑制剤。
6. 【請求項６】 請求項１記載の遺伝子が配列表の配列番
   号１又は２で表される配列を含む遺伝子である請求項１
   記載のウイルス複製抑制剤。
7. 【請求項７】 請求項１記載の遺伝子が配列表の配列番
   号１又は２で表される遺伝子にハイブリダイズし、か
   つ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII
   I 活性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチ
   ドをコードする遺伝子である請求項１記載のウイルス複
   製抑制剤。
8. 【請求項８】 請求項６又は７に記載の遺伝子がベクタ
   ーに組込まれていることを特徴とする請求項１記載のウ
   イルス複製抑制剤。
9. 【請求項９】 ベクターがプラスミドベクターである請
   求項８記載のウイルス複製抑制剤。
10. 【請求項１０】 ベクターがウイルスベクターである請
    求項８記載のウイルス複製抑制剤。
11. 【請求項１１】 ウイルスベクターがレトロウイルスベ
    クターである請求項１０記載のウイルス複製抑制剤。