JP2009519715A - ウイルスベクターを使用する制御された遺伝子発現に関する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の核酸構築物は、第1の核酸配列、第2の核酸配列、および第3の核酸配列を含むベクターを含み、該第1の核酸配列は第1の転写制御エレメントに作動可能に連結された目的の配列を含み、該第2の核酸配列は第2の転写制御エレメントに作動可能に連結され、かつ該第1の核酸配列の発現を制御するポリペプチドをコードし、該第3の核酸配列は該第1の転写制御エレメントに作動可能に連結された調節因子標的配列を含み、そして該第1および第2の転写制御エレメントは反対の方向に向いている。この構築物を用いて、本発明は、宿主の効率的なトランスフェクションを提供し、ならびに目的の移入された配列を有する宿主への修飾因子(例えば、テトラサイクリンなどの抗生物質)の単純な投与によって、目的の移入された配列の発現のタイミングおよびレベルの精巧な制御を提供することができる。
Description
(関連出願への相互参照)
この出願は、2005年12月16日に出願された米国仮出願第60/751,407号および、また2005年12月16日に出願された米国仮出願第60/751,117号の利益を主張する。2005年12月16日に出願された米国仮出願第60/751,407号および、また2005年12月16日に出願された米国仮出願第60/751,117号は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
この出願は、2005年12月16日に出願された米国仮出願第60/751,407号および、また2005年12月16日に出願された米国仮出願第60/751,117号の利益を主張する。2005年12月16日に出願された米国仮出願第60/751,407号および、また2005年12月16日に出願された米国仮出願第60/751,117号は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
謝辞
本発明は、米国国立衛生研究所(the National Institutes of Health)および米国国立アレルギー感染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)からの補助金R01 AI47717およびR01 AI48852の下での政府の支援を用いてなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所(the National Institutes of Health)および米国国立アレルギー感染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)からの補助金R01 AI47717およびR01 AI48852の下での政府の支援を用いてなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
背景
被験体が、培養中の細胞であるか、または治療遺伝子を受け取る必要がある動物モデルもしくはヒト被験体などの生物であるかに関わらず、細胞または生物における目的の配列の発現を移入かつ制御することがしばしば望ましい。HIVに基づくレンチウイルスベクターが、目的の配列を移入および/または発現するモードとして使用される場合、ウイルスはAIDSのための病原因子であるので、これらのベクターの使用の安全性に関する懸念が生じる。さらなる懸念には、細胞の癌遺伝子の挿入的活性化の可能性、ベクターまたは構築物が首尾よくかつ効果的にリボソームと結合する能力、およびベクターまたは構築物が核移入のために首尾よくシグナル伝達する能力が含まれる。今日まで、哺乳動物宿主または細胞において目的の配列を移入および/または発現する際の使用のために安全かつ有効であり、そして移入された目的の遺伝子または配列の発現の誘導と逆転の両方を行う重要な能力を提供するレンチウイルスベクターは作製されていなかった。
被験体が、培養中の細胞であるか、または治療遺伝子を受け取る必要がある動物モデルもしくはヒト被験体などの生物であるかに関わらず、細胞または生物における目的の配列の発現を移入かつ制御することがしばしば望ましい。HIVに基づくレンチウイルスベクターが、目的の配列を移入および/または発現するモードとして使用される場合、ウイルスはAIDSのための病原因子であるので、これらのベクターの使用の安全性に関する懸念が生じる。さらなる懸念には、細胞の癌遺伝子の挿入的活性化の可能性、ベクターまたは構築物が首尾よくかつ効果的にリボソームと結合する能力、およびベクターまたは構築物が核移入のために首尾よくシグナル伝達する能力が含まれる。今日まで、哺乳動物宿主または細胞において目的の配列を移入および/または発現する際の使用のために安全かつ有効であり、そして移入された目的の遺伝子または配列の発現の誘導と逆転の両方を行う重要な能力を提供するレンチウイルスベクターは作製されていなかった。
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、これらは、これらの高いレベルの複雑性に基づき、増殖していない細胞のゲノムに組み込み、潜在性感染の過程として、それらの生活環を調節することができる。これらのウイルスには、HIV−1、HIV−2、およびSIVが含まれる。他のレトロウイルスと同様に、レンチウイルスは、gag遺伝子、pol遺伝子、およびenv遺伝子を有し、これらは、2つの長末端反復(LTR)配列に隣接されている。これらの遺伝子の各々は、最初に1つの前駆体ポリタンパク質として発現される複数のタンパク質をコードする。gag遺伝子は、内部構造(マトリックスキャプシドおよびヌクレオキャプシド)タンパク質をコードする。pol遺伝子は、RNA指向性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素、インテグラーゼ、およびプロテアーゼ)をコードする。env遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードし、加えて、ウイルスRNAの核外移行の原因であるシス作用性エレメント(RRE)を含む。5’および3’LTRは、ビリオンRNAの転写およびポリアデニル化を促進するために働く。LTRは、ウイルス複製のために必要なすべての他のシス作用性配列を含む。ゲノムの逆転写のために必要な配列(tRNAプライマー結合部位)、および粒子へのウイルスRNAの効率的なキャプシド形成のために必要な配列(Psi部位)は、5’LTRに隣接している。キャプシド形成(または感染性ビリオンへのレトロウイルスRNAのパッケージング)のために必要な配列がウイルスゲノムから失われている場合、結果は、ゲノムRNAのキャプシド形成を妨害するシス欠損である。しかし、得られる変異体は、すべてのビリオンタンパク質の合成をなお方向付けることが可能である。HIVなどのレンチウイルスの包括的な概説は、例えば、Field’s Virology(Raven Publishers),B.N.Fieldsら編(1996)において提供される。
レンチウイルスベクターは種々の適用のために非常に有用であるが、遺伝子組換えを通して複製可能なレトロウイルス(RCR)が生成する可能性により、安全性の懸念を生じる。このような問題点を克服するために研究者達が試みてきた1つの方法は、gag/gag−polを2つの部分:すなわち、1つはgag/gag−proを発現するもの、およびもう1つはウイルスタンパク質R(Vpr)の融合パートナーとして逆転写酵素およびインテグラーゼを発現するものに分割する、HIVに基づくパッケージング系(トランス−レンチウイルス)を構築することである。しかし、このような方法は、感染性ウイルスベクター粒子を産生する効率が理想よりもはるかに低かったので、欠点を有することが判明した。
組換えレトロウイルスを生成しない、効率的なレトロウイルスパッケージング細胞株、特に、レンチウイルスパッケージング細胞株を産生するためのさらなる方法および系は、大きな価値がある。
発明の要旨
細胞および生物への遺伝子の効率的な送達および制御された発現のために、遺伝子移入構築物または他の発現系、および遺伝子調節系を組み合わせることにより、上記に列挙した問題点に対する解決法が本発明において提供される。したがって、本発明は、例えば、高度に効率的なレンチベクター送達系を通して、宿主の効率的なトランスフェクションを提供し、ならびに目的の移入された配列を有する宿主への修飾因子(例えば、テトラサイクリンなどの抗生物質)の単純な投与によって、目的の移入された配列の発現のタイミングおよびレベルの精巧な制御を提供する。本発明は、齧歯類、霊長類、およびイヌなどのいくつかの種の宿主における分裂していない細胞のこの効率的なトランスフェクションおよび調節を達成するというさらなる利点を提供する。
細胞および生物への遺伝子の効率的な送達および制御された発現のために、遺伝子移入構築物または他の発現系、および遺伝子調節系を組み合わせることにより、上記に列挙した問題点に対する解決法が本発明において提供される。したがって、本発明は、例えば、高度に効率的なレンチベクター送達系を通して、宿主の効率的なトランスフェクションを提供し、ならびに目的の移入された配列を有する宿主への修飾因子(例えば、テトラサイクリンなどの抗生物質)の単純な投与によって、目的の移入された配列の発現のタイミングおよびレベルの精巧な制御を提供する。本発明は、齧歯類、霊長類、およびイヌなどのいくつかの種の宿主における分裂していない細胞のこの効率的なトランスフェクションおよび調節を達成するというさらなる利点を提供する。
本発明において、遺伝子移入構築物および発現系が提供される。本発明の遺伝子移入構築物および発現系はレンチウイルスベクターであり得る。これらの構築物は、哺乳動物宿主細胞に目的の配列を移入するために、これらの構築物を安全かつ有効にする種々の成分を含み、そしてさらに、誘導性かつ可逆的な遺伝子移入構築物を含む細胞または被験体への適切な修飾因子の投与によって、哺乳動物宿主細胞中に移入された目的の配列の発現に対して、大きな制御を発揮する極度に重要な能力を提供する。本発明の遺伝子移入構築物は以下の1つ以上を含み得る:自己不活化5’LTR、調節因子応答性プロモーター、核内移行シグナル、調節因子応答性受容体をコードしている核酸と作動可能に結合されたプロモーター、RNA安定化エレメント、または自己不活化3’LTR。開示される遺伝子移入構築物は、分裂している細胞と分裂していない細胞の両方にDNAをパッケージングおよび送達するのに有用である。本明細書に開示されるパッケージング構築物および移入構築物は、互いとの組み合わせにおいて使用することができ、そしてまた、他のパッケージング構築物および遺伝子移入構築物、系、および当該分野において公知である方法、ならびに本明細書に開示される系および方法と組み合わせて使用することができる。
本明細書において、標的細胞中の目的の配列を誘導性かつ可逆的に発現するための特異的遺伝子移入構築物、およびこれらの構築物を使用するための方法もまた提供される。哺乳動物被験体を治療するための発現系として、開示される遺伝子移入構築物を利用するエキソビボ方法がさらに提供される。目的の配列の発現の動物モデルを作製する方法もまた提供される。さらに、本発明は、本明細書に開示される遺伝子移入構築物または発現系を組み込むか、またはこれを含む細胞を提供する。したがって、偽型レンチベクターが、標準的なDNAトランスフェクション技術に対して抵抗性である多くの細胞型を形質導入できるため、開示される遺伝子移入構築物は、安定な、誘導性/可逆性細胞株の構築を容易にする。
反対の方向で少なくとも2つの別々の配列の発現を駆動することができる二方向性プロモーターもまた提供される。開示される二方向性プロモーターは、本明細書に開示されるパッケージング構築物および遺伝子移入構築物とともに使用することもできる。
本明細書に記載される種々の遺伝子移入構築物を含む細胞株もまた提供される。
複製可能でない組換え体を生成可能である遺伝子移入構築物もまた、本明細書に開示される。
本明細書に記載される種々の遺伝子移入構築物を含む発現系もまた、本明細書に提供される。本明細書に記載される遺伝子移入構築物または発現系を含む細胞株、および本明細書に記載される方法によって作製された細胞もまた、提供される。
本明細書に開示される遺伝子移入構築物を標的細胞に導入する工程を含む、目的の遺伝子の発現を選択的に調節する方法もまた、提供される。
組換えタンパク質、抗体、およびトランスジェニック動物を作製する方法もまた、提供される。
GagおよびGag−Pro−Polポリタンパク質をコードする核酸配列を含むパッケージング構築物もまた、本発明で提供される。これらの構築物は安全であるが、本発明より前に利用可能であった構築物と比較して、パッケージング効率の改善を提供する。Gag−ProおよびGag−Pro−Polポリタンパク質の合成に必要とされる、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する、GagおよびGag−Pro−Polポリタンパク質をコードする核酸配列における1つ以上の変異をさらに含む、GagおよびGag−Pro−Polポリタンパク質をコードする核酸配列を含むパッケージング構築物もまた、本発明で提供される。
第1および第2の核酸配列を含むパッケージング構築物もまた本発明で提供され、第1の核酸配列はGagポリタンパク質をコードし、第2の核酸配列はGag−Proポリタンパク質をコードし、第1および第2の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み、第1および第2の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、そして第1および第2の核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。
第1、第2、および第3の核酸配列を含むパッケージング構築物もまた本発明で提供され、第1の核酸配列はGagポリタンパク質をコードし、第2の核酸配列はGag−Proポリタンパク質をコードし、そして第3の核酸配列はVpr−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質をコードする。
GagおよびGag−Polがトランスであるパッケージング構築物もまた本発明で提供され、Gagポリタンパク質をコードする核酸配列およびGag−Polポリタンパク質をコードする核酸配列が、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み、Gagポリタンパク質をコードする核酸配列およびGag−Proポリタンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。
本明細書に記載される種々のパッケージング構築物を含む細胞株、パッケージング系、および発現系もまた提供される。本明細書に記載される発現系を含む細胞株もまた提供される。
選択的に、本明細書に記載されるパッケージング構築物は、複製可能でない組換え体を生成することが可能である。
ウイルス様粒子を作製する方法もまた提供される。
本明細書に記載される細胞株、パッケージング構築物、遺伝子移入構築物、パッケージング系、および発現系の作製方法および使用方法が、本発明でさらに提供される。
ウイルス粒子形成を調節する因子をスクリーニングする方法もまた、本発明で提供される。
本明細書に開示される遺伝子移入構築物を含むワクチン、および本明細書に開示されるワクチンを被験体に投与する工程を含む、被験体における免疫応答を誘導する方法がさらに提供される。
したがって、本発明は、密接に調節された目的の配列の発現系と、効率的な目的の配列の送達系を首尾よく組み合わせ、そして、目的の配列の送達および発現の技術における顕著な進歩を表す。
本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成する添付の図面は、本明細書に記載するいくつかの局面を例証する。
詳細な説明
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および/または方法が開示および記載される前に、以下に記載される局面は、特定の合成方法または特定の投与方法に限定されず、そのようなものとして、当然、変化し得ることが理解される。本明細書で使用される命名法は特定の局面を記載する目的のみのためであり、限定であることを意図しないこともまた理解される。
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および/または方法が開示および記載される前に、以下に記載される局面は、特定の合成方法または特定の投与方法に限定されず、そのようなものとして、当然、変化し得ることが理解される。本明細書で使用される命名法は特定の局面を記載する目的のみのためであり、限定であることを意図しないこともまた理解される。
明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」「an」および「the」は、状況が明確に反対の意味を指示していない限り、複数形の言及を含むことを注記しなければならない。
全体を通して、「被験体」は個体を意味する。したがって、「被験体」は、ネコ、イヌなどの飼育されている動物、家畜(例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど)、実験用動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど)、および鳥類を含み得る。1つの局面において、被験体は、霊長類またはヒトなどの哺乳動物である。
「選択的な」または「選択的に」とは、引き続いて記載される事象または状況が起こり得るかまたは起こり得ないこと、ならびにこの記載が、事象または状況が起こる場合、およびこれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、「選択的に、組成物は1つの組み合わせを含み得る」という語句は、この組成物が、異なる分子の組み合わせを含み得るか、または1つの組み合わせを含まなくてもよいことを意味し、その結果、この記載は、組み合わせと組み合わせの非存在の両方を含む(すなわち、組み合わせの個々のメンバーを含む)。
「パッケージング細胞株」または「パッケージング細胞」という語句は、ウイルスRNAをパッケージングし、複製可能なヘルパーウイルスを産生する能力が欠損しているウイルス粒子またはウイルス様粒子を産生するために必要なコーディング配列を含む細胞(代表的には、哺乳動物細胞株)をいう。パッケージング機能が細胞内で提供される場合、パッケージング細胞株またはパッケージング細胞は組換えレトロウイルスを産生し、それによって、「レトロウイルス産生細胞株」または「レトロウイルス産生細胞」となる。
「レトロウイルス」という用語は、任意の既知のレトロウイルス(例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、ネコ白血病ウイルス(FLV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)などのc型レトロウイルス)をいう。本発明の「レトロウイルス」には、ヒトT細胞白血病ウイルス、HTLV−1およびHTLV−2、ならびにレトロウイルスのレンチウイルスファミリー、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、HIV−1、HIV−2、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウマ免疫不全ウイルス(EIV)、および他のクラスのレトロウイルスもまた含まれる。
「Gagポリタンパク質」または「Gagタンパク質」、「Proポリタンパク質」または「Proタンパク質」、および「Polポリタンパク質」または「Polタンパク質」という用語は、代表的には、単一の前駆体「ポリタンパク質」として発現されるレトロウイルスのgag、pro、およびpol遺伝子によってコードされる複数のタンパク質をいう。例えば、HIV gagは、他のタンパク質の中でも、p17、p24、p7、およびp6をコードする。HIV proはウイルスプロテアーゼをコードする。HIV polは、他のタンパク質の中でも、プロテアーゼ(PR)、逆転写酵素(RT)およびインテグラーゼ(IN)をコードする。本明細書で使用される場合、「ポリタンパク質」という用語は、gag、pro、またはpolポリタンパク質のすべてまたは一部を含むべきである。
「ベクター」または「構築物」という用語は、ベクター配列が連結されている別の核酸を細胞の中に輸送することが可能である核酸配列をいう。「発現ベクター」という用語には、細胞による発現のために適切な型である(例えば、転写制御エレメントに連結されている)遺伝子構築物を含む任意のベクター(例えば、プラスミド、コスミド、またはファージ染色体)が含まれる。プラスミドは一般的に使用されるベクターの型であるので、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に使用される。さらに、本発明は、等価な機能を働かせる他のベクターを含むことが意図される。
「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語は、部分的にまたは完全に異種である、すなわち、それが導入される細胞に対して外来性である核酸配列(例えば、治療遺伝子)を意味し得る。
「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語は、それが導入される細胞の内因性遺伝子に対して部分的にまたは完全に同種であるが、ゲノムを変化させるような方法で細胞のゲノムに挿入されるように設計されている(例えば、これは、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入され、つまり、その挿入は「ノックアウト」となる)核酸配列もまた意味し得る。例えば、目的の配列は、cDNA、DNA、またはmRNAであり得る。
「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語は、それが導入される細胞の内因性遺伝子に対して部分的にまたは完全に相補的である核酸配列もまた意味し得る。例えば、目的の配列は、マイクロRNA、shRNA、またはsiRNAであり得る。
「目的の配列」または「目的の遺伝子」は、選択された核酸の最適な発現のために必要であり得る1つ以上の転写調節配列および任意の他の核酸、例えば、イントロンもまた含み得る。「目的のタンパク質」は、目的の配列または目的の遺伝子から発現されるペプチドまたはポリペプチド配列(例えば、治療タンパク質)を意味する。
「遺伝子移入構築物」とは、例えば、次いで、ウイルス粒子が目的の標的細胞を形質導入できるように、ウイルス粒子を産生するために他のレンチウイルスまたはトランス−レンチウイルスベクター系ベクターとともに代表的に使用される核酸配列をいう。
「に作動可能に連結される」という用語は、別の核酸配列との核酸の機能的関連性をいう。プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終止部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結された核酸配列の例である。例えば、転写制御エレメントへのDNAの作動可能な連結は、このようなDNAの転写が、DNAを特異的に認識し、結合し、および転写するRNAポリメラーゼによってプロモーターから開始されるような、DNAとプロモーターの間の物理的かつ機能的な関連性をいう。
「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、上記細胞の染色体DNAへの核酸の導入を含む、レシピエント細胞への核酸、例えば、発現ベクターの導入を意味する。
「RNA搬出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質までのRNA転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントをいう。RNA搬出エレメントの例には以下が含まれるがこれらに限定されない:ヒト免疫不全ウイルス(HIV)rev応答性エレメント(RRE)(例えば、Cullenら(1991)J.Virol.65:1053;およびCullenら(1991)Cell 58:423−426)、およびB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント(PRE)(例えば、Huangら(1995)Molec.and Cell.Biol.15(7):3864−3869;Huangら(1994)J.Virol.68(5):3193−3199;Huangら(1993)Molec.and Cell.Biol 13(12):7476−7486、および米国特許第5,744,326号を参照のこと、これらはすべて、RNA搬出エレメントに関連するそれらの全体が参照により本明細書に援用される)。一般的に、RNA搬出エレメントは、遺伝子の3’UTR内に配置され、1コピーまたは複数コピーとして挿入することができる。RNA搬出エレメントは、本発明のパッケージング細胞株を生成する別々のベクターのいずれかまたはすべてに挿入することができる。
範囲は、「約」1つの特定の値から、および/または、「約」別の特定の値までとして本明細書では表現することができる。このような範囲が表現される場合、別の実施形態には、1つの特定の値から、および/または、他の特定の値までが含まれる。同様に、値が近似値として表現される場合、先行する語「約」の使用により、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。各々の範囲の終点は、他の終点と関連において、および他の終点とは独立しての両方で有意であることがさらに理解される。本発明に開示される多数の値が存在すること、および各値が、値それ自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書で開示されることもまた理解される。例えば、「10」という値が開示されるならば、「約10」という値もまた開示される。1つの値が開示される場合、その値「以下」、その値「以上」、および値の間の可能な範囲もまた開示されることもまた、当業者によって適切に理解されるように、理解される。例えば、「10」という値が開示されるならば、「10以下」ならびに「10以上」もまた開示される。本願を通して、データは多数の異なる形式で提供されること、およびこのデータは、終点および出発点を表し、ならびにデータの点の任意の組み合わせの範囲を表すこともまた理解される。例えば、特定のデータ点である「10」および特定のデータ点である「15」が開示される場合、10および15よりも大きい、10および15以上、10および15より小さい、10および15以下、ならびに10および15に等しいことが、10と15の間と同様に開示されると見なされることが理解される。
「ウイルス様粒子」または「ウイルス粒子」とは、宿主細胞中で、以下のウイルス遺伝子、gag、pro、rt、in、およびenvの少なくとも1つの発現によって産生されるタンパク質性のキャプシド様ビリオンをいう。産生される粒子は、好ましくは、遺伝子移入ベクターのmRNA等価物をさらに含み、かつ感染性であり、または、形質導入される所定の細胞型にとって感染性になるように作製することができる。
組成物
1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)のgagおよびpol遺伝子は、前駆体ポリタンパク質GagおよびGag−Pro−Polとして最初に発現される。出芽の間またはその後、これらのタンパク質は、ウイルスプロテアーゼ(PR)によってそれらの成熟型にプロセスされる。55kDa Gag前駆体は、マトリックス(MA)、キャプシド(CA)、スペーサーペプチドp2、ヌクレオキャプシド(NC)、スペーサーペプチドp1、およびp6を生成する。160kDa Gag−Pro−Polポリタンパク質は、MA、CA、p2、NC、p6、PR、逆転写酵素(RT)、およびインテグラーゼ(IN)を生成する。GagおよびGag−Pro−Polポリタンパク質は同じmRNAによってコードされるが、同じ速度では合成されない。頻繁でないリボソームフレームシフト事象は、およそ20:1の比率のGag対Gag−Pro−Pol産生を生じる。この比率の維持は、ウイルス粒子の形成および感染性のために決定的である。
1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)のgagおよびpol遺伝子は、前駆体ポリタンパク質GagおよびGag−Pro−Polとして最初に発現される。出芽の間またはその後、これらのタンパク質は、ウイルスプロテアーゼ(PR)によってそれらの成熟型にプロセスされる。55kDa Gag前駆体は、マトリックス(MA)、キャプシド(CA)、スペーサーペプチドp2、ヌクレオキャプシド(NC)、スペーサーペプチドp1、およびp6を生成する。160kDa Gag−Pro−Polポリタンパク質は、MA、CA、p2、NC、p6、PR、逆転写酵素(RT)、およびインテグラーゼ(IN)を生成する。GagおよびGag−Pro−Polポリタンパク質は同じmRNAによってコードされるが、同じ速度では合成されない。頻繁でないリボソームフレームシフト事象は、およそ20:1の比率のGag対Gag−Pro−Pol産生を生じる。この比率の維持は、ウイルス粒子の形成および感染性のために決定的である。
Gag単独の細胞内発現は、ウイルス様粒子(VLP)を産生するために十分である。さらに、RNA−Gag相互作用を経由して主に起こるゲノムRNAのパッケージングおよび二量体形成との、アセンブリプロセスにおける、GagおよびウイルスゲノムRNA相互作用のための重要な役割が存在する。GagのNCドメインはウイルスRNAに結合し、RNAパッケージングプロセスと二量体形成プロセスの両方を容易にすることが示されている。欠損性ウイルスPRを有するHIV−1はなおRNAをパッケージングするので、ゲノムRNAとHIV−1 Gagの間の初期の相互作用は、Gag前駆体中のNC配列を介して起こるらしい。さらに、野生型(WT)とPR欠損性(PR−)のビリオンの分析により、HIV−1の中でのゲノムRNAの二量体形成はタンパク質分解性プロセシングの前に開始することが明らかにされており、このことは、GagおよびGag−Pro−Pol前駆体タンパク質が、タンパク質プロセシングとは独立して、RNA二量体形成を補助し得ることを示す。
他のレトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは、gag、pol、およびenvに加えて、調節的または構造的機能を有するいくつかの「アクセサリー」遺伝子を有する。具体的には、HIV−1は、Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu、およびNefを含む、少なくとも6種のこのような遺伝子を保有する。密接に関連するHIV−2はVpuをコードしないが、HIV−1においては発見されていない、関連性のない別のタンパク質、Vpxをコードする。
HIV−1 Vpr遺伝子は14kDタンパク質(96アミノ酸)をコードする(Myersら(1993)Human Retroviruses and AIDS,Los Alamos National Laboratory,N.M.)。Vprオープンリーディングフレームは、大部分のHIV−2ウイルスおよびSIVウイルスにもまた存在する。HIV−2 VprとVpxの間のアミノ酸比較は高い相同性の領域を示し、VpxがVpr遺伝子の二量体形成によって生じ得ることを示唆する。VprおよびVpxは、成熟ウイルス粒子中に複数コピーで存在し、ウイルスアセンブリに関与するgagをコードする前駆体ポリタンパク質の一部であるp6タンパク質に結合することが示されてきた(WO 96/07741;WO 96/32494)。したがって、ウイルス粒子へのVprおよびVpxの組み込みは、p6との相互作用を経由して起こる(Lavalleeら(1994)J.Virol.68:1926−1934;およびWuら(1994)J.Virol.68:6161)。Vprは、特に、p6のカルボキシ末端領域と結合することがさらに示されてきた。HIVゲノムに関してトランスで発現されたVprおよびVpxは、HIVウイルスに対する異種タンパク質を標的とするために使用し得る(WO 96/07741;WO 96/32494)。これらのタンパク質の全長ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ならびにそれらの結合ドメインを含む、VprおよびVpxの構造および機能の記載は、WO 96/07741において、ならびにZhaoら(1994)J.Biol Chem,269(22):1577(Vpr);Mahalinghamら、91995)Virology 207:297(Vpr);およびHuら(1989)Virology 173:624)(Vpx)においてもまた提供される。Vprに関連する他の関連参考文献には、例えば、Kondoら(1995)J.Virol 69:2759;Lavalleeら(1994)J.Virol.68:1926;およびLevyら(1993)Cell 72:541が含まれる。Vpxに関連する他の関連参考文献には、例えば、Wuら(1994)J.Virol.68:6161が含まれる。これらの参考文献は、VprおよびVpxの構造および機能のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
レトロウイルスインテグラーゼ(IN)タンパク質はプロウイルスの組み込みを触媒し、インビボでの感染状態の持続のために必須である。この決定的な酵素の理解、とりわけ、そのタンパク質構造および触媒的組み込み反応の生化学的メカニズムにおいて、顕著な進歩がなされてきた(Brown,P.1997.Integration,161−204頁.J.M.Coffin,S.H.HughesおよびH.E.Varmus(編),Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.;Dyda,F.,A.B.Hickman,T.M.Jenkins,A.Engelman,R.CraigieおよびD.R.Davies.1994.Crystal structure of the catalytic domain of HIV−1 integrase:similarity to other polynucleotidyl transferases.Science 266:1981−1986;Katz,R.A.およびA.M.Skalka.1994.The retroviral enzymes.Annu.Rev.Biochem.63:133−173。これらのすべての参考文献は、INのタンパク質構造および触媒的組み込み反応の生化学的メカニズムのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。HIV−1 INは、発現され、他のGag(マトリックス、キャプシド、ヌクレオキャプシド、およびp6)およびPol(プロテアーゼ、逆転写酵素[RT]、およびIN)成分を含むより大きな160kDa Gag−Pol前駆体ポリタンパク質(Pr160Gag−Pol)の一部としてウイルス粒子にアセンブルされる。アセンブリ後、Pr160Gag−Polは、ウイルスプロテアーゼによってタンパク質分解的にプロセスされ、32kDa INタンパク質を含む個々のGagおよびPol成分を遊離する。複製しているウイルスを使用するIN機能の研究は、ウイルスcDNAの組み込みを触媒することに加えて、INがウイルス複製に対して他の効果を有し得ることを示唆してきた(Gallay,P.,S.Swingler,J.Song,F.BushmanおよびD.Trono.1995.HIV nuclear import is governed by the phosphotyrosine−mediated binding of matrix to the core domain of integrase.Cell 83:569−576;Leavitt,A.D.,G.Robles,N.AlesandroおよびH.E.Varmus.1996.Human immunodeficiency virus type 1 integrase mutants retain in vitro integrase activity yet fail to integrate viral DNA efficiently during infection.J.Virol.70:721−728;Masuda,T.,V.Planelles,P.KrogstadおよびI.S.Y.Chen.1995.Genetic analysis of human immunodeficiency virus type 1 integrase and the U3 att site:unusual phenotype of mutants in the zinc finger−like domain.J.Virol.69:6687−6696。これらのすべての参考文献は、INのタンパク質構造および触媒的組み込み反応の生化学的メカニズムのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。プロウイルスクローンを用いる研究において、IN遺伝子変異が複数のレベルでウイルス複製に影響を与え得ることが示されてきた。IN遺伝子の変異は、Gag−Pol前駆体タンパク質に影響を与えることができ、ならびに、アセンブリ、成熟、および他の引き続くウイルス事象を変化させることができる。IN遺伝子は、ウイルス粒子およびヌクレオタンパク質組み込み前複合体の中の成熟INタンパク質およびその組織化に影響を与えることもできる。それゆえに、このような変異は多面的であり、様々なメカニズムを通して、およびウイルス生活環の中の異なる段階において、ウイルス複製を変化させることができる。
逆転写はRTによって触媒され、逆転写はインビトロで組換えRT、鋳型、およびプライマーを用いて起こり得るが、このプロセスはインビボではより複雑である。複製しているウイルスの状況において、ウイルスcDNAの完全な合成は、異なるタンパク質および核酸を寄せ集めることと同様に単純なものではない;むしろ、これは、多数の一過性構造を含む複雑な多段階プロセスである。感染細胞の中で、逆転写は、他のウイルス因子および細胞因子を含む核酸−タンパク質(ヌクレオタンパク質)複合体の状況で起こる。さらに、ウイルスcDNAの合成は、逆転写に先行する多数の分子事象の適切な実行に多くを依存している。
パッケージング構築物および遺伝子移入構築物が本明細書で開示される。組換えレトロウイルスベクターを産生するためのプロトコール、およびパッケージング細胞株を形質転換するためのプロトコールは当該分野において周知である[Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.ら(編)Greene Publishing Associates,(1989),Sections 9.10−9.14および他の標準的な実験用マニュアル;Eglitisら(1985)Science 230:1395−1398;DanosおよびMulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:6460−6464;Wilsonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014−3018;Armentanoら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci USA 87:6141−6145;Huberら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:8039−8043;Ferryら(1991)Proc.Natl.Acad Sci USA 88:8377−8381;Chowdhuryら(1991)Science 254:1802−1805;van Beusechemら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:7640−7644;Kayら(1992) Human Gene Therapy 3:641−647;Daiら(1992)Proc.Natl.Acad Sci USA 89:10892−10895;Hwuら(1993)J.Immunol.150:4104−4115;米国特許第4,868,116号;同第4,980,286号;PCT出願 WO 89/07136;PCT出願 WO 89/02468;PCT出願 WO 89/05345;およびPCT出願 WO 92/07573。これらのすべての参考文献は、組換えレトロウイルス構築物およびベクターを産生するため、ならびに細胞株を形質転換するためのプロトコールのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。さらに、本発明において使用することができる適切なレトロウイルス配列は、商業的に利用可能な供給源から入手することができる。例えば、このような配列は、pLJ、pZIP、pWE、およびpEMなどのレトロウイルスプラスミドの型で購入することができる。本発明のベクターの中で利用することができる適切なパッケージング配列もまた使用されており、これには、例えば、プラスミド、ΨCrip、ΨCre、Ψ2、およびΨAmが含まれる。したがって、本発明は特定の実施形態(例えば、特定のレンチウイルスベクター)に関して記載されるべきであるが、本発明における使用のための他のレトロウイルスベクターが、本明細書に記載される指針に従って調製することができる。加えて、本明細書に開示される遺伝子移入ベクターは、本明細書に開示されるパッケージング系および発現系とともに使用することができる。
具体的には、GagおよびGag−Pro−Polをコードする核酸配列を含むパッケージング構築物が開示される。選択的に、このパッケージング構築物は第1および第2の核酸配列を含み、ここで、第1の核酸配列がGagタンパク質をコードし、第2の核酸配列がGag−Pro−Polタンパク質をコードし、第1および第2の核酸配列が、各々、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み、第1および第2の核酸配列が同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、第1および第2の核酸配列が、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。
第1の核酸配列がGagタンパク質をコードし、第2の核酸配列がGag−Proタンパク質をコードし、第1および第2の核酸配列が、各々、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み、第1および第2の核酸配列が同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、第1および第2の核酸配列が、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される、パッケージング構築物もまた開示される。この構築物中で、ポリRTおよびINを通常コードする核酸配列が除去または変異され、その結果、PolまたはRT−INタンパク質は発現されない。Polタンパク質をコードする核酸配列を除去または変異させることは、遺伝子組換えを通して複製可能なレトロウイルス(RCR)を生成する可能性をさらに減少する。次いで、RTおよびINは、別個の構築物から(トランスで)発現させ得る。例えば、逆転写酵素およびインテグラーゼは、ウイルスタンパク質R(Vpr)の融合パートナーとして発現させ得る。
第1、第2、および第3の核酸配列を含み、ここで、第1の核酸配列がGagタンパク質をコードし、第2の核酸配列がGag−Proタンパク質をコードし、第3の核酸配列がVpr逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質をコードする、パッケージング構築物もまた本明細書で開示される。さらに、第1および第2の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み得、第1、第2、および第3の核酸配列が同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、第1、第2、および第3の核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。この構築物中で、Polタンパク質をコード可能である核酸配列を除去または変異することができ、その結果、Polタンパク質は発現されない。逆転写酵素およびインテグラーゼは、Vpr逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質をコードする核酸配列によってトランスで供給することができる。
Vpr−RT−INを制御するためにさらに下流に配置されているIRESまたはIRES様エレメントもまた、本明細書で開示される。IRESおよびIRES様エレメントは以下に記載される。例えば、第1または第2の核酸配列と、第3の核酸配列の間のエレメントをさらに含み、第3の核酸配列が第1の核酸配列と第2の核酸配列の間に配置されておらず、このエレメントが、第1または第2の核酸配列と、第3の核酸配列の間の示差的発現を提供する、パッケージング構築物が開示される。例には、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが含まれる。この方法とともに有用であるIRESおよびIRES様エレメントが本明細書に記載される。IRESは、例えば、EMC−ウイルスIRES、HCV−ウイルスIRES、または異なる起源のIRESであり得る。使用することができるIRESの他の例には、http://ifr31w3.toulouse.inserm.fr/IRESdatabase/におけるIRESデータベース中に存在するIRESが含まれるがこれに限定されない。
rev応答性エレメントを含む核酸配列をさらに含むパッケージング構築物もまた開示される。
事実上、GagおよびGag−Polタンパク質は、部分的に重複するオープンリーディングフレームによってコードされる。Gagはそれ自体の開始コドンおよび終止コドンを有するのに対して、HIV−1 Gag−Pol前駆体の合成は、Gagの翻訳のそれの約5〜10%の頻度で起こるフレームシフト事象に起因する。他のレトロウイルスもまた、Gag−PolまたはGag−Proタンパク質の発現を調節するために、同様のフレームシフトメカニズムまたはリードスルー抑制メカニズムを使用する。したがって、細胞内Gag/Gag−Pol比率は、すべてのレトロウイルスの複製の間に調節される。HIVフレームシフト部位(ヘプタヌクレオチドAU−リッチ配列)は、ヌクレオキャプシド(NC)コード配列の3’末端に見い出される。すぐ下流のこの部位およびステム構造は、Gagの合成の間にリボソームを失速させ、リボソームが1ヌクレオチド逆流して、Gag−Pol融合タンパク質の頻繁でない(Gagと比較して)合成を可能にさせる。
Gagタンパク質の多量体形成はウイルス粒子を生じるのに対して、Gag−Pol前駆体タンパク質の発現は、ウイルス酵素が、ウイルスアセンブリの間にウイルス粒子に組み込まれることを確実にする。細胞からのビリオンの放出の間および放出後、Gag前駆体タンパク質は、ウイルスプロテアーゼ(PR)によって、成熟タンパク質:マトリックス、キャプシド(CA)、NC、p6、ならびに2つのスペーサーペプチド、p2およびp1に切断され、Gag−Pol融合物は切断されて、マトリックス、CA、p2、およびNC、ならびにトランスフレームタンパク質,PR、逆転写酵素(RT)、およびインテグラーゼ(IN)を生じる。
Gag前駆体タンパク質単独の合成は、ウイルス様粒子のアセンブリおよび放出のために十分であることが報告されてきた。Gag−Polまたはその成熟産物のビリオンへの組み込みは、感染した細胞におけるウイルスcDNAの合成および組み込みをそれらが媒介するので、感染性のために必要である。加えて、PRによる前駆体タンパク質の切断は、ビリオンコアの形態学的成熟および感染性ウイルス粒子の生成のために必要である。ウイルスゲノムRNAもまた、アセンブリの間にビリオンにパッケージされ、ゲノムの5’末端の近傍で見い出されるゲノムRNAパッケージング配列、およびGagのNCドメインとの相互作用によって駆動される。
他のレトロウイルスと同様に、HIV−1は、例えば、二量体RNAゲノムを有する。HIV−1ウイルスRNAのインビトロ二量体分析は、二量体開始配列を名付けられた50〜60ヌクレオチド配列にマッピングされ、これは、二量体RNA複合体の形成のために重要である。二量体開示配列中の変異は、ゲノムRNA二量体形成およびビリオンRNAパッケージングを妨害し、非感染性ウイルス粒子の産生を生じる。RNA二量体形成は、HIV−1におけるRNAパッケージングのために必須であり、ゲノムRNAのビリオンパッケージングおよびRNA二量体形成もまた他のレトロウイルスと関連していると考えられている。PR欠損性HIV−1ビリオンからのRNA二量体は、野生型成熟HIV−1からの二量体よりも熱安定性が低い。モロニーマウス白血病ウイルスに関する同様の観察もまた報告されている。
Gag−Pol前駆体単独の発現は感染性レトロウイルス粒子の産生のためには不十分であるが、ウイルス複製サイクルに関するGag/Gag−Pol比率およびRNA二量体形成の影響は決定的な因子である。ビリオン産生細胞におけるGag/Gag−Pol比率が、感染性ウイルス粒子の生成およびビリオンRNA二量体の安定性のために重要であることが示されてきた(Xhilagaら、Journal of Virology,February 2001,1834−1841頁.Vol.75,No.4)。
Gagタンパク質およびGag−Polタンパク質の比率が、約99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:1,6 83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39、60:40、または任意の介在する比率であるパッケージング系が本明細書で開示される。
加えて、Polタンパク質を発現可能である核酸配列を欠く、レンチウイルスベースのパッケージング構築物は、Vpr−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質を(シスで)発現可能である核酸配列を選択的に含み得る。代替として、Polタンパク質を発現可能である核酸配列を欠くパッケージング構築物を含む、レンチウイルスベースのパッケージング系はまた、Vpr−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質を(トランスで)発現可能である別個の核酸配列を含み得る。
本明細書に開示される遺伝子移入構築物は目的の配列を含み得る。この遺伝子移入構築物は、マーカーをコードする配列も含み得る。例えば、目的の配列およびマーカーをコードする配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。選択的に、この遺伝子移入構築物は、2つ、3つ、4つ、5つなどの目的の配列を含み得る。目的の配列は、同じまたは異なることが可能であり、別個の転写制御エレメントに作動可能に連結することが可能であり、または、別の目的の配列、マーカーコード配列、もしくは調節因子配列に作動可能に連結された転写制御エレメントに作動可能に連結することが可能である。例えば、本明細書に開示される発現系において、遺伝子移入構築物は、第3、第4、第5、またはより高度な順番の選択された目的の核酸配列を含むことができ、ここで、第7の核酸配列は、第3、第4、第5、またはより高度な順番の選択された目的のタンパク質をコードすることができる。
遺伝子移入構築物は、目的の配列の3’に位置するウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントをさらに含み得る。これらの遺伝子移入構築物は、本明細書の他の箇所で議論される1つ以上の長末端反復(LTR)配列もまた含み得る。
これらの遺伝子移入構築物、ならびに本明細書に開示される他の構築物もまた、自己不活化(SIN)であり得る。SINベクターは、組み込まれた移入ベクタープロウイルスDNAのいくつかのシス作用性配列を不活性にするために、ウイルス逆転写酵素の独特な特性を利用する新世代のレトロウイルスベクターである。これらの配列は、LTR中で見い出されるウイルスプロモーターならびに組み込まれたベクタープロウイルスDNA中に存在する任意のパッケージング配列を含み得る。SINベクターを作製するためのいくつかのストラテジーが利用可能であり、当該分野で周知である。例えば、スプリットイントロンストラテジーのその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される、Non−Human Primate Lentiviral Vectors for HumanGene Therapy,Genetic Disorders in the Arab World:United Arab Emirates(http://www.cags.org.ae/cbc101v.pdfにおいて利用可能である)においてTahir A Rizviによって記載されているような「スプリットイントロン」ストラテジーを使用することができる。「スプリットイントロン」ストラテジーは、効率的な真核生物スプライス部位の組み込みを使用して、組み込まれるベクタープロウイルスDNAからパッケージング配列を欠失させ、ウイルスタンパク質によってさらにパッケージングおよび増殖され得るRNAを生成することを不可能にする。このことは、偶発的にまたはさもなくばレトロウイルスベクター形質導入細胞中に存在し得る任意の内因性または外因性ウイルスとの、ベクターRNAの任意の潜在的な組換えの可能性を除外する。さらに、遺伝子移入構築物は、3’の長い末端反復配列中に選択的に変異を含み得る。プロモーター配列もまた、5’または3’の長い末端反復配列の代わりに置換することができる。
加えて、本明細書に開示される発現系は、目的の配列とマーカーをコードする配列の間のエレメントを有する、目的の配列およびマーカーをコードする配列を含む遺伝子移入構築物を含み得、ここで、このエレメントは、目的の配列およびマーカーをコードする配列の示差的発現を提供する。目的の配列とマーカーをコードする配列の間のエレメントは、内部リボソーム侵入部位(IRES)または内部リボソーム侵入部位様エレメント(IRES様)であり得る。IRESおよびIRES様エレメントは、本明細書の他の箇所で議論される。遺伝子移入構築物はまた、少なくとも1つの転写制御エレメントを含み得、これは本明細書の他の箇所で議論される。遺伝子移入構築物中に存在する転写制御エレメントはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、調節可能でもあり得る。遺伝子移入構築物はまた、調節因子配列を含み得、または調節因子配列は、本明細書に記載されるような別個の調節因子構築物によって供給することができる。
さらに、遺伝子移入構築物は、マーカーをコードする配列および目的の配列を含み得、ここで、マーカーをコードする配列および目的の配列は、同じまたは異なる転写制御エレメント(TCE)に作動可能に連結される。例えば、目的の配列が第1の転写制御エレメントに作動可能に連結され、マーカーをコードする配列が第2の転写制御エレメントに作動可能に連結されている遺伝子移入構築物が本明細書で開示される。1つの例において、第1の転写制御エレメントは、第2の転写制御エレメントよりもより強力であり得る。このような配置において、第2のTCEに作動可能に連結された、マーカーをコードする配列の発現は、第2のTCEに作動可能に連結された、目的の配列の発現よりも高い。例えば、第1のTCEに連結された、マーカーをコードする配列と、第2のTCEに作動可能に連結された、目的の配列の間の発現の比率は、99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:1,6 83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39、または60:40であり得る。
さらに、反対の方向である2つのプロモーター、ならびに二方向性プロモーターを含む遺伝子移入構築物が開示される。例えば、目的の配列およびマーカーをコードする配列は、反対の方向で発現させることができる。別の例において、目的の配列およびマーカーをコードする配列は、反対の方向で発現させることができる。さらに、目的の配列は、第1の転写制御エレメントに作動可能に連結することができ、マーカーをコードする配列は、第2の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。第1の転写制御エレメントおよび第2の転写制御エレメントは同じであり得、または異なり得る。さらに、少なくとも1つの転写制御エレメントは調節可能であり得る。また、目的の配列およびマーカーをコードする配列は、調節可能であり得る、単一の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。単一の転写制御エレメントは、調節可能である二方向性プロモーターであり得る。
第1の核酸配列、第2の核酸配列、および第3の核酸配列を含むベクターを含み、ここで、第1の核酸配列が、第1の転写制御エレメントに作動可能に連結された目的の配列を含み、第2の核酸配列が、第2の転写制御エレメントに作動可能に連結され、かつ第1の核酸配列の発現を制御するポリペプチドをコードし、第3の核酸配列が、第1の転写制御エレメントに作動可能に連結された調節因子配列を含み、第1および第2の転写制御エレメントが反対の方向に配向している、遺伝子移入構築物が具体的に開示される。
第1の核酸配列、第2の核酸配列、および第3の核酸配列を含むベクターを含み、ここで、第1の核酸配列、第2の核酸配列、および第3の核酸配列が、単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、第1の核酸配列が目的の配列を含み、第2の核酸配列が、第1の核酸配列の発現を制御可能であるポリペプチドをコードし、第3の核酸配列が、第1の転写制御エレメントに作動可能に連結されている調節因子配列を含み、転写制御エレメントが第1および第2の核酸配列の発現を駆動可能である、遺伝子移入構築物もまた開示される。
遺伝子移入構築物のベクターはウイルスベクターであり得、ウイルスベクターは、選択的に、自己不活化ベクターであり得る。さらに、遺伝子移入ベクターの第1の核酸配列の発現は、調節可能であり得る。
本明細書に開示される遺伝子移入構築物を含む細胞および細胞株もまた開示される。
RNA搬出エレメントを選択的に含む構築物もまた開示される。「RNA搬出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質までのRNA転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントをいう。RNA搬出エレメントの例には以下が含まれるがこれらに限定されない:ヒト免疫不全ウイルス(HIV)rev応答性エレメント(RRE)(例えば、Cullenら(1991)J.Virol.65:1053;およびCullenら(1991)Cell 58:423−426)、およびB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント(PRE)(例えば、Huangら(1995)Molec.and Cell.Biol.15(7):3864−3869;Huangら(1994)J.Virol.68(5):3193−3199;Huangら(1993)Molec.and Cell.Biol 13(12):7476−7486、および米国特許第5,744,326号を参照のこと。これらの参考文献は、RNA搬出エレメントのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。一般的に、RNA搬出エレメントは、遺伝子の3’UTR内に配置され、1コピーまたは複数コピーとして挿入することができる。RNA搬出エレメントは、本発明のパッケージング細胞株を生成する別個のベクターのいずれかまたはすべてに挿入することができる。
本明細書に開示される構築物は、Tatをコードする核酸配列を選択的に含み得る。Revをコードする核酸配列を選択的に含み得る構築物もまた開示される。上記TatおよびRevをコードする核酸配列は、上記GagまたはGag−Polをコードする核酸配列の一部、またはそれとは別個であるかのいずれかであり得る。TatおよびRevをコードする核酸配列は、それぞれ、転写レベルおよび翻訳レベルで、HIV遺伝子発現を調節する。例えば、HIV長末端反復(LTR)の弱い基礎転写活性に起因して、プロウイルスの発現は、Tat、Rev、およびNefタンパク質をコードする、少量の多重スプライシング転写物を生じる。Tatは、新生RNAの中のステム−ループ構造(トランス活性化応答性エレメント[TAR])に結合することによって、HIV転写を劇的に増加し、それによって、ポリメラーゼII複合体による転写伸長を刺激するサイクリン−キナーゼ複合体を補充する。
具体的には、Revは、すべてスプライスされていないウイルスmRNAおよび不完全にスプライスされているウイルスmRNAの一部である、そのRev応答性エレメント(RRE)RNA標的配列に直接的に結合する、核細胞質シャトルタンパク質である。多量体形成および引き続く細胞補因子との相互作用に際して、Revは、核エンベロープを横切るこれらのmRNAの移行を促進し、後期ウイルスタンパク質の産生に導く。
Revは、HIV転写物のエンベロープコード領域において天然に見い出されるRNAモチーフ(RRE)と、細胞核搬出機構の成分との間の接続因子として働くことによってこの効果を達成する。Rev結合配列は、インビトロもしくはインビボでRevに(典型的にはRNAに)特異的に結合する核酸、またはインビトロもしくはインビボでRevに(すなわち、RNAもしくはDNAに)特異的に結合する核酸である。いくつかの学術論文が、Rev結合をモニターするためのインビトロ結合アッセイを記載しており、これには、Wong−Staalら(1991)Viral And Cellular Factors that Bind to the Rev Response Element in Genetic Structure and Regulation of HIV(Haseltine and Wong−Staal編;part of the Harvard AIDS Institute Series on Gene Regulation of Human Retroviruses,Volume 1),311−322頁、および、ヒト血液を含む生物学的サンプル中でのRevの検出のためのゲル移動度シフトアッセイおよびフットプリントアッセイを記載する、この論文中で引用されている参考文献が含まれる。これらの参考文献は、Rev結合をモニターするための結合アッセイのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書に開示される構築物は、RREを含む核酸配列を選択的に含み得る。RREは、HIV転写物のエンベロープコード領域において見出され、細胞核搬出機構の成分である。上記に議論したように、RREおよびRevの多量体形成および引き続く複数の細胞補因子との相互作用に際して、核エンベロープを横切るこれらのウイルスmRNAの移行が起こり得る。
内部リボソーム侵入部位(IRES)および内部リボソーム侵入部位様エレメントもまた開示される。内部リボソーム侵入部位(IRES)は、翻訳開始コドンの上流にあるいくつかの真核生物およびウイルスのメッセンジャーRNA上への40Sリボソームサブユニットの内部侵入を媒介することが可能であるシス作用性RNA配列である。IRESの配列は非常に多様であり、かつmRNAの増えつつあるリストに存在しているが、IRESエレメントは、IRES機能のために必須であるらしい保存性Yn−Xm−AUG単位(Y、ピリミジン;X、ヌクレオチド)を含む。新規なIRES配列は、毎年、公的なデータベースに継続して加え続けられており、未知のIRES配列のリストは、確実にさらにより大きい。
IRES様エレメントもまた、翻訳開始コドンの上流にあるいくつかの真核生物およびウイルスのメッセンジャーRNA上への40Sリボソームサブユニットの内部侵入を媒介することが可能であるシス作用性配列である。IRESエレメントとは異なり、IRES様エレメントにおいては、IRES機能のために必須であるらしいYn−Xm−AUG単位(Y、ピリミジン;X、ヌクレオチド)は必要とされない。
本明細書に開示される構築物は、選択的に、IRESおよびIRES様エレメントを含み得る。例えば、本明細書に開示されるパッケージング構築物は、第1の核酸配列と第2の核酸配列の間のエレメントをさらに含み得、ここで、このエレメントは、第1の核酸配列および第2の核酸配列の示差的発現を提供する。さらなる例において、第1の核酸配列と第2の核酸配列の間のエレメントは、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントであり得る。さらなる例において、本明細書に開示されるパッケージング構築物は、第1の核酸配列または第2の核酸配列と、第3の核酸配列の間のエレメントをさらに含み得、ここで、第3の核酸配列は、第1の核酸配列と第2の核酸配列の間に位置せず、このエレメントは、第1の核酸配列または第2の核酸配列と、第3の核酸配列の間の示差的発現を提供する。
IRESまたはIRES様エレメントは、天然に存在し得るかまたは天然に存在し得ない。IRESの例には、http://ifr31w3.toulouse.inserm.fr/IRESdatabase/におけるIRESデータベース中に存在するIRESが含まれるがこれに限定されない。IRESの例には、EMC−ウイルスIRESまたはHCV−ウイルスIRESもまた含まれるがこれらに限定されない。加えて、IRESまたはIRES様エレメントは変異させることができ、ここで、IRESまたはIRES様エレメントの機能は保持される。
転写制御エレメント(TCE)もまた開示される。TCEは、それらに作動可能に連結された核酸配列の発現を駆動可能であるエレメントである。本明細書に開示される構築物は、少なくとも1つのTCEを含む。TCEは、選択的に、構成的または調節可能であり得る。
反対方向に配向されている第1および第2の転写制御エレメントを含み、ここで、1つの転写制御エレメントの活性が、他の転写制御エレメントの活性に影響を与えることができる構築物もまた開示される。選択的に、2つの転写制御エレメントは並列させることができ、またはリンカー配列は、第1の転写制御エレメントと第2の転写制御エレメントとの間に配置することができる。例えば、リンカー配列は染色体インシュレーター(chromosomal insulator)であり得る。
調節可能なTCEは、調節因子構築物から発現される融合タンパク質の結合ドメインに結合されることが可能である核酸配列を含み得、その結果、転写抑制ドメインは、調節可能なTCEの中に含まれる核酸配列の転写を抑制するように作用する。
調節因子構築物および調節因子配列もまた開示される。調節因子構築物は、調節因子配列を含む構築物であり得る。調節因子配列は、調節因子標的配列に作動可能に連結された配列の発現を制御可能である配列であり得る。例えば、調節因子配列は、本明細書の他の箇所に記載される核酸構築物中の調節因子標的配列に作動可能に連結された核酸配列の発現を制御するポリペプチドをコード可能である配列であり得る。例えば、調節因子構築物は、DNA結合ドメインおよび転写抑制ドメインを含む、薬物制御可能な(例えば、薬物誘導可能な)抑制因子融合タンパク質をコード可能な核酸配列を含む構築物であり得る。代替として、調節可能なTCEを含む構築物は、DNA結合ドメインおよび転写抑制ドメインを含む、薬物制御可能な(例えば、薬物誘導可能な)抑制因子融合タンパク質をコード可能な核酸配列をさらに含むことができる。このような配置において、薬物制御可能な(例えば、薬物誘導可能な)抑制因子融合タンパク質をコード可能な核酸配列は、抑制因子融合タンパク質が結合する調節可能なTCEと同じ構築物上にある。例えば、パッケージング構築物および遺伝子移入構築物は、薬物制御可能な(例えば、薬物誘導可能な)抑制因子融合タンパク質をコード可能な核酸配列と、抑制因子融合タンパク質が結合する調節可能なTCEの両方を含み得る。
本明細書を通して議論されるように、本明細書に開示される構築物は、調節因子配列、調節因子標的配列を含む調節可能なTCE、またはその両方を含み得る。調節因子構築物は、テトラサイクリン抑制因子(tetR)またはtetO配列に結合できるテトラサイクリン活性化因子(tetA)(さもなくば、リバースtetR−VP16として知られる)タンパク質をコード可能である調節因子配列を含み得る。tetO配列はTCEの中にあり得る。調節因子構築物は、SV40核局在化シグナルなどの核局在化シグナルをコードする核酸配列を選択的に含み得る。例えば、制御因子構築物は、配列番号1の配列を含み得る。さらに、調節因子構築物は、1つ以上のVP16最小トランス活性化ドメインを選択的に含み得る。例えば、制御因子構築物は、配列番号2または配列番号3の配列を含み得る。tetR−VP16はまた、「tet−オフ」と呼ぶことができる。リバースtetR−VP16はまた、「tet−オン」と呼ぶことができる。
調節因子構築物は、tetRタンパク質とtetAタンパク質の間のヘテロ二量体の形成を妨害するための、tetRとtetAの変更バージョンを選択的に含み得る。tetRとtetAの変更バージョンは、独立しているかまたは組み合わせたかのいずれかである、EおよびBtetオペレーターDNA結合ドメインを含み得る。例えば、調節因子構築物は、配列番号4または配列番号5の配列を含み得る。
調節可能なTCEは、調節因子標的配列を選択的に含み得る。調節因子標的配列は、調節因子構築物から発現される融合タンパク質の結合ドメインに結合可能である核酸配列を含むことができ、その結果、転写抑制ドメインは、調節可能なTCEの中に含まれる核酸配列の転写を抑制するように働く。調節因子標的配列は、1つ以上のtetオペレーター配列(tetO)を含み得る。調節因子標的配列は、TATAボックスまたはGAL−4をコードする核酸配列を含むがこれらに限定されない他の配列に作動可能に連結することができる。
本明細書に記載される遺伝子移入構築物は、第2の調節因子配列を選択的に含み得る。例えば、本明細書に記載するような遺伝子移入構築物は、第2の調節因子配列および第2の目的の配列に作動可能に連結された第2のGAL−4をコードする核酸配列を選択的に含み得、ここで、第2の目的の配列は第3の転写制御エレメントに作動可能に連結され、第2の目的の配列は、マイクロRNA、shRNA、およびsiRNAからなる群より選択され、第2の調節因子配列は、第2のGAL−4をコードする核酸配列と、第2の目的の配列の間に位置する。
調節可能なTCEおよび調節因子配列の存在は、これらが同じ構築物上にあるか、または異なる構築物上にあるかに関わらず、調節可能なTCEに作動可能に連結された配列の誘導性かつ可逆的発現を可能にする。このようなものとして、調節可能なTCEは、目的の配列の発現を選択的に誘導および逆転するための手段を提供する。
調節可能なTCEは、例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能であり得る。さらに、TCEは、少なくとも1つのtetオペレーター配列を選択的に含み得る。1つの例において、少なくとも1つのtetオペレーター配列は、TATAボックスに作動可能に連結することができる。
さらに、TCEは、本明細書の他の箇所に記載されるように、プロモーターであり得る。本明細書に開示されるパッケージング構築物とともに有用であるプロモーターの例は、本明細書を通して与えられる。例えば、プロモーターには、CMVベースのプロモーター、CAGプロモーター、SV40ベースのプロモーター、熱ショックタンパク質プロモーター、mH1プロモーター、hH1プロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、U6プロモーター、ユビキチンCプロモーター、またはEF−1αプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
加えて、本明細書に開示されるTCEは、互いに作動可能に連結される1つ以上のプロモーター、プロモーターの一部、または互いに作動可能に連結されるプロモーターの一部を含み得る。例えば、転写制御エレメントは、CMVプロモーターの3’部分、CMVプロモーターの5’部分、β−アクチンプロモーターの一部、またはCAGプロモーターに作動可能に連結された3’CMVプロモーターを含み得るがこれらに限定されない。
哺乳動物宿主細胞中でベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えば、ウイルスのゲノム、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、および大部分の好ましいサイトメガロウイルスから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、β−アクチンプロモーターから入手することができる。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点もまた含むSV40制限フラグメントとして好都合に入手することができる(Fiersら、Nature,273:113(1978)、これは、ウイルスプロモーターについてその全体が参照により本明細書に援用される)。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIII E制限フラグメントとして好都合に入手することができる(Greenway,P.J.ら、Gene 18:355 360(1982)これは、ウイルスプロモーターについてその全体が参照により本明細書に援用される)。当然、宿主細胞または関連する種からのプロモーターもまた本明細書で有用であり、組織特異的遺伝子発現および組織特異的に調節される遺伝子発現のために使用することができる。引用される参考文献は、プロモーターのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
「エンハンサー」とは、一般的には、転写開始部位から固定されていない距離で機能するDNAの配列をいい、転写単位に対して5’(Laimins,L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.78:993(1981))または3’(Lusky,M.L.ら、Mol.Cell Bio.3:1108(1983))のいずれかであり得る。引用される参考文献の各々は、エンハンサーのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。さらに、エンハンサーは、イントロンの中に(Banerji,J.L.ら、Cell 33:729(1983))、ならびにコード配列それ自体の中に(Osborne,T.F.ら、Mol.Cell Bio.4:1293(1984))あり得る。引用された参考文献の各々は、エンハンサーの潜在的な位置のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。これらのエンハンサーは通常10から300bp長の間であり、これらはシスで機能する。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写の調節を媒介する応答性エレメントを含む。プロモーターはまた、転写の調節を媒介する応答性エレメントを含み得る。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。今日、哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、およびインスリン)からの多くのエンハンサー配列が知られているが、代表的には、一般的な発現のために真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(bp 100 270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーターおよび/またはエンハンサーは、それらの機能の引き金を引く、光または特異的化学的事象のいずれかによって特異的に活性化することができる。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。γ照射などの照射、またはアルキル化化学療法薬物への曝露によって、ウイルスベクター遺伝子発現を増強するための方法もまた存在する。
特定の実施形態において、プロモーターおよび/またはエンハンサー領域は、発現される転写単位の領域の発現を最大化するために、構成的プロモーターおよび/またはエンハンサーとして作用することができる。特定の構築物において、プロモーターおよび/またはエンハンサーは、たとえそれが特定の時点で特定の型の細胞において発現されるのみであるにしても、すべての真核生物細胞型で活性である。この型の好ましいプロモーターはCMVプロモーターである(650塩基)。他の好ましいプロモーターは、SV40プロモーター、サイトメガロウイルス(全長プロモーター)、およびレトロウイルスベクターLTRである。
二方向性制御エレメントもまた開示される。例えば、CAGプロモーターの5’末端に融合されたCMVプロモーターの3’末端を含む二方向性転写制御エレメントが本明細書に開示される。ヒトEF−1αプロモーターの5’末端に誘導されたCMVプロモーターの3’末端を含む二方向性転写制御エレメントもまた本明細書に開示される。CAGプロモーターの5’末端に融合されたマウスH1プロモーターの5’を含む二方向性転写制御エレメントもまた本明細書に開示される。SV40プロモーターの5’末端に融合されたCMVプロモーターの3’末端を含む二方向性転写制御エレメントもまた本明細書に開示される。本明細書の他の箇所に開示される転写制御エレメントとしての二方向性転写制御エレメントは、調製可能または構成的であり得る。ef1αプロモーターの5’末端に融合されたCMVプロモーターの5’末端を含む二方向性転写制御エレメントもまた開示される。
二方向性転写制御エレメントは、配列番号12、配列番号13、配列番号14、または配列番号51に示される配列を含み得る。二方向性転写制御エレメントはまた、調節因子標的配列を含み得、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの抗生物質によって調節することができる。
すべての特異的調節エレメントは、クローニングし、黒色腫細胞などの特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用できることが示されてきた。グリア細胞繊維性酢酸タンパク質(GFAP)プロモーターは、グリア細胞起源の遺伝子を選択的に発現するために使用されてきた。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞)において使用される発現ベクターもまた、mRNA発現に影響を与えることができる転写の終結のために必要である配列を含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。この3’非翻訳領域もまた、転写終結部位を含む。転写単位もまたポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の1つの利点は、mRNAのように転写単位がプロセスされ、かつ輸送される可能性をこれが増加させることである。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物中で使用されることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、SV40初期ポリアデニル化シグナルから誘導され、約400塩基からなる。転写単位は、構築物からの発現、またはその安定性を改善するために、単独で、または上記の配列と組み合わせた、他の標準的な配列を含むこともまた好ましい。
Creリコンビナーゼは、loxP部位間のDNAの部位特異的組換えを触媒する、バクテリオファージP1からのI型トポイソメラーゼである(Abremski,K.およびHoess,R.(1984)J.Biol.Chem.,259,1509−1514、これは、Creリコンビナーゼの構造および機能のその教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される)。この酵素はエネルギー補因子を必要とせず、Cre媒介性組換えは、基質と反応生成物の間の平衡に達する(Abremski,K.ら(1983)Cell,32,1301−1311、これは、Creリコンビナーゼの作用のメカニズムの教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される)。loxP認識エレメントは、方向性を付与する8bpスペーサー領域に隣接する2つの13bp逆反復から構成される、34塩基対(bp)配列である(Metzger,D.およびFeil,R.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.,10,470−476、これは、loxP認識エレメントおよびCreリコンビナーゼの作用におけるそれらの役割のその教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される)。組換え生成物は、loxP部位の位置および相対的配向に依存する。単一のloxP部位を含む2つのDNA種は融合させることができる。直接的に反復するloxP部位の間のDNAは環状型で切除されるのに対して、対向するloxP部位間のDNAは、外部配列に関して反転される。
本明細書に記載される遺伝子移入構築物の転写制御エレメントに作動可能に連結された核酸配列の発現もまた、Creリコンビナーゼによって調節することができる。例えば、遺伝子移入構築物は、第1の核酸配列、第2の核酸配列、第3の核酸配列、および選択マーカーをコード可能である核酸配列を含む調節因子標的配列を含み、第1の核酸配列が第1の転写制御エレメントに作動可能に連結された目的の配列を含み、第2の核酸配列が第2の転写制御エレメントに作動可能に連結され、かつ第1の核酸配列の発現を制御するポリペプチドをコードし、第3の核酸配列が第1の転写制御エレメントに作動可能に連結された調節因子配列を含み、調節因子標的配列もまた、第1の転写制御エレメントに作動可能に連結され、かつ第1の転写制御エレメントと第1の核酸配列の間に位置している、ベクターを含み得る。このような配置において、調節因子標的配列は、少なくとも1つのtetオペレーター配列にさらに連結することができる、TATA配列によって隣接させることができる。付随する配列を有する調節因子標的配列は、loxP部位によってさらに隣接させることができ、その結果、Cre媒介性組換えの際に、調節因子標的配列は切除され、目的の配列は、第1の転写制御エレメントと融合させることができ、目的の配列の発現を可能にする。
第1の核酸配列が第1の転写制御配列に作動可能に連結され、第2の核酸配列が第2の転写制御配列に作動可能に連結されているパッケージング構築物もまた本明細書に開示される。第1の核酸配列および第2の核酸配列が第1の転写制御エレメントに作動可能に連結され、第3の核酸配列が第2の制御エレメントに作動可能に連結されているパッケージング構築物もまた開示される。
選択的に、第1の制御エレメントは第2の転写制御エレメントよりも強力であり得る。このような配置において、第1のTCEに作動可能に連結された配列の発現は、第2のTCEに作動可能に連結された配列の発現よりも高い。例えば、第1のTCEに作動可能に連結された配列と、第2のTCEに作動可能に連結された配列の間の発現の比率は、約99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:1,6 83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39、60:40、または任意の介在する比率であり得る。
反対の方向である2つのプロモーター、および二方向性プロモーターを含むパッケージング構築物がさらに開示される。例えば、第1の核酸配列および第2の核酸配列は、反対の方向で発現させることができる。別の例において、第1の核酸配列および第2の核酸配列は、第3の核酸配列の反対の方向で発現させることができる。選択的に、マーカーをコードする配列および目的の遺伝子は、反対の方向で発現させることができる。さらに、第1の核酸配列は第1の転写制御エレメントに作動可能に連結することができ、第2の核酸配列は第2の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。さらに、第1の核酸配列および第2の核酸配列は第1の転写制御エレメントおよび第3の核酸配列に作動可能に連結することができ、第3の核酸配列は第2の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。第1および第2の転写制御エレメントは同じであり得、または異なり得る。さらに、少なくとも1つの転写制御エレメントは調節可能であり得る。また、第1および第2の核酸配列は、調節可能であり得る単一の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。さらに、第1の核酸配列、第2の核酸配列、および第3の核酸配列は、調節可能であり得る単一の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。単一の転写制御エレメントはまた、これもまた調節可能であり得る二方向性プロモーターであり得る。
代表的なプロモーターは、最小プロモーターおよび他の上流シスエレメントからなる。Lewin,B. Gene VI(Oxford University Press,Oxford,1997),Odell,J.T.,Nagy,F.& Chua,N.−H.Nature 313,810−812(1990)、およびBenfey,P.N.& Chua,N.−H.Science 250,959−966(1990)。最小プロモーターは、本質的に、RNAポリメラーゼが転写を開始するために結合するが、それ自体、転写活性を有さないTATAボックス領域である。Benfey,P.N.& Chua,N.−H.Science 250,959−966(1990)。シスエレメントは、特定の転写因子による結合の際に、個々にまたは組み合わせて、プロモーターの空間的−時間的発現パターンを決定する(Benfey,P.N.& Chua,N.−H.Science 250,959−966(1990))。米国特許第5,814,618号は、複数のtetオペレーター配列(エンハンサーまたはリプレッサーとして本明細書中で定義される)および最小プロモーターを有する二方向性プロモーターを開示している。米国特許第5,955,646号は、二方向性異種構築物を開示している。米国特許第5,368,855号は、天然に存在する二方向性プロモーターを開示している。米国特許第5,359,142号は、遺伝子発現の増強におけるバリエーションを許容するために操作された構築物を開示している。米国特許第5,627,046号は、天然に存在する二方向性プロモーターを開示している。米国特許第5,827,693号は、修飾ヘモグロビンプロモーターを開示している。これらのすべての参考文献は、二方向性プロモーターのそれらの教示に関して、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
Gag−Proタンパク質およびGag−Pro−Polタンパク質の合成のために必要とされる、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する、Gagタンパク質およびGag−Pro−Polタンパク質をコードする核酸配列中の1つ以上の変異を含むパッケージング構築物もまた本明細書に開示される。Gag−Proタンパク質およびGag−Proタンパク質の合成のために必要とされる、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する、1つ以上の変異を含むパッケージング構築物もまた開示される。
GagおよびGag−Polは、1型HIV(HIV−1)およびSIV感染細胞中で、約20:1のモル比で、同じmRNA転写物から天然に作製される。この比率は、gagとpolのリーディングフレームの間、またはgagとproのリーディングフレームの間の重複の領域におけるリボソームのフレームシフトまたはリードスルーによって達成される(Swanstrom,R.,およびJ.W.Wills.1997.Synthesis,assembly,and processing of viral proteins,263−334頁.J.M.Coffin,S.H.Hughes,およびH.E.Varmus(編),Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.、これは、フレームシフトのその教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。成熟ビリオンの触媒サブユニットへの前駆体として、Polはビリオン成熟および感染性のために必須であり、アセンブルしているウイルス粒子へのその組み込みは、Gagとのその結合に依存する(同上)。gag−polフレームシフト部位は、RNA二次構造の領域がすぐ下流に続く保存性7ヌクレオチド滑り配列(UUUUUUA)配列番号7からなる(Swanstrom,R.,およびJ.W.Wills.1997.Synthesis,assembly,and processing of viral proteins,263−334頁.J.M.Coffin,S.H.Hughes,およびH.E.Varmus(編),Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。リボソームフレームシフトは、フェニルアラニンおよびロイシンについてのtRNA(コドンUUU UUA;配列番号8がgagフレームと比較して1ヌクレオチド(−1)逆流して、polリーディングフレーム中で翻訳が継続するときに(UUU UUA;配列番号8)−>UUU UUU(配列番号9))、滑り配列中で物理的に起こる(Jacks,T.,M.D.Power,F.R.Masiarz,P.A.Luciw,P.J.Barr,およびH.E.Varmus.1988.Characterization of ribosomal frameshifting in HIV−I gag−pol expression.Nature 331:280−283、これは、HIV−1におけるリボソームフレームシフトのその教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。例えば、変異は、フレームシフトのために必要とされるループ構造を破壊することができる。このことは、ループ構造を破壊するために個々のヌクレオチドを変化または除去することによって達成することができる。
例えば、図3は、フレームシフトのために必要とされるHIV gagおよびHIV gag−polのループ構造を示す。図4は、フレームシフトのために必要とされるループ構造の破壊を生じる、フレームシフトのために必要とされるHIV gagおよびHIV gag−polのループ構造の配列の変化を示す。第1の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるgag配列およびgag−pol配列の変異を含むパッケージング構築物が開示される。選択的に、フレームシフトのために必要とされるgag配列は、点変異を含み得る。例えば、フレームシフトのために必要とされるgag配列は、図1に提示されるような点変異を含み得る。選択的に、第1の核酸配列は、配列番号10のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、第2の核酸配列は、図2に提示されるような単一のヌクレオチド挿入ならびにいくつかの点変異を含み得る。選択的に、第2の核酸配列は、配列番号11のヌクレオチド配列を含み得る。
異なる種間でのコドン優先度は劇的に異なり得る。特定の発現系(大腸菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞)における外来性タンパク質の発現レベルを増強するために、宿主発現系のコドン頻度と一致するように外来性タンパク質のコドン頻度を調整することが非常に重要であり得る。このプロセスはコドン最適化として知られている。コドン最適化とは、コドン使用頻度を、目的の細胞/種の中で利用可能なtRNAプールと一致させるための遺伝子配列の変更をいう。コドン最適化は、重複しているリーディングフレームならびにコード領域中に埋め込まれている構造エレメントを一般的に含み;これらの特徴は大きなDNAウイルス間では広範ではない、小さなRNAウイルスおよびDNAウイルスからの遺伝子によるタンパク質発現を増加させるための強力なツールとして出現した。
1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)のコドン最適化env遺伝子(Andre,S.,B.Seed,J.Eberle,W.Schraut,A.Bultmann,およびJ.Haas.1998.Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage.J.Virol.72:1497−1503)およびgag遺伝子(Deml,L.,A.Bojak,S.Steck,M.Graf,J.Wild,R.Schirmbeck,H.Wolf,およびR.Wagner.2001.Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein.J.Virol.75:10991−11001;zur Megede,J.,M.C.Chen,B.Doe,M.Schaefer,C.E.Greer,.M.Selby,G.R.Otten,およびS.W.Barnett.2000.Increased expression and immunogenicity of sequence−modified human immunodeficiency virus type 1 gag gene.J.Virol.74:2628−2635)を用いる免疫は、遺伝子の発現の増強および抗原に対する免疫応答の改善に導く。Listeria(Nagata,T.,M.Uchijima,A.Yoshida,M.Kawashima,およびY.Koide.1999.Codon optimization effect on translational efficiency of DNA vaccine in mammalian cells:analysis of plasmid DNA encoding a CTL epitope derived from microorganisms.Biochem.Biophys.Res.Commun.261:445−451)、細菌が産生する破傷風毒素(Stratford,R.,G.Douce,L.Zhang−Barber,N.Fairweather,J.Eskola,およびG.Dougan.2000.Influence of codon usage on the immunogenicity of a DNA vaccine against tetanus.Vaccine 19:810−815)、Plasmodium(Nagata,T.,M.Uchijima,A.Yoshida,M.Kawashima,およびY.Koide.1999.Codon optimization effect on translational efficiency of DNA vaccine in mammalian cells:analysis of plasmid DNA encoding a CTL epitope derived from microorganisms.Biochem.Biophys.Res.Commun.261:445−451)、ヒトパピローマウイルス(Cid−Arregui,A.,V.Juarez,およびH.zur Hausen.2003.A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16 that yields enhanced expression of the protein in mammalian cells and is useful for DNA immunization studies.J.Virol.77:4928−4937;Liu,W.,F.Gao,K.Zhao,W.Zhao,G.Fernando,R.Thomas,およびI.Frazer.2002.Codon modified human papillomavirus type 16 E7 DNA vaccine enhances cytotoxic T−lymphocyte induction and anti−tumour activity.Virology 301:43−52)、およびその他(Gurunathan,S.,D.M.Klinman,およびR.A.Seder.2000.DNA vaccines:immunology,application,and optimization.Annu.Rev.Immunol.18:927−974)などの種々の他の病原性生物を用いて実施された同様の研究は、DNAワクチンの効力を増強するためのコドン最適化の潜在能力を確認した。コドン最適化は、当業者によって公知である種々の技術を使用して実施することができる。例えば、Ramakrishna L,Anand KK,Mohankumar KM,Ranga U.J Virol.2004 Sep;78(l7):9174−89に記載される方法を使用することができる。引用される参考文献のすべては、コドン最適化のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
コドン最適化が利用されているパッケージング構築物もまた開示される。例えば、第1の核酸配列がコドン最適化されるように、本明細書に記載のパッケージング構築物を修飾することができる。別の実施形態において、第2の核酸配列をコドン最適化することができる。また、第1の核酸と第2の核酸の両方をコドン最適化することができる。
複製可能でない組換え体を生成可能であるパッケージング構築物もまた開示される。複製可能な組換え体を生成可能でないパッケージング構築物もまた本明細書に開示される。上記に議論されたように、レトロウイルスベクター、特に、分裂していない細胞を感染させることが可能であるレンチウイルスに付随する利点の観点において、複製可能でないヘルパーウイルスを含まない組換えウイルスの純粋なストックを生成するための方法の改善は、多くの研究の対象であった。組換えレトロウイルスは、一般的に、所望の組換えRNAのキャプシド形成のために必要なウイルスタンパク質を産生するが、しかしウイルスRNAをパッケージングするためのシグナル(Ψ配列)を欠く哺乳動物細胞(「パッケージング細胞」)に、適切なプロウイルスDNAベクターを導入することによって産生される。したがって、レトロウイルスの必要とされるgag、pol、およびenv遺伝子がインタクトであるのに対して、これらのパッケージング株による野生型ヘルパーウイルスの放出は存在しない。しかし、パッケージングのために必要とされるΨ配列を含む別個のベクターで細胞がトランスフェクトされる場合に、野生型レトロウイルスは組換えによって生じ得る(Mannら(1983)Cell 33:153)。このことは、特に、HIVなどのレンチウイルスの場合において、および遺伝子治療などのベクターの特定の適用のために、顕著な安全性の危険を表し得る。
複製可能なヘルパーウイルスの産生に導く組換えに付随する危険を回避するための現在のアプローチには、パッケージング株を作製するために使用されるウイルス構築物におけるさらなる変異(例えば、LTR欠失)を作製すること、およびビリオンを別個のプラスミドに産生するために必要なウイルス遺伝子を分離することが含まれる。例えば、検出可能なヘルパーウイルスを含まない、組換えモロニーマウス白血病ウイルス(MuLV)は、パッケージング細胞中で、env遺伝子からgagおよびpol遺伝子を分離することによって産生することができることが最近示されてきた(Markowitzら(1998)J.Virol.62(4):1120)。これらのパッケージング細胞は、ビリオン産生のために必要なウイルスタンパク質を集合的にコードする2つの別個のプラスミドを含み、Ψパッケージングシグナルを含む第3のベクターで同時トランスフェクトされたときに、インタクトなレトロウイルスを産生するために必要な組換え事象(すなわち、3つのプラスミドベクター間)が起こる可能性を減少した。
本明細書に開示される構築物は、核局在化シグナルをコードする核酸配列を選択的に含み得る。加えて、本明細書に開示される構築物は、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された、核局在化シグナルをコードする核酸配列を選択的に含み得る。例えば、本明細書に開示される構築物は、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸、例えば、tet−onに作動可能に連結された、核局在化シグナルをコードする核酸配列を選択的に含み得る。核局在化配列は、細胞質から核膜、それゆえに核までポリペプチドを方向付けるものである。核局在化シグナルをコードする核酸は、転写制御エレメントをさらに含み得る。転写制御エレメントは本明細書の他の箇所で開示される。核局在化シグナルをコードする核酸配列には、例えば、4個のグリシン残基を含み、セリン残基が続く配列番号15(GGGGS)をコードし得る少なくとも1つのリンカー配列もまた隣接することができる。リンカー配列は染色体インシュレーターであり、一般的配列でもあり得る。一般的に、リンカー配列は、融合タンパク質の各機能的ドメインの干渉を減少するように働く。例えば、リンカー配列は、tet RもしくはtetAタンパク質、SV40 NLS、VP16、またはZNF10サイレンシングタンパク質への干渉を減少することができる。染色体インシュレーターであるリンカーは、誘導性プロモーターと、本明細書に開示される構築物の構成的プロモーターの間の干渉を減少することができ、それによって、誘導性プロモーターの漏出を減少する。
本明細書に開示されるパッケージング構築物を含む細胞株もまた開示される。細胞株を産生するための方法もまた、本明細書の他の箇所に記載される。
上記および下記に記載される実施形態は、本明細書に開示される組成物および方法のいずれかとともに有用である。
系
上記に議論されたパッケージング構築物とともに有用であるパッケージング構築物もまた開示される。例えば、パッケージング系は、本明細書の他の箇所で議論されるように、本発明の核酸構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含み得る。パッケージング細胞株もまた開示される。ウイルス様粒子を産生するためのパッケージング細胞株は、標的細胞、および本明細書に開示される1つのパッケージング構築物を含む。パッケージング細胞株はまた、本明細書の別の箇所で議論されるように、エンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含み得る。本明細書で使用される場合、エンベロープ糖タンパク質は、パッケージング構築物によって生成される粒子の偽型決定を許容する。エンベロープ糖タンパク質を発現可能である核酸配列を含む構築物は本明細書に記載される。例えば、エンベロープ構築物は、水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質(VSV G)およびモロニーマウス白血病ウイルス(MLV)のエンベロープを含み得る。
上記に議論されたパッケージング構築物とともに有用であるパッケージング構築物もまた開示される。例えば、パッケージング系は、本明細書の他の箇所で議論されるように、本発明の核酸構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含み得る。パッケージング細胞株もまた開示される。ウイルス様粒子を産生するためのパッケージング細胞株は、標的細胞、および本明細書に開示される1つのパッケージング構築物を含む。パッケージング細胞株はまた、本明細書の別の箇所で議論されるように、エンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含み得る。本明細書で使用される場合、エンベロープ糖タンパク質は、パッケージング構築物によって生成される粒子の偽型決定を許容する。エンベロープ糖タンパク質を発現可能である核酸配列を含む構築物は本明細書に記載される。例えば、エンベロープ構築物は、水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質(VSV G)およびモロニーマウス白血病ウイルス(MLV)のエンベロープを含み得る。
パッケージング構築物が、GagおよびGag−Pro−Polについての核酸をトランスで含むパッケージングおよび発現系もまた本明細書で開示される。例えば、第1、第2、および第3のパッケージング構築物を含む発現系が開示される。第1のパッケージング構築物は、Gagポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第1の核酸構築物を含み、ここで、Gagをコードする核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。第2のパッケージング構築物は、Gag−Pro−Polタンパク質をコードする核酸配列を含む第2の核酸構築物を含み、ここで、Gag−Pro−Polタンパク質をコードする核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。第3の核酸構築物は、エンベロープ糖タンパク質をコードする第3の核酸配列を含み、ここで、第3の核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。これらの構築物を含むパッケージングおよび発現系はまた、少なくとも1つの目的の遺伝子を含む遺伝子移入構築物もまた含み得る。
第1の変異した核酸が転写制御エレメントに作動可能に連結される、Gagポリタンパク質をコードする第1の変異した核酸を含む第1の核酸構築物;および第2の変異した核酸は転写制御エレメントに作動可能に連結される、Gag−Polポリタンパク質をコードする第2の変異した核酸を含む第2の核酸構築物を含むパッケージング系もまた開示される。第1の核酸構築物および第2の核酸構築物中での変異は、ウイルス粒子形成を可能にするGagおよびPolポリタンパク質の発現の比率を生じる。選択的に、パッケージング系の第1の核酸は、最小CMVプロモーターに作動可能に連結することができ、第2の変異した核酸は、熱ショックタンパク質プロモーターに作動可能に連結することができる。パッケージング系の構築物との使用のために適切な他のプロモーターは、本明細書の他の箇所に記載される。
本発明の構築物およびウイルス粒子は、標的細胞(例えば、真核生物細胞)または哺乳動物(例えば、ヒトまたは他の哺乳動物もしくは脊椎動物)に目的の配列を導入するために、インビトロ、インビボ、およびエキソビボで使用することができる。細胞は、商業的にもしくは寄託機関から入手することができ、または生検などにより、哺乳動物から直接的に入手することができる。細胞は、それらが戻される哺乳動物から、または同じもしくは異なる種の別の/異なる哺乳動物から、入手することができる。例えば、本発明のパッケージング細胞株またはウイルス粒子を使用して、目的のDNAは、ブタ細胞などの非ヒト細胞に導入することができ、次いで、これはヒトに導入される。代替として、細胞は哺乳動物から単離される必要はなく、ここで、例えば、遺伝子治療において哺乳動物に本発明のウイルス粒子を送達することが所望される。
エキソビボ治療は、例えば、Kasidら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:473(1990);Rosenbergら、N.Engl.J.Med.,323:570(1990);Williamsら、Nature,310:476(1984);Dickら、Cell,42:71(1985);Kellerら、Nature,318:149(1985);およびAndersonら、米国特許第5,399,346号において記載されており、エキソビボ治療のそれらの教示のためのそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
哺乳動物に直接的にウイルス粒子を投与する(導入する)ための方法は、一般的に当業者に公知である。例えば、投与の様式には、非経口、注射、粘膜、全身性、移植、腹腔内、経口、皮内、経皮(例えば、徐放ポリマー中)、筋肉内、注入および/またはボーラス注射を含む静脈内、皮下、局所的、硬膜外などが含まれる。本発明のウイルス粒子は、好ましくは、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、および等張性塩化ナトリウム溶液などの薬学的に許容されるキャリア中で投与することができる。
投与の頻度を含む、哺乳動物に投与される本発明のウイルス粒子の投薬量は、投与の様式および経路;レシピエント哺乳動物のサイズ、齢、性別、健康、体重、および食事;治療される疾患または状態の徴候の性質および程度;同時治療の種類、治療の頻度、ならびに所望される効果を含む種々の要因に依存して変化する。
本明細書に記載されるようなパッケージング構築物を含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ核酸構築物もまた含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結され;目的の1つ以上の配列を含む遺伝子移入構築物もまた含む発現系が開示される。エンベロープ糖タンパク質が細胞への侵入を促進する発現系もまた開示される。選択的に、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス(VSV−G)のGタンパク質、または細胞への侵入を媒介するための当該分野において公知であるいくつかの他のウイルス糖タンパク質の1つなどのウイルスエンベロープ糖タンパク質であり得る。
選択的に、発現系は、上記のように、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む、核局在化シグナルをコードする構築物をさらに含み得る。核局在化配列は上記に開示される。例えば、核局在化シグナルをコードする構築物は、5’から3’のサイトメガロウイルスプロモーター、第1のリンカーをコードする配列、第2の核局在化シグナル、第2のリンカー配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列もまた含み、ここで、コードされるリンカーはGGGS(配列番号15)である。
第1のパッケージング構築物を含み、第1のパッケージング構築物がGagポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第1の核酸構築物を含み、Gagをコードする核酸配列が、フレームシフトおよび翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み、かつ少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結され、Gag−Polポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第2の核酸構築物を含む第2のパッケージング構築物もまた含み、Gag−Polをコードする核酸配列は、フレームシフトおよび翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み、かつ少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結された発現系もまた開示される。発現系はまた、エンベロープ糖タンパク質をコードする第3の核酸配列を含む第3の核酸構築物を含み、第3の核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。発現系は、目的の1つ以上の配列を含む遺伝子移入構築物もまた含む。選択的に、発現系は、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む、核局在化シグナルをコードする構築物をさらに含み得る。核局在化シグナルは、細胞質から核膜、それゆえに核までポリペプチドを方向付けるものである。
上記に開示される発現系は、テトラサイクリントランス活性化因子に作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする第4の核酸配列を含む第4の核酸構築物もまた含み得る。第4の核酸構築物は、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントをさらに含み得る。核局在化シグナルをコードする配列はまた、少なくとも1つのリンカー配列に隣接することができる。第4の核酸配列は、5’から3’のサイトメガロウイルスプロモーター、配列番号15(GGGGS)をコードする核酸配列、核局在化シグナルをコードする核酸配列、配列番号15(GGGGS)をコードする核酸配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列もまた含む。
本明細書の他の箇所に開示される発現系を含む細胞株もまた開示される。
エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、エンベロープ核酸構築物もまた開示される。エンベロープ糖タンパク質は細胞への侵入を促進することができる。エンベロープ糖タンパク質は選択的にウイルス性であり得る。1つの例において、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス(VSV−G)のGタンパク質であり得る。
シス作用性エレメントがキャプシド形成、逆転写、および組み込みのために必要とされる実施形態もまた開示される。シス作用性エレメントは、本明細書に記載される構築物を用いて、トランスまたはシスで提供することができる。例えば、Polタンパク質を発現可能である核酸配列を欠くパッケージング構築物は、Vpr−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質を(シスで)発現可能である核酸配列を選択的に含み得る。代替的には、Polタンパク質を発現可能である核酸配列を欠くパッケージング構築物は、Vpr−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質を(トランスで)発現可能である別個の核酸配列を含み得る。
本明細書の他の箇所に記載されるパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程、およびエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を細胞に導入し、ここで、核酸配列をコードするエンベロープ糖タンパク質は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される工程、および目的の1つ以上の配列を含む、本明細書の他の箇所に記載される遺伝子移入構築物を細胞に導入する工程、およびウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に細胞を維持し、このウイルス様粒子は目的の遺伝子または配列を含む、工程を包含する遺伝子移入方法もまた開示される。
目的の外因性配列を含む細胞もまた開示され、ここで、目的の配列は、上記に記載される遺伝子移入方法を使用して細胞に移入される。
本明細書に記載される構築物は、マーカー生成物をコードする核酸配列を選択的に含み得る。このマーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達されたか、一回送達されると発現されるか否かを決定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、βガラクトシダーゼをコードする大腸菌lacZ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質である。
ある実施形態において、マーカーは選択マーカーであり得る。哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログG418、ハイグロマイシン、およびピューロマイシンである。このような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移入されるとき、選択圧下に配置されるならば、形質転換された哺乳動物宿主細胞は生存できる。2つの広範に使用される別個の選択レジメのカテゴリーが存在する。第1のカテゴリーは、細胞の代謝、および補充した培地と独立して増殖する能力を欠く変異体細胞株の使用に基づく。2つの例は、CHO DHFR細胞およびマウスLTK細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の付加なしで増殖する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路のために必要とされる特定の遺伝子を欠くので、失われたヌクレオチドが補充培地中に提供されない限り、これらは生存できない。培地を補充することに対する代替は、それぞれの遺伝子を欠く細胞にインタクトなDHFRまたはTK遺伝子を導入し、それにより、それらの増殖要求性を変化させることである。DHFRまたはTK遺伝子で形質転換しなかった個々の細胞は、補充していない培地中で生存可能ではない。
第2のカテゴリーは優性選択であり、これは、任意の細胞型中で使用される選択スキームをいい、変異型細胞型の使用を必要としない。これらのスキームは、代表的には、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を使用する。新規の遺伝子を有するこれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を発現し、選択で生き残る。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン(Southern P.およびBerg,P.,J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、ミコフェノール酸(Mulligan,R.C.およびBerg,P.Science 209:1422(1980))、またはハイグロマイシン(Sugden,B.ら、Mol.Cell.Biol.5:410 413 (1985.These))を使用する。引用される参考文献は、優性選択の例のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。これらの3つの例は、適切な薬物G418もしくはネオマイシン(ジェネティシン)、xgpt(ミコフェノール酸)、またはハイグロマイシンに対する耐性をそれぞれ付与するために、真核生物の制御下で細菌遺伝子を利用する。他の例には、ネオマイシンアナログG418およびピューロマイシンが含まれる。
エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される、エンベロープ核酸構築物もまた開示される。エンベロープ糖タンパク質は細胞への侵入を促進できる。エンベロープ糖タンパク質は選択的にウイルス性であり得る。1つの例において、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質(VSV−G)であり得る。
方法
ウイルス様粒子を作製する方法が本明細書に開示される。例えば、ウイルス様粒子を作製する方法は、本明細書のパッケージング構築物を使用する工程を包含する。細胞に上記のパッケージング核酸構築物のいずれかを導入する工程;およびエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を細胞に導入し、ここで、核酸配列をコードするエンベロープ糖タンパク質は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される工程;およびウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に細胞を維持する工程を包含する、ウイルス様粒子を作製する方法もまた開示される。
ウイルス様粒子を作製する方法が本明細書に開示される。例えば、ウイルス様粒子を作製する方法は、本明細書のパッケージング構築物を使用する工程を包含する。細胞に上記のパッケージング核酸構築物のいずれかを導入する工程;およびエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を細胞に導入し、ここで、核酸配列をコードするエンベロープ糖タンパク質は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される工程;およびウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に細胞を維持する工程を包含する、ウイルス様粒子を作製する方法もまた開示される。
細胞に上記のパッケージング核酸構築物のいずれかを導入する工程;およびエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を細胞に導入し、ここで、核酸配列をコードするエンベロープ糖タンパク質は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される工程;およびウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に細胞を維持する工程を包含する、ウイルス様粒子を作製する方法が本明細書にさらに開示される。
ウイルス様粒子は、選択されたレンチウイルス配列を適切なベクター(例えば、適切な調節エレメント(例えば、プロモーターおよびエンハンサー)、クローニングのための制限部位、マーカー遺伝子などを含む市販の発現プラスミド)に挿入することによって調製することができる。これは、当該分野において周知であるように、PCRを含む標準的なクローニング技術を使用して達成することができる。このようなベクターにクローニングされるレンチウイルス配列は、レンチウイルスゲノムRNA、またはウイルスRNAに対応するcDNAを含む任意の既知の供給源から入手することができる。レンチウイルスゲノムRNAに対応する適切なcDNAは市販されており、これには例えば、HIV−1のゲノム配列を含むpNLENV−1(Maldarelliら(1991)J.Virol.65:5732)が含まれ、これは、レンチウイルスゲノムRNAに対応する適切なcDNAのその教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される。レトロウイルス(例えば、レンチウイルス)cDNAの他の供給源には、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC),Rockville,Mdが含まれる。これらの参照は、現在利用可能であるレンチウイルスゲノムRNAに対応するcDNAの例のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用され、これらのクローンは、本明細書に開示される組成物および方法において使用することができるレトロウイルスcDNAの例のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
適切なベクター(例えば、発現ベクター)に一旦クローニングされると、レトロウイルス配列(例えば、gag、pol、env、LTR、およびシス作用性配列)は、本明細書に記載されるように修飾することができる。1つの実施形態において、pNLENV−1などのプラスミドから増幅されたレンチウイルス配列は、pUCベクター(例えば、pUC19)(University of California,San Francisco)、pBR322、またはpcDNA1(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,California)などの適切なバックボーンベクターにクローニングし、次いで、欠失(制限酵素を使用する)、置換(例えば、部位特異的変異誘発を使用する)、または他の(例えば、化学的)修飾によって修飾して、選択したレンチウイルス配列の発現または機能を妨害することができる。本明細書に記載されるように、gag、pol、およびenv遺伝子は、選択したアクセサリー遺伝子とともに、除去または変異させることができる。例えば、1つの実施形態において、GagおよびGag−Pro−Polポリタンパク質をコードする核酸配列は、Gag−ProおよびGag−Pro−Polポリタンパク質の合成のために必要とされるフレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少するように変異される。
本発明の各ベクターは、所望のレンチウイルスタンパク質(例えば、gag、pol、およびenv)をコードするため、または所望のレンチウイルスの機能(例えば、RNAのパッケージング)を方向付けるために必要な最小レンチウイルス配列を含み得る。すなわち、ベクターの残りは、好ましくは、非ウイルス起源であり、またはレンチウイルス(例えば、HIV)以外のウイルスからである。1つの実施形態において、本発明のレトロウイルスベクターに含まれるレンチウイルスLTRは、別のウイルスからの機能的に類似の配列でLTRの一部を置き換え、ハイブリッドLTRを作製することによって修飾される。例えば、プロモーターとして働くレンチウイルス5’LTRは、CMVプロモーターまたは異なるレトロウイルス(例えば、MuLVまたはMuSV)からのLTRによって部分的に置き換えることができる。代替的に、またはそれに加えて、レンチウイルス3’LTRは、別の遺伝子またはレトロウイルスからのポリアデニル化によって部分的に置き換えることができる。選択的に、HIV−1 3’LTRは、ウサギβ−グロビン遺伝子のポリアデニル化配列によって置き換えられる。この様式で本発明のベクター中の全体のレンチウイルス配列を最小化することによって、複製可能なヘルパーレンチウイルスに導く、ベクター間の組換えの機会は大きく減少する。
任意の適切な発現ベクターが本発明において利用できる。本明細書に記載されるように、適切な発現構築物は、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター構築物を含み得る。サイトメガロウイルスプロモーターは、任意の適切な供給源から入手することができる。例えば、完全なサイトメガロウイルスエンハンサー−プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)から得ることができる。CMVを得るための他の適切な供給源には、Clontech(Montain View,California)、Invitrogen(Carlsbad,California)、およびStratagene(La Jolla,California)などの商業的な供給源が含まれる。CMVプロモーターの一部またはすべてを本発明において使用することができる。本発明を実施するために使用することができる構築物の他の例には、MuLVプロモーター、SV40プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、ワクシニア P7.5プロモーター、熱ショックプロモーター、およびラットβ−アクチンプロモーターを使用する構築物が含まれる。RSVおよびMuLVなどのある場合において、これらのプロモーター−エンハンサーエレメントは、LTR配列の中に、またはそれに隣接して配置される。
遺伝子の転写、翻訳、プロセシング、および選択のために必要とされる適切な調節配列は当該分野において認識されており、適切な細胞中での所望のタンパク質の発現を指向するように選択される。したがって、「調節配列」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子の翻訳領域の5’(上流)または3’(下流)に存在し、その遺伝子の発現を制御またはそれに影響を与える任意の遺伝子エレメント、例えば、エンハンサーおよびプロモーター配列を含む。このような調節配列は、Goeddel,Gene expression Technology:Methods in Enzymology,185頁,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)において議論されており、これは、調節配列のその教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。調節配列は、本発明における使用のために、当業者が選択することができる。
1つの実施形態において、本発明は、選択した遺伝子の転写をオンおよびオフに切り換えることができるように、本明細書に開示された構築物中で誘導性プロモーターを利用する。このことは、細胞毒性ウイルスタンパク質の発現によって引き起こされる細胞毒性を最小化し、ベクターを含むパッケージング細胞の安定性を増加する。例えば、VSV−G(エンベロープタンパク質)およびVprの高レベルの発現は細胞毒性であり得(Yee,J.−K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci,91:9654−9568(1994))、それゆえに、本発明のパッケージング細胞中でのこれらのタンパク質の発現は、誘導性Tetオペレーター系(GIBCO BRL,Carlsbad,California)などの誘導性オペレーター系によって制御することができ、培養培地中のテトラサイクリンの濃度による遺伝子発現(すなわち、レトロウイルス粒子の生成)の強固な調節を可能にする。すなわち、Tetオペレーター系を用いると、テトラサイクリンの存在下で、テトラサイクリンは、Tetトランス活性化因子融合タンパク質(tTA)に結合し、Tetオペレーター配列へのtTAの結合を妨害し、Tetオペレーター配列の制御下での遺伝子の発現を可能にする(Gossenら(1992)PNAS 89:5547−5551、これは、tTAおよびTetオペレーター配列の制御下での発現を可能にすることのその教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。テトラサイクリンの非存在下では、tTAはTetオペレーター配列に結合し、Tetオペレーターの制御下での遺伝子の発現を妨害する。
偽型決定されたエンベロープを提供するタンパク質の発現の制御のために使用できる他の誘導性オペレーター系の例は、1)金属イオンに応答性である誘導性真核生物プロモーター(例えば、メタロシチオネインプロモーター)または糖質コルチコイドに応答性である誘導性真核生物プロモーターおよび2)大腸菌のLacSwitch(商標)誘導性哺乳動物発現系(Inducible Mammalian Expression System)(Stratagene)(La Jolla,California)である。手短に述べると、大腸菌ラクトースオペロンにおいて、Lacリプレッサーはホモ四量体としてlacオペレーターに結合して、lac2遺伝子の転写を遮断する。アロラクトース(生理学的誘導因子)またはイソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG、合成誘導因子)はLacリプレッサーに結合し、コンホメーションの変化を引き起こし、オペレーターのリプレッサーの親和性を効果的に減少する。リプレッサーがオペレーターから除去されるときには、ラクトースオペロンからの転写は再開する。
目的の配列の調節を可能にするために適切な条件下で、本明細書に記載されるような遺伝子移入構築物を標的細胞に導入する工程を包含する、目的の配列の発現を選択的に調節する方法もまた本明細書に開示される。本明細書に開示される方法は、組織特異的な様式で目的の配列の発現を指向するために使用することもできる。例えば、遺伝子移入構築物は、特定の組織における目的の配列の発現を駆動するために使用できる組織特異的なTCEを含み得る。このような遺伝子移入ベクターは、本明細書に記載されるようなウイルス粒子を作製するためにパッケージング構築物と組み合わせて使用することができる。次いで、ウイルス粒子は接合体に導入することができる。選択的に、組織特異的発現は、トランスジェニック動物の生成のために、本明細書に開示される方法を使用して達成することができ、ここで、目的の配列の発現は、誘導性/可逆的TCEの制御下にある。このような動物において、目的の配列の発現は、例えば、DOXが投与される部位に限定することができる。このようなものとして、目的の配列の発現は、DOX投与の部位においてのみ起こる。
本発明の方法を使用して産生されるウイルス粒子を被験体に投与する方法もまた本明細書に開示される。本発明の構築物およびウイルス粒子は、標的細胞(例えば、哺乳動物細胞)または哺乳動物(例えば、ヒト)に目的の配列を導入するために、インビトロ、インビボ、およびエキソビボで使用することができる。細胞は、商業的にもしくは寄託機関から入手することができ、または生検などにより、哺乳動物から直接的に入手することができる。細胞は、それらが戻される哺乳動物から、または同じもしくは異なる種の別の/異なる哺乳動物から、入手することができる。例えば、本発明のパッケージング細胞株またはウイルス粒子を使用して、目的のDNAは、ブタ細胞などの非ヒト細胞に導入することができ、次いで、これはヒトに導入される。代替として、細胞は哺乳動物から単離される必要はなく、ここで、例えば、遺伝子治療において哺乳動物に本発明のウイルス粒子を送達することが所望される。
エキソビボ治療は、例えば、Kasidら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:473(1990);Rosenbergら、N.Engl.J.Med.,323:570(1990);Williamsら、Nature,310:476(1984);Dickら、Cell,42:71(1985);Kellerら、Nature,318:149(1985);およびAndersonら、米国特許第5,399,346号において記載されており、エキソビボ治療のそれらの教示のためのそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
本発明の方法を使用して生成されたウイルス粒子を被験体に投与する方法もまた本明細書に開示される。伝統的に、成功した抗ウイルスワクチンは、大部分が生弱毒化ウイルスに依存してきた。生弱毒化HIVワクチン候補は、復帰、組換え、または変異のリスクを有しているので、理想的ではない。他の現在のHIVワクチン候補は、広範に有効な中和抗体、および一次HIV単離物に対する細胞毒性T細胞免疫応答を生成する困難さを示す。ウイルス様粒子(VLP)は、動物およびヒト患者に投与するために安全であること、ならびに細胞性および体液性免疫応答の強力かつ効率的な刺激因子であることが実証されてきた。それゆえに、VLPはHIVワクチンとして有用である。HIVまたはSIVキャプシドタンパク質のいずれかおよびHIV免疫エピトープを用いて構築したキメラHIV−1 VLP、ならびに免疫刺激分子は、初期のVLP設計に対してさらに改善され、免疫刺激の増強に導いた。粘膜表面を介するVLPワクチンの投与もまた、粘膜性および全身体液性および細胞性の免疫応答を誘発するために有望なストラテジーとして出現してきた。加えて、樹状細胞(DC)による抗原のプロセシングおよび特定の抗原の提示に関する情報は、VLPワクチン候補のための新規なストラテジーを作製してきた。
哺乳動物に直接的にウイルス粒子を投与する(導入する)ための方法は、当業者に一般的に公知である。例えば、投与の様式には、非経口、注射、粘膜、全身性、移植、腹腔内、経口、皮内、経皮(例えば、徐放ポリマー中)、筋肉内、注入および/またはボーラス注射を含む静脈内、皮下、局所的、硬膜外などが含まれる。本発明のウイルス粒子は、好ましくは、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、および等張性塩化ナトリウム溶液などの薬学的に許容されるキャリア中で投与することができる。
投与の頻度を含む、哺乳動物に投与される本発明のウイルス粒子の投薬量は、投与の様式および経路;レシピエント哺乳動物のサイズ、齢、性別、健康、体重、および食事;治療される疾患または状態の徴候の性質および程度;同時治療の種類、治療の頻度、ならびに所望される効果を含む種々の要因に依存して変化する。
本明細書に記載されるようなパッケージング構築物を含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ核酸構築物もまた含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結され;目的の1つ以上の配列を含む遺伝子移入構築物もまた含む発現系が開示される。エンベロープ糖タンパク質が細胞への侵入を促進する発現系もまた開示される。選択的に、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス(VSV−G)のGタンパク質などのウイルスエンベロープ糖タンパク質であり得る。
選択的に、発現系は、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸、例えば、tet−onに作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む、核局在化シグナルをコードする構築物をさらに含み得る。核局在化シグナルは、細胞質から核膜、それゆえに核までポリペプチドを方向付けるものである。核局在化シグナルをコードする核酸は転写制御エレメントをさらに含み得る。核局在化シグナルをコードする核酸配列には、例えば、配列番号15(GGGGS)をコードし得る少なくとも1つのリンカー配列が隣接し得る。リンカー配列は一般的配列であり得る。核局在化シグナルをコードする構築物は、5’から3’のサイトメガロウイルスプロモーター、第1のリンカーをコードする配列、第2の核局在化シグナル、第2のリンカー配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列もまた含み、ここで、コードされるリンカーは配列番号15(GGGGS)である。
第1および第2のパッケージング構築物、第3の核酸構築物、および遺伝子移入構築物を含む発現系もまた開示される。第1のパッケージング構築物はGagタンパク質をコードする核酸配列を含む第1の核酸構築物を含み、Gagをコードする核酸配列は、フレームシフトおよび翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み、かつ少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。第2のパッケージング構築物は、Gag−Polポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第2の核酸構築物を含み、Gag−Polをコードする核酸配列は、フレームシフトおよび翻訳リードスルーを減少する1つ以上の変異を含み、かつ少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。この発現系は、エンベロープ糖タンパク質をコードする第3の核酸配列を含む第3の核酸構築物もまた含み、第3の核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。この発現系は、目的の1つ以上の配列を含む遺伝子移入構築物もまた含む。選択的に、この発現系は、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された上記の核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む、核局在化シグナルをコードする構築物をさらに含み得る。核局在化配列は、細胞質から核膜、それゆえに核までポリペプチドを方向付けるものである。
さらに、核局在化シグナルをコードする核酸は転写制御エレメントをさらに含み得る。転写制御エレメントは本明細書の他の箇所に開示される。核局在化シグナルをコードする核酸配列には、例えば、配列番号15(GGGGS)をコードし得る少なくとも1つのリンカー配列が隣接し得る。核局在化シグナルをコードする構築物は、5’から3’のサイトメガロウイルスプロモーター、第1のリンカーをコードする配列、第2の核局在化シグナル、第2のリンカー配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列もまた含み、ここで、コードされるリンカーは配列番号15(GGGGS)である。
上記に開示される発現系は、テトラサイクリントランス活性化因子に作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする第4の核酸配列を含む第4の核酸構築物もまた含み得る。第4の核酸構築物は、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントをさらに含み得る。核局在化シグナルをコードする配列はまた、少なくとも1つのリンカー配列に隣接することができる。第4の核酸配列は、5’から3’のサイトメガロウイルスプロモーター、配列番号15(GGGGS)をコードする核酸配列、核局在化シグナルをコードする核酸配列、配列番号15(GGGGS)をコードする核酸配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列もまた含む。
本明細書の他の箇所に開示される発現系を含む細胞株もまた開示される。
本明細書の他の箇所に記載されるパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程、およびエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含み、このエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されているエンベロープ核酸構築物を導入する工程、および目的の1つ以上の配列を含む本明細書の他の箇所に記載の遺伝子移入構築物を細胞に導入する工程;およびウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に細胞を維持する工程を包含する、遺伝子移入方法もまた開示される。このウイルス様粒子は、目的の遺伝子または配列を含む。
目的の外因性配列を含む細胞もまた開示され、目的の配列は、上記の遺伝子移入方法を使用して細胞に移入される。
細胞による組換えタンパク質の発現を可能にするために適切な条件下で、本明細書の他の箇所に開示されるような目的の遺伝子を含むウイルス粒子と、標的細胞を接触させる工程を包含する、目的の遺伝子から組換えタンパク質を作製する方法もまた本明細書に開示される。例えば、標的細胞は、インビトロまたはインビボでウイルス粒子を接触させることができる。
組換えタンパク質の発現を可能にするために適切な条件下で、本明細書の他の箇所に開示されるような遺伝子移入構築物を標的細胞に導入し、ここで、目的の配列は組換えタンパク質をコードする核酸配列である工程を包含する、目的の遺伝子または配列から組換えタンパク質を作製する方法もまた開示される。本明細書の他の箇所に開示されるように、組換えタンパク質の発現は調節可能であり得る。例えば、組換えタンパク質の発現は、誘導性かつ可逆性であり得る。
細胞による組換えタンパク質の発現を可能にするために適切な条件下で、本明細書の他の箇所に開示されるような、組換えタンパク質をコードする目的の遺伝子または配列を含むウイルス粒子と標的細胞を接触させる工程を包含する、組換えタンパク質を作製する方法もまた本明細書に開示される。例えば、標的細胞は、インビトロまたはインビボでウイルス粒子と接触させることができる。
少なくとも1つのVP16配列に作動可能に連結された調節因子配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む第1の核酸構築物を標的細胞に導入する工程;第1の核酸配列の組み込みを可能にする条件下に細胞を維持して、標的細胞のゲノムに組み込む工程、および修飾標的細胞を形成する工程;目的の配列に作動可能に連結された調節因子標的配列を含む第2の核酸構築物を、工程(b)の修飾標的細胞に導入する工程であって、ここで、目的の配列は、組換えタンパク質をコードする核酸配列である工程;および組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で、修飾標的細胞を維持する工程を包含する、組換えタンパク質を作製する方法もまた本明細書に開示される。
少なくとも1つのVP16配列に作動可能に連結された調節因子配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む第1の核酸構築物を標的細胞に導入する工程;目的の配列に作動可能に連結された調節因子標的配列を含む第2の核酸構築物を、工程(a)の同じ修飾標的細胞に導入する工程であって、ここで、目的の配列は、組換えタンパク質をコード可能である核酸配列である工程;ならびに第1および第2の核酸配列の組み込みを可能にする条件下で標的細胞を維持して、標的細胞のゲノムに組み込む工程、ならびに修飾標的細胞を形成する工程;ならびに組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で、修飾標的細胞を維持する工程を包含する、組換えタンパク質を作製する方法もまた本明細書に開示される。
例えば、第1の核酸構築物は配列番号44の配列を含み得る。第2の核酸配列は、本明細書の別の箇所に記載される遺伝子移入ベクターのいずれかであり得る。例えば、第2の核酸は、調節因子標的配列に作動可能に連結された転写制御エレメントに作動可能に連結されている目的の配列を含み得る。第1の核酸構築物は、IRESまたはIRES様配列もまた含み得る。例えば、目的の配列は、選択マーカーに作動可能に連結されたIRESまたはIRES様配列に作動可能に連結することができる。
任意の公知の細胞トランスフェクション技術を、組換えタンパク質を作製する方法のために利用することができる。ウイルス粒子と細胞を接触させるための他の方法が本明細書の他の箇所に開示される。一般的に、インビトロ方法について、当該分野において周知であるように、細胞は、適切なトランスフェクション条件下で、適切な培地中で、構築物またはベクターとともにインキュベートする(すなわち、培養する)。例えば、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウム沈殿などの方法(O’Mahoneyら(1994)DNA & Cell Biol.13(12):1227−1232)を使用することができる。
本明細書に開示される遺伝子移入構築物を含むワクチンもまた開示される。本明細書に開示される遺伝子移入構築物を被験体に投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を産生する方法もまた開示される。
加えて、被験体における免疫応答を産生する方法が開示され、ここで、免疫応答はHIVに対する免疫応答であり、上記方法は、本明細書に開示される遺伝子移入構築物を被験体に投与する工程を含み、目的の配列は、HIV抗原を発現可能である配列である。
本明細書で使用される場合、特定の病原体に特異的な「ワクチン」または「被験体にワクチン接種するための組成物」とは、被験体に投与されたときに、被験体における免疫原性応答に導く調製物を意味する。本明細書で使用される場合、「免疫原性」応答は、病原体に対する防御免疫を被験体に付与するものである。理論によって束縛されることを望まないが、免疫原性応答は、中和抗体の生成から(すなわち、体液性免疫応答)、または免疫系の細胞毒性細胞(すなわち、細胞性免疫応答)から、または両方から生じ得ると考えられている。本明細書で使用される場合、「免疫原性抗原」は、被験体に導入されるときに、または宿主もしくは被験体の細胞中で合成されるときに、免疫原性応答を誘導する抗原である。本明細書で使用される場合、ワクチンまたはワクチン接種組成物の「有効量」は、被験体に投与されるときに、被験体に防御免疫を付与するために十分である量である。歴史的には、ワクチンは、病原体、とりわけ、その表面を含む1つ以上の特異的な分子成分または構造を活性成分として含むことが理解されてきた。このような構造は、病原性生物において共通して見出される、タンパク質、複合糖質、および/または複合脂質などの表面成分を含み得る。
しかし、本明細書で使用される場合、「ワクチン」または「被験体にワクチン接種するための組成物」という用語は、先の段落において要約された従来的な意味を拡張することが強調される。本明細書で使用される場合、これらの用語はまた、本発明の目的の配列または目的の配列を含む組成物もいう。目的の配列は、被験体の細胞内で目的の配列によってコードされる1つ以上の特定の遺伝子産物の生合成を誘導し、ここで、遺伝子産物は、病原体の特定の抗原である。次いで、生合成抗原は免疫原として働く。すでに注記されたように、目的の配列、およびそれゆえにワクチンは、特定の免疫原性抗原をコードする任意の核酸であり得る。本発明の好ましい実施形態において、ワクチンの目的の配列はDNAである。目的の配列は、分子生物学、細胞生物学、およびウイルス免疫学の分野の当業者の便宜のために、さらなる遺伝子または特定の配列を組み込んでいるプラスミドまたはベクターを含み得る(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Sambrook,Fritsch、およびManiatis,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1989;ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology.Ausubelら,John Wiley and Sons,New York 1987(年4回アップデート)を参照のこと。これらは、プラスミドまたはベクターの例または使用のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。
いくつかの組換えサブユニットおよびウイルスワクチンが近年考案されてきた。組換えサブユニットおよびウイルスワクチンのその教示のために、その内容がその全体として参照により本明細書に援用される米国特許第4,810,492号は、ワクチン中での抗原としての使用のための日本脳炎ウイルス(JEV)のE糖タンパク質の産生を記載する。対応するDNAは、大腸菌、酵母、または高等生物の細胞培養物などの適切な宿主細胞中で抗原タンパク質を発現するために発現系にクローニングされる。抗原タンパク質を発現する発現系にDNAをクローニングするための方法のその教示のために、その内容がその全体として参照により本明細書に援用される、米国特許第5,229,293号は、JEV Eタンパク質の遺伝子を保有する組換えバキュロウイルスを開示する。このウイルスは、Eタンパク質がワクチンとしての使用のために製造されかつ回収されるように、培養中で昆虫細胞に感染させるために使用される。
米国特許第5,021,347号は、JEV Eタンパク質が組み込まれる組換えワクシニアウイルスゲノムを開示する。この生組換えワクシニアウイルスは、JEVに対して免疫するためのワクチンとして使用される。デング血清型2、デング血清型4、およびJEVのEタンパク質のC末端短縮型の遺伝子を組み込んでいる、組換えワクシニアウイルスおよびバキュロウイルスは米国特許第5,494,671号に開示される。米国特許第5,514,375号は、prMからNS2Bまで広がるJEVオープンリーディングフレームの部分を発現する種々の組換えワクシニアウイルスを開示する。これらのポックスウイルスは、プロセシングしたMタンパク質およびEタンパク質を含む細胞外粒子の形成を誘導した。これらのJEVタンパク質をコードする2つの組換えウイルスは、マウスにおいて、高力価の中和およびヘマグルチニン阻害抗体、ならびに防御免疫を生じた。これらの効果の程度は、1回の免疫治療よりも、2回の免疫治療後により高かった。JEVのprM/MおよびEタンパク質の遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスは、マウスに投与された場合、防御免疫を付与した(Konishiら、Virology 180:401−410(1991))。JEVからのprMおよびEの遺伝子を保有する組換えワクシニアウイルスで感染させたHeLa細胞は、サブウイルス粒子を産生することが示された(Konishiら、Virology 188:714−720(1992))。Dmitrievらは、ダニ媒介性脳炎ウイルスからの構造タンパク質および特定の非構造タンパク質をコードする組換えワクシニアウイルスを用いるマウスの免疫を報告した(J.Biotechnology 44:97−103(1996))。これらの参考文献の各々は、組換えワクシニアウイルスのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
組換えウイルスベクターはまた、デング熱のためのウイルスワクチンとして役立たせるために調製されてきた。Zhaoら(J.Virol.61:4019−4022(1987))は、デング血清型4からワクシニアウイルスが保有する構造タンパク質およびNS1を調製し、組換えウイルスを用いる哺乳動物細胞の感染後に発現を達成した。同様の発現は、標的昆虫細胞に感染させるために組換えバキュロウイルスを使用して得られた(Zhangら、J.Virol.62:3027−3031(1988))。Brayら(J.Virol.63:2853−2856(1989))もまた、チャレンジされたときに、デング脳炎に対してマウスに防御免疫を付与する、Eタンパク質遺伝子に基づく組換えワクシニアデングワクチンを報告した。Falgoutら(J.Virol 63:1852−1860(1989))およびFalgoutら(J.Virol.64:4356−4363(1990))は同様の結果を報告した。Zhangら(J.Virol 62:3027−3031(1988))は、デングEタンパク質およびNS1タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスが、チャレンジされたときに、デング脳炎に対して同様にマウスを防御することを示した。構造遺伝子および非構造遺伝子が組換えウイルスワクチンに組み込まれた他の組み合わせは、有意な免疫を生じることに失敗した((Brayら、J.Virol.63:2853−2856(1989))。また、サルは、Eタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスで免疫したときに、デングウイルスチャレンジに対して完全な防御免疫を発生することに失敗した(Laiら(1990)119−124頁 F.Brown,R.M.Chancock,H.S.Ginsberg、およびR.Lerner(編)Vaccines 90:Modern approaches to new vaccines including prevention of AIDS,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。これらの参考文献の各々は、組換えウイルスワクチンに遺伝子を組み込む方法の組成物らの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用され、構造遺伝子および非構造遺伝子の例は、組換えウイルスワクチンに組み込まれた。
組換えDNA調製物を使用する免疫は、離乳マウスをモデルとして使用して、SLEVおよびデング−2ウイルスについて報告された(Phillpottsら、Arch.Virol.141:743−749(1996);Kochelら、Vaccine 15:547−552(1997))。SLEVのprM遺伝子およびE遺伝子をコードしているプラスミドDNAは、DNA免疫の単回または二重用量を用いるSLEVチャレンジに対する部分的防御を提供した。これらの実験において、対照マウスは約25%の生存を示し、防御抗体はDNA免疫マウスにおいて検出されなかった(Phillpottsら、Arch.Virol.141:743−749(1996))。prMを含む組換えデング−2プラスミドDNAの3回の皮内注射を受容したマウスにおいて、100%がデング−2中和抗体を発生し、対応するE遺伝子を受容しているマウスの92%は、同様に中和抗体を発生した(Kochelら、Vaccine 15:547−552(1997))。しかし、2回用量スケジュールを使用するチャレンジ実験は、致死的なデング−2ウイルスチャレンジに対してマウスを防御することに失敗した。抗原の引き続く精製または処理を伴って、細胞培養中の生合成的発現によって産生された、JEVなどのフラビウイルスの特定のタンパク質のみの使用に基づく組換えワクチンは、高い抗体力価を誘導しない。また、全体のウイルス調製物と同様に、これらのワクチンは、宿主からの抗原またはベクターへの有害なアレルギー反応のリスクを有する。デングウイルスおよびWNVに対するワクチン開発はより進歩が少なく、このようなウイルスベースのワクチンまたは組換えタンパク質ベースのワクチンは、上記に暗示したものと同様の問題に直面する。これらの参考文献の各々は、組換えウイルスワクチンに遺伝子を組み込む方法のそれらの教示のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用され、構造遺伝子および非構造遺伝子の例は、組換えウイルスワクチン、ならびに組換えDNA調製物を使用する免疫の方法に組み込まれた。
抗体を作製するための方法もまた本明細書に開示される。例えば、被験体における免疫応答を誘導することによって、抗体産生を誘導するインビボ方法が開示される。このインビボ方法は、本明細書の他の箇所に開示される方法によって作製される組換えタンパク質を、免疫応答を誘導するために十分な量で導入する工程を包含する。例えば、標的細胞は、本明細書に開示される遺伝子移入構築物またはウイルス粒子と、インビトロまたはインビボで接触させることができる。
(a)遺伝子移入構築物の転写制御エレメントが調節可能または構成的であり、目的の配列が目的のタンパク質をコード可能である、本明細書の他の箇所に開示されるような遺伝子移入構築物を標的細胞に導入する工程;(b)標的細胞のゲノムへの工程(a)の核酸構築物の組み込み、および修飾標的細胞の形成を可能にする条件下で、細胞を維持する工程;(c)工程(b)の修飾標的細胞を被験体に導入する工程;(d)目的の配列が免疫応答を誘導するために十分な量で発現され、免疫応答が目的のタンパク質に対する抗体を生成する、目的の配列の発現を誘導するために十分な量で遺伝子移入構築物の転写制御エレメントを調節可能である有効量の基質を被験体に投与する工程を包含する、目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法もまた開示される。加えて、本明細書に記載される方法から生成される抗体は単離することができる。
目的の抗原を結合する抗体を同定する方法もまた開示され、この方法は、目的の抗原を結合する抗体を含むことが疑われるサンプルと、目的の抗原を発現する標的細胞とを接触させる工程、およびサンプル中の抗体が標的細胞によって発現される目的の抗原に結合するか否かを決定し、それによって、目的の抗原に結合する抗体が、目的の抗原を結合する抗体として同定される工程を包含する。目的の抗原を発現する標的細胞は、本明細書に記載される方法によって生成される標的細胞であり得る。目的の抗原を結合する抗体を同定する開示される方法において使用される標的細胞は、本明細書の他の箇所に記載される遺伝子移入構築物を含む標的細胞であり得る。例えば、目的の抗原を結合する抗体を同定する方法もまた開示され、この方法は、標的細胞が請求項1、55、208、247、および286に記載の核酸構築物の1つ以上を含む、目的の抗原を結合する抗体を含むことが疑われるサンプルと、目的の抗原を発現する標的細胞を接触させる工程;ならびにサンプル中の抗体が標的細胞によって発現される目的の抗原に結合するか否かを決定し、それによって、目的の抗原に結合する抗体が、目的の抗原を結合する抗体として同定される工程を包含する。
(a)遺伝子移入構築物の転写制御エレメントが調節可能または構成的であり、目的の配列が目的のタンパク質をコード可能である、本明細書の他の箇所に開示されるような遺伝子移入構築物を標的細胞に導入する工程;(b)標的細胞のゲノムへの工程(a)の核酸構築物の組み込み、および修飾標的細胞の形成を可能にする条件下で、細胞を維持する工程;(c)工程(b)の修飾標的細胞を被験体に導入する工程;(d)目的の配列が免疫応答を誘導するために十分な量で発現され、免疫応答が目的のタンパク質に対する抗体を生成する、目的の配列の発現を誘導するために十分な量で遺伝子移入構築物の転写制御エレメントを調節可能である有効量の基質を被験体に投与する工程を包含する、目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法もまた開示される。
加えて、目的の抗原を結合する抗体を含まない、目的の抗原を結合する抗体を含むことが疑われるサンプルが、目的の抗原を結合する抗体として同定されないように、目的の抗原を発現しないこの方法において、対照を使用することができる。目的の抗原を結合する抗体を同定する開示される方法はまた、中和抗体を同定するために使用することができる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、任意のクラスの全体の免疫グロブリン(すなわち、インタクトな抗体)を含むがこれに限定されない。未変性の抗体は、通常、2つの同一の軽(L)鎖および2つの同一の重(H)鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。代表的には、各軽鎖は、1つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているのに対して、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔の空いた鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン(V(H))続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の末端に可変ドメイン(V(L))およびその他方の末端に定常ドメインを有する;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第1の定常ドメインとともに整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとともに整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に識別可能な型の1つに割り当てることができる。それらの定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンの5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのいくつかは、サブクラス(イソタイプ)、例えば、IgG−1、IgG−2、IgG−3、およびIgG−4;IgA−1およびIgA−2にさらに分けてもよい。当業者は、マウスについての比較し得るクラスを認識する。異なるクラスの免疫グロブリンに一致する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
「可変」という用語は、抗体間で配列が異なり、かつその特定の抗原についての各特定の抗体の結合および特異性において使用される、可変ドメインの特定の部分を説明するために本明細書で使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインを通して通常は均一に分布されてはいない。これは、代表的には、相補性決定領域(CDR)または軽鎖および重鎖の両方の可変ドメイン中にある超可変領域と呼ばれる3つのセグメント中に集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分はフレームワーク(FR)と呼ばれる。未変性の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、4つのFRを含み、このFRは、大部分がβシート配置を採用し、3つのCDRによって接続され、このCDRは、βシート構造を接続し、ある場合においては、その一部を形成するループを形成する。各鎖の中のCDRは、FR領域によって密接な近位に一緒に保持され、他の鎖からのCDRとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat E.A.ら「Sequences of Proteins of Immunological Interest」National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987))。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接的に関与しないが、しかし、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの、種々のエフェクター機能を示す。
本明細書で使用される場合、「抗体またはそのフラグメント」という用語には、二重または複数の抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、ならびにハイブリッドフラグメントを含む、F(ab’)2、Fab’、Fabなどのフラグメントが含まれる。したがって、それらの特異的抗原に結合する能力を保持している抗体のフラグメントが提供される。例えば、目的のタンパク質の結合活性を維持する抗体のフラグメントは、「抗体またはそのフラグメント」という用語の意味の中に含まれる。このような抗体およびフラグメントは当該分野において公知である技術によって作製することができ、実施例に示される方法、ならびに抗体を産生するため、および特異性および活性について抗体をスクリーニングするための一般的方法(HarlowおよびLane.Antibodies,A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988)を参照のこと。この内容は、抗体を産生するため、および特異性および活性について抗体をスクリーニングするための一般的方法のその教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)に従って、特異性および活性についてスクリーニングすることができる。
例えば、その内容が抗体フラグメントおよび抗原結合タンパク質単鎖抗体の結合体のその教示のためにその全体として参照により本明細書に援用される米国特許第4,704,692号において記載されるような、抗体フラグメントおよび抗原結合タンパク質(単鎖抗体)の結合体もまた、「抗体またはそのフラグメント」の意味の中に含まれる。
選択的に、抗体は他の種において生成され、ヒトにおける投与のために「ヒト化される」。非ヒト抗体(例えば、マウス)抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えば、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のCDR(ドナー抗体)からの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)が含まれる。ある例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体の中にも、移入されたCDR配列中またはフレームワーク配列中にも見い出されない残基もまた含む。一般的に、ヒト化抗体は、実質的にすべて、少なくとも1つ、および代表的には2つの可変ドメインを含み、すべてまたは実質的にすべてのCDR領域は、非ヒト免疫グロブリンの領域に一致し、すべてまたは実質的にすべてのFR領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、代表的にはヒト免疫グロブリンのそれを含む(Jonesら、Nature,321:522−525(1986);Riechmannら、Nature,332:323−327(1988);およびPresta、Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596(1992)、これらは、ヒト化抗体のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野において公知である。一般的に、ヒト化抗体は、ヒトではない供給源からそれに導入される1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入残基」と呼ばれ、これは、代表的には、「移入」可変ドメインから取られる。
ヒト化は、ヒト化抗体の対応する配列の代わりに齧歯類CDRまたはCDR配列で置き換えることによって、本質的にWinterおよび共同研究者の方法(Jonesら、Nature,321.522−525(1986);Riechmannら、Nature,332:323−327(1988);Verhoeyenら、Science,239:1534−1536(1988)、これらは、抗体のヒト化のそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される)に従って実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、これは、ヒト化抗体およびキメラ抗体のその教示のために、その全体が参照により援用され、ここで、実質的に、インタクトなヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種からの対応する配列によって置換されてきた。実務上、ヒト化抗体は、代表的には、あるCDR残基およびおそらくFR残基が、齧歯類抗体中の類似の部位からの残基によって置換される。
ヒト化抗体を作製する際に使用される、軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少するために非常に重要である。「ベスト−フィット」法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全体のライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(FR)として受容される(Simsら、J.Immunol.,151:2296(1993)およびChothiaら、J. Mol. Biol.,196:901(1987)、これは、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(FR)としての齧歯類の配列に最も近いヒト配列を使用することのそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される)。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークは、いくつかのヒト化抗体のために使用することができる(Carterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Prestaら、J.Immunol.,151:2623(1993)、これはまた、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(FR)として齧歯類の配列と最も近いヒト配列を使用するそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される)。
抗原についての高い親和性の保持および他の好ましい生物学的特性を有する抗体をヒト化することはさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親の配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用する、親の配列および種々の概念的ヒト化生成物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例証および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のあり得る役割の分析、すなわち、その抗原を結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このようなやり方で、標的抗原への親和性の増加などの所望の抗体の特徴が達成されるように、FR残基は、コンセンサス配列および移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、CDR配列は、直接的にかつ最も実質的に、抗原結合に影響を与えることに関与する(1994年3月3日に公開されたWO 94/04679を参照のこと。これは、抗原結合に対するCDR残基およびそれらの影響のその教示のために、その全体が参照により援用される)。
免疫の際に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーの産生が可能であるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を利用することができる。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(J(H))遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されてきた。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる(例えば、Jakobovitsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551−255(1993);Jakobovitsら、Nature,362:255−258(1993);Bruggemannら、Year in Immuno.,7:33(1993)を参照のこと。これらは、抗原チャレンジの際のヒト抗体の産生のそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される)。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーの中で産生することができる(Hoogenboomら、J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marksら、J.Mol.Biol.,222:581(1991)。これらは、ファージディスプレイライブラリーにおいてヒト抗体を産生することのそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される)。CoteらおよびBoeraerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,77頁(1985);Boernerら、J.Immunol.,147(l):86−95(1991)。これらは、ヒトモノクローナル抗体を調製することのそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される)。
モノクローナル抗体を産生する細胞もまた開示される。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体をいい、すなわち、この集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異以外は同一である。本発明のモノクローナル抗体には、重鎖および/または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるはまたは相同であるキメラ抗体を含むが、鎖の残りは、これらが所望の活性を示す限り、別の種由来または別の抗体もしくは所望の活性に属する抗体における対応する配列、ならびにこのような抗体のフラグメントと同一であるかまたは相同である(米国特許第4,816,567号およびMorrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855(1984)を参照のこと。これらは、キメラ抗体を具体的に含むモノクローナル抗体のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。
モノクローナル抗体はまた、KohlerおよびMilstein,Nature,256:495(1975)またはHarlowおよびLane.Antibodies,A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988)によって記載されるものなどの、ハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法においては、マウスおよび他の適切な宿主動物は、代表的には、免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生可能であるリンパ球を誘発可能である免疫因子で免疫される。代替として、リンパ球はインビトロで免疫することができる。好ましくは、免疫因子は、遺伝子移入構築物中に存在する目的の配列を含む。伝統的には、モノクローナル抗体の生成は、免疫原としての使用のための精製タンパク質またはペプチドの利用可能性に依存してきた。このようなものとして、本明細書に開示される方法は、宿主動物に注入することができるウイルス粒子の中に大量の目的のタンパク質を提供することによって、強力な免疫応答を誘発し、かつモノクローナル抗体を生成するための方法を提供する。
この系の利点には、哺乳動物系において見られるものと高度に類似した、生成の容易さ、高レベルの発現、および翻訳後修飾が含まれる。この系の用途には、融合タンパク質としての目的の抗体のタンパク質のドメインを発現することが含まれる。抗原はまた、シグナル配列と、目的のタンパク質の成熟タンパク質ドメインの抗体ヌクレオチド配列の間にインフレームで遺伝子フラグメントを挿入することによっても産生することができる。このことは、ビリオンの表面上での外来性タンパク質のディスプレイを生じる。この方法は、全体のウイルスを用いる免疫を可能にし、標的抗原の精製の必要性を除外する。
一般的に、モノクローナル抗体を作製するときには、ヒト起源の細胞が所望される場合には、いずれかの末梢血リンパ球(「PBL」)を、モノクローナル抗体を産生する方法において使用することができ、または非ヒト哺乳動物供給源が使用されるときには、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して、不死化細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding「Monoclonal Antibodies:Principles and Practice」Academic Press,(1986)59−103頁)。不死化細胞株は、齧歯類、ウシ、ウマ、およびヒト起源のミエローマ細胞を含む、形質転換哺乳動物細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞が利用される。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する1種以上の物質を好ましく含む、適切な培養培地中で培養することができる。例えば、親の細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(「HAT培地」)を含み、これらの物質は、HGPRT欠損細胞の増殖を妨害する。好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体の発現を補助し、HAT培地などの培地に対して感受性である。より好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株であり、これは、例えば、the SaIk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif、およびアメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville,Md.から入手することができる。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されてきた(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeurら「Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications」Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)51−63頁)。次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、目的のタンパク質に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈殿またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定される。このような技術およびアッセイは当該分野において公知であり、本明細書またはHarlow and Lane「Antibodies,A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988)においてさらに記載される。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈またはFACS分別手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖することができる。この目的のための適切な培養培地には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびRPMI−1640培地が含まれる。代替的には、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインA−セファロース、プロテインG、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来的な免疫グロブリン精製手樹によって、培養培地または腹水から単離または精製することができる。
インビトロ方法もまた、一価抗体を調製するために適切である。抗体のフラグメント、特に,Fabフラグメントを産生するための抗体の消化は、当該分野において公知である日常的な技術を使用して達成することができる。例えば、消化は、パパインを使用して実施することができる。パパイン消化の例は、1994年12月22日に公開されたWO 94/29348、米国特許第4,342,566号、ならびにHarlowおよびLane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988)において記載される。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位および残りのFcフラグメントを有する、Fabフラグメントと呼ばれる2つの同一の抗原結合フラグメントを産生する。ペプシン処理は、F(ab’)2フラグメントと呼ばれるフラグメントを生じ、これは、2つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋することがなお可能である。
抗体消化において産生されるFabフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメインもまた含む。Fab’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインを含む、重鎖ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加によって、Fabフラグメントとは異なる。F(ab’)2フラグメントは、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2つのFab’フラグメントを含む二価抗体である。Fab’−SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するFab’についての本明細書における命名である。抗体フラグメントは、もともとは、それらの間のヒンジシステインを有するFab’フラグメントの一部として産生された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた知られている。
抗体の単離された免疫学的に特異的なパラトープまたはフラグメントもまた提供される。抗体の特異的免疫原性エピトープは、分子の化学的または機械的破壊によって、全体の抗体から単離することができる。このようにして得られる精製フラグメントは、本明細書に教示される方法によって、それらの免疫原性および特異性を決定するために試験される。抗体の免疫反応性パラトープは、選択的に、直接的に合成される。免疫反応性フラグメントは、抗体アミノ酸配列由来の少なくとも約2〜5個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列として定義される。
生物活性を有する抗体のフラグメントもまた開示される。ポリペプチドフラグメントは、ポリペプチドをコードする核酸を、ポリペプチドフラグメントを産生可能である発現系、例えば、本明細書に開示される発現系の中にクローニングすることによって得られる組換えタンパク質であり得る。例えば、目的のタンパク質との抗体の相互作用に関連する生物学的効果を引き起こし得る特定のハイブリドーマから、抗体の活性ドメインを区別することができる。例えば、抗体の活性または結合特異性または親和性のいずれかに寄与しないことが見い出されているアミノ酸は、それぞれの活性の喪失を伴うことなく欠失させることができる。例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸は、未変性もしくは修飾非免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子のいずれかから連続的に除去され、それぞれの活性は、多くの利用可能なアッセイの1つにおいてアッセイされる。別の例において、抗体のフラグメントは修飾抗体を含み、ここで、少なくとも1つのアミノ酸が特定の位置に天然に存在するアミノ酸の代わりに置換されており、、アミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかの部分、または抗体の内部領域さえもが、ポリペプチドフラグメントまたは修飾抗体の精製を容易にすることができる、ビオチンなどの他の部分で置き換えられている。例えば、修飾抗体は、コード領域がハイブリッドポリペプチドを生じるように、ペプチド化学または2つのポリペプチドフラグメントをコードするそれぞれの核酸を発現ベクターにクローニングすることのいずれかを通して、マルトース結合タンパク質に融合することができる。ハイブリッドポリペプチドは、アミロースアフィニティーカラムにそれを通すことによってアフィニティー精製することができ、次いで、修飾抗体受容体は、特異的プロテアーゼXa因子でハイブリッドポリペプチドを切断することによって、マルトース結合領域から分離することができる(例えば、New England Biolabs Product Catalog,1996,164頁を参照のこと)。類似の精製手順は、真核生物細胞からハイブリッドタンパク質を単離するために同様に利用可能である。
フラグメントは、他の配列に結合されているか否かに関わらず、フラグメントの活性が非修飾の抗体または抗体フラグメントと比較して、有意に変化されないかまたは損なわれないならば、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾を含む。これらの修飾は、ジスルフィド結合可能なアミノ酸を除去または付加するため、その生物学的な寿命を増加するため、その分泌特性を変化させるためなどのために、ある付加的な特性を提供することができる。ある場合において、フラグメントは、結合活性、結合ドメインにおける結合の調節などのような生物活性特性を有さなければならない。抗体の機能的または活性な領域は、タンパク質の特定の領域の変異誘発、続いて、発現、および発現されたポリペプチドの試験によって同定することができる。このような方法は当業者に容易に明らかであり、抗原をコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことができる(Zoller MJら、Nucl.Acids Res.10:6487−500(1982))。
種々のイムノアッセイ形式が、特定のタンパク質、改変体、またはフラグメントと選択的に結合する抗体を選択するために使用することができる。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質、タンパク質改変体、またはそのフラグメントと選択的に免疫活性である抗体を選択するために日常的に使用される。選択的結合を決定するために使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明のためには、HarlowおよびLane.Antibodies,A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988)を参照のこと。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら、Anal.Biochem.,107:220(1980)のScatchard分析によって決定することができる。
モノクローナル抗体またはそのフラグメント、および目的のタンパク質へのの抗体またはそのフラグメントの結合を検出するための1種以上の試薬の容器を含む抗体試薬キットもまた提供される。これらの試薬は、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、または他のタグを含み得る。これらの試薬は、二次もしくは三次抗体、または酵素反応のための試薬もまた含み得、ここで、酵素反応は、可視化され得る生成物を産生する。
免疫応答を誘発するために十分な量で、本明細書の他の箇所に開示される方法によって作製された組換えタンパク質を被験体に導入する工程を含む、被験体における免疫応答を誘発する方法もまた開示される。例えば、標的細胞は、インビトロまたはインビボでウイルス粒子と接触させることができる。
(a)遺伝子移入構築物を標的細胞に導入する工程;(b)工程(a)における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程;および(c)免疫応答を誘発するために十分な量で、工程(b)の標的細胞を該被験体に導入する工程を包含する、被験体における免疫応答を誘発する方法もまた開示される。例えば、目的の配列は、膜タンパク質(例えば、HIV膜タンパク質)をコード可能であり得る。加えて、目的の配列を発現することは、誘導可能、可逆性、または誘導可能かつ可逆性であり得る。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」とは、抗体を作製すること、免疫を発生すること、抗原に対する過感受性を発生すること、および耐性を発生することを含む、抗原の存在に対する身体の全体としての反応をいう。それゆえに、抗原に対する免疫応答は、目的の抗原に対する体液性および/または細胞性の免疫応答の被験体における発生もまた含む。「体液性免疫応答」は、形質細胞によって産生される抗体によって媒介される。「細胞性免疫応答」は、Tリンパ球および/または他の白血球細胞によって媒介されるものである。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体によって認識され、および/または個体における免疫応答を誘発し得る任意の因子(例えば、任意の物質、化合物、分子、タンパク質、または他の部分)をいう。
本明細書に開示される方法は、任意の細胞型とともに使用することができる。換言すれば、任意の細胞型が、本明細書に開示される方法のために標的細胞として働くことができる。真核生物宿主細胞には、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、および有核細胞が含まれ得るがこれらに限定されない。哺乳動物細胞もまた、本明細書に開示される方法とともに使用することができる。標的細胞は、本明細書に記載される核酸構築物のいずれかもまた含み得る。例えば、標的細胞は、1種以上の遺伝子移入構築物および/または本明細書に記載される1種以上のパッケージング構築物を含み得る。
「哺乳動物」および「哺乳動物の」という用語は、本明細書で使用される場合、子供に乳を飲ませ、生きた子供を出産するか(真獣類哺乳動物もしくは有胎盤哺乳動物)または産卵する(後獣類もしくは非胎盤哺乳動物)、単孔類動物、有袋動物、および有胎盤哺乳動物を含む任意の脊椎動物をいう。哺乳動物種の例には、ヒトおよび他の霊長類(例えば、サル、チンパンジー)、齧歯類(例えば、ラット、マウス、モルモット)、および反芻動物(例えば、ウシ、ブタ、ウマ)が含まれる。
哺乳動物細胞の例には、ヒト細胞(HeLa細胞、293T細胞、NIH 3T3細胞)、ウシ細胞、ヒツジ細胞、ブタ細胞、マウス細胞(例えば、胚性幹細胞)、ウサギ細胞、およびサル細胞(例えば、COSl細胞)が含まれる。細胞は、分裂していない細胞(肝細胞、筋原線維、造血幹細胞、神経細胞)または分裂している細胞であり得る。細胞は、胚性細胞、骨髄幹細胞、または他の前駆細胞であり得る。細胞が体細胞である場合、細胞は、例えば、上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、血液細胞(造血細胞、赤血球、T細胞、B細胞など)、腫瘍細胞、心筋細胞、マクロファージ、樹状細胞、神経細胞(例えば、グリア細胞または星状細胞)、または病原体感染細胞(例えば、細菌、ウイルス、ウイルソイド、寄生生物、またはプリオンに感染した細胞)であり得る。
代表的には、特定の組織(例えば、上皮、線維芽細胞、または造血細胞)から単離された細胞は、「細胞型」として分類される。細胞は、商業的にそしくは寄託機関から、または生検などによって、動物から直接的に得ることができる。代替的には、例えば、遺伝子治療においてウイルスを動物に送達することが所望される場合には、細胞は動物から単離される必要は全くない。
任意の細胞型が、例えば、本明細書の他の箇所に記載される組換えタンパク質または抗体を作製するために使用することができるが、細胞表面上のオリゴサッカリドの存在は、結晶化および抗体の発生の困難さを提示し得る。抗体産生を刺激する際に使用できる、タンパク質のグリコシル化に関与する1種以上の酵素が欠損している標的細胞を使用して組換えタンパク質および抗体を作製する方法が本明細書に開示される。タンパク質のグリコシル化に関与する1つのこのような酵素は、UDP−GlcNAc:−D−マンノシド−l,2−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GnTI)である。
多くの分泌タンパク質、ならびに分泌系のタンパク質の内在性膜タンパク質は糖タンパク質であり、すなわち、これらは、アスパラギンにN連結され、またはセリン、スレオニン、もしくはヒポキサンチンにO連結されたグリカン(オリゴサッカリド)によって修飾される。Nグリコシル化は、タンパク質の正確なフォールディング、タンパク質分解の妨害、タンパク質のコンホメーションおよび認識、タンパク質の溶解性、細胞外空間へのタンパク質の分泌、およびタンパク質の生物学的活性の原因であり得る。
GnTIはII型内在性膜タンパク質であり、内側ゴルジ槽に局在され、これは、高マンノースNグリカンの複合およびハイブリッド構造への転換における第1段階を触媒する。機能的GnTI遺伝子を欠いているマウスは誕生前に死亡するので、複合Nグリカンは胚発生の生存能力のために決定的である。しかし、GnTI活性を欠く多数の変異体が単離されているので、複合Nグリカンは、インビトロで培養される細胞の生存能力のためには必須ではない。
精製糖タンパク質上の異種Nグリカンを取り扱うことの例は、すべてのグリコシル化を除外するためにツニカマイシン処理を使用することである。したがって、テトラサイクリン誘導性発現を伴うツニカマイシン処理は、ミリグラム量のグリコシル化されていないロドプシンの精製のために使用されてきた。しかし、Nグリカンを除去することは、扱われる糖タンパク質の構造および機能におけるそれらの役割を許容しないので、このアプローチは理想的ではない。例えば、ロドプシンの構造および機能におけるグリコシル化の正確な役割は完全に理解されているわけではないが、これは明白に重要な役割を有する。光受容体のグリコシル化の非存在から生じるシグナル伝達特性の顕著な欠損は以前に報告されている。また、3つのアミノ酸の変化を伴うロドプシン変異体(El13Q/E134Q/M257Y)は、ツニカマイシンの存在下で発現されたときには精製することができなかった。変異した他の細胞株は、Puthalakathら、Glycosylation Defect in Lec! Chinese Hamster Ovary Mutant is Due to a Point Mutation in N−Acetylglucosaminyltransferase I Gene,J.B.C.,271,27818−27822(1996)に記載されており、これは、GnTI活性を欠く細胞株のその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
異種Nグリカンを取り扱う別の例は、Nグリカン合成に関与する種々の酵素のうちの1つ、例えば、GlcNAcトランスフェラーゼIが欠損している細胞中で、タンパク質を産生することである。このアプローチは、Nグリカン合成に関与する種々の酵素の欠損から生じる種々のレクチンに抵抗性であるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株の多様なコレクションの単離のために以前に使用されている。均一なグリコシル化パターンを生成するために変異された細胞株は、US 2004/0029229に記載されており、これは、均一なNグリカンを保証するために変異されている細胞株のその教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される。Reevesらもまた、均一なグリコシル化パターンを生成するために変異された細胞株を記載している(Structure and function in rhodopsin:high−level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N−glycosylation by a tetracycline−inducible N−acetylglucosaminyltransferase I−negative HEK293S stable mammalian cell line;PNAS 2002 Oct 15;99(21):13419−24.Epub 2002 Oct 7)。GnTI遺伝子はまた、gntI遺伝子を破壊するために変異されている細胞株のその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される、Koprivovaら、N−Glycosylation in the Moss Physcomitrella patens is Organized Similarly to that in Higher Plants,Plant Biology 5(2003):582−591によって記載されるように、植物中で破壊されてきた。
例えば、本明細書に記載される標的細胞は、糖タンパク質上で均一なグリコシル化パターンを生成することができる。標的細胞は、対照細胞と比較して,GnTI活性が減少している。アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi分子、リボザイム、およびsiRNA分子は、発現を破壊するために利用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi分子、リボザイム、およびsiRNA分子は、単独でまたは抗ウイルス化合物などの他の治療剤と組み合わせて使用することができる。このような方法はまた、本明細書に開示される構築物および方法とともに使用することもできる。例えば、標的細胞はまた、GnTI siRNAを発現可能な遺伝子移入ベクターを含むことができ、ここで、GnTI siRNAの発現は、構成的または調節可能であり得る。
本明細書に開示される方法によって作製されるタンパク質を被験体に投与する工程を包含する、選択されたタンパク質で被験体を治療する方法もまた開示される。選択されたタンパク質の投与の方法には、注射(皮下、表皮、皮内)、粘膜内(例えば、鼻、直腸、および膣)、腹腔内、静脈内、経口、または筋肉内が含まれるがこれらに限定されない。投与の他の様式には、経口および肺投与、坐剤、経皮適用が含まれる。投薬量処理は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。
被験体の細胞への外因性DNAの投与および取り込み(すなわち、遺伝導入またはトランスフェクション)を含む、本明細書に記載される方法において、開示される核酸は、当業者によって十分に理解されるように、細胞への核酸の送達のためにベクターの型であり得、それによって、抗体をコードするDNAフラグメントは、プロモーターの転写調節下にある。ベクターは、本明細書に開示されるベクターのいずれかであり得る。核酸またはベクターの細胞への送達は、種々のメカニズムを経由してであり得る。1つの例として、送達はリポソームを介してであり得、LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO−BRL,Inc.,Gaithersburg,MD)、SUPERFECT(Qiagen,IncHilden, Germany)およびTRANSFECTAM(Promega Biotec,Inc.,Madison,WI)などの市販のリポソーム調製剤、ならびに当該分野において標準的な手順に従って開発された他のリポソームを使用する。加えて、開示される核酸またはベクターは、Genetronics,Inc.(San Diego,CA)から利用可能である技術であるエレクトロポレーションによって、ならびにSONOPORATION machine(ImaRx Pharmaceutical Corp.,Tucson,AZ)を用いて、インビボで送達することができる。
1つの例において、本明細書に開示される組換えレトロウイルスは、感染させ、それによって広範な中和抗体をコードする核酸を感染細胞に送達するために使用することができる。
核酸またはベクターの非経口投与は、使用される場合、一般的には、注射によって特徴付けられる。注射液は、従来的な型で、液体溶液もしくは懸濁液、注射の前に液体中の懸濁液の溶液のために適切な固体型、またはエマルジョンとしてのいずれかで調製することができる。非経口投与のためのより最近に修正されたアプローチは、一定の投薬量が維持されるように、遅延放出系または持続放出系の使用を含む。例えば、非経口投与方法のためのアプローチのその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第3,610,795号を参照のこと。治療化合物の適切な製剤および種々の投与の経路のさらなる議論については、例えば、治療化合物の適切な製剤および種々の投与の経路のその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第19版)A.R. Gennaro編,Mack Publishing Company,Easton,PA(1995)を参照のこと。
ウイルス粒子形成を調節する因子についてのスクリーニングする方法もまた、本明細書に開示される。例えば、第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程であって、ここで、第1の核酸配列はGagポリタンパク質をコードし、第2の核酸配列はGag−Pro−Polポリタンパク質をコードし、第1の核酸配列および該第2の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1個以上の変異を含む、工程を包含する、ウイルス粒子形成を調節する因子をスクリーニングする方法が開示される。さらに、第1の核酸配列および第2の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現させることができ、第1の核酸配列および第2の核酸配列は、スクリーニングされる因子に作動可能に連結することができる。次に、エンベロープ構築物を細胞に導入することができ、このエンベロープ構築物は、エンベロープ糖タンパク質をコードする第3の核酸配列を含むことができ、ここで、この第3の核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。次いで、細胞は、ウイルス粒子の形成を可能にするために適切な条件下で培養することができる。次いで、ウイルス粒子を検出することができ、対照と比較した、スクリーニングされた薬剤の存在下でのウイルス粒子の数の増加または減少は、その因子がウイルス粒子形成を調節することを示す。対照培養は別個の培養であり得、またはその因子の投与の前もしくは後の同じ培養であり得る。調節可能な配列を含む調節因子構築物もまた細胞に導入することができ、ここで、調節可能なエレメントは、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。種々の調節可能な転写制御因子および調節因子配列が、本明細書の全体を通して議論される。例えば、転写制御エレメントはCMVプロモーターであり得、そして調節可能エレメントはtetRまたはtetAであり得る。
陽性パッケージング細胞形質転換体(すなわち、取り上げられ、レトロウイルスベクターを組み込まれた細胞)は、当該分野で周知である種々の選択マーカーを使用するためにスクリーニングすることができる。例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)、およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(β−gal)などのマーカー遺伝子は、構築物中に含めることができ、例えば、酵素活性または薬物耐性アッセイを使用してアッセイすることができる。代替液には、細胞は、ウイルスタンパク質産生の尺度として、Goffら(1981)J.Virol.38:239に記載されるように、逆転写酵素(RT)活性についてのアッセイすることができる。
同様のアッセイは、望ましくない複製可能なヘルパーウイルスの細胞をパッケージングすることによって、産生について試験するために使用することができる。例えば、本明細書に記載されるものなどのマーカー遺伝子は、これもまた本明細書に開示される構築物の中に含めることができる。本明細書に記載されるパッケージング構築物を用いる標的細胞の一過性トランスフェクション後、パッケージング細胞(本明細書に開示されるパッケージング構築物を少なくとも含む細胞)は、他の非パッケージング細胞とともにサブ培養することができる。これらの非パッケージング細胞は、マーカー遺伝子を有する本発明の組換え複製欠損構築物で感染させることができる。しかし、これらの非パッケージング細胞はウイルス粒子を産生するために必要な遺伝子(例えば、gag、pol、およびenv遺伝子)を含まないので、これらは、次には、これらの他の細胞とともにサブ培養したときに他の細胞に感染しないはずである。これらの他の細胞が、非パッケージング細胞とともにサブ培養したときにマーカー遺伝子の存在について陽性であるならば、望ましくない複製可能なウイルスが産生される。
したがって、望ましくないヘルパーウイルスの産生について試験するために、本発明のパッケージング細胞は、第1の細胞株(例えば、NIH3T3)とともにサブ培養することができ、これは、次には、マーカー遺伝子またはRT活性の存在について試験され、複製可能なヘルパーレトロウイルスの存在を示す。マーカー遺伝子は、当該分野において周知であるように、例えば、FACS、染色、および酵素活性アッセイを使用するためにアッセイすることができる。
トランスジェニック動物を作製するための方法もまた、本明細書に開示される。具体的には、本明細書に開示される方法によって作製したウイルス粒子を接合体に導入する工程;この接合体を分娩まで成長させる工程;そのゲノムが、目的の遺伝子を発現可能である核酸構築物を含む動物を入手する工程;F1子孫を得るために、この動物を非トランスジェニック動物と交配させる工程;および、そのゲノムが、目的の遺伝子を発現可能であるかまたはその遺伝子を含むことが可能である核酸構築物を含む動物を選択する工程であって、ここで、この動物が、選択された目的の配列を発現するか、またはその配列を含む、工程を包含する、トランスジェニック動物を作製するための方法が開示される。本明細書に開示される方法によって作製されたトランスジェニック動物もまた開示される。
本明細書のウイルス粒子は、本発明の方法を実施する目的のために、トランスジェニック非ヒト動物を産生するために動物のゲノムに導入することができる。選択マーカーはまた、目的の配列を含むこれらの動物を同定するためのレポーターとして使用することもできる。例えば、光生成タンパク質をレポーターとして使用することができ、画像化は、代表的には、インタクトな生きている非ヒトトランスジェニック動物、例えば、生きているトランスジェニック齧歯類(例えば、マウスまたはラット)を使用して実行される。選択した動物細胞に核酸を導入するために使用することができる任意の技術が利用可能である(「Transgenic Animal Technology:A Laboratory Handbook」Carl A.Pinkert(編)第1版,Academic Press;ISBN:0125571658;「Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual」Brigid Hoganら,ISBN:0879693843,出版社:Cold Spring Harbor Laboratory Press,刊行日:1999年9月,第2版、これらは、核酸を動物細胞に導入するために使用することができる技術の教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される)。種々の形質転換技術が当該分野において周知である。選択した動物細胞に核酸を導入するために使用することができる方法には以下が含まれるがこれらに限定されない。
(i)核への直接的マイクロインジェクション:ウイルス粒子は、組換えDNAを機械的に移入するために、マイクロピペットを使用して、動物の細胞核に直接的にマイクロインジェクションすることができる。この方法は、核以外の細胞内区画に露出せず、高頻度で安定な組換え体を生じるという利点を有する。動物細胞核への直接的マイクロインジェクションのその技術の教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される、Capecchi,M.,Cell 22:479−488(1980)を参照のこと。
例えば、雄性前核膜の形成後可能な限り初期に、および接合体雌性前核によってそれがプロセスされる前に、ウイルス粒子は、接合体の初期雄性前核にマイクロインジェクションすることができる。したがって、この方法に従うマイクロインジェクションは、雄性および雌性の前核が十分に分かれており、両方が細胞膜に近接して位置しているときに着手するべきである。例えば、Wagnerらへの米国特許第4,873,191号(1989年10月10日発行);およびRicha,J.,(2001)「Production of Transgenic Mice」Mol.Biotech.,17:261−8を参照のこと。これらは、接合体の初期雄性前核への直接的マイクロインジェクションのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
(ii)ES細胞トランスフェクション:本発明のウイルス粒子はまた、胚性幹(ES)細胞に導入することもできる。標的ベクターとの相同組換えを受けるES細胞クローンが同定され、次いで、ES細胞−マウスキメラが産生される。ホモ接合性動物は、ヘミ接合性キメラ動物を交配させることによって産生される。手順は、例えば、Roller,B.H.およびSmithies,O.,(1992)「Altering genes in animals by gene targeting」Ann.R.Imm 10:705−30において記載されている。
(iii)エレクトロポレーション:本発明のウイルス粒子はまた、エレクトロポレーションによって動物細胞に導入することもできる。この技術において、動物細胞は、ウイルス粒子の存在下で電気穿孔される。高電界強度の電気パルスが生体膜を可逆的に浸透可能にし、核酸の導入を可能にする。エレクトロポレーションの間に作製された孔は、核酸などの高分子の取り込みを可能にする。手順は、例えば、Potter,H.ら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.81:7161−7165(1984);およびSambrook,第16章において記載されており、これらは、エレクトロポレーションによって動物細胞に核酸またはウイルス粒子を導入することのそれらの教示のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
(iv)リン酸カルシウム沈殿:ウイルス粒子はまた、直接的取り込みの他の方法によって、例えば、リン酸カルシウムを使用して、細胞に移入することができる。例えば、Graham,F.およびA.Van der Eb,Virology 52:456−467(1973);およびSambrook,第16章において記載されており、これらは、リン酸カルシウム沈殿によって動物細胞に核酸またはウイルス粒子を導入することのそれらの教示のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
(v)リポソーム:人工膜ベシクル(リポソーム)中への核酸のカプセル化、続いて標的細胞膜とのリポソームの融合もまた、動物細胞に核酸を導入するために使用することができる。Mannino,R.およびS.Gould−Fogerite,BioTechniques,6:682(1988)を参照のこと。これは、動物細胞に核酸を導入するためにリポソームを使用することのその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
(vi)ポリブレンおよびDEAE−デキストランを使用するトランスフェクション:これらの技術はSambrook,第16章において記載されており、これは、動物細胞に核酸を導入するためにポリブレンおよびDEAE−デキストランを使用するトランスフェクションを使用することのその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
(vii)プロトプラスト融合:プロトプラスト融合は、代表的には、培養動物細胞との、高コピー数の目的のプラスミドを有する細菌プロトプラストの融合を含み、通常はポリエチレングリコールを用いる処理によって媒介される(Rassoulzadegan,M.ら、Nature,295:257(1982)、これは、動物細胞に核酸を導入するためにプロトプラスト融合を使用することのその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される)。
(iix)弾道穿通:核酸セグメントの導入のための別の方法は、小さなビーズもしくは粒子のマトリックス中、または表面上のいずれかでの、核酸を有する小さな粒子による高速弾道穿通である。Kleinら、Nature,327,70−73,1987。これは、動物細胞に核酸を導入するために弾道穿通を使用することのその教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
エレクトロポレーションは容易さの利点を有し、広範に適用可能であることが見い出されているが、標的細胞の実質的な画分がエレクトロポレーションの間に殺傷される可能性がある。それゆえに、感受性が高い細胞および少量でのみ入手可能な細胞にとっては、核への直接的なマイクロインジェクションが好ましくあり得る。また、高い効率の核酸の組み込みがとりわけ重要である場合、例えば、選択マーカーの使用を伴わない形質転換(上記に議論されるようなもの)などの場合は、核への直接的マイクロインジェクションが有利な方法である。なぜなら、代表的には5〜25%の標的細胞が、マイクロインジェクションされた核酸を安定に組み込んだからである。
目的の配列を含むトランスジェニック動物もまた、本明細書に開示される。例えば、KISS−1、FOX P3、NF Kβ、マイクロRNA 223、またはCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニック動物が本明細書に開示される。
本明細書に記載される遺伝子移入構築物を含むトランスジェニック動物もまた本明細書に開示される。本明細書に開示される方法によって作製されるトランスジェニック動物もまた開示される。
本願を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本明細書に記載される化合物、組成物、および方法をより完全に説明するために、それらの全体が参照により本願に援用される。
種々の修飾およびバリエーションを、本明細書に記載される化合物、組成物、および方法に対して作製することができる。本明細書に記載される化合物、組成物、および方法の他の局面は、本明細書に開示される化合物、組成物、および方法の詳細および実施の考慮から明らかである。詳細な説明および実施例は例示として見なされることが意図される。
以下の実施例は、本明細書に記載され、かつ特許請求される化合物、組成物、物品、装置、および/または方法がいかにして作製および評価されるかの完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、純粋に例示的であることを意図しており、発明者らが彼らの発明であると見なしていることの範囲を限定することを意図しない。数字(例えば、量、温度など)に関して正確さを保証するための努力は行われてきたが、ある程度の誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されない限り、部は重量部であり、温度は℃または大気温度であり、圧力は大気圧またはその周辺である。記載されるプロセスから得られる生成物の純度および収率を最適化するために使用できる、反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、ならびに他の反応範囲、および条件の数値のバリエーションおよび組み合わせが存在する。合理的かつ日常的な実験のみが、このようなプロセス条件を最適化するために必要である。
実施例1
テトラサイクリンベースの単一の誘導性可逆的レンチベクターの構築
テトラサイクリンベースの単一の誘導性可逆的レンチベクターを、目的の配列、eGFPの配列の発現を駆動するために構築した。最初に、1.2kbのヒトEFl−aプロモーターをPCRによってpEF4/His(Invitrogen)から増幅し、EcoRIおよびBamHI制限酵素を使用してpHRCMVeGFP/blasにクローニングした。得られたベクターはpHREFeGFP/blasと称した。次に、テトラサイクリンリプレッサーをコード可能な配列はコドン最適化し、SV40核局在化シグナルに連結した。次いで、SV40核局在化シグナルに連結された、コードされた最適化テトラサイクリンリプレッサー遺伝子は、NcoIおよびXhoI制限酵素を使用して、eGFPを置き換えたpHREFeGFP/blasにクローニングした。得られたベクターはpHREFtet/blasと称した。次いで、500bpのヒトCMVプロモーターをPCRによって増幅し、3’CMVプロモーターに2つのtetオペレーター配列を導入した。このPCRフラグメントは、ClaIおよびEcoRI制限酵素を使用して、pHREFtet/blasにクローニングした。得られたベクターはpHRCMVO2(R)EFtet/blasと称した。次いで、CMVプロモーターの方向を逆転した。次いで、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含むEGFPフラグメントを、pHRCMVO2(R)EFtet/blasにクローニングし、これは、次いで、CMVプロモーターによって制御された。得られたベクターはpHReGFPO2/EFtet/blasと称した。次に、1.2kbのヒトユビキチン6プロモーターをPCRによってpUB6/V5−His(Invitrogen)から増幅し、EcoRIおよびNcoI制限酵素を使用してpHReGFPO2/EFtet/blasにクローニングした。得られたベクターはpHReGFPO2/UB6tet/blasと称した。この段階後、300bpの5’ヒトCMVプロモーター配列を含む1.6kbのCAGプロモーター、および1.2kbのニワトリβ−アクチンプロモーターを、pDRIVE−CAG(Invivogen)から得て、pHReGFPO2/EFtet/blasにクローニングした。pHReGFPO2/EFtet/blasはSnaBIおよびNcoI制限酵素によって切断し、5’CMV配列およびEFプロモーターを除去し、CAGプロモーターで置き換えた。得られた構築物はpHReGFPO2/CAGtet/blasと称した。
テトラサイクリンベースの単一の誘導性可逆的レンチベクターの構築
テトラサイクリンベースの単一の誘導性可逆的レンチベクターを、目的の配列、eGFPの配列の発現を駆動するために構築した。最初に、1.2kbのヒトEFl−aプロモーターをPCRによってpEF4/His(Invitrogen)から増幅し、EcoRIおよびBamHI制限酵素を使用してpHRCMVeGFP/blasにクローニングした。得られたベクターはpHREFeGFP/blasと称した。次に、テトラサイクリンリプレッサーをコード可能な配列はコドン最適化し、SV40核局在化シグナルに連結した。次いで、SV40核局在化シグナルに連結された、コードされた最適化テトラサイクリンリプレッサー遺伝子は、NcoIおよびXhoI制限酵素を使用して、eGFPを置き換えたpHREFeGFP/blasにクローニングした。得られたベクターはpHREFtet/blasと称した。次いで、500bpのヒトCMVプロモーターをPCRによって増幅し、3’CMVプロモーターに2つのtetオペレーター配列を導入した。このPCRフラグメントは、ClaIおよびEcoRI制限酵素を使用して、pHREFtet/blasにクローニングした。得られたベクターはpHRCMVO2(R)EFtet/blasと称した。次いで、CMVプロモーターの方向を逆転した。次いで、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含むEGFPフラグメントを、pHRCMVO2(R)EFtet/blasにクローニングし、これは、次いで、CMVプロモーターによって制御された。得られたベクターはpHReGFPO2/EFtet/blasと称した。次に、1.2kbのヒトユビキチン6プロモーターをPCRによってpUB6/V5−His(Invitrogen)から増幅し、EcoRIおよびNcoI制限酵素を使用してpHReGFPO2/EFtet/blasにクローニングした。得られたベクターはpHReGFPO2/UB6tet/blasと称した。この段階後、300bpの5’ヒトCMVプロモーター配列を含む1.6kbのCAGプロモーター、および1.2kbのニワトリβ−アクチンプロモーターを、pDRIVE−CAG(Invivogen)から得て、pHReGFPO2/EFtet/blasにクローニングした。pHReGFPO2/EFtet/blasはSnaBIおよびNcoI制限酵素によって切断し、5’CMV配列およびEFプロモーターを除去し、CAGプロモーターで置き換えた。得られた構築物はpHReGFPO2/CAGtet/blasと称した。
実施例2
高力価のテトラサイクリンベースの単一の誘導性可逆的ウイルス粒子の生成
293Y細胞を、pHReGFPO2/EFtet/blas、pHReGFPO2/CAGtet/blas;pHReGFPO2/UB6tet/blasおよびpHReGFPO2/CAGtet/blasを含む、パッケージング構築物、エンベロープ構築物、および異なる遺伝子移入構築物とともに同時トランスフェクトし、異なるバージョンの誘導性ウイルス粒子を産生した。これらの同時トランスフェクションから得られたウイルス粒子力価は、HeLa細胞中でのeGFP発現を決定するための蛍光顕微鏡法を使用して測定した。トランスフェクト細胞由来の上清の力価は1〜4×106/mlであったのに対し、濃縮上清(400倍高い)の力価は2〜10×108/mlであった。
高力価のテトラサイクリンベースの単一の誘導性可逆的ウイルス粒子の生成
293Y細胞を、pHReGFPO2/EFtet/blas、pHReGFPO2/CAGtet/blas;pHReGFPO2/UB6tet/blasおよびpHReGFPO2/CAGtet/blasを含む、パッケージング構築物、エンベロープ構築物、および異なる遺伝子移入構築物とともに同時トランスフェクトし、異なるバージョンの誘導性ウイルス粒子を産生した。これらの同時トランスフェクションから得られたウイルス粒子力価は、HeLa細胞中でのeGFP発現を決定するための蛍光顕微鏡法を使用して測定した。トランスフェクト細胞由来の上清の力価は1〜4×106/mlであったのに対し、濃縮上清(400倍高い)の力価は2〜10×108/mlであった。
実施例3
堅固に調節される誘導性単一レンチベクター
マウスT細胞株(4×104)は、pHReGFPO2/EFtet/blas(力価2.5×106/ml)由来の100μlのウイルス粒子上清で感染させた。翌日、感染細胞は以下の群に分けた:群1、これは、0.1μg DOX/mlを含む培地中でインキュベートした、および群2、これは、DOXを含まない培地中でインキュベートした。感染の3日後、細胞はFACS分析によって分析し、GFP発現のレベルを決定した。群1の分析は、16,195のGFP発現シグナル平均強度を示し、これは、群2と比較して44.2倍の増加であった。
堅固に調節される誘導性単一レンチベクター
マウスT細胞株(4×104)は、pHReGFPO2/EFtet/blas(力価2.5×106/ml)由来の100μlのウイルス粒子上清で感染させた。翌日、感染細胞は以下の群に分けた:群1、これは、0.1μg DOX/mlを含む培地中でインキュベートした、および群2、これは、DOXを含まない培地中でインキュベートした。感染の3日後、細胞はFACS分析によって分析し、GFP発現のレベルを決定した。群1の分析は、16,195のGFP発現シグナル平均強度を示し、これは、群2と比較して44.2倍の増加であった。
実施例4
単一レンチベクターはDOXに高度に感受性であり、遺伝子発現を迅速に誘導した
単一ベクター系において遺伝子発現を誘導するために必要とされるDOX濃度を決定するために、pHReGFPO2/EFtet/blas(力価2.5×106/ml)由来のウイルス粒子で感染させた細胞に、異なる濃度のDOXを加えた。GFP発現は蛍光顕微鏡法によってモニターした。図4Aは、15ngのDOXが、48時間以内にGFP発現を誘導するために十分であったことを示す。
単一レンチベクターはDOXに高度に感受性であり、遺伝子発現を迅速に誘導した
単一ベクター系において遺伝子発現を誘導するために必要とされるDOX濃度を決定するために、pHReGFPO2/EFtet/blas(力価2.5×106/ml)由来のウイルス粒子で感染させた細胞に、異なる濃度のDOXを加えた。GFP発現は蛍光顕微鏡法によってモニターした。図4Aは、15ngのDOXが、48時間以内にGFP発現を誘導するために十分であったことを示す。
実施例5
構成的プロモーター活性は、単一の誘導性レンチベクターの誘導可能なプロモーター活性に有意な影響を与える
テトラサイクリンリプレッサーの発現レベルが遺伝子移入ベクターの誘導可能な能力に影響を与えたか否かを決定するために、異なるプロモーターを遺伝子移入ベクターにクローニングして、テトラサイクリンリプレッサーの発現を駆動した。使用したプロモーターは、ヒトEF−1aプロモーター(pHReGFPO2/EF−la/blas)、CAGプロモーター(pHReGFPO2/CAGtet/blas)、およびヒトユビキチン6プロモーター(pHReGFPO2/UB6tet/blas)であった。EF−1aは3つの中では最強のプロモーターであったのに対して、ヒトユビキチン6プロモーターが最弱であった。293T細胞由来のウイルス粒子は、マウスT細胞株に感染させた。陽性感染細胞は、ブラストサイジン抗生物質を使用して選択した。3日間の選択後、感染細胞を2つの群に分けた:群1、これは、DOXを含む培地中でインキュベートした、および群2、これは、DOXを含まない培地中でインキュベートした。表1は、異なるベクターを使用したGFPの発現レベルの誘導を示す。
構成的プロモーター活性は、単一の誘導性レンチベクターの誘導可能なプロモーター活性に有意な影響を与える
テトラサイクリンリプレッサーの発現レベルが遺伝子移入ベクターの誘導可能な能力に影響を与えたか否かを決定するために、異なるプロモーターを遺伝子移入ベクターにクローニングして、テトラサイクリンリプレッサーの発現を駆動した。使用したプロモーターは、ヒトEF−1aプロモーター(pHReGFPO2/EF−la/blas)、CAGプロモーター(pHReGFPO2/CAGtet/blas)、およびヒトユビキチン6プロモーター(pHReGFPO2/UB6tet/blas)であった。EF−1aは3つの中では最強のプロモーターであったのに対して、ヒトユビキチン6プロモーターが最弱であった。293T細胞由来のウイルス粒子は、マウスT細胞株に感染させた。陽性感染細胞は、ブラストサイジン抗生物質を使用して選択した。3日間の選択後、感染細胞を2つの群に分けた:群1、これは、DOXを含む培地中でインキュベートした、および群2、これは、DOXを含まない培地中でインキュベートした。表1は、異なるベクターを使用したGFPの発現レベルの誘導を示す。
構成的プロモーターの効果は2つのレベルで見ることができ、最初にプロモーターは基底の漏出レベルに効果を与え、2番目には、構成的プロモーターは、目的の遺伝子(ここではeGFP)の最大発現レベルに影響を与える。強力な構成的プロモーターは、高レベルのテトラサイクリンリプレッサー発現を駆動でき、これは、DOXの非存在下で基底の漏出レベルを促進および制御する.CMVプロモーターベースの誘導性プロモーターは、しばしば、HaLa細胞などの他の細胞型との比較において、T細胞中で活性がより低い。
強力な構成的プロモーターが調節因子構築物に連結される場合、例えば、tetRに作動可能に連結されたEF−1αは、誘導性系に適用され、このような強力な構成的プロモーターは、CMVベースの誘導性プロモーター活性を刺激することができる。目的の遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターが、調節因子構築物の発現を駆動する強力な構成的プロモーターにさらに作動可能に連結される場合、目的の遺伝子の発現は、T細胞中で非常に活性になる。
実施例6
単一の誘導性レンチベクターを使用するeGFPトランスジェニックマウスの生成
22から24日齢の間の雌性マウス(B6株)を、以前に記載されたように(B.Hogan,R.UBeddington,F.UCostantini,E.ULacy,Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1994)、妊馬血清(PMS)およびヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)の組み合わせを用いて過剰排卵させた。ドナー胚は、B.Hogan,R.Beddington,F.Costantini,E. Lacy,Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1994)によって記載されるように、後で収集した。以前に記載された方法を使用して作製された濃縮ウイルス粒子(力価約2×108/ml)を、マイクロインジェクション系(CellTram,Eppendorf GmbH,Hamburg,Germany)を使用して、収集と同じ日に単細胞段階の胚に送達した。ピペットをガイドするためのマイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットは、透明帯を通して囲卵腔に押し出し、10plから100plのウイルスストックを胚に送達した。感染した胚は、KSOM−AA(Speciality Media,NJ)中で一晩培養し、これらの2細胞段階の胚は、トランスジェニック動物を作製する方法のその教示のためにその全体が本明細書に参照により援用される、B.Hogan,R.Beddington,F.Costantini,E.Lacy,Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY,(1994)によって記載されるように、偽妊娠雌(10週齢CD1)に移した。pHReGFPO2/EFtet由来の11例のファウンダー(本明細書ではEF−ファウンダーという)およびpHReGFPO2/CAGtet由来の8例のファウンダー(本明細書ではCAG−ファウンダーという)を同定した。
単一の誘導性レンチベクターを使用するeGFPトランスジェニックマウスの生成
22から24日齢の間の雌性マウス(B6株)を、以前に記載されたように(B.Hogan,R.UBeddington,F.UCostantini,E.ULacy,Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1994)、妊馬血清(PMS)およびヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)の組み合わせを用いて過剰排卵させた。ドナー胚は、B.Hogan,R.Beddington,F.Costantini,E. Lacy,Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1994)によって記載されるように、後で収集した。以前に記載された方法を使用して作製された濃縮ウイルス粒子(力価約2×108/ml)を、マイクロインジェクション系(CellTram,Eppendorf GmbH,Hamburg,Germany)を使用して、収集と同じ日に単細胞段階の胚に送達した。ピペットをガイドするためのマイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットは、透明帯を通して囲卵腔に押し出し、10plから100plのウイルスストックを胚に送達した。感染した胚は、KSOM−AA(Speciality Media,NJ)中で一晩培養し、これらの2細胞段階の胚は、トランスジェニック動物を作製する方法のその教示のためにその全体が本明細書に参照により援用される、B.Hogan,R.Beddington,F.Costantini,E.Lacy,Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY,(1994)によって記載されるように、偽妊娠雌(10週齢CD1)に移した。pHReGFPO2/EFtet由来の11例のファウンダー(本明細書ではEF−ファウンダーという)およびpHReGFPO2/CAGtet由来の8例のファウンダー(本明細書ではCAG−ファウンダーという)を同定した。
pHReGFPO2/EFtetおよびpHReGFPO2/CAGtetの2つのバージョンは、トランスジェニックマウスに対する有害な効果の可能性を回避するために、ブラスチシジン遺伝子を除去することによって、pHReGFPO2/Eftet/blasおよびpHReGFPO2/CAGtet/blasから生成した。ゲノムDNAは、3週間齢のファウンダーから抽出し、PCRおよびノーザンブロット分析によって分析して、陽性トランスジェニックマウスの存在および組み込み構築物のコピー数を決定した。表2は陽性トランスジェニックマウスの数を示す。
実施例7
DOXを含む飲料水を使用する、トランスジェニックマウスにおけるeGFPの誘導
誘導性構築物がインビボでeGFP発現を誘導し得るか否かを決定するために、トランスジェニックマウスに、100μg/ml DOXを含む飲料水を供給した。身体(足)およびPBMCにおけるGFP発現は、トランスジェニックマウスがDOXを供給される前後で、蛍光顕微鏡法およびFACS分析によって分析した。12例の陽性マウスのすべてが、PBMCと身体(足)の両方でeGFPの発現を誘導することが可能であったが、誘導可能なレベルはこれらのマウス間で変動した。eGFP発現は、DOX前のすべてのトランスジェニックマウスにおいて検出されたが、そのレベルはマウスにわたって変動した。eGFP発現は、トランスジェニックマウスがDOXを供給された後で有意に増加した。CAGプロモーターを含む構築物由来のウイルス粒子で感染されたトランスジェニックマウスは、EF−1aプロモーターを含む構築物由来のウイルス粒子で感染されたトランスジェニックマウスと比較して、最高レベルの誘導を生じた。これらのデータは、上記のインビトロの結果と異なっていた。
DOXを含む飲料水を使用する、トランスジェニックマウスにおけるeGFPの誘導
誘導性構築物がインビボでeGFP発現を誘導し得るか否かを決定するために、トランスジェニックマウスに、100μg/ml DOXを含む飲料水を供給した。身体(足)およびPBMCにおけるGFP発現は、トランスジェニックマウスがDOXを供給される前後で、蛍光顕微鏡法およびFACS分析によって分析した。12例の陽性マウスのすべてが、PBMCと身体(足)の両方でeGFPの発現を誘導することが可能であったが、誘導可能なレベルはこれらのマウス間で変動した。eGFP発現は、DOX前のすべてのトランスジェニックマウスにおいて検出されたが、そのレベルはマウスにわたって変動した。eGFP発現は、トランスジェニックマウスがDOXを供給された後で有意に増加した。CAGプロモーターを含む構築物由来のウイルス粒子で感染されたトランスジェニックマウスは、EF−1aプロモーターを含む構築物由来のウイルス粒子で感染されたトランスジェニックマウスと比較して、最高レベルの誘導を生じた。これらのデータは、上記のインビトロの結果と異なっていた。
実施例8
トランスジェニックマウスの身体(指)におけるeGFP発現の可視化は誘導性かつ可逆的であった
遺伝子移入構築物中に含まれる導入遺伝子が全身を通って発現できるか否かを決定するために、CAGプロモーターによって駆動されるeGFPを含む、上記のような遺伝子移入構築物を使用して、上記のようなトランスジェニック動物を生成した。CAGプロモーターの制御下にあるeGFPを用いると、eGFPは全身を通って発現できることが可能である。上記の遺伝子移入構築物を含むトランスジェニック動物の全身を通ってGFPが発現したか否かを決定するために、トランスジェニックマウスの指を蛍光顕微鏡法によって分析した。この研究のために、上記のCAGファウンダーのうちの4つ(CAGファウンダー1#、2#、6#、および7#と名付けた)を分析のために選択した。eGFPの発現は、DOXの添加後2#および6#で見られ、これらの2例のマウスにおけるGFP発現がDOXによって堅固に制御できることを示唆した。CAGファウンダー1#におけるeGFP発現は、試験したトランスジェニックファウンダーの間でDOXの添加後に最も高い発現を示したのに対し、その指は、DOX誘導なしでは最低レベルでeGFPを発現した。CAGファウンダー7#は、DOXの添加に応答したeGFP発現のある程度の遅れを示し、全体の発現強度は、他のCAGファウンダーの発現強度と比較して弱かった。
トランスジェニックマウスの身体(指)におけるeGFP発現の可視化は誘導性かつ可逆的であった
遺伝子移入構築物中に含まれる導入遺伝子が全身を通って発現できるか否かを決定するために、CAGプロモーターによって駆動されるeGFPを含む、上記のような遺伝子移入構築物を使用して、上記のようなトランスジェニック動物を生成した。CAGプロモーターの制御下にあるeGFPを用いると、eGFPは全身を通って発現できることが可能である。上記の遺伝子移入構築物を含むトランスジェニック動物の全身を通ってGFPが発現したか否かを決定するために、トランスジェニックマウスの指を蛍光顕微鏡法によって分析した。この研究のために、上記のCAGファウンダーのうちの4つ(CAGファウンダー1#、2#、6#、および7#と名付けた)を分析のために選択した。eGFPの発現は、DOXの添加後2#および6#で見られ、これらの2例のマウスにおけるGFP発現がDOXによって堅固に制御できることを示唆した。CAGファウンダー1#におけるeGFP発現は、試験したトランスジェニックファウンダーの間でDOXの添加後に最も高い発現を示したのに対し、その指は、DOX誘導なしでは最低レベルでeGFPを発現した。CAGファウンダー7#は、DOXの添加に応答したeGFP発現のある程度の遅れを示し、全体の発現強度は、他のCAGファウンダーの発現強度と比較して弱かった。
CAGファウンダーからのDOXの除去の12日後、マウスの指を再度蛍光顕微鏡法によって分析した。CAGファウンダー1#を例外として、指におけるGFP発現の強度は、誘導前の発現レベルと類似の発現レベルまで、劇的に低下した。これらの結果は、これらのトランスジェニックマウスにおけるGFPマウスが、DOXの存在または非存在に依存して、誘導性かつ可逆的であり得ることを示す。
実施例9
トランスジェニックマウスの血液細胞におけるGFP発現は、DOXによって誘導性かつ可逆的であった
CAGファウンダーマウス由来のGFP発現は、4つの異なる時点でモニターした:(1)マウスが、それらの飲料水中のDOX(0.1mg/ml DOX)を供給される前、(2)マウスが、それらの飲料水中のDOX(0.1mg/ml DOX)を供給された12日後、(3)(2)の時点より、飲料水中からのDOXの除去の12日後、および、次いで、(3)の時点のマウスに、1日および2日の間、それらの飲料水中のDOX(0.1mg/ml DOX)を供給した後である。CAGファウンダー1#マウスとCAGファウンダー2#マウスの両方の血液細胞のGFP発現は、COXによって堅固に制御された。加えて、GFP発現は、DOXの中止の際に逆転できた。さらに、試験した血液細胞中のGFP発現レベルは、バックグラウンドレベル(DOXの添加前のレベル)に戻ることができた。このデータは、単一のレンチウイルス系が、遺伝子移入構築物の中で、配列の発現を誘導および逆転できることを示す。
トランスジェニックマウスの血液細胞におけるGFP発現は、DOXによって誘導性かつ可逆的であった
CAGファウンダーマウス由来のGFP発現は、4つの異なる時点でモニターした:(1)マウスが、それらの飲料水中のDOX(0.1mg/ml DOX)を供給される前、(2)マウスが、それらの飲料水中のDOX(0.1mg/ml DOX)を供給された12日後、(3)(2)の時点より、飲料水中からのDOXの除去の12日後、および、次いで、(3)の時点のマウスに、1日および2日の間、それらの飲料水中のDOX(0.1mg/ml DOX)を供給した後である。CAGファウンダー1#マウスとCAGファウンダー2#マウスの両方の血液細胞のGFP発現は、COXによって堅固に制御された。加えて、GFP発現は、DOXの中止の際に逆転できた。さらに、試験した血液細胞中のGFP発現レベルは、バックグラウンドレベル(DOXの添加前のレベル)に戻ることができた。このデータは、単一のレンチウイルス系が、遺伝子移入構築物の中で、配列の発現を誘導および逆転できることを示す。
実施例10
DOXによる複数器官におけるGFP発現の誘導
上記のレンチウイルス系が、動物の全身を通って目的の配列を発現可能であるか否かを決定するために、GFPの発現を試験した。一旦、CAGファウンダー2#が生成されると、動物を解剖し、蛍光顕微鏡法を使用して、器官を個々に分析した。高GFP発現は、Tgマウス(CAGファウンダー2#)の骨および筋肉において見られたが、GFP発現は正常マウスにおいては見られなかった。Tgマウスにおいては、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、および腸で高GFP発現が観察されたのに対して、Tgマウスの脳ではGFP発現はより弱かった。このデータは、トランスジェニックマウスにおけるeGFP発現が、全身を通してDOXによって誘導できるが、誘導レベルは異なる器官の間で変動し得ることを示す。
DOXによる複数器官におけるGFP発現の誘導
上記のレンチウイルス系が、動物の全身を通って目的の配列を発現可能であるか否かを決定するために、GFPの発現を試験した。一旦、CAGファウンダー2#が生成されると、動物を解剖し、蛍光顕微鏡法を使用して、器官を個々に分析した。高GFP発現は、Tgマウス(CAGファウンダー2#)の骨および筋肉において見られたが、GFP発現は正常マウスにおいては見られなかった。Tgマウスにおいては、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、および腸で高GFP発現が観察されたのに対して、Tgマウスの脳ではGFP発現はより弱かった。このデータは、トランスジェニックマウスにおけるeGFP発現が、全身を通してDOXによって誘導できるが、誘導レベルは異なる器官の間で変動し得ることを示す。
実施例11
誘導性GFP発現のために必要とされる飲料水中のDOXの濃度の決定
以前の研究は、tet調節可能な系を含むトランスジェニックマウスの飲料水中の0.1〜10mg/mlのDOX濃度が、動物の中で誘導性遺伝子発現のために必要とされると報告した。上記のトランスジェニックマウスにおけるGFPの誘導性発現のために必要とされるDOXの濃度を決定するために、0μg/ml(群1)、4μg/ml(群2)、20μg/ml(群3)、および100μg/ml(群4)を含む、異なる濃度のDOXを含む飲料水を供給した4つの群に、CAGファウンダー6#からのF1マウスを分けた。GFP発現は、マウスDOXの供給の0、1、2、3、5、および18日後に、UV光下で、トランスジェニックマウスの指のGFP発現を可視化することによってモニターした。実験の過程にわたって試験したマウスの指の蛍光シグナルの強度を観察した。群3および群4のマウスは、DOX供給の1日後にGFPを発現し始め、このことは、水を飲むことに通して、DOXが迅速に遺伝子発現を誘導できることを示した。群3および4の蛍光シグナルの強度は、DOX供給の5日後にそれらの最高レベルのGFP発現を発現した。加えて、群2のマウスに供給した4μg/mlのDOXは、GFP発現を誘導するために十分であったが、しかし、その誘導は遅れ、強度は群3および4のマウスと比較して相対的に低かった。蛍光シグナルの強度が用量依存的な様式で現れることもまた注目される。
誘導性GFP発現のために必要とされる飲料水中のDOXの濃度の決定
以前の研究は、tet調節可能な系を含むトランスジェニックマウスの飲料水中の0.1〜10mg/mlのDOX濃度が、動物の中で誘導性遺伝子発現のために必要とされると報告した。上記のトランスジェニックマウスにおけるGFPの誘導性発現のために必要とされるDOXの濃度を決定するために、0μg/ml(群1)、4μg/ml(群2)、20μg/ml(群3)、および100μg/ml(群4)を含む、異なる濃度のDOXを含む飲料水を供給した4つの群に、CAGファウンダー6#からのF1マウスを分けた。GFP発現は、マウスDOXの供給の0、1、2、3、5、および18日後に、UV光下で、トランスジェニックマウスの指のGFP発現を可視化することによってモニターした。実験の過程にわたって試験したマウスの指の蛍光シグナルの強度を観察した。群3および群4のマウスは、DOX供給の1日後にGFPを発現し始め、このことは、水を飲むことに通して、DOXが迅速に遺伝子発現を誘導できることを示した。群3および4の蛍光シグナルの強度は、DOX供給の5日後にそれらの最高レベルのGFP発現を発現した。加えて、群2のマウスに供給した4μg/mlのDOXは、GFP発現を誘導するために十分であったが、しかし、その誘導は遅れ、強度は群3および4のマウスと比較して相対的に低かった。蛍光シグナルの強度が用量依存的な様式で現れることもまた注目される。
FACSを使用して,GFPを発現する陽性血液細胞を単離および定量した。図5は、マウスDOXの供給前およびその18日後の血液細胞中でのGFP発現のFACS分析の結果を示す。群2、3、および4のすべてのマウスについて、GFP発現細胞の数と強度の両方が、マウスにDOXを供給した後で増加した。
DOXの薬物動態学を決定するために、群4マウスからの43%の血液細胞がGFPを発現し(DOX供給の18日後)、このレベルを、100パーセント誘導の閾値を設定するために使用した。図6は、群2、3、および4のマウスの間の血液細胞中でのGFP発現の誘導動力学を示す。このデータは、DOXが、開示されたトランスジェニックマウスの血液および指におけるGFP発現を誘導できること、および誘導レベルが用量依存性であることを明らかにする。
実施例12
shRNAを発現するためのテトラサイクリンベースの単一の誘導性で可逆的なレンチベクターの構築
ヒトH1プロモーターを、NotIを含むセンスプライマー
shRNAを発現するためのテトラサイクリンベースの単一の誘導性で可逆的なレンチベクターの構築
ヒトH1プロモーターを、NotIを含むセンスプライマー
マウスH1プロモーターを、NotIを含むセンスプライマー
これらの実験のために使用した目的の配列は、eGFPコード領域(nt126から144まで)を標的とするように設計されたshRNAであった。shRNAは、互いにアニールさせたセンスプライマー
実施例13
マウスH1誘導性プロモーターによる遺伝子発現の効率的サイレンシング
eGFPを発現可能である異なる細胞株[HeLa細胞、CEM−SS細胞(ヒトT細胞株)およびマウスT細胞株]を、pHRhHlGFPi(126)EFtet/blasおよびpHRmHlGFPi(126)EFtet/blas由来のウイルス粒子で感染させた。感染の2日後、レンチベクターを含む細胞は、ブラスチシジンに細胞を3日間曝露することによって、抗生物質(10μg/mlのブラスチシジン)を用いて選択した。陽性細胞は、2つの群、0.5μg/ml DOXを含む培地中で培養した群1、およびDOXを欠く培地中で培養した群2に分けた。DOX誘導の7日後、群1および2からの細胞を、FACSを使用して分析した。図7は、ヒトとマウスの両方のH1プロモーターがshRNAを発現可能であり、これは、次には、HeLa細胞におけるeGFP発現を効率的にサイレンシングできることを示す。eGFP発現の抑制は50倍までであった。
マウスH1誘導性プロモーターによる遺伝子発現の効率的サイレンシング
eGFPを発現可能である異なる細胞株[HeLa細胞、CEM−SS細胞(ヒトT細胞株)およびマウスT細胞株]を、pHRhHlGFPi(126)EFtet/blasおよびpHRmHlGFPi(126)EFtet/blas由来のウイルス粒子で感染させた。感染の2日後、レンチベクターを含む細胞は、ブラスチシジンに細胞を3日間曝露することによって、抗生物質(10μg/mlのブラスチシジン)を用いて選択した。陽性細胞は、2つの群、0.5μg/ml DOXを含む培地中で培養した群1、およびDOXを欠く培地中で培養した群2に分けた。DOX誘導の7日後、群1および2からの細胞を、FACSを使用して分析した。図7は、ヒトとマウスの両方のH1プロモーターがshRNAを発現可能であり、これは、次には、HeLa細胞におけるeGFP発現を効率的にサイレンシングできることを示す。eGFP発現の抑制は50倍までであった。
ヒトH1プロモーターは、ヒトT細胞株におけるeGFP発現をサイレンシングする際により効率的ではない(1〜2倍)のに対して、マウスH1プロモーターはeGFP発現を10倍まで減少した(図8)こともまた注目される。マウスT細胞株においては、eGFP発現は、マウスH1プロモーターによってバックグラウンドレベルまで減少したが、ヒトH1プロモーターは、eGFP発現を4倍まで減少した。このデータは、上記のウイルス粒子で感染した細胞中のeGFP発現レベルが、DOXによって堅固に制御されることを示す。
実施例14
単一のレンチベクターによる内因性タンパク質CXCR4の誘導性サイレンシング
単一の誘導性レンチベクターが内因性タンパク質発現を減少できるか否かを決定するために、マウスCXCR4 mRNAを標的とするshRNAを含む単一のレンチベクターを構築した。shRNAは、互いにアニールさせたセンスプライマー
単一のレンチベクターによる内因性タンパク質CXCR4の誘導性サイレンシング
単一の誘導性レンチベクターが内因性タンパク質発現を減少できるか否かを決定するために、マウスCXCR4 mRNAを標的とするshRNAを含む単一のレンチベクターを構築した。shRNAは、互いにアニールさせたセンスプライマー
マウスT細胞株の2つの群を、pHRmHlGFPi(682)EFtet/GFP由来のウイルス粒子で感染させた。群1は5×106IU/mlの力価で感染させ、群2は5×107IU/mlの力価で感染させた。感染の3日後、各群の細胞を、2つのさらなる群に下位分割した。さらなる群は、0.5μg/mlのDOXを含む培地(群1aおよび2a)またはDOXを含まない培地(群1bおよび2b)のいずれかで培養した。培養の5日後、すべての細胞を、PE(BD Pharmgen)と結合体化した抗CXCR4抗体で染色した。次いで、これらの染色した細胞をFACSによって分析した。pHRmHlGFPi(682)EFtet/GFP由来のウイルス粒子の5×106IU/mlで感染させたこれらの細胞は85%の細胞でGFPを発現するのに対して、5×107IU/mlのウイルス粒子で感染させた細胞は98%の細胞においてGFPを発現した(図9)。DOXの存在下では、群1aの細胞はCXCR4の強度を60%減少したのに対して、群2aの細胞はCXCR4の強度を85%減少した。これらのデータは、レンチウイルスがshRNA活性を誘導でき、これが次には、内因性タンパク質発現を減少できることを示す。加えて、これらのデータは、複数コピーの組み込んだベクターが、高レベルの遺伝子サイレンシングを誘発できることを示す。
実施例15
単一のレンチベクターは、トランスジェニックマウスにおいて遺伝子発現をサイレンシングするために、誘導性にshRNAを発現できる
単一のレンチベクターが動物においてタンパク質発現を減少するためにshRNAを発現できるか否かを決定するために、Jackson研究室からのeGFPトランスジェニックマウスの同種系統を標的として選択した。eGFPトランスジェニックマウスの同種系統を使用して、eGFPタンパク質発現に対するshRNAの効果を測定することができる。この実験のためのレンチウイルスを生成するために、pHRmHlGFPi(126)EFtet/blasプラスミドのEF−1aプロモーターをCAGプロモーターで置き換えて、トランスジェニックマウスにおける単一のレンチベクターの遺伝子発現の能力を改善した。得られたベクターは、pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blasと称した。細胞培養において、pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas由来のベクターは、pHRmHlGFPi(126)EFtet/blasと同様に、GFP発現を誘導性にサイレンシングすることが可能であるshRNAを発現した。
単一のレンチベクターは、トランスジェニックマウスにおいて遺伝子発現をサイレンシングするために、誘導性にshRNAを発現できる
単一のレンチベクターが動物においてタンパク質発現を減少するためにshRNAを発現できるか否かを決定するために、Jackson研究室からのeGFPトランスジェニックマウスの同種系統を標的として選択した。eGFPトランスジェニックマウスの同種系統を使用して、eGFPタンパク質発現に対するshRNAの効果を測定することができる。この実験のためのレンチウイルスを生成するために、pHRmHlGFPi(126)EFtet/blasプラスミドのEF−1aプロモーターをCAGプロモーターで置き換えて、トランスジェニックマウスにおける単一のレンチベクターの遺伝子発現の能力を改善した。得られたベクターは、pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blasと称した。細胞培養において、pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas由来のベクターは、pHRmHlGFPi(126)EFtet/blasと同様に、GFP発現を誘導性にサイレンシングすることが可能であるshRNAを発現した。
pHRmHlGFPi(126)EFtet/blasまたはpHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas構築物由来の2×108IU/mlのウイルス粒子を、マイクロインジェクション系(上記)を使用して,GFPマウスのホモ接合性株の単細胞段階の胚に送達した。得られたトランスジェニックマウスは、本明細書では、GFP/CAGファウンダーマウスという。翌日、2細胞段階の胚をCD1乳母に移植した。pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas由来のウイルス粒子を注入した11例のマウスの内の5例が、PCR分析によって確認されたように、導入遺伝子について陽性であったのに対し、pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas由来のレンチベクターを注入した9例のマウスの内の4例が、PCR分析によって確認されたように、導入遺伝子について陽性であった。このようなものとして、PCR分析によって導き出されるような導入遺伝子マウスの割合は、2つのレンチベクターの各々についておよそ40%であった。
導入遺伝子発現について陽性であると同定された2例のマウス、GFP/CAGファウンダー6#およびGFP/CAGファウンダー9#は、4週間飼育した。次いで、4週齢トランスジェニックマウスの尾静脈からの血液を収集し、血液細胞中のGFP発現のレベルをFACS分析によって分析した。次いで、shRNAの発現を誘導するために、同じマウスに、それらの飲料水を介してDOXを供給した。再度、DOX供給の5日後および10日後に、4週齢トランスジェニックマウスの尾静脈から血液を収集した。前回と同様に、血液細胞中のGFP発現のレベルはFACSによって分析した。pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas由来の4例の陽性トランスジェニックマウスのうちの2例が、DOXの供給後にGFP発現のレベルを減少した(図12のGFP/CAGファウンダー6#およびGFP/CAGファウンダー9#を参照のこと)。ある細胞は10倍までのGFP発現のレベルの減少を示した一方、ある細胞は変化を示さなかったので、血液細胞中のGFP発現のレベルの減少は均一ではなかった。加えて、pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas構築物由来のウイルス粒子で感染させた5例の陽性トランスジェニックマウスのうちの5例が、GFP発現のレベルの変化を示さなかった。しかし、誘導前のGFP/CAGファウンダー6#とGFP/CAGファウンダー9#の両方についてのGFP発現のレベルは、非トランスジェニックマウス(shRNAベクターなし)と同じであり、このことは、トランスジェニック動物におけるH1誘導性プロモーターがDOXによって堅固に制御できることを示す(図11)。
実施例16
単一のレンチベクターは、shRNAを誘導性に発現でき、トランスジェニックマウスにおける遺伝子発現をサイレンシングする
単一の誘導性レンチベクターが、生殖細胞系伝達を通して機能的なままδあり得るか否かを決定するために、GFP/CAGファウンダー6#(雌性)およびGFP/CAGファウンダー9#(雄性)を交尾させた。すべてのF1マウスは、レンチベクター組み込みコピーの数を決定するために、サザンブロット分析によって分析した。11例のF1マウスのうちの2例が、2つの組み込みレンチベクターのコピーを有した。他のF1マウスは、1つの組み込みコピーを有するか(5例のマウス)または陰性(4例のマウス)のいずれかであった。
単一のレンチベクターは、shRNAを誘導性に発現でき、トランスジェニックマウスにおける遺伝子発現をサイレンシングする
単一の誘導性レンチベクターが、生殖細胞系伝達を通して機能的なままδあり得るか否かを決定するために、GFP/CAGファウンダー6#(雌性)およびGFP/CAGファウンダー9#(雄性)を交尾させた。すべてのF1マウスは、レンチベクター組み込みコピーの数を決定するために、サザンブロット分析によって分析した。11例のF1マウスのうちの2例が、2つの組み込みレンチベクターのコピーを有した。他のF1マウスは、1つの組み込みコピーを有するか(5例のマウス)または陰性(4例のマウス)のいずれかであった。
レンチベクターを含むF1マウスがDOX調節を介してGFP発現のレベルを誘導性に減少できるか否かを決定するために、レンチベクターの2つの組み込みコピーを含むF1マウス(F1−6#およびF1−9#)を分析した。マウスがDOXを供給される前、およびマウスがDOXを供給された10日後、17日後、27日後に、4週齢のF1−6#およびF1−9#トランスジェニックマウスからの血液を収集した。血液細胞中のGFPの発現レベルを、FACS分析によって分析した。図13は、マウスがDOXを供給された後の、血液細胞中のGFPの発現レベルを示す。両方のトランスジェニックマウス(F1−6#およびF1−9#)のGFPの発現レベルは、非トランスジェニックマウスのそれと同様であった。図14は、マウスがDOXを供給された10日後、17日後、27日後のトランスジェニックマウス血液細胞中のGFPの発現レベルを示す。マウスがDOXを供給された後に、血液細胞中で減少した。ある細胞はGFPの発現レベルを30倍まで減少し、ある細胞中のGFPの発現レベルは変化しないままであったので、血液細胞中のGFPの発現レベルの減少は均一ではなかった。DOXの供給の17日後、75%の血液細胞はGFPの発現レベルの20倍の減少を示した。DOXの供給の27日後、85%の血液細胞はGFPの発現レベルの30倍の減少を示した。これらのデータは、誘導性レンチベクターが、F1マウスにおけるGFPの発現をサイレンシングするために十分なshRNAを発現したことを示し、このことは、単一の誘導性レンチベクターが生殖細胞系伝達後に機能的であったことを示す。
実施例17
shRNAを発現するための単一の誘導性レンチベクターは、生殖細胞系伝達を通して機能的であった
単一の誘導性レンチベクターが生殖細胞系伝達を通して機能的であったか否かを決定するために、2例の陽性トランスジェニックマウス(GFP/CAGファウンダー6#は雌性であり、GFP/CAGファウンダー9#は雄性であった)を交尾させた。互いに交尾させるための2つのファウンダーを使用して、本発明者らは、GFPレベルを有意にサイレンシングするために、shRNAの発現を増加させることを希望する。すべてのF1マウスは、レンチベクター組み込みコピーの数を決定するために、サザンブロットによって分析した。11例のF1マウスのうちの2例が、2つの組み込みレンチベクターのコピーを有した。他のF1マウスは、レンチベクターの1つの組み込みコピーを有するか(5例のマウス)または陰性(4例のマウス)のいずれかであった。
shRNAを発現するための単一の誘導性レンチベクターは、生殖細胞系伝達を通して機能的であった
単一の誘導性レンチベクターが生殖細胞系伝達を通して機能的であったか否かを決定するために、2例の陽性トランスジェニックマウス(GFP/CAGファウンダー6#は雌性であり、GFP/CAGファウンダー9#は雄性であった)を交尾させた。互いに交尾させるための2つのファウンダーを使用して、本発明者らは、GFPレベルを有意にサイレンシングするために、shRNAの発現を増加させることを希望する。すべてのF1マウスは、レンチベクター組み込みコピーの数を決定するために、サザンブロットによって分析した。11例のF1マウスのうちの2例が、2つの組み込みレンチベクターのコピーを有した。他のF1マウスは、レンチベクターの1つの組み込みコピーを有するか(5例のマウス)または陰性(4例のマウス)のいずれかであった。
レンチベクターを含むF1マウスがDOXによってGFPを誘導性に減少できるか否かを決定するために、ベクターの2つの組み込みコピーを含むF1マウス(F1−6#およびF1−9#)を分析した。マウスがDOXを供給される前、およびマウスがDOXを供給された10日後、17日後、27日後に、4週齢のトランスジェニックマウスの血液を収集した。血液細胞中のGFPレベルを、FACS分析によって分析した。図13は、DOX前の、血液細胞中のGFPの発現レベルを示す。両方のトランスジェニックマウス(F1−6#およびF1−9#)のGFPの発現レベルは、非トランスジェニックマウスのそれと同様であった。図14は、DOXの10日後、17日後、27日後に分析した血液細胞中のGFPレベルを示す。血液細胞のGFPレベルは、DOX後により少ない。血液細胞中のGFPの発現レベルの減少は均一ではなく、ある細胞はGFPの発現レベルを30倍まで減少したのに対し、他の細胞のGFPの発現レベルは変化しなかった。DOXの供給の17日後、75%の血液細胞はGFPの発現レベルの約20倍の減少を示したのに対し、DOXの供給の27日後、85%の血液細胞はGFPの発現レベルの約30倍の減少を示した。これらのデータは、誘導性レンチベクターが、F1マウスにおけるGFPタンパク質をサイレンシングするためのshRNAを発現したことを示し、このことは、生殖細胞系伝達を通した単一の誘導性レンチベクターが機能的であったことを示す。
実施例18
単一の誘導性レンチベクターは、II型ポリメラーゼを使用して遺伝子発現をサイレンシングするために、マイクロRNAベースのshRNAを発現する
以前に、他の研究者らは、H.Bujardおよび共同研究者らによって開発されたテトラサイクリン(tet)調節系を使用する、単一の誘導性レンチベクターを報告した。このようなベクターは、単一のベクター中の誘導性プロモーターおよびヒトCMVプロモーターの制御下で、GFPレポーター遺伝子およびテトラサイクリントランス活性化因子を発現する。誘導性プロモーターと構成的プロモーターの両方が、5’−LTRから3’−LTRまでの同じ方向に配置される。この型の単一ベクターは、マイクロRNAまたはshRNAを発現し、これは、おそらく、非特異的なRNA配列にハイブリダイズする。これらの非特異的配列は、マイクロRNAまたはshRNAの効率および機能を減少することができる。
単一の誘導性レンチベクターは、II型ポリメラーゼを使用して遺伝子発現をサイレンシングするために、マイクロRNAベースのshRNAを発現する
以前に、他の研究者らは、H.Bujardおよび共同研究者らによって開発されたテトラサイクリン(tet)調節系を使用する、単一の誘導性レンチベクターを報告した。このようなベクターは、単一のベクター中の誘導性プロモーターおよびヒトCMVプロモーターの制御下で、GFPレポーター遺伝子およびテトラサイクリントランス活性化因子を発現する。誘導性プロモーターと構成的プロモーターの両方が、5’−LTRから3’−LTRまでの同じ方向に配置される。この型の単一ベクターは、マイクロRNAまたはshRNAを発現し、これは、おそらく、非特異的なRNA配列にハイブリダイズする。これらの非特異的配列は、マイクロRNAまたはshRNAの効率および機能を減少することができる。
このような問題点を克服するために、反対の方向に配向されている、二シストロン性の誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターを有する、単一の誘導性レンチベクターを生成した。プロモーターの干渉および誘導性プロモーターの基底レベルの漏出を減少させるために、1.2kbのニワトリインシュレーターを、誘導性プロモーターと構成的プロモーターの間に挿入した。CAGプロモーターは、テトラサイクリンリプレッサー遺伝子(tetR−VP16融合タンパク質)の発現を駆動するため、およびインビボでの誘導性遺伝子発現を改善するために選択した。加えて、改善したtet−on系をこのベクターのために使用し、これには、M2と呼ばれるtet−onからの変異体、および単一の全長Vp16ドメインを置き換えた、4コピーの最小Vp16トランス活性化因子ドメインが含まれる。また、DsRed−exp遺伝子がテトラサイクリントランス活性化因子遺伝子の下流に挿入され、その発現はCAGプロモーターによって駆動され、IRESによって発現される。最終構築物は、pHRpATRE/CAGM2Redと称する。
Invitrogen miRNAキットを使用して、21bpのmiRNA標的化配列(480から500、
実施例19
Cre−loxPベースの条件付き、誘導性、可逆的なレンチベクター系の開発
Cre−loxPベースの条件付き、誘導性、可逆的なレンチベクター系を、トランスジェニック動物において生成および適用した。この系を生成するために、Cre−loxp系をテトラサイクリン誘導性系と組み合わせて、組織特異的、誘導性、可逆的な様式で遺伝子を発現した。pHRpATRE/CAGM2RedにおけるM2遺伝子の上流に850bpのloxp−DsRed−loxpを挿入することによって構築物を生成し、M2の下流のIRES−DsRedフラグメントを欠失させた。得られた構築物は、Cre−loxPベースの条件付き、誘導性、可逆的なレンチベクター系であり、pHRpATRE/CAGloxRedM2と称した。次に、pHR miRNA−GFP(480)/CAGM2RedからのmiRNA−GFP(480)フラグメントをpHRpATRE/CAGloxRedM2にクローニングし、それによって、pHRmiRNA−GFP(480)/CAGloxRedM2と称する構築物を生成した。DsRed蛍光タンパク質は、Cre−loxpの機能をモニターするための手段を提供する。
Cre−loxPベースの条件付き、誘導性、可逆的なレンチベクター系の開発
Cre−loxPベースの条件付き、誘導性、可逆的なレンチベクター系を、トランスジェニック動物において生成および適用した。この系を生成するために、Cre−loxp系をテトラサイクリン誘導性系と組み合わせて、組織特異的、誘導性、可逆的な様式で遺伝子を発現した。pHRpATRE/CAGM2RedにおけるM2遺伝子の上流に850bpのloxp−DsRed−loxpを挿入することによって構築物を生成し、M2の下流のIRES−DsRedフラグメントを欠失させた。得られた構築物は、Cre−loxPベースの条件付き、誘導性、可逆的なレンチベクター系であり、pHRpATRE/CAGloxRedM2と称した。次に、pHR miRNA−GFP(480)/CAGM2RedからのmiRNA−GFP(480)フラグメントをpHRpATRE/CAGloxRedM2にクローニングし、それによって、pHRmiRNA−GFP(480)/CAGloxRedM2と称する構築物を生成した。DsRed蛍光タンパク質は、Cre−loxpの機能をモニターするための手段を提供する。
Cre遺伝子を、下線を付したBgl II制限酵素およびSV40 NLSを含むセンスプライマー
実施例20
pTREGag−HCV−Gag−Polパッケージング構築物の構築
pTREプラスミド(Clontechより購入)からのテトラサイクリン誘導性プロモーターフラグメントを、上記のようにPCRによって増幅した。次いで、PCR産物をpcDNA 3.1にクローニングしてCMVプロモーターを置き換え、本明細書ではpTRE−neoと称するテトラサイクリン誘導性プラスミドを生成した。
pTREGag−HCV−Gag−Polパッケージング構築物の構築
pTREプラスミド(Clontechより購入)からのテトラサイクリン誘導性プロモーターフラグメントを、上記のようにPCRによって増幅した。次いで、PCR産物をpcDNA 3.1にクローニングしてCMVプロモーターを置き換え、本明細書ではpTRE−neoと称するテトラサイクリン誘導性プラスミドを生成した。
次に、MA(what is this)、CA、およびNCをコードする配列を含む1357bpのHIV−1 gagフラグメントを、EcoRI制限部位を含むセンスプライマー
次に、P2およびP6コード配列を含む194bp HIV−1 gagフラグメントを、MscI制限部位を含むセンスプライマー
pTRE−neoベクターはまた、EcoRIおよびXhoI制限酵素でも消化した。次いで、PCR産物の2つのフラグメントをpTRE−neoにクローニングした。得られたプラスミドはpTRE−Gagプラスミドと称した。
次に、MA、CA、およびNCをコードする配列を含む1313bp HIV−1 gagフラグメントを、EcoRI、MluI、およびBssHII制限酵素を含むセンスプライマー
次いで、P2、TF、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ、vifおよびvprを含む、3695bp HIV−1 gagおよびpolフラグメントを、BglII制限部位を含むセンスプライマー
次いで、pTRE−neoをEcoRIおよびXhoI制限酵素で消化した。次いで、2つのPCR産物フラグメントをpTRE−neoにクローニングした。得られたプラスミドは、pTRE−Gag−Pol/dTat/dRevと称した。
pCMV−Gag−Polは、XhoIおよびSal I制限酵素によって消化し、vpr、Tat、Rev、およびRREを含む1710bpフラグメントを得た。次いで、このフラグメントを、XhoIおよびSal I制限酵素を使用してpTRE−Gag−Polプラスミドにクローニングし、pTRE−Gag−Polと称するプラスミドを生成した。
340bp HCV IRESフラグメントを、MluI制限酵素を含むセンスプライマー
pTRE Gagは、MluIおよびBssH II制限酵素を使用して消化し、1646bp Gagを得て、MluIおよびXhoI制限酵素を使用して、pTRE−HCV−Gag−Polにサブクローニングした。最終プラスミドは、pTREGag−HCV−Gag−Polと称した。得られたプラスミドは、保存性フレームシフト形成ループ構造を欠いている。第2に、Gag−Pol融合タンパク質の発現は、HCV IRESによって調節される。
実施例21
KISS−1トランスジェニックマウスの生成および分析
メタスタチンは、癌細胞中でKISS−1によってコードされる抗転移ペプチドである。最近の研究は、メタスタチンが、視床下部および海馬の一部などの特定の脳の領域において高度に発現されるオーファンGタンパク質共役受容体GPR54のリガンドであることを発見した。キスペプチンは、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)の分泌を調整する際に極めて重要な役割を果たす。新たな証拠は、キスペプチンが、GPR54を通して、GnRH分泌を刺激するように作用することを確認した。キスペプチンおよびGPR54は、霊長類における思春期成熟のために決定的である。しかし、KiSS−1トランスジェニックマウスは今日まで報告されていなかった。以下に記載する実験は、ヒトKiSS−1遺伝子を誘導性かつ可逆的に発現する、単一の誘導性レンチベクターベースのトランスジェニックマウスの産生を記載する。
KISS−1トランスジェニックマウスの生成および分析
メタスタチンは、癌細胞中でKISS−1によってコードされる抗転移ペプチドである。最近の研究は、メタスタチンが、視床下部および海馬の一部などの特定の脳の領域において高度に発現されるオーファンGタンパク質共役受容体GPR54のリガンドであることを発見した。キスペプチンは、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)の分泌を調整する際に極めて重要な役割を果たす。新たな証拠は、キスペプチンが、GPR54を通して、GnRH分泌を刺激するように作用することを確認した。キスペプチンおよびGPR54は、霊長類における思春期成熟のために決定的である。しかし、KiSS−1トランスジェニックマウスは今日まで報告されていなかった。以下に記載する実験は、ヒトKiSS−1遺伝子を誘導性かつ可逆的に発現する、単一の誘導性レンチベクターベースのトランスジェニックマウスの産生を記載する。
ヒトKiSS−1遺伝子を、BamHI制限酵素部位を含むセンスプライマー
pHRKiSSO2CAGtetGFP由来の高力価レンチベクター感染性粒子を使用して、上記のように単細胞段階胚に感染させた。感染性粒子の力価は、蛍光顕微鏡法を使用して、GFP陽性細胞によって決定した。感染の翌日、2細胞段階胚を、乳母に移した(CD1)。陽性トランスジェニックマウスを、GFP発現に基づいて選択した(マウスは緑色の身体を有していた)。試験した7例のマウスの中で、7例の陽性トランスジェニックマウスが存在していた。4週齢ファウンダートランスジェニックマウス(2例の雌性および2例の雄性)に、500μg/mlのDOXを含む水を供給し、KiSS遺伝子発現を誘導した。KiSSトランスジェニックマウスの表現型を測定するために、膣口(雌性マウスについて)および雄性マウスについてペニスをモニターした。DOX誘導の5日後、5週齢雌性マウスの膣は開いた。加えて、5週齢マウスのペニスは、色およびサイズが変化した。KiSS Tgマウスのペニスは、対照マウスのペニスよりもサイズがより大きく、かつより発達していた。
実施例22
レンチベクターを使用する、M2トランス活性化タンパク質を発現するGNTl−細胞株の生成
改変M2遺伝子(VP16に作動可能に連結されたtetONを含む)を、BamHIおよびXhoIを使用して、pHREF−lablasベクター(配列番号52)にクローニングした。得られたベクターは、PS839pHREFM2blas(配列番号44)と称した。PS839pHREFM2blasを含む感染性粒子は、PS839pHREFM2blas、パッケージング構築物(p8.91,Trono lab,Lausanne,Switzerland)、およびpCMV−VSV−G(pMD−G,Trono lab,Lausanne,Switzerland)を使用する同時トランスフェクションによって生成した。感染性粒子は、HEK293S細胞(GnTl+)およびGnTl−HEK293S細胞(HEK293S細胞(GnTl+)およびGnTF HEK293S細胞the Massachusettes Institute of Technologyによって提供された)に感染させるために使用した。形質導入細胞は、1週間にわたりブラスチシジン(20μg/ml)を用いて選択した。得られた(resistant)細胞株は、GnTl+HEK293S W2細胞およびGnTl−HEK293S W2細胞と称した。これらの細胞株は、上記のM2構築物を含む。
レンチベクターを使用する、M2トランス活性化タンパク質を発現するGNTl−細胞株の生成
改変M2遺伝子(VP16に作動可能に連結されたtetONを含む)を、BamHIおよびXhoIを使用して、pHREF−lablasベクター(配列番号52)にクローニングした。得られたベクターは、PS839pHREFM2blas(配列番号44)と称した。PS839pHREFM2blasを含む感染性粒子は、PS839pHREFM2blas、パッケージング構築物(p8.91,Trono lab,Lausanne,Switzerland)、およびpCMV−VSV−G(pMD−G,Trono lab,Lausanne,Switzerland)を使用する同時トランスフェクションによって生成した。感染性粒子は、HEK293S細胞(GnTl+)およびGnTl−HEK293S細胞(HEK293S細胞(GnTl+)およびGnTF HEK293S細胞the Massachusettes Institute of Technologyによって提供された)に感染させるために使用した。形質導入細胞は、1週間にわたりブラスチシジン(20μg/ml)を用いて選択した。得られた(resistant)細胞株は、GnTl+HEK293S W2細胞およびGnTl−HEK293S W2細胞と称した。これらの細胞株は、上記のM2構築物を含む。
CCR1を発現するためのテトラサイクリン誘導性細胞株の生成
今日まで、CCケモカイン受容体ファミリーの少なくとも10個のメンバーが記載されている。記載されたメンバーは、ケモカイン命名に関するIUIS/WHO小委員会に従い、CCR1からCCR10まで命名されている。CCR1は同定された最初のCCケモカイン受容体であって、複数の炎症性/誘導性のCCケモカイン(例えば、CCL4−6およびCCLl4−16)を結合する。ヒトにおいては、この受容体は、末梢血リンパ球および単球上で見い出すことができる。この受容体はまた、分化マーカーCD191の指定クラスターである。
今日まで、CCケモカイン受容体ファミリーの少なくとも10個のメンバーが記載されている。記載されたメンバーは、ケモカイン命名に関するIUIS/WHO小委員会に従い、CCR1からCCR10まで命名されている。CCR1は同定された最初のCCケモカイン受容体であって、複数の炎症性/誘導性のCCケモカイン(例えば、CCL4−6およびCCLl4−16)を結合する。ヒトにおいては、この受容体は、末梢血リンパ球および単球上で見い出すことができる。この受容体はまた、分化マーカーCD191の指定クラスターである。
ヒトCCR1を含むレンチウイルスベクターの構築
ヒトCCRl cDNA(GENBANK番号:BC051306)は(Hunts ville,AL)から入手し、Invitrogen TA Cloneキット(Carlsbad,CA)を使用して、pCR−2.1ベクターにクローニングした。得られた構築物はpCR−hCCRlと称した。CCRl遺伝子の終結コドンは、Tag遺伝子(TEV−Flag−10His)と融合させるために変異させた(図16Bを参照のこと)。hEP2R遺伝子は制限酵素で消化し、pHTRE−puro(L494pHRTREpuroとしても知られる;配列番号45)にクローニングした。得られたベクターはpHTRE−hCCRl−TEV−Flag−10His(PT834pHRTRE−hCCRlTEVpurとしても知られる;配列番号46)と称した。このベクターの代表的なマップは図16Aに示すことができる。図16に示すことができるように、hCCR1発現を駆動するプロモーターはtet調節エレメント(TRE)であり、直後にhCCRコード領域がある。組み込まれたベクターは、二シストロン性mRNAを転写し、ピューロマイシン耐性遺伝子をhCCR1とシスに配置する。
ヒトCCRl cDNA(GENBANK番号:BC051306)は(Hunts ville,AL)から入手し、Invitrogen TA Cloneキット(Carlsbad,CA)を使用して、pCR−2.1ベクターにクローニングした。得られた構築物はpCR−hCCRlと称した。CCRl遺伝子の終結コドンは、Tag遺伝子(TEV−Flag−10His)と融合させるために変異させた(図16Bを参照のこと)。hEP2R遺伝子は制限酵素で消化し、pHTRE−puro(L494pHRTREpuroとしても知られる;配列番号45)にクローニングした。得られたベクターはpHTRE−hCCRl−TEV−Flag−10His(PT834pHRTRE−hCCRlTEVpurとしても知られる;配列番号46)と称した。このベクターの代表的なマップは図16Aに示すことができる。図16に示すことができるように、hCCR1発現を駆動するプロモーターはtet調節エレメント(TRE)であり、直後にhCCRコード領域がある。組み込まれたベクターは、二シストロン性mRNAを転写し、ピューロマイシン耐性遺伝子をhCCR1とシスに配置する。
hCCR1を発現するためのテトラサイクリン誘導性細胞株の構築
pHTRE−hCCRl−TEV−Flag−10His由来の感染性粒子を生成するために、pHTRE−hCCRl−TEV−Flag−10Hisプラスミドを、p8.91パッケージング構築物(Trono lab,Lausanne,Switzerland)およびpCMV−VSV−G(pMD−G;Trono lab,Lausanne, Switzerland)とともに、293T細胞に同時トランスフェクトした。pHTRE−hCCRl−TEV−Flag−10Hisを含むウイルス粒子は、GnTI活性が減少しており、およびテトラサイクリントランス活性化因子を発現する、GnTI HEK293S W2細胞に感染させるために使用した。感染細胞は、高レベルのCFTRタンパク質(3〜5mg/109細胞)を産生することが見い出され、これは、膜タンパク質の発現のために使用される他の公知の系よりも1ログ高い。形質導入した細胞はピューロマイシン(1.0〜
4.0μg/ml)によって選択され、hCCRl−mCellと称された安定な細胞株を樹立した。
pHTRE−hCCRl−TEV−Flag−10His由来の感染性粒子を生成するために、pHTRE−hCCRl−TEV−Flag−10Hisプラスミドを、p8.91パッケージング構築物(Trono lab,Lausanne,Switzerland)およびpCMV−VSV−G(pMD−G;Trono lab,Lausanne, Switzerland)とともに、293T細胞に同時トランスフェクトした。pHTRE−hCCRl−TEV−Flag−10Hisを含むウイルス粒子は、GnTI活性が減少しており、およびテトラサイクリントランス活性化因子を発現する、GnTI HEK293S W2細胞に感染させるために使用した。感染細胞は、高レベルのCFTRタンパク質(3〜5mg/109細胞)を産生することが見い出され、これは、膜タンパク質の発現のために使用される他の公知の系よりも1ログ高い。形質導入した細胞はピューロマイシン(1.0〜
4.0μg/ml)によって選択され、hCCRl−mCellと称された安定な細胞株を樹立した。
テトラサイクリン誘導性細胞株におけるhCCR1発現の分析
hCCRl−mCell(これは、0、1、2、おおび4μgピューロマイシンとともに選択した)を6ウェルプレート中で増殖させ、培養培地に加えた。翌日、誘導したhCCRl−mCellを収集し、一次抗体(M2フラグ抗体)および二次抗体(HRP−結合体化抗マウス抗体)を使用してウェスタンブロッティングによって分析した。このブロットをまた、対照として働く抗チューブリンによって同時染色した。52kDaバンドがhCCRl−mCell中のM2フラグ抗体によって検出されたが、HERK細胞からは検出されず、一方55kDaバンドはすべての細胞で検出された。
hCCRl−mCell(これは、0、1、2、おおび4μgピューロマイシンとともに選択した)を6ウェルプレート中で増殖させ、培養培地に加えた。翌日、誘導したhCCRl−mCellを収集し、一次抗体(M2フラグ抗体)および二次抗体(HRP−結合体化抗マウス抗体)を使用してウェスタンブロッティングによって分析した。このブロットをまた、対照として働く抗チューブリンによって同時染色した。52kDaバンドがhCCRl−mCell中のM2フラグ抗体によって検出されたが、HERK細胞からは検出されず、一方55kDaバンドはすべての細胞で検出された。
高レベルの表面発現CCR1
抗CCR1特異的抗体がhCCRl−mCellにおけるCCR1の細胞表面発現を検出するか否かを決定するために、Alexa Fluor(登録商標)647結合体化マウス抗ヒトCCRlモノクローナル抗体(CAT#557914,BD Bioscience,San Jose,CA)を、DOXを用いる誘導(24時間)のありなしの両方で、hCCRl−mCellを染色するために使用した。対照として、非形質導入293細胞を含めた。結果は、DOX誘導された細胞株が、非常に高い細胞表面レベルのCCR1を発現することを示した。誘導レベルは、非誘導hCCR1−mCellと比較して、誘導hCCR1−mCellにおいて約10倍であった。
抗CCR1特異的抗体がhCCRl−mCellにおけるCCR1の細胞表面発現を検出するか否かを決定するために、Alexa Fluor(登録商標)647結合体化マウス抗ヒトCCRlモノクローナル抗体(CAT#557914,BD Bioscience,San Jose,CA)を、DOXを用いる誘導(24時間)のありなしの両方で、hCCRl−mCellを染色するために使用した。対照として、非形質導入293細胞を含めた。結果は、DOX誘導された細胞株が、非常に高い細胞表面レベルのCCR1を発現することを示した。誘導レベルは、非誘導hCCR1−mCellと比較して、誘導hCCR1−mCellにおいて約10倍であった。
細胞増殖を停止し、および/またはアポトーシスを引き起こすためのCCR1の誘導
hCCRl−mCellは、1μg/mlのDOXの存在下または非存在下で、6ウェルプレート上で増殖させた。細胞増殖は顕微鏡法によってモニターした。DOXを用いる誘導の24時間後、hCCRl−mCellは増殖を停止したのに対し、誘導したhCCRl− mCellの大部分はプレートから脱離した。このデータは、高レベルのhCCRl発現が、リガンドなしでhCCRlシグナルの活性化を引き起こしたことを示す。
hCCRl−mCellは、1μg/mlのDOXの存在下または非存在下で、6ウェルプレート上で増殖させた。細胞増殖は顕微鏡法によってモニターした。DOXを用いる誘導の24時間後、hCCRl−mCellは増殖を停止したのに対し、誘導したhCCRl− mCellの大部分はプレートから脱離した。このデータは、高レベルのhCCRl発現が、リガンドなしでhCCRlシグナルの活性化を引き起こしたことを示す。
実施例23
CFTR(Cl−アニオン膜貫通(transmembrine)チャネル)を発現するためのテトラサイクリン誘導性細胞株の生成
CFTR His(10×)レンチウイルスベクターの構築
CFTR His(6×)レンチウイルスベクター(PT764pHRTRECFTR−His6puro;配列番号47としても知られる)DNAを、BstXIおよびXhoIで消化し、C末端6×His含有DNAフラグメントを除去した。野生型CFTRプラスミドDNAを鋳型として使用し。PCRを使用して、10×His含有C末端CFTR BstXI/XhoI DNAフラグメントを増幅した。BstXIおよびXhoIを用いる消化後、このフラグメントをクローニングし、エンドヌクレアーゼ制限分析およびヌクレオチド配列分析によって確認した。得られたベクターは、CFTR His(10×)(PT823pHRTRECFTR−Hisl0pur;配列番号48としても知られる)と称した。
CFTR(Cl−アニオン膜貫通(transmembrine)チャネル)を発現するためのテトラサイクリン誘導性細胞株の生成
CFTR His(10×)レンチウイルスベクターの構築
CFTR His(6×)レンチウイルスベクター(PT764pHRTRECFTR−His6puro;配列番号47としても知られる)DNAを、BstXIおよびXhoIで消化し、C末端6×His含有DNAフラグメントを除去した。野生型CFTRプラスミドDNAを鋳型として使用し。PCRを使用して、10×His含有C末端CFTR BstXI/XhoI DNAフラグメントを増幅した。BstXIおよびXhoIを用いる消化後、このフラグメントをクローニングし、エンドヌクレアーゼ制限分析およびヌクレオチド配列分析によって確認した。得られたベクターは、CFTR His(10×)(PT823pHRTRECFTR−Hisl0pur;配列番号48としても知られる)と称した。
GnT1+および−HEK293S(GnT1−)の形質導入(CFTR His(6×)およびCFTR His(10×)レンチウイルスベクターを有する細胞)
各レンチウイルスベクターを、本明細書の他の箇所に記載されるようにパッケージングし、そしてこれを使用して、GnTl+HEK293S W2細胞およびGnTl−HEK293S W2細胞に形質導入した。mlあたり25μgのピューロマイシンを用いる2日間の培地の補充後、高度にCFTRを発現した細胞株を選択した。4日間の選択後、生存している細胞を、ピューロマイシンを含まない培地中で拡大した。
各レンチウイルスベクターを、本明細書の他の箇所に記載されるようにパッケージングし、そしてこれを使用して、GnTl+HEK293S W2細胞およびGnTl−HEK293S W2細胞に形質導入した。mlあたり25μgのピューロマイシンを用いる2日間の培地の補充後、高度にCFTRを発現した細胞株を選択した。4日間の選択後、生存している細胞を、ピューロマイシンを含まない培地中で拡大した。
イムノブロット分析
各型の300万個の細胞(形質導入GnTl+HEK293S W2細胞およびGnTl−HEK293S W2細胞)を収集し、イムノブロット分析のために膜画分を調製した。加えて、CFTR+対照(CFTR−FLAG)を分析した。ブロットしたタンパク質は、Rl104抗CFTR MAbを用いて検出した、結果は、形質導入されたGnTl−HEK293S W2細胞中での6×と10×の両方のタグ化CFTRタンパク質の発現を示した。ポリアクリルアミドゲルにおける形質導入GnTl−HEK293S W2細胞からのバンドの移動度は、形質導入GnTl+HEK293S W2細胞において発現された同じタンパク質からのバンドよりも速かったことが観察された。
各型の300万個の細胞(形質導入GnTl+HEK293S W2細胞およびGnTl−HEK293S W2細胞)を収集し、イムノブロット分析のために膜画分を調製した。加えて、CFTR+対照(CFTR−FLAG)を分析した。ブロットしたタンパク質は、Rl104抗CFTR MAbを用いて検出した、結果は、形質導入されたGnTl−HEK293S W2細胞中での6×と10×の両方のタグ化CFTRタンパク質の発現を示した。ポリアクリルアミドゲルにおける形質導入GnTl−HEK293S W2細胞からのバンドの移動度は、形質導入GnTl+HEK293S W2細胞において発現された同じタンパク質からのバンドよりも速かったことが観察された。
CFTR−His(10×)を発現するGnT1−HEK293S細胞におけるイオンチャネル機能の分析
発現されたCFTR−His(10×)タンパク質が活性であるか否かを決定するために、ハロゲン化物クエンチ色素6−ヒドロキシ−N−(3−スルホプロピル)キノリニウム(SPQ,Molecular Probes)を用いて、ハロゲン化物流入をGnT1+およびGnT1−細胞株において測定した。比較のために、野生型CFTRを発現するGnT1+細胞を並行して分析した。手短に述べると、形質導入したHEK293s wt−CFTR、HEK293S CFTR−His(10×)、HEK293S GnT1−CFTR−His(10×)細胞株を、カバーガラス上に播種し、〜50%コンフルエントまで増殖させた。次いで、細胞を低浸透圧で10mM SPQに10分間ロードし、クエンチNaI緩衝液中に配置した。単一の細胞の蛍光は、Zeiss倒立顕微鏡、PTI画像処理システム、およびHamamatsuカメラを用いて測定した。励起は340nmであり、発光は410nmで測定した。実験の開始時に、細胞をクエンチ緩衝液(NaI)中に浸漬し、安定なベースラインの確立後、ハロゲン化物を含まないデクエンチ緩衝液に200秒間交換した。細胞は、アゴニスト(20μM フォルスコリン)を用いて620秒間刺激し、次いで、クエンチNaI緩衝液に戻した。蛍光は、各細胞についてベースライン値に標準化し、蛍光の変化は、ベース蛍光の上のパーセント増加として示した。各時点において分析された細胞の総数(少なくとも30個)の平均をプロットした。得られた結果は、細胞株の各々について、ハロゲン化物の流入の有意な活性化を実証する。HEK293S CFTR−His(10×)、およびGnTl−HEK293S CFTR−His(10×)細胞株は、両方が、HEK293S wt−CFTRと比較して、蛍光のより大きな変化を生じた。
発現されたCFTR−His(10×)タンパク質が活性であるか否かを決定するために、ハロゲン化物クエンチ色素6−ヒドロキシ−N−(3−スルホプロピル)キノリニウム(SPQ,Molecular Probes)を用いて、ハロゲン化物流入をGnT1+およびGnT1−細胞株において測定した。比較のために、野生型CFTRを発現するGnT1+細胞を並行して分析した。手短に述べると、形質導入したHEK293s wt−CFTR、HEK293S CFTR−His(10×)、HEK293S GnT1−CFTR−His(10×)細胞株を、カバーガラス上に播種し、〜50%コンフルエントまで増殖させた。次いで、細胞を低浸透圧で10mM SPQに10分間ロードし、クエンチNaI緩衝液中に配置した。単一の細胞の蛍光は、Zeiss倒立顕微鏡、PTI画像処理システム、およびHamamatsuカメラを用いて測定した。励起は340nmであり、発光は410nmで測定した。実験の開始時に、細胞をクエンチ緩衝液(NaI)中に浸漬し、安定なベースラインの確立後、ハロゲン化物を含まないデクエンチ緩衝液に200秒間交換した。細胞は、アゴニスト(20μM フォルスコリン)を用いて620秒間刺激し、次いで、クエンチNaI緩衝液に戻した。蛍光は、各細胞についてベースライン値に標準化し、蛍光の変化は、ベース蛍光の上のパーセント増加として示した。各時点において分析された細胞の総数(少なくとも30個)の平均をプロットした。得られた結果は、細胞株の各々について、ハロゲン化物の流入の有意な活性化を実証する。HEK293S CFTR−His(10×)、およびGnTl−HEK293S CFTR−His(10×)細胞株は、両方が、HEK293S wt−CFTRと比較して、蛍光のより大きな変化を生じた。
実施例24
ヒトEP2Rを発現するためのテトラサイクリン誘導性細胞株の生成
EP2を含むレンチウイルスベクターの構築
hEP2 cDNAをSchering Ag(Berlin,Germany)から入手し、PCRによって増幅し、Invitrogen TA Cloneキット(Carlsbad,CA)を使用してpCR−2.1ベクターにクローニングした。この得られた構築物をpCR−hEP2R(配列番号49)と称した。EP2遺伝子の終結コドンを、Tag遺伝子と融合させるために変異させた(TEV−Flag−10His)(図17)。hEP2R遺伝子は制限酵素で消化し、pHTRE−puro(配列番号45)にクローニングした。得られたベクターは、pHTRE−hEP2R−TEV−Flag−10His(配列番号50)と称した。このベクターの代表的なマップは図17において見ることができる。図17において見ることができるように、hEP2R発現を駆動するプロモーターは、tet調節エレメント(TRE)であり、直後にhEP2Rコード領域がある。組み込まれたベクターは二シストロン性mRNAを転写し、ピューロマイシン耐性遺伝子を、hEP2Rとシスに配置する。
ヒトEP2Rを発現するためのテトラサイクリン誘導性細胞株の生成
EP2を含むレンチウイルスベクターの構築
hEP2 cDNAをSchering Ag(Berlin,Germany)から入手し、PCRによって増幅し、Invitrogen TA Cloneキット(Carlsbad,CA)を使用してpCR−2.1ベクターにクローニングした。この得られた構築物をpCR−hEP2R(配列番号49)と称した。EP2遺伝子の終結コドンを、Tag遺伝子と融合させるために変異させた(TEV−Flag−10His)(図17)。hEP2R遺伝子は制限酵素で消化し、pHTRE−puro(配列番号45)にクローニングした。得られたベクターは、pHTRE−hEP2R−TEV−Flag−10His(配列番号50)と称した。このベクターの代表的なマップは図17において見ることができる。図17において見ることができるように、hEP2R発現を駆動するプロモーターは、tet調節エレメント(TRE)であり、直後にhEP2Rコード領域がある。組み込まれたベクターは二シストロン性mRNAを転写し、ピューロマイシン耐性遺伝子を、hEP2Rとシスに配置する。
hEP2Rを発現するためのテトラサイクリン誘導性細部株の構築
pHTRE−hEP2R−TEV−Flag−10His(配列番号50)由来の感染性粒子を生成するために、pHTRE−hEP2R−TEV−Flag−10Hisプラスミド(配列番号50)を、p8.91パッケージング構築物(Trono lab,Lausanne,Switzerland)およびpCMV−VSV−G(pMD−G;Trono lab,Lausanne,Switzerland)とともに、293Tに同時トランスフェクトした。pHTRE−hEP2R−TEV−Flag−10Hisを含むウイルス粒子を使用して、テトラサイクリントランス活性化因子もまた発現する、GnTI活性が減少している遺伝子改変細胞株に感染させた。感染細胞は、高レベルのhEP2Rタンパク質(3〜5mg/109細胞)を産生することが見い出され、これは、膜タンパク質の発現のために使用される他の既知の系よりも、1ログ高い。形質導入された細胞はピューロマイシン(1.0から4.0μg/mlまで)によって選択して、hEP2R−mCellと称された安定な細胞株を樹立した。
pHTRE−hEP2R−TEV−Flag−10His(配列番号50)由来の感染性粒子を生成するために、pHTRE−hEP2R−TEV−Flag−10Hisプラスミド(配列番号50)を、p8.91パッケージング構築物(Trono lab,Lausanne,Switzerland)およびpCMV−VSV−G(pMD−G;Trono lab,Lausanne,Switzerland)とともに、293Tに同時トランスフェクトした。pHTRE−hEP2R−TEV−Flag−10Hisを含むウイルス粒子を使用して、テトラサイクリントランス活性化因子もまた発現する、GnTI活性が減少している遺伝子改変細胞株に感染させた。感染細胞は、高レベルのhEP2Rタンパク質(3〜5mg/109細胞)を産生することが見い出され、これは、膜タンパク質の発現のために使用される他の既知の系よりも、1ログ高い。形質導入された細胞はピューロマイシン(1.0から4.0μg/mlまで)によって選択して、hEP2R−mCellと称された安定な細胞株を樹立した。
テトラサイクリン誘導性細胞株におけるhEP2R発現の分析
hEP2R−mCell(これは、0μgまたは2μgのピューロマイシン/mlを用いて選択した)を6ウェルプレート中で増殖させ、1μg/mlのDOXを培養培地に加えた。翌日、誘導されたhEP2R−mCellを収集し、一次抗体(M2フラグ抗体)および二次抗体(HRP結合体化抗マウス抗体)を使用して、ウェスタンブロットによって分析した。このブロットは、対照として役立つ抗チューブリンによって同時染色した。hEP2R−mCellにおいてM2フラグ抗体によって3本のバンドが検出されたが、HERK細胞では検出されなかった。3本のバンドのサイズは、45から53kDaまでであり、これらはチューブリンのサイズ(55kDa)よりも小さかった。hEP2Rのサイズは53kDaと予測される。
hEP2R−mCell(これは、0μgまたは2μgのピューロマイシン/mlを用いて選択した)を6ウェルプレート中で増殖させ、1μg/mlのDOXを培養培地に加えた。翌日、誘導されたhEP2R−mCellを収集し、一次抗体(M2フラグ抗体)および二次抗体(HRP結合体化抗マウス抗体)を使用して、ウェスタンブロットによって分析した。このブロットは、対照として役立つ抗チューブリンによって同時染色した。hEP2R−mCellにおいてM2フラグ抗体によって3本のバンドが検出されたが、HERK細胞では検出されなかった。3本のバンドのサイズは、45から53kDaまでであり、これらはチューブリンのサイズ(55kDa)よりも小さかった。hEP2Rのサイズは53kDaと予測される。
細胞増殖を停止し、および/またはアポトーシスを引き起こすhEP2Rの誘導
hEP2R−mCellは、1μg/mlのDOXの存在下または非存在下で、6ウェルプレート中で増幅させた。細胞増殖は顕微鏡法によってモニターした。誘導の24時間後、hEP2R−mCellは増殖を停止したのに対して、誘導されたhEP2R−mCellの大部分がプレートから脱離した。このデータは、高レベルのhEP2R発現が、リガンドなしでhEP2Rシグナルの活性化を起こしたことを示す。
hEP2R−mCellは、1μg/mlのDOXの存在下または非存在下で、6ウェルプレート中で増幅させた。細胞増殖は顕微鏡法によってモニターした。誘導の24時間後、hEP2R−mCellは増殖を停止したのに対して、誘導されたhEP2R−mCellの大部分がプレートから脱離した。このデータは、高レベルのhEP2R発現が、リガンドなしでhEP2Rシグナルの活性化を起こしたことを示す。
Claims (452)
- 第1の核酸配列、第2の核酸配列、および第3の核酸配列を含むベクターを含む単一の核酸構築物であって、該第1の核酸配列は第1の転写制御エレメントに作動可能に連結された目的の配列を含み、該第2の核酸配列は第2の転写制御エレメントに作動可能に連結され、かつ該第1の核酸配列の発現を制御するポリペプチドをコードし、該第3の核酸配列は該第1の転写制御エレメントに作動可能に連結された調節因子標的配列を含み、そして該第1および第2の転写制御エレメントは反対の方向に向いている、核酸構築物。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記ウイルスベクターが自己不活化している、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記第1または第2の転写制御エレメントが他の転写制御エレメントの活性に影響を与える、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記第1または第2の転写制御エレメントが並列している、請求項1に記載の核酸構築物。
- リンカー配列が前記第1の転写制御エレメントと第2の転写制御エレメントとの間に位置している、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記リンカー配列が染色体インシュレーターである、請求項6に記載の核酸構築物。
- 請求項1に記載の核酸構築物を含む細胞株。
- 前記調節因子標的配列が少なくとも1つのtetオペレーター配列を含む、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列がTATAボックスに作動可能に連結されている、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列が2つのtetオペレーター配列に隣接したTATAボックスを含む、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列が配列番号6の配列を含む、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記第1の核酸配列の発現がCreの存在に依存する、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列がTATA配列に隣接した選択マーカーを含み、該TATA配列が少なくとも1つのtetオペレーター配列に作動可能に連結され、該選択マーカーはlox P部位に隣接し、そして該調節因子配列が前記第1の転写制御エレメントと前記第1の核酸配列の間に位置する、請求項13に記載の核酸構築物。
- 前記目的の配列が目的のタンパク質をコードする、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記コードされるタンパク質がDNAポリメラーゼIIIの転写因子である、請求項15に記載の核酸構築物。
- 前記目的の配列が、マイクロRNA、shRNA、siRNA、またはmRNAの配列である、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列がテトラサイクリンリプレッサーをコードする核酸配列を含む、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が、核局在化シグナルをコードする核酸配列をさらに含む、請求項18に記載の核酸構築物。
- 前記コードされている核局在化シグナルがSV40核局在化シグナルである、請求項19に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が配列番号1の配列を含む、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列がVP16をさらに含む、請求項18に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が配列番号2の配列を含む、請求項22に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列がテトラサイクリンアクチベーターをコードする核酸配列を含む、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が核局在化シグナルをコードする核酸配列をさらに含む、請求項24に記載の核酸構築物。
- 前記コードされる核局在化シグナルがSV40核局在化シグナルである、請求項25に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が配列番号2の配列を含む、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列がVP16をさらに含む、請求項24に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が配列番号3の配列を含む、請求項28に記載の核酸構築物。
- 第3の転写制御エレメントに作動可能に連結された第4の核酸配列をさらに含み、該第4の核酸配列は第2の目的の配列を含む、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記第3の転写制御エレメントがプロモーターである、請求項30に記載の核酸構築物。
- 前記第2の目的の配列が目的のタンパク質をコードする、請求項31に記載の核酸構築物。
- 前記第2の目的の配列が、マイクロRNA、shRNA、siRNA、またはmRNAである、請求項31に記載の核酸構築物。
- 前記第3の転写制御エレメントが、マウスHi、ヒトH1、またはU6プロモーターからなる群より選択される、請求項33に記載の核酸構築物。
- 選択マーカーをコードする配列を含む第4の核酸配列をさらに含む、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記選択マーカーがGFPまたはRFPからなる群より選択される、請求項35に記載の核酸構築物。
- 内部リボソーム侵入部位をさらに含む、請求項35に記載の核酸構築物。
- 前記第1の核酸配列の発現が調節可能である、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記転写制御エレメントがプロモーターまたはエンハンサーからなる群より選択される、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記プロモーターが、mH1プロモーター、hH1プロモーター、CAGプロモーター、CMVプロモーター、CMVベースのプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ユビキチンCプロモーター、またはEF−1αプロモーターからなる群より選択される、請求項39に記載の核酸構築物。
- 前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項40に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列に作動可能に連結された、GAL−4をコードする核酸配列をさらに含む、請求項16に記載の核酸構築物。
- 少なくとも2つのtetO配列を含む、請求項42に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列が少なくとも1つのtet調節因子標的配列を含む、請求項42に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列がTATAボックスに作動可能に連結されている、請求項42に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列が、2つのtetオペレーター配列に隣接するTATAボックスを含む、請求項42に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列が配列番号6の配列を含む、請求項42に記載の核酸構築物。
- 第2の調節因子配列および第2の目的の配列に作動可能に連結されたGAL−4をコードする核酸配列をさらに含み、該第2の目的の配列は第3の転写制御エレメントに作動可能に連結され、該第2の目的の配列は、マイクロRNA、shRNA、およびsiRNAからなる群より選択され、そして該第2の調節因子配列は、該GAL−4をコードする核酸配列と、該第2の目的の配列との間に配置されている、請求項42に記載の核酸構築物。
- 前記第2の調節因子標的配列が少なくとも1つの調節因子標的配列を含む、請求項48に記載の核酸構築物。
- 前記第2の調節因子標的配列がTATAボックスに作動可能に連結されている、請求項48に記載の核酸構築物。
- 前記第2の調節因子標的配列が、2つのtetオペレーター配列に隣接するTATAボックスを含む、請求項48に記載の核酸構築物。
- 前記第2の調節因子標的配列が配列番号6の配列を含む、請求項48に記載の核酸構築物。
- 前記第3の転写制御エレメントがプロモーターまたはエンハンサーからなる群より選択される、請求項48に記載の核酸構築物。
- 前記プロモーターが、mH1プロモーター、hH1プロモーター、ユビキチンCプロモーター、またはEF−1αプロモーターからなる群より選択される、請求項53に記載の核酸構築物。
- 第1の核酸配列、第2の核酸配列、および第3の核酸配列を含むベクターを含む単一の核酸構築物であって、該第1の核酸配列、該第2の核酸配列、および該第3の核酸配列は、単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、該第1の核酸配列は目的の配列を含み、該第2の核酸配列は該第1の核酸配列の発現を制御可能であるポリペプチドをコードし、該第3の核酸配列は第1の転写制御エレメントに作動可能に連結された調節因子標的配列を含み、そして該第1の転写制御エレメントは該第1の核酸配列および第2の核酸配列の発現を駆動可能である、核酸構築物。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記ウイルスベクターが自己不活化している、請求項56に記載の核酸構築物。
- 請求項55に記載の核酸構築物を含む細胞株。
- 前記調節因子標的配列が少なくとも1つのtetオペレーター配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列がTATAボックスに作動可能に連結されている、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列が2つのtetオペレーター配列に隣接したTATAボックスを含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列が配列番号6の配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記第1の核酸配列の発現がCreの存在に依存する、請求項55に記載の核酸構築物。
- 調節因子配列がTATA配列に隣接した選択マーカーを含み、該TATA配列が少なくとも1つのtetオペレーター配列に連結され、該選択マーカーはlox P部位にもまた隣接し、そして該調節因子配列が前記第1の転写制御エレメントと前記第1の核酸配列との間に位置する、請求項63に記載の核酸構築物。
- 前記目的の配列が目的のタンパク質をコードする、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記目的のタンパク質がDNAポリメラーゼIIIの転写因子である、請求項65に記載の核酸構築物。
- 前記目的の配列が、マイクロRNA、shRNA、siRNA、またはmRNAである、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列に作動可能に連結された、GAL−4をコードする核酸配列をさらに含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 配列番号6の配列を含む、請求項68に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列が少なくとも1つのtet調節因子標的配列を含む、請求項68に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列がTATAボックスに作動可能に連結されている、請求項68に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列が、2つのtetオペレーター配列に隣接するTATAボックスを含む、請求項68に記載の核酸構築物。
- 前記調節因子標的配列が配列番号6の配列を含む、請求項68に記載の核酸構築物。
- 前記第2の調節因子標的配列および第2の目的の配列に作動可能に連結されたGAL−4をコードする核酸配列をさらに含み、該第2の目的の配列は第3の転写制御エレメントに作動可能に連結され、該第2の目的の配列は、マイクロRNA、shRNA、およびsiRNAからなる群より選択され、そして該第2の調節因子標的配列は、該GAL−4をコードする核酸配列と、該第2の目的の配列との間に配置されている、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記第2の調節因子標的配列が少なくとも1つのtet調節因子標的配列を含む、請求項74に記載の核酸構築物。
- 前記第2の調節因子標的配列がTATAボックスに作動可能に連結されている、請求項74に記載の核酸構築物。
- 前記第2の調節因子標的配列が、2つのtetオペレーター配列に隣接するTATAボックスを含む、請求項74に記載の核酸構築物。
- 前記第2の調節因子標的配列が配列番号6の配列を含む、請求項74に記載の核酸構築物。
- 前記第3の転写制御エレメントがプロモーターまたはエンハンサーからなる群より選択される、請求項74に記載の核酸構築物。
- 前記プロモーターが、mH1プロモーターまたは、hH1プロモーターからなる群より選択される、請求項79に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列がテトラサイクリンリプレッサーをコードする核酸配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が、核局在化シグナルをコードする核酸配列をさらに含む、請求項81に記載の核酸構築物。
- 前記コードされる核局在化シグナルがSV40核局在化シグナルである、請求項82に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が配列番号1の配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列がVP16をさらに含む、請求項81に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が配列番号2の配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列がテトラサイクリンアクチベーターをコードする核酸配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が、核局在化シグナルをコードする核酸配列をさらに含む、請求項87に記載の核酸構築物。
- 前記コードされる核局在化シグナル配列がSV40核局在化シグナルである、請求項88に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が配列番号2の配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列がVP16をさらに含む、請求項87に記載の核酸構築物。
- 前記第2の核酸配列が配列番号3の配列を含む、請求項91に記載の核酸構築物。
- 第3の転写制御エレメントに作動可能に連結された第4の核酸配列をさらに含み、該第4の核酸配列が第2の目的の配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記第3の転写制御エレメントがプロモーターである、請求項93に記載の核酸構築物。
- 前記第2の目的の配列が目的のタンパク質をコードする、請求項93に記載の核酸構築物。
- 前記第3の転写制御エレメントがプロモーターである、請求項93に記載の核酸構築物。
- 前記第2の目的の配列が、マイクロRNA、shRNA、siRNA、またはmRNAである、請求項93に記載の核酸構築物。
- 前記第3の転写制御エレメントが、マウスHiプロモーター、ヒトH1プロモーター、U6もしくはユビキチンCプロモーター、またはEF−1αプロモーターからなる群より選択される、請求項97に記載の核酸構築物。
- 第4の核酸配列をさらに含み、該第4の核酸配列は選択マーカーをコードする配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記選択マーカーがGFPまたはRFPからなる群より選択される、請求項99の核酸構築物。
- 内部リボソーム侵入部位をさらに含む、請求項99に記載の核酸構築物。
- 前記第1の核酸配列の発現が調節可能である、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記転写制御エレメントが、プロモーターまたはエンハンサーからなる群より選択される、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記転写制御エレメントが、CMVプロモーターの3’部分を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記転写制御エレメントが、CMVプロモーターの5’部分を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記転写制御エレメントが、β−アクチンプロモーターの一部を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記転写制御エレメントがCAGプロモーターを含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記転写制御エレメントが、CAGプロモーターに作動可能に連結された3’CMVプロモーター配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記転写制御エレメントが、配列番号12の配列を含む、請求項55に記載の核酸構築物。
- 前記転写制御エレメントが、マウスHiプロモーター、ヒトH1プロモーター、U6ユビキチンCプロモーター、またはEF−1αプロモーターからなる群より選択される、請求項67に記載の核酸構築物。
- CAGプロモーターの5’末端に融合されたCMVプロモーターの3’末端を含む、二方向性転写制御エレメント。
- 配列番号12に示される配列を含む、請求項111に記載の二方向性転写制御エレメント。
- 前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項111に記載の二方向性転写制御エレメント。
- 前記二方向性プロモーターが構成的である、請求項111に記載の二方向性転写制御エレメント。
- EF−1αプロモーターの5’末端に融合されたCMVプロモーターの3’末端を含む二方向性転写制御エレメント。
- 配列番号13に示される配列を含む、請求項115に記載の二方向性転写制御エレメント。
- 前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項115に記載の二方向性転写制御エレメント。
- 前記二方向性プロモーターが構成的である、請求項115に記載の二方向性転写制御エレメント。
- 目的の配列の調節を可能にするのに適切な条件下で、請求項1に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程を包含する、目的の配列の発現を選択的に調節する方法。
- 組換えタンパク質の発現を可能にするのに適切な条件下で、請求項1に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程を含む組換えタンパク質を作製する方法であって、目的の配列は、該組換えタンパク質をコードする核酸配列である、方法。
- 前記標的細胞が糖タンパク質上で均一なグリコシル化パターンを生成する、請求項120に記載の方法。
- 前記標的細胞が、対照細胞と比較してGnTI活性が減少している、請求項120に記載の方法。
- 前記目的の配列の調節を可能にするのに適切な条件下で、請求項1に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程によって前記標的細胞が産生される、請求項120に記載の方法。
- 請求項1に記載の核酸構築物がインビトロで前記標的細胞に導入される、請求項120に記載の方法。
- 免疫応答を誘発するために十分な量で、請求項120に記載の方法によって作製された組換えタンパク質を被験体に導入する工程を包含する、被験体における免疫応答を誘発する方法。
- 請求項1に記載の核酸構築物がインビボで前記標的細胞に導入される、請求項120に記載の方法。
- 目的の配列の調節を可能にするのに適切な条件下で、請求項55に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程を包含する、目的の配列の発現を選択的に調節する方法。
- 組換えタンパク質の発現を可能にするのに適切な条件下で、請求項55に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程を包含する、組換えタンパク質を作製する方法であって、目的の配列は、該組換えタンパク質をコードする核酸配列である、方法。
- 前記標的細胞が糖タンパク質上で均一なグリコシル化パターンを生成する、請求項128に記載の方法。
- 前記標的細胞が、対照細胞と比較してGnTI活性が減少している、請求項128に記載の方法。
- 請求項331に記載の方法を使用して前記標的細胞が産生される、請求項128に記載の方法。
- 前記核酸構築物がインビトロで前記標的細胞に導入される、請求項128に記載の方法。
- 免疫応答を誘発するために十分な量で、請求項128に記載の方法によって作製された組換えタンパク質を被験体に導入する工程を包含する、被験体における免疫応答を誘発する方法。
- 前記核酸構築物がインビボで前記標的細胞に導入される、請求項128に記載の方法。
- トランスジェニック動物を作製する方法であって、
a)請求項1に記載の核酸構築物を接合体に導入する工程;
b)該接合体を分娩まで成長させる工程;
c)そのゲノムが該核酸構築物を含む動物を入手する工程;
d)F1子孫を得るために、該動物を非トランスジェニック動物と交配させる工程;および
e)そのゲノムが該核酸構築物を含む動物を選択する工程
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の核酸構築物を含む導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック動物。
- トランスジェニック動物を作製する方法であって、
a)請求項55に記載の核酸構築物を接合体に導入する工程;
b)該接合体を分娩まで成長させる工程;
c)そのゲノムが該核酸構築物を含む動物を入手する工程;
d)F1子孫を得るために、該動物を非トランスジェニック動物と交配させる工程;および
e)そのゲノムが該核酸構築物を含む動物を選択する工程
を包含する、方法。 - 請求項55に記載の核酸構築物を含む導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック動物。
- Kiss−1を発現しているトランスジェニック動物。
- Kiss−1の発現が調節可能である、請求項139に記載のトランスジェニック動物。
- 請求項135に記載の方法を使用して産生される、Kiss−1を発現するトランスジェニック動物。
- 請求項137に記載の方法を使用して産生される、Kiss−1を発現するトランスジェニック動物。
- 請求項1に記載の核酸構築物を含む、Kiss−1を発現するトランスジェニック動物。
- 請求項55に記載の核酸構築物を含む、Kiss−1を発現するトランスジェニック動物。
- FOX P3を発現するトランスジェニック動物。
- FOX P3の発現が調節可能である、請求項145に記載のトランスジェニック動物。
- 請求項135に記載の方法を使用して産生される、FOX P3を発現するトランスジェニック動物。
- 請求項137に記載の方法を使用して産生される、FOX P3を発現するトランスジェニック動物。
- 請求項1に記載の核酸構築物を含む、FOX P3を発現するトランスジェニック動物。
- 請求項55に記載の核酸構築物を含む、FOX P3を発現するトランスジェニック動物。
- NFκβを発現するトランスジェニック動物。
- NFκβの発現が調節可能である、請求項151に記載のトランスジェニック動物。
- 請求項135に記載の方法を使用して産生される、NFκβを発現するトランスジェニック動物。
- 請求項137に記載の方法を使用して産生される、NFκβを発現するトランスジェニック動物。
- 請求項1に記載の核酸構築物を含む、NFκβを発現するトランスジェニック動物。
- 請求項55に記載の核酸構築物を含む、NFκβを発現するトランスジェニック動物。
- マイクロRNA223を発現するトランスジェニック動物。
- マイクロRNA223の発現が調節可能である、請求項157に記載のトランスジェニック動物。
- 請求項135に記載の方法を使用して産生される、マイクロRNA223を発現するトランスジェニック動物。
- 請求項137に記載の方法を使用して産生される、マイクロRNA223を発現するトランスジェニック動物。
- 請求項1に記載の核酸構築物を含む、マイクロRNA223を発現するトランスジェニック動物。
- 請求項55に記載の核酸構築物を含む、マイクロRNA223を発現するトランスジェニック動物。
- Creを発現するトランスジェニック動物。
- Creの発現が調節可能である、請求項163に記載のトランスジェニック動物。
- 請求項447に記載の方法を使用して産生される、請求項163に記載のトランスジェニック動物。
- 請求項448に記載の方法を使用して産生される、請求項163に記載のトランスジェニック動物。
- 請求項1に記載の核酸構築物を含む、Creを発現するトランスジェニック動物。
- 請求項55に記載の核酸構築物を含む、Creを発現するトランスジェニック動物。
- 請求項1に記載の核酸構築物を含むワクチン。
- 請求項55に記載の核酸構築物を含むワクチン。
- 請求項169に記載の組成物を被験体に投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を産生する方法。
- 請求項170に記載の組成物を被験体に投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を産生する方法。
- 被験体における免疫応答を産生する方法であって、該免疫応答がHIVに対する免疫応答であり、該方法は請求項169に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 被験体における免疫応答を産生する方法であって、該免疫応答がHIVに対する免疫応答であり、該方法は請求項170に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 組換えタンパク質を作製する方法であって、
a.少なくとも1つのVP16配列に作動可能に連結された調節配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む第1の核酸構築物を標的細胞に導入する工程;
b.該第1の核酸配列の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程;
c.工程(b)の細胞に、目的の配列に作動可能に連結された調節因子標的配列を含む第2の核酸構築物を導入する工程であって、
該目的の配列は組換えタンパク質をコードする核酸配列である、工程;および
d.組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で、工程(c)の細胞を維持する工程
を包含する、方法。 - 前記第1の核酸構築物が配列番号44の配列を含む、請求項175に記載の方法。
- 前記第2の核酸構築物が、調節因子標的配列に作動可能に連結された転写制御エレメントに作動可能に連結されている目的の配列を含む、請求項175に記載の方法。
- 前記目的の配列が、選択マーカーに作動可能に連結されたIRES配列に作動可能に連結されている、請求項175に記載の方法。
- 前記目的の配列が、選択マーカーに作動可能に連結されたIRES様配列に作動可能に連結されている、請求項175に記載の方法。
- 組換えタンパク質を作製する方法であって、
a.少なくとも1つのVP16配列に作動可能に連結された調節因子配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む第1の核酸構築物を標的細胞に導入する工程;
b.目的の配列に作動可能に連結されている調節因子標的配列を含む第2の核酸構築物を、工程(a)の同じ標的細胞に導入する工程であって、該目的の配列は組換えタンパク質をコード可能な核酸配列である、工程;ならびに
c.該標的細胞のゲノムへの該第1の核酸配列および第2の核酸配列の組み込みを可能にする条件下に該標的細胞を維持する工程;ならびに
d.該組換えタンパク質の発現を可能にする条件下に工程(c)の細胞を維持する工程
を包含する、方法。 - 前記第1の核酸構築物が配列番号44の配列を含む、請求項180に記載の方法。
- 前記第2の核酸構築物が、調節因子標的配列に作動可能に連結された転写制御エレメントに作動可能に連結されている目的の配列を含む、請求項180に記載の方法。
- 前記目的の配列が、選択マーカーに作動可能に連結されたIRES配列に作動可能に連結されている、請求項180に記載の方法。
- 前記目的の配列が、選択マーカーに作動可能に連結されたIRES様配列に作動可能に連結されている、請求項180に記載の方法。
- 被験体における免疫応答を誘発する方法であって、
a.請求項1に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程;
b.工程(a)における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程;および
c.免疫応答を誘発するために十分な量で、該被験体に工程(b)の標的細胞を導入する工程
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項185に記載の方法。
- 被験体における免疫応答を誘発する方法であって、
a.請求項55に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程;
b.工程(a)における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程;および
c.免疫応答を誘発するために十分な量で、該被験体に工程(b)の標的細胞を導入する工程
を包含する、方法。 - 請求項55に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項187に記載の方法。
- 被験体における免疫応答を誘発する方法であって、
a.請求項1に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程であって、
請求項1に記載の核酸構築物の転写制御エレメントが調節可能である、工程;
b.工程(a)における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程;および
c.工程(b)の標的細胞を該被験体に導入する工程;および
d.目的の配列の発現を誘導するために十分な量で、請求項1に記載の核酸構築物の転写制御エレメントを調節可能である物質の有効量を該被験体に投与する工程であって、
該目的の配列は、免疫応答を誘導するために十分な量で発現される、工程
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項189に記載の方法。
- 被験体における免疫応答を誘発する方法であって、
a.請求項55に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程;
b.工程(a)における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程;および
c.工程(b)の標的細胞を該被験体に導入する工程;および
d.目的の配列の発現を誘導するために十分な量で、請求項55に記載の核酸構築物の転写制御エレメントを調節可能である物質の有効量を該被験体に投与する工程であって、
該目的の配列は、免疫応答を誘導するために十分な量で発現される、工程
を包含する、方法。 - 請求項55に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項191に記載の方法。
- 目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法であって、
a.請求項1に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程であって、
請求項1に記載の核酸構築物の転写制御エレメントは調節可能であり、
目的の配列は、目的のタンパク質をコード可能である、工程;
b.工程(a)における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程;
c.工程(b)の細胞を該被験体に導入する工程;
d.該目的の配列の発現を誘導するために十分な量で、請求項1に記載の核酸構築物の転写制御エレメントを調節可能である物質の有効量を該被験体に投与する工程であって、
該目的の配列は、免疫応答を誘導するために十分な量で発現され、そして
該免疫応答が、該目的のタンパク質に対する抗体を生成する、工程
を包含する、方法。 - 前記方法によって産生される前記抗体を単離する工程をさらに包含する、請求項193に記載の方法。
- 請求項1に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項193に記載の方法。
- 目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法であって、
a.請求項55に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程であって、
請求項55に記載の核酸構築物の転写制御エレメントは調節可能であり、
目的の配列は、目的のタンパク質をコード可能である、工程;
b.工程(a)における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程;
c.工程(b)の標的細胞を該被験体に導入する工程;
d.該目的の配列の発現を誘導するために十分な量で、請求項55に記載の核酸構築物の転写制御エレメントを調節可能である物質の有効量を該被験体に投与する工程であって、
該目的の配列は、免疫応答を誘導するために十分な量で発現され、そして
該免疫応答が、該目的のタンパク質に対する抗体を生成する、工程
を包含する、方法。 - 前記方法によって産生される前記抗体を単離する工程をさらに包含する、請求項196に記載の方法。
- 請求項55に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項196に記載の方法。
- 目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法であって、
a.請求項1に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程であって、
目的の配列は、目的のタンパク質をコードすることが可能である、工程;
b.工程(a)における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程;および
c.工程(b)の細胞を該被験体に導入する工程であって、
該細胞は、免疫応答を誘導するために十分な量で該目的の配列を発現し、
該免疫応答は、該目的のタンパク質に対する抗体を生成する、工程;
を包含する、方法。 - 前記方法によって産生される前記抗体を単離する工程をさらに包含する、請求項199に記載の方法。
- 請求項1に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項199に記載の方法。
- 目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法であって、
a.請求項55に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程であって、
請求項55に記載の核酸構築物の転写制御エレメントは調節可能であり、
目的の配列は、目的のタンパク質をコードすることが可能である、工程;
b.工程(a)における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程;
c.工程(b)の細胞を該被験体に導入する工程であって、
該細胞は、免疫応答を誘導するために十分な量で該目的の配列を発現し、
該免疫応答は、該目的のタンパク質に対する抗体を生成する、工程;
を包含する、方法。 - 前記方法によって産生される前記抗体を単離する工程をさらに包含する、請求項202に記載の方法。
- 請求項55に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項202に記載の方法。
- ef1αプロモーターの5’末端に融合されたCMVプロモーターの5’末端を含む、二方向性転写制御エレメント。
- 前記CMVプロモーターの3’末端に作動可能に連結された調節因子標的配列をさらに含む、請求項205に記載の二方向性転写制御エレメント。
- 配列番号51に記載の配列を含む、請求項205に記載の二方向性転写制御エレメント。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むパッケージング構築物であって、該第1の核酸配列はGagポリタンパク質をコードし、該第2の核酸配列はGag−Pro−Polポリタンパク質をコードし、該第1の核酸配列および該第2の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1個以上の変異を各々含み、該第1の核酸配列および該第2の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、そして該第1の核酸配列および該第2の核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物。
- rev応答エレメントを含む第3の核酸配列をさらに含む、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 請求項208に記載のパッケージング構築物を含む細胞株。
- 前記第1の核酸配列と前記第2の核酸配列との間のエレメントをさらに含み、該エレメントは、該第1の核酸配列と該第2の核酸配列の示差的発現を提供する、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列と前記第2の核酸配列との間の前記エレメントが、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項211に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位がEMC−ウイルスIRESまたはHCV−ウイルスIRESである、請求項212に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項212に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項212に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが調節可能である、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが少なくとも1つのtetオペレーター配列を含む、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 標的である少なくとも1つのtetオペレーター配列がTATAボックスに作動可能に連結されている、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 標的である少なくとも1つの転写制御エレメントが配列番号6の配列を含む、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントがプロモーターである、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項221に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが構成的である、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの前記構成的転写制御エレメントがプロモーターである、請求項223に記載のパッケージング構築物。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項224に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるgag配列中の少なくとも1つの点変異を含む、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列が配列番号19のヌクレオチド配列を含む、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 前記第2の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるgag−pol配列における単一ヌクレオチド挿入および少なくとも1つの点変異を含む、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列が配列番号11のヌクレオチド配列を含む、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列の1つ以上は最適化されたコドンである、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- Tatをコードする核酸配列をさらに含む、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- Revをコードする核酸配列をさらに含む、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 約99:1〜約80:20の比率でGagおよびGag−Polを発現することが可能である、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 複製可能でない組換え体を生成することが可能である、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列が第1の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、前記第2の核酸配列が第2の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の転写制御エレメントが前記第2の転写制御エレメントよりも強力である、請求項235に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列が反対の方向で発現される、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項208に記載のパッケージング構築物。
- 前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項239に記載のパッケージング構築物。
- 前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項239に記載のパッケージング構築物。
- 前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項241に記載のパッケージング構築物。
- 請求項208に記載のパッケージング構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含む、パッケージング系。
- 請求項209に記載のパッケージング構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含む、パッケージング系。
- 請求項243に記載のパッケージング系を使用してウイルス様粒子を作製する方法。
- 請求項244に記載のパッケージング系を使用してウイルス様粒子を作製する方法。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むパッケージング構築物であって、該第1の核酸配列はGagポリタンパク質をコードし、該第2の核酸配列はGag−Proポリタンパク質をコードし、該第1の核酸配列および該第2の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1個以上の変異を含み、該第1の核酸配列および該第2の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、そして該第1の核酸配列および該第2の核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物。
- rev応答エレメントを含む第3の核酸配列をさらに含む、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列の間のエレメントをさらに含み、該エレメントは、該2つの核酸配列の示差的発現を提供する、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列の間の前記エレメントが内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項249に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位がEMC−ウイルスIRESまたはHCV−ウイルスIRESである、請求項250に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項250に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項250に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが調節可能である、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが少なくとも1つのtetオペレーター配列を含む、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つのtetオペレーター配列がTATAボックスに作動可能に連結されている、請求項256に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが配列番号6の配列を含む、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントがプロモーターである、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項259に記載のパッケージング構築物。
- 1つ以上の前記転写制御エレメントが構成的である、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるgag配列中の少なくとも1つの点変異を含む、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列が配列番号19のヌクレオチド配列を含む、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記第2の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるgag−pol配列における単一ヌクレオチド挿入および少なくとも1つの点変異を含む、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記第2の核酸配列が配列番号20のヌクレオチド配列を含む、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列の1つ以上は最適化されたコドンである、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- Tatをコードする核酸配列をさらに含む、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- Revをコードする核酸配列をさらに含む、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 約99:1〜約80:20の比率でGagおよびGag−Polを発現することが可能である、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 複製可能でない組換え体を生成することが可能である、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列が第1の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、前記第2の核酸配列が第2の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の転写制御エレメントが前記第2の転写制御エレメントよりも強力である、請求項271に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列が反対の方向で発現される、請求項271に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の転写制御エレメントおよび前記第2の転写制御エレメントが同じである、請求項271に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の転写制御エレメントおよび前記第2の転写制御エレメントが異なる、請求項271に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項271に記載のパッケージング構築物。
- 前記標的である第1の核酸配列および第2の核酸配列が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項247に記載のパッケージング構築物。
- 前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項277に記載のパッケージング構築物。
- 前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項277に記載のパッケージング構築物。
- 前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項279に記載のパッケージング構築物。
- 請求項247に記載のパッケージング構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含む、パッケージング系。
- 請求項248に記載のパッケージング構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含む、パッケージング系。
- 請求項281に記載のパッケージング系を使用してウイルス様粒子を作製する方法。
- 請求項282に記載のパッケージング系を使用してウイルス様粒子を作製する方法。
- 請求項247に記載の標的パッケージング構築物を含む細胞株。
- 第1の核酸配列、第2の核酸配列、および第3の核酸配列を含むパッケージング構築物であって、該第1の核酸配列はGagポリタンパク質をコードし、該第2の核酸配列はGag−Proポリタンパク質をコードし、該第3の核酸配列はVpr−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質をコードし、該第1の核酸配列および該第2の核酸配列はフレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1個以上の変異を含み、該第1の核酸配列、該第2の核酸配列、および該第3の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、そして該第1の核酸配列、該第2の核酸配列、および該第3の核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物。
- 前記第1の核酸配列と前記第2の核酸配列との間のエレメントをさらに含み、該エレメントは、該第1の核酸配列および該第2の核酸配列の示差的発現を提供する、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 示差的発現を提供する、前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列の間の前記エレメントが内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項287に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位がEMC−ウイルスIRESまたはHCV−ウイルスIRESである、請求項288に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項288に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項288に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが調節可能である、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが少なくとも1つのtetオペレーター配列を含む、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つのtetオペレーター配列がTATAボックスに作動可能に連結されている、請求項294に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが配列番号6の配列を含む、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントがプロモーターである、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項297に記載のパッケージング構築物。
- 1つ以上の前記転写制御エレメントが構成的である、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの前記構成的転写制御エレメントがプロモーターである、請求項299に記載のパッケージング構築物。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項300に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるgag配列中の少なくとも1つの点変異を含む、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列が配列番号19のヌクレオチド配列を含む、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 前記第2の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるgag−pol配列における単一ヌクレオチド挿入および少なくとも1つの点変異を含む、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 前記第2の核酸配列が配列番号20のヌクレオチド配列を含む、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列の1つ以上は最適化されたコドンである、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- Tatをコードする核酸配列をさらに含む、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- Revをコードする核酸配列をさらに含む、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 約99:1〜約80:20の比率でGagおよびGag−Polを発現することが可能である、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 複製可能でない組換え体を生成することが可能である、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列が第1の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、前記第3の核酸配列が第2の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の転写制御エレメントが前記第2の転写制御エレメントよりも強力である、請求項311に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列または前記第3の核酸配列が反対の方向で発現される、請求項286に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列が第1の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、前記第3の核酸配列が第2の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項313に記載のパッケージング構築物。
- 少なくとも1つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項314に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列、前記第2の核酸配列、および前記第3の核酸配列が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項313に記載のパッケージング構築物。
- 前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項316に記載のパッケージング構築物。
- 前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項316に記載のパッケージング構築物。
- 前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項318に記載のパッケージング構築物。
- 前記第1の核酸配列または前記第2の核酸配列と前記第3の核酸配列との間のエレメントをさらに含む、請求項286に記載のパッケージング構築物であって、該第3の核酸配列は、該第1の核酸配列と該第2の核酸配列の間に配置されず、該エレメントは、該第1の核酸配列または該第2の核酸配列と、該第3の核酸配列との間の示差的発現を提供する、構築物。
- 前記エレメントが内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項320に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位がEMC−ウイルスIRESまたはHCV−ウイルスIRESである、請求項321に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項321に記載のパッケージング構築物。
- 前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項321に記載のパッケージング構築物。
- 請求項286に記載のパッケージング構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含む、パッケージング系。
- 請求項325に記載のパッケージング系を使用してウイルス様粒子を作製する方法。
- 発現系であって、
a.請求項208、247、または286に記載のパッケージング構築物;
b.エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ核酸構築物であって、該エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物;および
c.1つ以上の目的の遺伝子を含む遺伝子移入構築物
を含む、発現系。 - テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された、核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む核局在化シグナルをコードする構築物をさらに含む、請求項327に記載の発現系。
- 前記核局在化シグナルをコードする構築物が転写制御エレメントをさらに含む、請求項328に記載の発現系。
- 前記転写制御エレメントがプロモーターまたはエンハンサーである、請求項329に記載の発現系。
- 前記核局在化シグナルをコードする核酸配列が少なくとも1つのリンカー配列と隣接している、請求項328に記載の発現系。
- 前記リンカー配列が配列番号15をコードする、請求項331に記載の発現系。
- 前記核局在化シグナルをコードする構築物が、5’から3’へサイトメガロウイルスプロモーター、第1のリンカーをコードする配列、第2の核局在化シグナル、第2のリンカー配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列を含み、該コードされるリンカーが配列番号15である、請求項328に記載の発現系。
- 前記エンベロープ糖タンパク質が細胞への侵入を促進する、請求項327に記載の発現系。
- 前記エンベロープ糖タンパク質がウイルスエンベロープ糖タンパク質である、請求項327に記載の発現系。
- 前記ウイルスエンベロープ糖タンパク質が水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質(VSV−G)である、請求項335に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物がマーカーをコードする配列をさらに含み、前記目的の遺伝子および該マーカーをコードする配列が少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項327に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物が2つの目的の配列を含む、請求項327に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物が前記目的の遺伝子の3’に位置するウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントをさらに含む、請求項327に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物が1つ以上の長い末端反復配列を含む、請求項327に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物が3’の長い末端反復配列に変異を含む、請求項340に記載の発現系。
- プロモーター配列が5’または3’の長い末端反復配列の代わりに置換されている、請求項340に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物の少なくとも1つの転写制御エレメントがプロモーターである、請求項337に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物の前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項337に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物の前記転写制御エレメントが調節因子構築物をさらに含み、該調節因子構築物が少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結された調節可能エレメントを含む、請求項344に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物が、前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間のエレメントをさらに含み、該エレメントが、該目的の遺伝子および該マーカーをコードする配列の示差的発現を提供する、請求項337に記載の発現系。
- 前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間の前記エレメントが、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項346に記載の発現系。
- 前記内部リボソーム侵入部位がEMC−ウイルスIRESまたはHCV−ウイルスIRESである、請求項347に記載の発現系。
- 前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項347に記載の発現系。
- 前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項347に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物が少なくとも1つの転写制御エレメントを含む、請求項337に記載の発現系。
- 前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項337に記載の発現系。
- 前記転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項337に記載の発現系。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが少なくとも1つのtetオペレーター配列を含む、請求項337に記載の発現系。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが配列番号6の配列を含む、請求項337に記載の発現系。
- 前記転写制御エレメントがプロモーターである、請求項351に記載の発現系。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項356に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物の少なくとも1つの転写制御エレメントが構成的である、請求項351に記載の発現系。
- 前記構成的転写制御エレメントがプロモーターである、請求項358に記載の発現系。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項359に記載の発現系。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が異なる転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項337に記載の発現系。
- 前記マーカーをコードする配列に作動可能に連結された前記転写制御エレメントが、前記目的の遺伝子に作動可能に連結された前記転写制御エレメントよりも強力である、請求項361に記載の発現系。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が反対の方向で発現される、請求項337に記載の発現系。
- 少なくとも1つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項363に記載の発現系。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項363に記載の発現系。
- 前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項365に記載の発現系。
- 前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項366に記載の発現系。
- 請求項327に記載の発現系を含む細胞株。
- 発現系であって、
a.Gagポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第1の核酸構築物を含む第1のパッケージング構築物であって、該Gagをコードする核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1個以上の変異を含み、かつ少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物;
b.Gag−Polポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第2の核酸構築物を含む第2のパッケージング構築物であって、該Gag−Polをコードする核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1個以上の変異を含み、かつ少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物;
c.エンベロープ糖タンパク質をコードする第3の核酸配列を含む第3の核酸構築物であって、該第3の核酸配列が少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物;および
d.少なくとも1つの目的の遺伝子を含む遺伝子移入構築物
を含む、発現系。 - 請求項369に記載の発現系を含む細胞株。
- テトラサイクリントランス活性化因子コーディングに作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする第4の核酸配列を含む第4の核酸構築物をさらに含む、請求項369に記載の発現系。
- 前記第4の核酸構築物が転写制御エレメントをさらに含む、請求項371に記載の発現系。
- 前記核局在化シグナルをコードする配列が少なくとも1つのリンカー配列と隣接している、請求項371に記載の発現系。
- 前記リンカー配列が配列番号15をコードする、請求項373に記載の発現系。
- 前記第4の核酸配列が、5’から3’へ、サイトメガロウイルスプロモーター、配列番号15をコードする核酸配列、核局在化シグナルをコードする核酸配列、配列番号15をコードする核酸配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸配列を含む、請求項371に記載の発現系。
- 前記ウイルスエンベロープ糖タンパク質が水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質(VSV−G)である、請求項371に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物がマーカーをコードする配列をさらに含み、前記目的の遺伝子および該マーカーをコードする配列が少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項369に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物が第2の目的の遺伝子をさらに含む、請求項369に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物が、前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間のエレメントをさらに含み、該エレメントは、該目的の遺伝子および該マーカーをコードする配列の示差的発現を提供する、請求項369に記載の発現系。
- 前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間のエレメントが、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項379に記載の発現系。
- 前記内部リボソーム侵入部位がEMC−ウイルスIRESまたはHCV−ウイルスIRESである、請求項380に記載の発現系。
- 前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項380に記載の発現系。
- 前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項380に記載の発現系。
- 前記遺伝子移入構築物が少なくとも1つの転写制御エレメントを含む、請求項369に記載の発現系。
- 前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項369に記載の発現系。
- 前記転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項369に記載の発現系。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが少なくとも1つのtetオペレーター配列を含む、請求項369に記載の発現系。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが配列番号6の配列を含む、請求項369に記載の発現系。
- 前記転写制御エレメントがプロモーターである、請求項369に記載の発現系。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項389に記載の発現系。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが構成的である、請求項369に記載の発現系。
- 前記構成的転写制御エレメントがプロモーターである、請求項391に記載の発現系。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項392に記載の発現系。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が異なる転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項377に記載の発現系。
- 前記マーカーをコードする配列に作動可能に連結された前記転写制御エレメントが、前記目的の遺伝子に作動可能に連結された前記転写制御エレメントよりも強力である、請求項394に記載の発現系。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が反対の方向で発現される、請求項377に記載の発現系。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が2つの異なる転写制御エレメントに作動可能に連結される、請求項396に記載の発現系。
- 少なくとも1つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項397に記載の発現系。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項396に記載の発現系。
- 前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項399に記載の発現系。
- 前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項399に記載の発現系。
- ウイルス様粒子を作製する方法であって、
a.請求項208、247、または286に記載のパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程;および
b.エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を該細胞に導入し、該エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、工程;および
c.ウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に該細胞を維持する工程
を包含する、方法。 - 遺伝子移入方法であって
a.請求項208、247、または286に記載のパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程;および
b.エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を該細胞に導入し、該エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、工程;
c.1つ以上の目的の遺伝子を含む遺伝子移入構築物を該細胞に導入する工程;および
d.ウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に該細胞を維持する工程
を包含する、方法。 - 前記遺伝子移入構築物がマーカーをコードする核酸配列をさらに含み、前記目的の遺伝子および該マーカーをコードする核酸配列が少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項403に記載の方法。
- 前記遺伝子移入構築物が、前記目的の遺伝子の3’に位置するウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントをさらに含む、請求項404に記載の方法。
- 前記遺伝子移入構築物の前記転写制御エレメントがプロモーターである、請求項404に記載の方法。
- 前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項404に記載の方法。
- 前記遺伝子移入構築物が、前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間のエレメントをさらに含み、該エレメントが、該目的の遺伝子および該マーカーをコードする配列の示差的発現を提供する、請求項404に記載の方法。
- 前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間の前記エレメントが、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項408に記載の方法。
- 前記内部リボソーム侵入部位または前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項409に記載の方法。
- 前記内部リボソーム侵入部位も前記内部リボソーム侵入部位様エレメントも天然に存在しない、請求項409に記載の方法。
- 前記内部リボソーム侵入部位がEMC−ウイルスIRESまたはHCV−ウイルスIRESである、請求項409に記載の方法。
- 前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項409に記載の方法。
- 前記内部リボソーム侵入部位または前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項409に記載の遺伝子移入構築物。
- 前記遺伝子移入構築物が少なくとも1つの転写制御エレメントを含む、請求項403に記載の方法。
- 前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項415に記載の方法。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項415に記載の方法。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが少なくとも1つのtetオペレーター配列を含む、請求項415に記載の方法。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが配列番号6の配列を含む、請求項415に記載の方法。
- 前記転写制御エレメントがプロモーターである、請求項415に記載の方法。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項420に記載の方法。
- 少なくとも1つの転写制御エレメントが構成的である、請求項404に記載の方法。
- 前記構成的転写制御エレメントがプロモーターである、請求項422に記載の方法。
- 前記プロモーターがCMVベース、CAG、SV40ベース、熱ショックタンパク質ベース、mH1ベース、hH1ベース、ニワトリβアクチンベース、U6ベース、ユビキチンCベース、またはEF−1αベースのプロモーターである、請求項423に記載の方法。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が異なる転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項404に記載の方法。
- 前記目的の遺伝子に作動可能に連結された前記転写制御エレメントが、前記マーカーをコードする配列に作動可能に連結された前記転写制御エレメントよりも強力である、請求項425に記載の方法。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が反対の方向で発現される、請求項404に記載の方法。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が2つの異なる転写制御エレメントに作動可能に連結される、請求項427に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項428に記載の方法。
- 前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項427に記載の方法。
- 前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項430に記載の方法。
- 前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項427に記載の方法。
- 前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項430に記載の方法。
- テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸配列に作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む核局在化シグナルをコードする構築物を前記細胞に導入する工程をさらに包含する、請求項427に記載の方法。
- 前記核局在化シグナルをコードする構築物が転写制御エレメントをさらに含む、請求項434に記載の方法。
- 前記転写制御エレメントがプロモーターまたはエンハンサーである、請求項435に記載の方法。
- 前記核局在化シグナルをコードする配列が少なくとも1つのリンカー配列と隣接している、請求項434に記載の方法。
- 前記リンカー配列が配列番号15をコードする、請求項437に記載の方法。
- 前記核局在化シグナルをコードする構築物が、5’から3’へ、サイトメガロウイルスプロモーター、配列番号15をコードする核酸配列、核局在化シグナルをコードする核酸配列、配列番号15をコードする核酸配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸配列を含む、請求項434に記載の方法。
- 目的の外因性遺伝子を含む細胞であって、該目的の遺伝子が、請求項403に記載の方法によって該細胞に移入される、細胞。
- 細胞による組換えタンパク質の発現を可能にするのに適切な条件下で、請求項402に記載の方法によって作製されたウイルス粒子と標的細胞を接触させる工程を包含する、組換えタンパク質を作製する方法。
- 免疫応答を誘発するために十分な量で、請求項441に記載の方法によって作製された組換えタンパク質を被験体に導入する工程を包含する、被験体における免疫応答を誘導する方法。
- 前記標的細胞が糖タンパク質上で均一なグリコシル化パターンを生成する、請求項442に記載の方法。
- 前記標的細胞は、対照細胞と比較してGnTI活性が減少している、請求項443に記載の方法。
- 請求項443の方法によって作製されたタンパク質を被験体に投与する工程を包含する、選択されたタンパク質で被験体を治療する方法。
- ウイルス粒子形成を調節する因子をスクリーニングする方法であって
a.第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程であって、該第1の核酸配列はGagポリタンパク質をコードし、該第2の核酸配列はGag−Pro−Polポリタンパク質をコードし、該第1の核酸配列および該第2の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する1個以上の変異を含み、該第1の核酸配列および該第2の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、そして該第1の核酸配列および該第2の核酸配列は、スクリーニングされる該因子に作動可能に連結されている、工程;
b.エンベロープ糖タンパク質をコードする第3の核酸配列を含むエンベロープ構築物を該細胞に導入する工程であって、該第3の核酸配列は、少なくとも1つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、工程;
c.ウイルス粒子の形成を可能にするのに適切な条件下で該細胞を培養する工程;
d.該ウイルス粒子を検出する工程;
e.対照培養物と比較した場合に、スクリーニングされる該培養物中でのウイルス粒子の数の増加または減少は、該因子がウイルス粒子形成を調節することを示す、工程
を包含する、方法。 - トランスジェニック動物を作製する方法であって、
a.請求項402に記載の方法によって作製したウイルス粒子を接合体に導入する工程;
b.該接合体を分娩まで成長させる工程;
c.そのゲノムが、目的の遺伝子を発現可能である核酸構築物を含む動物を入手する工程;
d.F1子孫を得るために、該動物を非トランスジェニック動物と交配させる工程;および
e.そのゲノムが、該目的の遺伝子を発現可能である該核酸構築物を含む動物を選択する工程であって、該動物が、選択された目的の遺伝子を発現する、工程
を包含する、方法。 - 請求項447に記載の方法によって作製されたトランスジェニック動物。
- パッケージング系であって
a.Gagポリタンパク質をコードする第1の変異した核酸を含む第1の核酸構築物であって、該第1の変異した核酸は転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物;および
b.Gag−Polポリタンパク質をコードする第2の変異した核酸を含む第2の核酸構築物であって、該第2の変異した核酸は転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物;
を含み、
c.該第1の核酸構築物および該第2の核酸構築物の変異は、ウイルス粒子形成を可能にするGagおよびGag−Polポリタンパク質の発現の比率を生じる、パッケージング系。 - 前記GagおよびGag−Polポリタンパク質の発現の比率が約99:1〜約80:20である、請求項449に記載のパッケージング系。
- 前記第1の変異した核酸が最小CMVプロモーターに作動可能に連結され、前記第2の変異した核酸が熱ショックタンパク質プロモーターに作動可能に連結されている、請求項449に記載のパッケージング系。
- 目的の抗原を結合する抗体を同定する方法であって、該方法は
a.目的の抗原を結合する抗体を含むことが疑われるサンプル、および該目的の抗原を発現する標的細胞を接触させる工程であって、
該標的細胞は、請求項1、55、208、247、および286に記載の核酸構築物の1つ以上を含む、工程;ならびに
b.該サンプル中の抗体が、該標的細胞によって発現された該目的の抗原に結合するか否かを決定し、それによって、該目的の抗原に結合する該抗体が、該目的の抗原を結合する抗体として同定される、工程
を包含する、方法。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2018524637A (ja) * | 2015-04-24 | 2018-08-30 | ファイ・バイオメッド・カンパニー・リミテッド | スマートコンタクトレンズ及びスマート眼鏡 |
KR20190008229A (ko) * | 2016-05-12 | 2019-01-23 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 강력하고 균형 잡힌 양방향성 프로모터 |
JP2020509752A (ja) * | 2017-03-10 | 2020-04-02 | ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インクThe Medical College Of Wisconsin, Inc. | 網膜疾患のためのリボスイッチ調節遺伝子治療 |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2008050774A1 (fr) * | 2006-10-23 | 2008-05-02 | Research Organization Of Information And Systems | Procédé de production de souche cellulaire pouvant exprimer un gène induit par la tétracycline ou de souche cellulaire présentant une inactivation conditionnelle de gènes, et utilisation des souches cellulaires |
CN103391998A (zh) * | 2010-07-26 | 2013-11-13 | Adv生物制剂公司 | 用于重组蛋白表达的载体和方法 |
EP2476441A1 (en) | 2011-01-13 | 2012-07-18 | Universitat Autònoma De Barcelona | Methods and reagents for efficient and targeted delivery of therapeutic molecules to CXCR4 cells |
US10106817B2 (en) * | 2013-02-14 | 2018-10-23 | The J. David Gladstone Institutes | Compositions and methods of use thereof for identifying anti-viral agents |
PL3283634T3 (pl) * | 2015-04-14 | 2019-10-31 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Rekombinowany adenowirus eksprymujący dwa transgeny z dwukierunkowym promotorem |
CN105255895B (zh) * | 2015-11-06 | 2018-01-02 | 爱博环球生物技术有限公司 | 用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的mar转录调控元件及其表达系统 |
US11208669B2 (en) * | 2016-01-12 | 2021-12-28 | University Of Cincinnati | Lentivirus packaging system comprising a synthetic positive feedback loop |
US10179919B2 (en) * | 2016-02-23 | 2019-01-15 | Immune Design Corp. | Multigenome retroviral vector preparations and methods and systems for producing and using same |
CN105802970A (zh) * | 2016-05-30 | 2016-07-27 | 东北师范大学 | 靶向沉默Gβ1的shRNA |
CN106689065B (zh) * | 2016-12-13 | 2023-05-30 | 广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所(中国农业科学院甘蔗研究中心) | 一种自动取米蛾卵装置 |
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AU2018356538B2 (en) * | 2017-10-25 | 2023-09-28 | Nouscom Ag | Eukaryotic cell line |
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CN108424934A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-08-21 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 一种慢病毒cag-cmv双启动子改造载体构建及应用 |
EP3988650A4 (en) * | 2019-06-21 | 2022-09-21 | Osaka University | METHOD FOR PREPARING AN ARTIFICIAL RECOMBINANT RNA VIRUS STABLELY INTEGRATING A FOREIGN GENE |
CN114480503A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-05-13 | 北京镁伽科技有限公司 | 用dna标签标记的基因过表达慢病毒质粒文库及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0710283A4 (en) * | 1993-07-22 | 1997-07-02 | Merck & Co Inc | THE EXPRESSION OF HUMAN INTERLEUKIN-1-g (b) IN A TRANSGENIC ANIMAL |
US7622300B2 (en) * | 1998-06-03 | 2009-11-24 | Kappes John C | Trans-lentiviral vector particles and transduction of eukaryotic cells therewith |
US20060031945A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-09 | Yu Shen | Inducible expression systems for modulating the expression of target genes in eukaryotic cells and non-human animals |
US20070042494A1 (en) * | 2005-05-31 | 2007-02-22 | Tal Kafri | Heterologous retroviral packaging system |
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Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018524637A (ja) * | 2015-04-24 | 2018-08-30 | ファイ・バイオメッド・カンパニー・リミテッド | スマートコンタクトレンズ及びスマート眼鏡 |
US10399291B2 (en) | 2015-04-24 | 2019-09-03 | Phi Biomed Co., Ltd. | Smart contact lenses and smart glasses |
KR20190008229A (ko) * | 2016-05-12 | 2019-01-23 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 강력하고 균형 잡힌 양방향성 프로모터 |
JP2019514415A (ja) * | 2016-05-12 | 2019-06-06 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーJanssen Vaccines & Prevention B.V. | 強力でバランスのとれた双方向性プロモーター |
JP7046835B2 (ja) | 2016-05-12 | 2022-04-04 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | 強力でバランスのとれた双方向性プロモーター |
US11473105B2 (en) | 2016-05-12 | 2022-10-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
KR102573534B1 (ko) | 2016-05-12 | 2023-08-31 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 강력하고 균형 잡힌 양방향성 프로모터 |
JP2020509752A (ja) * | 2017-03-10 | 2020-04-02 | ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インクThe Medical College Of Wisconsin, Inc. | 網膜疾患のためのリボスイッチ調節遺伝子治療 |
Also Published As
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