JP2020509752A - 網膜疾患のためのリボスイッチ調節遺伝子治療 - Google Patents
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Abstract
本発明は、対象内のトランスジーンの発現を制御するための改変リボスイッチを含むコンストラクトを提供する。疾患（特に眼疾患）を治療する方法も企図される。【選択図】図１
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月１０日に出願された米国仮出願第６２／４６９，７０５号の優先権を主張し、その内容全体が参照により組み込まれる。
本出願は、２０１７年３月１０日に出願された米国仮出願第６２／４６９，７０５号の優先権を主張し、その内容全体が参照により組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
Ｎ／Ａ
Ｎ／Ａ
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）と緑内障は、世界的に視力喪失の主な原因である。ＡＭＤは、５０歳以上の人によく見られる眼疾患である。ＡＭＤでは、黄斑、即ち、網膜の中心付近の数百万の光感知細胞、及びシャープ、中心視野、並びに正面の物体を見る能力に必要な眼の部分で構成される小領域に損傷がある。黄斑の損傷は、ドルーゼンと呼ばれる沈着物の形成、場合によっては網膜における異常な血管の成長によって引き起こされる。
緑内障は、眼の視神経が損傷して視力喪失や失明をもたらす疾患のグループである。緑内障の特徴は、体液（房水）の蓄積に関連した眼圧の増加である。一部の患者は疾患が遺伝的である。他の患者では、眼の炎症が緑内障に関与すると考えられている。
ＡＭＤも緑内障も予防することができない。症状や視力低下のない早期ＡＭＤの治療法はない。進行ＡＭＤは生物製剤で治療される。緑内障はしばしばプロスタグランジン点眼薬で治療される。現在の治療は侵襲的で高価であり、患者とクリニックに負担がかかり、毎月の点眼（ＡＭＤ）又は毎日の点眼投与が必要である。
眼の遺伝子治療は、遺伝性網膜疾患の患者の生活の質を大幅に改善する可能性がある。いくつかの要因により、眼は遺伝子置換療法の理想的な器官になる。眼はアクセスしやすく、区画化された特権的な部位である。これは、免疫学的に、炎症性免疫応答を誘発することなく、眼が外来蛋白質／抗原の導入に耐え得ることを意味する。臨床試験では、対照コントロールを活用できる。このため、眼疾患の遺伝子治療が開発されている。
これに関し、組換えアデノ随伴ウィルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、網膜疾患の遺伝子治療を媒介するための有望なツールとして登場した。ベクター送達後の遺伝子発現レベルを効果的にコントロールすることは、潜在的な遺伝子治療の成功にとって最も重要であり、治療用トランスジーンのコントロールされない過剰発現は、毒性を引き起こし得る。従来、誘導性プロモーターシステムが採用されてきた。残念ながら、ＡＡＶのコーディング容量が限られ、且つそのようなシステムを効果的に機能させるために必要な制御エレメントのサイズが大きいため、従来のプロモーターを含めることは実現可能ではない。
リボスイッチは代替可能な選択肢である。リボスイッチは、小さな標的分子に結合し且つ標的とする、ｍＲＮＡ分子の特異的な制御コンポーネントであり、それにより、リボスイッチを含むｍＲＮＡの蛋白質産物の発現をシス様式で制御する。従って、リボスイッチを含むｍＲＮＡは、その標的分子の濃度に応じて、自身の活性の制御に直接関与している。いくつかのリボスイッチは「自己標的」であり、それは自身の発現を制御できることを意味する。このスイッチには、相互に排他的な２つの二次構造の１つに適合できるＲＮＡエレメントが含まれる。これらの構造の１つは遺伝子発現が「オン」になるシグナルであり、もう１つの立体構造は遺伝子を「オフ」にする。
しかしながら、遺伝子発現をオン又はオフにするために「スイッチを切り替える」には、しばしば毒性濃度のリガンドが必要である。従って、本研究の目標は、これらの制御デバイスの効率、改善された制御パラメーター、及び臨床適用性を改善することである。本発明の主題は、眼の遺伝子治療で使用するための網膜における遺伝子発現をオン又はオフにすることができるリボスイッチである。
本発明は、遺伝子サイレンシングの二重機構により機能する改変リボスイッチを使用してトランスジーンの発現を制御するコンストラクト、キット、及び方法を提供することにより、前述の欠点を克服する。本発明は、遺伝子サイレンシングのための二重機構により、従来のリボスイッチに比べて独特で改善されたデザインを提供し、それによりトランスジーンの発現のより良いコントロールを可能にする。本明細書では、リガンドの存在下で遺伝子発現の増加を媒介するオン型スイッチである自己標的リガンド不活性化マイクロＲＮＡ（ＳＬＩＭ）スイッチを含む、新規改変リボスイッチについてより詳細に説明する。ＡＭＤを治療するための本技術を使用した組成物、及び方法を本明細書で提供する。具体的には、トランスジーン（例えば、ＶＥＧＦ阻害剤）の発現を断続的に切り替えるために、このＳＬＩＭスイッチを使用できる。ＳＬＩＭスイッチのさらなる実施形態では、緑内障の治療に使用できる。この技術の組成物、及び使用方法は、緑内障の治療を企図しており、患者の眼のプロスタグランジンの発現を断続的にオフにするか、減少させるために有益であろう。
本発明の前述並びに他の態様及び利点は、以下で詳述される。説明の際には、本明細書の一部を形成する添付図面を参照し、例示として、本発明の好ましい実施形態が示される。そのような実施形態は必ずしも本発明の全範囲を表すものではなく、従って、本発明の範囲を解釈するためには特許請求の範囲及び本明細書が参照される。
本特許又は出願には、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて、国際事務局（ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｅ）によって提供される。
本明細書の開示は、疾患、特に眼疾患、より具体的にはＡＭＤ及び緑内障の治療に使用するための改変リボスイッチ（例えば、改変ｍｉＲＮＡスイッチ）及びその改変リボスイッチを含むシステムを提供する。本発明は、制御ツールとして新規改変マイクロＲＮＡ（リボスイッチ）を使用し、眼の遺伝子発現を制御するための新規システムを提供することを目的とする。そのような遺伝的コンストラクト、及びそれを利用するキット又は方法は、遺伝子発現のコントロール（例えば、特定の化合物（例えば、眼のプロスタグランジン）の制御に関与する組換え蛋白質又はトランスジーンの生産）に有用であり得る。
そのようなＲＮＡベースのシステム（リボスイッチ）は、誘導性プロモーターシステムより優れた３つの明確な利点を提供する。第１に、小さな遺伝的フットプリント（〜１００ｂｐ）を有するため、大量のコーディングキャパシティを犠牲にすることなく、ｒＡＡＶベクターゲノム内に簡単に組み込むことができる。第２に、そのデバイスはシスで作用し、機能に蛋白質補因子が必要ないため、免疫応答の可能性を制限する。最後に、リボスイッチのアプタマードメインは、蛋白質、小分子薬、又はイオンを含む、ほとんどの任意の活性化リガンドに応答するようにデザインできる。
この技術の一実施形態は、緑内障患者の眼圧を制御するために、眼におけるプロスタグランジンＦ２α合成に関与するトランスジーンの発現を調節することである。第二の実施形態は、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を防止するために、眼における抗ＶＥＧＦ組換え融合蛋白質、具体的にはアフリベルセプト（アイリーア）の発現を調節することである。
この技術のいくつかの実施形態は、トランスジーンの発現を制御するために目的のトランスジーンのスイッチオン又はオフのいずれかを可能にするリガンドコントロール遺伝子制御エレメントである改変リボスイッチを含むコンストラクトを使用する。リボスイッチが機能するメカニズムは、限定されず、十分な濃度のリガンドが存在する場合にリボザイムとして機能し、それ自体を切断する能力、リボソーム結合部位にアクセスできず、翻訳の発生を防ぐようにｍＲＮＡを折り畳む能力、及び／又はｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子のスプライシングに影響を与える能力を含む。改変リボスイッチ及びそのようなリボスイッチを含むコンストラクト又はカセットを含む実施形態が本明細書で企図される。
マイクロＲＮＡは、遺伝子発現の制御において重要な役割を果たすノンコーディングＲＮＡのクラスである。転写後レベルで作用するｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって大きな一次転写物（ｐｒｉ−ｍＲＮＡ）として転写され、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａを含む蛋白質複合体によりプロセシングされ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ）を形成する。本発明において、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏＲＮＡは、遺伝子発現をサイレンシングするためのサイレンシングＲＮＡとして作用することができるｐｒｅ−ｍＲＮＡにプロセシングされるようにデザインされている。
リボスイッチは２つの部分、アプタマー及び発現プラットフォームに分けられる。アプタマーは、標的小分子リガンドが結合する「センサー」である。発現プラットフォームは、アプタマーセンサーの変化に応じて構造変化を起こす。アプタマードメインの結合は、発現プラットフォーム内で立体構造の変化を引き起し、この立体構造の変化は、遺伝子をオン又はオフにすることにより遺伝子発現を制御する。これは図１に示されている。アプタマーは青色、発現プラットフォームじゃ赤、リガンドは緑で示されている。しばしば、「スイッチを切り替える」には有毒な濃度のリガンドが必要である。しかし、本発明は、非毒性レベルのリガンドを使用する眼遺伝子治療で使用するために、網膜における遺伝子発現をオン又はオフにすることができる改変リボスイッチを提供する。
多くの例示的なリボスイッチ、具体的には、自己標的リガンド不活性化マイクロＲＮＡ（ＳＬＩＭ）の実施形態が本明細書に記載されている。自己標的リガンド不活性化マイクロＲＮＡ（ＳＬＩＭ）は、リガンドの存在下で遺伝子発現の増加を媒介するオン型スイッチである（例えば、図２Ａ及び２Ｂを参照）。ＡＭＤ及び緑内障を治療するためにこの技術を使用する組成物、及び方法が本明細書で提供される。具体的には、このＳＬＩＭシステムは、ＶＥＧＦ阻害剤の発現を断続的に切り替えるために使用できる。この技術の組成物及び使用方法には、緑内障の治療が企図され、患者の眼におけるプロスタグランジンの発現を断続的に停止又は低下させるために有益であることが企図される。両方について、以下で詳しく説明する。
ＳＬＩＭ：遺伝子発現を改変するためのオン型改変リボスイッチ
本発明の一実施形態は、目的のトランスジーンの発現を制御するために発現コンストラクトに組み込むことができるオン型リボスイッチである自己標的リガンド不活性化マイクロＲＮＡ（ＳＬＩＭ）スイッチを提供する。ＳＬＩＭスイッチ（図２Ａ及びＢのｓｍｉＲＮＡ）では、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの基底領域を、標的リガンドに結合できるアプタマーに置き換える必要がある。この配列は、発現コンストラクトの３’又は５’非翻訳領域のいずれかにクローニングされる。リガンドの結合は、アプタマーとｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの立体構造を変化させ、Ｄｒｏｓｈａによるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの非切断をもたらす。標的ｍｉＲＮＡ配列は、３’又は５’非翻訳領域のいずれかにクローニングされ、第２レベルの制御を可能にする。ここで、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、リガンドの非存在下で切断されると、ｍｉＲＮＡにプロセシングされ、ｍｉＲＮＡは標的ｍｉＲＮＡ配列に結合して転写を防ぐことができる。ＳＬＩＭスイッチが発現コンストラクトに組み込まれると、リガンドが存在しない場合はトランスジーンの発現がオフになり、リガンドがアプタマーに結合するとオンになる。
ＳＬＩＭスイッチは、転写後レベルで遺伝子発現を制御することにより機能を切り替える。活性化リガンドが存在しない条件では、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは新生転写物からＤｒｏｓｈａによって切断される。このｍｉＲＮＡはプロセシングされ、相補的な標的サイトの結合を通じて、遺伝子サイレンシングの第２のメカニズムとして機能する。活性化リガンドが存在すると、遺伝子発現は変化せず、遺伝子が発現する。
一実施形態では、トランスジーンの発現を制御するための外来核酸コンストラクトが提供される。コンストラクトは、（ａ）トランスジーン、（ｂ）トランスジーンの非翻訳領域内にあるｓｍｉＲＮＡスイッチ（ＳＬＩＭスイッチ）、及び（ｃ）ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部に相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列をコードする。ここで、ｓｍｉＲＮＡスイッチは、リガンドに結合することができるアプタマードメイン及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列を含む。ｍｉＲＮＡスイッチは、（１）ｍＲＮＡの切断の制御（ポリＡテール又は５’キャップのいずれかを除去し、ＲＮＡを不安定にする）と（２）ｓｍｉＲＮＡからのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの切断の制御の両方によって、トランスジーンの発現を制御する。ここで、切断されたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部がプロセシングされ、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列に結合し、トランスジーンの発現をサイレンシングする。
上述のように、リガンドの非存在下では、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは転写物から切断され、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列に結合し、トランスジーンをサイレンシングする。これは図２Ｂに示されている。いくつかの実施形態では、上記（ｃ）のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部に相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列は、トランスジーンに含まれる（図２Ｂの下図に示すように）。言い換えれば、ＳＬＩＭスイッチは、トランスジーン自体に対して生成することができる。
好ましい実施形態では、異種自己標的リガンド不活性化マイクロＲＮＡ（ＳＬＩＭ）スイッチは、（ａ）目的の標的遺伝子、（ｂ）トランスジーンの非翻訳領域内に位置する少なくとも１つのｓｍｉＲＮＡスイッチを含む。ここで、ｓｍｉＲＮＡスイッチは、リガンドに結合できるアプタマードメイン及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含む。ここで、ｓｍｉＲＮＡスイッチは、（１）トランスジーンのｍＲＮＡの切断の制御、及び（ｂ）ｓｍｉＲＮＡからのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの切断の制御の両方によって、トランスジーンの発現を制御する。ここで、切断されたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部は、トランスジーンの一部（言い換えれば、トランスジーンの一部はｍｉＲＮＡ標的配列として機能する）に結合し、トランスジーンの発現をサイレンシングする。適切なリボスイッチは、図１８及び１９に記載されており、各リボスイッチが標的とするアイリーアトランスジーン又はＦｌｔ１トランスジーンの一部を含む（例えば、アイリーア標的１（配列番号７０）内に見られるアイリーアの一部を標的とするアイリーア標的１のためのＳＬＩＭスイッチ（例えば、配列番号２１又は２６又は３１）、アイリーア標的２（配列番号７１）を標的とするアイリーア標的２のためのＳＬＩＭスイッチ（例えば、配列番号２２又は２７又は３２）等（例えば、アイリーア標的３を標的とするアイリーア標的３のためのＳＬＩＭスイッチ、アイリーア標的４を標的とするアイリーア標的４のためのＳＬＩＭスイッチ、アイリーア標的５を標的とするアイリーア標的５のためのＳＬＩＭスイッチ、Ｆｌｔ１標的１を標的とするＦｌｔ１標的１のためのＳＬＩＭスイッチ等）。本明細書に記載の方法で使用するために、外来発現コンストラクト内で１つ以上のＳＬＩＭスイッチを組み合わせることができる（例えば、アイリーア又はＳｆｌｔ１の標的１、標的２、標的３、標的４、及び標的５のためのＳＬＩＭスイッチは、図１８−１９に見られるＳＬＩＭの標的に対するコンストラクトの任意の組み合わせ（例えば、ＳＬＩＭ １及び２、ＳＬＩＭ １及び３、ＳＬＩＭ １及び４、ＳＬＩＭ １及び５、ＳＬＩＭ ２及び３、ＳＬＩＭ ２及び４、ＳＬＩＭ ２及び５、ＳＬＩＭ ３及び４、ＳＬＩＭ ３及び５、ＳＬＩＭ ４及び５、ＳＬＩＭ １、２及び３、ＳＬＩＭ １、２及び４、ＳＬＩＭ １、２及び５、ＳＬＩＭ １、３及び４、ＳＬＩＭ １、３及び５、ＳＬＩＭ １、４及び５、ＳＬＩＭ ２、３及び４、ＳＬＩＭ ２、３及び５、ＳＬＩＭ ２、４及び５、ＳＬＩＭ ３、４及び５、ＳＬＩＭ １、２、３及び４、ＳＬＩＭ １、２、３及び５、ＳＬＩＭ ２、３、４及び５及びＳＬＩＭ １、２、３、４及び５）で組み合わせることができる）。
一実施形態では、トランスジーンのｍＲＮＡを調節することによりトランスジーンの発現を制御するための外来核酸コンストラクトが提供される。上記核酸は以下をコードする。（ａ）目的の標的遺伝子、（ｂ）トランスジーンの非翻訳領域内にある少なくとも１つのｓｍｉＲＮＡスイッチ。ここで、ｓｍｉＲＮＡスイッチは、リガンドに結合できるアプタマードメイン及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含む。ここで、ｓｍｉＲＮＡスイッチは、（１）トランスジーンのｍＲＮＡの切断の制御、及び（２）ｓｍｉＲＮＡからのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの切断の制御の両方によって、トランスジーンの発現を制御する。ここで、切断されたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部は、トランスジーンの一部に（ｍｉＲＮＡ標的配列として）結合し、トランスジーンの発現をサイレンシングする。好ましい実施形態では、外来核酸コンストラクトはＡＡＶウィルスベクターである。
いくつかの実施形態では、アイリーア又はｓＦｌｔ１に対して生成されたＳＬＩＭスイッチは、図１８及び１９に記載されている配列に示され、ＡＭＤの治療に使用される。
一実施形態では、外来核酸コンストラクトは、ＳＬＩＭスイッチ、トランスジーン、及び少なくとも１つの標的ｍｉＲＮＡ配列をコードする。そのようなＳＬＩＭスイッチのデザインが図２Ａに示される。一例では、適切なＳＬＩＭスイッチ（ｓｍｉＲＮＡ）は、アプタマードメインとｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードする。適切なアプタマードメインは、当技術分野で公知のオン型リボスイッチのアプタマードメインから選択され、特に、例えば、Ｌ２Ｂｕｌｇｅ１８ｔｃ（限定されないが、例えば、配列番号１２）、Ｋ１９（例えば、配列番号１５）、Ｌ２Ｂｕｌｇｅ９（例えば、配列番号１１）を含むが、これらに限定されない。適切なアプタマードメインは図３に示され、以下に記載されている。
適切なＳＬＩＭスイッチは、限定されないが、図３（ｓｍｉＲＮＡ）に示される我々が開発したＴｈｅｏ−ＳＬＩＭ（配列番号１）、及び本明細書に記載のＴｅｔ−ＳＬＩＭ（配列番号１７）を含む。これらのＳＬＩＭスイッチは、ヒトゲノム内の遺伝子と交差反応しないように設計されているため、オフターゲット効果を引き起こさない。
追加のＳＬＩＭスイッチが図１８〜２３に示されている。
核酸に対して使用される「外来」という用語は、原核生物の宿主細胞にとって外因（通常、自然界では見られない）である、又は原核生物の宿主細胞では通常見られない組換え核酸である。いくつかの実施形態において、外来核酸配列は、多くの異なる供給源又は生物に由来する配列を含む異種配列である。外来という用語はまた、コンストラクトが使用される種とは異なる種からの配列を含むコンストラクトを包含する。例えば、本発明のｒＡＡＶコンストラクトは、内因性ＡＡＶ配列だけでなく、ヒト又はＡＡＶウィルスに固有ではない他の供給源からの外来配列を含む。
本明細書で提供される核酸コンストラクトは、天然に存在しない配列を含む合成人工コンストラクトである。
用語「トランスジーン」及び「目的の標的遺伝子」は、本発明のコンストラクトの使用により所望の細胞で発現される外来遺伝子を指すために言い換え可能なものとして使用される。
さらに、適切なアプタマーを様々なリガンドに対してデザインし、アプタマーをｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列に連結することによりＳＬＩＭスイッチに組み込むことができる（例えば、図２Ａ参照）。
いくつかの実施形態では、コンストラクトは、トランスジーン及びＳＬＩＭスイッチを含む。実施形態のいくつかでは、トランスジーンはＳＬＩＭスイッチのｍｉＲＮＡ標的配列として機能する。他の実施形態では、コンストラクトは、ＳＬＩＭスイッチをさらに含み、少なくとも１つの標的ｍｉＲＮＡ配列、好ましくは３’又は５’ＵＴＲに約１〜４個の標的ｍｉＲＮＡ配列も含む。例えば、図２Ｂ（上図）は、そのようなコンストラクトの適切なデザインを示している。適切なリガンドは以下でさらに議論され、具体的には、例えば、テトラサイクリン、テオフィリン及びグアニンなどの、血液網膜関門を通過できるリガンドが含まれる。
いくつかの実施形態では、コンストラクトは、少なくとも１つの標的ｍｉＲＮＡ配列、あるいは少なくとも２つ、あるいは少なくとも３つ、あるいは少なくとも４つの標的ｍｉＲＮＡ配列を含む。追加される標的ｍｉＲＮＡ配列の数は、使用されるベクター（例えば、ｒＡＡＶベクターの使用）に依存してもよく、標的ｍｉＲＮＡの適切な数は、例えば、１〜５を含む。ｒＡＡＶベクターのサイズには制限があるため、標的サイトを追加すると、使用可能なコーディング配列が制限され得る。従って、トランスジーンのサイズと配列に応じて、追加される標的ｍｉＲＮＡ配列の数も変わり得る。
一実施形態では、ｓｍｉＲＮＡが配列番号１である場合、標的ｍｉＲＮＡ配列は配列番号１０（ＧＡＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＴＡＴＡＡＡＡ）にコードされる。適切な一実施形態では、コンストラクトは、例えば、配列番号２に見られるように、少なくとも３つの標的ｍｉＲＮＡ配列を含む。
一実施形態では、コンストラクトは、リガンドの投与によりトランスジーンの発現を誘導できる適切なトランスジーンを含む。例えば、以下により詳細に記載されるように、トランスジーンは、ＶＥＧＦ阻害剤、具体的にはＡＭＤの治療のために眼で発現されるように誘導され得るＶＥＧＦ阻害剤であり得る。具体的には、適切なＶＥＧＦ阻害剤はアフリベルセプトであり、これは配列番号８に見られるｃＤＮＡによってコードされる。
別の実施形態では、アプタマードメイン及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは配列番号１内にコードされる。一実施形態において、コンストラクトは、コンストラクト内に見出される他の配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ＷＰＲＥエレメント等を含む。当業者は、核酸コンストラクトからのトランスジーンの発現に必要な他の公知のエレメントを組み込むことができるだろう。
いくつかの実施形態では、コンストラクトは、特に、アデノ随伴ウィルス（ｒＡＡＶ）、レンチウィルス、アデノウィルス、プラスミド、単純ヘルペスウィルス、バキュロウィルス、バクテリオファージである。好ましくは、コンストラクトはアデノ随伴ウィルスである。アフリベルセプトのトランスジーン、Ｔｈｅｏ−ＳＬＩＭスイッチ、及び３つのｍｉＲＮＡ標的配列を組み込んだ適切なｒＡＡＶコンストラクト（例えば、配列番号９又は配列番号１９にコードされる配列）を図２に示す。
いくつかの実施形態では、ＳＬＩＭスイッチは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの基底領域がアプタマーで置換されることを必要とする。この配列は、発現カセットの３’又は５’非翻訳領域のいずれかにクローニングされる。さらに、成熟ｍｉＲＮＡの配列に相補的なｍｉＲＮＡ標的サイトは、カセットの５’又は３’非翻訳領域のいずれかに１又は複数のコピーを含めることができる。
自己標的リガンド不活性化ｍｉＲＮＡ（ＳＬＩＭ）スイッチは、転写後レベルで遺伝子発現を制御することにより機能を切り替える。活性化リガンドが存在しない条件では、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは新生転写物からＤｒｏｓｈａによって切断される。このｍｉＲＮＡはプロセシングされ、相補的な標的サイトとの結合を通じて、遺伝子サイレンシングの第２のメカニズムとして機能する。活性化リガンドが提供されると、遺伝子発現は変化しない。
各リボスイッチの複数のコピーを、目的の遺伝子の３’非翻訳領域に含めることができる。各リボスイッチは表１に示すような最適なコピー数を有すると考えられる。さらに、いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的サイトの複数のコピーを３’又は５’非翻訳領域に含めることができる。合成リボスイッチはアプタマーと発現プラットフォームを含み、遺伝子発現を制御するための発現プラットフォーム活性の変化に依存する。ｍｉＲＮＡ標的サイトは、成熟ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡによって認識される治療カセット（コンストラクト）内の配列である。以下でさらに説明するように、ｍｉＲＮＡ標的サイトはトランスジーン内に含まれていてもよい。言い換えると、リボスイッチから切断されプロセシングされたｓｉＲＮＡはトランスジーンに結合し、その発現を阻害する。
あるいは、ＳＬＩＭスイッチは、ＡＭＤの治療のためのアイリーア及びｓＦｌｔ１を有するトランスジーン自体に対して生成することができる。その配列は図１６〜１８、１９及び２３に示される。
一実施形態では、核酸コンストラクトは、目的の標的遺伝子、例えば、ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、アイリーア（配列番号２０）又はｓＦＬＴ１（配列番号３６））、及び標的遺伝子の非翻訳領域内に位置する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ ＳＬＩＭスイッチ（例えば、各ＶＥＧＦ阻害剤の配列番号２１〜３５又は配列番号３７〜５１から選択される少なくとも１つ）を含む。
いくつかの実施形態において、核酸コンストラクトは、アイリーア遺伝子を含むｒＡＡＶベクター（例えば、配列番号１９）である。例えば、配列番号１９は、ＳＬＩＭスイッチを使用したアイリーアの発現のための完全なＡＡＶ発現ベクターを提供する。配列番号１９内で、ＸはＳＬＩＭ配列が挿入されてもよい位置を示す。挿入され得る適切なＳＬＩＭ配列は、図１８に示され得、限定されないが、６Ｓ−フォリン酸応答性ＳＬＩＭ（ｍｉＲＮＡ）スイッチ（例えば、配列番号２１、２２、２３、２４、及び２５を含む）（リガンドの６Ｓ−フォリン酸で活性化する）、テオフィリン応答性ＳＬＩＭ（例えば、配列番号２６、２７、２８、２９、及び３０）（リガンドのテオフィリンで活性化する）、又はテトラサイクリン応答性ＳＬＩＭ（例えば、配列番号３１、３２、３３、３４、及び３５）（リガンドのテトラサイクリンで活性化する）を含む。いくつかの実施形態では、１〜５個のＳＬＩＭ配列、あるいは１〜３個のＳＬＩＭ配列がＡＡＶ発現ベクターに挿入される。例えば、配列番号１９は、配列番号２１の１〜５コピー、あるいは配列番号２２の１〜５コピー、あるいは配列番号２３の１〜５コピー、あるいは配列番号２４の１〜５コピー、あるいは配列番号２５の１〜５コピー、あるいは配列番号２６の１〜５コピー、あるいは配列番号２７の１〜５コピー、あるいは配列番号２８の１〜５コピー、あるいは配列番号２９の１〜５コピー、あるいは配列番号３０の１〜５コピー、あるいは配列番号３１の１〜５コピー、あるいは配列番号３２の１〜５コピー、あるいは配列番号３３の１〜５コピー、あるいは配列番号３４の１〜５コピー、あるいは配列番号３５の１〜５コピーを組み込んでもよい。
別の実施形態において、核酸コンストラクトは、目的の標的遺伝子、例えば、ＶＥＧＦ阻害剤ｓＦＬＴ１（配列番号３６）、及び標的遺伝子の非翻訳領域内に位置する少なくとも１つのｓｍｉＲＮＡ ＳＬＩＭスイッチ（例えば、配列番号３７〜５１から選択された少なくとも１つ）を含む。
いくつかの実施形態において、核酸コンストラクトはｓＦＬＴ１遺伝子（配列番号３６）を含む。ｓＦＬＴ１は、ベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）内に挿入されてもよく、ＳＬＩＭ配列が挿入されてもよい位置を示すＸが隣接していてもよい。挿入され得る適切なＳＬＩＭ配列は、図１８に示され得、限定されないが、６Ｓ−フォリン酸応答性ＳＬＩＭ（ｍｉＲＮＡ）スイッチ（例えば、配列番号３７、３８、３９、４０、４１を含む）（リガンドの６Ｓ−フォリン酸で活性化する）、テオフィリン応答性ＳＬＩＭ（例えば、配列番号４２、４３、４４、４５、４６）（リガンドのテオフィリンで活性化する）、又はテトラサイクリン応答性ＳＬＩＭ（例えば、配列番号４７、４８、４９、５０、及び５１）（リガンドのテトラサイクリンで活性化する）を含む。いくつかの実施形態では、１〜５個のＳＬＩＭ配列、あるいは１〜３個のＳＬＩＭ配列がコンストラクトに挿入される。例えば、配列番号３６は、配列番号３７の１〜５コピー、あるいは配列番号３８の１〜５コピー、あるいは配列番号３９の１〜５コピー、あるいは配列番号４０の１〜５コピー、あるいは配列番号４１の１〜５コピー、あるいは配列番号４２の１〜５コピー、あるいは配列番号４３の１〜５コピー、あるいは配列番号４４の１〜５コピー、あるいは配列番号４５の１〜５コピー、あるいは配列番号４６の１〜５コピー、あるいは配列番号４７の１〜５コピー、あるいは配列番号４８の１〜５コピー、あるいは配列番号４９の１〜５コピー、あるいは配列番号５０の１〜５コピー、あるいは配列番号５１の１〜５コピーをＸに組み込んでもよい。ＳＬＩＭ配列の代替の組み合わせが考えられる（例えば、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、及び４１から選択される１〜５個のＳＬＩＭ配列から）。適切には、コンストラクト内で同じリガンドにより活性化されるＳＬＩＭ配列（例えば、テトラサイクリンリガンドにより活性である１〜５個のＳＬＩＭ配列）を使用することが好ましい。
図２１に示される別の実施形態では、核酸コンストラクトはＰＴＧＳ２（配列番号５２）、及びＰＴＧＦＲ（配列番号５３）を含む（配列番号５４にＰＴＧＳ２−Ｐ２Ａ−ＰＴＧＦＲとして組み合わせて示されている）。適切な核酸コンストラクトは、図２３に配列番号８１として示される（ＰＧＦ２ａｌｐｈａ生合成制御遺伝子（ＰＴＧＳ２（配列番号６０）、及び２つの合成リボスイッチＴＣ４０（配列番号５９）、及びＴＣ４５（配列番号６３）を含むＰＴＧＦＲ（配列番号６２）を含むＡＡＶ発現ベクター）。そのようなコンストラクトの適切な使用は、緑内障の治療用である。
リガンド
使用される特定のリガンドは、特定のアプリケーションとＳＬＩＭスイッチに組み込まれているアプタマーに依存する。眼の疾患及び障害の治療には、血液網膜関門を通過できるリガンドが好ましい。血液網膜関門を通過できる適切なアプタマーには、限定されないが、例えば、テトラサイクリン、テオフィリン、グアニン、ガラクチトール、プロゲステロン、マンニトール、エストラジオール、ドーパミン、キニジン、尿素、ジゴキシン、ウラシル、ベラパミル、チオ尿素、モキシフロキサシン、チミン、レボフロキシン、コルチコステロン、アセタゾラミド、テストステロン、ドキシサイクリン、及びその組み合わせを含む。
使用される特定のリガンドは、特定のアプリケーションとＳＬＩＭスイッチに組み込まれているアプタマーに依存する。眼の疾患及び障害の治療には、血液網膜関門を通過できるリガンドが好ましい。血液網膜関門を通過できる適切なアプタマーには、限定されないが、例えば、テトラサイクリン、テオフィリン、グアニン、ガラクチトール、プロゲステロン、マンニトール、エストラジオール、ドーパミン、キニジン、尿素、ジゴキシン、ウラシル、ベラパミル、チオ尿素、モキシフロキサシン、チミン、レボフロキシン、コルチコステロン、アセタゾラミド、テストステロン、ドキシサイクリン、及びその組み合わせを含む。
好ましい実施形態では、リガンドは、テトラサイクリン、テオフィリン、及びグアニンからなる群から選択される。
リガンドの適切な投与経路は、当技術分野で知られており、経口投与、眼を介した投与（例えば、点眼）等が含まれる。
眼疾患の治療
本技術のコンストラクトは、眼疾患の治療のための遺伝子治療に特に有用である。眼は、いくつかの理由でこのタイプの遺伝子治療の特に良いターゲットである。眼は高度に特殊化された器官で、光刺激を電気シグナルに変換し、それらのシグナルを視覚野に中継するように進化した。光感覚と画像形成は、神経感覚網膜の最外層に位置する光受容細胞の活性化によって媒介される。このとき、角膜とレンズによって集束された入射光は、シグナルカスケードの活性化と電気インパルスの伝播をもたらす。その複雑さにもかかわらず、眼には多くの特徴があり、遺伝子治療にとって魅力的な器官である。即ち、比較的免疫特権があり、コンパートメントのサイズが小さく、視覚化と検査が簡単で、手術を受ける患者に最小限のリスクで簡単にアクセスできる。網膜（ＡＭＤ）又は角膜（緑内障）は、遺伝子治療の主要な標的である。ベクター送達は、通常、治療粒子を含む液体懸濁液を、標的細胞に近接する解剖学的に制約された空間に注入することにより達成される。ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦ又はｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．ｓＦＬＴ１ベクターは、網膜神経節細胞やミュラーグリアを含む網膜内部の細胞を標的とする場合に最も有益であり得、そのため、硝子体内注射により投与され得る。ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．ＰＴＧＳ２−Ｐ２−ＰＴＧＦＲベクターは、角膜内皮細胞を含む角膜及び前房の細胞を標的とする場合に最も有益であり得、そのため、前房内注射により投与され得る。眼遺伝子治療への応用のためにｒＡＡＶを使用した多数のｒＡＡＶ臨床試験が成功裏に完了した。しかし、これまでの全ての試験では、光受容体を標的とするようにデザインされた網膜下送達アプローチが利用されてきた。現在、フェーズＩ／ＩＩ臨床試験（ＮＣＴ０１４９４８０５）が、ＡＭＤの治療のために、ＶＥＧＦの可溶性受容体である可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（ｓＦＬＴ）のｒＡＡＶを介した過剰発現を利用して進行中である。この試験でのｓＦＬＴの発現は常時性であり、本明細書に記載の提案されたｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦ及びｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．ｓＦＬＴ１技術とは異なり、制御することはできない。緑内障の治療のためのｒＡＡＶベースの遺伝子治療の臨床試験は進行していない。
ＡＭＤの治療
本発明は、ＡＭＤの少なくとも１つの症状を阻害、軽減又は緩和することにより、加齢性黄斑変性症を治療する方法を提供する。ＡＭＤは、脈絡膜、網膜色素上皮、及び神経感覚網膜を含む眼内の複数の組織層が関与する疾患であり、２つの形態で発生する。ドライ型ＡＭＤは、網膜中心部の進行性の地図状萎縮を特徴とする非増殖性疾患である。患者の約１０〜１５％で疾患はウェット型に進行し、これは脈絡膜から網膜下空間への血管の異常な成長を特徴とする。脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、主にＶＥＧＦの眼内濃度の増加の結果として生じ、ＡＭＤの主要な視力を脅かす症状である。抗ＶＥＧＦ剤の投与は、ＣＮＶの発生率を有意に減少させることが知られており、現在のＡＭＤのゴールドスタンダード治療法である。しかし、治療計画は侵襲的であり、精製組換え抗ＶＥＧＦ蛋白質の硝子体内注射を繰り返し（例えば、毎月又は隔月）行う必要がある。
提案されたｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦ技術は、ＡＭＤ患者におけるＣＮＶ形成の発生率を有意に減少させ、その結果視力喪失を防ぐように作用し得る。特に、ＳＬＩＭテクノロジーを採用することで、活性化リガンドの投与による抗ＶＥＧＦ発現のコントロールをし得る。
本発明のｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦベクター技術は、ＡＭＤ患者におけるＣＮＶ形成の発生率を有意に減少させ、その結果視力喪失を防ぐように作用し得る。特に、ＳＬＩＭテクノロジーを採用することで、活性化リガンドの投与による抗ＶＥＧＦ発現のコントロールをし得る。
本発明は、本明細書に記載のＶＥＧＦ阻害剤及びＳＬＩＭリボスイッチ（例えば、ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦ又はｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．ｓＦＬＴ１ベクターを含む）を含むコンストラクトを対象の眼に投与する工程、及びさらに治療有効量のリガンドを投与する工程を含む、ＡＭＤの少なくとも１つの症状を治療、軽減、緩和又は阻害する方法を提供する。ＳＬＩＭリボスイッチは、本明細書でより詳細に説明されるように、どのリガンドを使用するかを決定することができる。適切には、治療は、ＡＭＤの１つ以上の症状の軽減、緩和又は阻害、例えば、ＣＮＶの進行の軽減又は阻害をもたらす。
一実施形態では、ＡＭＤの少なくとも１つの症状を治療、阻害、又は軽減する方法は、ＶＥＧＦ阻害剤をコードするトランスジーンに作動可能に接続された１つ以上のオン型リボスイッチを含むコンストラクトを投与する工程、及び治療有効量のリガンドを投与する工程を含む。適切なオン型リボスイッチは当技術分野で公知であり、限定されないが、例えば、Ｌ２Ｂｕｌｇｅ１８ｔｃ（配列番号１２）、Ｋ１９（配列番号１５）、及びＬ２Ｂｕｌｇｅ ９（配列番号１１）を含む。さらに、コンストラクトは、コンストラクトに組み込み可能な最適なコピー数のオン型リボスイッチをコードしてもよい。リボスイッチの最適なコピー数は、表１に詳述されている。例えば、ＡＭＤの治療のためのコンストラクトは、１〜３個のＬ２Ｂｕｌｇｅ１８ｔｃリボスイッチ、及びＶＥＧＦ阻害剤を含んでいてもよい。
治療有効量のリガンドの投与によってトランスジーンの遺伝子発現を変化させるために、ＳＬＩＭリボスイッチを本発明のコンストラクトに組み込むことができる。「治療有効量」は、細胞内のトランスジーン産物の発現レベルを変化させるリガンドの量又は投与量を意味する。当業者は、適切な応答を生じさせるために治療有効量を滴定及び決定し、治療されるべき所望の疾患の症状の軽減をもたらすことができる。治療的有効量はまた、対象に対して無毒性用量のリガンドのレベルを維持する。適切には、用量は、対象における発現の個別の要求に応じて、日毎、週毎、又は月毎で決められてもよい。
緑内障の治療
本発明は、眼疾患を治療するために眼内のトランスジーンを制御するために使用できる網膜モデルにおける初めての高機能遺伝子スイッチを提供する。上記のＳＬＩＭスイッチは、従来のリボスイッチよりも拡大したダイナミックレンジを有するポテンシャルを有し、高眼圧を含む緑内障の１つ以上の症状の治療、抑制、又は改善に使用できる。プロスタグランジン合成は、活性化リガンドを経口摂取することにより制御される。活性化リガンドの投与量は、リバウンドトノメーターを使用した患者の眼圧（ＩＯＰ）の測定値によって決定される。
本明細書の開示は、ＳＬＩＭスイッチ及び本明細書に記載のプロスタグランジン合成を制御する１つ以上の遺伝子を含むコンストラクトをコードするアデノ随伴ウィルスを使用する遺伝子治療を含む緑内障の治療方法を提供する。別の実施形態では、本明細書の開示は、プロスタグランジン合成を制御する１つ以上の遺伝子、及び少なくとも１つのオン型リボスイッチ（ＳＬＩＭ）を含むコンストラクトをコードするアデノ随伴ウィルスを投与する工程を含む、緑内障の治療方法を提供する。図２１及び２３は、そのような例の１つであり、プロスタグランジン合成の制御に必要な遺伝子をコードするＡＡＶベクター、及び本発明での使用に適したＳＬＩＭリボスイッチを示す。
緑内障は、網膜神経節細胞の進行性喪失及び最終的な重度の視覚障害を導く眼圧（ＩＯＰ）上昇によって代表される。ＩＯＰの増加は、眼の後房の毛様体による房水の生産と前房の小柱網を介したその排液との不均衡に起因する。緑内障は、小柱網を介したドレナージが完全（閉塞隅角）に又は部分的（開放隅角）にブロックされているかどうかに基づいて分類できる。開放隅角緑内障は最も一般的であり、通常、ゆっくり進行する視力喪失以外の症状を示さない。閉塞隅角緑内障は一般的な喪失であり、医学的に緊急事態であると考えられ、急性眼痛、頭痛、かすみ目、過度の流涙吐き気、及び嘔吐を示す。
その慢性的性質のため、提案されたｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．ＰＴＧＳ２−Ｐ２−ＰＴＧＦＲ（配列番号８１）技術は、緑内障の治療に適切であろう。
一実施形態では、緑内障の少なくとも１つの症状を軽減、阻害又は改善する方法が提供される。この方法は、外来核酸コンストラクトを対象の眼に投与する工程を含む。一実施形態では、外来核酸コンストラクトは、プロスタグランジン２α合成を制御するトランスジーン、及び少なくとも１つのｓｍｉＲＮＡリボスイッチをコードする。別の実施形態では、外来核酸コンストラクトは、（ｉ）プロスタグランジン合成を制御するトランスジーン（例えば、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、（ｉｉ）トランスジーンの非翻訳領域内に位置するｓｍｉＲＮＡスイッチであって、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに隣接する少なくとも２つのリボスイッチを含み、各リボスイッチは、発現プラットフォームに作動可能に連結されたアプタマーを含む、ｓｍｉＲＮＡスイッチ、（ｉｉｉ）ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部に相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列、をコードし、ここで、トランスジーンは対象の細胞に組み込まれ、トランスジーンを発現し、（ｂ）眼内のトランスジーンの発現を制御し、緑内障の少なくとも１つの症状を軽減、抑制、又は改善するために、アプタマーに結合できるリガンドの治療有効量を投与する工程を含む。一実施形態では、症状は高眼圧である。
適切なリガンドは、本明細書に記載されるように、血液網膜関門を通過できるリガンドを含む。
適切には、プロスタグランジン２α合成を制御するトランスジーンは、限定されないが、特に、例えば、ＰＴＧＳ２（配列番号５２）を含む。他の適切なトランスジーンは、当該分野で公知である。
キット
本明細書の開示はキットを提供する。キットは、本明細書に記載の方法での使用に適していてもよい。一態様では、キットは、本明細書に記載のコンストラクト（例えば、コンストラクトを含むＳＬＩＭスイッチ）を含むｒＡＡＶベクターを含むことができる。いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載のＶＥＧＦ阻害剤をコードするｒＡＡＶベクターを含むコンストラクトを含むことができる。他の態様では、キットは、本明細書に記載のプロスタグランジン合成の制御に関与する１つ以上の遺伝子をコードするｒＡＡＶベクターを含むコンストラクトを含むことができる。さらに、キットは、ｒＡＡＶベクターの初期投与後に投与されるリガンドの１つ以上の投与を含んでもよい。投与のタイミングと適切な投与方法に関するインストラクションが提供され得る。
「対象」及び「患者」という用語は言い換え可能なものとして使用され、限定されないが、特定の治療のレシピエントになる、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類等を含む任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、用語「対象」及び「患者」は、本明細書ではヒトに関して言い換え可能なものとして使用される。
「治療する」又は「治療」という用語は、限定されないが、疾患又は障害に関連する１つ以上の徴候又は症状を軽減、阻害又は予防することを含む。例えば、緑内障の治療は、例えば、眼圧の低下を含む（例えば、治療される緑内障の症状は、高眼圧である）。
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益な又は望ましい生物学的、及び／又は臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。
本明細書の開示の文脈内における「発現プラットフォーム」に関しては、核酸発現に関する効果を媒介する改変リボスイッチの一部が、発現プラットフォームとして知られている。好ましくは、発現プラットフォームは、リボスイッチのアプタマードメインに作動可能に連結され、好ましくは構造的に連結され、最も好ましくは核酸リンカーによって連結される。アプタマードメインが核酸配列によって発現プラットフォームにリンクしていることが最も好ましい。好ましくは、発現プラットフォームの一部のステム構成は、ステム構造の構成の変化が、核酸配列の発現を促進する第１の構成と核酸配列の発現を阻害する第２の構成との間での、発現プラットフォームの対応する構造の変化をもたらすように、リガンドの結合時に構成を変える。
「遺伝子コンストラクト」は、宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。限定されないが、例えば、外来ＤＮＡを細胞に運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、又はウィルスを含む。遺伝子コンストラクトは、追加の選択マーカー遺伝子、及び当技術分野で知られている他の遺伝エレメントも含むことができる。遺伝子コンストラクトは、好ましくは細胞に形質導入、形質転換、又は感染させ、それにより細胞にベクターにコードされる核酸、及び／又は蛋白質を発現させることができる。
「作動可能に連結された」第１エレメントは、第１エレメントが第２エレメントと機能的な関係にあるときに、第２エレメントと作動可能に連結される。例えば、アプタマーのリガンドへの結合が発現プラットフォームの構造変化を引き起こし、発現プラットフォームの機能を変化させる場合、アプタマーは発現プラットフォームに作動可能に連結される。（例えば、発現プラットフォームがリボザイムである場合、アプタマーとリガンドの結合は、リボザイム活性を活性化できる）。典型的には、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、必要に応じて２つの蛋白質コード領域を結合するために、同じリーディングフレーム内にある。
本発明は、記載された特定の実施形態に限定されないことが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解される。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の実施形態を含む。
本発明の思想から逸脱することなく、既に説明したものに加えて多くの追加の変更が可能であることは、当業者に明らかである。本明細書の開示を解釈する際、全ての用語は文脈と一致するできるだけ最も広い方法で解釈されるべきである。「含む」という用語のバリエーションは、非排他的な方法でエレメント、コンポーネント、又は工程を指すと解釈されるべきであり、そのため、参照されるエレメント、コンポーネント、又は工程は、明示的に参照されない他のエレメント、コンポーネント、又は工程と組み合わせられてもよい。特定のエレメントを「含む」として参照される実施形態は、それらのエレメント「から本質的になる」、及び「からなる」としても考えられる。値の範囲が示されている箇所では、その開示は、明示的に記述されていない範囲の下限と上限の他の組み合わせを明確に意図している。例えば、１と１０の間、又は２と９の間の値との記述は、１と９の間、又は２と１０の間の値も想定している。２つの値の「間」と識別される範囲には、エンドポイント値を含む。例えば、１と１０の間の値の記述には、１、及び１０の値を含む。
「から本質的になる」及び「からなる」という用語は、ＭＰＥＰ及び関連するフェデラルサーキットの解釈に沿って解釈されるべきである。「から本質的になる」の移行句は、クレームの範囲を、クレームされた発明の「基本的、及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない」特定の材料又は工程に限定する。「からなる」は、クレームで特定されていない任意のエレメント、工程、又は成分を除外する閉じた用語である。例えば、配列に関して、「からなる」は配列番号にリストされている配列に向けられ、また、配列番号をその一部として含み得るより大きな配列に向けられる。
方法に関して説明される本明細書の開示の態様は、本明細書の開示で議論される物の組成物又はキットの文脈で利用できる。同様に、物の組成物に関して説明される本明細書の開示の態様は、方法、及びキットの文脈で利用でき、キットに関して説明される本明細書の開示の態様は、方法、及び物の組成物の文脈で利用できる。
本発明は、１つ以上の好ましい実施形態の用語に関して説明される、そして明示的に述べられたものとは別に、多くの同等物、代替物、バリエーション、及び改変が可能であり、本発明の範囲内であることが理解される。
本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮すればより十分に理解される。
実施例１：インビボで眼の遺伝子発現を制御する能力
この実施例は、６つのリボスイッチが細胞培養時、及びマウスの網膜に送達されたときにインビボでリガンドに応答することを示している。
６つの小さな（〜１００ｂｐ）リボスイッチ（Ｋ１９、Ｔｃ４０ｘ４５、ＧｕａＭ８ＨＤＶ、Ｌ２Ｂｕｌｇｅ１８ｔｃ、Ｌ２Ｂｕｌｇｅ９ａｎｄＴｈｅｏ６ＨＤＶ）は、細胞培養時、及びｒＡＡＶ２ベクターを使用してマウスの網膜に送達されたときにインビボでリガンドに反応した。
最適なコピー数（最大ダイナミックレンジ）と活性化リガンドに対する用量反応性を決定するために、デュアルルシフェラーゼアッセイを使用して、リボスイッチをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で評価した。リガンドはテトラサイクリンとテオフィリンを使用した。
細胞培養実験により、適切なリガンドの投与に応答して蛍光発光に有意な変化が見られた（ｐ＜０．０１、ワンウェイＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４全グループ）。
次に、最適なコピー数の各リボスイッチをｒＡＡＶ ＧＦＰレポーターカセットにクローニングし、ＡＡＶ２キャプシドにパッケージした。各ＧＦＰ−リボスイッチカセットを、非誘導性ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を保有するＡＡＶ２コントロールベクターと組み合わせて、Ｃ５７Ｂｌ／６ｊマウスに硝子体内注射した。注射の４週間後、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＧＦＰ蛍光レベルを、カスタム「マルチライン」共焦点走査レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）を使用してインビボで定量した。その後、マウスに１０００ｍｇ／ｋｇの用量の活性化リガンド（テトラサイクリン、テオフィリン）を投与し、強制経口投与の２時間後、及び２４時間後に蛍光レベルを定量した。
インビボの結果は、各リボスイッチの活性化リガンドをマウスに投与すると、治療前レベルと比較して、強制経口投与後２時間でＧＦＰ蛍光に高度に有意な変化が生じることを示した（ｐ＜０．０１、ペアードｔ検定、Ｎ＝６）（図６Ａ及び６Ｂ）。重要なことに、ＧＦＰ蛍光は、活性化リガンドを投与した２４時間後に治療前のレベルまで回復した。これは、眼の網膜において遺伝子を送達及び発現できることを示している。
実施例２：リボスイッチの最適コピー数とダイナミックレンジの評価
実施例２Ａ：公知のリボスイッチのテスト
この実施例は、コンストラクトに使用できるリボスイッチの最適数と関連するダイナミックレンジを示す。両方のアッセイのプロトコルの概要を８Ａ及び８Ｂに示す。最適なコピー数を決定するために、０〜４コピーの各リボスイッチを含むプラスミドを、リードアウト用の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のトランスジーンを使用して作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートに播種し、２日目に１μｇの各プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。３日目に、細胞を蛍光顕微鏡で観察し（励起４６７〜４９８ｎｍ）、プレートリーダーを使用して蛍光を定量した（４８８ｎｍ励起、５２０ｎｍ発光）。
ダイナミックレンジを決定するために、最適なコピー数のリボスイッチを含むホタルルシフェラーゼを含むコンストラクトを作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１日目に播種し、２日目に１μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。細胞をリボスイッチに対応する０〜１００μＭのリガンドで処理し、プレートリーダーを使用して３日目に発光を定量した。結果を表２に示す。
図９Ａに示されるように、オン型リボスイッチの１つとしてＬ２Ｂｕｌｇｅ１８ｔｃリボスイッチを試験した。細胞を０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、及び１００μＭのテトラサイクリン（リガンド）で処理し、蛍光顕微鏡の結果を図９Ｄに示した。蛍光を定量化した結果を図９Ｂに示す。この結果は、図３Ｃに示されるように、３つのコピーが最適なダイナミックレンジを提供することを示している。
Ｋ１９リボスイッチも上記のように試験し（図１０）、結果を図９Ｂ〜Ｄに示す。この結果は、１コピーが最適なコピー数であることを示している。
Ｌ２Ｂｕｌｇｅ ９もテストされ（活性化リガンドテオフィリンを使用）、最適なコピー数は３であると決定された。
いくつかのオン型リボスイッチの結果を上記の表１にまとめている。
実施例２Ｂ：新規ＳＬＩＭスイッチのテスト
図１２Ａ及び１３Ａにそれぞれ示されているように、実施例２Ａに記載されている実験を、標的ｍｉＲＮＡ配列を含む新しくデザインされたＴｅｔ−ＳＬＩＭ及びＴｈｅｏ−ＳＬＩＭスイッチを使用して実施した。図１２Ｂ及び１３Ｂは両方のスイッチのダイナミックレンジを示し、一方、図１２Ｃ及び１３Ｃは、それぞれのリガンド０〜１００μＭで処理された細胞で見られた蛍光を示す。両方のＳＬＩＭリボスイッチは、当技術分野で知られている同様のリボスイッチよりも広いダイナミックレンジを有していた。
実施例３：抗ＶＥＧＦ化合物を含むＳＬＩＭを使用したマウス実験
アダルト（＞２ヶ月齢）野生型（例えば、Ｃ５７Ｂｌ／６ｊ株）マウス（ｎ＝２０）は、認可サプライヤー（例えば、ジャクソンラボラトリーズ）から購入され、標準条件でザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシンにグループ収容される。順化期間の後、各動物は両側硝子体内注射を受ける。一方の眼は、ＳＬＩＭ遺伝子スイッチ（ここでは、ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦと称す）のコントロール下で血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤（例えば、アフリベルセプト（アイリーア））の生合成に必要なｃＤＮＡ配列をパッケージした精製組換えアデノ随伴ウィルス（ｒＡＡＶ）を含む２μｌ滅菌バッファー（ＨＢＳＳ＋０．０１４％ツイーン２０）が投与される。反対側の眼には、外科的介入の効果のコントロールのためにバッファーが注入される。ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦベクターを網膜の細胞に組み込むには４週間かかる。予備データに基づいて、神経節細胞とミュラーグリアが効果的に形質導入されると予想される。網膜及び脈絡膜血管のベースラインインテグリティを確立するために、共焦点走査レーザー検眼鏡を使用してフルオレセインアンジオグラフィー（ＦＡ）により両眼が撮像される。その後、動物はランダムに治療（活性化リガンド投与）又はコントロール（活性化リガンド非投与）グループのいずれかに割り当てられる。集中的な赤外線レーザービームでブルッフ膜に小孔を開けることにより、両眼に急性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）が誘発される。ＣＮＶ形成の程度は、ＦＡによって７及び１４日後に評価される。
コントロール群（リガンドなし＝低レベルのαＶＥＧＦ発現）の動物は、ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦを注入した眼において、反対側の緩衝液を注入した眼と似た程度のＣＮＶ形成を示すと予想される。対照的に、実験群（リガンドあり＝高レベルのαＶＥＧＦ発現）の動物は、ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦを注入した眼において、反対側の緩衝液注入眼と比較し、ＣＮＶ形成の有意な減少を示すと予想される。これは、ｒＡＡＶを介したＶＥＧＦ阻害剤の過剰発現がＣＮＶ形成を防ぐために効果的な方法であること、及びＶＥＧＦ阻害剤の発現レベルを活性化リガンドの補充により調節（即ち増加）でき、ＣＮＶ形成の減少を導くことを示すのに役立つだろう。その後、生化学分析のための眼の収集を可能にするために全ての動物を安楽死させ、治療済み（リガンドあり）の眼及びコントロール（リガンドなし）の眼内のαＶＥＧＦ蛋白質レベルの直接定量が可能となる。
実施例４：ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ． αＶＥＧＦベクターを使用したＡＭＤの治療
ＡＭＤはゆっくりと進行する性質があるため、初期診断から重度の視覚障害の発症までの間に介入する治療可能時間域が存在する。診断後、患者は生理学的に適切なバッファーに懸濁したｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦベクターの硝子体内注射を１回受け得る。ＡＭＤ患者の現在の治療パラダイムでは、毎月又は隔月の抗ＶＥＧＦ蛋白質の硝子体内注射を伴う。従って、ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦの単回投与は、侵襲性が大幅に低い代替治療法となり得る。現在、抗ＶＥＧＦ蛋白質の硝子体内注射は、外来患者処置として局所麻酔下で行われている。これは、ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦベクターの硝子体内投与にも当てはまると予想される。ｒＡＡＶ．ＳＬＡＭ．Ｆ２αベクターを網膜内層の細胞に組み込むには、４〜８週間かかり得る。この間、患者は従来の抗ＶＥＧＦ療法を受け続けることができる。ＳＬＩＭ技術はオン型スイッチであり、そのため抗ＶＥＧＦ蛋白質は、活性化リガンドが提供されるまで患者の眼で発現しない。患者の眼における抗ＶＥＧＦ蛋白質の発現レベルは、活性化リガンド（例えば、錠剤）の経口投与により制御される。ＳＬＩＭ技術は用量依存的であるため、患者／医師は眼内の抗ＶＥＧＦ発現レベルを正確に調節できる。この手順の一部として標的とされる網膜細胞は分裂しない。結果として、その細胞へのベクターの組み込み後、ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦベクターは患者の生涯を通じて持続すると予想される。従って、抗ＶＥＧＦ発現は、活性化リガンドの投与により患者の生涯を通じていつでも誘導され得、反復的な眼内注射の必要性をなくす。
実施例５：ＡＭＤを治療するためのＡＡＶリボスイッチ
ＡＭＤを治療するための現在の治療方法論は、血管新生促進機能を阻害するための、ＶＥＧＦ−Ａ蛋白質に対する可溶性受容体又は中和抗体の投与にフォーカスされている。アイリーア（アフリベルセプト）は、２０１１年にウェットＡＭＤの治療のために食品医薬品局によって認可された組換え融合ＶＥＧＦトラップであり、ウェットＡＭＤの患者のＣＮＶの治療に非常に効果的であることがわかっている。このアプローチはＣＮＶ形成の防止に大部分は成功したが、患者の生涯を通じて抗ＶＥＧＦ剤の毎月の高用量硝子体内注射を必要とし、実質的な金銭的及び経済的負担をもたらす。さらに、アイリーアとルセンティスの両方の複数年にわたる連続的なボーラス投与は、網膜及び脈絡膜の萎縮の速度を加速することが示されている。患者はまた、眼内炎や白内障の形成のような注射関連の合併症のリスクが高くなる。本実施例では、我々の研究室で開発されたいくつかの技術を組み合わせて、単回硝子体内投与後のウェットＡＭＤを治療するための誘導性ｒＡＡＶベースの遺伝子治療アプローチを構築する。
アイリーアのｒＡＡＶを介した過剰発現が、ブルッフ膜のレーザー損傷後のＣＮＶ形成を防止できるかどうかを評価した。テトラサイクリン応答性リボスイッチリボスイッチ（１ｘＴＣ４５）を発現カセットの３’−ＵＴＲに組み込むことにより、アイリーアの眼内濃度の調節が、観察されたＣＮＶ病変の重症度の変化を導くかどうかということに対処することもできた。この目的のために、年齢を合わせたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＰＢＳ（ｎ＝１０）、１．０ｘ１０１０ｖｇのｒＡＡＶ２／２［ＭＡＸ］．ｓｍＣＢＡ−Ｅｙｌｅａ（ｎ＝１０）、又は１．０ｘ１０１０ｖｇのｒＡＡＶ２／２［ＭＡＸ］．ｓｍＣＢＡ−Ｅｙｌｅａ−１ｘ−ＴＣ４５（ｎ＝２０）のいずれかを片側注射した。注射直後に、ｒＡＡＶ２／２［ＭＡＸ］．ｓｍＣＢＡ−Ｅｙｌｅａ−１ｘ−ＴＣ４５を注射したマウスの半分（ｎ＝１０）に、５０ｍｇ／ｇテトラサイクリンを含む飼料を与えた。注射の６週間後、ＣＮＶの形成を、赤外線レーザーダイオードを使用してブルッフ膜を破ることによって開始した（方法を参照）。レーザー損傷の７日後、ｃＳＬＯイメージングを使用したフルオレセインアンジオグラフィーにより、血管新生病変のサイズと漏出を評価した。アイリーアを遍在的に発現するマウスの大部分（ｓｍＣＢＡ−Ｅｙｌｅａ）は、レーザー損傷の部位で病変を発症しなかったか、もしくは５分経過後でも最小限のフルオレセインを漏出させる小さなグレード１又は２Ａタイプの病変が発症した。（図１４Ａ〜Ｃ）。オフ型ｓｍＣＢＡ−Ｅｙｌｅａ−１ｘ−ＴＣ４５ベクターを注入し、通常の飼料を与えたマウスも、非誘導性アイリーアコンストラクトと比較して２Ｂ病変の数のわずかな増加が観察されたものの、主に軽微な病変のみを発症した（図１４Ｄ−Ｆ）。ＴＣ４５リボスイッチの活性化を介してアイリーア発現を低下させると、ＣＮＶ病変の重症度が大幅に増加し（図１４Ｇ〜Ｉ）、その程度はＰＢＳ偽注射マウス（図１４Ｌ〜Ｊ）と類似した。
病変画像は、Ｋｒｚｙｓｔｏｌｉｋらのグレーディングシステムを使用し、盲検化された３人の科学者によって分類分けした（詳細は方法を参照）。重要なことに、グレードの分布は各治療群で有意に異なっていた。偽注射を受けたマウスは、臨床的に重大な「グレード２Ｂ」病変の発生率が最も高く、アイリーアを遍在的に過剰発現するマウス（ｓｍＣＢＡ−Ｅｙｌｅａ）は、「グレード２Ｂ」病変の発生率が最も低かった。
特に、ＴＣ４５リボスイッチの活性化によるアイリー発現のダウンレギュレーションは、標準飼料を与えられたｒＡＡＶ２［ＭＡＸ］．ｓｍＣＢＡ−Ｅｙｌｅａ−１ｘ−ＴＣ４５注入マウスと比較し、「グレード２Ｂ」病変の発生率を大幅に増加させた（図１５Ａ）。最後に、アイリーア特異的ＥＬＩＳＡ（イーグルバイオサイエンス）を使用し、各サンプルの非複合体アイリーアのレベルを決定した。予想されたように、非誘導コンストラクト（ｓｍＣＢＡ−Ｅｙｌｅａ）を注入された眼は、最高レベルの遊離アイリーア（４３８ｎｇ／ｍＬ）を含んでいた。さらに、調整可能なコンストラクトを含むベクターを注射した動物では、高レベルの遊離アイリーア（３９５ｎｇ／ｍＬ）が検出されたが、非誘導性コンストラクトを注射した動物よりもレベルは低かった。重要なことに、ＴＣ４５リボスイッチのテトラサイクリンを介した活性化は、非複合体アイリーアの有意な１．７５倍の減少をもたらした（ｐ＜０．０５）（図１５Ｂ）。遊離アイリーアのレベルは、臨床的に重大な病変の発生と強く相関していた。
実施例６：ヒトにおけるＡＭＤ治療のためのｍｉＲＮＡを不活性化する自己標的リガンド
ＳＬＩＭスイッチでは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの基底領域をアプタマーに置き換える必要がある。この配列は、発現カセットの３’又は５’非翻訳領域のいずれかにクローニングされる。さらに、成熟ｍｉＲＮＡの配列に相補的なｍｉＲＮＡ標的サイトは、カセットの５’又は３’非翻訳領域のいずれかに１又は複数のコピーを含めることができる。
自己標的リガンド不活性化ｍｉＲＮＡ（ＳＬＩＭ）は、転写後レベルで遺伝子発現を制御することにより機能を切り替える。活性化リガンドが存在しない条件では、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは新生転写物からＤｒｏｓｈａによって切断される。このｍｉＲＮＡはプロセシングされ、相補的な標的サイトの結合を通じて、遺伝子サイレンシングの第２のメカニズムとして機能する。活性化リガンドが提供されると、遺伝子発現は変化しない。
各リボスイッチ（ＳＬＩＭ）の複数のコピーを、目的の遺伝子の３’非翻訳領域に含めることができる。表２に示すように、各リボスイッチは最適なコピー数を有すると考えられる。さらに、ｍｉＲＮＡ標的サイトの複数のコピーを３’又は５’非翻訳領域に含めることができる。
ＡＭＤはゆっくりと進行する性質があるため、初期診断から重度の視覚障害の発症までの間に介入する治療可能時間域が存在する。診断後、患者は生理学的に適切なバッファーに懸濁したｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦベクターの硝子体内注射を１回受け得る。ＡＭＤ患者の現在の治療パラダイムでは、毎月又は隔月の抗ＶＥＧＦ蛋白質の硝子体内注射を伴う。従って、ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦの単回投与は、侵襲性が大幅に低い代替治療法となり得る。現在、抗ＶＥＧＦ蛋白質の硝子体内注射は、外来患者処置として局所麻酔下で行われている。これは、ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦベクターの硝子体内投与にも当てはまると予想される。この間、患者は従来の抗ＶＥＧＦ療法を受け続けることができる。ＳＬＩＭ技術はオン型スイッチであり、そのため抗ＶＥＧＦ蛋白質は、活性化リガンドが提供されるまで患者の眼で発現しない。患者の眼における抗ＶＥＧＦ蛋白質の発現レベルは、活性化リガンド（例えば、錠剤）の経口投与により制御される。ＳＬＩＭ技術は用量依存的であるため、患者／医師は眼内の抗ＶＥＧＦ発現レベルを正確に調節できる。この手順の一部として標的とされる網膜細胞は分裂しない。結果として、その細胞へのベクターの組み込み後、ｒＡＡＶ．ＳＬＩＭ．αＶＥＧＦベクターは患者の生涯を通じて持続すると予想される。従って、抗ＶＥＧＦ発現は、活性化リガンドの投与により患者の生涯を通じていつでも誘導され得、反復的な眼内注射の必要性をなくす。
リボスイッチを含むベクターによる緑内障の治療
原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）は、世界的に不可逆的な失明の２番目に多い原因であり、網膜神経節細胞の進行性喪失と視神経の萎縮によって特徴付けられ、視野障害につながる。ＰＯＡＧの主要なリスクは、房水の流出の減少に起因する眼圧の上昇（ＩＯＰ）である。緑内障のゴールドスタンダードの臨床治療は、局所薬物投与と後期疾患の手術の組み合わせによりＩＯＰを低下させることである。残念ながら、緑内障の大部分は無症候性（即ち、痛みを伴わない）であり、生涯にわたる毎日の治療計画を維持する必要があるため、薬物療法の患者のコンプライアンスは非常に低く（＜２０％）、早期に診断された患者でも重度の視力を脅かす合併症の発症につながる。
ＡＡＶリボスイッチ実験−緑内障を治療するためのモデル
プロスタグランジンアナログ（例えば、ラタノプロスト）は、角膜上皮全体に吸収され、房水に拡散する前に間質と角膜内皮を通過する際に活性型に加水分解されるエステル化プロドラッグとして臨床的に投与される。可溶性ＰＧＦ２αアナログのＰＴＧＦＲへの結合は、細胞外マトリックスのリモデリングとブドウ膜強膜房水流出の増加を促進する毛様体筋内のマトリックスメタロプロチナーゼ（ＭＭＰ）産生のアップレギュレーションを引き起こす。天然のＰＧＦ２αは、多段階プロセスにより角膜に高レベルで存在するアラカドン酸から酵素的に誘導される。
プロスタグランジンアナログ（例えば、ラタノプロスト）は、角膜上皮全体に吸収され、房水に拡散する前に間質と角膜内皮を通過する際に活性型に加水分解されるエステル化プロドラッグとして臨床的に投与される。可溶性ＰＧＦ２αアナログのＰＴＧＦＲへの結合は、細胞外マトリックスのリモデリングとブドウ膜強膜房水流出の増加を促進する毛様体筋内のマトリックスメタロプロチナーゼ（ＭＭＰ）産生のアップレギュレーションを引き起こす。天然のＰＧＦ２αは、多段階プロセスにより角膜に高レベルで存在するアラカドン酸から酵素的に誘導される。
角膜から前房へのＰＧＦ２αのデノボ生合成及び分泌は、現在のゴールドスタンダードの臨床治療アプローチを改善するＩＯＰを低下させるための効果的な戦略となることは確かである。我々はＰＧＦ２α生合成の律速酵素であるプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）及びＰＴＧＦＲの過剰発現により、３か月間でＩＯＰが有意に減少することを示した。両方の酵素のｃＤＮＡ配列（下記）を、リボスイッチを含まないか（非誘導性）、もしくは３’ＴＣ４０及び５’ＴＣ４５テトラサイクリン誘導性リボスイッチを組み込んだＡＡＶ発現コンストラクト（下記の完全配列）に組み込んだ。マウスに、ＰＢＳ（Ｎ＝１０）、ｒＡＡＶ．ｓｍＣＢＡ−ＰＴＧＦＲ．Ｐ２Ａ．ＰＴＧＦＲ（Ｎ＝１０、非誘導性）、又はｒＡＡＶ．ｓｍＣＢＡ−ＴＣ４０−ＰＴＧＦＲ．Ｐ２Ａ．ＰＴＧＦＲ−ＴＣ４５（誘導性）の前房内注射（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）を行った。ＩＯＰは、注射の前と後１２週間にリバウンド眼圧測定によって測定された。その期間、誘導性マウスの半分にテトラサイクリンを含む飼料を与えた。飼料（ＰＧＦ２ａｌｐｈａ発現オフ）を与えられたマウスは、１２週間にわたって眼圧の低下を示さなかった。通常の飼料（ＰＧＦ２ａｌｐｈａ発現オン）のマウスは、ＰＧＦ２ａｌｐｈａが恒常的に発現している場合（スイッチなし）と同様に、ＩＯＰの高度に有意な減少を示した。
配列表ステートメント
本出願は、明細書全体及び添付の配列表ステートメントに配列表を含む。完全なリストとは見なされないが、以下にいくつかの配列を列挙する。
本出願は、明細書全体及び添付の配列表ステートメントに配列表を含む。完全なリストとは見なされないが、以下にいくつかの配列を列挙する。
Ｌ２ｂｕｌｇｅ９（テオフィリンオフスイッチ）（配列番号１１）
ＣＴＣＧＡＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＴＧＴＣＣＡＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＴＴＧＧＧＣＣＣ
Ｌ２ｂｕｌｇｅ１８ｔｃ（テトラサイクリンオンスイッチ）（配列番号１２）
ＣＴＣＧＡＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＴＧＴＣＣＡＡＡＡＣＡＴＡＣＣＡＧＡＴＴＴＣＧＡＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＴＴＧＧＧＣＣＣ
Ｔｈｅｏ６ＨＤＶ（テオフィリンオフスイッチ）（配列番号１３）
ＡＴＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＣＡＴＡＣＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＧＣＴＣＴＣ
ＧｕａＭ８ＨＤＶ（グアニンオフスイッチ）（配列番号１４）
ＡＴＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＣＴＡＴＡＡＴＣＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＧＧＣＡＣＧＣＡＡＧＴＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＡＣＣＧＴＡＡＡＴＧＴＣＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＧ
Ｋ１９（テトラサイクリンオンスイッチ）（配列番号１５）
ＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＧＣＧＣＧＴＣＣＴＧＧＡＴＴＣＧＴＧＧＴＡＡＡＡＣＡＴＡＣＣＡＧＡＴＴＴＣＧＡＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＡＧＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＣＡＡＡＴＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＧＣＧＣＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＣ
ＴＣ４０（テトラサイクリンオフスイッチ）（配列番号１６）
ＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＡＡＡＴＡＧＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＣＣＴＡＧＧＣＴＣＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＡＴＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＴＡＴＣＣＡＣ
Ｔｅｔ−ＳＬＩＭ（配列番号１７）
ＣＴＡＧＣＡＣＧＧＧＴＣＣＣＴＡＡＡＡＣＡＴＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＣＧＣＣＣＣＣＡＴＴＴＴＧＡＧＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＡＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＴＡＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡＴＧＡＴＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＡＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧ
Claims (53)
- トランスジーンのｍＲＮＡを調節することにより前記トランスジーンの発現を制御するための外来核酸コンストラクトであって、前記核酸は、
（ａ）目的の標的遺伝子、
（ｂ）前記トランスジーンの非翻訳領域内に位置する少なくとも１つのｓｍｉＲＮＡスイッチであって、リガンドに結合できるアプタマードメイン及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含む、少なくとも１つのｓｍｉＲＮＡスイッチ、
（ｃ）前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部に相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列、
をコードし、
前記少なくとも１つのｓｍｉＲＮＡスイッチは、（１）前記トランスジーンのｍＲＮＡの切断の制御、及び（２）前記ｓｍｉＲＮＡからの前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの切断の制御、の両方によって前記トランスジーンの発現を制御し、
前記切断されたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列に結合し、前記トランスジーンの発現をサイレンシングする、
コンストラクト。 - リガンドの非存在下で、前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは転写物から切断され、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列に結合し、
前記ｐｒｉ−ｍＲＮＡの一部の前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列への結合は、前記トランスジーンをサイレンシングする、請求項１に記載のコンストラクト。 - 前記リガンドの前記アプタマードメインへの結合は、前記ｓｍｉＲＮＡの構造を変化させ、前記構造変化は、前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが前記転写物から切断される能力を阻害し、ここで前記トランスジーンは翻訳可能である、請求項１又は２に記載のコンストラクト。
- 前記ｓｍｉＲＮＡスイッチは、配列番号１の核酸配列によってコードされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列は、核酸配列ＧＡＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＴＡＴＡＡＡＡ（配列番号１０）によってコードされる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトは、３つのｍｉＲＮＡ標的配列をコードし、少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的配列は配列番号２によってコードされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトは、配列番号２１〜３５及び３７〜５１からなる群から選択される１つ以上のｓｍｉＲＮＡスイッチを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記ｓｍｉＲＮＡは３’ＵＴＲ内に位置し、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列は５’ＵＴＲ内に位置する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトは、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記（ｃ）のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部に相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列は、切断されたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部が結合する前記コンストラクト内の前記トランスジーンの一部である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記トランスジーンは、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記ＶＥＧＦ阻害剤は、アフリベルセプトであり、配列番号８によりコードされる、請求項１１に記載のコンストラクト。
- 前記ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号３６によりコードされるｓＦＬＴ１である、請求項１１に記載のコンストラクト。
- 前記アプタマーは、血液網膜関門を通過できるリガンドに結合する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記リガンドは、テトラサイクリン、テオフィリン、グアニン、ガラクチトール、プロゲステロン、マンニトール、エストラジオール、ドーパミン、キニジン、尿素、ジゴキシン、ウラシル、ベラパミル、チオ尿素、ミキシフラキサシン（ｍｉｘｉｆｌａｘａｃｉｎ）、チミン、レボフロキシン、コルチコステロン、アセタゾラミド、テストステロン、ドキシサイクリン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載のコンストラクト。
- 前記リガンドは、テトラサイクリン、テオフィリン、及びグアニンからなる群より選択される、請求項１２又は１３に記載のコンストラクト。
- 前記トランスジーンは、プロスタグランジン合成に関与する遺伝子を含む、請求項１に記載のコンストラクト。
- 前記トランスジーンは、配列番号５２によりコードされるプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）を含む、請求項１７に記載のコンストラクト。
- 配列番号５３によりコードされるＰＴＧＦＲをさらに含む、請求項１８に記載のコンストラクト。
- 配列番号５４をさらに含む、請求項１７又は１８に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトは、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記配列は、配列番号８１である、請求項２１記載のコンストラクト。
- それを必要とする対象において加齢黄斑変性の少なくとも１つの症状を軽減する方法であって、
（ａ）下記（ｉ）、（ｉｉ）をコードする外来核酸コンストラクトを対象の眼に投与する工程、及び
（ｉ）抗ＶＥＧ阻害剤、
（ｉｉ）非翻訳領域内にあるｓｍｉＲＮＡスイッチであって、リガンドに結合できるアプタマードメイン及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含むリボスイッチを含む、ｓｍｉＲＮＡスイッチ、
（ｂ）前記抗ＶＥＧＦ阻害剤の発現を制御し、加齢黄斑変性の少なくとも１つの症状を軽減するために、治療有効量の前記リガンドを対象に投与する工程、
を含む、方法。 - 前記コンストラクトは、アデノ随伴ウィルスベクターである、請求項２３に記載の方法。
- 前記トランスジーンは、アフリベルセプトである、請求項２３又は２４に記載の方法。
- 前記リガンドは、血液網膜関門を通過できる、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記リガンドは、テトラサイクリン、テオフィリン、グアニン、ガラクチトール、プロゲステロン、マンニトール、エストラジオール、ドーパミン、キニジン、尿素、ジゴキシン、ウラシル、ベラパミル、チオ尿素、ミキシフルキサシン（ｍｉｘｉｆｌｘａｃｉｎ）、チミン、レボフロキシン、コルチコステロン、アセタゾラミド、テストステロン、ドキシサイクリン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
- 前記コンストラクトは、配列番号２１〜３５及び３７〜５１からなる群より選択される１つ以上のＳＬＩＭを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記コンストラクトは、前房内注射により眼へ投与される、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記リガンドは、経口投与又は点眼により投与される、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記外来核酸コンストラクトは、非翻訳領域内に１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
- それを必要とする対象において緑内障の少なくとも１つの症状を軽減する方法であって、
（ａ）下記（ｉ）、（ｉｉ）をコードする外来核酸コンストラクトを対象の眼に投与する工程、
（ｉ）プロスタグランジン２アルファ合成を制御するトランスジーン、
（ｉｉ）前記トランスジーンの非翻訳領域内にあるｓｍｉＲＮＡスイッチであって、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに隣接する少なくとも２つのリボスイッチを含み、各リボスイッチは、発現プラットフォームに作動可能に連結されたアプタマーを含む、ｓｍｉＲＮＡスイッチ、
ここで、前記トランスジーンは前記対象の細胞に組み込まれ、前記トランスジーンを発現する、及び
（ｂ）眼内のトランスジーンの発現を制御するために、アプタマーに結合できるリガンドの治療有効量を投与する工程、
を含む、方法。 - 前記少なくとも１つの症状は、前記対象の眼内の眼圧の低下である、請求項３２に記載の方法。
- 前記コンストラクトは、眼への前房内注射により投与される、請求項３２又は３３に記載の方法。
- 前記リガンドは、血液網膜関門を通過できる、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記リガンドは、テトラサイクリン、テオフィリン、グアニン、ガラクチトール、プロゲステロン、マンニトール、エストラジオール、ドーパミン、キニジン、尿素、ジゴキシン、ウラシル、ベラパミル、チオ尿素、ミキシフルキサシン、チミン、レボフロキシン、コルチコステロン、アセタゾラミド、テストステロン、ドキシサイクリン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
- 前記外来核酸コンストラクトは、（ｉｉｉ）ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部に相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含む、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ｓｍｉＲＮＡスイッチは、ＴＣ４０（配列番号５９）、ＴＣ４５（配列番号６３）、又は両方のｓｍｉＲＮＡスイッチの組み合わせを含む、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
- トランスジーンのｍＲＮＡを調節することにより前記トランスジーンの発現を制御するための外来核酸コンストラクトであって、前記核酸は、
（ａ）目的の標的遺伝子、
（ｂ）前記トランスジーンの非翻訳領域内に位置するｓｍｉＲＮＡスイッチであって、リガンドに結合できるアプタマードメイン及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含む、ｓｍｉＲＮＡスイッチ、
を含み、
前記ｓｍｉＲＮＡスイッチは、（１）前記トランスジーンのｍＲＮＡの切断の制御、及び（２）前記ｓｍｉＲＮＡからのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの切断の制御の両方によって、トランスジーンの発現を制御し、
前記切断されたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部は、ｍｉＲＮＡ標的配列としてトランスジーンの一部に結合し、前記トランスジーンの発現をサイレンシングする、
コンストラクト。 - リガンドの非存在下で、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは転写物から切断され、前記ｍｉＲＮＡ標的配列に結合し、
ｐｒｉ−ｍＲＮＡの一部の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列への結合は、前記トランスジーンをサイレンシングする、請求項３９に記載のコンストラクト。 - 前記リガンドの前記アプタマードメインへの結合は、前記ｓｍｉＲＮＡの構造を変化させ、前記構造変化は、前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが前記転写物から切断される能力を阻害し、ここで前記トランスジーンは翻訳可能である、請求項３９又は４０に記載のコンストラクト。
- 前記ｓｍｉＲＮＡスイッチは、配列番号２１〜３５及び３７〜５１からなる群より選択される核酸配列によりコードされる、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- ｓｍｉＲＮＡは３’ＵＴＲ内に位置し、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列は５’ＵＴＲ内に位置する、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含む、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記トランスジーンは、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記ＶＥＧＦ阻害剤は、アフリベルセプトであり、配列番号８によりコードされる、請求項４５に記載のコンストラクト。
- 前記ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号３６によりコードされるｓＦＬＴ１である、請求項４５に記載のコンストラクト。
- 前記アプタマーは、血液網膜関門を通過できるリガンドに結合する、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記リガンドは、テトラサイクリン、テオフィリン、グアニン、ガラクチトール、プロゲステロン、マンニトール、エストラジオール、ドーパミン、キニジン、尿素、ジゴキシン、ウラシル、ベラパミル、チオ尿素、ミキシフラキサシン（ｍｉｘｉｆｌａｘａｃｉｎ）、チミン、レボフロキシン、コルチコステロン、アセタゾラミド、テストステロン、ドキシサイクリン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４８に記載のコンストラクト。
- 前記リガンドは、テトラサイクリン、テオフィリン、及びグアニンからなる群から選択される、請求項４９のコンストラクト。
- 前記トランスジーンは、プロスタグランジン合成に関与する遺伝子を含む、請求項３９記載のコンストラクト。
- 前記トランスジーンは、配列番号５２によりコードされるプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、及び配列番号５３によりコードされるＰＴＧＦＲを含む、請求項５１記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトは、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３９〜５２のいずれか１項に記載のコンストラクト。
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