JP7420710B2 - 組換えａａｖ９由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含む、対象の錐体視細胞において目的のポリヌクレオチドを発現させる方法 - Google Patents
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Description
本発明は、組換えAAV9由来ベクター及びその適用、特に、組換えAAV9由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含む、対象の錐体視細胞において目的のポリヌクレオチドを発現させる方法に関する。
中心窩(黄斑の中心にある)は、高い色視力を提供することにより霊長類の視覚的知覚を支配する網膜の特殊な領域である(1)。最も高い錐体の密度は、中心窩の中心(中心窩の中心から0.3mm未満)に見出され、そこに桿体視細胞は無い(2)。錐体の密度は、中心窩から離れるにつれて100分の1にまで減少する(3)。中心窩の錐体細胞は、中期網膜色素変性症(4、5)や色覚異常(6)等の遺伝性網膜疾患の治療を目的とした遺伝子治療の主な標的となる。現在、治療用タンパク質をコードするウイルスベクターは、錐体への遺伝子送達を提供するために、視細胞と網膜色素上皮(RPE)細胞の間の網膜下腔に注入される必要がある。このアプローチにおいて、従来のAAV(すなわちAAV2)による遺伝子送達は、注入された液体の局所的な「小疱(bleb)」と接触する細胞に限定される。更に、網膜変性を伴う眼においては、網膜下注入中に生じる網膜剥離が懸念となる。レーバー先天性黒内障の患者に健康なRPE65遺伝子を送達するためにアデノ随伴ウイルス(AAV)の網膜下送達を使用した最初の臨床試験(7～9)は、ウイルスベクターを送達するための黄斑の剥離にもかかわらず、視力にいくらかの改善を導いている(10、11)。しかしながら、中心窩下注入の場合、いくつかの症例では、黄斑円孔と、黄斑の薄層化の増加によって治療が複雑化した(11)。更に、周辺領域とは異なり、中心窩においては治療効果が無かった(12)。AAVを用いた遺伝子治療は、脈絡膜血症の患者に対しても、黄斑を遺伝子送達の標的として試験された(13)。この後者の試験の6か月間のフォローアップ結果は、これまでのところ、中心窩下網膜剥離がこの領域の視力低下を引き起こさないことを示唆しているが、この試験の患者の1人は、未治療の眼と比較して、治療された眼の視力が低下していた(13)。臨床段階の適用に到達する遺伝子治療が増えるにつれ、この壊れやすい領域を剥離させることなく、中心窩に遺伝子治療を送達するための新たな方法を見つける必要性が高まっている(14)。これは、中心窩領域に到達するように横方向に広がるベクターを使用した周辺への網膜下注入により達成されうる。
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本発明は、組換えAAV9由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含む、対象の錐体視細胞において目的のポリヌクレオチドを発現させる方法を含む、組換えAAV9由来ベクター及びその適用に関する。特に本発明は、特許請求の範囲により規定される。
第1の側面において、本発明は、錐体視細胞に影響を及ぼす網膜疾患の治療における使用のための以下を含む組換えAAV9由来ベクターに関する:
- 対応する野生型AAV9キャプシドタンパク質に対し、7～11アミノ酸長のペプチドがキャプシドタンパク質のGHループに挿入されているVP1キャプシドタンパク質であって、前記ペプチドが配列番号1から配列番号8のいずれか1つを含む、VP1キャプシドタンパク質;及び
- 配列番号12に記載のpR1.7プロモーター又は前記プロモーターの機能的バリアントの制御下にある目的のポリヌクレオチド。
- 対応する野生型AAV9キャプシドタンパク質に対し、7～11アミノ酸長のペプチドがキャプシドタンパク質のGHループに挿入されているVP1キャプシドタンパク質であって、前記ペプチドが配列番号1から配列番号8のいずれか1つを含む、VP1キャプシドタンパク質;及び
- 配列番号12に記載のpR1.7プロモーター又は前記プロモーターの機能的バリアントの制御下にある目的のポリヌクレオチド。
好ましくは、ペプチドは、配列番号10に記載の野生型AAV9キャプシドタンパク質に対し、アミノ酸588と589の間でGHループに挿入されている。
好ましくは、ペプチドは、配列番号9を含むか、又はそれから成る。
好ましくは、組換えAAV9由来ベクターは、配列番号11に記載のVP1キャプシドタンパク質及び配列番号12に記載のpR1.7プロモーターの制御下にある目的のポリヌクレオチドを含む。
好ましくは、組換えAAV9由来ベクターにより治療される対象は、加齢性黄斑変性症、バッセン-コルツヴァイク症候群、脈絡膜血症、旋回性萎縮、レフサム症候群、アッシャー症候群、色盲、青色錐体単色症、色覚異常、不完全色覚異常、乏錐体三色性、網膜色素変性症(RP)、黄斑変性症、スターガルト病、バルデット-ビードル症候群、ボーンホルム眼病、ベスト病、及びレーバー先天性黒内障から成る群から選択される網膜疾患に罹患している。
好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、遺伝子補充療法において使用されうる遺伝子であり、好ましくは、網膜色素変性症GTPaseレギュレーター(RPGRORF15)、CNGB3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのベータサブユニット)、CNGA3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのアルファサブユニット)又はGNAT2をコードする遺伝子から選択される。
好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、神経栄養因子をコードする。より好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、RdCVF、RdCVF2、RdCVFL又はRdCVFL2をコードする。
好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、ロドプシン、フォトプシン、L/M波長(赤/緑)錐体オプシン、又は短波長(S)錐体オプシン(青)といったオプシンをコードする。より好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、配列番号13、配列番号14又は配列番号15に記載のアミノ酸配列から成るオプシンをコードする。
好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びCRISPR関連エンドヌクレアーゼから成る群から選択される遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする。より好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、Cas9ヌクレアーゼをコードする。
好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、干渉性RNA(RNAi)、特にsiRNA又はshRNAをコードする。
好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする。
好ましくは、治療は、組換えAAV9由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含む。
好ましくは、網膜下送達は、中心窩から距離をおいて、前記領域を剥離させることなく行われる。
別の側面では、本発明は、以下を含む組換えAAV9由来ベクターに関する:
- 対応する野生型AAV9キャプシドタンパク質に対し、7～11アミノ酸長のペプチドがキャプシドタンパク質のGHループに挿入されているVP1キャプシドタンパク質であって、前記ペプチドが配列番号1から配列番号8のいずれか1つを含む、VP1キャプシドタンパク質;及び
- 配列番号12に記載のpR1.7プロモーター又は前記プロモーターの機能的バリアントの制御下にある目的のポリヌクレオチド。
- 対応する野生型AAV9キャプシドタンパク質に対し、7～11アミノ酸長のペプチドがキャプシドタンパク質のGHループに挿入されているVP1キャプシドタンパク質であって、前記ペプチドが配列番号1から配列番号8のいずれか1つを含む、VP1キャプシドタンパク質;及び
- 配列番号12に記載のpR1.7プロモーター又は前記プロモーターの機能的バリアントの制御下にある目的のポリヌクレオチド。
好ましくは、ペプチドは、上記の通りである。
好ましくは、組換えAAV9由来ベクターは、配列番号11に記載のVP1キャプシドタンパク質及び配列番号12に記載のpR1.7プロモーターの制御下にある目的のポリヌクレオチドを含む。
好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、上記の通りである。
別の側面において、本発明は、組換えAAV9由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含む、対象の錐体視細胞において目的のポリヌクレオチドを発現させる方法に関する。
解剖学的に独特な霊長類の眼の網膜下腔環境内における、AAV形質導入様式の理解の断絶は、臨床における中心窩錐体への非侵襲的且つ効率的な遺伝子送達の確立の妨げとなっていた。本明細書において、発明者らは、マウスモデル、ヒト人工多能性幹細胞由来オルガノイド、死後ヒト網膜外植片、及び生存マカクにおけるサポート的研究により、中心窩におけるAAV媒介錐体形質導入に関連する制限を克服する、いくつかの新たなベクターとプロモーターの組み合わせを確立する。それらは、AAV9バリアントが、中心窩から数ミリメートル離れた網膜下腔に注入されると、この繊細な領域を剥離させることなく、効率的な中心窩錐体形質導入を提供することを示している。この送達モダリティは、錐体特異的プロモーターに依存し、光遺伝学的視力回復に適合した高レベルの導入遺伝子発現をもたらす。
したがって、本発明の第1の目的は、以下を含む組換えAAV9由来ベクターに関する:
- 対応する野生型AAV9キャプシドタンパク質に対し、7～11アミノ酸長のペプチドがキャプシドタンパク質のGHループに挿入されているVP1キャプシドタンパク質であって、前記ペプチドが配列番号1から配列番号8のいずれか1つを含む、VP1キャプシドタンパク質;及び
- 配列番号12に記載のpR1.7プロモーター又は前記プロモーターの機能的バリアントの制御下にある目的のポリヌクレオチド。
- 対応する野生型AAV9キャプシドタンパク質に対し、7～11アミノ酸長のペプチドがキャプシドタンパク質のGHループに挿入されているVP1キャプシドタンパク質であって、前記ペプチドが配列番号1から配列番号8のいずれか1つを含む、VP1キャプシドタンパク質;及び
- 配列番号12に記載のpR1.7プロモーター又は前記プロモーターの機能的バリアントの制御下にある目的のポリヌクレオチド。
特に、組換えAAV9由来ベクターは、配列番号11に記載のVP1キャプシドタンパク質及び配列番号12に記載のpR1.7プロモーターの制御下にある目的のポリヌクレオチドを含みうる。
本発明の別の目的は、本発明に従う組換えAAV9由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含む、対象の錐体視細胞において目的のポリヌクレオチドを発現させる方法に関する。
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、典型的にはヒトが意図される。典型的には、対象は、錐体視細胞に影響を与える網膜疾患に罹患しているか、又は罹患する可能性が高い。このような網膜疾患は、錐体視細胞に直接的又は間接的に影響を与えうる。したがって、網膜錐体視細胞に影響を与える多種多様な網膜疾患は、本明細書に提供される教示があれば、かように治療可能であり、典型的には、加齢性黄斑変性症、バッセン-コルツヴァイク症候群、脈絡膜血症、旋回性萎縮、レフサム症候群、アッシャー症候群、色盲、青色錐体単色症、色覚異常、不完全色覚異常、乏錐体三色性、網膜色素変性症(RP)、黄斑変性症、スターガルト病、バルデット-ビードル症候群、ボーンホルム眼病、ベスト病、及びレーバー先天性黒内障を含む。
したがって、本発明の更なる目的は、本発明に従う組換えAAV9由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含む、治療を必要とする対象の錐体視細胞に影響を及ぼす網膜疾患を治療する方法を提供することである。この側面において、特に配列番号12に記載のpR1.7プロモーターの制御下にある目的のポリヌクレオチドは、錐体視細胞で発現させた場合、網膜疾患に対して有益な効果を及ぼし、特に前記疾患を治療することができる。
本発明はまた、錐体視細胞に影響を及ぼす網膜疾患の治療において使用するための、本発明に従う組換えAAV9由来ベクターにも関する。特に、本発明は、錐体視細胞に影響を与える網膜疾患の治療のための医薬を調製するための、前記組換えAAV9由来ベクターの使用に関する。上記で説明したように、好ましくは、治療は、組換えAAV9由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含み、目的のポリヌクレオチドは、網膜疾患を治療することができる。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療する」という用語は、疾患にかかるリスクのある、又は疾患に罹患した疑いのある患者、並びに、病気であるか、又は疾患若しくは医学的状態に罹患していると診断された患者の治療を含む、予防的若しくは防止的治療並びに治癒的若しくは疾患修飾的治療の両方を指し、臨床的再発の抑制も含む。治療は、疾患又は再発性疾患の1つ以上の症状を予防、治癒、発症を遅らせる、重症度を軽減する、又は改善するために、医学的疾患を有する対象又は最終的に疾患を獲得しうる対象に施されうる。「治療レジメン」とは、病気の治療のパターン、例えば治療中に使用される投与のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含みうる。「導入レジメン」又は「導入期間」という語句は、疾患の初期治療に使用される治療レジメン(又は治療レジメンの一部)を指す。導入レジメンの一般的な目標は、治療レジメンの最初の期間中に患者に高レベルの薬剤を供給することである。導入レジメンは(一部又は全体で)「負荷レジメン」を使用することができ、これは、維持レジメン中に医師が使用するよりも多い用量の薬物を投与すること、維持レジメン中に医師が薬剤を投与するよりも頻繁に薬剤を投与すること、又はその両方を含みうる。「維持レジメン」又は「維持期間」という語句は、例えば、患者を寛解状態に長期間(数か月又は数年)保つために、病気の治療中の患者の維持のために使用される治療レジメン(又は治療レジメンの一部)を指す。維持レジメンは、継続的治療(例えば、一定の間隔、例えば、毎週、毎月、毎年等で薬剤を投与すること)又は断続的治療(例えば、中断された治療、断続的な治療、再発時の治療、又は特定の所定の基準[例えば、疾患の症状等]の達成時の治療)を使用してもよい。
本明細書で使用される場合、「錐体視細胞」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、哺乳動物の眼の網膜における3つの型の光受容体細胞のうちの1つである。それらは色覚を担っており、薄明かりの下でより良く働く桿体細胞とは対照的に、比較的明るい光の中で最もよく機能する。特定のベクターとpR1.7プロモーター(又は前記プロモーターの機能的バリアント)との組み合わせは、錐体視細胞における目的のポリヌクレオチドの発現を特別に駆動する。
本明細書で使用される場合、「網膜下送達」という用語は、光受容体細胞と網膜色素上皮細胞との間の網膜内の位置を指す網膜下腔へのベクターの投与を指す。網膜下送達は「小疱」の形成を導き、これは、眼の網膜下腔内の液体で満たされた小袋を指す。本発明の小疱は、単一の空間内への流体の単一回の注入、同じ空間への1つ以上の流体の複数回の注入、又は複数の空間への複数回の注入によって作られてもよく、位置を変えると、網膜下腔の所望の部分に対して治療効果を達成するのに有用な全体的流体空間が創出される。
本発明によれば、網膜下送達は中心窩から距離をおいて行われ、これは、この繊細な領域を剥離させることなく、中心窩の中心から0.5ミリメートル以上離れて小疱が形成されることを意味する。本明細書で使用される場合、「中心窩」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、錐体視細胞のみを含み、網膜全体で錐体の密度が最も高い、直径が約0.5mm以下の霊長類の網膜中心部の小さな領域を指す。
本明細書で使用される場合、本明細書中の「目的のポリヌクレオチド」という用語は、任意の種類の理由から、その発現が標的細胞において望まれる任意のポリペプチド、構造タンパク質、酵素等をコードする任意のヌクレオチド配列を意味する。それはまた、非コード配列、例えばアンチセンス配列又は遺伝子の発現を減少させることを目的とする干渉性RNAの配列も意味しうる。当業者は、その分野の科学文献の知識により、特定の網膜疾患を治療するためにより適切でありうるポリヌクレオチドがどれであるかを理解している。
遺伝子治療は、錐体視細胞に、そこにおいて欠損している目的のポリヌクレオチド(例えば遺伝子)の機能的コピーを導入することにより(遺伝子補充療法)、又は治療される眼疾患に対して有益な効果を有する目的のポリヌクレオチドを錐体視細胞に送達することにより(対症療法)行われうる。言い換えれば、目的のポリヌクレオチドは、錐体視細胞に影響を及ぼす網膜疾患を治療できることが好ましい。遺伝子補充療法に使用されうる目的のポリヌクレオチドの例は、網膜色素変性GTPaseレギュレーター(RPGRORF15)(参考文献:1. B. S. Pawlyk、O. V. Bulgakov、X. Sun、M. Adamian、X. Shu、A. J. Smith、E. L. Berson、R. R. Ali、S. Khani、A. F. Wright、M. A. Sandberg、T. Li、Photoreceptor rescue by an abbreviated human RPGR gene in a murine model of X-linked retinitis pigmentosa. Gene Ther 23、196～204頁(2016年).; 2. D. H. Hong、B. S. Pawlyk、M. Adamian、M. A. Sandberg、T. Li、A single, abbreviated RPGR-ORF15 variant reconstitutes RPGR function in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci 46、435～441頁(2005年).; 3. W. A. Beltran、A. V. Cideciyan、A. S. Lewin、W. W. Hauswirth、S. G. Jacobson、G. D. Aguirre、Gene augmentation for X-linked retinitis pigmentosa caused by mutations in RPGR. Cold Spring Harbor perspectives in medicine 5、a017392 (2014年).; 4. W. T. Deng、F. M. Dyka、A. Dinculescu、J. Li、P. Zhu、V. A. C
hiodo、S. L. Boye、T. J. Conlon、K. Erger、T. Cossette、W. W. Hauswirth、Stability and Safety of an AAV Vector for Treating RPGR-ORF15 X-Linked Retinitis Pigmentosa. Hum Gene Ther 26、593～602頁(2015年). 5. Z. Wu、S. Hiriyanna、H. Qian、S. Mookherjee、M. M. Campos、C. Gao、R. Fariss、P. A. Sieving、T. Li、P. Colosi、A. Swaroop、A long-term efficacy study of gene replacement therapy for RPGR-associated retinal degeneration. Hum Mol Genet 24、3956～3970頁(2015年).; 6. W. A. Beltran、A. V. Cideciyan、A. S. Lewin、S. Iwabe、H. Khanna、A. Sumaroka、V. A. Chiodo、D. S. Fajardo、A. J. Roman、W.-T. Deng、M. Swider、T. S. Aleman、S. L. Boye、S. Genini、A. Swaroop、W. W. Hauswirth、S. G. Jacobson、G. D. Aguirre、in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2012年)、vol. 109、2132～2137頁)、CNGB3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのベータサブユニット)(例えば、Kohlら(2005年) Eur J Hum Genet. 13(3):302頁を参照)、GNAT2(トランスデューシンの錐体特異的アルファサブユニット)及びCNGA3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのアルファサブユニット)(例えば、GenBankアクセッションNo. NP_001289;及びBooijら(2011年) Ophthalmology 118: 160～167頁を参照)等の、錐体視細胞において特異的又は優先的に発現される遺伝子である。
hiodo、S. L. Boye、T. J. Conlon、K. Erger、T. Cossette、W. W. Hauswirth、Stability and Safety of an AAV Vector for Treating RPGR-ORF15 X-Linked Retinitis Pigmentosa. Hum Gene Ther 26、593～602頁(2015年). 5. Z. Wu、S. Hiriyanna、H. Qian、S. Mookherjee、M. M. Campos、C. Gao、R. Fariss、P. A. Sieving、T. Li、P. Colosi、A. Swaroop、A long-term efficacy study of gene replacement therapy for RPGR-associated retinal degeneration. Hum Mol Genet 24、3956～3970頁(2015年).; 6. W. A. Beltran、A. V. Cideciyan、A. S. Lewin、S. Iwabe、H. Khanna、A. Sumaroka、V. A. Chiodo、D. S. Fajardo、A. J. Roman、W.-T. Deng、M. Swider、T. S. Aleman、S. L. Boye、S. Genini、A. Swaroop、W. W. Hauswirth、S. G. Jacobson、G. D. Aguirre、in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2012年)、vol. 109、2132～2137頁)、CNGB3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのベータサブユニット)(例えば、Kohlら(2005年) Eur J Hum Genet. 13(3):302頁を参照)、GNAT2(トランスデューシンの錐体特異的アルファサブユニット)及びCNGA3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのアルファサブユニット)(例えば、GenBankアクセッションNo. NP_001289;及びBooijら(2011年) Ophthalmology 118: 160～167頁を参照)等の、錐体視細胞において特異的又は優先的に発現される遺伝子である。
いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、神経栄養因子をコードしうる。本明細書において使用される場合、「神経栄養因子」とは、神経細胞の生存及び維持、神経分化の促進等の生理作用を有するタンパク質の総称である。いくつかの実施形態では、神経栄養因子はRdCVFである。本明細書で使用される場合、「RdCVF」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、桿体由来の錐体生存因子を指す(Leveillard T、Mohand-Said S、Lorentz O、Hicks D、Fintz A C、Clerin Eら Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet 2004年; 36: 755～759頁)。この遺伝子は、チオールオキシドレダクターゼ活性を有すると推定される長鎖型(RdCVF-L、217アミノ酸、Q8VC33)(JEFFERY、Trends Biochem. Sci.、vol.24(l):8-l l、1999年; JEFFERY、Trends Genet.、vol.19(8) :415～417頁、2003年)と錐体に対する栄養活性を有するが酸化還元活性を持たない短鎖型(RdCVF-S、109アミノ酸、Q91W38)の両方をコードしている。いくつかの実施形態では、神経栄養因子はRdCVF2であり、これは、遺伝子構造、桿体依存的な様式での発現及びタンパク質立体構造に関してRdCVFと多くの類似点を共有している(例えば、国際公開第2008/148860号及びChalmel F、Leveillard T、Jaillard C、Lardenois A、Berdugo N、Morel E、Koehl P、Lambrou G、Holmgren A、Sahel JA、Poch O. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 2007年8月31日;8:74頁を参照)。RdCVFと同様に、RdCVF2の短いアイソフォームは、その推定チオールオキシレダクターゼ活性には依存しない錐体レスキュー活性を示す。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、RdCVFL2をコードする。
いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドの産物は、オプシンである。オプシン配列は、ヒト、藻類及び細菌を含む、任意の適切な単細胞又は多細胞生物に由来しうる。いくつかの実施形態では、オプシンは、ロドプシン、フォトプシン、L/M波長(赤/緑)錐体オプシン、又は短波長(S)錐体オプシン(青)である。いくつかの実施形態では、オプシンは、チャネルロドプシン又はハロロドプシン又はクルクハロロドプシンである。いくつかの実施形態では、オプシンは、米国特許公開第2007/0261127号(例えば、ChR2; Chop2);米国特許公開第2001/0086421号;米国特許公開第2010/0015095号;及びDiesterら(2011年) Nat. Neurosci. 14:387頁に記載されているような光応答性オプシンである。オプシンの他の例は、NpHR、eNpHR 1.0、eNpHR 2.0、eNpHR 3.0、SwiChR、SwiChR 2.0、SwiChR 3.0、Mac、Mac 3.0、Arch、ArchT、Arch 3.0、ArchT 3.0、iChR、ChR2、C1V1-T、C1V1-TT、Chronos、Chrimson、ChrimsonR、CatCh、VChR1-SFO、ChR2-SFO、ChR2-SSFO、ChEF、ChIEF、Jaws、ChloC、Slow ChloC、iC1C2、iC1C2 2.0、及びiC1C2 3.0を含む。いくつかの実施形態では、オプシンは、配列番号13又は配列番号14、又は配列番号15に記載のアミノ酸配列から成る。
いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドの産物は、例えば、エンドヌクレアーゼが網膜疾患に関連するアレルをノックアウトする、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼである。例えば、野生型の場合には網膜の構造タンパク質であり、且つ/又は正常な網膜機能を提供する遺伝子の欠陥コピーを優性アレルがコードしている場合、部位特異的エンドヌクレアーゼを欠陥アレルに誘導し、欠陥アレルをノックアウトすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、ベクターは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド;及び欠陥アレルの機能的なコピーをコードし、機能的コピーが機能的網膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。使用に適した部位特異的エンドヌクレアーゼは、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びCRISPR関連エンドヌクレアーゼを含む。本明細書で使用される場合、「CRISPR関連エンドヌクレアーゼ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、塩基配列の短い反復を含む原核生物DNAのセグメントである、クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピートを指す。当技術分野でよく知られているように、CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、小さなガイドRNA(gRNA)及び/又は相同性指向性修復(HDR)テンプレートと関連しうる。特に、本発明に従うCRISPR関連エンドヌクレアーゼは、Cas9又はその誘導体である。Cas9ヌクレアーゼは、野生型のストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)又はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)の配列、好ましくは野生型のストレプトコッカス・ピオゲネスと同一のヌクレオチド配列を有しうる。或いは、野生型のストレプトコッカス・ピオゲネス又はスタフィロコッカス・アウレウスのCas9配列は改変されうる。例えば、Cas9ヌクレアーゼ配列は、Addgene社(ケンブリッジ、マサチューセッツ州)のPX330又はPX260等の市販のベクター内に含まれる配列でありうる。いくつかの実施形態では、Cas9エンドヌクレアーゼは、Genbankアクセッション番号KM099231.1 GL669193757; KM099232.1; GL669193761; CP032481; LT996890; CP031130; CP022607; AP014942又はKM099233.1 GL669193765のCas9エンドヌクレアーゼ配列、又はPX330若しくはPX260(Addgene社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)のCas9アミノ酸配列のいずれかのバリアント又は断片であるアミノ酸配列を有しうる。Cas9ヌクレオチド配列は、Cas9の生物学的に活性なバリアントをコードするように改変可能であり、これらのバリアントは、例えば、1つ以上の変異(例えば、追加、削除、又は置換変異、又はそのような変異の組み合わせ)を含むという理由で、野生型Cas9とは異なるアミノ酸配列を有する、又は含むことができる。例えば、Cas9ヌクレアーゼは、鎖特異的切断に関与する保存されたFiNH及びRuvCドメインにおいて変異させることができる。例えば、RuvC触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの変異(D10A)は、Cas9ニッカーゼ変異体(Cas9n)がDNAを切断するのではなくニックを入れて、一本鎖の切断を生じさせることを可能とし、そして、HDRによるその後の優先的な修復は、オフターゲットの二本鎖切断による望ましくないインデル変異の頻度を潜在的に減らすことができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、1つ以上のガイドRNAを含む。本明細書で使用される場合、「1つ以上のガイドRNA」という用語は、残基の挿入又は削除をガイドするRNAを指す。本発明の文脈において、ガイドRNAは、Cas9を特定のゲノム遺伝子座に動員するために使用される。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、コード配列又は非コード配列に相補的な配列でありうる。いくつかの実施形態では、対象は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする1つのポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのベクターとガイドRNAを含む少なくとも1つのベクターの組み合わせを投与される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの産物は、干渉性RNA(RNAi)、特にsiRNAである。「低分子干渉」又は「低分子干渉性RNA」又はsiRNAは、目的の遺伝子(「標的遺伝子」)を標的とするヌクレオチドのRNA二重鎖である。「RNA二重鎖」は、RNA分子の2つの領域間の相補的対合によって形成される構造を指す。siRNAは、siRNAの二重鎖部分のヌクレオチド配列が、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で遺伝子に「標的化」される。いくつかの実施形態では、siRNAの二重鎖の長さは、30ヌクレオチド未満である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの産物は、ショートヘアピンRNA(shRNA)である。「ショートヘアピン」又はshRNAという用語は、ループ構造中にヌクレオチドを含み、siRNAにプロセシングされるRNAを指す。したがって、shRNAもまた、標的遺伝子の相補的結合に依存した配列特異的な様式で遺伝子のノックダウンをもたらす。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの産物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、プレmRNA分子、hnRNA(異種核RNA)又はmRNA分子中の標的ヌクレオチド配列に実質的に相補的であるヌクレオチド配列を指すと理解される。アンチセンス配列の相補性(又は実質的な相補性)の程度は、好ましくは、アンチセンス配列を含む分子が、生理学的条件下でRNA分子中の標的ヌクレオチド配列と安定なハイブリッドを形成できるようなものである。
本明細書において使用される場合、「AAV」という用語は、30を超える天然に存在し利用可能なアデノ随伴ウイルス、及び人工のAAVを指す。通常、本明細書に記載のAAVキャプシド、ITR、及び他の選択されるAAV成分は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8、既知又は言及されているAAVのいずれかのバリアント、又はまだ発見されていないAAV又はそのバリアント、又はそれらの混合物を限定せずに含む、任意のAAVの中から容易に選択されうる。例えば、国際公開第2005/033321号を参照。AAVの様々な血清型のゲノム配列及びタンパク質配列、並びに天然末端反復(TR)、Repタンパク質、及びVP1タンパク質を含むキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。そのような配列は、文献、又はGenBankやProtein Data Bank(PDB)等の公共データベースにおいて見出されうる。例えば、その開示がAAVの核酸及びアミノ酸配列を教示するために参照により本明細書に組み込まれるGenBank及びPDBのアクセッション番号NC_002077及び3NG9(AAV-1)、AF043303及び1LP3(AAV-2)、NC_001729(AAV-3)、U89790及び2G8G(AAV-4)、NC_006152及び3NTT(AAV-5)、3OAH(AAV6)、AF513851(AAV-7)、NC_006261及び2QA0(AAV-8)、AY530579及び3UX1(AAV-9(isolate hu.14))を参照。また、例えば、Srivistavaら(1983年) J. Virology 45:555頁; Chioriniら(1998年) J. Virology 71:6823頁; Chioriniら(1999年) J. Virology 73: 1309頁; Bantel-Schaalら(1999年) J. Virology 73:939頁; Xiaoら(1999年) J. Virology 73:3994頁; Muramatsuら(1996年) Virology 221:208頁; Shadeら(1986年) J. Virol. 58:921頁; Gaoら(2002年) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854頁; Morisら(2004年) Virology 33:375～383頁;国際公開第00/28061号、国際公開第99/61601号、国際公開第98/11244号;及び米国特許第6,156,303号及び米国特許第7,906,111号も参照。
本明細書において使用される場合、「組換えAAV9由来ベクター」又は「rAAV9由来ベクター」という用語は、AAV9起源ではない目的のポリヌクレオチド配列(すなわち、例えば、細胞に送達される導入遺伝子等の異種性配列)及び/又は、例えば、その親和性を変更するために天然のDNA又はタンパク質(Cap及び/又はRep)が改変されたものを含む、9型アデノ随伴ウイルスを指す。言い換えれば、前記rAAV9由来ベクターは、天然には存在しない。本発明の文脈において、rAAV9由来ベクターは、好ましくは網膜下注入により、ポリヌクレオチドの錐体視細胞への効率的な送達及び高レベルな発現を提供する一方で、ベクターに対する中和抗体の発生及び/又は隣接する細胞におけるオフターゲット発現等の潜在的な副作用を最小限に抑えるために、特定のプロモーターの制御下にある(異種性配列としての)上記の目的のポリヌクレオチド配列、及び改変されたAAV9 VP1キャプシドタンパク質を含む。
より具体的には、本発明に従う組換えAAV9由来ベクターは、以下を含む:
- 対応する野生型AAV9キャプシドタンパク質に対し、7～11アミノ酸長のペプチドがキャプシドタンパク質のGHループに挿入されているVP1キャプシドタンパク質であって、前記ペプチドが配列番号1から配列番号8のいずれか1つを含む、VP1キャプシドタンパク質;及び
- 配列番号12に記載のpR1.7プロモーター又は前記プロモーターの機能的バリアントの制御下にある目的のポリヌクレオチド。
- 対応する野生型AAV9キャプシドタンパク質に対し、7～11アミノ酸長のペプチドがキャプシドタンパク質のGHループに挿入されているVP1キャプシドタンパク質であって、前記ペプチドが配列番号1から配列番号8のいずれか1つを含む、VP1キャプシドタンパク質;及び
- 配列番号12に記載のpR1.7プロモーター又は前記プロモーターの機能的バリアントの制御下にある目的のポリヌクレオチド。
上記のように、長さが7～11アミノ酸であり、配列番号1から配列番号8のいずれか1つを含むペプチド(本明細書では挿入ペプチドとも呼ばれる)が、VP1キャプシドタンパク質のGHループに挿入される。これは、前記挿入ペプチドが、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸又は11アミノ酸の長さを有しうることを意味する。より具体的には、挿入ペプチドは、配列番号1から配列番号8のいずれか1つのアミノ末端及び/又はカルボキシル末端にスペーサーを有しうる。本発明に従う適切なスペーサーは、1つ以上のロイシン、アラニン、グリシン及びセリンを含むが、これらに限定はされない。例えば、本発明に従う挿入ペプチドは、好ましくは、配列番号9を含むか、又はそれから成る。より好ましくは、本発明に従う挿入ペプチドは、配列番号9から成る。挿入ペプチドの役割は、野生型AAV9に比べて、錐体視細胞へのrAAV9ベクターの感染力を高めることである。
この挿入ペプチドの存在のために、rAAV9-ベクターのVP1キャプシドタンパク質は、野生型(すなわち天然)のAAV9キャプシドタンパク質(配列番号10等)に比べて改変されていると言われる。場合により、本発明に従うVP1キャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質が、目的のポリヌクレオチドをカプセル化し、目的の標的細胞に結合し、前記細胞内に内在化して輸送する能力を保持する限り、アミノ酸欠失、アミノ酸置換又は更なるアミノ酸挿入等の、更なる修飾(すなわち変異)を含みうる。そのような変異の導入を可能にする方法は、当業者に知られている。例えば、参照のタンパク質をコードするヌクレオチド配列において、例えば、縮重プライマーを用いたPCRにより、ランダム又は定方向突然変異誘発によって変異を導入することが可能である。前記の技法は、特にSambrookらにより「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第4版、Cold Spring Harbour Laboratory Press (2012年及び2014年からの更新)において、また、Ausubelらにより「Current 25 Protocols in Molecular Biology」、John Wiley&Sons (2012年)において説明されている。
ペプチドの挿入は、前記キャプシドタンパク質のGHループ(ループIVとしても知られる)内、より詳細には、GHループの溶媒接近可能領域内で行われる(Van Vlietら(2006年) Mol. Ther. 14:809頁; Padronら(2005年) J. Virol. 79:5047頁; and Shenら(2007年) Mol. Ther. 15: 1955年)。好ましい実施形態では、前記ペプチドの挿入部位は、AAV9キャプシドタンパク質のアミノ酸570～614の間に位置する2つの隣接するアミノ酸間の単一の挿入部位である。例えば、挿入部位は、AAV9キャプシドタンパク質のアミノ酸571～612内である。より好ましくは、前記ペプチドの挿入部位は、AAV9キャプシドタンパク質のアミノ酸588と589の間に位置する。
したがって、好ましい実施形態では、上記のペプチドは、配列番号10に記載の野生型AAV9キャプシドタンパク質に対し、アミノ酸588と589の間でGHループに挿入されている。
より好ましい実施形態では、上記のペプチドは、配列番号10に記載の野生型AAV9キャプシドタンパク質のアミノ酸588と589の間でGHループに挿入されている。
更により好ましくは、配列番号1を含むペプチド、好ましくは配列番号9のペプチドは、配列番号10に記載の野生型AAV9キャプシドタンパク質のアミノ酸588と589の間でGHループに挿入されている。言い換えれば、本発明に従うrAAV9ベクターは、最も好ましくは、配列番号11に記載のVP1キャプシドタンパク質及び目的のポリヌクレオチド配列(すなわちAAVに対して異種のポリヌクレオチド)を含む。したがって、本発明の組換えAAV9由来ベクターにおいては、配列番号10に記載のAAV9の天然VP1キャプシドタンパク質が、配列番号11に記載のVP1キャプシドタンパク質によって置換されうる。
本発明の組換えAAV9由来ベクターは、典型的には5'及び3'アデノ随伴ウイルス逆位末端反復(ITR)、プロモーターpR1.7に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチド(すなわち、異種性ポリヌクレオチド)を含む。本発明の目的のために、プロモーターpR1.7に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドは、好ましくは2つのAAV ITRに隣接している。本発明のベクターは、当技術分野で公知の方法を使用して作製される。手短に言えば、本方法は一般に、(a)AAVベクターの宿主細胞への導入、(b)AAVベクターから失われたウイルス機能を含むAAVヘルパー構築物の宿主細胞への導入、そして(c)ヘルパーウイルスを宿主細胞に導入することを含む。AAVベクターの複製とAAVビリオンへのパッケージングを達成するためは、AAVビリオンの複製とパッケージングのための全ての機能が存在する必要がある。宿主細胞への導入は、標準的なウイルス学の手法を使用して、同時に又は連続的に行われうる。最後に、AAVビリオンを生成するために宿主細胞を培養し、イオジキサノールやCsCl勾配等の標準的な手法、又は他の精製方法を使用して精製する。こうして、精製されたAAVビリオンは、本方法において使用する準備が整う。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そして、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置し、DNA依存性RNAポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、及び転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、並びにプロモーターからの転写量を調節するために直接又は間接的に作用することが当業者に知られているヌクレオチドの任意の他の配列を含むがこれらに限定されない任意の他のDNA配列の存在によって構造的に同定される、1つ以上の遺伝子の転写を制御する核酸断片を指す。本明細書において使用される場合、「pR1.7プロモーター」という用語は、Hum Gene Ther. 2016年 Jan;27(1):72～82頁に記載されており、配列番号12に記載の核酸配列によって特徴付けられる1.7-kb L-オプシンプロモーターを指す。プロモーター及び目的のポリヌクレオチドは、作動可能に連結されている。本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、それらが互いに機能的な関係を持つように物理的に連結された2つ以上の核酸又はアミノ酸配列要素を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写及び/又は発現を開始又はさもなければ制御/調節することができる場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されており、その場合、コード配列はプロモーターの「制御下にある」と理解されるべきである。一般に、2つの核酸配列が作動可能に連結されている場合、それらは同じ方向にあり、通常は同じリーディングフレームにもある。通常、これらは本質的に隣接しているが、これは要求されなくともよい。
本発明は更に、目的のポリヌクレオチドがpR7.1プロモーターの機能的バリアントの制御下にある、本明細書に記載のrAAV9由来ベクターを包含する。pR7.1プロモーターの「機能的バリアント」は、通常、天然のpR7.1プロモーター(配列番号12)と比較して1つ以上のヌクレオチド変異(ヌクレオチドの削除、付加、置換等)を有しているが、これは、目的のポリヌクレオチドの転写を有意に変化させない。本発明の文脈において、前記の機能的バリアントは、目的のポリヌクレオチドの錐体視細胞における強力な発現を駆動する能力を保持する。このような能力は、Yeら(2016)(18)及びKhabouら(2018)(17)に記載のようにして試験されうる。
好ましい実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、配列番号12に記載のpR1.7プロモーター、又はそれに対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%又は99%の配列同一性を有する前記プロモーターの機能的バリアントの制御下にある。
当業者によく知られているように、2つのヌクレオチド(又はアミノ酸)配列間の「配列同一性の%」は、最適な比較のためのアラインメントの際に、配列によって共有される同一な位置の数の関数である。比較される配列内の位置が同じヌクレオチド(又はアミノ酸)で占められている場合、その配列は、その位置で同一であると言われる。実際、同一性は完全な一致のみを指し、ヌクレオチド(又はアミノ酸)の相互の類似度は考慮しない。配列同一性のパーセンテージは、同一な位置の数に100を掛け、ギャップ(配列の端のギャップではなく、内部のギャップのみ)を含む、アラインメントされた領域(オーバーラップしている位置)の長さで割ることによって計算できる。この比較において、配列は同じ長さでも、又は異なる長さでもありうる。本発明において、好ましくは、配列の最適なアラインメントは、アラインメントが同一又は類似の長さの配列を用いて行われる場合、NeedlemanとWunsch (Journal of Molecular Biology;1970年、48(3):443～53頁)によって記述されたアルゴリズム等のグローバルホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、このアルゴリズムのコンピューター上の実装により(例えば、DNASTAR(登録商標) Lasergeneソフトウェアを使用)、又は目視検査により行われうる。或いは、異なる長さの配列を使用してアラインメントが行われる場合、配列の最適なアラインメントは、好ましくは、SmithとWaterson (Journal of Molecular Biology;1981年、147:195～197頁)によって記述されたアルゴリズム等のローカルホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、このアルゴリズムのコンピューター上の実装により(例えば、DNASTAR(登録商標) Lasergeneソフトウェアを使用)、又は目視検査により行われうる。グローバル及びローカルのホモロジーアラインメントアルゴリズムの例は、当業者にはよく知られており、ClustalV(グローバルアラインメント)、ClustalW(ローカルアラインメント)及びBLAST(ローカルアラインメント)を含むが、これらに限定はされない。
「治療有効量」とは、合理的なベネフィット/リスク比で網膜疾患を治療するのに十分なベクターの量を意味する。ベクターの総1日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。特定の患者に対する特定の治療上有効な用量のレベルは、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事;投与の時間、投与経路、及び使用される特定の化合物の排泄速度;治療の期間;使用される特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬剤;及び、医療分野でよく知られている同様な因子を含む、様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当分野の技術の範囲内で周知されている。したがって、ベクターの用量は、病状、対象(例えば、対象の体重及び/又は年齢、代謝、網膜の状態等に従う)、治療スケジュール等に応じて適合されうる。本発明の文脈の中での好ましい有効量は、錐体視細胞の最適な形質導入を可能にする量である。典型的には、1用量ごとに108～1010個のウイルスゲノム(vg)がマウスに投与される。典型的には、ヒトに投与されるAAVベクターの用量は、好ましくは眼1つあたり109～1012vgの範囲でありうる。
したがって、本発明のベクターは、医薬組成物に調合されうる。これらの組成物は、ベクターに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、又は当業者に周知の他の物質を含みうる。そのような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分(すなわち本発明のベクター)の効能を妨げるべきではない。担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路、すなわち本発明では網膜下注入に従って、当業者により決定されうる。医薬組成物は、典型的には液体の形態である。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物又は植物油、鉱油又は合成油等の液体担体を含む。生理食塩水、塩化マグネシウム、デキストロース若しくは他の糖溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール等のグリコールが含まれていてもよい。注入の場合、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なpH、等張性及び安定性を有する水溶液の形態となるであろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液等の等張性媒体を使用して、適切な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤、及び/又は注射剤への結合を回避するための界面活性剤(すなわちプルロニック（登録商標）)等の他の添加剤が含められてもよい。遅延放出のために、ベクターは、生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセル中、又は当技術分野で既知の方法に従うリポソーム担体系中等、徐放用に調合された医薬組成物中に含まれていてもよい。典型的には、本発明の医薬組成物は、プレフィルドシリンジで供給される。「使用準備済シリンジ」又は「プレフィルドシリンジ」は、充填された状態で供給される、すなわち、投与される医薬組成物がシリンジ内に既に存在し、投与の準備ができているシリンジである。プレフィルドシリンジは、利便性、入手可能性、正確性、無菌性、安全性の向上等、別個に提供されるシリンジやバイアルと比較して、多くの利点を有する。プレフィルドシリンジの使用は、投与量の精度の向上、バイアルから薬物を吸引する際に発生しうる針刺し怪我の可能性の低減、薬剤を再構成し、且つ/又は薬剤をシリンジに引き込む必要性による投与エラーを減らす投与量の事前計量、並びに薬剤の浪費を最小限に抑えることでコストの低減を助けるシリンジの過充填の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の液体医薬組成物のpHは、5.0～7.0、5.1～6.9、5.2～6.8、5.3～6.7又は5.4～6.6の範囲である。
特許請求の範囲にかかわらず、本発明は、以下の条項によっても定義される。
第1項. 対象の錐体視細胞において目的のポリヌクレオチドを発現させる方法であって、配列番号11に記載のVP1キャプシドタンパク質及び配列番号12に記載のpR1.7プロモーターの制御下にある目的のポリヌクレオチドを含む、組換えAAV9由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含む方法。
第2項. 対象が、錐体視細胞に影響を与える網膜疾患に罹患しているか、又は罹患する可能性が高い、第1項の方法。
第3項. 対象が、加齢性黄斑変性症、バッセン-コルツヴァイク症候群、脈絡膜血症、旋回性萎縮、レフサム症候群、アッシャー症候群、色盲、青色錐体単色症、色覚異常、不完全色覚異常、乏錐体三色性、網膜色素変性症(RP)、黄斑変性症、スターガルト病、バルデット-ビードル症候群、ボーンホルム眼病、ベスト病、及びレーバー先天性黒内障から成る群から選択される網膜疾患に罹患している、第1項の方法。
第4項. 目的のポリヌクレオチドが、網膜色素変性症GTPaseレギュレーター(RPGRORF15)、CNGB3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのベータサブユニット)、CNGA3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのアルファサブユニット)又はGNAT2をコードする、第1項の方法。
第5項. 目的のポリヌクレオチドが、神経栄養因子をコードする、第1項の方法。
第6項. 目的のポリヌクレオチドが、RdCVF、RdCVF2、RdCVFL又はRdCVFL2をコードする、第1項の方法。
第7項. 目的のポリヌクレオチドが、ハロロドプシン又はクルクハロロドプシンのようなロドプシン、フォトプシン、L/M波長(赤/緑)錐体オプシン、又は短波長(S)錐体オプシン(青)といったオプシンをコードする、第1項の方法。
第8項. 目的のポリヌクレオチドが、配列番号13、配列番号14又は配列番号15に記載のアミノ酸配列から成るオプシンをコードする、第7項の方法。
第9項. 目的のポリヌクレオチドが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びCRISPR関連エンドヌクレアーゼから成る群から選択される遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする、第1項の方法。
第10項. 目的のポリヌクレオチドが、Cas9ヌクレアーゼをコードする、第1項の方法。
第11項. 目的のポリヌクレオチドが、干渉性RNA(RNAi)、特にsiRNA又はshRNAをコードする、第1項の方法。
第12項. 目的のポリヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする、第1項の方法。
第13項. 網膜下送達が、中心窩から距離をおいて、前記領域を剥離させることなく行われる、第1項の方法。
第14項. 配列番号11に記載のVP1キャプシドタンパク質及び配列番号12に記載のpR1.7プロモーターの制御下にある目的のポリヌクレオチドを含む、組換えAAV9由来ベクター。
第15項. 錐体視細胞に影響を与える網膜疾患の治療方法における使用のための、第14項の組換えAAV9由来ベクター。
本発明は、以下の図面と実施例によって更に説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでは決してない。
材料及び方法:
AAVの作製
AAVベクターは、コトランスフェクション法を使用して以前に記載されたようにして作製し、イオジキサノール勾配超遠心分離によって精製した(49)。AAVベクターストックは、SYBR Green(Thermo Fischer Scientific社)を使用して定量的PCRにより力価を測定した(50)。
AAVの作製
AAVベクターは、コトランスフェクション法を使用して以前に記載されたようにして作製し、イオジキサノール勾配超遠心分離によって精製した(49)。AAVベクターストックは、SYBR Green(Thermo Fischer Scientific社)を使用して定量的PCRにより力価を測定した(50)。
動物及び眼内注入
本研究では、野生型C57BL6/j(Janvier Labs社)又はrd10マウス(Vision Institute社の動物施設にて繁殖及び飼育)、並びにマカクザル(Noveprim社、モーリシャス)を使用した。
本研究では、野生型C57BL6/j(Janvier Labs社)又はrd10マウス(Vision Institute社の動物施設にて繁殖及び飼育)、並びにマカクザル(Noveprim社、モーリシャス)を使用した。
眼への注入(n=6眼/条件)では、イソフルラン吸入により6週齢の雌マウスに麻酔をかけた。瞳孔を拡張させ、33ゲージの針を眼に挿入して、2μLのAAVベクター溶液を硝子体内又は網膜下に1μL送達した。
マカクの眼への注入に関しては、まず、AAVに対する中和抗体価の不在に基づき、マカクを選択した。手術に先立ち、10mg/kgのケタミンと0.5mh/kgのキシラジンの筋肉内注射により、霊長類を麻酔した。麻酔は、プロポフォール1ml/kg/h(PropoVet Multidose 10mg/ml、Zoetis社)の静脈内注入で維持した。次に、瞳孔を拡張させ、まぶたを開瞼器で開いたままにした。硝子体内注入には、32mm、27ゲージの針を備えた1mlシリンジを使用した。針を縁の後方約2mmの強膜に挿入し、100μlのウイルスベクター溶液を送達した。最後に、針をゆっくりと取り外した。動物に局所コルチコステロイド注射は与えなかった。
網膜下AAV注入では、1つは内部照明プローブ用、もう1つは網膜下カニューレ用の2つの25ゲージ硝子体切除ポートを縁の後方約2mmに設定した。注入には、41ゲージの先端を有する25ゲージの網膜下カニューレを備えた1mlのハミルトンシリンジを使用した。内部照明プローブとカニューレを眼中に導入した。ウイルスベクター溶液(50μl)を網膜下に注入し、中心窩の下又は上に小疱を作成した。その後、機器を撤去した。NHP5の右眼を除き、12mgのケナコート(Bristol-Myers Squibb社)の眼球側注射から成るコルチコステロイド治療を眼に施した(47)。網膜下又は硝子体内ベクター投与後、眼科用ステロイドと抗生物質軟膏(Fradexam、TVM社)を注入後の角膜に塗布した。
マカクの眼のin vivoイメージング
瞳孔拡張後、Spectralis HRA+OCTシステム(Heidelberg Engineering社、ドイツ)を用いて、488nmの励起波長と500nmのバリアフィルターで構成される「眼底自己蛍光モード」を使用して、OCT画像とGFPの蛍光画像を取得した。
瞳孔拡張後、Spectralis HRA+OCTシステム(Heidelberg Engineering社、ドイツ)を用いて、488nmの励起波長と500nmのバリアフィルターで構成される「眼底自己蛍光モード」を使用して、OCT画像とGFPの蛍光画像を取得した。
マカク網膜の2光子イメージングとex-vivo電気生理学的記録
パルスフェムト秒レーザー(InSight(商標) DeepSee(商標)、Newport Corporation社)を備えた40×水浸対物レンズ(LUMPLFLN40x/W/0.80、Olympus社)を備えた2光子顕微鏡を使用して、ホールマウントの(視細胞側を上にした)網膜又は網膜スライス(垂直断面)でGFP陽性網膜細胞を画像化した。AAVで処置したマカク網膜を単離し、その後、酸素化(95%O2、5%CO2)Ames培地(Sigma-Aldrich社)中で画像化した。ライブ2光子イメージングでは、網膜を顕微鏡の記録チャンバーに配置し、波長930nmの励起レーザーを使用してzスタックを取得した。画像は、ImageJ(NIH)を使用してオフラインで処理した。全細胞パッチクランプ記録には、Axon Multiclamp 700B増幅器を使用した。電極は、ホウ珪酸ガラス(BF100-50-10、Sutter Instruments社)で製作し、6～9MΩに引き合わせた。ピペットは、115mM Kグルコン酸、10mM KCl、1mM MgCl2、0.5mM CaCl2、1.5mM EGTA、10mM HEPES、及び4mM ATP-Na2(pH 7.2)で満たした。細胞は、電圧クランプ構成で-40mVの電位でクランプするか、電流クランプ(電流ゼロ)構成で記録した。網膜は、記録に先立ち、記録チャンバー内で少なくとも30分、暗順応させた。
パルスフェムト秒レーザー(InSight(商標) DeepSee(商標)、Newport Corporation社)を備えた40×水浸対物レンズ(LUMPLFLN40x/W/0.80、Olympus社)を備えた2光子顕微鏡を使用して、ホールマウントの(視細胞側を上にした)網膜又は網膜スライス(垂直断面)でGFP陽性網膜細胞を画像化した。AAVで処置したマカク網膜を単離し、その後、酸素化(95%O2、5%CO2)Ames培地(Sigma-Aldrich社)中で画像化した。ライブ2光子イメージングでは、網膜を顕微鏡の記録チャンバーに配置し、波長930nmの励起レーザーを使用してzスタックを取得した。画像は、ImageJ(NIH)を使用してオフラインで処理した。全細胞パッチクランプ記録には、Axon Multiclamp 700B増幅器を使用した。電極は、ホウ珪酸ガラス(BF100-50-10、Sutter Instruments社)で製作し、6～9MΩに引き合わせた。ピペットは、115mM Kグルコン酸、10mM KCl、1mM MgCl2、0.5mM CaCl2、1.5mM EGTA、10mM HEPES、及び4mM ATP-Na2(pH 7.2)で満たした。細胞は、電圧クランプ構成で-40mVの電位でクランプするか、電流クランプ(電流ゼロ)構成で記録した。網膜は、記録に先立ち、記録チャンバー内で少なくとも30分、暗順応させた。
ヒトiPSC培養
我々は、以前に公開されたプロトコールに基づき、ヒトiPSCから網膜オルガノイドを作製した(37)。クローンhiPSC-2は、既に記述されているように(37)、「前神経培地」中において、出生後ヒト包皮(ATCC CRL 2429)由来の線維芽細胞フィーダー上で増幅及び分化させた。非常にコンフルエントな付着性のiPS細胞培養から開始して、線維芽細胞増殖因子2(FGF2)の非存在下で、2週間後に自己形成網膜オルガノイドを確認することができる。この時点で、オルガノイドを機械的に単離し、3D条件で最長43日間培養した。オルガノイドを機械的に単離した後、FGF2を3つの条件で7日間培地に補充し、成長を促進させた。分化の28日目に、網膜オルガノイドにpR1.7プロモーターの制御下でGFP遺伝子を保持するAAV2-7m8ベクターを5×1010vg/オルガノイドの用量で感染させた。既存の細胞集団の細胞周期停止を促進するために、28日目から1週間、10μMのDAPT(Selleck社)を培地に添加した。蛍光強度は、感染の5日後に最初に観察され、43日目まで増加し続けた。
我々は、以前に公開されたプロトコールに基づき、ヒトiPSCから網膜オルガノイドを作製した(37)。クローンhiPSC-2は、既に記述されているように(37)、「前神経培地」中において、出生後ヒト包皮(ATCC CRL 2429)由来の線維芽細胞フィーダー上で増幅及び分化させた。非常にコンフルエントな付着性のiPS細胞培養から開始して、線維芽細胞増殖因子2(FGF2)の非存在下で、2週間後に自己形成網膜オルガノイドを確認することができる。この時点で、オルガノイドを機械的に単離し、3D条件で最長43日間培養した。オルガノイドを機械的に単離した後、FGF2を3つの条件で7日間培地に補充し、成長を促進させた。分化の28日目に、網膜オルガノイドにpR1.7プロモーターの制御下でGFP遺伝子を保持するAAV2-7m8ベクターを5×1010vg/オルガノイドの用量で感染させた。既存の細胞集団の細胞周期停止を促進するために、28日目から1週間、10μMのDAPT(Selleck社)を培地に添加した。蛍光強度は、感染の5日後に最初に観察され、43日目まで増加し続けた。
ヒト死後網膜外植片
ヒト網膜外植片は、以前に記載されたプロトコル(38)を用いて調製した。簡単に言うと、眼をCO2非依存培地(Thermo Fischer Scientific社)中で解体した。前部を取り除き、網膜を分離して、細かく切った。これらの外植片を、Transwell細胞培養インサート(Corning社)に光受容体側を上にして置き、B27(Thermo Fischer Scientific社)を補充した2mLのNeurobasal培地(Thermo Fischer Scientific社)を各外植片の下の各ウェルに加えた。翌日、各外植片を、1010個のウイルス粒子を含む0.5μLのAAV-pR1.7-GFPを1滴用いることで感染させた。ベクターの感染した外植片を10～15日間インキュベートしてGFPを発現させ、落射蛍光マクロスコープを使用して確認した。
ヒト網膜外植片は、以前に記載されたプロトコル(38)を用いて調製した。簡単に言うと、眼をCO2非依存培地(Thermo Fischer Scientific社)中で解体した。前部を取り除き、網膜を分離して、細かく切った。これらの外植片を、Transwell細胞培養インサート(Corning社)に光受容体側を上にして置き、B27(Thermo Fischer Scientific社)を補充した2mLのNeurobasal培地(Thermo Fischer Scientific社)を各外植片の下の各ウェルに加えた。翌日、各外植片を、1010個のウイルス粒子を含む0.5μLのAAV-pR1.7-GFPを1滴用いることで感染させた。ベクターの感染した外植片を10～15日間インキュベートしてGFPを発現させ、落射蛍光マクロスコープを使用して確認した。
組織学、免疫組織化学及び顕微鏡検査
マウスの眼を摘出し、直ちに凍結切片用に10%ホルマリン-4%ホルムアルデヒドで2時間固定した。解剖後、4%ホルムアルデヒドで3時間、マカクの網膜を固定した。網膜オルガノイド及びヒト網膜外植片を、培養期間の終わりにPBSでリンスし、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定した。凍結切片の場合、マウス及びマカクの網膜、網膜オルガノイド及びヒト網膜外植片をPBS-30%スクロース中に4℃で一晩浸漬させた。マウスの眼杯、ヒトの網膜外植片、マカクの網膜をOCT(最適切断温度)培地中に埋め込み、液体窒素中で凍結させ、その一方、網膜のオルガノイドは、7.5%ゼラチン及び10%スクロース(PBS)中に埋め込み、ドライアイスで冷やしたイソペンタン中で凍結させた。Micromクライオスタットを使用して、厚さ10μmの垂直断面を切断した。ブロッキングバッファー中でインキュベートした後、切片を4℃で一次抗体と共に一晩インキュベートした:ヒトCone Arrestin(hCAR)抗体(米国ロサンゼルス、南カリフォルニア大学のCheryl Craftから贈与);M/Lオプシン抗体(Millipore社、AB5405)、及びマウスCone Arrestin抗体(Millipore社、AB15282)。切片を複数回洗浄した後、二次抗体(Alexa Fluor 488、594又は647、ThermoFisher社)とDAPIを追加し、その後、数回洗浄した。網膜のフラットマウント又は凍結切片を蛍光顕微鏡用のVectashieldマウンティング培地(Vector Laboratories社)にマウントして、網膜切片をOlympus Upright共焦点顕微鏡を使用して可視化し、Fiji Softwareで分析した。中心窩の三次元投影は、Imarisソフトウェア(Bitplane社)で作成した。
マウスの眼を摘出し、直ちに凍結切片用に10%ホルマリン-4%ホルムアルデヒドで2時間固定した。解剖後、4%ホルムアルデヒドで3時間、マカクの網膜を固定した。網膜オルガノイド及びヒト網膜外植片を、培養期間の終わりにPBSでリンスし、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定した。凍結切片の場合、マウス及びマカクの網膜、網膜オルガノイド及びヒト網膜外植片をPBS-30%スクロース中に4℃で一晩浸漬させた。マウスの眼杯、ヒトの網膜外植片、マカクの網膜をOCT(最適切断温度)培地中に埋め込み、液体窒素中で凍結させ、その一方、網膜のオルガノイドは、7.5%ゼラチン及び10%スクロース(PBS)中に埋め込み、ドライアイスで冷やしたイソペンタン中で凍結させた。Micromクライオスタットを使用して、厚さ10μmの垂直断面を切断した。ブロッキングバッファー中でインキュベートした後、切片を4℃で一次抗体と共に一晩インキュベートした:ヒトCone Arrestin(hCAR)抗体(米国ロサンゼルス、南カリフォルニア大学のCheryl Craftから贈与);M/Lオプシン抗体(Millipore社、AB5405)、及びマウスCone Arrestin抗体(Millipore社、AB15282)。切片を複数回洗浄した後、二次抗体(Alexa Fluor 488、594又は647、ThermoFisher社)とDAPIを追加し、その後、数回洗浄した。網膜のフラットマウント又は凍結切片を蛍光顕微鏡用のVectashieldマウンティング培地(Vector Laboratories社)にマウントして、網膜切片をOlympus Upright共焦点顕微鏡を使用して可視化し、Fiji Softwareで分析した。中心窩の三次元投影は、Imarisソフトウェア(Bitplane社)で作成した。
潜在的な調節要素のin silico同定及びトランスクリプトーム分析
赤オプシン遺伝子プロモーター配列(pR2.1及びpR1.7配列)と錐体アレスチン3ゲノム領域について、TF結合部位分析を行った。TRANSFACデータベース8.3(http://alggen.lsi.upc.es/)をTF結合部位の予測に使用した。予測されたリスト中の各TFを感覚系ナレッジベース(KBASS、http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/transcriptomics/index.php)を使用して分析し、トランスクリプトーム実験RNG209(51)を使用して、ヒト網膜で発現されるものを選択した。以前に記載されたように、ロバストマルチアレイ平均(RMA)により正規化した実験RNG209から調製したサンプルにおいて、フィルターを使用して、40ユニットを超える信号強度値のTFを保持した(52)。この実験において対照として使用したヒト網膜標本は、眼疾患又は糖尿病の過去の病歴のない患者の死後12時間以内に収集された死後標本であった。17人の患者に相当する19個の眼から19個のサンプルを収集した。性比は男性12人/女性7人、平均年齢は61歳(25～78歳の範囲)であった。
赤オプシン遺伝子プロモーター配列(pR2.1及びpR1.7配列)と錐体アレスチン3ゲノム領域について、TF結合部位分析を行った。TRANSFACデータベース8.3(http://alggen.lsi.upc.es/)をTF結合部位の予測に使用した。予測されたリスト中の各TFを感覚系ナレッジベース(KBASS、http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/transcriptomics/index.php)を使用して分析し、トランスクリプトーム実験RNG209(51)を使用して、ヒト網膜で発現されるものを選択した。以前に記載されたように、ロバストマルチアレイ平均(RMA)により正規化した実験RNG209から調製したサンプルにおいて、フィルターを使用して、40ユニットを超える信号強度値のTFを保持した(52)。この実験において対照として使用したヒト網膜標本は、眼疾患又は糖尿病の過去の病歴のない患者の死後12時間以内に収集された死後標本であった。17人の患者に相当する19個の眼から19個のサンプルを収集した。性比は男性12人/女性7人、平均年齢は61歳(25～78歳の範囲)であった。
統計
Graphpad Prismにおいて、一元配置Anovaテストを使用して、データを分析した(多重比較、Tukey補正)。グラフのエラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を示している。p値は次の*p<0.033のように表される、ns:非有意。
Graphpad Prismにおいて、一元配置Anovaテストを使用して、データを分析した(多重比較、Tukey補正)。グラフのエラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を示している。p値は次の*p<0.033のように表される、ns:非有意。
研究の承認
動物に関しては、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実験を行った。プロトコールは、地域の動物倫理委員会によって承認されたものを欧州議会の指令2010/63/EUに従って実施した。ドナーからの死後ヒト眼球は、外科手術部(Ecole de Chirugie、Assitance Publique Hopitauxde Paris)から入手した。プロトコールは、外科手術部及びクインゼヴィンツ国立眼科病院の組織審査委員会により承認された。死後ヒト網膜外植片に関する全ての実験は、地域の規制とヘルシンキ宣言のガイドラインに従って実施した。
動物に関しては、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実験を行った。プロトコールは、地域の動物倫理委員会によって承認されたものを欧州議会の指令2010/63/EUに従って実施した。ドナーからの死後ヒト眼球は、外科手術部(Ecole de Chirugie、Assitance Publique Hopitauxde Paris)から入手した。プロトコールは、外科手術部及びクインゼヴィンツ国立眼科病院の組織審査委員会により承認された。死後ヒト網膜外植片に関する全ての実験は、地域の規制とヘルシンキ宣言のガイドラインに従って実施した。
結果:
齧歯類モデルにおける強力且つ特異的な錐体細胞特異的プロモーターの選択
注入部位から離れた位置にある錐体の強力且つ特異的な標的化に適したベクターとプロモーターの組み合わせを見つけるために、我々は、マウス網膜における硝子体内及び網膜下の送達後に、いくつかのAAVを比較した。効率的な錐体視細胞の標的化を可能とするために、我々は、両方の投与経路を介して視細胞を効率的に標的化することが示されているAAV2-7m8と呼ばれる改変AAVバリアントを使用した(16、17)。錐体細胞の特異的な標的化が、硝子体に投与されたAAVを使用して試みられたことはこれまで無かった。臨床で適用可能な錐体における限定的な遺伝子発現に適したプロモーター配列を見つけるために、我々は、非ヒト霊長類(NHP)(18)又はヒト組織(4)のいずれかで以前に検証されているプロモーターに焦点を当てた。我々は、mCAR(マウスCone Arrestin)、pR2.1及びpR1.7プロモーター(ヒト赤オプシン遺伝子エンハンサー及びプロモーター配列に基づく合成プロモーター)の制御下にあるGFPをコードするAAV2-7m8ベクターを生成し、それらを等しい力価で6週齢の野生型マウスの眼に注入した。網膜下注入の3週間後、網膜横断面を錐体アレスチンで染色し、GFPの発現を調べた(データは示さず)。mCARプロモーターでは、桿体と錐体の両光受容体において、高いGFP発現を我々は見出したが、pR2.1とpR1.7は主に錐体で強力な発現を導いた。同じベクターを使用して、我々は、硝子体内送達後には著しく異なる発現パターンを得た(データは示さず)。mCARプロモーターは、一部の錐体においてGFPの発現を引き起こしたが、桿体並びに内核層(INL)及び神経節細胞層(GCL)の細胞に対して漏出性であった(データは示さず)。pR2.1及びpR1.7の両プロモーターは、mCARプロモーターよりも多くの錐体の標識をもたらす(データは示さず)。pR2.1は、pR1.7よりも多くの錐体に形質導入したが、INL及びGCLにおいても非特異的なGFP発現を生じさせた。pR1.7プロモーターのみが、錐体においてGFP発現を示し、桿体における発現は最小限であり、網膜の内側に対して漏出しなかった(データは示さず)。最後に、網膜疾患の状態は、AAVを介した遺伝子送達と導入遺伝子発現パターンに影響を与えうるため(20、21)、我々は、網膜変性のマウスモデルにおいてAAV2-7m8-pR1.7のベクターとプロモーターの組み合わせを検証した。我々は、網膜色素変性症のrd10マウスモデルにおいて硝子体内にAAV2-7m8-pR1.7-GFPを注入した。注入の2か月後、GFPの発現は錐体に限定されており(データは示さず)、硝子体内注入と網膜下注入の両方を介した錐体指向性の遺伝子治療に対するこのベクターの適合性が裏付けられた。
齧歯類モデルにおける強力且つ特異的な錐体細胞特異的プロモーターの選択
注入部位から離れた位置にある錐体の強力且つ特異的な標的化に適したベクターとプロモーターの組み合わせを見つけるために、我々は、マウス網膜における硝子体内及び網膜下の送達後に、いくつかのAAVを比較した。効率的な錐体視細胞の標的化を可能とするために、我々は、両方の投与経路を介して視細胞を効率的に標的化することが示されているAAV2-7m8と呼ばれる改変AAVバリアントを使用した(16、17)。錐体細胞の特異的な標的化が、硝子体に投与されたAAVを使用して試みられたことはこれまで無かった。臨床で適用可能な錐体における限定的な遺伝子発現に適したプロモーター配列を見つけるために、我々は、非ヒト霊長類(NHP)(18)又はヒト組織(4)のいずれかで以前に検証されているプロモーターに焦点を当てた。我々は、mCAR(マウスCone Arrestin)、pR2.1及びpR1.7プロモーター(ヒト赤オプシン遺伝子エンハンサー及びプロモーター配列に基づく合成プロモーター)の制御下にあるGFPをコードするAAV2-7m8ベクターを生成し、それらを等しい力価で6週齢の野生型マウスの眼に注入した。網膜下注入の3週間後、網膜横断面を錐体アレスチンで染色し、GFPの発現を調べた(データは示さず)。mCARプロモーターでは、桿体と錐体の両光受容体において、高いGFP発現を我々は見出したが、pR2.1とpR1.7は主に錐体で強力な発現を導いた。同じベクターを使用して、我々は、硝子体内送達後には著しく異なる発現パターンを得た(データは示さず)。mCARプロモーターは、一部の錐体においてGFPの発現を引き起こしたが、桿体並びに内核層(INL)及び神経節細胞層(GCL)の細胞に対して漏出性であった(データは示さず)。pR2.1及びpR1.7の両プロモーターは、mCARプロモーターよりも多くの錐体の標識をもたらす(データは示さず)。pR2.1は、pR1.7よりも多くの錐体に形質導入したが、INL及びGCLにおいても非特異的なGFP発現を生じさせた。pR1.7プロモーターのみが、錐体においてGFP発現を示し、桿体における発現は最小限であり、網膜の内側に対して漏出しなかった(データは示さず)。最後に、網膜疾患の状態は、AAVを介した遺伝子送達と導入遺伝子発現パターンに影響を与えうるため(20、21)、我々は、網膜変性のマウスモデルにおいてAAV2-7m8-pR1.7のベクターとプロモーターの組み合わせを検証した。我々は、網膜色素変性症のrd10マウスモデルにおいて硝子体内にAAV2-7m8-pR1.7-GFPを注入した。注入の2か月後、GFPの発現は錐体に限定されており(データは示さず)、硝子体内注入と網膜下注入の両方を介した錐体指向性の遺伝子治療に対するこのベクターの適合性が裏付けられた。
mCAR、pR1.7及びpR2.1プロモーター配列のバイオインフォマティクス解析
他の種での更なる研究に移る前に、我々は、3つのプロモーターで得られた異なる発現パターンの背後にある理由をより良く理解することを目指した。そのために、我々は、バイオインフォマティクスを使用して、各プロモーター配列内の転写因子(TF)結合部位を分析した(データは示さず)。本分析は、以下の疑問に答えることを目的としている:(i)なぜpR1.7は錐体においてpR2.1よりも効率的なのか、(ii)pR2.1及びmCARプロモーターが硝子体内投与後にオフターゲット発現を引き起こすのはなぜか。我々は、pR1.7とpR2.1の間で観察された異なる発現パターンは、pR2.1プロモーターの5'領域にある337bpの配列中にあるが、pR1.7プロモーター中には無い付加的なTF結合部位によるものであると仮定した(データ示さず)。興味深いことに、我々は、この337bpの配列内に、ニワトリ卵白アルブミン上流プロモーター転写因子I(COUP-TFI)結合部位を見出した(データは示さず)。COUP-TFIは、マウスの網膜における緑オプシン遺伝子(Opn1mw)の発現を抑制することが示されており(22)、よって、AAVが網膜下に送達される際、マカクの錐体におけるpR2.1プロモーターの発現低下の原因となる可能性がある。同じ特異的な337bpの領域内において、我々は、CCAAT/エンハンサー結合タンパク質ベータ(CEBPB)や基本転写因子II-I(GTF2I)等、一般的な偏在性のアクチベーターTFの結合部位も複数見出した(データは示さず)。これらの結合及び基礎的な転写機構の集合を高め、錐体において特異的に発現されるのではないTFの付加的な結合部位が、pR1.7と比較して、pR2.1で観察された一部のオフターゲット発現の原因である可能性がある(データは示さず)。また我々は、AAV構築物において使用されるこのプロモーターの短いバージョンを使用した際の特異性の欠如を説明するために、ゲノムのmCARプロモーター配列(マウスArr3しても知られる)中のTF結合部位も分析した。この短い配列は、TATAボックス、TATA様ボックス、並びにCRX(錐体-桿体ホメオボックスタンパク質)及びSP(特異性タンパク質)TFの結合部位を提示する(23)(データは示さず)ゲノムの近位CARプロモーターの521bpの部分から成る(データは示さず)。しかしながら、521bpの領域のすぐ上流に位置するCARプロモーター活性を調節する「Reg」配列(23)は、短いmCAR配列からは除かれている(データは示さず)。STRINGデータベース(24)から取得したmCARプロモーターに結合するTFのインタラクトームに基づくと、CRX及びSP TFは互いに相互作用し、また、RARA(レチノイン酸受容体アルファ)、RXRA(レチノイドX受容体アルファ)及びTHRB(甲状腺ホルモン受容体ベータ)TFと相互作用する(データは示さず)。これらの3つの核内受容体(NR)は、細胞特異的転写コアクチベーター複合体(26、27)を形成することにより、MED1(25)(メディエーター複合体サブユニット1)を介して、遺伝子発現の細胞型特異的な調節に関与する(データは示さず)。CRX及びSPの結合部位は521bp領域上にあり、RXRA、RARA及びTHRBの結合部位はReg領域上に位置している(データは示さず)。更に、Reg領域は、錐体で発現される重要な核内受容体であるTHRβ2の5つの結合部位を含んでいる(28)(データは示さず)。これら全ての理由から、Reg領域の削除が、短いmCARプロモーターで観察されるオフターゲット発現の原因である可能性が高い。
他の種での更なる研究に移る前に、我々は、3つのプロモーターで得られた異なる発現パターンの背後にある理由をより良く理解することを目指した。そのために、我々は、バイオインフォマティクスを使用して、各プロモーター配列内の転写因子(TF)結合部位を分析した(データは示さず)。本分析は、以下の疑問に答えることを目的としている:(i)なぜpR1.7は錐体においてpR2.1よりも効率的なのか、(ii)pR2.1及びmCARプロモーターが硝子体内投与後にオフターゲット発現を引き起こすのはなぜか。我々は、pR1.7とpR2.1の間で観察された異なる発現パターンは、pR2.1プロモーターの5'領域にある337bpの配列中にあるが、pR1.7プロモーター中には無い付加的なTF結合部位によるものであると仮定した(データ示さず)。興味深いことに、我々は、この337bpの配列内に、ニワトリ卵白アルブミン上流プロモーター転写因子I(COUP-TFI)結合部位を見出した(データは示さず)。COUP-TFIは、マウスの網膜における緑オプシン遺伝子(Opn1mw)の発現を抑制することが示されており(22)、よって、AAVが網膜下に送達される際、マカクの錐体におけるpR2.1プロモーターの発現低下の原因となる可能性がある。同じ特異的な337bpの領域内において、我々は、CCAAT/エンハンサー結合タンパク質ベータ(CEBPB)や基本転写因子II-I(GTF2I)等、一般的な偏在性のアクチベーターTFの結合部位も複数見出した(データは示さず)。これらの結合及び基礎的な転写機構の集合を高め、錐体において特異的に発現されるのではないTFの付加的な結合部位が、pR1.7と比較して、pR2.1で観察された一部のオフターゲット発現の原因である可能性がある(データは示さず)。また我々は、AAV構築物において使用されるこのプロモーターの短いバージョンを使用した際の特異性の欠如を説明するために、ゲノムのmCARプロモーター配列(マウスArr3しても知られる)中のTF結合部位も分析した。この短い配列は、TATAボックス、TATA様ボックス、並びにCRX(錐体-桿体ホメオボックスタンパク質)及びSP(特異性タンパク質)TFの結合部位を提示する(23)(データは示さず)ゲノムの近位CARプロモーターの521bpの部分から成る(データは示さず)。しかしながら、521bpの領域のすぐ上流に位置するCARプロモーター活性を調節する「Reg」配列(23)は、短いmCAR配列からは除かれている(データは示さず)。STRINGデータベース(24)から取得したmCARプロモーターに結合するTFのインタラクトームに基づくと、CRX及びSP TFは互いに相互作用し、また、RARA(レチノイン酸受容体アルファ)、RXRA(レチノイドX受容体アルファ)及びTHRB(甲状腺ホルモン受容体ベータ)TFと相互作用する(データは示さず)。これらの3つの核内受容体(NR)は、細胞特異的転写コアクチベーター複合体(26、27)を形成することにより、MED1(25)(メディエーター複合体サブユニット1)を介して、遺伝子発現の細胞型特異的な調節に関与する(データは示さず)。CRX及びSPの結合部位は521bp領域上にあり、RXRA、RARA及びTHRBの結合部位はReg領域上に位置している(データは示さず)。更に、Reg領域は、錐体で発現される重要な核内受容体であるTHRβ2の5つの結合部位を含んでいる(28)(データは示さず)。これら全ての理由から、Reg領域の削除が、短いmCARプロモーターで観察されるオフターゲット発現の原因である可能性が高い。
AAVの硝子体内投与によるマカク中心窩錐体への安全な遺伝子送達
他の研究者らと我々は、ユビキタスプロモーターを備えたAAVバリアントを使用したマカク錐体の形質導入を示しているが(16、29～31)、硝子体に投与したAAVによる錐体の形質導入の達成は、炎症を引き起こす高用量でのみ可能であった(16、29)。我々は、強力な錐体特異的プロモーターを使用すれば、安全性と両立できる、より低い硝子体内に注入されるAAVの用量で、中心窩錐体の標的化を達成できると考えた(29、32)。そのような「用量節約」が可能かどうかをテストするために、我々は、2つのマカクの眼にAAV2-7m8-pR1.7-GFPを、他の2つのマカクの眼にAAV2-7m8-CMV-GFPを1011ウイルスゲノム(vg)の用量で注入した(表1)。我々は、in vivo眼底イメージングを使用してCMVの注入から早くも2週間後にはGFP発現を観察し、それは注入後2か月まで増加した(データは示さず)。GFPの蛍光は主に、周辺と傍中心窩領域に見られた。pR1.7によるGFPの発現は、投与後6～8週間で検出可能となり、中心窩に限定されていた(データは示さず)。光干渉断層法(OCT)で評価したところ、中心窩に検出可能な損傷は無かった(データは示さず)。注入から3か月後に動物を屠殺した。我々はそれから、黄斑のフラットマウント(データは示さず)と中心窩のレベルの網膜凍結切片(データは示さず)を調製し、眼毎に等しい取得設定を用いて、共焦点顕微鏡を使用してGFP蛍光を画像化した。これらの画像はin vivoの所見を裏付け、そして、AAV2-7m8-pR1.7を使用した1011粒子の用量での、硝子体からの特異的且つ強力な錐体の形質導入を示している。hCAR+細胞の約58%が、中心窩において検出可能なレベルのGFPを発現していることが見出された。同様な用量を使用して、CMVにより錐体に形質導入することは不可能である(検出可能な導入遺伝子の発現無し)。
他の研究者らと我々は、ユビキタスプロモーターを備えたAAVバリアントを使用したマカク錐体の形質導入を示しているが(16、29～31)、硝子体に投与したAAVによる錐体の形質導入の達成は、炎症を引き起こす高用量でのみ可能であった(16、29)。我々は、強力な錐体特異的プロモーターを使用すれば、安全性と両立できる、より低い硝子体内に注入されるAAVの用量で、中心窩錐体の標的化を達成できると考えた(29、32)。そのような「用量節約」が可能かどうかをテストするために、我々は、2つのマカクの眼にAAV2-7m8-pR1.7-GFPを、他の2つのマカクの眼にAAV2-7m8-CMV-GFPを1011ウイルスゲノム(vg)の用量で注入した(表1)。我々は、in vivo眼底イメージングを使用してCMVの注入から早くも2週間後にはGFP発現を観察し、それは注入後2か月まで増加した(データは示さず)。GFPの蛍光は主に、周辺と傍中心窩領域に見られた。pR1.7によるGFPの発現は、投与後6～8週間で検出可能となり、中心窩に限定されていた(データは示さず)。光干渉断層法(OCT)で評価したところ、中心窩に検出可能な損傷は無かった(データは示さず)。注入から3か月後に動物を屠殺した。我々はそれから、黄斑のフラットマウント(データは示さず)と中心窩のレベルの網膜凍結切片(データは示さず)を調製し、眼毎に等しい取得設定を用いて、共焦点顕微鏡を使用してGFP蛍光を画像化した。これらの画像はin vivoの所見を裏付け、そして、AAV2-7m8-pR1.7を使用した1011粒子の用量での、硝子体からの特異的且つ強力な錐体の形質導入を示している。hCAR+細胞の約58%が、中心窩において検出可能なレベルのGFPを発現していることが見出された。同様な用量を使用して、CMVにより錐体に形質導入することは不可能である(検出可能な導入遺伝子の発現無し)。
光遺伝学を用いた視力回復のための中心窩錐体への治療的遺伝子送達
我々は次に、このプロモーターを治療用遺伝子送達に使用する可能性を評価することを目指した。遺伝子(すなわち、色覚異常の治療のためのCNGB3)補充後の機能的転帰を試験するための網膜変性の既存の盲目マカク又は霊長類モデルは存在していない。しかしながら、我々は内因性の錐体オプシンを介した応答と光遺伝学を介した光応答を区別できるため、光遺伝学的な戦略を使用して、野生型マカクにおける視力回復を評価することは可能である(4)。我々は、中心窩錐体における過分極性微生物オプシン(15)であるJawsの発現により、光遺伝学的視力回復の可能性を評価した。1匹のマカクの硝子体に1011vgのAAV2-7m8-pR1.7-Jaws-GFPを注入して、マウスにおいて以前に記述されたようにして、中期網膜色素変性症における休眠錐体の再活性化について、その治療ポテンシャルを評価した(4、15)。我々は、GFP発現のみと同様に(データは示さず)、注入を行った眼の中心窩錐体に限定された高レベルのJaws-GFP発現を見出した(データは示さず)。それから、注入の2か月後に動物を屠殺し、網膜の半分を組織学的検査のために処理した。網膜フラットマウントは、我々の高い視力を担う密集して詰まった錐体を含む中心窩の領域である中心窩における錐体の典型的な解剖学的形態を示した。錐体アレスチンの免疫染色を使用して、形質導入された錐体を定量化した(データは示さず)。錐体アレスチン陽性細胞(hCAR+)の約50%が、この網膜で検出可能なレベルのJaws-GFPを発現していることが見出された。網膜の残りの半分は、過分極性ポンプJawsから生じる光遺伝学的光応答の化学分析のための外植片(33)として保存された(データは示さず)。Jawsを発現する形質導入された錐体及びGFP発現なしの対照錐体において、電気生理学的記録を行った(データは示さず)。GFP陽性Jaws錐体における全細胞パッチクランプ記録は、オレンジ色の光フラッシュ(n=4)に対して強い光応答を示した(データは示さず)。記録された細胞の活性スペクトルは、Jawsについて以前に示されたように(14)、575～600nmのオレンジ色の光を使用して最大の光応答が得られることを示した(データは示さず)。電流クランプ構成で記録されたJawsを発現する錐体は、光誘発過分極に続いて短い脱分極を示したが(n=4個の細胞)、対照の錐体は同じ光刺激に対して反応しなかった(n=3個の細胞)(データは示さず)。
我々は次に、このプロモーターを治療用遺伝子送達に使用する可能性を評価することを目指した。遺伝子(すなわち、色覚異常の治療のためのCNGB3)補充後の機能的転帰を試験するための網膜変性の既存の盲目マカク又は霊長類モデルは存在していない。しかしながら、我々は内因性の錐体オプシンを介した応答と光遺伝学を介した光応答を区別できるため、光遺伝学的な戦略を使用して、野生型マカクにおける視力回復を評価することは可能である(4)。我々は、中心窩錐体における過分極性微生物オプシン(15)であるJawsの発現により、光遺伝学的視力回復の可能性を評価した。1匹のマカクの硝子体に1011vgのAAV2-7m8-pR1.7-Jaws-GFPを注入して、マウスにおいて以前に記述されたようにして、中期網膜色素変性症における休眠錐体の再活性化について、その治療ポテンシャルを評価した(4、15)。我々は、GFP発現のみと同様に(データは示さず)、注入を行った眼の中心窩錐体に限定された高レベルのJaws-GFP発現を見出した(データは示さず)。それから、注入の2か月後に動物を屠殺し、網膜の半分を組織学的検査のために処理した。網膜フラットマウントは、我々の高い視力を担う密集して詰まった錐体を含む中心窩の領域である中心窩における錐体の典型的な解剖学的形態を示した。錐体アレスチンの免疫染色を使用して、形質導入された錐体を定量化した(データは示さず)。錐体アレスチン陽性細胞(hCAR+)の約50%が、この網膜で検出可能なレベルのJaws-GFPを発現していることが見出された。網膜の残りの半分は、過分極性ポンプJawsから生じる光遺伝学的光応答の化学分析のための外植片(33)として保存された(データは示さず)。Jawsを発現する形質導入された錐体及びGFP発現なしの対照錐体において、電気生理学的記録を行った(データは示さず)。GFP陽性Jaws錐体における全細胞パッチクランプ記録は、オレンジ色の光フラッシュ(n=4)に対して強い光応答を示した(データは示さず)。記録された細胞の活性スペクトルは、Jawsについて以前に示されたように(14)、575～600nmのオレンジ色の光を使用して最大の光応答が得られることを示した(データは示さず)。電流クランプ構成で記録されたJawsを発現する錐体は、光誘発過分極に続いて短い脱分極を示したが(n=4個の細胞)、対照の錐体は同じ光刺激に対して反応しなかった(n=3個の細胞)(データは示さず)。
最後に、我々は1010個のAAV2-7m8-pR1.7-Jaws-GFP粒子を別のマカクの硝子体に注入して、更に低い用量での中心窩形質導入の実現可能性を評価した。我々は、この低い用量でさえも検出可能な中心窩Jaws発現を得たが、発現レベルは1011粒子よりも低かった(データは示さず)。まとめると、AAV2-7m8-pR1.7-GFP(n=2)又はJaws-GFP(n=2)を注入した4匹全てのマカクの眼が、錐体の光遺伝学的再活性化と適合性のある硝子体内アプローチの再現性及び強度を示している。
AAV9-7m8-Jawsの遠位網膜下投与による中心窩錐体の強化された光遺伝学的反応
強力な錐体プロモーターを伴うAAV2-7m8の硝子体内注入による中心窩錐体の形質導入は、主に中心窩に存在する休眠錐体を有する網膜色素変性症患者の脆弱な網膜の錐体を治療するための理想的なアプローチとなる可能性がある。しかしながら、色覚異常症の患者と、AAV2に対する強い中和抗体力価を有する網膜色素変性症の一部の患者(32)に対しては、網膜下アプローチが有利となりうる。以前の研究は、AAV9の網膜下注入が、低用量の中心及び周辺の両送達で錐体における効率的な導入遺伝子発現を導くことを示しているが、これは、AAV9の主要な受容体であるガラクトシル化グリカンが錐体光受容体上に豊富であるためであると考えられる(30、34)。これに基づき、強化されたAAV9バリアントは、遠位小疱からの中心窩錐体の効率的な形質導入をもたらす可能性があると我々は考えた。遠位の網膜下注入部位を介した中心窩錐体遺伝子の送達を促進するために、我々は、野生型AAV9よりも30倍の感染力の増加をもたらすAAV9-7m8バリアントを使用した。我々は、Jaws-GFPをコードする5×1010粒子のこのベクターを1匹の動物の周辺網膜(図1、A～B)に、中心窩を剥離させることなく、網膜下注入した。注入後早くも2週間で、小疱(破線で区切られている)において、そして中心窩においても、強いJaws-GFP蛍光を我々は観察した(図1C)。蛍光強度は、硝子体内処置した網膜よりも、中心窩において高かった。我々は、同じベクターを1010vgの低用量で注入した第2の眼で同じデータを観察した(図2A)。動物が直立した状態において上位周辺小疱が中心窩に向かって下降しないことを更に確認するため、また、更なる用量の低減が可能かどうかを調べるために、我々は、他の2つの眼に510vgの用量で注入を行ったが、今回は中心窩よりも下位とした(Table 1(表1))。OCTを使用して、我々は、中心窩が手術後に剥離しないことを観察した(図3)。中心窩錐体にまで及ぶ同じ発現パターンがこれらの網膜において得られた(図2B)。これらの結果はあわせて、このアプローチの再現性と低ウイルス用量との適合性を示している。
強力な錐体プロモーターを伴うAAV2-7m8の硝子体内注入による中心窩錐体の形質導入は、主に中心窩に存在する休眠錐体を有する網膜色素変性症患者の脆弱な網膜の錐体を治療するための理想的なアプローチとなる可能性がある。しかしながら、色覚異常症の患者と、AAV2に対する強い中和抗体力価を有する網膜色素変性症の一部の患者(32)に対しては、網膜下アプローチが有利となりうる。以前の研究は、AAV9の網膜下注入が、低用量の中心及び周辺の両送達で錐体における効率的な導入遺伝子発現を導くことを示しているが、これは、AAV9の主要な受容体であるガラクトシル化グリカンが錐体光受容体上に豊富であるためであると考えられる(30、34)。これに基づき、強化されたAAV9バリアントは、遠位小疱からの中心窩錐体の効率的な形質導入をもたらす可能性があると我々は考えた。遠位の網膜下注入部位を介した中心窩錐体遺伝子の送達を促進するために、我々は、野生型AAV9よりも30倍の感染力の増加をもたらすAAV9-7m8バリアントを使用した。我々は、Jaws-GFPをコードする5×1010粒子のこのベクターを1匹の動物の周辺網膜(図1、A～B)に、中心窩を剥離させることなく、網膜下注入した。注入後早くも2週間で、小疱(破線で区切られている)において、そして中心窩においても、強いJaws-GFP蛍光を我々は観察した(図1C)。蛍光強度は、硝子体内処置した網膜よりも、中心窩において高かった。我々は、同じベクターを1010vgの低用量で注入した第2の眼で同じデータを観察した(図2A)。動物が直立した状態において上位周辺小疱が中心窩に向かって下降しないことを更に確認するため、また、更なる用量の低減が可能かどうかを調べるために、我々は、他の2つの眼に510vgの用量で注入を行ったが、今回は中心窩よりも下位とした(Table 1(表1))。OCTを使用して、我々は、中心窩が手術後に剥離しないことを観察した(図3)。中心窩錐体にまで及ぶ同じ発現パターンがこれらの網膜において得られた(図2B)。これらの結果はあわせて、このアプローチの再現性と低ウイルス用量との適合性を示している。
次に、網膜フラットマウントを調製した。中心窩を組織学的検査のために処理し、注入部位と中心窩の内側の間の領域(図1、D～F)の錐体の大きな集団(図1D)で、強いJaws-GFP発現が示された。中心窩のGFP及び錐体アレスチン陽性(CAR+)細胞の細胞数測定は、硝子体内注入で得られた約50%と比較して、錐体の約95%がこの網膜下アプローチ(図1、E～F)を使用して標識されたことを示した(データは示さず)。光電流の振幅は、硝子体内送達後のJaws錐体(データは示さず)に比べ、網膜下送達後のJaws錐体(図1、G～H)では、同様な形状の光感度曲線で5倍高くなっていた。これは、硝子体内送達で形質導入された錐体と比較して、網膜下に形質導入された錐体におけるJawsの発現がより高いためである可能性が高い。様々な周波数でのフリッカー刺激を用いた時間分析は、8×1016光子cm-2s-1において、2Hzから30Hzまでの非常に速く、ロバストな光電流応答を示した(図1L)。どちらの場合も、光強度応答閾値は約1015光子cm-2s-1で観測された。電流ゼロモードの電流クランプ構成における錐体の記録は、実験者が細胞の実際の静止膜電位を記録することを可能とするが、我々は、網膜下に注入された網膜でより明白な光誘起過分極とその後に続く短い脱分極を観察し(図1、I～J)、これは、硝子体内に注入された網膜よりも高いJaws-GFPの発現レベルと相関している。Jaws誘発性の光電流は、予想どおり、575nmにピークを有する刺激波長の関数として振幅が変化した(図1K)。増加する刺激周波数の適用は、8.1016光子cm-2s-1において最大30Hzまで、ベースラインに戻る確実な光電流が得られることを示した(図1L)。
pR1.7プロモーターは、ヒトの錐体において強力で特異性の高い遺伝子発現を駆動する
全体的にみて、非ヒト霊長類における我々のデータは、視覚回復のための光遺伝学的適用に適合性のある非侵襲的で特異的且つ高レベルな霊長類の中心窩錐体形質導入を初めて示したものである。しかしながら、プロモーター活性は種間で重要な変動を示すため(29、35、36)、ヒトの細胞及び組織でpR1.7を検証する必要があると我々は考えた。錐体プロモーター活性の効率をテストするために使用できる優れたヒト視細胞細胞株又は他のモデルが無いため、我々は、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞由来の3D網膜オルガノイドを使用した(37)。我々は、光受容体の豊富な網膜オルガノイドを生成し、pR1.7プロモーターの制御下にあるGFPをコードするAAV2-7m8ベクターで感染させた(データは示さず)。GFPの発現は、感染から早くも5日後に観察され、分析のため43日目に実験を終了させるまで増加し続けた。これらのオルガノイドにおけるGFPの発現は、ヒトCone Arrestin(hCAR)の免疫染色と共局在していた(データは示さず)。最後に、ヒト網膜オルガノイドは成熟したヒト網膜の全ての機能を表すわけではないため、我々は、死後ヒト網膜外植片においてpR1.7プロモーターの有効性と特異性を検証した。ヒト網膜外植片を以前に記述されたようにして培養し(38)、1滴のAAV2-7m8-pR1.7-GFPに感染させた(データは示さず)。感染から15日後、凍結切片上でGFPの発現を分析した。発現はONLに限定され(データは示さず)、錐体細胞マーカーであるM/L-オプシンと共局在していた(データは示さず)。これらのデータはあわせて、ヒトの錐体における限定的な遺伝子発現の誘導におけるpR1.7の高い効率と特異性を示している。
全体的にみて、非ヒト霊長類における我々のデータは、視覚回復のための光遺伝学的適用に適合性のある非侵襲的で特異的且つ高レベルな霊長類の中心窩錐体形質導入を初めて示したものである。しかしながら、プロモーター活性は種間で重要な変動を示すため(29、35、36)、ヒトの細胞及び組織でpR1.7を検証する必要があると我々は考えた。錐体プロモーター活性の効率をテストするために使用できる優れたヒト視細胞細胞株又は他のモデルが無いため、我々は、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞由来の3D網膜オルガノイドを使用した(37)。我々は、光受容体の豊富な網膜オルガノイドを生成し、pR1.7プロモーターの制御下にあるGFPをコードするAAV2-7m8ベクターで感染させた(データは示さず)。GFPの発現は、感染から早くも5日後に観察され、分析のため43日目に実験を終了させるまで増加し続けた。これらのオルガノイドにおけるGFPの発現は、ヒトCone Arrestin(hCAR)の免疫染色と共局在していた(データは示さず)。最後に、ヒト網膜オルガノイドは成熟したヒト網膜の全ての機能を表すわけではないため、我々は、死後ヒト網膜外植片においてpR1.7プロモーターの有効性と特異性を検証した。ヒト網膜外植片を以前に記述されたようにして培養し(38)、1滴のAAV2-7m8-pR1.7-GFPに感染させた(データは示さず)。感染から15日後、凍結切片上でGFPの発現を分析した。発現はONLに限定され(データは示さず)、錐体細胞マーカーであるM/L-オプシンと共局在していた(データは示さず)。これらのデータはあわせて、ヒトの錐体における限定的な遺伝子発現の誘導におけるpR1.7の高い効率と特異性を示している。
眼内注入のin vivo安全性試験
我々は次に、AAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFPの硝子体内注入、及びAAV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFPの網膜下注入後の免疫反応を評価した。
我々は次に、AAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFPの硝子体内注入、及びAAV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFPの網膜下注入後の免疫反応を評価した。
網膜の異常及び浸潤の検出
炎症(免疫反応)は、注入の2か月後に網膜凍結切片のH&E染色及び炎症細胞免疫化学(IHC)によって評価した。H&E染色と網膜切片の顕微鏡観察に基づくと、AAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFPの硝子体内投与(図4A)とAVV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFPの網膜下注入(図4B)のいずれも、細胞浸潤又は網膜の組織崩壊とは関連しておらず、これは、以前の部分のKiller Red及びGFPの眼とは対照的であった。
炎症(免疫反応)は、注入の2か月後に網膜凍結切片のH&E染色及び炎症細胞免疫化学(IHC)によって評価した。H&E染色と網膜切片の顕微鏡観察に基づくと、AAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFPの硝子体内投与(図4A)とAVV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFPの網膜下注入(図4B)のいずれも、細胞浸潤又は網膜の組織崩壊とは関連しておらず、これは、以前の部分のKiller Red及びGFPの眼とは対照的であった。
炎症マーカーの検出のための免疫組織化学分析
局所的な適応免疫応答を分析するために、我々はAAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFP及びAVV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP構築物の両方を注入したサル網膜のIHC分析を行った。網膜下で処置した動物及び硝子体内で処置した動物の凍結切片を抗ヒトHLA ABC(MHC I)、抗HLA-DR(主要組織適合性複合体II(MHC II))、抗ヒトCD8、抗F4/80で染色した。上記のマーカーについて陽性の切片は無かった。ミクログリアとマクロファージの造血マーカーであるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)とイオン化カルシウム結合アダプター分子1(IBA1)の染色は陰性であった(AVV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFPに関しては図5;AAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFPについてのデータは示さず)。
局所的な適応免疫応答を分析するために、我々はAAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFP及びAVV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP構築物の両方を注入したサル網膜のIHC分析を行った。網膜下で処置した動物及び硝子体内で処置した動物の凍結切片を抗ヒトHLA ABC(MHC I)、抗HLA-DR(主要組織適合性複合体II(MHC II))、抗ヒトCD8、抗F4/80で染色した。上記のマーカーについて陽性の切片は無かった。ミクログリアとマクロファージの造血マーカーであるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)とイオン化カルシウム結合アダプター分子1(IBA1)の染色は陰性であった(AVV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFPに関しては図5;AAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFPについてのデータは示さず)。
考察:
中心窩は、霊長類の網膜表面積の1%未満しか占めていないが、一次視覚野の細胞の約50%に入力を提供する(1)。網膜の最も薄くて繊細な部分である中心窩における錐体の高い集中は、高い視力を可能にし、そして、治療的介入の際に、この領域における錐体の独特な機能(39)と構造(40)を維持することは最も重要である。中心窩の錐体は、網膜下又は硝子体内注入のいずれかを使用して、異なる投与経路を介して標的化できるが(35、41、42)、中心窩の剥離は、特に変性網膜において、機械的な損傷を導くおそれがある(43)。これら全ての理由により、この領域を剥離させることなく、治療薬を中心窩に送達する方法が必要とされる。硝子体内注入は、網膜剥離を伴わずに治療薬を送達する外科的にシンプルな方法である。遺伝子治療ベクターは、げっ歯類において、光受容体に損傷を与えることなく、硝子体内注入により網膜の外側を標的化することができる(17、35)。しかしながら、硝子体内注入による霊長類の錐体への安全で効率的な遺伝子送達は、おそらく硝子体内でのベクターの実質的な希釈とその結果としての効力の喪失が原因で、これまで達成されていなかった。この課題を克服するためには、より低い局所濃度で高レベルの遺伝子発現を提供する細胞型特異的なプロモーターの使用が重要となる(29、44)。
中心窩は、霊長類の網膜表面積の1%未満しか占めていないが、一次視覚野の細胞の約50%に入力を提供する(1)。網膜の最も薄くて繊細な部分である中心窩における錐体の高い集中は、高い視力を可能にし、そして、治療的介入の際に、この領域における錐体の独特な機能(39)と構造(40)を維持することは最も重要である。中心窩の錐体は、網膜下又は硝子体内注入のいずれかを使用して、異なる投与経路を介して標的化できるが(35、41、42)、中心窩の剥離は、特に変性網膜において、機械的な損傷を導くおそれがある(43)。これら全ての理由により、この領域を剥離させることなく、治療薬を中心窩に送達する方法が必要とされる。硝子体内注入は、網膜剥離を伴わずに治療薬を送達する外科的にシンプルな方法である。遺伝子治療ベクターは、げっ歯類において、光受容体に損傷を与えることなく、硝子体内注入により網膜の外側を標的化することができる(17、35)。しかしながら、硝子体内注入による霊長類の錐体への安全で効率的な遺伝子送達は、おそらく硝子体内でのベクターの実質的な希釈とその結果としての効力の喪失が原因で、これまで達成されていなかった。この課題を克服するためには、より低い局所濃度で高レベルの遺伝子発現を提供する細胞型特異的なプロモーターの使用が重要となる(29、44)。
本研究において、我々はまず、様々なプロモーターをAAV2-7m8キャプシドと組み合わせて使用して、非侵襲的な硝子体内注入を介した錐体の強力且つ排他的な形質導入を達成しようとした。我々は3つのプロモーターを選択し、錐体形質導入の特異性と強度を並行して試験した。マウスの網膜においてin vivoで試験した全てのプロモーターが、網膜下の送達により、光受容体層における導入遺伝子の発現を引き起こしている。mCARプロモーターは、桿体と錐体における発現を導いた。驚いたことに、硝子体内送達後、pR1.7のみが錐体に対する特異性を維持し、一方、pR2.1とmCARは、網膜内層ニューロンにおいて非特異的な遺伝子発現を引き起こした。mCARとpR2.1は、網膜内層の細胞で非特異的な発現を生じさせるため、それらは、下流ニューロンでの発現が光受容体からの応答を無効化するであろう光遺伝学的適用には不適である。各プロモーター配列内のTF結合部位のその後のin silico分析は、より特異的なpR1.7による形質導入とmCARプロモーターで観察される特異性の欠如の基礎を提案した。次に、pR1.7プロモーターを備えたAAV2-7m8が中心窩錐体を形質導入する能力を研究するために、我々は、マカクの眼において遺伝子送達試験を行った。霊長類の錐体への遺伝子発現の完全な制限は、AAV2-7m8-pR1.7を使用した硝子体内投与を介して、中心窩において達成された。
硝子体内注入経路の1つの欠点は、網膜下投与と比較して、免疫系との相互作用に対する、この区画に投与されたAAVの感受性が高いことである(32)。抗体中和は、非ヒト霊長類における硝子体内AAVベクター媒介遺伝子送達への障壁をもたらすことが示されており、これは、おそらくヒトへの適用に挑戦を課すであろう。したがって、我々は、AAV2に対する中和抗体を持つ患者のための別の遺伝子送達アプローチの開発を目指した。この目的のために、我々は、遠位部位でのAAV9-7m8の網膜下投与による中心窩錐体への遺伝子送達を試験した(Table 2(表2))。我々は、横方向に拡散して小疱の外側における発現を媒介するベクターの能力のおかげで、この新たな送達アプローチにより、ロバストな光応答が得られることを示した。同じ光遺伝学的錐体再活性化戦略を使用して、我々は、このアプローチもJawsを介したロバストな光応答を提供するが、硝子体内経路と比較して、錐体の割合が高いことを示した(4、15)。
我々のin vivoにおける所見はあわせて、網膜の遺伝子送達における3つの重要な考慮事項を示している。まず、強化されたAAVベクターは、定方向進化(AAV2-7m8(35))又は合理的設計(AAV9-7m8(17))のどちらを介して取得しても、親の血清型が十分な遺伝子送達を提供できない治療目標を達成できる。実際、AAV2とAAV9は、非侵襲的な中心窩の標的化を効率的に行えないが(30、31)、7m8改変ベクターはこのギャップを埋める。第二に、強力な細胞型特異的プロモーターは、遺伝子治療の安全性にとって重要な用量の節約(すなわち、免疫応答の回避)を可能にする。第三に、我々の研究は、導入遺伝子の発現パターンに対するベクター投与経路の無視できない影響を示している。最後に、我々の動物におけるin vivoの結果を補完するために、in vivo実験と組み合わせて、臨床応用のために遺伝子治療を検証するための多目的なプラットフォームを構成する一連のex vivo試験をヒトの組織において行った。本明細書に記載のベクターとプロモーターの組み合わせは、錐体の標的化が望まれるあらゆる網膜疾患に有用となるであろう。各投与経路とベクターは、患者の血清学的状態と対象疾患の自然経過に基づいて検討されうる(Table 2(表2)を参照)。pR1.7とAAV2-7m8の組み合わせは、硝子体に送達した場合、ヒト中心窩錐体における治療遺伝子発現に理想的であり、網膜色素変性症において光遺伝学によって残りの休眠錐体を蘇生させるための理想的な方法となりうる(4)。色覚異常では、錐体が中心と周辺の両方に存在するため、AAV9-7m8-pR1.7を使用した周辺における遺伝子送達は、中心窩と周辺の両方の錐体に治療遺伝子を送達することから、より効果的となりうる。
我々のin vivo実験は、注入後に免疫応答を誘発しなかったため、AAV9-7m8-pR1.7及びAAV2-7m8-pR1.7ベクターの安全性を更に確認している。
配列:
配列番号1:スペーサー無しの挿入ペプチド7m8
LGETTRP
配列番号1:スペーサー無しの挿入ペプチド7m8
LGETTRP
配列番号2:挿入ペプチド
NETITRP
NETITRP
配列番号3:挿入ペプチド
KAGQANN
KAGQANN
配列番号4:挿入ペプチド
KDPKTTN
KDPKTTN
配列番号5:挿入ペプチド
KDTDTTR
KDTDTTR
配列番号6:挿入ペプチド
RAGGSVG
RAGGSVG
配列番号7:挿入ペプチド
AVDTTKF
AVDTTKF
配列番号8:挿入ペプチド
STGKVPN
STGKVPN
配列番号9:挿入ペプチド7m8
AALGETTRPA
AALGETTRPA
配列番号10:野生型AAV9 VP1キャプシド
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配列番号11:組換えAAV9由来ベクターのVP1キャプシド
配列番号12:pR1.7プロモーター
ggaggctgaggggtggggaaagggcatgggtgtttcatgaggacagagcttccgtttcatgcaatgaaaagagtttggagacggatggtggtgactggactatacacttacacacggtagcgatggtacactttgtattatgtatattttaccacgatctttttaaagtgtcaaaggcaaatggccaaatggttccttgtcctatagctgtagcagccatcggctgttagtgacaaagcccctgagtcaagatgacagcagcccccataactcctaatcggctctcccgcgtggagtcatttaggagtagtcgcattagagacaagtccaacatctaatcttccaccctggccagggccccagctggcagcgagggtgggagactccgggcagagcagagggcgctgacattggggcccggcctggcttgggtccctctggcctttccccaggggccctctttccttggggctttcttgggccgccactgctcccgctcctctccccccatcccaccccctcaccccctcgttcttcatatccttctctagtgctccctccactttcatccacccttctgcaagagtgtgggaccacaaatgagttttcacctggcctggggacacacgtgcccccacaggtgctgagtgactttctaggacagtaatctgctttaggctaaaatgggacttgatcttctgttagccctaatcatcaattagcagagccggtgaaggtgcagaacctaccgcctttccaggcctcctcccacctctgccacctccactctccttcctgggatgtgggggctggcacacgtgtggcccagggcattggtgggattgcactgagctgggtcattagcgtaatcctggacaagggcagacagggcgagcggagggccagctccggggctcaggcaaggctgggggcttcccccagacaccccactcctcctctgctggacccccacttcatagggcacttcgtgttctcaaagggcttccaaatagcatggtggccttggatgcccagggaagcctcagagttgcttatctccctctagacagaaggggaatctcggtcaagagggagaggtcgccctgttcaaggccacccagccagctcatggcggtaatgggacaaggctggccagccatcccaccctcagaagggacccggtggggcaggtgatctcagaggaggctcacttctgggtctcacattcttggatccggttccaggcctcggccctaaatagtctccctgggctttcaagagaaccacatgagaaaggaggattcgggctctgagcagtttcaccacccaccccccagtctgcaaatcctgacccgtgggtccacctgccccaaaggcggacgcaggacagtagaagggaacagagaacacataaacacagagagggccacagcggctcccacagtcaccgccaccttcctggcggggatgggtggggcgtctgagtttggttcccagcaaatccctctgagccgcccttgcgggctcgcctcaggagcaggggagcaagaggtgggaggaggaggtctaagtcccaggcccaattaagagatcaggtagtgtagggtttgggagcttttaaggtgaagaggcccgggctgatcccacaggccagtataaagcgccgtgaccctcaggtgatgcgccagggccggctgccgtcggggacagggctttccatagcc
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配列番号13:Jaws-GFP=Halo57+変異2箇所+KGC+GFP+ER2
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配列番号14:Jaws=Halo57+変異2箇所+KGC+ER2
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配列番号15;Halo57+変異2箇所+KGC
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この出願を通して、本発明の関係する技術水準を様々な参考文献が記載している。これらの参考文献の開示は、本明細書中に参考として援用される。
（参考文献）
（参考文献）
Claims (15)
- 組換えAAV9由来ベクターを含む、錐体視細胞に影響を及ぼす網膜疾患の治療における使用のための組成物であって、前記ベクターが、
配列番号11に記載のアミノ酸配列からなるVP1キャプシドタンパク質、配列番号12に記載の核酸配列からなるpR1.7プロモーター、及びその制御下にある目的のポリヌクレオチド
を含み、
前記網膜疾患が、加齢性黄斑変性症、バッセン-コルツヴァイク症候群、脈絡膜血症、旋回性萎縮、レフサム症候群、アッシャー症候群、色盲、青色錐体単色症、色覚異常、不完全色覚異常、乏錐体三色性、網膜色素変性症(RP)、黄斑変性症、スターガルト病、バルデット-ビードル症候群、ボーンホルム眼病、ベスト病、及びレーバー先天性黒内障から成る群から選択される、組成物。 - 目的のポリヌクレオチドが、遺伝子補充療法において使用されうる遺伝子であり、好ましくは、網膜色素変性症GTPaseレギュレーター(RPGRORF15)、CNGB3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのベータサブユニット)、CNGA3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのアルファサブユニット)又はGNAT2をコードする遺伝子から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 目的のポリヌクレオチドが、神経栄養因子をコードする、請求項1に記載の組成物。
- 目的のポリヌクレオチドが、RdCVF、RdCVF2、RdCVFL又はRdCVFL2をコードする、請求項1に記載の組成物。
- 目的のポリヌクレオチドが、ロドプシン、フォトプシン、L/M波長(赤/緑)錐体オプシン、又は短波長(S)錐体オプシン(青)といったオプシンをコードする、請求項1に記載の組成物。
- 目的のポリヌクレオチドが、配列番号13、配列番号14又は配列番号15に記載のアミノ酸配列から成るオプシンをコードする、請求項1に記載の組成物。
- 目的のポリヌクレオチドが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びCRISPR関連エンドヌクレアーゼから成る群から選択される遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする、請求項1に記載の組成物。
- 目的のポリヌクレオチドが、Cas9ヌクレアーゼをコードする、請求項1に記載の組成物。
- 目的のポリヌクレオチドが、干渉性RNA(RNAi)、特にsiRNA又はshRNAである、請求項1に記載の組成物。
- 目的のポリヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。
- 治療が、組換えAAV9由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含む、請求項1に記載の組成物。
- 網膜下送達が、中心窩から距離をおいて、前記中心窩を剥離させることなく行われる、請求項1に記載の組成物。
- 配列番号11に記載のアミノ酸配列からなるVP1キャプシドタンパク質、配列番号12に記載の核酸配列からなるpR1.7プロモーター、及びその制御下にある目的のポリヌクレオチドを含む、組換えAAV9由来ベクター。
- 目的のポリヌクレオチドが、遺伝子補充療法において使用されうる遺伝子であり、好ましくは、網膜色素変性症GTPaseレギュレーター(RPGRORF15)、CNGB3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのベータサブユニット)、CNGA3(錐体環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルのアルファサブユニット)又はGNAT2をコードする遺伝子から選択される、あるいは
目的のポリヌクレオチドが、
神経栄養因子、
RdCVF、RdCVF2、RdCVFL又はRdCVFL2、
ロドプシン、フォトプシン、L/M波長(赤/緑)錐体オプシン、又は短波長(S)錐体オプシン(青)といったオプシン、
配列番号13、配列番号14又は配列番号15に記載のアミノ酸配列から成るオプシン、
ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びCRISPR関連エンドヌクレアーゼから成る群から選択される遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼ、又は
Cas9ヌクレアーゼ
から選択されるタンパク質をコードする、あるいは
目的のポリヌクレオチドが、
干渉性RNA(RNAi)、特にsiRNAもしくはshRNA、又は
アンチセンスオリゴヌクレオチド
である、請求項13に記載の組換えAAV9由来ベクター。 - 請求項13又は14に記載の組換えAAV9由来ベクターの治療有効量の網膜下送達を含む、対象の錐体視細胞において目的のポリヌクレオチドを発現させる方法で使用するための組成物であって、請求項13又は14に記載の組換えAAV9由来ベクターを含む組成物。
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