WO2016114354A1 - 骨格筋前駆細胞の選択方法 - Google Patents

骨格筋前駆細胞の選択方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2016114354A1
WO2016114354A1 PCT/JP2016/050997 JP2016050997W WO2016114354A1 WO 2016114354 A1 WO2016114354 A1 WO 2016114354A1 JP 2016050997 W JP2016050997 W JP 2016050997W WO 2016114354 A1 WO2016114354 A1 WO 2016114354A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
mir
medium
cell
skeletal muscle
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/050997
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
博英 齊藤
誠弥 高橋
英俊 櫻井
佐藤　貴彦
了 高山
Original Assignee
国立大学法人京都大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人京都大学 filed Critical 国立大学法人京都大学
Priority to JP2016569506A priority Critical patent/JP6883791B2/ja
Priority to US15/543,513 priority patent/US10620109B2/en
Priority to EP16737425.5A priority patent/EP3246398B1/en
Publication of WO2016114354A1 publication Critical patent/WO2016114354A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1434—Optical arrangements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a technique for identifying and selecting skeletal muscle progenitor cells.
  • Expectations are directed to tissue cells derived from pluripotent stem cells for drug discovery screening and cell transplantation treatment, and many methods for inducing these tissue cells are currently being developed. However, it is difficult to induce differentiation of all cells from pluripotent stem cells uniformly into desired cells. Therefore, in order to properly use the induced cells, a technique for purifying the desired cells is important.
  • Non-patent Document 1 a purification method using an antibody with a cell surface antigen as an index has been proposed, but an appropriate cell surface antigen is not recognized in all desired cells.
  • an appropriate cell surface antigen is not recognized in all desired cells.
  • human skeletal muscle progenitor cells such cell surface antigens do not exist, which is a major issue for cell transplantation treatment (Non-patent Document 1).
  • An object of the present invention is to select a skeletal muscle progenitor cell from a group of cells containing skeletal muscle progenitor cells and other cell types, derived from pluripotent stem cells, and homogeneous from pluripotent stem cells containing the selection method. It is to provide a method for producing a skeletal muscle progenitor cell population. The object of the present invention is also to provide skeletal muscle progenitor cells suitable for transplantation.
  • the present inventors have hypothesized that cells can be identified using miRNA specifically expressed in skeletal muscle progenitor cells as an index, An mRNA whose marker protein expression is controlled by miRNA responsiveness was prepared and introduced into a group of cells including skeletal muscle progenitor cells. As a result, the skeletal muscle progenitor cells were successfully selected based on the difference in the expression of the marker protein, and the present invention was completed.
  • a method for selecting skeletal muscle progenitor cells comprising the step of introducing miRNA-responsive mRNA into a cell group, wherein the miRNA-responsive mRNA is: (i) a nucleic acid having a sequence specifically recognized by miRNAs specifically expressed in skeletal muscle progenitor cells, and (ii) a sequence comprising a nucleic acid comprising a sequence encoding a marker protein, Wherein (ii) is functionally linked to the nucleic acid of (i).
  • the miRNA specifically expressed in the skeletal muscle progenitor cell of (i) is one or more miRNA selected from the group consisting of miR-1, miR-133 and miR-206.
  • the marker protein of (ii) is one or more genes selected from the group consisting of a fluorescent protein, an apoptosis-inducing protein, and a protein encoded by a suicide gene, [1] to [3] The method according to any one.
  • the differentiation induction from the pluripotent stem cells into skeletal muscle progenitor cells includes the following steps (1) to (5): (1) culturing pluripotent stem cells in a culture medium containing a TGF- ⁇ inhibitor and a GSK3 ⁇ inhibitor; (2) a step of culturing the cells obtained in the step (1) in a culture medium containing a TGF- ⁇ inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor, IGF1, HGF and bFGF, (3) culturing the cells obtained in the step (2) in a culture medium containing a TGF- ⁇ inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor and IGF1, (4) a step of culturing the cell obtained in the step (3) in a culture solution containing a TGF- ⁇ inhibitor, IGF1 and HGF, and (5) the following steps (1) to (5): (1) culturing pl
  • a step of culturing in a culture medium containing a TGF- ⁇ inhibitor, IGF1 and serum [8]
  • the TGF- ⁇ inhibitor in the steps (1) to (5) is SB431542
  • the GSK3 ⁇ inhibitor in the step (1) is CHIR99021
  • the GSK3 ⁇ inhibitors in the steps (2) and (3) The method according to [7], wherein is LiCl.
  • a method for producing skeletal muscle progenitor cells from pluripotent stem cells comprising the following steps (1) to (3): (1) a step of producing skeletal muscle progenitor cells from pluripotent stem cells, (2) A step of introducing miRNA-responsive mRNA containing the following (i) and (ii) into the cells obtained in the step (1): (i) a nucleic acid having a sequence specifically recognized by miRNA expressed specifically in skeletal muscle progenitor cells, and (ii) a sequence comprising a nucleic acid encoding a marker protein, wherein (ii) ) Is functionally linked to the nucleic acid of (i), and (3) A step of selecting a cell in which the translation amount of the marker protein is small or cannot be detected.
  • step (1) includes the following steps (1-1) to (1-5): (1-1) culturing pluripotent stem cells in a culture medium containing a TGF- ⁇ inhibitor and a GSK3 ⁇ inhibitor; (1-2) a step of culturing the cells obtained in the step (1-1) in a culture solution containing a TGF- ⁇ inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor, IGF1, HGF and bFGF, (1-3) culturing the cells obtained in the step (1-2) in a culture medium containing a TGF- ⁇ inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor and IGF1, (1-4) a step of culturing the cells obtained in the step (1-3) in a culture solution containing a TGF- ⁇ inhibitor, IGF1 and HGF, and (1-5) of (1-4) A step of culturing the cells obtained in the step in a culture medium containing a TGF- ⁇ inhibitor, IGF1 and serum.
  • the TGF- ⁇ inhibitor in the steps (1-1) to (1-5) is SB431542, the GSK3 ⁇ inhibitor in the step (1-1) is CHIR99021, and the step (1-2) And the method according to [11], wherein the GSK3 ⁇ inhibitor of (1-3) is LiCl.
  • the method according to [11] or [12], wherein the serum of the step (1-5) is horse serum.
  • the miRNA specifically expressed in the skeletal muscle progenitor cell of (i) is one or more miRNA selected from the group consisting of miR-1, miR-133 and miR-206.
  • the marker protein of (ii) is a fluorescent protein, and further includes a step of introducing control mRNA into the cell obtained in the step (1), and the step (3) further includes the control mRNA.
  • the method according to [16] which is a step of selecting a cell into which is introduced.
  • the method of the present invention makes it possible to selectively obtain skeletal muscle progenitor cells from pluripotent stem cells.
  • FIG. 1A shows the results of quantifying the expression of miR-206 in the skeletal muscle differentiation process by forced expression of Dox-MyoD in human iPS cell lines using a quantitative RT-PCR method (qRT-PCR).
  • Dox was added to the medium until day 7, but not during day8-day9.
  • Dayday included in the sample name represents the number of days when differentiation was induced.
  • the value of iPS day10 is 1, and error bars indicate standard deviation.
  • FIG. 1B shows a schematic diagram of the miRNA switch.
  • FIG. 1C shows the results of FACS analysis of (Dox ⁇ ) Day 1 without Dox induction
  • FIG. 1D shows the results of FACS analysis of (Dox +) Day 6 with Dox induction.
  • FIGS. 2A and 2B show the results of quantification of miR-206 expression in PAX3-GFPCiPSCs (A) and MYF5-tdTomato C3 iPSCs (B) by qRT-PCR.
  • D on the horizontal axis represents the number of days from the start of differentiation induction.
  • the vertical axis shows the expression level ratio with the value at D2 being 1
  • FIG. 2B shows the expression level ratio with the value at D19 being 1. Error bars indicate standard deviation.
  • FIG. 1C and 1D the vertical axis represents the fluorescence amount of EGFP
  • the horizontal axis represents the fluorescence amount of tagBFP.
  • FIGS. 2A and 2B show the results of quantification of miR-206 expression in PAX3-GFPCiPSCs (A) and MYF5-tdTomato C3 iPSCs (B) by qRT-PCR.
  • D on the horizontal axis represents the number of days from the start of differentiation
  • FIG. 2C shows dot plots after transfection of PAX3-GFP ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ iPSCs cells on day 44 (left) and day 78 (right) of miR-206 switch.
  • the vertical axis represents tagBFP
  • the horizontal axis represents tagRFP fluorescence.
  • FIG. 2D shows a dot plot after transfection of miR-206 switch into cells on day 55 (left) and day 88 (right) of induction of differentiation of MYF5-tdTomato C3 iPSCs.
  • the vertical axis represents tagBFP
  • the horizontal axis represents EGFP fluorescence.
  • FIG. 2E shows a dot plot after transfecting miR-1 switch or miR-133 switch into cells on day 78 of induction of differentiation of PAX3-GFP iPSCs.
  • the vertical axis represents tagBFP
  • the horizontal axis represents tagRFP fluorescence.
  • FIG. 2F shows a dot plot after transfection of miR-489 switch or miR-708 switch into cells on the 88th day of differentiation induction of MYF5-tdTomato C3 iPSCs.
  • the vertical axis represents tagBFP
  • the horizontal axis represents EGFP fluorescence.
  • FIG. 3A shows a dot plot after transfection with miR-206 switch on day 84 of induction of differentiation of PAX3-GFP iPSCs.
  • FIG. 3B shows a dot plot after transfection of miR-206 switch on day 87 of induction of differentiation of MYF5-tdTomato C3 iPSCs.
  • FIG. 3C shows the miR-206 + fraction (corresponding to P2 in FIG. 3A) and the miR-206- fraction (corresponding to FIG. 3A) selected with the miR-206 switch on day 84 of induction of differentiation of PAX3-GFP3-iPSCs.
  • the result of quantifying the gene expression of MYF5 in the cell population (corresponding to P4) by qRT-PCR is shown.
  • FIG. 3D shows the results of qRT-PCR quantifying the gene expression of MYOD1 in the cell population of miR-206 + and miR-206- fractions on the 84th day after induction of differentiation of PAX3-GFP iPSCs.
  • FIG. 3E shows the result of qRT-PCR quantifying the gene expression of MYOGENIN in the cell population of miR-206 + fraction and miR-206- fraction on the 84th day after induction of differentiation of PAX3-GFP PSCs.
  • FIG. 3F shows miR-206 + fraction (corresponding to P4 in FIG. 3B) and miR-206- fraction (in FIG.
  • FIG. 3B shows the results of quantifying the gene expression of MYF5 in qRT-PCR.
  • FIG. 3G shows the results of quantifying the gene expression of MYOD1 in the miR-206 + fraction and miR-206- fraction on the 87th day of differentiation induction of Myf5-tdTomato C3 iPSCs by qRT-PCR.
  • FIG. 3H shows the result of qRT-PCR quantifying the gene expression of MYOGENIN in the miR-206 + fraction and miR-206- fraction on the 87th day after induction of differentiation of Myf5-tdTomato C3 iPSCs.
  • FIG. 4A shows a dot plot after transfection of miR-206 switch in PAX3-GFP iPSCs on day 86 of differentiation induction.
  • FIG. 4B shows dot plots in which the horizontal axis is developed with GFP in the miR-206 + fraction (corresponding to P2 in FIG. 4A) and the miR-206- fraction (corresponding to P5 in FIG. 4A), respectively.
  • FIG. 4C shows the results of quantification of MYF5 expression by qRT-PCR.
  • FIG. 4D shows the result of quantifying the expression of MYOD1 by qRT-PCR.
  • FIG. 4E shows the result of quantifying the expression of MYOGENIN by qRT-PCR.
  • FIG. 4F shows the results of quantifying PAX7 expression by qRT-PCR.
  • FIG. 4G shows the results of quantifying PAX3 expression by qRT-PCR.
  • 4B to 4G, PB7, P 6, P 4, and P 3 are miR-206- / GFP-, miR-206- / GFP +, miR-206 + / GFP-, and miR-, respectively. Means 206 + / GFP +.
  • FIG. 5A shows the fluorescence image of the cells (miR-206 + (A)) stained with MHC antibody and Hoechst after isolating the miR-206 fraction at 95 days after induction of differentiation of MYF5-tdTomato C3 iPSCs. Indicates.
  • FIG. 5B shows the fluorescence of cells stained with MHC antibody and Hoechst for 8 days after the miR-206- fraction was isolated on day 95 of differentiation induction of MYF5-tdTomato C3 iPSCs (miR-206- (B)). Show the image.
  • FIG. 5A shows the fluorescence image of the cells (miR-206 + (A)) stained with MHC antibody and Hoechst after isolating the miR-206 fraction at 95 days after induction of differentiation of MYF5-tdTomato C3 iPSCs. Indicates.
  • FIG. 5B shows the fluorescence of cells stained with MHC antibody and Hoechst for 8 days after
  • 5C shows cells that were cultured for 8 days (5-day skeletal muscle progenitor cell culture and 3-day skeletal muscle differentiation culture) after isolating the miR-206 + fraction on day 95 of induction of differentiation of MYF5-tdTomato C3 iPSCs ( The fluorescence image dye
  • FIG. 1 The fluorescence image dye
  • FIG. 5D shows cells that were cultured for 8 days (5-day skeletal muscle progenitor cell culture and 3-day skeletal muscle differentiation culture) after isolating the miR-206- fraction on day 95 of induction of differentiation of MYF5-tdTomatoToC3 iPSCs ( The fluorescence image dye
  • FIG. 5E shows MHC positive rates in miR-206 + (A), miR-206- (B), miR-206 + (C) and miR-206- (D). The MHC positive rate is expressed as the ratio of the number of MHC positive cells to the number of cells stained with Hoechst.
  • FIG. 5E shows MHC positive rates in miR-206 + (A), miR-206- (B), miR-206 + (C) and miR-206- (D).
  • the MHC positive rate is expressed as the ratio of the number of MHC positive cells to the number of cells stained with Hoechs
  • FIG. 6A shows a dot plot after transfection of miR-206 switch on day 86 of induction of differentiation of disease iPS cell line.
  • FIG. 6B shows a dot plot after transfection of miR-206 switch on day 95 of 201B7 differentiation induction.
  • FIG.6C shows miR-206 + fraction selected by miR-206 switch on day 86 of induction of differentiation of disease iPS cell line (corresponding to P2 in FIG. 6A) and miR-206- fraction (FIG. 6A). The result of quantifying the gene expression of MYF5 in (corresponding to P3) by qRT-PCR is shown.
  • FIG. 6A shows a dot plot after transfection of miR-206 switch on day 86 of induction of differentiation of disease iPS cell line.
  • FIG. 6C shows miR-206 + fraction selected by miR-206 switch on day 86 of induction of differentiation of disease iPS cell line (corresponding to P2 in FIG. 6A) and miR-206- fraction (FIG.
  • FIG. 6D shows the result of qRT-PCR quantifying the gene expression of MYOD1 in miR-206 + and miR-206- on the 86th day after induction of differentiation of the disease iPS cell line.
  • FIG. 6E shows the results of quantifying MYOGENIN gene expression in miR-206 + and miR-206- on day 86 of induction of differentiation of disease iPS cell lines by qRT-PCR.
  • FIG. 6F shows the result of qRT-PCR quantifying the gene expression of MYF5 in the miR-206 + fraction and miR-206- fraction selected with the miR-206 switch on day 95 of 201B7 differentiation induction.
  • FIG. 6G shows the result of quantifying the gene expression of MYOD1 in the miR-206 + cell population and the miR-206- cell population on day 95 of 201B7 differentiation induction by qRT-PCR.
  • FIG. 6H shows the result of qRT-PCR quantifying the gene expression of MYOGENIN in the miR-206 + fraction and miR-206- fraction on day 95 of 201B7 differentiation induction.
  • the vertical axis indicates the expression level ratio with the expression level of the miR-206- fraction as 1, and the error bar indicates the standard deviation.
  • FIG. 7A shows a fluorescence image obtained by staining the fraction of miR-206 + on day 86 of induction of differentiation of a disease iPS cell line with antibodies of MYOD1 and PAX7 and Hoechst.
  • FIG. 7B shows a fluorescence image obtained by staining the miR-206- cell population on the 86th day after induction of differentiation of the disease iPS cell line with MYOD1, PAX7 antibody and Hoechst.
  • FIG. 7C is a graph showing the MYOD1 positive rate, PAX7 positive rate, and MYOD1 + PAX7 positive rate in miR-206 + and miR-206-. Each positive rate is expressed as the ratio of the number of positive cells to the number of cells stained with Hoechst.
  • the present invention provides a method for selecting skeletal muscle progenitor cells, which comprises the step of introducing miRNA-responsive mRNA into a cell group.
  • the miRNA-responsive mRNA is introduced, and the cell group to be selected may be any cell group that can contain skeletal muscle progenitor cells.
  • the cell group to be selected may be any cell group that can contain skeletal muscle progenitor cells.
  • it may be a group of cells induced to differentiate from pluripotent stem cells to skeletal muscle progenitor cells, or a group of cells taken out from the living body, but is not limited thereto. Therefore, miRNA-responsive mRNA may be introduced into a group of cells whose skeletal muscle progenitor cells are unknown.
  • the cell group may be a cell group induced to differentiate from pluripotent stem cells to skeletal muscle progenitor cells.
  • a cell group that has been induced to differentiate from pluripotent stem cells to skeletal muscle progenitor cells is a cell group that has undergone a process of inducing differentiation from pluripotent stem cells to skeletal muscle progenitor cells by a method that will be described in detail later.
  • cells that have become skeletal muscle progenitor cells by the induction of and cells differentiated into cell types other than skeletal muscle progenitor cells can be contained.
  • skeletal muscle means mature muscle and includes muscle fibers, that is, myocytes that are multinucleated cells.
  • skeletal muscle progenitor cell means a cell that has not reached mature muscle cells but is in its previous stage and has the ability to selectively differentiate into muscle cells.
  • skeletal muscle progenitor cells do not mean that they have no ability to differentiate into other mesoderm cells such as osteoblasts and adipocytes, and in some cases, differentiation into cells other than muscle cells. Cells having ability can also be included in the skeletal muscle progenitor cells of the present invention.
  • Skeletal muscle progenitor cells are characterized by the expression of specific genes, e.g., at least selected from MyoD, Myf5, Pax7, Myogenin, myosin heavy chain, NCAM, Desmin, SkMAct, MF20, M-Cadherin, Fgfr4 and VCAME1 It can be identified by detecting the expression of one marker gene.
  • the skeletal muscle progenitor cells in the present invention can be preferably Myf5-positive cells, more preferably Myf5 and Pax7-positive cells.
  • Skeletal muscle progenitor cells in the present invention include skeletal muscle stem cells or satellite cells unless otherwise specified.
  • miRNA-responsive mRNA means (i) a nucleic acid containing a sequence specifically recognized by miRNA expressed specifically in skeletal muscle progenitor cells (hereinafter referred to as miRNA target sequence), and (ii) ) An mRNA comprising a nucleic acid comprising a sequence encoding a marker protein and operably linked so that translation of the marker protein of (ii) is controlled by the nucleic acid sequence of (i).
  • that being controlled by the nucleic acid sequence of (i) means that miRNA-responsive mRNA inhibits or degrades translation according to the abundance of miRNA specifically expressed in skeletal muscle progenitor cells. This means that the translation amount of the marker protein is suppressed.
  • the “miRNA” in the present invention is a short non-coding RNA (20-25 bases) existing in cells involved in regulation of gene expression through inhibition of translation from mRNA to protein and degradation of mRNA. .
  • This miRNA is transcribed from DNA as a single-stranded pri-miRNA that can take a hairpin loop structure including miRNA and its complementary strand, and a part of it is cleaved by an enzyme called Drosha in the nucleus. After being transported out of the nucleus, it is further cleaved by Dicer and functions.
  • miRNA specifically expressed in skeletal muscle progenitor cells used in the present invention is expressed higher in skeletal muscle progenitor cells than in cells other than skeletal muscle progenitor cells. If it is miRNA which has, it will not specifically limit. For example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more in skeletal muscle progenitor cells compared to cells other than skeletal muscle progenitor cells However, it may be miRNA that is highly expressed at a rate of 90% or more, but is not limited thereto.
  • miRNAs are listed in database information (for example, http://www.mirbase.org/ or http://www.microrna.org/) and / or described in the database. It can select suitably from miRNA described in literature information.
  • the “miRNA specifically expressed in skeletal muscle progenitor cells” in the above (i) is preferably a short gene generated from hsa-miR-1, hsa-miR-133 and hsa-miR-206.
  • RNAs also referred to as miR-1, miR-133 and miR-206, respectively
  • miR-1 is hsa-miR-1-3p
  • miR- 133 is hsa-miR-133a-3p
  • the miRNA specifically expressed in a preferred skeletal muscle progenitor cell is hsa-miR-206 (SEQ ID NO: 3).
  • RNA -It means that miRNA exists in the state of forming induced-silencing complex (RISC).
  • the target sequence of miRNA is preferably, for example, a sequence that is completely complementary to the miRNA.
  • the miRNA target sequence may have a mismatch (mismatch) with a completely complementary sequence as long as it can be recognized in the miRNA.
  • the mismatch from the sequence that is completely complementary to the miRNA may be any mismatch that can be normally recognized by the miRNA in the desired cell, and the mismatch of about 40 to 50% in the original function in the cell in vivo. There may be.
  • Such mismatch is not particularly limited, but 1 base, 2 bases, 3 bases, 4 bases, 5 bases, 6 bases, 7 bases, 8 bases, 9 bases, or 10 bases or 1% of the total recognition sequence, 5% %, 10%, 20%, 30%, or 40% discrepancy.
  • mRNA ⁇ / RTI> provided by the cell, in particular, on the part other than the seed region, i.e., on the 5 'side in the target sequence, corresponding to about 3' side 16 base of the miRNA
  • a region may contain a number of mismatches, and portions of the seed region may contain no mismatches, or may contain 1 base, 2 bases, or 3 bases mismatches.
  • Such a sequence may be a base length including the number of bases to which the RISC specifically binds, and the length is not particularly limited, but is preferably a sequence of 18 bases or more and less than 24 bases, more preferably It is a sequence of 20 bases or more and less than 22 bases.
  • the miRNA target sequence introduces miRNA-responsive mRNA having the sequence into cells other than skeletal muscle progenitor cells and skeletal muscle progenitor cells, and translation of the corresponding marker protein is suppressed only in skeletal muscle progenitor cells. By confirming this, it can be appropriately determined and used.
  • preferred miRNA target sequences corresponding to “miRNA specifically expressed in skeletal muscle progenitor cells” are exemplified in Table 1.
  • the “marker protein” used in the present invention is an arbitrary protein that is translated in a cell, functions as a marker, and enables cell selection.
  • proteins that can be translated into cells and function as markers include fluorescent proteins, photoproteins, proteins that assist fluorescence, luminescence or color, membrane proteins, apoptosis-inducing proteins, or suicide proteins. However, it is not limited to these.
  • fluorescent proteins include blue fluorescent proteins such as Sirius, TagBFP, and EBFP; cyan fluorescent proteins such as mTurquoise, TagCFP, AmCyan, mTFP1, MidoriishiCyan, and CFP; TurboGFP, AcGFP, TagGFP, Azami-Green (for example, hmAG1 ), Green fluorescent proteins such as ZsGreen, EmGFP, EGFP, GFP2, HyPer; yellow fluorescent proteins such as TagYFP, EYFP, Venus, YFP, PhiYFP, PhiYFP-m, TurboYFP, ZsYellow, mBanana; KusabiraOrange (eg, hmKO2), mOrange Orange fluorescent proteins such as: TurboRFP, DsRed-Express, DsRed2, TagRFP, DsRed-Monomer, AsRed2, mStrawberry and other red fluorescent proteins; TurboFP602, mRFP1, JRed, KillerRed, m
  • the photoprotein can be exemplified by aequorin, but is not limited thereto.
  • proteins that assist fluorescence, luminescence, or coloration include, but are not limited to, enzymes that degrade fluorescence, luminescence, or color precursors such as luciferase, phosphatase, peroxidase, and ⁇ -lactamase.
  • a protein that assists fluorescence, luminescence, or coloration is used as a marker
  • the corresponding precursor is brought into contact with the cell group, or the cell group corresponds. This can be done by introducing a precursor.
  • the apoptosis-inducing protein means a protein having apoptosis-inducing activity for cells.
  • a suicide protein means a protein whose expression in a cell is lethal to the cell.
  • a suicide protein may be one that causes cell death by itself (eg, diphtheria A toxin) or that makes the cell sensitive to a particular drug (eg, simple Herpes thymidine kinase may make cells sensitive to antiviral compounds).
  • suicide proteins include diphtheria A toxin, herpes simplex thymidine kinase (HSV-TK), carboxypeptidase G2 (CPG2), carboxylesterase (CA), cytosine deaminase (CD), cytochrome P450 (cyt-450), deoxycytidine kinase (DCK), nitroreductase (NR), purine nucleoside phosphorylase (PNP), thymidine phosphorylase (TP), varicella-zoster virus thymidine kinase (VZV-TK), xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (XGPRT) and the like. It is not limited to these.
  • the marker protein may have a localization signal.
  • the localization signal include a nuclear localization signal, a cell membrane localization signal, a mitochondrial localization signal, a protein secretion signal, and the like.
  • a classical nuclear translocation sequence (NLS), M9 Examples include, but are not limited to, sequences, mitochondrial target sequence (MTS), and endoplasmic reticulum translocation sequences.
  • Such a localization signal is particularly advantageous when cells are selected on an image by imaging cytometry or the like described later.
  • the translation of the marker protein of (ii) is operably linked so as to be controlled by the nucleic acid sequence of (i).
  • the miRNA-responsive mRNA preferably comprises a Cap structure (7-methylguanosine 5′-phosphate), an open reading frame encoding a marker protein, and a poly A tail in the 5 ′ to 3 ′ direction from the 5 ′ end. It comprises at least one miRNA target sequence in the 5′UTR, in the 3′UTR, and / or in the open reading frame.
  • the position of the target sequence of miRNA in mRNA may be 5′UTR or 3′UTR, may be within the open reading frame (3 ′ side of the start codon), and all of these include miRNA
  • the target sequence may be provided.
  • the number of miRNA target sequences may be one, two, three, four, five, six, seven, eight or more.
  • the nucleic acids (i) and (ii) are linked in this order in the 5 ′ to 3 ′ direction. Therefore, only one miRNA target sequence needs to be present in the 5 'UTR. This is because efficient translation suppression can be achieved.
  • the number of bases and the kind of base between the cap structure and the target sequence of miRNA may be arbitrary as long as they do not constitute a stem structure or a three-dimensional structure.
  • the number of bases between the cap structure and the miRNA target sequence can be designed to be 0 to 50 bases, preferably 10 to 30 bases.
  • the number of bases and the type of base between the miRNA target sequence and the start codon may be arbitrary as long as they do not constitute a stem structure or a three-dimensional structure, and the number of bases between the miRNA target sequence and the start codon is 0. It can be designed with an arrangement of -50 bases, preferably 10-30 bases.
  • an AUG serving as a start codon does not exist in the miRNA target sequence in the miRNA-responsive mRNA.
  • the target sequence of miRNA when the target sequence of miRNA is present in the 5 ′ UTR and AUG is included in the target sequence, the target sequence is in-frame in relation to the sequence encoding the marker protein linked to the 3 ′ side. It is preferable to be designed as follows.
  • AUG in the target sequence can be converted to GUG and used.
  • the location of the target sequence in the 5'UTR can be changed as appropriate.
  • the number of bases between the cap structure and the AUG sequence in the target sequence is 0 to 60 bases, for example, 0 to 15 bases, 10 to 20 bases, 20 to 30 bases, 30 to 40 bases, 40 to 50 bases , Can be designed in an arrangement of 50 to 60 bases.
  • the mRNA in the present invention preferably contains a modified base such as pseudouridine or 5-methylcytidine instead of ordinary uridine or cytidine for the purpose of reducing cytotoxicity.
  • a modified base such as pseudouridine or 5-methylcytidine instead of ordinary uridine or cytidine for the purpose of reducing cytotoxicity.
  • the positions of the modified bases can be all or part of the uridine and cytidine independently, and if they are part of the base, they can be random positions at an arbitrary ratio.
  • the miRNA target sequence when the miRNA target sequence is present in the 5'UTR, for example, the sequences shown in Table 2 below may be employed, but there are no particular limitations except for the miRNA target sequence.
  • miRNA-responsive mRNA is required for translating the marker protein.
  • the downstream of the sequence encoding the marker protein (that is, 3′UTR) is not particularly limited as long as it has a polyA sequence.
  • the miRNA target sequence is present in the 5′UTR, for example, the following table The sequence described in 3 can be employed.
  • the miRNA-responsive mRNA can be synthesized by those skilled in the art by any method known in genetic engineering if the sequence is determined according to the above. In particular, it can be obtained by an in vitro synthesis method using a template DNA containing a promoter sequence as a template.
  • a screening step for examining the effectiveness of the selection may be performed. Specifically, a plurality of candidate miRNA-responsive mRNAs having 5 ′ UTR as exemplified above are prepared, and each is introduced into a group of skeletal muscle progenitor cells of known purity for effective selection. It is possible to determine a target sequence of miRNA having high specificity and miRNA-responsive mRNA. Such a process is also described in detail in the examples.
  • the selection of skeletal muscle progenitor cells of the present invention includes a step of introducing miRNA-responsive mRNA into a cell group, and a step of selecting cells in which the translation amount of the marker protein contained in the miRNA-responsive mRNA is low or undetectable.
  • miRNA-responsive mRNA Only one type of miRNA-responsive mRNA to be introduced may be used, or two or more types, for example, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 types may be used.
  • two or more miRNA-responsive mRNAs it is desirable that each miRNA-responsive mRNA is different for both the miRNA target sequence and the marker protein.
  • the number of miRNA target sequences contained in the miRNA-responsive mRNA, the distance from the 5 ′ end of the miRNA target sequence, and other structural features of the miRNA-responsive mRNA are as follows: Each miRNA-responsive mRNA may be the same or different.
  • miRNA-responsive mRNA that has the same miRNA target sequence but a different marker protein.
  • a nucleic acid containing a sequence encoding an apoptosis-inducing protein that signals by different pathways for example, miRNA-responsive mRNA in which Fas and Bim are combined with the same miRNA target sequence. It can be expected that cells other than skeletal muscle progenitor cells will be efficiently removed.
  • the step of introducing miRNA-responsive mRNA into a cell group is performed using a lipofection method, a liposome method, an electroporation method, a calcium phosphate coprecipitation method, a DEAE dextran method, a microinjection method, a gene gun method, etc. More than one species of miRNA-responsive mRNA is directly introduced into cells included in the cell group.
  • a plurality of mRNAs Is preferably co-introduced into the cell population.
  • the introduction amount at this time varies depending on the cell group to be introduced, the mRNA to be introduced, the introduction method and the kind of the introduction reagent, and those skilled in the art can appropriately select these in order to obtain a desired translation amount.
  • control mRNA is an mRNA containing a sequence encoding a marker protein other than the marker protein contained in the miRNA-responsive mRNA or a sequence encoding a drug resistance protein, and does not have a miRNA target site.
  • An example is mRNA.
  • the marker protein translated from the control mRNA is preferably a protein that does not cause cell death due to translation of the marker protein. Therefore, fluorescent proteins, photoproteins, proteins that assist fluorescence, luminescence, or coloration, and membrane proteins are preferably used. It is done.
  • the “drug resistant protein” used in the present invention may be any protein as long as it is resistant to the corresponding drug.
  • examples include, but are not limited to, proteins encoded by antibiotic resistance genes.
  • antibiotic resistance genes include kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, blasticidin resistance gene, gentamicin resistance gene, kanamycin resistance gene, tetracycline resistance gene, chloramphenicol resistance gene, etc. .
  • a puromycin resistance gene or a blasticidin resistance gene is used as the antibiotic resistance gene.
  • the selection method according to one embodiment of the present invention includes a step of simultaneously introducing miRNA-responsive mRNA and control mRNA into a target cell group. Such a step can be preferably carried out by co-introduction of miRNA-responsive mRNA and control mRNA.
  • control mRNA By using control mRNA, cells with low or non-translated marker protein translated from miRNA-responsive mRNA can be selected as skeletal muscle progenitor cells even when the efficiency of miRNA-responsive mRNA introduction into cells is low It becomes.
  • control mRNA when control mRNA is used, those skilled in the art can appropriately select the amount of control mRNA introduced to obtain a desired translation amount.
  • the marker protein translated from the control mRNA is preferably different from the marker protein contained in the miRNA-responsive mRNA.
  • the marker protein contained in the miRNA-responsive mRNA is an apoptosis-inducing protein
  • the marker protein contained in the control mRNA can be a fluorescent protein.
  • cells that survive with suppressed expression of apoptosis-inducing protein can be selected as skeletal muscle progenitor cells.
  • a control mRNA containing a sequence encoding a drug resistance protein can be used together with an miRNA-responsive mRNA that translates any marker protein.
  • an miRNA-responsive mRNA that translates any marker protein among cells that are resistant to the corresponding drug, cells that do not express or reduce the marker protein can be selected as skeletal muscle progenitor cells.
  • the marker protein contained in the miRNA-responsive mRNA and the marker protein contained in the control mRNA are fluorescent proteins, it is desirable that the fluorescent wavelengths of the two fluorescent proteins are different.
  • control mRNA in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include EGFP-RNA, tagBFP-RNA, tagRFP-RNA as shown in the Examples.
  • the step of selecting cells in which the translation amount of the marker protein contained in the miRNA-responsive mRNA is low or undetectable can be performed by detecting a signal from the marker protein using a predetermined detection device.
  • a predetermined detection device include, but are not limited to, a flow cytometer, an imaging cytometer, a fluorescence microscope, a light emission microscope, and a CCD camera.
  • the detection apparatus those suitable for those skilled in the art can be used depending on the marker protein.
  • the marker when it is a fluorescent protein or a luminescent protein, it can be selected using a flow cytometer, and when the marker is a protein that assists fluorescence, luminescence or coloration, using a microscope, Using a culture dish coated with photo-responsive cell culture equipment, light can be applied to colored cells, and the cells that have not been irradiated can be separated from the culture dish and sorted.
  • the protein is a membrane-localized protein
  • a cell surface protein-specific detection reagent such as an antibody and a marker protein quantification method using the above-described detection device
  • a magnetic cell separation device MCS It is possible to isolate cells without the marker protein quantification process, and when the marker protein is a drug resistance gene, By detecting the expression of the protein, it is possible method of isolating live cells.
  • sorting cells means isolating skeletal muscle progenitor cells with higher purity than a cell group that has not undergone the step of sorting using miRNA-responsive mRNA.
  • the purity of the selected cells is not particularly limited as long as it is high purity as compared with the case where it does not undergo the step of selecting using miRNA-responsive mRNA, but it is preferably 60% or more, %, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, Examples are 95%, 96%, 97%, 98%, 99% and 100%.
  • the pluripotent stem cell that can be used in the present invention is a stem cell that has pluripotency that can be differentiated into all cells existing in a living body and also has a proliferative ability.
  • ES embryonic stem
  • GS sperm stem
  • EG embryonic germ
  • iPS induced pluripotent stem
  • embryonicity derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer Stem (ntES) cells, Muse cells and the like are included.
  • Preferred pluripotent stem cells are ES cells, iPS cells, and ntES cells, and more preferably human ES cells and human iPS cells, and more preferably human iPS cells, from the viewpoint of use in the treatment of myogenic diseases. It is.
  • Embryonic stem cells ES cells are stem cells established from the inner cell mass of early embryos (for example, blastocysts) of mammals such as humans and mice, and having pluripotency and proliferation ability by self-replication.
  • ES cells are embryonic stem cells derived from the inner cell mass of the blastocyst, the embryo after the morula, in the 8-cell stage of a fertilized egg, and have the ability to differentiate into any cell that constitutes an adult, so-called differentiation. And ability to proliferate by self-replication.
  • ES cells were discovered in mice in 1981 (MJ Evans and MH Kaufman (1981), Nature 292: 154-156), and then ES cell lines were established in primates such as humans and monkeys (JA Thomson et al. (1998), Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848; JA Thomson et al. (1996), Biol. Reprod 55: 254-259; JA JA Thomson and VS Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165).
  • ES cells can be established by taking an inner cell mass from a blastocyst of a fertilized egg of a target animal and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder. In addition, maintenance of cells by subculture is performed using a culture solution to which substances such as leukemia inhibitory factor (LIF) and basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor (bFGF)) are added. It can be carried out.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • DMEM / F-12 culture medium supplemented with 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 2 mM L-glutamic acid, 20% KSR and 4 ng / ml bFGF is used as the culture medium for ES cell production.
  • Human ES cells can be maintained in a humid atmosphere of 37 ° C., 2% CO 2 /98% air (O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 215-224).
  • ES cells also need to be passaged every 3-4 days, where passage is eg 0.25% trypsin and 0.1 mg / ml collagenase IV in PBS containing 1 mM CaCl 2 and 20% KSR. Can be used.
  • ES cells can be generally selected by Real-Time PCR using the expression of gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog as an index.
  • gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog
  • OCT-3 / 4, NANOG, and ECAD can be used as an index (E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 443). -452).
  • Human ES cell lines for example, WA01 (H1) and WA09 (H9) are obtained from the WiCell Research Institute, and KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are obtained from the Institute of Regenerative Medicine (Kyoto, Japan), Kyoto University Is possible.
  • sperm stem cells are testis-derived pluripotent stem cells that are the origin of spermatogenesis. Like ES cells, these cells can be induced to differentiate into various types of cells, and have characteristics such as the ability to create chimeric mice when transplanted into mouse blastocysts (M. Kanatsu-Shinohara et al. ( 2003) Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012).
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • Embryonic germ cells are cells that are established from embryonic primordial germ cells and have the same pluripotency as ES cells, such as LIF, bFGF, stem cell factor, etc. It can be established by culturing primordial germ cells in the presence of these substances (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847; JL Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550 -551).
  • iPS Artificial pluripotent stem cells
  • somatic cells in the form of DNA or protein, which is almost equivalent to ES cells
  • It is an artificial stem cell derived from a somatic cell having the characteristics of, for example, differentiation pluripotency and proliferation ability by self-replication (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol.
  • the reprogramming factor is a gene that is specifically expressed in ES cells, its gene product or non-coding RNA, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-coding RNA, or It may be constituted by a low molecular compound.
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • the reprogramming factors include histone deacetylase (HDAC) inhibitors [for example, small molecule inhibitors such as valproate (VPA), trichostatin A, sodium butyrate, MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg Nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene) etc.], MEK inhibitors (eg PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901), Glycogen synthase-kinase 3 inhibitors (eg, Bio and CHIR99021), DNA methyltransferase inhibitors (eg, 5-azacytidine), histone methyltransferase inhibitors (eg, small molecule inhibitors such as BIX-01294, Suv39hl, Suv39h2, SetDBl and G9a nucleic acid expression inhibitors such as siRNA and
  • the reprogramming factor may be introduced into a somatic cell by a technique such as lipofection, fusion with a cell membrane-permeable peptide (for example, TAT and polyarginine derived from HIV), or microinjection.
  • a cell membrane-permeable peptide for example, TAT and polyarginine derived from HIV
  • DNA it can be introduced into somatic cells by techniques such as vectors such as viruses, plasmids, artificial chromosomes, lipofection, liposomes, and microinjection.
  • viral vectors examples include retroviral vectors and lentiviral vectors (above, Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (WO 2010/008054) and the like.
  • artificial chromosome vectors examples include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC).
  • a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, enhancer, ribosome binding sequence, terminator, polyadenylation site, etc. so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • Selective marker sequences such as kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, etc. Can be included.
  • the above vector has a LoxP sequence before and after the introduction of the gene into a somatic cell in order to excise the gene or promoter encoding the reprogramming factor and the gene encoding the reprogramming factor that binds to it. May be.
  • RNA it may be introduced into somatic cells by techniques such as lipofection and microinjection, and in order to suppress degradation, RNA incorporating 5-methylcytidine and pseudouridine® (TriLink® Biotechnologies) is used. Yes (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630).
  • culture media for iPS cell induction examples include DMEM, DMEM / F12, or DME culture media containing 10-15% FBS (these culture media include LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine). , Non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc.) or commercially available culture media (eg, culture media for mouse ES cell culture (TX-WES culture solution, Thrombo X), primate ES cells) Culture medium for culture (primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free medium (mTeSR, Stemcell Technology).
  • the somatic cell and the reprogramming factor are contacted on DMEM or DMEM / F12 containing 10% FBS for about 4 to 7 days. Then, re-spread the cells on feeder cells (e.g., mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and use bFGF-containing primate ES cell culture medium about 10 days after contact of the somatic cells with the reprogramming factor. Culturing and generating iPS-like colonies about 30 to about 45 days or more after the contact.
  • feeder cells e.g., mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • 10% FBS-containing DMEM culture medium including LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • 5% CO 2 at 37 ° C. can contain puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc.
  • somatic cells to be reprogrammed themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One.
  • extracellular matrix eg, Laminin- 5 (WO2009 / 123349) and Matrigel (BD)
  • a method of culturing using a medium not containing serum is also exemplified (Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci USA 106.15720-15725).
  • iPS cells may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237 -241 or WO2010 / 013845).
  • the culture medium is exchanged with a fresh culture medium once a day from the second day onward.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
  • IPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • a drug resistance gene that is expressed in conjunction with a gene that is expressed when somatic cells are initialized for example, Oct3 / 4, Nanog
  • a culture solution containing the corresponding drug selection The established iPS cells can be selected by culturing with the culture medium.
  • the marker gene is a fluorescent protein gene
  • iPS cells are selected by observing with a fluorescence microscope, in the case of a luminescent enzyme gene, by adding a luminescent substrate, and in the case of a chromogenic enzyme gene, by adding a chromogenic substrate can do.
  • the term “somatic cell” refers to any animal cell (preferably, a mammalian cell including a human) except a germ line cell such as an egg, oocyte, ES cell, or totipotent cell.
  • Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells. , Passage cells, and established cell lines.
  • somatic cells include, for example, (1) neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, tissue stem cells such as dental pulp stem cells (somatic stem cells), (2) tissue progenitor cells, (3) lymphocytes, epithelium Cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, enterocytes, spleen cells, pancreatic cells (exocrine pancreas cells, etc.), brain cells, lung cells, kidney cells Examples thereof include differentiated cells such as fat cells.
  • the mammal individual from which somatic cells are collected is not particularly limited, but is preferably a human.
  • somatic cells should be collected from the patient or another person with the same or substantially the same HLA type from the viewpoint that no rejection occurs.
  • the type of HLA is “substantially the same” means that when the cells obtained by inducing differentiation from iPS cells derived from the somatic cells are transplanted into a patient by using an immunosuppressant or the like, the transplanted cells are This means that the HLA types match to the extent that they can be engrafted.
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci plus HLA-C) are the same (hereinafter the same).
  • E Cloned embryo-derived ES cells obtained by nuclear transfer ntES cells are cloned embryo-derived ES cells prepared by nuclear transfer technology and have almost the same characteristics as ES cells derived from fertilized eggs (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72: 932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450: 497-502).
  • an ES cell established from an inner cell mass of a blastocyst derived from a cloned embryo obtained by replacing the nucleus of an unfertilized egg with a somatic cell nucleus is an ntES (nuclear transfer ES) cell.
  • ntES nuclear transfer ES
  • nuclear transfer technology JB Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16: 642-646) and ES cell production technology (above) are used (Kiyaka Wakayama et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (extra number) , 47-52).
  • Nuclear transfer can be initialized by injecting a somatic cell nucleus into a mammal's enucleated unfertilized egg and culturing for several hours.
  • Muse cells are pluripotent stem cells produced by the method described in WO2011 / 007900. Specifically, fibroblasts or bone marrow stromal cells are treated with trypsin for a long time, preferably 8 or 16 hours. It is a pluripotent cell obtained by suspension culture after treatment, and is positive for SSEA-3 and CD105.
  • a method comprising the following steps can be used; (1) culturing pluripotent stem cells in a culture medium containing a TGF- ⁇ inhibitor and a GSK3 ⁇ inhibitor; (2) a step of culturing the cells obtained in the step (1) in a culture medium containing a TGF- ⁇ inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor, IGF1, HGF and bFGF, (3) culturing the cells obtained in the step (2) in a culture medium containing a TGF- ⁇ inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor and IGF1, (4) a step of culturing the cell obtained in the step (3) in a culture solution containing a TGF- ⁇ inhibitor, IGF1 and HGF, and (5) the cell obtained in the step (4).
  • This step may include a step of culturing pluripotent stem cells prior to induction of differentiation from pluripotent stem cells to skeletal muscle progenitor cells.
  • pluripotent stem cells may be isolated by any method and cultured by suspension culture, or may be cultured by adhesion culture using a coated culture dish.
  • adhesion culture is preferably used.
  • a method for separating pluripotent stem cells for example, a method of separating mechanically, a separation solution having protease activity and collagenase activity (for example, Accutase (TM) and Accumax (TM)) or only collagenase activity is used.
  • TM Accutase
  • TM Accutase
  • TM Accumax
  • a separation method using a separation solution a dissociation method using Trypsin / EDTA, and the like.
  • a method of dissociating cells using Trypsin / EDTA is used.
  • the floating culture means that an embryoid body is formed by culturing cells in a non-adhering state on a culture dish, and is not particularly limited.
  • artificial culture is intended to improve adhesion to cells.
  • Culture dishes that have not been treated (eg, coated with an extracellular matrix) or artificially suppressed adhesion (eg, coated with polyhydroxyethyl methacrylic acid (poly-HEMA)) Can be done using.
  • the adhesion culture can be performed by culturing on a feeder cell or using a culture vessel coated with an extracellular matrix.
  • the coating treatment can be performed by placing a solution containing an extracellular matrix in a culture container and then removing the solution as appropriate.
  • the feeder cell means another cell that plays an auxiliary role used for adjusting the culture condition of the target cell.
  • the extracellular matrix is a supramolecular structure existing outside the cell and may be naturally derived or an artificial product (recombinant). Examples thereof include substances such as collagen, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, tenascin, entactin, elastin, fibrillin, laminin or fragments thereof.
  • These extracellular substrates may be used in combination, and may be prepared from cells such as BD-Matrigel (TM). Examples of the artifact include laminin fragments.
  • laminin is a protein having a heterotrimeric structure having one ⁇ chain, one ⁇ chain, and one ⁇ chain, and is not particularly limited.
  • the ⁇ chain includes ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, It is ⁇ 4 or ⁇ 5, the ⁇ chain is ⁇ 1, ⁇ 2 or ⁇ 3, and the ⁇ chain is exemplified by ⁇ 1, ⁇ 2 or ⁇ 3.
  • the laminin fragment is not particularly limited as long as it is a laminin fragment having integrin-binding activity, and examples thereof include an E8 fragment which is a fragment obtained by digestion with elastase.
  • the step of culturing pluripotent stem cells is preferably adhesion culture, and the adhesion culture is a culture vessel coated with Matrigel (TM). Can be an adherent culture.
  • the culture medium to be used can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • basal medium examples include IMDM medium, MediumMedi199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 medium , RPMI-base medium, mTeSR1 and mixed media thereof.
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham's F12 medium Ham's F12 medium
  • RPMI 1640 medium Fischer's medium
  • StemPro34 medium RPMI-base medium
  • mTeSR1 is preferably used.
  • the medium may contain serum or may be serum-free.
  • the medium can be, for example, albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen It may contain one or more serum replacements such as precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol (2ME), thiol glycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, It may also contain one or more substances such as growth factors, small molecule compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • the culture period of the step of culturing pluripotent stem cells is exemplified by 1 day or more and 10 days or less, for example, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 Day, 10 days, etc., preferably 4 days.
  • the medium contains a ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho kinase (ROCK).
  • ROCK Rho kinase
  • Y-27632 can be preferably used in the present invention.
  • the concentration of Y-27632 in the medium is not particularly limited, but preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, for example, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 11 ⁇ M, 12 ⁇ M, 13 ⁇ M, 14 ⁇ M , 15 ⁇ M, 16 ⁇ M, 17 ⁇ M, 18 ⁇ M, 19 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 35 ⁇ M, 40 ⁇ M, 45 ⁇ M, and 50 ⁇ M, but are not limited thereto. More preferably, it is 10 ⁇ M.
  • the period during which the ROCK inhibitor is added to the medium may be the culture period of the step of culturing pluripotent stem cells, and may be a period that suppresses cell death at the time of single dispersion, for example, at least 1 Day.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably 5%.
  • the medium can be changed during the culture period.
  • the medium used for the medium exchange may be a medium having the same components as the medium before the medium exchange or a medium having different components.
  • a medium having the same components is used.
  • the timing of the medium exchange is not particularly limited, but is performed, for example, every 1 day, every 2 days, every 3 days, every 4 days, or every 5 days after the start of cultivation with a fresh medium.
  • the medium exchange is preferably performed every 2 days.
  • Step (1) Step of culturing pluripotent stem cells in a culture solution containing a TGF- ⁇ inhibitor and a GSK3 ⁇ inhibitor
  • This step (1) is a step of culturing pluripotent stem cells with a TGF- ⁇ inhibitor and a GSK3 ⁇ inhibitor. It is the process of culturing in the culture solution containing.
  • the culture solution used in this step (1) can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • IMDM medium for example, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 (invitrogen) , RPMI-base medium, and mixed media thereof.
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham's F12 medium for example, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 (invitrogen) , RPMI-base medium, and mixed media thereof.
  • a mixed medium of IMDM medium and Ham's F12 medium is preferable.
  • the basal medium may contain serum or may be serum-free.
  • albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) serum substitute for FBS during ES cell culture
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • selenium sub-selenium
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • selenium sub-selenium
  • serum substitutes such as sodium acid
  • collagen precursor such as collagen precursor, trace elements
  • thiol glycerol lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non It may also contain one or more substances such as essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like.
  • a preferred basal medium is a mixed medium of IMDM medium and Ham's F12 medium supplemented
  • the TGF- ⁇ inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits signal transduction from binding to the receptor of TGF- ⁇ to SMAD, but for example, ALK, which is a receptor for TGF- ⁇ .
  • ALK which is a receptor for TGF- ⁇ .
  • TGF- ⁇ inhibitors include, for example, Lefty-1 (NCBI Accession No., mouse: NM_010094, human: NM_020997 is exemplified), SB431542, SB202190 (above, RKLindemann et al., Mol.
  • the TGF- ⁇ inhibitor used in this step (1) can be preferably SB431542.
  • the concentration of SB431542 in the medium is not particularly limited, but preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, for example, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 11 ⁇ M, 12 ⁇ M, 13 ⁇ M, 14 ⁇ M, 15 ⁇ M 16 ⁇ M, 17 ⁇ M, 18 ⁇ M, 19 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 35 ⁇ M, 40 ⁇ M, 45 ⁇ M, and 50 ⁇ M, but are not limited thereto. More preferably, it is 10 ⁇ M.
  • a GSK3 ⁇ inhibitor is defined as a substance that inhibits the kinase activity of GSK3 ⁇ protein (for example, phosphorylation ability for ⁇ -catenin), and many of them are already known.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor used in this step (1) may preferably be CHIR99021.
  • the concentration of CHIR99021 in the medium is not particularly limited, but is, for example, in the range of 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably in the range of 5 ⁇ M to 50 ⁇ M, for example, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, Although not limited to 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 35 ⁇ M, 40 ⁇ MM, 45 ⁇ M, and 50 ⁇ M.
  • a concentration higher than 1 ⁇ M which is the concentration used in GSK3 ⁇ inhibition, is used, and more preferably 5 ⁇ M or more.
  • the culture period is exemplified by 10 days or more and 30 days or less, for example, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, It can be 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, etc., preferably 21 days.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably 5%.
  • passaging is an operation of dissociating cells in culture from a container and reseeding.
  • cells that are adhered to each other to form a population are dissociated (separated) into individual cells.
  • a method for dissociating cells for example, a method of dynamically dissociating, a dissociation solution having protease activity and collagenase activity (for example, Accutase (TM) and Accumax (TM)), or a dissociation solution having only collagenase activity is used.
  • TM Accutase
  • TM Accutase
  • TM Accumax
  • dissociation solution having only collagenase activity is used.
  • the dissociation method using Trypsin / EDTA for example, a method of dissociating cells using Trypsin / EDTA is used.
  • the passage is not particularly limited, but every 4 to 10 days from the start of this step, for example, every 4 days, every 5 days, every 6 days, every 7 days, every 8 days, every 9 days, every 10 days, preferably Is carried out every 7 days.
  • the culture solution immediately after the passage may contain a ROCK inhibitor for the purpose of preventing cell death of the replated cells.
  • the ROCK inhibitor can be used under the same conditions as described above.
  • the timing of the medium exchange is not particularly limited, but is performed, for example, every 1 day, every 2 days, every 3 days, every 4 days, or every 5 days after the start of cultivation with a fresh medium.
  • the medium exchange is preferably performed every 2 days.
  • Step (2) Step of culturing in a culture medium containing TGF- ⁇ inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, IGF1, HGF and bFGF
  • the cells obtained in the step (1) are treated with TGF- It is a step of culturing in a culture solution containing a ⁇ inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor, IGF1, HGF and bFGF.
  • the culture solution used in this step (2) can be prepared using a medium used for animal cell culture as a basal medium.
  • IMDM medium for example, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 (invitrogen) , RPMI-base medium, SF-O3 medium (Adeia Co., Ltd.) and mixed media thereof.
  • SF-O3 medium is preferably used.
  • the basal medium may contain serum or may be serum-free.
  • serum substitutes such as sodium acid
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • selenium sub-selenium
  • serum substitutes such as sodium acid
  • collagen precursor such as collagen precursor
  • trace elements such as collagen precursor
  • thiol glycerol lipids
  • amino acids such as L-glutamine
  • Glutamax Invitrogen
  • non It may also contain one or more substances such as essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like.
  • a preferred basal medium is SF-O3 medium supplemented with albumin and 2-mercaptoethanol.
  • the TGF- ⁇ inhibitor used in this step (2) may be the same as described above, but may preferably be SB431542.
  • the concentration of SB431542 in the medium used in this step (2) is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, for example, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 11 ⁇ M.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor used in this step (2) may be the same as described above, but may preferably be LiCl.
  • the concentration of LiCl in the medium used in this step (2) is not particularly limited, but is preferably 1 mM to 50 mM, for example, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM. 20 mM, 25 mM, 30 mM, 40 mM, and 50 mM, but are not limited thereto. More preferably, it is 5 mM.
  • the concentration of IGF1 in the medium used in this step (2) is not particularly limited, and is, for example, in the range of 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably in the range of 1 ng / ml to 50 ng / ml.
  • the concentration of HGF in the medium used in this step (2) is not particularly limited, and is, for example, in the range of 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably in the range of 1 ng / ml to 50 ng / ml.
  • the concentration of bFGF in the medium used in this step (2) is not particularly limited, but is, for example, in the range of 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably in the range of 1 ng / ml to 50 ng / ml.
  • the culture period is exemplified by 1 day or more and 10 days or less, for example, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, It can be 10 days, etc., preferably 4 days.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably 5%.
  • Step (3) a step of culturing in a culture solution containing a TGF- ⁇ inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor and IGF1
  • This step (3) comprises the steps of: It is a step of culturing in a culture solution containing a GSK3 ⁇ inhibitor and IGF1.
  • the culture solution used in this step (3) can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • IMDM medium for example, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 (invitrogen) , RPMI-base medium, SF-O3 medium and mixed medium thereof.
  • SF-O3 medium is preferably used.
  • the basal medium may contain serum or may be serum-free.
  • serum substitutes such as sodium acid
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • selenium sub-selenium
  • serum substitutes such as sodium acid
  • collagen precursor such as collagen precursor
  • trace elements such as collagen precursor
  • thiol glycerol lipids
  • amino acids such as L-glutamine
  • Glutamax Invitrogen
  • non It may also contain one or more substances such as essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like.
  • a preferred basal medium is SF-O3 medium supplemented with albumin and 2-mercaptoethanol.
  • the TGF- ⁇ inhibitor used in this step (3) may be the same as described above, but may preferably be SB431542.
  • the concentration of SB431542 in the medium used in this step (3) is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, for example, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 11 ⁇ M.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor used in this step (3) may be the same as described above, but may preferably be LiCl.
  • the concentration of LiCl in the medium used in this step (3) is not particularly limited, but is preferably 1 mM to 50 mM, for example, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM. 20 mM, 25 mM, 30 mM, 40 mM, and 50 mM, but are not limited thereto. More preferably, it is 5 mM.
  • the concentration of IGF1 in the medium used in this step (3) is not particularly limited, and is, for example, in the range of 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably in the range of 1 ng / ml to 50 ng / ml.
  • the culture period is exemplified by 1 day or more and 10 days or less, for example, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, It can be 10 days, etc., preferably 3 days.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably 5%.
  • Step (4) Step of culturing in a culture solution containing a TGF- ⁇ inhibitor, IGF1 and HGF
  • the cells obtained in the above step (3) are treated with a TGF- ⁇ inhibitor, IGF1 and It is a step of culturing in a culture solution containing HGF.
  • the culture solution used in this step (4) can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • IMDM medium for example, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 (invitrogen) , RPMI-base medium, SF-O3 medium and mixed medium thereof.
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham's F12 medium RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 (invitrogen)
  • RPMI-base medium for example, SF-O3 medium is preferably used.
  • the basal medium may contain serum or may be serum-free.
  • serum substitutes such as sodium acid
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • selenium sub-selenium
  • serum substitutes such as sodium acid
  • collagen precursor such as collagen precursor
  • trace elements such as collagen precursor
  • thiol glycerol lipids
  • amino acids such as L-glutamine
  • Glutamax Invitrogen
  • non It may also contain one or more substances such as essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like.
  • a preferred basal medium is SF-O3 medium supplemented with albumin and 2-mercaptoethanol.
  • the TGF- ⁇ inhibitor used in this step (4) may be the same as described above, but may preferably be SB431542.
  • the concentration of SB431542 in the medium used in this step (4) is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, for example, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 11 ⁇ M.
  • the concentration of IGF1 in the medium used in this step (4) is not particularly limited, and is, for example, in the range of 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably in the range of 1 ng / ml to 50 ng / ml.
  • the concentration of HGF in the medium used in this step (4) is not particularly limited. For example, it is in the range of 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably in the range of 1 ng / ml to 50 ng / ml.
  • the culture period is exemplified by 7 days or more and 20 days or less.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably 5%.
  • the timing of the medium exchange is not particularly limited, but is performed, for example, every 1 day, every 2 days, every 3 days, every 4 days, or every 5 days after the start of cultivation with a fresh medium. Preferably, it is performed every 2 days.
  • the medium exchange can be performed, for example, once a week, twice a week, three times a week, or four times a week after starting culture with a fresh medium. Preferably, it is performed twice a week.
  • Step (5) Step of culturing in a culture solution containing a TGF- ⁇ inhibitor, IGF1 and serum
  • the cells obtained in the above step (4) are treated with a TGF- ⁇ inhibitor, IGF1 and It is a step of culturing in a culture solution containing serum.
  • the culture solution used in this step (5) can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • IMDM medium for example, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 (invitrogen) , RPMI-base medium and mixed media thereof are included.
  • a DMEM medium is preferably used.
  • the basal medium may contain serum or may be serum-free.
  • serum substitutes such as sodium acid
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • selenium sub-selenium
  • serum substitutes such as sodium acid
  • collagen precursor such as collagen precursor
  • trace elements such as collagen precursor
  • thiol glycerol lipids
  • amino acids such as L-glutamine
  • Glutamax Invitrogen
  • non It may also contain one or more substances such as essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like.
  • a preferred basal medium is a DMEM medium supplemented with serum, L-glutamine and 2-mercaptoethanol.
  • the serum used in this step (5) is preferably horse serum, and the concentration in the basal medium is 1 to 10%, more preferably 2%.
  • the TGF- ⁇ inhibitor used in this step (5) may be the same as described above, but may preferably be SB431542.
  • the concentration of SB431542 in the medium used in this step (5) is not particularly limited, but is preferably 500 nM to 50 ⁇ M, for example, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, Examples include, but are not limited to, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 35 ⁇ M, 40 ⁇ M, 45 ⁇ M, and 50 ⁇ M. More preferably, it is 5 ⁇ M.
  • the concentration of IGF1 in the medium used in this step (5) is not particularly limited, and is, for example, in the range of 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably in the range of 1 ng / ml to 50 ng / ml.
  • the culture period is long, and there is no particular influence on the induction of skeletal muscle progenitor cells, but it is 9 days to 100 days, preferably 9 days. It is 75 days or less and 9 days or more and 60 days or less.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably 5%.
  • the timing of the medium exchange is not particularly limited, but is performed, for example, every 1 day, every 2 days, every 3 days, every 4 days, or every 5 days after the start of cultivation with a fresh medium. Preferably, it is performed every 2 days.
  • the medium exchange can be performed, for example, once a week, twice a week, three times a week, or four times a week after starting culture with a fresh medium. Preferably, it is performed twice a week.
  • a kit for producing skeletal muscle progenitor cells from pluripotent stem cells contains a skeletal muscle progenitor cell inducer containing a specific factor for induction of skeletal muscle progenitor cells (eg, lyophilized product, frozen in an appropriate buffer) Solution, etc.), cells, reagents and culture media.
  • the kit may further include a document or instructions describing the differentiation induction procedure.
  • the present invention provides a therapeutic agent for myogenic diseases comprising skeletal muscle progenitor cells selected by the above method.
  • the myogenic diseases in the present invention include, for example, muscular dystrophy (eg, Duchenne muscular dystrophy (DMD), Becker muscular dystrophy, congenital muscular dystrophy, limb girdle muscular dystrophy, myotonic muscular dystrophy, etc.), congenital myopathy, distal myopathy And hereditary myopathy such as mitochondrial myopathy, polymyositis, dermatomyositis, non-hereditary myopathy dystrophy such as myasthenia gravis, glycogenosis, and periodic limb paralysis.
  • muscular dystrophy eg, Duchenne muscular dystrophy (DMD), Becker muscular dystrophy, congenital muscular dystrophy, limb girdle muscular dystrophy, myotonic muscular dystrophy, etc.
  • congenital myopathy e.g, congenital muscular dystrophy, limb girdle muscular dystrophy, myotonic muscular dystrophy, etc.
  • congenital myopathy e.g.
  • a selected skeletal muscle progenitor cell when used as a therapeutic agent for myogenic disease, it is preferably used after re-culturing the selected skeletal muscle progenitor cell in a culture solution.
  • the culture solution used for re-culture can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • the same medium as in the above step (5) is used, but is not limited thereto.
  • the period of re-culture may be any period as long as the engraftment rate at the transplant destination is increased when transplanting skeletal muscle progenitor cells, but is exemplified by 6 hours to 60 hours, for example, 6 hours, 12 hours, It can be 18 hours, 24 hours, 30 hours, 36 hours, 42 hours, 48 hours, 54 hours, 60 hours, etc., preferably 24 hours.
  • Skeletal muscle progenitor cells for the treatment of hereditary muscular diseases such as muscular dystrophy include skeletal muscle progenitors derived from pluripotent stem cells derived from other patients with the same or substantially the same HLA type as the patient Cells are preferably used.
  • human regenerative medicine it is not easy to obtain human ES cells of the same or substantially the same type of HLA, so human iPS cells are used as pluripotent stem cells for inducing skeletal muscle progenitor cells. It is preferable to use it.
  • skeletal muscle progenitor cells differentiated from iPS cells derived from the patient's own somatic cells can be used as skeletal muscle progenitor cells for the treatment of hereditary muscle disease.
  • iPS cells derived from somatic cells of a DMD patient are deficient in the dystrophin gene
  • a normal dystrophin gene is introduced into the iPS cells.
  • the dystrophin cDNA is 14 kb in length, and the optimal adeno-associated virus (AAV) vector for gene transfer into muscle cells has only about 4.5 kb capacity, so the current gene therapy strategy is a shortened functional dystrophin gene.
  • AAV adeno-associated virus
  • the mutation site of the causative gene can be repaired using the endogenous DNA repair mechanism or homologous recombination of iPS cells. That is, a chimeric RNA / DNA oligonucleotide (chimeraplast) having a sequence with a normal mutation site is introduced and bound to a target sequence to form a mismatch, and an endogenous DNA repair mechanism is activated to induce gene repair.
  • gene repair can be performed by introducing a single-stranded DNA having 400-800 bases homologous to the mutation site to cause homologous recombination.
  • the normal skeletal muscle progenitor cell derived from the patient can be produced by inducing differentiation of the iPS cell obtained by repairing the disease-causing gene thus obtained into the skeletal muscle progenitor cell through the above-described steps.
  • an immune response to normal gene products may occur even in the patient's own skeletal muscle progenitor cells Therefore, in any case, when transplanting skeletal muscle progenitor cells, it is preferable to use an immunosuppressant in combination.
  • a dystrophin function may be substituted by introducing a utrophin gene, which is a dystrophin homolog expressed in patient skeletal muscle.
  • the skeletal muscle progenitor cells selected by the method of the present invention can be formulated in the form of cells.
  • the preparation can be produced as a parenteral preparation such as an injection, suspension, drip infusion, etc. by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier according to conventional means.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants.
  • An aqueous liquid for injection can be mentioned.
  • the agent of the present invention includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, lidocaine hydrochloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin, polyethylene glycol) Etc.), preservatives (eg, sodium benzoate, benzalkonium chloride, etc.), antioxidants (eg, ascorbic acid, sodium edetate, etc.) and the like.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • a soothing agent eg, lidocaine hydrochloride, procaine hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, polyethylene glycol
  • preservatives eg, sodium benzoate, benzalkonium chloride, etc.
  • antioxidants eg, ascorbic acid, sodium edetate, etc.
  • skeletal muscle progenitor cells may be suspended in the aqueous solution so as to be about 1.0 ⁇ 10 6 to about 1.0 ⁇ 10 7 cells / mL. Since the thus obtained preparation is stable and has low toxicity, it can be safely administered to mammals such as humans.
  • the administration method is not particularly limited, it is preferably injection or drip administration, and examples include intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration (affected local administration) and the like.
  • the dose of the agent of the present invention varies depending on the administration subject, treatment target site, symptom, administration method, etc., but usually in DMD patients (weight 60 kg), for example, in the case of intravenous injection, Conveniently, about 1.0 ⁇ 10 5 to about 1 ⁇ 10 7 cells as skeletal muscle progenitor cells are administered about 4 to about 8 times at intervals of about 1 to about 2 weeks.
  • MYOD1-hiPSCs Human iPS cells capable of forced expression of MYOD1 in a Dox-dependent manner (hereinafter referred to as MYOD1-hiPSCs) were used under the auspices of Dr. Hidetoshi Sakurai (PLoS One. 2013 Apr 23; 8 ( 4): e61540). Differentiation was induced from the MYOD1-hiPSCs to skeletal muscle cells. In detail, it culture
  • iPS culture medium primaryate ES cell culture medium: Reprocell # RCHEMD001
  • iPSCs were prepared.
  • iPS cells expressing tdTomato by linking the tdTomato sequence to the 5 'side of the start codon of the MYF5 locus by homologous recombination using the CRISPR / CAS9 system according to conventional methods.
  • a strain MYF5-tdTomato C3 iPSCs
  • Both cell lines confirm that only one allele has been genetically modified.
  • ⁇ Disease iPS cell line> Using Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit (Life Technologies) to fibroblasts obtained by culturing skin collected with consent from patients with facial scapulohumeral muscular dystrophy, Okita K et al., Nat Methods. 8: 409-412, 2011 (hereinafter referred to as a disease iPS cell line).
  • iPS cells PAX3-GFP iPSCs, MYF5-tdTomato C3 iPSCs, 201B7, or disease iPS cell lines.
  • CDMi basal medium supplemented with 10 ⁇ M SB431542 and 5 ⁇ M CHIR99021 (1% Albumin from bovine serum (SIGMA), 1%) against iPS cells cultured on 6-well plates coated with Matrigel (BD bioscience) 1: 1IMDM (Invitrogen) supplemented with Penicillin-Streptomycin Mixed Solution (26253-84 Nacalai Tesque), 1% CD Lipid Concentrate (Invitrogen), 1% Insulin-Trandferin-Selenium (Invitrogen) and 0.5 mM 1-Thioglycerol (SIGMA) And F12 (Invitrogen) mixed medium) (hereinafter referred to as differentiation medium A) and cultured.
  • 1IMDM Invitrogen
  • Penicillin-Streptomycin Mixed Solution 26253-84 Nacalai Tesque
  • CD Lipid Concentrate Insulin-Trandferin-Selenium
  • SIGMA Insulin-Trandferin-Selenium
  • F12 Invitrogen
  • the medium was changed every two days. Seven days later, the cells were subcultured, and differentiation medium A was added to each iPS cell cultured on a 6-well plate coated with Matrigel (BD bioscience) and cultured. Thereafter, the medium was changed every two days. Seven days later, the cells were subcultured, and differentiation medium A was added to 6-well plates coated with matrigel (BD bioscience) and cultured. After 24 hours, the medium was changed with differentiation medium A. Thereafter, the medium was changed every two days. Further, 6 days later (14 days after the first day of induction), subculture was performed, and differentiation medium A was added to 6-well plates coated with Matrigel (BD bioscience) and cultured. After 24 hours, the medium was changed with differentiation medium A.
  • SF-O3 basic medium (0.2%) supplemented with 200 ⁇ M 2-ME, 5 mM LiCl, 10 ⁇ M SB431542, 10 ng / ml IGF-1, 10 ng / ml HGF and 10 ng / ml bFGF
  • the medium was exchanged with SF-O3 (Sanko Junyaku SS1303) to which BSA (Sigma) was added (hereinafter referred to as muscle differentiation medium A).
  • muscle differentiation medium B change medium in SF-O3 basic medium supplemented with 200 ⁇ M 2-ME, 5 mM LiCl, 10 ⁇ M SB431542 and 10 ng / ml IGF-1.
  • muscle differentiation medium C change medium in SF-O3 basic medium supplemented with 200 ⁇ M 2-ME, 5 mM LiCl, 10 ⁇ M SB431542 and 10 ng / ml IGF-1.
  • muscle differentiation medium C The medium was changed at). Thereafter, the medium was changed twice a week in the muscle differentiation medium C.
  • muscle differentiation medium D 14 days after changing to muscle differentiation medium C (42 days after the first day of differentiation induction), DMEM basic medium (1% Penicillin-Streptomycin Mixed Solution) supplemented with 2% Horse Serum (HS), 5 ⁇ M SB431542 and 10ng / ml IGF-1
  • the medium was replaced with DMEM (Invitrogen # 11960069)) (hereinafter referred to as muscle differentiation medium D) supplemented with 1% L-gluthamine (Nacalai Tesque # 16948-04) and 200 ⁇ M 2-ME. Thereafter, the medium was changed twice a week in the muscle differentiation medium D.
  • the culture in the muscle differentiation medium D was carried out for a maximum of 95 days from the start of differentiation induction.
  • the PCR product was purified using MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN). Each PCR product is referred to as a fluorescent protein cassette (EGFP cassette (SEQ ID NO: 15), tagBFP cassette (SEQ ID NO: 16) or tagRFP cassette (SEQ ID NO: 17)).
  • EGFP cassette SEQ ID NO: 15
  • tagBFP cassette SEQ ID NO: 16
  • tagRFP cassette SEQ ID NO: 17
  • 5′-UTR was obtained by using IVT_5prime_UTR (IVT_5prime_UTR (SEQ ID NO: 18)) as a template and corresponding primers (TAP_T7_G3C fwd primer (SEQ ID NO: 19) and Rev5UTR primer (SEQ ID NO: 20)) and KOD-Plus-Neo (KOD-401).
  • TOYOBO was amplified by PCR (cycle: 94 ° C for 2 minutes, followed by 13 cycles of 98 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 10 seconds, stored at 15 ° C).
  • the amplified PCR product was purified using MiniElute PCR-purification Kit (QIAGEN).
  • the obtained PCR product is referred to as a Control 5'-UTR cassette (SEQ ID NO: 21).
  • a 5'-UTR cassette having an miRNA response element is divided into 5UTR-miR-1 cassette (SEQ ID NO: 22), 5UTR-miR-133 cassette (SEQ ID NO: 23), 5UTR-miR-206 cassette (SEQ ID NO: 24), 5UTR- This was designated as miR-489 cassette (SEQ ID NO: 25) or 5UTR-miR-708 cassette (SEQ ID NO: 26), and was obtained by DNA synthesis.
  • 3′-UTR was obtained by using IVT_3prime_UTR (IVT_3prime_UTR (SEQ ID NO: 27)) as a template and corresponding primers (Fwd3UTR primer (SEQ ID NO: 28) and Rev3UTR2T20 (SEQ ID NO: 29)) and KOD-Plus-Neo (KOD-401, TOYOBO). ) was amplified by PCR (cycle: 94 ° C for 2 minutes, 98 ° C for 10 seconds, and 68 ° C for 10 seconds, 13 cycles, stored at 15 ° C). The amplified PCR product was purified using MiniElute PCR-purification Kit (QIAGEN). The obtained PCR product is referred to as a 3'-UTR cassette (SEQ ID NO: 30).
  • the DNA template for the production of mRNA containing Control 5'-UTR is shown in invitro transcription.
  • Each of the fluorescent protein cassettes created above, Control 5'-UTR, 3'-UTR cassette, and corresponding primers (TAP_T7_G3C fwd Using primer and 3UTR120A rev primer (SEQ ID NO: 31)) and KOD-Plus-Neo (KOD-401, TOYOBO) as appropriate, PCR (cycle: 94 °C 2 minutes, 98 °C 10 seconds, 68 °C 45) Amplification was performed by 20 cycles of seconds and stored at 15 ° C.
  • DNA template for producing mRNA containing each 5'-UTR cassette by in vitro transcription is the fluorescent protein cassette prepared above, each 5'-UTR cassette, 3'-UTR cassette, and the corresponding primer ( GCT7pro_5UTR2 (SEQ ID NO: 32) and 3UTR120A rev primer) and KOD-Plus-Neo (KOD-401, TOYOBO) PCR (cycle: 94 °C 2 minutes, 98 °C 10 seconds, 60 °C 30 seconds, 68 °C 45 seconds)
  • the amplified PCR product was purified using MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN).
  • the obtained PCR products were EGFP DNA template (SEQ ID NO: 33), tagBFP DNA template (SEQ ID NO: 34), tagRFP DNA template (SEQ ID NO: 35), miR-206-EGFP DNA template (SEQ ID NO: 36), miR-1.
  • -tagBFP DNA template SEQ ID NO: 37
  • miR-133-tagBFP DNA template SEQ ID NO: 38
  • miR-206-tagBFP DNA template SEQ ID NO: 39
  • miR-489-tagBFP DNA template SEQ ID NO: 40
  • miR -708-tagBFPtagDNA template SEQ ID NO: 41.
  • MRNA synthesis was performed using MEGAscript T7 kit (Ambion) and the DNA template prepared above.
  • pseudouridine-5′-triphosphate and methylcytidine-5′-triphosphate (TriLink BioTechnologies) were used in place of uridine triphosphate and cytidine triphosphate, respectively.
  • guanidine-5′-triphosphate was diluted 5-fold with Anti Reverse cap Analog (New England Biolabs). The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 5 hours, and TURBO DNase (Amibion) was added, followed by further incubation at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the obtained mRNA was purified by FavorPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes using Antarctic phosphatase (New England Biolabs). Then, it further refine
  • the obtained mRNAs were respectively EGFP mRNA (SEQ ID NO: 42), tagBFP mRNA (SEQ ID NO: 43), tagRFP mRNA (SEQ ID NO: 44), miR-206-EGFP switch (SEQ ID NO: 45), miR-1-tagBFP switch ( SEQ ID NO: 46), miR-133-tagBFP switch (SEQ ID NO: 47), miR-206-tagBFP switch (SEQ ID NO: 48), miR-489-tagBFP switch (SEQ ID NO: 49), and miR-708-tagBFP switch (sequence) No. 50).
  • RNA that suppresses translation of fluorescent protein in response to miRNA expression (hereinafter referred to as miRNA switch) and mRNA that encodes a fluorescent protein gene different from miRNA-responsive mRNA (hereinafter referred to as transfection control) Introduced into cells.
  • miRNA switch mRNA that suppresses translation of fluorescent protein in response to miRNA expression
  • transfection control mRNA that encodes a fluorescent protein gene different from miRNA-responsive mRNA
  • Stemfect RNA transfection kit Stemfect RNA transfection kit (Stemgent) was used as follows. Stemfect Transfection Buffer and 2 types of mRNA were prepared to 12.5 ⁇ L in a 1.5 mL tube, and 1 ⁇ L Stemfect RNA Transfection Reagent and Stemfect Transfection Buffer were prepared to 12.5 ⁇ L in the other 1.5 mL tube.
  • the above two prepared solutions were mixed and incubated at room temperature for 15 minutes.
  • the total amount of the mixed solution was added to a well (24 well plate) in which cells were cultured, and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 hours. Thereafter, the medium was removed, and 500 ⁇ L of medium (DMEM 2% HS) was added to the wells. After 24 hours, analysis was performed using fluorescence activated cell sorting (BD, hereinafter FACS).
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • DMEM 2% HS Medium
  • DMEM 2% HS Medium
  • the number of cells was counted with cell countess (invitrogen), and then diluted as necessary.
  • cell countess invitrogen
  • a mixed solution containing mRNA prepared at the same time as the cells were seeded was added to the well. Incubated for 4 hours at 37 ° C., 5% CO 2 . Thereafter, the medium was removed, and a necessary amount of medium (DMEM 2% HS) was added to the wells. After 24 hours, analysis was performed using FACS.
  • qRT-PCR ⁇ Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)> The reverse transcription reaction was performed using ReverTra Ace (TOYOBO). PCR was performed using Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). For miRNA expression level analysis, reverse transcription reaction was performed using TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), and PCR was performed using TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). The primers used are shown in Table 5.
  • the necessary amount of antibody was prepared with Can Get Signal Solution B (TOYOBO), and 100 ⁇ L was dropped and left at room temperature for 1 hour or at 4 ° C. overnight. After washing with PBS-T, the necessary amount of antibody and Hoechst were prepared with Can Get Signal Solution B (TOYOBO) and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing with PBS-T, 1 to 2 drops of Permaflow (Terumo) was dropped, covered with a cover glass, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more. The antibody is shown in Table 6.
  • miR-206-EGFP switch Prepare mRNA (miR-206-EGFP switch) that suppresses EGFP translation in response to miR-206 expression and transfection control tagBFP mRNA using the method described above ( Figure 1B) and introduce it into MYOD1-hiPSCs Thus, it was verified whether skeletal muscle lineage cells could be selected (FIG. 1C).
  • miR-206-EGFP switch was transfected into cells cultured for 1 day without adding Dox (Dox- Day 1), the ratio between the fluorescence value of co-introduced tagBFP and the fluorescence value of EGFP encoded by miRNA switch was uniform in the cell population (FIG. 1C).
  • PAX3-GFP iPSCs or MYF5-tdTomato C3 iPSCs were examined to specifically select skeletal muscle lineage cells by miR-206 switch from the cell population obtained by the above-described differentiation induction method of skeletal muscle progenitor cells.
  • the expression level of miR-206 in the differentiation induction process was examined by qRT-PCR (FIGS. 2A and 2B). As a result, the expression level of miR-206 increased in the process of induction of differentiation.
  • miR-206-tagBFP switch mRNA that suppresses translation of tagBFP in response to miR-206 expression
  • miR-206-tagBFP switch was transfected to examine whether skeletal muscle lineage cells could be selected. At this time, EGFP mRNA was used for transfection control. When miR-206-tagBFP switch was transfected into MYF5-tdTomato C3 iPSCs at 55 and 88 days after differentiation induction, it was suggested that the cell population was separated (Fig. 2D).
  • cell populations differentiated from PAX3-GFP iPSCs and MYF5-tdTomato C3 iPSCs into skeletal muscle progenitor cells can be expressed according to the expression level of miR-206 in the cells using the miR-206-tagBFP switch. It was suggested that can be selected.
  • MiRNA-1 and miRNA-133 reported as miRNAs related to skeletal muscle differentiation (Care, A et al. 2007 Nature Medicine. PMID 17468766, Tatsuguchi, M et al. 2007 Journal of Molecular and Cellular Cardiology. PMID 17498736) And miR-489 (Cheung, T et al. 2012 Nature. PMID 22358842) and miRNA-708 (Yamaguchi et al. 2012 J Mol Histol. PMID 22562803), which have been reported to be expressed in skeletal muscle stem cells. It was produced and verified whether the cell population was divided in the same manner (FIGS. 2E and 2F).
  • skeletal muscle lineage cells can be efficiently selected from the cell population by using miR-206, miRNA-1 and miRNA-133 as indices.
  • miR-206 switch Two cell populations separated by miR-206-tagBFP switch responsiveness were isolated by sorting using FACS, and cells were evaluated by qRT-PCR. At this time, miR-206 switch was introduced into PAX3-GFP iPSCs on the 84th day of differentiation induction together with the transfection control, and two cell populations (responding to miR-206-tagBFP switch) due to the responsiveness to miR-206-tagBFP switch.
  • miR-206 switch was introduced into MYF5-tdTomato C3 iPSCs cells on day 87 of differentiation induction together with transfection control and selected (Fig. 3B).
  • the skeletal muscle lineage cells can be specifically selected by using the miR-206 switch.
  • miR-206 switch was introduced into PAX3-GFP iPSCs 86 days after differentiation induction together with transfection control, and miR-206 switch responsiveness The two cell populations were further divided into GFP positive and negative and sorted (FIGS. 4A and 4B).
  • MYF5, MYOD1, MYOGENIN, and PAX7 are miR-206 + and GFP positive (P3 gate, hereafter miR-206 + / PAX3 +) and miR-206 + and GFP negative (P4 gate, hereafter, miR- MiR-206- and GFP positive (P6 gate, miR-206- / PAX3 +) and miR-206- and GFP negative (P7 gate, miR-206- / PAX3-) Also increased (FIGS. 4C to 4F).
  • MHC Myosin Heavy Chain
  • skeletal muscle lineage cells were selected by miR-206 switch (Figs. 6A and B) for cells derived from disease iPS cell lines ⁇ and 201B7 (86th and 95th day of induction, respectively), and qRT-PCR analysis was performed. Then, the expression level of genes involved in skeletal muscle differentiation was examined (FIGS. 6C to 6H).
  • the differentiation-induced disease iPS cell line (induction day 86) was selected with the miR-206 switch, and the cells after sorting were selected.
  • the expression of MYOD1 and PAX7 was confirmed in the miR-206 + fraction (FIG. 7A).
  • the miR-206 + fraction cells expressing both MYOD1 and PAX7 proteins were observed (FIG. 7C).
  • expression of MYOD1 was not observed in the miR-206- fraction, and expression of PAX7 was slightly observed (FIG. 7B). From the above, it was suggested that skeletal muscle progenitor cells with regenerative ability may be included in the miR-206 positive skeletal muscle lineage cell population selected by the miR-206 switch.
  • skeletal muscle progenitor cells can be selectively obtained from pluripotent stem cells, and a myogenic disease therapeutic agent containing the skeletal muscle progenitor cells can be provided.
  • skeletal muscle progenitor cells differentiated from iPS cells derived from the patient's own somatic cells can be provided as skeletal muscle progenitor cells for the treatment of hereditary muscle disease.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明の目的は、骨格筋前駆細胞を含有する細胞群より骨格筋前駆細胞を選別する方法を提供することである。miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を提供することにより、上記課題を解決する。なお、当該miRNA応答性mRNAは、(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列を含む核酸、および　(ii) マーカータンパク質をコードする配列を含む核酸を含む。

Description

骨格筋前駆細胞の選択方法
　本発明は、骨格筋前駆細胞を識別し、選択する技術に関する。
　創薬スクリーニングや細胞移植治療のため、多能性幹細胞由来の組織細胞に期待が向けられており、現在、これらの組織細胞の誘導方法が多く開発されている。しかし、多能性幹細胞から全ての細胞を均一に所望の細胞へと分化誘導することは困難である。従って、誘導された細胞を適正に利用するためには、所望の細胞を純化する技術が重要となる。
　このような純化の方法として、細胞表面抗原を指標として、抗体を用いた純化方法が提案されているが、適切な細胞表面抗原が所望する全ての細胞において認識されているわけではない。特に、ヒト骨格筋前駆細胞については、このような細胞表面抗原は存在せず、細胞移植治療に向けて大きな課題となっている（非特許文献１）。
Mizuno Y, et al. FASEB J. 24:2245-2253, 2010
　本発明の目的は、多能性幹細胞から誘導した、骨格筋前駆細胞および他の細胞種を含む細胞群から骨格筋前駆細胞を選択する方法、ならびに、当該選択方法を含む多能性幹細胞から均一な骨格筋前駆細胞集団を製造する方法を提供することである。本発明の目的はまた、移植に適した骨格筋前駆細胞を提供することである。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、骨格筋前駆細胞に特異的に発現するmiRNAを指標として、細胞を識別し得るのではないかとの仮説の下、miRNA応答性にマーカータンパク質の発現が制御されるmRNAを作製し、骨格筋前駆細胞を含む細胞群へ導入した。その結果、マーカータンパク質の発現の差異により骨格筋前駆細胞を効率よく選別することに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］　miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、骨格筋前駆細胞の選別方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記：
　(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列を有する核酸、および
　(ii) マーカータンパク質をコードする配列を含む核酸
を含む配列からなり、
　ここで、当該(ii)は、当該(i)の核酸に機能的に連結している、方法。
［２］　前記(i)および(ii)が、5'から3'の方向に連結されている、［１］に記載の方法。
［３］　前記(i)の骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAが、miR-1、miR-133およびmiR-206からなる群から選択される１またはそれ以上のmiRNAである、［１］または［２］に記載の方法。
［４］　前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質および自殺遺伝子にコードされるタンパク質からなる群から選択される１またはそれ以上の遺伝子である、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
［５］　前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質であって、コントロールmRNAをさらに細胞群に導入する工程を含む、［４］に記載の方法。［６］　前記細胞群が、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞へと分化誘導させた細胞群である、［１］から［５］のいずれかに記載の方法。
［７］　前記多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞への分化誘導が、下記の工程（１）から（５）を含む、［６］に記載の方法：
（１）多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
（２）（１）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程、
（３）（２）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程、
（４）（３）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程、および
（５）（４）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程。
［８］　前記工程（１）から（５）のTGF-β阻害剤がSB431542であり、前記工程（１）のGSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記工程（２）および（３）のGSK3β阻害剤がLiClである、［７］に記載の方法。
［９］　前記工程（５）の血清がウマ血清である、［７］または［８］に記載の方法。
［１０］　下記の工程（１）から（３）を含む多能性幹細胞からの骨格筋前駆細胞の製造方法：
（１）多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を製造する工程、
（２）（１）の工程で得られた細胞へ、下記(i) および(ii)を含むmiRNA応答性mRNAを導入する工程：
　(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列を有する核酸、および
　(ii)マーカータンパク質をコードする核酸
を含む配列からなり、ここで、当該(ii)は、当該(i)の核酸に機能的に連結している、ならびに、
（３）前記マーカータンパク質の翻訳量が少ないまたは検出できない細胞を選択する工程。
［１１］　前記工程（１）が下記の工程（１-１）から（１-５）を含む、［１０］に記載の方法：
（１-１）多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
（１-２）（１-１）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程、
（１-３）（１-２）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程、
（１-４）（１-３）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程、および
（１-５）（１-４）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程。
［１２］　前記工程（１-１）から（１-５）のTGF-β阻害剤がSB431542であり、前記工程（１-１）のGSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記工程（１-２）および（１-３）のGSK3β阻害剤がLiClである、［１１］に記載の方法。
［１３］　前記工程（１-５）の血清がウマ血清である、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］　前記(i)および(ii)が、5'から3'の方向に連結されている、［１０］から［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］　前記(i)の骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAが、miR-1、miR-133およびmiR-206からなる群から選択される１またはそれ以上のmiRNAである、［１０］から［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］　前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質および自殺遺伝子にコードされるタンパク質からなる群から選択される１またはそれ以上の遺伝子である、［１０］から［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］　前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質であって、コントロールmRNAをさらに（１）の工程で得られた細胞へ導入する工程を含み、前記工程（３）が、さらに当該コントロールmRNAが導入された細胞を選択する工程である、［１６］に記載の方法。
　本発明の方法により、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を選択的に得ることが可能となる。
図１Aは、ヒトiPS細胞株でのDox-MyoD強制発現による骨格筋分化過程におけるmiR-206の発現をQuantitative RT-PCR 法（qRT-PCR）を行い定量した結果を示す。Doxの培地への添加は、day 7までの期間おこない、day8-day9の期間は添加しなかった。 サンプル名に含まれるdayはそれぞれ分化誘導を行った日数を表している。iPS day 0の値を1としており、エラーバーは標準偏差を示している。図１Bは、miRNAスイッチの模式図を示す。図１Cは、Dox誘導を行っていない（Dox-）Day 1のFACS解析の結果を示し、図1Dは、Dox誘導を行った（Dox+）Day 6のFACS解析の結果を示す。図１Cおよび図１Dの縦軸はEGFPの蛍光量を、横軸はtagBFPの蛍光量を示す。 図２AおよびBは、PAX3-GFP iPSCs（A）およびMYF5-tdTomato C3 iPSCs (B)のmiR-206の発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図中、横軸のDは分化誘導開始からの日数を表す。縦軸は、図２Aでは、D2での値を1とした発現量比を示し、図２Bでは、D19での値を1とした発現量比を示す。エラーバーは標準偏差を示す。図２Cは、PAX3-GFP iPSCsの分化誘導44日目（左図）および78日目（右図）の細胞にmiR-206スイッチをトランスフェクションした後のドットプロットを示す。図中、縦軸はtagBFP、横軸はtagRFPの蛍光量を示す。図２Dは、MYF5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導55日目（左図）および88日目（右図）の細胞にmiR-206スイッチをトランスフェクションした後のドットプロットを示す。図中、縦軸はtagBFP、横軸はEGFPの蛍光量を示す。図２Eは、PAX3-GFP iPSCsの分化誘導78日目の細胞にmiR-1スイッチまたはmiR-133スイッチをトランスフェクションした後のドットプロットを示す。図中、縦軸はtagBFP、横軸はtagRFPの蛍光量を示す。図２Fは、MYF5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導88日目の細胞にmiR-489スイッチまたはmiR-708スイッチをトランスフェクションした後のドットプロットを示す。図中、縦軸はtagBFP、横軸はEGFPの蛍光量を示す。 図３Aは、PAX3-GFP iPSCsの分化誘導84日目において、miR-206スイッチをトランスフェクションした後のドットプロットを示す。図３Bは、MYF5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導87日目において、miR-206スイッチをトランスフェクションした後のドットプロットを示す。図３Cは、PAX3-GFP iPSCsの分化誘導84日目においてmiR-206スイッチで選別されたmiR-206+画分(図３A中のP2に相当)およびmiR-206-画分(図３A中のP4に相当)の細胞集団におけるMYF5の遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図３Dは、PAX3-GFP iPSCsの分化誘導84日目のmiR-206+画分およびmiR-206-画分の細胞集団におけるMYOD1の遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図３Eは、PAX3-GFP iPSCsの分化誘導84日目のmiR-206+画分およびmiR-206-画分の細胞集団におけるMYOGENINの遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図３Fは、Myf5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導87日目においてmiR-206スイッチで選別されたmiR-206+画分(図３B中のP4に相当)およびmiR-206-画分(図３B中のP5に相当)におけるMYF5の遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図３Gは、Myf5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導87日目のmiR-206+画分およびmiR-206-画分におけるMYOD1の遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図３Hは、Myf5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導87日目のmiR-206+画分およびmiR-206-画分におけるMYOGENINの遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図３Cから図３Hの縦軸は、miR-206-画分由来の発現量を1とした発現量比を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 図４Aは、分化誘導86日目のPAX3-GFP iPSCsにおいて、miR-206スイッチのトランスフェクション後のドットプロットを示す。図４Bは、それぞれmiR-206+画分（図４A中のP2に相当）、miR-206-画分（図４A中のP5に相当）において、横軸をGFPで展開したドットプロットを示す。図４Cは、MYF5の発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図４Dは、MYOD1の発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図４Eは、MYOGENINの発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図４Fは、PAX7の発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図４Gは、PAX3の発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図４Bから図４Gの各グラフにおいて、P 7、P 6、P 4 、P 3は、それぞれ、miR-206-/GFP-、miR-206-/GFP+、miR-206+/GFP-およびmiR-206+/GFP+を意味する。図４Cから図４G中、縦軸は、P 7の発現量を1とした発現量比を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 図５Aは、MYF5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導95日目におけるmiR-206画分を単離後、8日間培養した細胞（miR-206+ (A)）のMHC抗体とHoechstで染色した蛍光像を示す。図５Bは、MYF5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導95日目におけるmiR-206-画分を単離後、8日間培養した細胞（miR-206- (B)）のMHC抗体とHoechstで染色した蛍光像を示す。図５Cは、MYF5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導95日目におけるmiR-206+画分を単離後、8日間培養（5日骨格筋前駆細胞用培養および3日間骨格筋分化培養）した細胞（miR-206+ (C)）のMHC抗体とHoechstで染色した蛍光像を示す。図５Dは、MYF5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導95日目におけるmiR-206-画分を単離後、8日間培養（5日骨格筋前駆細胞用培養および3日間骨格筋分化培養）した細胞（miR-206- (D)）のMHC抗体とHoechstで染色した蛍光像を示す。図５Eは、miR-206+ (A)、miR-206- (B)、miR-206+ (C)およびmiR-206- (D)におけるMHC陽性率を示す。なお、MHC陽性率は、Hoechstで染色された細胞数に対するMHC陽性細胞数の比として表す。 図6Aは、疾患iPS細胞株の分化誘導86日目において、miR-206スイッチをトランスフェクションした後のドットプロットを示す。図6Bは、201B7の分化誘導95日目において、miR-206スイッチをトランスフェクションした後のドットプロットを示す。図6Cは、疾患iPS細胞株の分化誘導86日目においてmiR-206スイッチで選別されたmiR-206+画分 (図6A中のP2に相当)およびmiR-206-画分(図6A中のP3に相当)におけるMYF5の遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図6Dは、疾患iPS細胞株の分化誘導86日目のmiR-206+およびmiR-206-におけるMYOD1の遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図6Eは、疾患iPS細胞株の分化誘導86日目のmiR-206+およびmiR-206-におけるMYOGENINの遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図6Fは、201B7の分化誘導95日目においてmiR-206スイッチで選別されたmiR-206+画分およびmiR-206-画分におけるMYF5の遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図6Gは、201B7の分化誘導95日目のmiR-206+細胞集団およびmiR-206-細胞集団におけるMYOD1の遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図6Hは、201B7の分化誘導95日目のmiR-206+画分およびmiR-206-画分におけるMYOGENINの遺伝子発現をqRT-PCRを行い定量した結果を示す。図6Cから図6 Hの図中、縦軸は、miR-206-画分の発現量を1とした発現量比を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 図7Aは、疾患iPS細胞株の分化誘導86日目におけるmiR-206+の画分をMYOD1、PAX7の抗体とHoechstで染色した蛍光像を示す。図7Bは、疾患iPS細胞株の分化誘導86日目におけるmiR-206-の細胞集団をMYOD1、PAX7の抗体とHoechstで染色した蛍光像を示す。図7Cは、miR-206+およびmiR-206-におけるMYOD1陽性率、PAX7陽性率、およびMYOD1+PAX7両陽性率を表したグラフである。なお、各陽性率は、Hoechstで染色された細胞数に対する各陽性細胞数の比として表す。
　以下に本発明を、実施態様を示して詳細に説明する。しかしながら、本発明は以下の実施態様に限定されるものではない。
　本発明は、miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、骨格筋前駆細胞を選別する方法を提供する。本実施態様による方法の、導入する工程において、miRNA応答性mRNAが導入され、選別の対象となる細胞群は、骨格筋前駆細胞を含有しうる任意の細胞群であって良い。例えば、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞へ分化誘導させた細胞群であってもよく、生体内から取り出した細胞の集団であってもよいが、これらには限定されない。したがって、骨格筋前駆細胞を含有するか否かが不明な細胞群にmiRNA応答性mRNAを導入することもあり得る。好ましい実施態様において、細胞群は、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞へ分化誘導された細胞群であり得る。多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞へ分化誘導された細胞群とは、後に詳述する方法により、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞へと分化誘導させる工程を経た細胞群であって、所望の誘導により骨格筋前駆細胞となった細胞と、骨格筋前駆細胞以外の細胞種へと分化された細胞とを含有しうる。
　本発明において、「骨格筋」とは、成熟筋を意味し、筋繊維すなわち多核細胞である筋細胞を含む。また、本発明において「骨格筋前駆細胞」とは、成熟した筋細胞へは至っていないもののその前段階にある細胞であって、筋細胞へ選択的に分化し得る能力を有する細胞を意味する。ここで、骨格筋前駆細胞は、骨芽細胞や脂肪細胞などの他の中胚葉細胞への分化能を全く有しないことを意味するものではなく、場合によっては、筋細胞以外の細胞への分化能を有している細胞も本発明の骨格筋前駆細胞に包含され得る。骨格筋前駆細胞は、特定の遺伝子の発現によって特徴づけられ、例えば、MyoD、Myf5、Pax7、Myogenin、ミオシン重鎖、NCAM、Desmin、SkMAct、MF20、M-Cadherin、Fgfr4およびVCAME1から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子の発現を検出することによって同定可能である。本発明における骨格筋前駆細胞は、好ましくは、Myf5陽性の細胞であり得、より好ましくは、Myf5およびPax7陽性の細胞である。本発明における骨格筋前駆細胞は、特に断りがない限り、骨格筋幹細胞またはサテライト細胞を含むものとする。
＜miRNA応答性mRNA＞
　本発明において、miRNA応答性mRNAとは、(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列（以下、miRNA標的配列という）を含む核酸、および(ii) マーカータンパク質をコードする配列を含む核酸を含み、当該(ii)のマーカータンパク質の翻訳が、当該(i)の核酸配列により制御されるよう機能的に連結されているmRNAである。
　本発明において、当該(i)の核酸配列により制御されるとは、骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAの存在量に応じて、miRNA応答性mRNAが翻訳の阻害または分解等を受けて、マーカータンパク質の翻訳量が抑制されることを意味する。
　本発明における「miRNA」とは、mRNAからタンパク質への翻訳の阻害やmRNAの分解を通して、遺伝子の発現調節に関与する、細胞内に存在する短鎖（20-25塩基）のノンコーディングRNAである。このmiRNAは、DNAからmiRNAとその相補鎖を含むヘアピンループ構造を取ることが可能な一本鎖のpri-miRNAとして転写され、核内にあるDroshaと呼ばれる酵素により一部が切断されpre-miRNAとなって核外に輸送された後、さらにDicerによって切断されて機能する。
　本発明において使用される前記(i)の「骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNA」とは、骨格筋前駆細胞以外の細胞と比較して骨格筋前駆細胞でより高く発現しているmiRNAであれば特に限定されない。例えば、骨格筋前駆細胞以外の細胞と比較して骨格筋前駆細胞において、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上あるいはそれ以上の割合で高く発現しているmiRNAであってよいが、これらには限定されない。このようなmiRNAは、データベースの情報（例えば、http://www.mirbase.org/又はhttp://www.microrna.org/）に登録されたmiRNA、及び／または当該データベースに記載されている文献情報に記載されたmiRNAより適宜選択することができる。本発明において、前記(i)の「骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNA」は、好ましくは、hsa-miR-1、hsa-miR-133およびhsa-miR-206から生成する短鎖ノンコーディングRNA（それぞれ、miR-1、miR-133およびmiR-206ともいう）であり、より好ましいmiR-1は、hsa-miR-1-3p（配列番号１）であり、より好ましいmiR-133は、hsa-miR-133a-3p（配列番号２）である。本発明において、好ましい骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAは、hsa-miR-206（配列番号３）である。
　本発明において、前記(i)の「骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される」とは、当該miRNAが、所定の複数のタンパク質と相互作用して、RNA-induced silencing complex（ＲＩＳＣ）を形成した状態にあるmiRNAが存在していることをいうものとする。
　本発明において、miRNAの標的配列は、例えば、当該miRNAに完全に相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該miRNA標的配列は、miRNAにおいて認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該miRNAに完全に相補的な配列からの不一致は、所望の細胞において、通常にmiRNAが認識し得る不一致であれば良く、生体内における細胞内の本来の機能では、４０～５０％ 程度の不一致があっても良い。このような不一致は、特に限定されないが、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、若しくは１０塩基又は全認識配列の１％、５％、１０％、２０％、３０％、若しくは４０％の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えている mRNA 上のmiRNA 標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわちmiRNA の 3’ 側 16 塩基程度に対応する、標的配列内の 5’ 側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、１塩基、２塩基、若しくは３塩基の不一致を含んでもよい。このような配列は、当該ＲＩＳＣが特異的に結合する塩基数を含む塩基長であればよく、長さは別段限定されないが、好ましくは、１８塩基以上、２４塩基未満の配列、より好ましくは、２０塩基以上、２２塩基未満の配列である。本発明において、miRNAの標的配列は、骨格筋前駆細胞および骨格筋前駆細胞以外の細胞へ当該配列を有するmiRNA応答性mRNAを導入し、骨格筋前駆細胞においてのみ対応するマーカータンパク質の翻訳が抑制されることを確認することによって、適宜決定して用いることができる。本発明において、「骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNA」に対応する、好ましいmiRNAの標的配列を表１に例示する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明において使用される「マーカータンパク質」とは、細胞内で翻訳されて、マーカーとして機能し、細胞の選別を可能にする任意のタンパク質である。細胞内で翻訳されてマーカーとして機能しうるタンパク質としては、一例としては、蛍光タンパク質、発光タンパク質、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパク質、膜タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質、または自殺タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において、蛍光タンパク質としては、Sirius、TagBFP、EBFPなどの青色蛍光タンパク質；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFPなどのシアン蛍光タンパク質；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green (例えば、hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPerなどの緑色蛍光タンパク質；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBananaなどの黄色蛍光タンパク質；KusabiraOrange (例えば、hmKO2)、mOrangeなどの橙色蛍光タンパク質；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberryなどの赤色蛍光タンパク質；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed（例えば、hdKeimaRed）、mRasberry、mPlumなどの近赤外蛍光タンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。
　本発明において、発光タンパク質としては、イクオリンを例示することができるが、これに限定されない。また、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパク質として、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βラクタマーゼなどの蛍光、発光又は呈色前駆物質を分解する酵素を例示することができるが、これらには限定されない。ここで本発明において、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパク質をマーカーとして使用する場合、骨格筋前駆細胞の選別において、対応する前駆物質と細胞群を接触させること、又は細胞群内に対応する前駆物質を導入することによって行われ得る。
　本発明において、アポトーシス誘導タンパク質とは、細胞に対してアポトーシス誘導活性を有するタンパク質を意味する。例えば、IκB、Smac/DIABLO、ICE、HtrA2/OMI、AIF、endonuclease G、Bax、Bak、Noxa、Hrk (harakiri)、Mtd、Bim、Bad、Bid、PUMA、activated caspase-3、Fas、Tk等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において自殺タンパク質とは、細胞におけるその発現がその細胞にとって致死的であるタンパク質を意味する。本発明において、自殺タンパク質は、それ自体で細胞死をもたらすもの（例えば、ジフテリアＡ毒素）であってもよく、またはこのタンパク質が、特定の薬物に対して細胞を感受性にするもの（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼにより、抗ウイルス化合物に対して細胞を感受性にする）であってもよい。自殺タンパク質として、例えば、ジフテリアＡ毒素、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（HSV-TK）、カルボキシペプチダーゼG2（CPG2）、カルボキシルエステラーゼ（CA）、シトシンデアミナーゼ（CD）、チトクロームP450（cyt-450）、デオキシシチジンキナーゼ（dCK）、ニトロレダクターゼ（NR）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）、チミジンホスホリラーゼ（TP）、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（VZV-TK）、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において、上記マーカータンパク質は、局在化シグナルを備えていてもよい。局在化シグナルとしては、核局在化シグナル、細胞膜局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、タンパク質分泌シグナル等を挙げることができ、具体的には、古典的核移行配列（NLS）、Ｍ９配列、ミトコンドリア標的配列 (MTS)、小胞体移行配列を挙げることができるが、これらには限定されない。このような局在化シグナルは、後述するイメージングサイトメトリー等により画像上で細胞の選別を行うときに特に有利である。
　本発明において、(ii)のマーカータンパク質の翻訳が、当該(i)の核酸配列により制御されるよう機能的に連結されているとは、マーカータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ただし、開始コドンを含む。）の５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、及び／または当該オープンリーディングフレーム内に、少なくとも１つのmiRNAの標的配列を備えることを意味する。miRNA応答性mRNAは、好ましくは、５’末端から、５’から３’の向きに、Ｃａｐ構造（７メチルグアノシン５’リン酸）、マーカータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム並びに、ポリＡテイルを備え、５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、及び／またはオープンリーディングフレーム内に少なくとも１つのmiRNAの標的配列を備える。mRNAにおけるmiRNAの標的配列の位置は、５’ＵＴＲであっても、３’ＵＴＲであってもよく、オープンリーディングフレーム内（開始コドンの３’側）であってもよく、これらのすべてにmiRNAの標的配列を備えていてもよい。したがって、miRNA標的配列の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つあるいはそれ以上であっても良い。
　好ましくは、miRNA応答性mRNAは、(i)および(ii)の核酸が、5'から3'の方向にこの順序で連結されている。したがって、miRNAの標的配列は、５’ＵＴＲに１つ存在すればよい。効率的な翻訳抑制を達成することができるためである。このとき、ｃａｐ構造とmiRNAの標的配列との間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよい。例えば、ｃａｐ構造とmiRNA標的配列との間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるように設計することができる。また、miRNA標的配列と開始コドンとの間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよく、miRNA標的配列と開始コドンと間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるような配置にて設計することができる。
　本発明において、miRNA応答性mRNA 中のmiRNA標的配列内には、開始コドンとなるAUGが存在しないことが好ましい。例えば、miRNAの標的配列が５’ＵＴＲに存在し、かつ、当該標的配列内にAUGを含む場合には、３'側に連結されるマーカータンパク質をコードする配列との関係上でインフレームとなるように設計されることが好ましい。あるいは、標的配列内にAUGを含む場合、標的配列内のAUGをGUGに変換して使用することも可能である。また、標的配列内のAUGの影響を最小限に留めるために、５’ＵＴＲ内における標的配列の配置場所を適宜変更することができる。例えば、ｃａｐ構造と標的配列内のAUG配列との間の塩基数が、０～６０塩基、例えば、０～１５塩基、１０～２０塩基、２０～３０塩基、３０～４０塩基、４０～５０塩基、５０～６０塩基となるような配置にて設計され得る。
　本発明における、mRNAは、細胞毒性を低減させることを目的として、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン、５－メチルシチジンなどの修飾塩基を含んでいることが好ましい。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
　本発明において、miRNAの標的配列が５’ＵＴＲに存在する場合、例えば、下記の表２に記載の配列が採用され得るが、miRNAの標的配列以外は、特に限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明において、miRNA応答性mRNAは、マーカータンパク質を翻訳するために必要となる。それに続くマーカータンパク質をコードする配列の下流（すなわち、３’ＵＴＲ）は、ポリA配列を有していれば特に限定されないが、miRNAの標的配列が５’ＵＴＲに存在する場合、例えば、下記表３に記載の配列が採用され得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　miRNA応答性mRNAは、上記に従って配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。特には、プロモーター配列を含むテンプレートDNAを鋳型として用いたin vitro合成法により、得ることができる。
　なお、本実施態様による選別方法を実施する前に、その選別における有効性を検討するスクリーニング工程を実施してもよい。具体的には、上記に例示したような５’UTRを有する、候補となる複数種のmiRNA応答性mRNAを作製して、それぞれを純度が既知の骨格筋前駆細胞群に導入し、選別の有効性が高いmiRNAの標的配列並びにmiRNA応答性mRNAを決定することができる。このような工程は、実施例においても詳述している。
＜骨格筋前駆細胞の選別方法＞
　本発明の骨格筋前駆細胞の選別において、miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程、および前記miRNA応答性mRNAに含まれるマーカータンパク質の翻訳量が少ないまたは検出できない細胞を選別する工程を含む。
　導入されるmiRNA応答性mRNAは、１種のみ用いる場合もあり、２種以上、例えば、３種、４種、５種、６種、７種、または８種以上用いる場合もある。例えば、２種以上のmiRNA応答性mRNAを用いる場合、それぞれのmiRNA応答性mRNAは、miRNA標的配列、マーカータンパク質ともに、異なることが望ましい。また、２種以上のmiRNA応答性mRNAを用いる場合、miRNA応答性mRNAに含まれるmiRNA標的配列の数、miRNA標的配列の５’末端からの距離、並びにmiRNA応答性mRNAにおけるその他の構造的特徴は、各miRNA応答性mRNAにおいて同一であっても良く、異なっていても良い。あるいは、miRNA標的配列は同一であるが、マーカータンパク質は異なるmiRNA応答性mRNAを用いることも可能である。例えば、異なる経路でシグナル伝達するアポトーシス誘導タンパク質をコードする配列を含む核酸、例えば、FasとBimなどを同一のmiRNA標的配列と組み合わせたmiRNA応答性mRNAを用いることも可能であり、この場合には、骨格筋前駆細胞以外の細胞の除去を効率よく行うことが期待できる。
　本発明において、miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程は、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて、１種以上のmiRNA応答性mRNAを直接、細胞群に含まれる細胞に導入する。異なる２種以上のmiRNA応答性mRNAを導入する場合、あるいはmiRNA応答性mRNAと、後述するコントロールとなるmRNA（以下、コントロールmRNAまたはトランスフェクションコントロールとも指称する）とを用いる場合には、複数のmRNAを細胞群に共導入することが好ましい。共導入した２種以上のmRNAの細胞内での割合は個々の細胞で維持されるため、これらのmRNAから発現するタンパク質の活性比は、細胞集団内において一定となるためである。この時の導入量は、導入される細胞群、導入するmRNA、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。
　本発明において、コントロールmRNAとは、miRNA応答性mRNAに含有されるマーカータンパク質以外のマーカータンパク質をコードする配列または薬剤耐性タンパク質をコードする配列を含むmRNAであって、miRNAの標的部位を有さないmRNAが例示される。コントロールmRNAから翻訳されるマーカータンパク質は、当該マーカータンパク質の翻訳により細胞死を起こさないタンパク質が好ましく、従って、蛍光タンパク質、発光タンパク質、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパク質、膜タンパク質が好適に用いられる。
　本発明において使用される「薬剤耐性タンパク質」は、対応する薬剤に対して抵抗性を有するタンパク質であれば何でもよい。例えば、抗生物質耐性遺伝子にコードされるタンパク質を含むが、これらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。本発明において、好ましくは、ピューロマイシン耐性遺伝子またはブラストサイジン耐性遺伝子が抗生物質耐性遺伝子として用いられる。
　本発明の一実施態様による選別方法において、より好ましくは、miRNA応答性mRNAとコントロールmRNAを同時に、対象となる細胞群へ導入する工程を含む。かかる工程は、好ましくは、miRNA応答性mRNAとコントロールmRNAとの共導入により実施することができる。コントロールmRNAを用いることで、miRNA応答性mRNAの細胞への導入効率が低い場合においても、miRNA応答性mRNAから翻訳されるマーカータンパク質が低いまたは翻訳されない細胞を骨格筋前駆細胞として選別することが可能となる。本発明において、コントロールmRNAを用いる場合、コントロールmRNAの導入量もまた、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。
　本発明において、コントロールmRNAを用いる場合、当該コントロールmRNAから翻訳されるマーカータンパク質は、miRNA応答性mRNAに含まれるマーカータンパク質と異なることが好ましい。例えば、miRNA応答性mRNAに含まれるマーカータンパク質がアポトーシス誘導タンパク質である場合、コントロールmRNAに含まれるマーカータンパク質は、蛍光タンパク質であり得る。この場合、アポトーシス誘導タンパク質の発現が抑制され生存し、さらに蛍光タンパク質で標識された細胞を骨格筋前駆細胞として選別することができる。
　また、薬剤耐性タンパク質をコードする配列を含むコントロールmRNAは、任意のマーカータンパク質を翻訳するmiRNA応答性mRNAとともに用いることができる。この場合、対応する薬剤に対して耐性である細胞のうち、マーカータンパク質の発現しない、または低減した細胞を骨格筋前駆細胞として選別することができる。
　一方、miRNA応答性mRNAに含まれるマーカータンパク質およびコントロールmRNAに含まれるマーカータンパク質が蛍光タンパク質である場合には、両蛍光タンパク質の蛍光波長が異なることが望ましい。
　本発明におけるコントロールmRNAは、別段限定されることはないが、例えば、実施例に示すEGFP mRNA、tagBFP mRNA、tagRFP mRNAなどが挙げられる。
　本発明において、miRNA応答性mRNAに含まれるマーカータンパク質の翻訳量が少ないまたは検出できない細胞を選別する工程は、所定の検出装置を用いて、マーカータンパク質からの信号を検出することにより実施することができる。検出装置としては、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、CCDカメラ等が挙げられるが、これらには限定されない。このような検出装置は、マーカータンパク質により、当業者が適したものを用いることができる。例えば、マーカーが、蛍光タンパク質又は発光タンパク質の場合には、フローサイトメーターを用いて選別が可能であり、マーカーが、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパク質の場合には、顕微鏡を用いて、光応答性細胞培養器材をコーティングした培養皿を用いて、呈色等された細胞へ光照射し、照射されなかった細胞が培養皿から剥離されることを利用して選別することができ、マーカータンパク質が、膜局在タンパク質の場合には、抗体などの細胞表面タンパク質特異的な検出試薬と、上記の検出装置を用いたマーカータンパク質の定量方法が可能である他、磁気細胞分離装置(MACS)といった、マーカータンパク質の定量過程を経ない細胞の単離方法が可能であり、マーカータンパク質が薬剤耐性遺伝子の場合、薬剤投与によりマーカータンパク質の発現を検出して、生細胞を単離する方法が可能である。
　本発明において、細胞を選別するとは、miRNA応答性mRNAを用いて選別する工程を経ていない細胞群より高い純度で骨格筋前駆細胞を単離することを意味する。本発明において、選別された細胞の純度は、miRNA応答性mRNAを用いて選別する工程を経ていない場合と比較して高純度であれば別段限定されないが、60%以上であることが好ましく、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%および100%が例示される。
＜多能性幹細胞＞
　本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば、胚性幹(ES)細胞、精子幹(GS)細胞、胚性生殖(EG)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、Muse細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、iPS細胞およびntES細胞であり、筋原性疾患治療に用いるという観点から、より好ましくは、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞であり、さらに好ましくは、ヒトiPS細胞である。
(A) 胚性幹細胞
　ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
　ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され(M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
　ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006),Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
　ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSRおよび4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F-12培養液を使用し、37℃、2% CO2/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3～4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2および20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
　ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
　ヒトＥＳ細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
(B) 精子幹細胞
　精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41～46頁,羊土社(東京、日本))。
(C) 胚性生殖細胞
　胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
(D) 人工多能性幹細胞
　人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720に記載の組み合わせが例示される。
　上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGF-β阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
　初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
　また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
　iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10～15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
　培養法の例としては、例えば、37℃、5％ CO2存在下にて、10％FBS含有DMEMまたはDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30～約45日またはそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25～約30日またはそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
　上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103～約5×106細胞の範囲である。
　iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
　本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。例えば、主たるHLA(例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座、あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。
(E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
　ntES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がntES(nuclear transfer ES)細胞である。ntES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et
al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47～52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
(F) Multilineage-differentiating Stress Enduring cells（Muse細胞）
　Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
＜多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を製造する方法＞
　本発明によれば、多能性細胞から骨格筋前駆細胞を製造するにあたって、以下の工程を含む方法を用いることができる；
（１）多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
（２）（１）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程、
（３）（２）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程、
（４）（３）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程、および
（５）（４）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程。
　本発明における骨格筋前駆細胞の分化誘導方法について、下記に詳述する。
分化誘導前準備
　本工程では、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞への分化誘導に先立って、多能性幹細胞を培養する工程を含み得る。ここでは、多能性幹細胞を任意の方法で分離し、浮遊培養により培養してもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養により培養してもよい。本工程では、好ましくは、接着培養が用いられる。ここで、多能性幹細胞の分離方法としては、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法、Trypsin/ EDTAを用いた解離方法などが挙げられる。好ましくは、Trypsin/ EDTAを用いて細胞を解離する方法が用いられる。
　本発明において、浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することで胚様体を形成させることであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックスなどによるコーティング処理）されていない培養皿、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）した培養皿を使用して行うことができる。
　本発明において、接着培養とは、フィーダー細胞上で、または細胞外基質によりコーティング処理された培養容器を用いて培養することによって行い得る。コーティング処理は、細胞外基質を含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。
　本発明において、フィーダー細胞とは、目的の細胞の培養条件を整えるために用いる補助的役割を果たす他の細胞を意味する。本発明において、細胞外基質とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物（組換え体）であってもよい。例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ラミニンといった物質またはこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、BD Matrigel(TM)などの細胞からの調製物であってもよい。人工物としては、ラミニンの断片が例示される。本発明において、ラミニンとは、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ1本ずつ持つヘテロ三量体構造を有するタンパク質であり、特に限定されないが、例えば、α鎖は、α１、α２、α３、α４またはα５であり、β鎖は、β１、β２またはβ３であり、ならびにγ鎖は、γ１、γ２またはγ３が例示される。本発明において、ラミニンの断片とは、インテグリン結合活性を有しているラミニンの断片であれば、特に限定されないが、例えば、エラスターゼにて消化して得られる断片であるE8フラグメントが例示される。
　多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞への分化誘導に先立って、多能性幹細胞を培養する工程は、好ましくは、接着培養であり、当該接着培養は、Matrigel(TM)でコーティングされた培養容器を用いた接着培養であり得る。多能性幹細胞を培養する工程において、使用する培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium、mTeSR1およびこれらの混合培地などが包含される。本工程において、好ましくは、mTeSR1が用いられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい培地は、mTeSR1である。
　多能性幹細胞を培養する工程の培養期間は、1日以上10日以下が例示され、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日などであり得て、好ましくは、4日である。
　多能性幹細胞を培養する工程において、多能性幹細胞を分離する場合、培地中に、ROCK阻害剤が含まれていることが好ましい。ROCK阻害剤は、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものであれば特に限定されないが、例えば、Y-27632が本発明において好適に使用され得る。
　培地中におけるY-27632の濃度は、特に限定されないが、1μM～50μMが好ましく、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM 、45μM、50μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10μMである。
　培地中に、ROCK阻害剤を添加する期間は、多能性幹細胞を培養する工程の培養期間であってもよく、単一分散時の細胞死を抑制する期間であればよく、例えば、少なくとも1日である。
　多能性幹細胞を培養する工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2～5％、好ましくは5％である。
　多能性幹細胞を培養する工程において、培養期間の途中で培地交換を行うことができる。培地交換に用いられる培地は、培地交換前の培地と同じ成分を有する培地であっても、異なる成分を有する培地であってもよい。好ましくは、同じ成分を有する培地が用いられる。培地交換の時期は、特に限定されないが、新鮮な培地での培養を開始してから、例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎に行われる。本工程において、培地交換は、好ましくは、2日毎に行われる。
工程（１）：多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程
　本工程（１）は、多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程である。本工程（１）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium、およびこれらの混合培地などが包含される。本工程（１）において、好ましくは、IMDM培地およびHam's F12培地の混合培地である。
　基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。本工程（１）において、好ましい基礎培地は、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、セレンおよびチオールグリセロールを添加したIMDM培地およびHam's F12培地の混合培地である。
　本発明において、TGF-β阻害剤は、TGF-βの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質である限り特に限定されないが、例えば、TGF-βの受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、ALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質などが挙げられる。本発明において、TGF-β阻害剤は、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009146408) およびこれらの誘導体などが例示される。
　本工程（１）で使用されるTGF-β阻害剤は、好ましくは、SB431542であり得る。
　培地中におけるSB431542の濃度は、特に限定されないが、1μM～50μMが好ましく、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10μMである。 
　本発明において、GSK3β阻害剤は、GSK3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、GSK3β阻害剤として最初に見出されたLithium chloride (LiCl)、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。
　本工程（１）で使用されるGSK3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
　培地中におけるCHIR99021の濃度は、特に限定されないが、例えば1μM～50μMの範囲内、好ましくは5μM～50μMの範囲内にあり、例えば、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM 、45μM、50μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、GSK3β阻害において使用される濃度である1μMよりも高い濃度が使用され、より好ましくは、5μM以上である。
　本工程（１）において、培養期間は、10日以上30日以下が例示され、例えば、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日などであり得て、好ましくは、21日である。
　本工程（１）において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2～5％、好ましくは5％である。
　本工程（１）において、所望の細胞の含有率を上昇させる観点から、好ましくは、工程内において継代を含む。本発明において、継代とは、培養中の細胞を容器から解離させ、再播種する操作である。細胞を解離させる工程においては、互いに接着して集団を形成している細胞を個々の細胞に解離（分離）させる。細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)など）、コラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法、Trypsin/ EDTAを用いた解離方法などが挙げられる。好ましくは、Trypsin/ EDTAを用いて細胞を解離する方法が用いられる。
　本工程（１）において、継代は、特に限定されないが、本工程の開始から4～10日毎、例えば、4日毎、5日毎、6日毎、7日毎、8日毎、9日毎、10日毎、好ましくは、7日毎に行われる。
　継代直後の培養液は、再播種された細胞の細胞死を防ぐ目的で、ROCK阻害剤を含んでいてもよい。ROCK阻害剤は、前記と同様の条件で用いることができる。
　本工程（１）において、適宜培地交換を行うことが望ましい。培地交換の時期は、特に限定されないが、新鮮な培地での培養を開始してから、例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎に行われる。本工程において、培地交換は、好ましくは、2日毎に行われる。
工程（２）：TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程
　本工程（２）は、前記工程（１）で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程である。本工程（２）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium、SF-O3培地（エーディア株式会社）およびこれらの混合培地などが包含される。本工程（２）において、好ましくは、SF-O3培地が用いられる。
　基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。本工程（２）において、好ましい基礎培地は、アルブミンおよび2-メルカプトエタノールを添加したSF-O3培地である。
　本工程（２）で使用するTGF-β阻害剤は、前記と同様のものを用いることができるが、好ましくは、SB431542であり得る。本工程（２）で使用する培地中におけるSB431542の濃度は、特に限定されないが、1μM～50μMが好ましく、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM 、45μM、50μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10μMである。 
　本工程（２）で使用されるGSK3β阻害剤は、前記と同様のものを用いることができるが、好ましくは、LiClであり得る。本工程（２）で使用する培地中におけるLiClの濃度は、特に限定されないが、1mM～50mMが好ましく、例えば、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、5mMである。 
　本工程（２）で使用する培地中におけるIGF1の濃度は、特に限定されないが、例えば1ng/ml～100ng/mlの範囲内、好ましくは1ng/ml～50ng/mlの範囲内にあり、例えば、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35g/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10ng/mlである。
　本工程（２）で使用する培地中におけるHGFの濃度は、特に限定されないが、例えば1ng/ml～100ng/mlの範囲内、好ましくは1ng/ml～50ng/mlの範囲内にあり、例えば、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35g/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10ng/mlである。
　本工程（２）で使用する培地中におけるbFGFの濃度は、特に限定されないが、例えば1ng/ml～100ng/mlの範囲内、好ましくは1ng/ml～50ng/mlの範囲内にあり、例えば、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35g/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10ng/mlである。
　本工程（２）において、培養期間は、1日以上10日以下が例示され、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日などであり得て、好ましくは、4日である。
　本工程（２）において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2～5％、好ましくは5％である。
工程（３）：TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程
　本工程（３）は、前記工程（２）で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程である。本工程（３）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium、SF-O3培地およびこれらの混合培地などが包含される。本工程（３）において、好ましくは、SF-O3培地が用いられる。
　基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。本工程（３）において、好ましい基礎培地は、アルブミンおよび2-メルカプトエタノールを添加したSF-O3培地である。
　本工程（３）で使用するTGF-β阻害剤は、前記と同様のものを用いることができるが、好ましくは、SB431542であり得る。本工程（３）で使用する培地中におけるSB431542の濃度は、特に限定されないが、1μM～50μMが好ましく、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM 、45μM、50μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10μMである。 
　本工程（３）で使用されるGSK3β阻害剤は、前記と同様のものを用いることができるが、好ましくは、LiClであり得る。本工程（３）で使用する培地中におけるLiClの濃度は、特に限定されないが、1mM～50mMが好ましく、例えば、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、5mMである。
　本工程（３）で使用される培地中におけるIGF1の濃度は、特に限定されないが、例えば1ng/ml～100ng/mlの範囲内、好ましくは1ng/ml～50ng/mlの範囲内にあり、例えば、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35g/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10ng/mlである。
　本工程（３）において、培養期間は、1日以上10日以下が例示され、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日などであり得て、好ましくは、3日である。
　本工程（３）において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2～5％、好ましくは5％である。
工程（４）：TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程
　本工程（４）は、前記工程（３）で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程である。本工程（４）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium、SF-O3培地およびこれらの混合培地などが包含される。本工程（４）において、好ましくは、SF-O3培地が用いられる。
　基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。本工程（４）において、好ましい基礎培地は、アルブミンおよび2-メルカプトエタノールを添加したSF-O3培地である。
　本工程（４）で使用するTGF-β阻害剤は、前記と同様のものを用いることができるが、好ましくは、SB431542であり得る。本工程（４）で使用する培地中におけるSB431542の濃度は、特に限定されないが、1μM～50μMが好ましく、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM 、45μM、50μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10μMである。
　本工程（４）で使用される培地中におけるIGF1の濃度は、特に限定されないが、例えば1ng/ml～100ng/mlの範囲内、好ましくは1ng/ml～50ng/mlの範囲内にあり、例えば、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35g/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10ng/mlである。
　本工程（４）で使用される培地中におけるHGFの濃度は、特に限定されないが、例えば、1ng/ml～100ng/mlの範囲内、好ましくは、1ng/ml～50ng/mlの範囲内にあり、例えば、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35g/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10ng/mlである。
　本工程（４）において、培養期間は、7日以上20日以下が例示され、例えば、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日などであり得て、好ましくは、14日である。
　本工程（４）において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2～5％、好ましくは5％である。
　本工程（４）において、適宜培地交換を行うことが望ましい。培地交換の時期は、特に限定されないが、新鮮な培地での培養を開始してから、例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎に行われる。好ましくは、2日毎に行われる。あるいは、別の観点から培地交換は、新鮮な培地での培養を開始してから、例えば、週1回、週2回、週3回、週4回行われ得る。好ましくは、週2回行われる。
工程（５）：TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程
　本工程（５）は、前記工程（４）で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程である。本工程（５）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base mediumおよびこれらの混合培地などが包含される。本工程（５）において、好ましくは、DMEM培地が用いられる。
　基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。本工程（５）において、好ましい基礎培地は、血清、L-グルタミンおよび2-メルカプトエタノールを添加したDMEM培地である。本工程（５）において用いる血清は、好ましくは、ウマ血清であり、基礎培地中の濃度は、１から１０％、より好ましくは、２％である。
　本工程（５）で使用するTGF-β阻害剤は、前記と同様のものを用いることができるが、好ましくは、SB431542であり得る。本工程（５）で使用される培地中におけるSB431542の濃度は、特に限定されないが、500nM～50μMが好ましく、例えば、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM 、45μM、50μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、5μMである。
　本工程（５）で使用される培地中におけるIGF1の濃度は、特に限定されないが、例えば1ng/ml～100ng/mlの範囲内、好ましくは1ng/ml～50ng/mlの範囲内にあり、例えば、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35g/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10ng/mlである。
　本工程（５）において、培養期間は、長期にわたることで骨格筋前駆細胞の誘導において特段の影響はでないことから特に上限はないが、9日以上100日以下が例示され、好ましくは、9日以上75日以下、9日以上60日以下である。例えば、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日、31日、32日、33日、34日、35日、36日、37日、38日、39日、40日、41日、42日、43日、44日、45日、46日、47日、48日、49日、50日、51日、52日、および53日などが挙げられる。
　本工程（５）において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2～5％、好ましくは5％である。
　本工程（５）において、適宜培地交換を行うことが望ましい。培地交換の時期は、特に限定されないが、新鮮な培地での培養を開始してから、例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎に行われる。好ましくは、2日毎に行われる。あるいは、別の観点から培地交換は、新鮮な培地での培養を開始してから、例えば、週1回、週2回、週3回、週4回行われ得る。好ましくは、週2回行われる。
＜多能性幹細胞からの骨格筋前駆細胞製造用キット＞
　本発明の一つの態様において、多能性幹細胞からの骨格筋前駆細胞の製造用キットを提供する。本キットには、上記したmiRNA応答性mRNAに加えて、骨格筋前駆細胞の誘導のための特定の因子を含む骨格筋前駆細胞誘導剤（例えば、凍結乾燥物、適当な緩衝液に溶解した凍結液剤など）、細胞、試薬および培養液を含み得る。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
＜筋原性疾患治療剤＞
　本発明は、前記方法により選別された骨格筋前駆細胞を含む筋原性疾患治療剤を提供する。
　本発明における筋原性疾患は、例えば、筋ジストロフィー（例、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー等）、先天性ミオパチー、遠位型ミオパチー、ミトコンドリアミオパチーなどの遺伝性ミオパチー、多発性筋炎、皮膚筋炎、重症筋無力症などの非遺伝性ミオパチー筋ジストロフィー、糖原病、周期性四肢麻痺、が例示される。より好ましい対象は、筋ジストロフィーである。
　本発明において、筋原性疾患治療剤として、選別された骨格筋前駆細胞を用いる場合、選別された骨格筋前駆細胞を培養液中で再培養した後用いることが好ましい。再培用において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができ、例えば、前記工程（５）と同様の培地が用いられるが、これに限定されない。
　再培養の期間は、骨格筋前駆細胞を移植した際に、移植先における生着率が高まる期間であればいくらでもよいが、6時間以上60時間以下が例示され、例えば、6時間、12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間、48時間、54時間、60時間などであり得て、好ましくは、24時間である。
　筋ジストロフィーをはじめとする遺伝性筋疾患の治療用の骨格筋前駆細胞としては、患者とHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から誘導された多能性幹細胞から分化誘導した骨格筋前駆細胞が好ましく使用される。ヒトの再生医療においては、HLAの型が同一もしくは実質的に同一なヒトES細胞を入手することは容易でないため、骨格筋前駆細胞を誘導するための多能性幹細胞としては、ヒトiPS細胞を用いることが好ましい。
　別の一実施態様においては、遺伝性筋疾患治療用の骨格筋前駆細胞として、患者本人の体細胞由来のiPS細胞から分化させた骨格筋前駆細胞を用いることも可能である。例えば、DMD患者の体細胞から誘導したiPS細胞は、ジストロフィン遺伝子が欠損しているので、iPS細胞に正常なジストロフィン遺伝子を導入する。ジストロフィンcDNAは全長14kbで、筋細胞への遺伝子導入に最適なアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは約4.5kbの収容力しかないので、現在の遺伝子治療戦略としては、短縮化した機能的なジストロフィン遺伝子（マイクロジストロフィン遺伝子（3.7kb））をAAVベクターで導入するか、あるいはより大きなDNAを挿入できるレトロウイルス／レンチウイルスベクターを用いて6.4kbのミニジストロフィン遺伝子を導入する、または全長ジストロフィン遺伝子を裸でもしくはGuttedアデノウイルスベクターを用いて導入する方法が試みられている。iPS細胞の場合、レトロウイルス／レンチウイルスで最も高い導入効率が得られる他、人工染色体による全長cDNAの導入も可能であるため、遺伝子治療の選択肢が拡がるという利点がある。また肢帯型筋ジストロフィーの場合、サルコグリカン遺伝子異常が原因のため、該遺伝子をiPS細胞に導入すればよい。あるいは、iPS細胞の内因性DNA修復機構や相同組換えを利用して、原因遺伝子の変異部位を修復することもできる。即ち、変異部位を正常にした配列を有するキメラRNA/DNAオリゴヌクレオチド（chimeraplast）を導入し、標的配列に結合させてミスマッチを形成させ、内因性DNA修復機構を活性化して遺伝子修復を誘導する。あるいは、変異部位に相同な400-800塩基の一本鎖DNAを導入して相同組換えを起こさせることにより遺伝子修復を行なうこともできる。このようにして得られる、疾患原因遺伝子が修復されたiPS細胞を、上記工程を経て骨格筋前駆細胞に分化誘導することにより、患者本人由来の正常な骨格筋前駆細胞を製造することができる。
　遺伝性筋疾患患者は、生来、正常な遺伝子産物を有していないことから、患者本人の骨格筋前駆細胞であっても、正常遺伝子産物（例えば、ジストロフィン）に対する免疫応答が起きる可能性があるので、いずれにせよ、骨格筋前駆細胞の移植に際しては、免疫抑制剤を併用することが好ましい。あるいは、この免疫応答を回避する目的で、DMDの場合、患者骨格筋でも発現しているジストロフィンホモログであるユートロフィン遺伝子を導入してジストロフィン機能を代替させても良い。
　本発明の方法により選別された骨格筋前駆細胞は、細胞の形態で製剤化することもできる。
　本発明において製剤は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造され得る。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸リドカイン、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、など）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウムなど）などと配合しても良い。
　本発明の剤を水性懸濁液剤として製剤化する場合、上記水性液に約1.0×106-約1.0×107細胞/mLとなるように、骨格筋前駆細胞を懸濁させればよい。このようにして得られる製剤は、安定で低毒性であるので、ヒトなどの哺乳動物に対して安全に投与することができる。投与方法は特に限定されないが、好ましくは注射もしくは点滴投与であり、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与（患部局所投与）などが挙げられる。本発明の剤の投与量は、投与対象、治療標的部位、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、DMD患者（体重60kgとして）においては、例えば、静脈内注射の場合、１回につき骨格筋前駆細胞量として約1.0×105-約1×107細胞を、約1-約2週間隔で、約4-約8回投与するのが好都合である。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
＜Dox-MYOD1強制発現によるiPS細胞から骨格筋細胞への分化誘導法＞
　Dox依存的にMYOD1の強制発現が可能なヒトiPS細胞（以下、MYOD1-hiPSCsと言う。）はiPS細胞研究所櫻井英俊博士から分与を受けて用いた（PLoS One. 2013 Apr 23;8(4):e61540）。当該MYOD1-hiPSCsから骨格筋細胞へ分化誘導した。詳細には、マトリゲル（BD bioscience）でコートされた24 wellプレートにおいてbFGFを除いたiPS培地（霊長類ES細胞培地：Reprocell #RCHEMD001）で培養した。24時間後、1μg/mLのドキシサイクリン（LKT Laboratries）を培地に加えた。さらに24時間後、分化誘導培地-１（表４）に変えて分化9日目まで培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜PAX3-GFP、MYF5-tdTomatoレポーターiPS細胞＞
　ヒトiPS細胞（201B7）は、京都大学の山中教授より供与されたものを、従来の方法で培養した（Takahashi K, et al. Cell. 131:861-72, 2007）。当該201B7を常法に従ってBACコンストラクトを用いた相同組換えによりPax3遺伝子座の開始コドンの３’側へEGFP配列を連結させ、PAX3の発現と連携してEGFPを発現するiPS細胞株（PAX3-GFP iPSCs）を作製した。同様に、201B7を常法に従ってCRISPR/CAS9システムを用いた相同組換えにより、MYF5遺伝子座の開始コドンの５’側へtdTomato配列を連結させ、MYF5の発現と連携してtdTomatoを発現するiPS細胞株（MYF5-tdTomato C3 iPSCs）を作製した。どちらの細胞株も、片アレルのみに遺伝子組み換えが行われたことを確認している。
＜疾患iPS細胞株＞
　顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー患者より同意を得て採取した皮膚を培養することによって得られた線維芽細胞へ、Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit（Life Technologies）を用いて、Okita K et al., Nat Methods. 8:409-412, 2011に記載の方法に従って作製した（以下、疾患iPS細胞株という）。
＜骨格筋前駆細胞への分化誘導法＞
　iPS細胞（PAX3-GFP iPSCs、MYF5-tdTomato C3 iPSCs、201B7、または疾患iPS細胞株）から骨格筋細胞へ分化誘導した。詳細には、マトリゲル（BD bioscience）でコートされた6 wellプレート上で培養されたiPS細胞に対して10μM SB431542および5μM CHIR99021を添加したCDMi基本培地（1% Albumin from bovine serum (SIGMA)、1% Penicillin-Streptomycin Mixed Solution (26253-84 ナカライテスク)、1% CD Lipid Concentrate (Invitrogen)、1% Insulin-Trandferin-Selenium (Invitrogen)および0.5mM 1-Thioglycerol (SIGMA)を添加した１：１IMDM（Invitrogen）およびF12（Invitrogen）混合培地）（以下、分化培地Aと言う）を加えて培養した。以後、2日おきに培地交換を行った。7日後に継代し、マトリゲル（BD bioscience）でコートされた6 wellプレート上で培養された各iPS細胞に対して分化培地Aを加えて培養した。以後、2日おきに培地交換を行った。7日後に継代し、マトリゲル（BD bioscience）でコートされた6 wellプレートに分化培地Aを加えて培養した。24時間後に分化培地Aにて培地交換を行った。以後、2日おきに培地交換を行った。さらに６日後（誘導初日から14日後）、継代を行い、マトリゲル（BD bioscience）でコートされた6 wellプレートに分化培地Aを加えて培養した。24時間後に分化培地Aにて培地交換を行った。以後、2日おきに培地交換を行った。さらに6日後（分化誘導初日から21日後）、200μM 2-ME、5mM LiCl、10μM SB431542、10ng/ml IGF-1、10ng/ml HGFおよび10ng/ml bFGFを添加したSF-O3基本培地（0.2% BSA (Sigma)を添加したSF-O3 （三光純薬 SS1303））（以下、筋分化培地Aと言う）にて培地交換を行った。4日後（分化誘導初日から25日後）、200μM 2-ME、5mM LiCl、10μM SB431542および10ng/ml IGF-1を添加したSF-O3基本培地（以下、筋分化培地Bと言う）にて培地交換を行った。3日後（分化誘導初日から28日後）、200μM 2-ME、5mM LiCl、10μM SB431542、10ng/ml IGF-1および10ng/ml HGFを添加したSF-O3基本培地（以下、筋分化培地Cと言う）にて培地交換を行った。以後、週２回筋分化培地Cにて培地交換を行った。筋分化培地Cに変えてから14日後（分化誘導初日から42日後）、2% Horse Serum(HS)、5μM SB431542および10ng/ml IGF-1を添加したDMEM基本培地（1% Penicillin-Streptomycin Mixed Solution、1% L-gluthamine (ナカライテスク　#16948-04)および200μM 2-MEを添加したDMEM (Invitrogen #11960069)）（以下、筋分化培地Dと言う）にて培地交換を行った。以後、週２回筋分化培地Dにて培地交換を行った。筋分化培地D中での培養は、最長、分化誘導開始から95日まで行った。
＜in vitro transcriptionのためのDNA templateの作製＞
　蛍光タンパク質 (EGFP、tagBFPおよびtagRFP)をコードする遺伝子は、pEGFP-N1 (Clontech)、pTagBFP-Tubulin (evrogen)、またはpTAP-tagRFPを鋳型として、対応するプライマー（それぞれ、TAPEGFP_IVTfwd（配列番号１１）およびTAP_IVTrev（配列番号１４）、tagBFP fwd（配列番号１２）およびTAP_IVTrev、またはtagRFP fwd（配列番号１3）およびTAP_IVTrev）およびKOD-Plus-Neo（KOD-401,TOYOBO）を用いて、PCR（サイクル：94℃ 2分10秒、68℃ 30秒を20サイクル行い、15℃で保存）により得られた。PCR産物をMiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)を用いて精製した。PCR産物をそれぞれ、蛍光タンパク質カセット（EGFPカセット（配列番号１５）、tagBFPカセット（配列番号１６）またはtagRFPカセット（配列番号１７））と称す。
　5’-UTRは、IVT_5prime_UTR（IVT_5prime_UTR（配列番号１８））を鋳型として、対応するプライマー（TAP_T7_G3C fwd primer（配列番号１９）およびRev5UTR primer（配列番号２０））とKOD-Plus-Neo（KOD-401,TOYOBO）を用いて、PCR（サイクル：94℃ 2分後、98℃ 10秒、68℃ 10秒を13サイクル行い、15℃で保存）により増幅を行った。増幅されたPCR産物を、MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)を用いて精製した。得られたPCR産物をControl 5’-UTRカセットと言う（配列番号２１）。
　miRNA応答配列を有する5’-UTRカセットを、5UTR-miR-1カセット（配列番号２２）、5UTR-miR-133カセット（配列番号２３）、5UTR-miR-206カセット（配列番号２４）、5UTR-miR-489カセット（配列番号２５）または5UTR-miR-708カセット（配列番号２６））と称し、DNA合成により得た。
　3’-UTRは、IVT_3prime_UTR（IVT_3prime_UTR（配列番号２７））を鋳型として、対応するプライマー（Fwd3UTR primer（配列番号２８）およびRev3UTR2T20（配列番号２９））とKOD-Plus-Neo（KOD-401,TOYOBO）を用いて、PCR（サイクル：94℃ 2分後、98℃ 10 秒、68℃ 10秒を13サイクル行い、15℃で保存）により増幅を行った。増幅されたPCR産物を、MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)を用いて精製した。得られたPCR産物を3’-UTRカセット（配列番号３０）と称す。
　in vitro transcriptionにてControl 5’-UTR を含むmRNAを製造するためのDNA templateは、上記で作製された各蛍光タンパク質カセット、Control 5’-UTR、3’-UTRカセット、対応するプライマー（TAP_T7_G3C fwd primerおよび3UTR120A rev primer（配列番号３１））およびKOD-Plus-Neo（KOD-401,TOYOBO）を適宜選択して用いて、PCR（サイクル：94℃ 2分後、98℃ 10秒、68℃ 45秒を20サイクル行い、15℃で保存）により増幅を行った。in vitro transcriptionにて各5’-UTRカセットを含むmRNAを製造するためのDNA templateは、上記で作製された各蛍光タンパク質カセット、各5’-UTRカセット、3’-UTRカセット、対応するプライマー（GCT7pro_5UTR2（配列番号３２）および3UTR120A rev primer）およびKOD-Plus-Neo（KOD-401,TOYOBO）をPCR（サイクル：94℃ 2分後、98℃ 10 秒、60℃ 30秒、68℃ 45秒を20サイクル行い、15℃で保存）増幅されたPCR産物を、MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)を用いて精製を行った。得られたPCR産物をそれぞれ、EGFP DNA template（配列番号３３）、tagBFP DNA template（配列番号３４）,tagRFP DNA template（配列番号３５）miR-206-EGFP DNA template（配列番号３６）、miR-1-tagBFP DNA template（配列番号３７）、miR-133-tagBFP DNA template（配列番号３８）、miR-206-tagBFP DNA template（配列番号３９）、miR-489-tagBFP DNA template（配列番号４０）、miR-708-tagBFP DNA template（配列番号４１）と称す。
＜in vitro transcription＞
　MEGAscript T7 kit (Ambion)と上記で作製されたDNA templateを用いてmRNA合成を行った。この反応において、ウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に替えて、シュードウリジン－5’ －三リン酸及びメチルシチジン-5’-三リン酸(TriLink BioTechnologies)をそれぞれ用いた。IVT(mRNA合成)反応の前に、グアニジン-5’-三リン酸は、Anti Reverse cap Analog (New England Biolabs)で5倍希釈した。反応混合液を37℃で5時間インキュベートして、TURBO DNase (Amibion)を加えた後、37℃でさらに30分インキュベートした。得られたmRNAは、FavorPrep Blood ／ Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech)で精製し、Antarctic phosphatase (New England Biolabs)を用いて37℃で30分インキュベートした。その後、RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN)により、さらに精製した。得られたmRNAをそれぞれ、EGFP mRNA（配列番号４２）、tagBFP mRNA（配列番号４３）、tagRFP mRNA（配列番号４４）、miR-206-EGFPスイッチ（配列番号４５）、miR-1-tagBFPスイッチ（配列番号４６）、miR-133-tagBFPスイッチ（配列番号４７）、miR-206-tagBFPスイッチ（配列番号４８）、miR-489-tagBFPスイッチ（配列番号４９）、およびmiR-708-tagBFPスイッチ（配列番号５０）と称す。
＜miRNAスイッチを用いた解析＞
　miRNAの発現に応答して蛍光タンパク質の翻訳を抑制するmRNA（以下、miRNAスイッチという）と共にmiRNA応答性のmRNAとは異なる蛍光タンパク質の遺伝子をコードしたmRNA（以下、トランスフェクションコントロールという）をそれぞれの細胞に導入した。細胞を播種せずmRNA導入を行う場合は、Stemfect RNA transfection kit（Stemgent）を用いて以下の方法で行った。1.5 mL tube内にStemfect Transfection Buffer と2種類のmRNAが12.5 μLになるように調製し、もう一方の1.5mL tubeに1μLのStemfect RNA Transfection ReagentとStemfect Transfection Bufferが12.5 μLになるように調製した。調製された上記の2種類の溶液を混合し、室温で15分間インキュベートした。混合液を全量、細胞が培養されているwell（24well plate）に加え37℃、5%CO2下で4 時間インキュベートした。その後、培地を除き、500 μLの培地（DMEM 2%HS）をwellに加えた。24時間後、fluorescence activated cell sorting（BD、以下FACS）を用いて解析を行った。細胞を播種してmRNA導入を行う場合は、24well plateで培養されている細胞に200 μLのAccumax（フナコシ）を加え、37℃、5%CO2下で10-15分インキュベートした後、500 μLの培地（DMEM 2%HS）を加え15 mL tubeに回収して4℃、2000 rpm、10分で遠心を行い、上清を取り除いた。500 μLの培地を加えピペッティングした後、cell countess（invitrogen）で細胞数を計測後、必要に応じて希釈した。24well plateにまき直す場合は 2×105 cell/well、6well plateにまき直す場合は1×106 cell/wellで細胞をまき直した。細胞をwellにまくと同時に調製された（上記の方法）mRNAを含む混合液をwellに加えた。37℃、5%CO2下で4 時間インキュベートした。その後、培地を除き、必要量の培地（DMEM 2%HS）をwellに加えた。24時間後、FACSを用いて解析を行った。
＜FACSによる解析＞
　各解析対象の細胞に24 well plate、1 wellあたり200 μLのAccumax（フナコシ）を加え（6 well plateでは1mL）加え、37℃、5%CO2下で10-15分インキュベートした。その後500 μLの培地（DMEM 2%HS）を加え細胞を15 mL tubeに回収して4℃、2000 rpm、10分で遠心を行い、上清を取り除いた。1 well あたり200 μLの培地（DMEM 2%HS）またはHBSSを加えて、ピペッティングで懸濁しフィルターで通して解析に用いた。
＜Quantitative RT-PCR（qRT-PCR）＞
　逆転写反応にはReverTra Ace（TOYOBO）を用いて行った。PCRはPower SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用いて行った。miRNAの発現量解析には、逆転写反応はTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）を用いて行いPCRはTaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用いて行った。用いたプライマーは表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜免疫染色＞
　FACSでソーティングされた1×104個の細胞をサイトスピンを用いて、1000 rpm 2分で遠心を行いスライドガラスに接着させた。室温で30分ドライヤーで乾燥後、4%PFAを200μL滴下し室温で20分乾燥させ、固定した。ドライヤーで30分乾燥後、PBSで洗浄した。余分なPBSを取り除き、5% Blocking one（ナカライテスク）を200μLを滴下し、室温で1時間静置した。Can Get Signal Solution B（TOYOBO）にて必要量の抗体を調製し、100μL滴下し室温で1時間または4℃で一晩静置した。PBS-Tで洗浄後、Can Get Signal Solution B（TOYOBO）にて必要量の抗体とHoechstを調製し、室温で1時間静置した。PBS-Tで洗浄後、Permaflow（テルモ）を1～2滴、滴下後カバーガラスを被せ、室温にて30分以上静置した。抗体については表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜Re-culture＞
　FACSでソーティングされた3×104個の細胞をマトリゲル（BD bioscience）コートされた48 well plate に播種し、筋分化培地Aにて培養した。播種後、翌日筋分化培地Aにて培地交換を行い、以後４日に一度筋分化培地Aにて培地交換または、5日後に筋分化培地Dにて培地交換を行った。7日後、必要な抗体を用いて細胞の免疫染色を行った。抗体については表６に示す。
＜結果＞
　筋組織に特異的に発現しているという報告があるmiR-206（The Journal of Cell Biology, 174(5), 677-87, 2006）が、Dox-MYOD1強制発現による骨格筋細胞への分化過程において、どのように発現変動するかをqRT-PCRを用いて調べた（図1A）。その結果、Dox添加により骨格筋細胞へと分化誘導されるに従い、miR-206の発現量が上昇することが示された。Doxの培地への添加は、day 1からday 7の間におこなった。day9にてmiR-206の発現が減少することから、MyoD発現の減少に伴ってmiR-206の発現が抑制されることが示唆された（PLoS One. 2013 Apr 23;8(4):e61540）。
　miR-206の発現量に応答してEGFPの翻訳が抑制されるmRNA（miR-206-EGFPスイッチ）とトランスフェクションコントロールのtagBFP mRNAを上述の方法で作製し（図1B）、MYOD1-hiPSCsへ導入して骨格筋系譜細胞を選別できるか検証した（図1C）。Doxを添加せず1日培養した（Dox- Day 1）細胞にmiR-206-EGFPスイッチをトランスフェクションしたところ、共導入したtagBFPの蛍光値とmiRNAスイッチがコードしているEGFPの蛍光値の比が細胞集団で均一となっていた（図1C）。一方、Dox添加後6日培養した（Dox+ Day 6）細胞にmiR-206スイッチをトランスフェクションしたところ、tagBFPとEGFPの蛍光値の比が変動した（図1D）。以上より、miR-206-EGFPとトランスフェクションコントロール（tagBFP mRNA）の共導入により骨格筋系譜細胞を選別できることが示唆された。
　続いて、PAX3-GFP iPSCsまたはMYF5-tdTomato C3 iPSCsを上述の骨格筋前駆細胞の分化誘導法により得られた細胞集団からmiR-206スイッチにより骨格筋系譜細胞を特異的に選別できるか検討した。まず、分化誘導過程におけるmiR-206の発現量をqRT-PCRにより調べた（図2Aおよび図2B）。その結果、miR-206の発現量は分化誘導される過程で上昇した。
　続いて、PAX3-GFP iPSCsから誘導された細胞から、miR-206の発現量に応答してtagBFPの翻訳が抑制されるmRNA（以下、miR-206-tagBFPスイッチと言う）により骨格筋系譜細胞を選別できるか検討した。このとき、トランスフェクションコントロールにはtagRFP mRNAを用いた。分化誘導後44日目のPAX3-GFP iPSCsにmiR-206-tagBFPスイッチをトランスフェクションしたところ、tagBFPとtagRFPの蛍光値の比が細胞集団で均一となっていた（図2C左図）。一方、分化誘導78日目のPAX3-GFP iPSCsに対してトランスフェクションを行ったところ、tagBFPとtagRFPの蛍光値の比が変動し、細胞集団を分離できることが示された（図2C右図）。以上より、分化誘導78日目の細胞集団において、miR206を発現する細胞が存在することが示唆された。
　同様に、MYF5-tdTomato C3 iPSCsにおいて、miR-206-tagBFPスイッチをトランスフェクションし、骨格筋系譜細胞を選別できるか検討を行った。このとき、トランスフェクションコントロールにはEGFP mRNAを用いた。分化誘導後55日目および88日目のMYF5-tdTomato C3 iPSCsにmiR-206-tagBFPスイッチをトランスフェクションしたところ、細胞集団が分かれていることが示唆された（図2D）。
　以上の結果、PAX3-GFP iPSCsおよびMYF5-tdTomato C3 iPSCsから骨格筋前駆細胞へ分化誘導した細胞集団は、miR-206-tagBFPスイッチを用いることで細胞内のmiR-206の発現量に応じて細胞を選別できることが示唆された。
　骨格筋分化に関連するmiRNAとして報告されているmiRNA-1およびmiRNA-133（Care, A et al. 2007 Nature Medicine. PMID 17468766、Tatsuguchi, M et al. 2007 Journal of Molecular and Cellular Cardiology. PMID 17498736）、ならびに骨格筋幹細胞での発現が報告されているmiR-489（Cheung, T et al. 2012 Nature. PMID 22358842）およびmiRNA-708（Yamaguchi et al. 2012 J Mol Histol. PMID 22562803）のスイッチをそれぞれ作製し同様に細胞集団が分かれるか検証した（図2Eおよび図2F）。分化誘導78日目のPAX3-GFP iPSCsに対してmiRNA-1スイッチまたはmiRNA-133スイッチをトランスフェクションコントロール（tagRFP mRNA）と共にトランスフェクションしたところ、miR-206スイッチ同様に細胞集団が分かれることが示されたが（図2E）、miR-206スイッチよりも応答性が低いことが示唆された。一方、分化誘導88日目のMYF5-tdTomato C3 iPSCsにmiR-489スイッチ、miR-708スイッチをトランスフェクションコントロール（EGFP mRNA）と共にトランスフェクションしたところ、スイッチに応答している集団は見られなかった（図2F）。
　以上の結果から、miR-206、miRNA-1およびmiRNA-133を指標とすることで細胞集団から骨格筋系譜細胞を効率良く選別できることが示唆された。
　miR-206-tagBFPスイッチ応答性により分かれた2つの細胞集団に対してFACSを用いてソーティングにより単離し、qRT-PCRによって細胞を評価した。このとき、分化誘導84日目の PAX3-GFP iPSCsにmiR-206スイッチをトランスフェクションコントロールと共に導入し、miR-206-tagBFPスイッチへの応答性により2つの細胞集団（miR-206-tagBFPスイッチに応答した細胞集団（以下、miR-206+）およびmiR-206スイッチに応答しない細胞集団（以下、miR-206-））の選別を行った（図3A）。
　同様に、MYF5-tdTomato C3 iPSCsの分化誘導87日目の細胞にmiR-206スイッチをトランスフェクションコントロールと共に導入し選別した（図3B）。
　その結果、選別されたmiR-206+における骨格筋分化に関わる遺伝子、MYF5、MYOD1、MYOGENIN遺伝子の発現量がPAX3-GFP iPSCsおよびMYF5-tdTomato C3 iPSCsから骨格筋前駆細胞へ誘導された細胞集団において、miR-206-での発現量よりも増加していることが示された（図3Cから図3H）。
　以上の結果から、miR-206スイッチを用いることで、骨格筋系譜細胞を特異的に選別できることが示された。
　miR206+集団のなかに骨格筋前駆細胞が含まれているか検討するため、分化誘導後86日目のPAX3-GFP iPSCsにmiR-206スイッチをトランスフェクションコントロールと共に導入し、miR-206のスイッチの応答性により２つに分け、2つの細胞集団をさらにGFP陽性、陰性で分けて選別を行った（図４Aおよび図４B）。MYF5、MYOD1、MYOGENIN、PAX7の遺伝子の発現量が、miR-206+かつGFP陽性（P3ゲート、以下、miR-206+/PAX3+）とmiR-206+かつGFP陰性（P4ゲート、以下、miR-206+/PAX3-）においてmiR-206-かつGFP陽性（P6ゲート、以下、miR-206-/PAX3+）とmiR-206-かつGFP陰性（P7ゲート、以下、miR-206-/PAX3-）よりも増加していることが示された（図4Cから図4F）。
　次に、miR-206を発現している細胞を単離し(miR-206+画分)再播種後、骨格筋細胞に分化誘導されるか確認した（図5Aおよび図5E）。分化誘導95日目のMYF5-tdTomato細胞株をmiR-206スイッチで選別し、miR-206+画分と、miR-206スイッチにより選別された細胞以外の画分(miR-206-画分)をマトリゲルコートされた48 well plateに再播種し、8日間培養した。8日間、筋分化培地Aにて培養したwell（図5Aおよび図5B）と5日間筋分化培地Aにて培養した後、3日間筋分化培地Dにて培養したwell（図5Cおよび図5D）に分けて培養し、細胞の免疫染色を行った。miR-206+画分でMyosin Heavy Chain（以下MHC）タンパク質が発現していることが確認され（図5Aおよび図5C）、miR-206-画分ではMHCタンパク質の発現がわずかに見られた（図5Bおよび図5D）。染色された核に対するMHCの陽性率はmiR-206+集団で約60 %前後となり、一方でmiR-206-集団では約5 %前後となった（図5E）。これらの結果から、miR-206+集団は、骨格筋細胞への分化能をもつ骨格筋系譜細胞を多く含んでいることが示唆され、またmiR-206-集団は骨格筋細胞への分化能を持たない細胞を多く含んでいることが示唆された。
　細胞移植治療を行う場合、ゲノム改変を行っていないiPS細胞を用いて分化誘導を行う必要がある。続いて、レポーターラインの細胞株だけでなく、疾患iPS細胞株、およびゲノム改変を行っていない201B7でも同様にmiR-206スイッチにより骨格筋系譜細胞を選別できるか検討した。疾患iPS細胞株 及び 201B7から誘導した細胞（それぞれ、誘導86日目および95日目）でも同様にmiR-206スイッチにより骨格筋系譜細胞を選別し（図6AおよびB）、qRT-PCR解析を行い、骨格筋分化に関わる遺伝子の発現量を調べた（図6Cから図6H）。いずれのiPS細胞株においても、MYF5（図6Cおよび図6F）、MYOD1（図6Dおよび図6G）、MYOGENIN（図6Eおよび図6H）の発現量がmiR-206+で上昇していることが示された。以上の結果から、疾患iPS細胞株、201B7においても、miR-206スイッチにより骨格筋系譜細胞が選別でき、当該選別された骨格筋系譜細胞集団内に骨格筋前駆細胞が含まれることが示唆された。
　次に、骨格筋前駆細胞で認められるMYOD1およびPAX7の発現をタンパク質レベルでも確認するため、分化誘導した疾患iPS細胞株（誘導86日目）をmiR-206スイッチにより選別し、ソーティング後の細胞で免疫染色を行ったところ、miR-206+画分においてMYOD1およびPAX7の発現が確認された（図7A）。さらに、miR-206+画分では、MYOD1およびPAX7の両タンパク質を発現している細胞が見られた（図7C）。一方、miR-206-画分ではMYOD1の発現は見られず、PAX7の発現がわずかに見られた（図7B）。以上より、miR-206スイッチで選別されたmiR-206陽性の骨格筋系譜細胞集団内に再生能力をもつ骨格筋前駆細胞が含まれる可能性が示唆された。
　本発明によれば、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を選択的に得ることができ、当該骨格筋前駆細胞を含む筋原性疾患治療剤を提供することが可能となる。特に、遺伝性筋疾患治療用の骨格筋前駆細胞として、患者本人の体細胞由来のiPS細胞から分化させた骨格筋前駆細胞を提供することが可能となる。
　本出願は、２０１５年１月１４日出願の日本国特許出願、特願２０１５-００５４４７を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims (17)

  1. 　miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、骨格筋前駆細胞の選別方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記：
    　(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列を含む核酸、および
    　(ii) マーカータンパク質をコードする配列を含む核酸
    を含む配列からなり、
    　ここで、当該(ii)は、当該(i)の核酸に機能的に連結している、方法。
  2. 　前記(i)および(ii)が、5'から3'の方向に連結されている、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記(i)の骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAが、miR-1、miR-133およびmiR-206からなる群から選択される１またはそれ以上のmiRNAである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質および自殺遺伝子にコードされるタンパク質からなる群から選択される１またはそれ以上の遺伝子である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質であって、コントロールmRNAをさらに細胞群に導入する工程を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記細胞群が、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞へと分化誘導させた細胞群である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞への分化誘導が、下記の工程（１）から（５）を含む、請求項６に記載の方法：
    （１）多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
    （２）（１）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程、
    （３）（２）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程、
    （４）（３）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程、および
    （５）（４）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程。
  8. 　前記工程（１）から（５）のTGF-β阻害剤がSB431542であり、前記工程（１）のGSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記工程（２）および（３）のGSK3β阻害剤がLiClである、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記工程（５）の血清がウマ血清である、請求項７または８に記載の方法。
  10. 　下記の工程（１）から（３）を含む多能性幹細胞からの骨格筋前駆細胞の製造方法：
    （１）多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を製造する工程、
    （２）（１）の工程で得られた細胞へ、下記(i) および(ii)を含むmiRNA応答性mRNAを導入する工程：
    　(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列を有する核酸、および
    　(ii)マーカータンパク質をコードする核酸
    を含む配列からなり、ここで、当該(ii)は、当該(i)の核酸に機能的に連結している、ならびに、
    （３）前記マーカータンパク質の翻訳量が少ないまたは検出できない細胞を選択する工程。
  11. 　前記工程（１）が下記の工程（１-１）から（１-５）を含む、請求項１０に記載の方法：
    （１-１）多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
    （１-２）（１-１）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程、
    （１-３）（１-２）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程、
    （１-４）（１-３）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程、および
    （１-５）（１-４）の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程、
  12. 　前記工程（１-１）から（１-５）のTGF-β阻害剤がSB431542であり、前記工程（１-１）のGSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記工程（１-２）および（１-３）のGSK3β阻害剤がLiClである、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記工程（１-５）の血清がウマ血清である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 　前記(i)および(ii)が、5'から3'の方向に連結されている、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記(i)の骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAが、miR-1、miR-133およびmiR-206からなる群から選択される１またはそれ以上のmiRNAである、請求項１０から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質および自殺遺伝子にコードされるタンパク質からなる群から選択される１またはそれ以上の遺伝子である、請求項１０から１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質であって、コントロールmRNAをさらに（１）の工程で得られた細胞へ導入する工程を含み、前記工程（３）が、さらに当該コントロールmRNAが導入された細胞を選択する工程である、請求項１６に記載の方法。
PCT/JP2016/050997 2015-01-14 2016-01-14 骨格筋前駆細胞の選択方法 WO2016114354A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016569506A JP6883791B2 (ja) 2015-01-14 2016-01-14 骨格筋前駆細胞の選択方法
US15/543,513 US10620109B2 (en) 2015-01-14 2016-01-14 Method for selecting skeletal muscle progenitor cell
EP16737425.5A EP3246398B1 (en) 2015-01-14 2016-01-14 Method for selecting skeletal muscle progenitor cell

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-005447 2015-01-14
JP2015005447 2015-01-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016114354A1 true WO2016114354A1 (ja) 2016-07-21

Family

ID=56405894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/050997 WO2016114354A1 (ja) 2015-01-14 2016-01-14 骨格筋前駆細胞の選択方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10620109B2 (ja)
EP (1) EP3246398B1 (ja)
JP (1) JP6883791B2 (ja)
WO (1) WO2016114354A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017073600A1 (ja) * 2015-10-28 2017-05-04 国立大学法人京都大学 ｍＲＮＡの設計方法
WO2019013294A1 (ja) * 2017-07-12 2019-01-17 国立大学法人京都大学 高発現性ｍＲＮＡスイッチ
WO2019031595A1 (ja) * 2017-08-10 2019-02-14 国立大学法人京都大学 神経前駆細胞の選別方法
JP2020509752A (ja) * 2017-03-10 2020-04-02 ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インクＴｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｉｎｃ． 網膜疾患のためのリボスイッチ調節遺伝子治療

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11318167B2 (en) * 2015-12-11 2022-05-03 The Johns Hopkins University Isolation of fusion-competent myoblasts and therapeutic applications thereof related to muscular dystrophy
AU2019334666B2 (en) * 2018-09-07 2023-11-02 Cha Biotech Co., Ltd. Medium for direct differentiation of pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell, method for preparing mesenchymal stem cell by using same, and mesenchymal stem cell prepared thereby

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010008100A1 (ja) * 2008-07-17 2010-01-21 国立大学法人名古屋大学 骨格筋細胞又は骨細胞の誘導法
US20100323356A1 (en) * 2007-11-22 2010-12-23 Japan Science And Technology Agency Small rna-dependent translational regulatory system in cell or artificial cell model
WO2011154553A2 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 Cellartis Ab Novel micrornas for the detection and isolaton of human embryonic stem cell-derived cardiac cell types
WO2013073246A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Kyoto University Method of inducing differentiation from pluripotent stem cells to skeletal muscle cells
WO2015141827A1 (ja) * 2014-03-20 2015-09-24 国立大学法人京都大学 心筋細胞の選別方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040110286A1 (en) * 2002-12-06 2004-06-10 The John P. Robarts Research Institute Method for making hematopoietic cells
CA2903764A1 (en) 2005-12-12 2007-06-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Micrornas that regulate muscle cell proliferation and differentiation
EP2258863A1 (en) * 2009-05-25 2010-12-08 Universita'Degli Studi di Roma "La Sapienza" miRNA biomarkers for the diagnosis of duchenne muscular dystrophy progression, for monitoring therapeutic interventions, and as therapeutics
WO2016108288A1 (ja) * 2014-12-29 2016-07-07 国立大学法人京都大学 骨格筋前駆細胞の製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100323356A1 (en) * 2007-11-22 2010-12-23 Japan Science And Technology Agency Small rna-dependent translational regulatory system in cell or artificial cell model
WO2010008100A1 (ja) * 2008-07-17 2010-01-21 国立大学法人名古屋大学 骨格筋細胞又は骨細胞の誘導法
WO2011154553A2 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 Cellartis Ab Novel micrornas for the detection and isolaton of human embryonic stem cell-derived cardiac cell types
WO2013073246A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Kyoto University Method of inducing differentiation from pluripotent stem cells to skeletal muscle cells
WO2015141827A1 (ja) * 2014-03-20 2015-09-24 国立大学法人京都大学 心筋細胞の選別方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIKI, KENJI ET AL.: "Efficient Detection and Purification of Cell Populations UsingSynthetic MicroRNA Switches", CELL STEM CELL, vol. 16, pages 699 - 711, XP055225629, DOI: doi:10.1016/j.stem.2015.04.005 *
See also references of EP3246398A4 *
SHELTON, MICHAEL ET AL.: "Derivation and Expansion of PAX7-Positive Muscle Progenitors from Human and Mouse Embryonic Stem Cells", STEM CELL REPORTS, vol. 3, no. 3, 2014, pages 516 - 529, XP055281322, DOI: doi:10.1016/j.stemcr.2014.07.001 *
TOWNLEY-TILSON ET AL.: "MicroRNAs 1, 133, and 206: Critical factors of skeletal and cardiac muscle development, function, and disease", THE INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRY & CELL BIOLOGY, vol. 42, 2010, pages 1252 - 1255, XP002601173, DOI: doi:10.1016/J.BIOCEL.2009.03.002 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017073600A1 (ja) * 2015-10-28 2017-05-04 国立大学法人京都大学 ｍＲＮＡの設計方法
JPWO2017073600A1 (ja) * 2015-10-28 2018-08-16 国立大学法人京都大学 ｍＲＮＡの設計方法
JP2020509752A (ja) * 2017-03-10 2020-04-02 ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インクＴｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｉｎｃ． 網膜疾患のためのリボスイッチ調節遺伝子治療
WO2019013294A1 (ja) * 2017-07-12 2019-01-17 国立大学法人京都大学 高発現性ｍＲＮＡスイッチ
JPWO2019013294A1 (ja) * 2017-07-12 2020-10-22 国立大学法人京都大学 高発現性ｍＲＮＡスイッチ
JP7318931B2 (ja) 2017-07-12 2023-08-01 国立大学法人京都大学 高発現性ｍＲＮＡスイッチ
WO2019031595A1 (ja) * 2017-08-10 2019-02-14 国立大学法人京都大学 神経前駆細胞の選別方法
JPWO2019031595A1 (ja) * 2017-08-10 2020-07-09 国立大学法人京都大学 神経前駆細胞の選別方法
JP7236738B2 (ja) 2017-08-10 2023-03-10 国立大学法人京都大学 神経前駆細胞の選別方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3246398B1 (en) 2021-06-16
US10620109B2 (en) 2020-04-14
JP6883791B2 (ja) 2021-06-09
JPWO2016114354A1 (ja) 2017-10-19
EP3246398A1 (en) 2017-11-22
EP3246398A4 (en) 2018-06-06
US20170370821A1 (en) 2017-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7282304B2 (ja) 新規ドーパミン産生神経前駆細胞の誘導方法
JP7166631B2 (ja) 新規軟骨細胞誘導方法
JP6883791B2 (ja) 骨格筋前駆細胞の選択方法
JP5896421B2 (ja) 多能性幹細胞から骨格筋または骨格筋前駆細胞への分化誘導法
JP6845500B2 (ja) 骨格筋前駆細胞の製造方法
JP6612736B2 (ja) 心筋細胞の選別方法
US10626368B2 (en) Method for inducing cerebral cortex neurons
JP6373253B2 (ja) 新規心筋細胞マーカー
US20200056248A1 (en) Method for sorting tissue cells
JPWO2019031595A1 (ja) 神経前駆細胞の選別方法
WO2022102742A1 (ja) 骨格筋系譜細胞および骨格筋幹細胞の高効率純化用細胞表面マーカーおよびその利用
EP4180516A1 (en) Skeletal muscle precursor cells and method for purifying same, composition for treating myogenic diseases, and method for producing cell group containing skeletal muscle precursor cells
WO2021015086A1 (ja) 骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16737425

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016569506

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15543513

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2016737425

Country of ref document: EP