JP2023527578A - 眼疾患を処置するための方法及び医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、それを必要とする対象において眼疾患を処置するための方法であって、処置量のＳＯＸ２１遺伝子発現及び／又は活性のインヒビターを当該対象に投与する工程を含む方法に関する。先天小瞳孔のマウスモデルを研究することによって、本発明者らは、この極めて稀で純粋に眼の疾患が、遺伝子発現の３Ｄ調節に関連する予想外の複雑な機構に起因することを実証する。本発明者らは、この疾患が、１又は複数のＤＣＴエンハンサーの採用によって誘導される転写因子ＳＯＸ２１の不正な発現に起因することを提案する。本発明者らは、ＳＯＸ２１がＴｇｆβ２遺伝子の調節領域に結合することを示し、本発明者らは、ＰＯＡＧの患者、及びＭＣＯＲの本発明者らの患者のうちの１人において観察された蓄積を再現する最小のＭＣＯＲ欠失を有するマウスの虹彩におけるこの栄養因子の過剰発現及び房水におけるその産物の蓄積を実証する。

Description

本発明は、眼科の分野に属する。より詳細には、本発明は、緑内障、原発性開放隅角緑内障及び近視を含む眼疾患を処置するための方法及び医薬組成物に関する。

虹彩及び毛様体（ＣＢ：ｃｉｌｉａｒｙ ｂｏｄｙ）は、３つの主な層（目に見える表面から水晶体に隣接する後部まで）：間質、前上皮層（ＡＥＬ：ａｎｔｅｒｉｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｌａｙｅｒ）及び後上皮層（ＰＥＬ：ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｌａｙｅｒ）に組織化された連続した眼組織である。虹彩の根は、ＣＢ及び角膜強膜接合部に付着し、虹彩－角膜角として知られる空間を作り出す。眼は、その構造に栄養を提供する房水として知られる流体を含む。この流体はＣＢによって生成される。これは、虹彩とレンズとの間を流れ、瞳孔を通って虹彩の前部に至り、そこで角膜強膜と虹彩根部との併合に位置する小柱状網目構造（ＴＭ：ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ）と呼ばれる篩状構造を通過した後、シュレム管内に排出される（Davis&Ashery-Padan,2008）。虹彩及びＣＢの完全性は、網膜に到達する光の量と眼圧（ＩＯＰ：ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の両方を調節するために必要であり、その増加は、視神経損傷（緑内障、ＧＬＣ：ｇｌａｕｃｏｍａ）の主要な危険因子である（Gould et al.,2004）。先天小瞳孔（ＭＣＯＲ：ｍｉｃｒｏｃｏｒｉａ）は、これらの機能の両方に影響を及ぼす虹彩の非常に稀な常染色体優性奇形である。これは、虹彩散大筋が部分的に又は完全に欠如していることを特徴とし、これは通常、虹彩ＡＥＬから発生し、虹彩根部から瞳孔縁まで間質内で縦方向に延びる。瞳孔縁付近の間質内の括約筋は正常に機能し、瞳孔を収縮させることができる。散大筋異常は、ほとんど又は全く散大しないピンホール瞳孔（＜２mm）及び虹彩透過照明（Simpson&Parsons,1989）に現れる。眼の軸長の顕著な延長（軸性近視）及び開放隅角ＧＬＣが、それぞれＭＣＯＲに罹患した８０％及び３０％の個体において認められる（Toulemont et al.,1995）。近視は最も一般的な眼の状態であり、ＧＬＣは世界中で失明の第２の主因であり、７０００万人（２０２０年には世界人口の３．５４％）が罹患している（Tham et al.,2014）。原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ：Ｐｒｉｍａｒｙ ｏｐｅｎ ａｎｇｌｅ ｇｌａｕｃｏｍａ）は、ＧＬＣ症例の大部分（２０２０年の世界人口の３．０５％）を占める（Tham et al.,2014）。

眼の軸長の延長は、典型的には、ＭＣＯＲにおいて強い近視をもたらす。これは、虹彩透過照明によって引き起こされるグレアを減少させるために瞼を閉じる傾向によって誘発される早期の視力喪失（形状欠乏近視）に起因する可能性がある（Toulemont et al.,1995）。眼の閉塞は実際に、近視の実験動物モデルにおける出生後の種々の発達時点での片側眼瞼閉鎖及び外科的眼瞼閉鎖を有する乳児における単眼近視によって実証されるように、軸性近視を引き起こし得る（Weiss,2003）。出生後の眼の成長中のＩＯＰの上昇はまた、眼の長さを増加させ得る（Toulemont et al.,1995）。しかしながら、虹彩の透過照明及び光嫌悪が主要な症状である近視と眼皮膚白化症との間の相関の欠如は、正常なＩＯＰを有するＭＣＯＲ個体と比較してＧＬＣを有するＭＣＯＲ個体において軸性近視が増加していないことと同様に、これらの仮定に疑問を呈する。

先天小瞳孔におけるＧＬＣは、早期発症（診断時の平均年齢２０±１０歳）（Sergouniotis et al.,2017；Tawara et al.,2005；Toulemont et al.,1995）及び高いＩＯＰを特徴とする。視神経上の緑内障性損傷は、眼底検査を複雑にする瞳孔縮瞳、及び視神経円板の形状を変更する重度の近視（Toulemont et al.,1995）のために、監視が困難である。罹患した個体は、典型的には４０～５０年の間に盲目になる。ＭＣＯＲ個体の虹彩角膜角は開いており、典型的には正常な様相（Bremner et al.,2004；Ramirez-Miranda et al.,2011；Simpson&Parsons,1989）を示す（開放隅角ＧＬＣ、ＯＡＧ：ｏｐｅｎ ａｎｇｌｅ ＧＬＣ）。場合によっては、強膜岬への虹彩の根部の異常な挿入が存在し、この異常は角度を閉じない（Mazzeo et al.,1986；Tawara et al.,2005；Toulemont et al.,1995）。一部の著者らは、この虹彩角膜角異常をＧＬＣに結び付けることを検討しているが、このような結び付きは、特に、ＯＡＧを有するＭＣＯＲ症例よりも、高齢であっても、正常なＩＯＰを有するＭＣＯＲ個体における角異常の有病率が高いという観点から、偽である（Mazzeo et al.,1986；Sergouniotis et al.,2017；Toulemont et al.,1995）。ＯＡＧの原因の正確な知識がない場合、小児期発症又は若年性ＧＬＣ（Ramprasad et al.,s.d.；Rouillac et al.,1998）の用語は、ＧＬＣを虹彩角膜角の奇形（異形成）、すなわち遺伝子異常ＧＣＬ（Coulon et al.,1986）又は発達ＧＬＣ（Tawara et al.,2005）に関連付ける一部によって提案されている用語よりも好ましいはずである。

すべての試験されたＭＣＯＲファミリー（Fares-Taie et al.,2015；Pozza et al.,2020；Sergouniotis et al.,2017）における顕微鏡下染色体１３ｑ３２．１再編成の同定は、疾患の原因として遺伝子発現の３Ｄ調節解除を伴っていたが、虹彩の発達不全の根底にある機構、並びにＯＡＧ及び近視が虹彩奇形の効果的な結果であるかどうかは依然として不明である。

したがって、ＭＣＯＲ患者における虹彩奇形、ＯＡＧ及び高近視の根底にある分子機構を特徴付け、ＯＡＧ及び高近視が虹彩の異常な発達又は独立した特徴に続発するかどうかを決定する必要がある。

本発明は、それを必要とする対象において眼疾患を処置するための方法であって、処置量のＳＯＸ２１遺伝子発現及び／又は活性のインヒビターを当該対象に投与する工程を含む方法に関する。特に、本発明は特許請求の範囲によって定義される。

重要なＭＣＯＲを引き起こす欠失（Fares-Taie et al.,2015）を有する本発明者らが作製したマウスモデルを研究することによって、本発明者らは、この非常に稀で純粋に眼の疾患が、遺伝子発現の３Ｄ調節に関連する予想外の複雑な機構に起因することを示唆した（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図３Ａ、図３Ｂ）。本発明者らのデータは、疾患が、おそらく１又は複数のＤＣＴエンハンサーの採用によって誘導される虹彩及び毛様体における転写因子ＳＯＸ２１の不正な発現に起因することを示している。ＣＨＩＰＳｅｑ、ＲＮＡｓｅｑ及びＥＬＩＳＡの組み合わせを使用して、本発明者らは、（ｉ）ＳＯＸ２１がＴｇｆβ２遺伝子の調節領域に結合し（図２Ａ～図２Ｂ）（ｉｉ）Ｔｇｆβ２ ｍＲＮＡが虹彩で過剰発現し（データは示さず）、その産物（ＴＧＦβ２）がＭＣＯＲマウスモデルの房水に蓄積し（図３Ａ）、ヒトＭＣＯＲ個体（図３Ｂ）及び一般的な原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）に罹患した個体（Carreon et al.,2017；Vranka et al.,2015）で観察された蓄積を再現することを示した。

房水中のＴＧＦＢ２の上昇は、ヒト及びマウスの傍管状領域として知られるシュレム管に隣接するＴＭの最深部に細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）蓄積を誘導することが示されている。ＥＣＭ蓄積は、ＴＭの濾過能力を低下させることによる、ＰＯＡＧを含むＯＡＧの主なトリガーである。房水流出抵抗の増加は、ＩＯＰの上昇及び緑内障、すなわち、その軸索が視神経（Carreon et al.,2017；Vranka et al.,2015）を形成する網膜神経節細胞の死をもたらす。したがって、本発明者らは、ＭＣＯＲマウスモデルの視神経におけるグリア細胞の存在量の減少を示し（図３Ｃ）、緑内障性視神経分解を強く支持している。

あわせて、本発明者らの結果は、ＭＣＯＲにおけるＯＡＧは、虹彩角膜異常の結果ではなく、むしろＰＯＡＧのようにＴＧＦβ２過剰発現の直接的な結果であると思われるという見解を支持する。更に、ＴＧＦβ２が眼球の軸方向伸長における重要な因子として作用し得ることを知ると（Jia et al.,2017）、その過剰発現はまた、ＭＣＯＲにおける高い近視の原因となり得る。

したがって、本発明者らのデータは、ＭＣＯＲ及びＰＯＡＧの両方においてＯＡＧの潜在的な処置標的としてＳＯＸ２１を含むＴＧＦβ２調節の新規経路を開示している。

ｃΔＭＣＯＲ及びＷＴ動物におけるＳｏｘ２１の瞳孔反応、１Mb－ＴＡＤ、ＲＴｑＰＣＲ、ＷＢ及びＨＩＣ分析での発現レベル分析。（Ａ）瞳孔測定によって決定される瞳孔径は、ＷＴ動物と比較して、ｃΔＭＣＯＲにおける瞳孔サイズの中程度であるが統計学的に有意な基礎減少を示す（＊＊：ｐ＜０．０１、ｎ＝８動物、各群）；散瞳投与時（ネオシン、１０分）の瞳孔サイズは、２つのマウス系統において類似していた（ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ、有意でない）。 （Ｂ）ＲＮＡｓｅｑによって決定される遺伝子の存在。ＲＮＡｓｅｑ存在量は、非常に可変的なレベルの発現を示すすべての遺伝子の表現を可能にするために、ｌｏｇ［Ｄｅｓｑ正規化カウント］によって表されることに留意されたい。Ｄｚｉｐ１、Ｄｎａｊｃ３及びＵｇｇｔ２の存在量はｃΔＭＣＯＲ及びＷＴにおいて異なるが、差次的発現の倍数はｐ＜０．０５で＜１．５である（ＲＮＡｓｅｑ分析カットオフ）。ｃΔＭＣＯＲ試料とＷＴ試料との間の差が低いことと一致して、半定量的ＲＴｑＰＣＲ分析は調節解除を示すことができなかった。 （Ｃ）新生仔ｃΔＭＣＯＲ及びＷＴマウスからの虹彩／毛様体ＲＮＡ抽出物中のＤｃｔ及びＳｏｘ２１存在量のＲＴｑＰＣＲ分析（ｎ＝５、各群）。 ＳＯＸ２１に結合するＴＧＦβ２ゲノム配列。（Ａ）ｃΔＭＣＯＲマウスの虹彩においてＳＯＸ２１に結合するＣＨＩＰ－ｓｅｑによって同定されるマウス配列及び （Ｂ）ヒト合成配列。下線を引いた配列は、マウス（ＳＯＸ２１．１；青色）及びヒト（ＳＯＸ２１；緑色）のコンセンサスＳＯＸ２１結合部位に対応する。 ｃΔＭＣＯＲマウス及びＷＴマウスにおける房水中のＴＧＦＢ２濃度の分析並びに視神経乳頭の完全性の予備的分析。（Ａ）１２月齢マウス（各遺伝子型について９匹のマウス）の及び（Ｂ）ｃΔＭＣＯＲマウス（＊＊ｐ＜０．０１）における及び一人のＭＣＯＲ患者における蓄積を示すヒト試料における、房水中のＴＧＦＢ２のＥＬＩＳＡ投薬量。 （Ａ）１２月齢マウス（各遺伝子型について９匹のマウス）の及び（Ｂ）ｃΔＭＣＯＲマウス（＊＊ｐ＜０．０１）における及び一人のＭＣＯＲ患者における蓄積を示すヒト試料における、房水中のＴＧＦＢ２のＥＬＩＳＡ投薬量。 （Ｃ）ｃΔＭＣＯＲマウス及びＷＴマウスの視神経乳頭のＨＥ染色（各遺伝子型ｎ＝１）。グリア細胞は、顕著な着色によって見ることができる。グリア細胞数は、それらの存在量がｃΔＭＣＯＲマウスにおいて高度に減少することを示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 未編集細胞（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び編集細胞（Ｄ、Ｅ、Ｆ）ＳＶ４０－ｈＩＰＥｐｉＣ細胞の免疫細胞化学分析。ＤＣＴは、編集されていない細胞及び編集された細胞（Ａ、Ｄ）の細胞質に見られる。ＳＯＸ２１は、編集された細胞（Ｄ、Ｅ）のいくつかの核に見られるが、編集されていない細胞には見られない。Ｃ及びＦは、ＤＡＰＩスケールバー、１０μmで染色された核を示す。 リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定される、神経膠腫細胞に対するＲＰＥ１、ＭＰ４１及びＯＣＭ－１におけるＳＯＸ２１存在量。データは、編集されていない（ＷＴ）細胞と比較して、ヘテロ接合性（ＨＴ）において重要なＭＣＯＲ欠失を有する編集された細胞におけるＳＯＸ２１発現の誘導を示さない。

眼疾患の処置方法
したがって、第１の態様において、本発明は、それを必要とする対象において眼疾患を処置するための方法であって、処置有効量のＳＯＸ２１遺伝子発現及び／又は活性のインヒビターを当該対象に投与する工程を含む方法に関する。

本明細書で使用される場合、「処置する」又は「処置」という用語は、予防的又は予防的処置、並びに治癒的又は疾患修飾処置の両方を指し、疾患に罹患するリスクがあるか又は疾患に罹患した疑いがある対象、並びに疾患又は病状に罹患していると診断されたか又は臨床的再発の抑制を含む対象の処置を含む。処置は、疾患若しくは再発性疾患の１つ以上の症状を予防するため、治癒するため、その発症を遅延させるため、その重症度を低下させるため、若しくはその１つ以上の症状を改善するために、又はそのような処置の非存在下で予想される生存期間を超えて対象の生存期間を延長するために、医学的障害を有するか、又は最終的にその障害を獲得し得る対象に投与され得る。「処置レジメン」とは、病気の処置パターン、例えば処置中に使用される投与パターンを意味する。処置レジメンは、誘導レジメン及び維持レジメンを含み得る。「導入レジメン」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置に使用される処置レジメン（又は処置レジメンの一部）を指す。誘導レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間中に対象に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは、「負荷計画」を（部分的又は全体的に）使用することができ、これは、維持レジメン中に医師が使用するよりも多い用量の薬物を投与すること、維持レジメン中に医師が投与するよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含むことができる。「維持レジメン」又は「メンテナンス期間」という語句は、疾患の処置中に対象を維持するために、例えば対象を長期間（月又は年）寛解状態に保つために使用される処置レジメン（又は処置レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、連続療法（例えば、定期的な間隔、例えば、毎週、毎月、毎年などで薬物を投与すること）又は間欠療法（例えば、中断された処置、断続的な処置、再発時の処置、又は特定の所定の基準［例えば、疼痛、疾患発現など］の達成時の処置）を用いることができる。

本明細書で使用される場合、「眼疾患」という用語は、眼と関連する疾患を指す。本発明の文脈において、眼疾患は、ＴＧＦβ２発現及び／又は活性の増加に関連する。より具体的には、眼疾患は、眼の軸長の延長、眼内圧（ＩＯＰ）の上昇、虹彩の奇形などの虹彩の機能障害及び／又は解剖学的異常に関連する。特定の実施形態では、眼疾患は、先天小瞳孔（ＭＣＯＲ）、緑内障、開放隅角緑内障（ＡＯＧ）又は近視からなるがこれらに限定されない群において選択される。

特定の実施形態では、眼疾患は先天小瞳孔である。

本明細書で使用される場合、「先天小瞳孔」（ＭＣＯＲ）という用語は、常染色体優性形質として伝達される虹彩発達の超希少遺伝性疾患である。これは、散大筋（ＤＭ：ｄｉｌａｔｏｒ ｍｕｓｃｌｅ）線維が部分的又は完全に存在しないことを特徴とする。ＤＭ発達異常は、ほとんど又は全く散大しないピンホール瞳孔（＜２mm）及び虹彩透過照明に現れる。軸性近視及びＯＡＧは、それぞれＭＣＯＲに罹患した８０％及び３０％の個体において認められる。

特定の実施形態では、眼疾患は緑内障である。

本明細書で使用される場合、「緑内障」という用語は、広範囲の臨床症状、病因、及び処置様式を包含する眼疾患の群を指す。緑内障は、視神経円板上に見える視神経の病理学的変化を引き起こし、それは対応する視野損失を引き起こし、未処置の場合は失明をもたらす。眼内圧の低下は、すべての緑内障における主要な処置目標である。緑内障は、閉塞隅角緑内障としても知られる閉塞隅角緑内障と、開放隅角緑内障の２つのカテゴリーに大別される。閉塞隅角緑内障は、虹彩と小柱網の内面との接触による前房隅角の閉塞によって引き起こされる。この解剖学的角度の閉鎖は、眼の前房からの正常な房水の排出を防止する。開放隅角緑内障は、前房の隅角が開いたままである間に小柱網を通る房水の流出が減少する任意の緑内障である。

特定の実施形態において、緑内障は、開放隅角緑内障（ＯＡＧ）である。

本明細書で使用される場合、開放隅角緑内障（ＡＯＧ）という用語は、排液管のゆっくりとした閉塞によって引き起こされ、眼内圧の上昇及び視神経の分解をもたらす緑内障の１つを指す。「開放隅角」とは、虹彩と角膜又は前房隅角としても知られている虹彩と角膜とが交わる角度が、本来のように広く開いていることを意味する。ＯＡＧは潜行的に発症し、生涯にわたる症状である。開放隅角緑内障は、原発性（ＰＯＡＧ）緑内障又は慢性緑内障とも呼ばれる。ＭＣＯＲ患者の３０％で発生する。ＯＡＧは世界中で失明の第２の主因であり^５、世界中で７０００万人が罹患している。

特定の実施形態では、眼疾患は近視である。

本明細書で使用される場合、「近視」という用語は、眼球の軸方向長さの延長によって引き起こされる近視（軸性近視）の１つを指す。近視は、最も一般的な眼の状態である^６。

特定の実施形態では、上記の眼疾患は小児及び若年成人に見られる。

別の実施形態において、上記のような眼疾患は、高齢者に見られる。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、げっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類などの哺乳動物を意味する。特に、本発明による対象はヒトである。より具体的には、対象は、上記のような眼疾患に罹患しているか、又は罹患しやすい。特定の実施形態では、対象は、ＭＣＯＲに罹患しているか又は罹患しやすい。特定の実施形態では、対象は、緑内障に罹患しているか、又は罹患しやすい。特定の実施形態では、対象は、開放隅角緑内障（ＯＡＧ）を患っているか、罹患しやすい。特定の実施形態では、対象は近視に罹患しているか、又は近視に罹患しやすい。特定の実施形態では、対象は、ＴＧＦβ２の過剰発現及び／又は活性を有するか、又は有しやすい。別の実施形態において、対象は、小児又は若年成人である。別の実施形態では、対象は高齢者である。

本発明者らの結果は、ＳＯＸ２１媒介ＴＧＦβ２過剰発現が、独立した様式で、ＭＣＯＲ遺伝子座においてゲノム再編成を有する個体におけるＤＭ奇形、ＯＡＧ及び近視を引き起こすトリガーであるという見解と一致している。

したがって、本発明は、眼疾患の処置におけるＳＯＸ２１発現及び／又は活性のインヒビターの使用に関する。

より具体的には、本発明によるインヒビターは、それだけに限らないが、ＭＣＯＲ、緑内障、ＯＡＧ、近視からなる群において選択される眼疾患を処置するのに適している。

本明細書で使用される場合、「ＳＯＸ２１」という用語は、ＳＲＹボックス転写因子２１を指す。これは、ヒトにおいてＳＯＸ２１遺伝子によってコードされるタンパク質である。これは、転写因子のＳＯＸ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＳＯＸ遺伝子は、ＤＮＡの副溝に結合する転写因子のファミリーをコードし、ＨＭＧ－ｂｏｘ（高移動度群用）と呼ばれる相同配列を特徴とする遺伝子のスーパーファミリーに属する。このＨＭＧボックスは、真核生物種全体にわたって高度に保存されたＤＮＡ結合ドメインである。ＳＯＸ２１は、ＳＯＸ２１神経発生機能に必要なＮ末端ＨＭＧボックス及びＣ末端ドメインを有する２７６アミノ酸残基タンパク質である。ヒトＳＯＸ２１とマウスＳＯＸ２１は、９９％のアミノ酸配列同一性を共有する。眼におけるＳＯＸ２１の唯一知られている機能は、ヒヨコ及びゼブラフィッシュにおける研究に由来する（Lan et al.,2011；Uchikawa et al.,1999）。ヒヨコにおいて、ＳＯＸ２１は、水晶体及び網膜における眼胞の形態形成及び仕様の初期段階の間に一過性に活性化されるが、その後はもはや発現されない（Uchikawa et al.,1999）。ＳＯＸ２１の眼発現は、虹彩が発達し始める前に停止する。ゼブラフィッシュにおけるように、ヒヨコにおけるその機能喪失は、正常な水晶体発達を妨げる（Pauls et al.,2012）。

天然に存在するヒトＳＯＸ２１遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００７０８４に示されるようなヌクレオチド配列を有し、天然に存在するヒトＳＯＸ２１タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００９０１５に示されるようなアミノ酸配列を有する。天然マウスＳＯＸ２１遺伝子はＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿１７７７５３に示すヌクレオチド配列を有し、天然マウスＳＯＸ２１タンパク質はＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿８０８４２１に示すアミノ酸配列を有する。

本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、１つ以上のタンパク質又は酵素の全部又は一部を含むアミノ酸の特定の配列をコードするか又はそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列などの調節ＤＮＡ配列を含んでも含まなくてもよい。

本明細書で使用される場合、「対立遺伝子」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、翻訳されると機能的又は機能不全（存在しないものを含む）遺伝子産物をもたらす、特定の染色体上の特定の位置に位置する遺伝子の代替形態（対の一方のメンバー）を指す。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、１つ以上のタンパク質又は酵素の全部又は一部を含むアミノ酸残基の１つ以上の長鎖を指す。

ヒトＳＯＸ２１は、当技術分野において以下のヌクレオチド配列、配列番号１を有する。

ヒトＳＯＸ２１は、当技術分野において以下のアミノ酸配列、配列番号２を有する。

本明細書で使用される場合、「インヒビター」という用語は、ＳＯＸ２１及び／又はその生成物の活性及び／又は発現を阻害することができる天然又は合成化合物を指す。本明細書中で使用されるとき、用語「ＳＯＸ２１発現」とは、ＳＯＸ２１タンパク質（ＳＯＸ２１遺伝子産物）をコードするＳＯＸ２１遺伝子のことを指す。より具体的には、ＳＯＸ２１発現の阻害は、ＴＧＦｂ２遺伝子及び／又はその産物ＴＧＦβ２の調節解除をもたらす。本明細書で使用される場合、「ＳＯＸ２１活性」という用語は、眼の発生及び／又は機能におけるＳＯＸ２又はＰＡＸ６などの他の遺伝子とのその配位を指す。より具体的には、ＳＯＸ２１活性の阻害は、ＴＧＦβ２遺伝子、ＴＧＦβ２タンパク質又はＴＧＦβ２シグナル伝達の調節解除をもたらす。典型的には、本発明の文脈において、ＳＯＸ２１の阻害は、ＴＧＦβ２の発現及び／又は活性の減少をもたらす。

特定の実施形態では、ＳＯＸ２１のインヒビターは、ＳＯＸ２１発現のインヒビターである。

「ＳＯＸ２１発現のインヒビター」は、ＳＯＸ２１をコードする遺伝子の発現を阻害するか又は有意に低下させる生物学的効果を有する天然又は合成化合物を指す。典型的には、ＳＯＸ２１発現のインヒビターは、以下の事象、すなわち、（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写によって）、（２）ＲＮＡ転写物（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端形成によって）のプロセッシング、（３）ＲＮＡのポリペプチド又はタンパク質への翻訳、及び／又は（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾、の１つ以上に対して生物学的効果を有する。

特定の実施形態では、ＳＯＸ２１遺伝子発現のインヒビターがｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、転写因子デコイ、リボザイム又はエンドヌクレアーゼである、本発明による方法。

特定の実施形態では、ＳＯＸ２１発現のインヒビターはｓｈＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、一般に、細胞に導入されたベクターを使用して発現され、ベクターは、ｓｈＲＮＡが常に発現されることを確実にするためにＵ６プロモーターを利用する。このベクターは通常、娘細胞に渡され、遺伝子サイレンシングを遺伝させる。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によってｓｉＲＮＡに切断され、その後、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、それが結合しているｓｉＲＮＡと一致するｍＲＮＡに結合して切断する。

いくつかの態様において、ＳＯＸ２１発現のインヒビターは低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ＳＯＸ２１発現は、ＳＯＸ２１発現が特異的に阻害されるように、対象又は細胞を低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクター若しくは構築物と接触させることによって減少させることができる（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択する方法は、その配列が既知である遺伝子について当技術分野で周知である（例えば、Brummelkamp et al.,2002；Elbashir et al.,2001；Hannon,2002;McManus et al.,2002；Tuschl et al.,1999；米国特許第６，５７３，０９９号明細書及び同６，５０６，５５９号明細書；並びに国際公開第０１／３６６４６号、同第９９／３２６１９号及び同第０１／６８８３６号を参照されたい）。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、Ａｌｎｙｌａｍによって開発されたＡＬＮ－ＰＣＳ０２である（フェーズ１進行中）。

いくつかの態様において、ＳＯＸ２１発現のインヒビターはｍｉＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」という用語は、一般に２１から２２ヌクレオチド長（１９から最大２３ヌクレオチドの長さが報告されてさえいるが）である成熟マイクロＲＮＡ（非コード低分子ＲＮＡ）分子を指す。ｍｉＲＮＡはそれぞれ、より長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」：ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）からプロセッシングされる。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、非タンパク質コード遺伝子から転写されるか、又は（イントロン又は非コードエクソン内の）タンパク質コード遺伝子に組み込まれる。「前駆体ｍｉＲＮＡ」は、不完全に塩基対合したステムを含むヘアピン構造に折り畳まれ、２つの段階でプロセッシングされ、Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒと呼ばれる２つのリボヌクレアーゼＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって動物において触媒される。プロセッシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」とも称される）は、翻訳を抑制するためにそれらをそれらの標的ｍＲＮＡと会合することができる大きなリボ核タンパク質複合体（ＲＩＳＣ）にアセンブルされる。

いくつかの実施形態において、ＳＯＸ２１発現のインヒビターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それに結合することによってＳＯＸ２１ ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断し、したがってタンパク質翻訳を防止するか又はｍＲＮＡ分解を増加させ、したがって細胞内のＳＯＸ２１タンパク質のレベル、したがって活性を低下させるように作用する。例えば、ＳＯＸ２１をコードするｍＲＮＡ転写物配列の固有の領域に相補的な少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、従来のホスホジエステル技術によって合成し、例えば、静脈内、皮下又は硝子体内の注入によって投与することができる。配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に緩和するためのアンチセンス技術を使用する方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号明細書；同第６，５６６，１３１号明細書；同第６，３６５，３５４号明細書；同第６，４１０，３２３号明細書；同第６，１０７，０９１号明細書；同第６，０４６，３２１号明細書；及び同第５，９８１，７３２号明細書を参照されたい）。

ＡＯＮは、当技術分野で周知のいくつかの手順のいずれかを用いてデノボで合成することができる。例えば、ｂ－シアノエチルホスホラミダイト法（Beaucage et al.,1981）；ヌクレオシドＨ－ホスホネート法（Garegg et al.,1986；Froehler et al.,1986，Garegg et al.,1986，Gaffney et al.,1988）これらの化学は、市場で入手可能な様々な自動核酸合成機によって実施することができる。これらの核酸は、合成核酸と称され得る。或いは、ＡＯＮは、プラスミドにおいて大規模に産生され得る（Sambrook,et al.,1989を参照のこと）。ＡＯＮは、公知の技術、例えば制限酵素、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを使用するものを使用して、既存の核酸配列から調製することができる。このようにして調製されたＡＯＮは、単離された核酸と称され得る。

ＡＯＮは安定化されていてもよいし、安定化されていてもよい。「安定化された」ＡＯＮは、インビボ分解（例えばエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを介して）に対して比較的耐性のＡＯＮを指す。安定化は、長さ又は二次構造の作用であり得る。或いは、ＡＯＮ安定化は、リン酸骨格修飾を介して達成することができる。本発明の好ましい安定化ＡＯＮは、修飾された骨格を有し、例えば、最大活性を提供し、細胞内エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼによる分解からＡＯＮを保護するためのホスホロチオエート結合を有する。他の可能な安定化修飾としては、ホスホジエステル修飾、ホスホジエステル修飾とホスホロチオエート修飾との組み合わせ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ－エトキシ、及びそれらの組み合わせが挙げられる。ＡＯＮの化学的に安定化された修飾バージョンには、「モルホリノ」（ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー、ＰＭＯ）、２’－Ｏ－Ｍｅｔオリゴマー、２’－フルオロ（２’－Ｆ）オリゴマー、トリシクロ（ｔｃ）－ＤＮＡ、Ｕ７短鎖核（ｓｎ）ＲＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ－オリゴアンチセンス分子（その全内容が参照により本明細書に援用される、２００９年４月１０日に出願された、Tricyclo-DNA Antisense Oligonucleotides,Compositions and Methods for the Treatment of Diseaseについての米国特許仮出願番号第６１／２１２，３８４号）、非ロックド核酸（ＵＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、セリノール核酸（ＳＮＡ）、ねじれ挿入核酸（ＴＩＮＡ）、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、Ｄ－アルトリトール核酸（ＡＮＡ）及びモルホリノ核酸（ＭＮＡ）もスプライス調節で研究されている。最近、２－チオリボチミジン及び５－（フェニルトリアゾール）－２－デオキシウリジンヌクレオチドを含む核酸塩基修飾ＡＯは、エクソンスキッピングを誘導することが報告されている（Chen S,Le BT,Chakravarthy M,Kosbar TR,Veedu RN.Systematic evaluation of 2’-Fluoro modified chimeric antisense oligonucleotide-mediated exon skipping in vitro.Sci Rep.2019 Apr 15;9(1):6078）。

特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ／ＥＮＡキメラオリゴヌクレオチド（Takagi M,Yagi M,Ishibashi K,Takeshima Y,Surono A,Matsuo M,Koizumi M.Design of 2’-O-Me RNA/ENA chimera oligonucleotides to induce exon skipping in dystrophin pre-mRNA.Nucleic Acids Symp Ser(Oxf).2004;(48):297-8）であり得る。

別の特定の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡギャップマー、すなわち、ＲＮアーゼＨ切断を誘導するのに十分な長さのデオキシヌクレオチドモノマーの中央ブロックを含有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド（Hagedorn PH,Persson R,Funder E.,Albak N,Dieme SL,Hansen DJ,Moller MR,Papargyri N,Christiansen H,Hansen BR,Hansen HF,Jensen MA,Koch T.Locked nucleic acid:modality,diversity,and drug discovery.Drug Discovery Today Volume 23,Issue 1,January 2018,Pages 101-114）である。

別の特定の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－ホスホロチオエートヌクレオチドである。

この効果のために使用され得るＡＯＮの他の形態は、限定されないが、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス（Denti,MA,et al,2008；Goyenvalle,A,et al,2004）に基づくウイルス移入法と組み合わせて、Ｕ１又はＵ７などの核内低分子ＲＮＡ分子に結合したＡＯＮ配列である。

いくつかの実施形態において、ＳＯＸ２１のインヒビターは、ＴＧＦβ２核酸配列中のＳＯＸ２１標的部位に結合する。これは、前記標的部位（例えば、立体干渉によって）を遮断し、ＳＯＸ２１によるその認識及び結合を防止し、したがってＳＯＸ２１及びその作用を阻害する効果を有する。いくつかの実施形態において、ＳＯＸ２１標的部位は、ＴＧＦβ２のイントロン１上に位置する。

特定の実施形態において、ＴＧＦβ２のイントロン１は、以下に記載されるように、以下の核酸配列、すなわち、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６（マウス）及び配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２（ヒト）を含む領域の少なくとも１つを有する。

更なる実施形態では、ＳＯＸ２１のインヒビターは、以下の核酸配列、すなわち、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２上のＳＯＸ２１の結合を阻害する。

別の実施形態では、ＳＯＸ２１のインヒビターは、以下の核酸配列、すなわち、配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２上のＳＯＸ２１の結合を阻害する。

いくつかの実施形態において、ＳＯＸ２１インヒビターは、ＴＧＦβ２核酸配列におけるＳＯＸ２１標的部位への前記オリゴヌクレオチドの結合が相補的な塩基対形成を介して起こり得るオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦβ２における標的部位の核酸配列（ＴＧＦβ２イントロン１のセンス配列及び相補配列の両方）に相補的である。

したがって、いくつかの実施形態では、ＳＯＸ２１インヒビターオリゴヌクレオチドとＴＧＦβ２核酸配列中のＳＯＸ２１標的部位との間の結合は、ＳＯＸ２１インヒビターオリゴヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのヌクレオチドとＴＧＦβ２核酸配列中のＳＯＸ２１標的部位中に存在する対応するヌクレオチドとの間の相補的塩基対形成を介して起こり、その結果、ＴＧＦβ２核酸配列中のＳＯＸ２１インヒビターオリゴヌクレオチドの少なくとも一部とＳＯＸ２１標的部位とが一緒になって塩基対核酸二重鎖を定義する。前記相補的塩基対形成（したがって、二重鎖形成）は、ＴＧＦβ２核酸配列におけるＳＯＸ２１標的部位の２つ又はそれを超える連続するヌクレオチドの領域にわたって起こり得る（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１個の連続ヌクレオチド）。（上記のように）ＳＯＸ２１インヒビターオリゴヌクレオチドがＴＧＦβ２核酸配列中のＳＯＸ２１標的に結合するときに形成される塩基対核酸二重鎖は、１つ以上のミスマッチ対合を含み得る。

いくつかの実施形態において、相補的塩基対核酸二重鎖（例えば、３、４、５又は６）の２つ又はそれを超える領域が形成され、各領域は、１つ以上のミスマッチ対合によって次の領域から分離される。

いくつかの実施形態において、標的部位は、ＴＧＦβ２のイントロン１上に位置する。ＳＯＸ２１インヒビターオリゴヌクレオチドが、ＴＧＦβ２核酸配列中のＳＯＸ２１標的部位への結合についてＳＯＸ２１と競合するいくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの核酸は、配列番号３からなる以下の配列、すなわち、配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２から選択される核酸配列を含むか、又はそれからなる。

したがって、前記核酸配列は、ＳＯＸ２１のシード領域によって標的化される位置における相補的結合を介してＴＧＦβ２のイントロン１に位置するＳＯＸ２１標的部位に結合し、したがって、ＳＯＸ２１の結合を妨げる。

典型的には、そのようなインヒビターは、ＳＯＸ２１とＴＧＦβ２との相互作用を遮断し、したがって、ＴＧＦβ２の活性化を減少させる。特定の実施形態において、ＳＯＸ２１発現のインヒビターはデコイである。本発明の文脈において、デコイは、核酸配列の断片又はＳＯＸ２１の変異体を指し、そのようなデコイは転写因子デコイとも呼ばれる。

特定の実施形態では、転写因子デコイはオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。本発明の文脈において、上記の核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、転写因子であるＳＯＸ２１に結合する。ＳＯＸ２１のコンセンサス結合配列を有するＯＤＮ。このストラテジーは、次いで標的ＳＯＸ２１によって認識及び結合されるそのような「デコイ」ＯＤＮの細胞内送達を含む。転写因子のＤＮＡ結合部位がデコイによって占有されると、タンパク質は、ＴＧＦβ２などの標的遺伝子のプロモーター領域にその後結合することができなくなる。このようなストラテジーは当技術分野で周知であり、J.Mann et al 2000:Therapeutic applications of transcription factor decoy oligonucleotides;J Clin Invest.2000;106(9):1071-1075に記載されている。

「変異体」という用語は、核酸に関して、ヌクレオチド配列の１つ以上の変化によってそれが由来する核酸と比較して異なるポリヌクレオチドとして理解されるべきである。変異体が由来する核酸は、親核酸としても知られている。典型的には、変異体は人工的に、好ましくは遺伝子技術的手段によって構築される。典型的には、親核酸は野生型核酸又はその一部である。本発明において使用可能な変異体はまた、親核酸のホモログ、オルソログ又はパラログに由来し得る。ヌクレオチド配列の変化は、１つ又はいくつかの部位で起こり得る交換、挿入、欠失、５’切断、又は３’切断、又はこれらの変化の任意の組み合わせであり得る。特定の実施形態では、本発明で使用可能な変異体は、ヌクレオチド配列の総数で最大６００（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００又は６００まで）の変化を示す。ヌクレオチド交換は、ポリペプチド変異体に関して以下に示すように、非保存的及び／又は好ましくは保存的アミノ酸交換をもたらし得る。代替的又は追加的に、本明細書で使用される「変異体」は、それが由来する親核酸とある程度の配列同一性によって特徴付けることができる。より正確には、本発明の文脈における核酸変異体は、その親核酸に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す。

特に、核酸変異体の配列同一性は、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００又はそれ以上のアミノ酸の連続ストレッチにわたって、より好ましくは参照核酸（親核酸）の全長にわたってである。「少なくとも８０％の配列同一性」という用語は、核酸配列比較に関しても本明細書を通して使用される。この用語は、好ましくは、それぞれの参照核酸又はそれぞれの参照核酸に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を指す。特に、問題の核酸及び参照核酸は、上記の連続ストレッチにわたって示された配列同一性を示す。

更なる実施形態では、核酸は、核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）である。

本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、「完全に相補的」及び「実質的に相補的」を含み、これは、オリゴヌクレオチドとその対応する標的配列との間に、通常、８０％を超える、好ましくは８５％を超える、更により好ましくは９０％を超える、最も好ましくは９５％を超える相補性の程度があることを意味する。例えば、その配列とその標的配列との間に１つのミスマッチを有する２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの場合、相補性の程度は９５％である。

特に、本発明は、標的配列と少なくとも２５％の配列同一性を有するＳＯＸ２１との相互作用に必要なＴＧＦβ２（イントロン１）の核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも２５％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列との２５％；２６％；２７％；２８％；２９％；３０％；３１％；３２％；３３％；３４％；３５％；３６％；３７％；３８％；３９％；４０％；４１％；４２％；４３％；４４％；４５％；４６％；４７％；４８％；４９％；５０％；５１％；５２％；５３％；５４％；５５％；５６％；５７％；５８％；５９％；６０％；６１％；６２％；６３％；６４％；６５％；６６％；６７％；６８％；６９％；７０％；７１％；７２％；７３％；７４％；７５％；７６％；７７％；７８％；７９％；８０％；８１％；８２％；８３％；８４％；８５％；８６％；８７％；８８％；８９％；９０％；９１％；９２％；９３％；９４％；９５％；９６％；９７％；９８％；９９％又は１００％の同一性を有することを意味する。配列同一性は、同一性パーセント（又は類似性若しくは相同性）に関して頻繁に測定される。パーセンテージが高いほど、２つの配列はより類似している。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムが、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444,1988；Higgins and Sharp,Gene,73:237-244,1988；Higgins and Sharp,CABIOS,5:151-153,1989；Corpet et al.Nuc.Acids Res.,16:10881-10890,1988；Huang et al.,Comp.Appls Biosci.,8:155-165,1992；及びPearson et al.,Meth.Mol.Biol.,24:307-31,1994）に記述されている。Altschul et al.,Nat.Genet.,6:119-129,1994は、配列アラインメント方法及び相同性計算の詳細な考察を提示している。一例として、位置合わせツールＡＬＩＧＮ（Myers and Miller,CABIOS 4:11-17,1989）又はＬＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman,1988）を使用して、配列比較（Internet Program（登録商標）1996,W.R.Pearson and the University of Virginia,fasta20u63 version 2.0u63,release date December 1996）を実行することができる。ＡＬＩＧＮは配列全体を互いに比較し、ＬＦＡＳＴＡは局所類似性の領域を比較する。これらのアライメントツール及びそれらのそれぞれのチュートリアルは、例えば、ＮＣＳＡウェブサイトで、インターネットで入手可能である。或いは、約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較のために、デフォルトパラメータ（ギャップ存在コストは１１、残留物ギャップあたりのコストは１）に設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ ２配列関数を使用することができる。短いペプチド（約３０アミノ酸未満）をアライメントする場合、アライメントは、デフォルトパラメータ（開放ギャップ９、延長ギャップ１のペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ ２配列関数を使用して実行されるべきである。ＢＬＡＳＴ配列比較システムは、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である。Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410,1990；Gish.&States,Nature Genet.,3:266-272,1993；Madden et al.Meth.Enzymol.,266:131-141,1996；Altschul et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402,1997；及びZhang&Madden,Genome Res.,7:649-656,1997も参照されたい。

典型的には、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する。

特定の実施形態では、本発明に従って使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５４、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７又は１０８の長さを有する。

いくつかの態様において、ＳＯＸ２１発現のインヒビターはリボザイムである。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のエンドヌクレアーゼ切断を含む。それにより、ＳＯＸ２１ ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的かつ効率的に触媒する操作されたヘアピン型又はハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子が本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、典型的には以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位について標的分子を走査することによって最初に同定される。同定されると、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する約１５～２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にする可能性がある予測される構造的特徴（二次構造など）について評価することができる。候補標的の適合性はまた、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのそれらのアクセス可能性を試験することによって評価することができる。

いくつかの態様において、ＳＯＸ２１発現のインヒビターはエンドヌクレアーゼである。「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。デオキシリボヌクレアーゼＩなどのいくつかは、ＤＮＡを比較的非特異的に（配列に関係なく）切断するが、多くの、典型的には制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素と呼ばれ、非常に特異的なヌクレオチド配列でのみ切断する。エンドヌクレアーゼに基づくゲノム不活性化の背後にある機構は、一般に、ＤＮＡ一本鎖又は二本鎖切断の第１のステップを必要とし、これはその後、ＤＮＡ修復のための２つの異なる細胞機構を引き起こすことができ、これは、ＤＮＡ不活性化のために利用することができる：エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び高忠実度相同指向修復（ＨＤＲ）。特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓである。本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、塩基配列の短い反復を含有する原核生物ＤＮＡのセグメントである、関連するクラスター化して規則的に配置された短い回文配列リピートを指す。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、米国特許第８６９７３５９号明細書及び米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、（Zetsche et al.,2015）のプロボテラ及びフランシセラ１（Ｃｐｆ１）由来のより最近に特徴付けられたＣＲＩＳＰＲであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１である。

別の実施形態では、ＳＯＸ２１活性のインヒビターは、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、有機小分子、抗体又はアプタマーである。

「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸残基及び多くとも１０アミノ酸残基の長さを有する短いペプチド、オリゴペプチド（１１～１００アミノ酸残基）、及びより長いペプチド（「ポリペプチド」の通常の解釈、すなわち１００を超えるアミノ酸残基の長さ）並びにタンパク質（前記機能的実体は、グリコシル化されることによって、脂質化されることによって、又は補綴基を含むことによって化学的に修飾され得る少なくとも１つのペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドを含む）の両方を指す。

特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＴＧＦβ２のイントロン１に結合することができるデコイペプチド、ポリペプチド又はペプチド模倣体である。

特定の実施形態では、ペプチド模倣体は、本発明の文脈においてＳＯＸ２１などのペプチドを模倣するように設計された小さなタンパク質様鎖である。本明細書で使用される「ペプチド模倣体」又はＰＭという用語は、非ペプチド化学部分を意味する。ペプチドは、あるアミノ酸のカルボキシル基が別のアミノ酸のアミノ基と反応するときに形成される共有化学結合であるペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸モノマーの短鎖である。最短のペプチドは、単一のペプチド結合によって結合された２アミノ酸からなるジペプチドであり、その後にトリペプチド、テトラペプチドなどが続く。ペプチド模倣化学部分は、非アミノ酸化学部分を含む。ペプチド模倣化学部分はまた、１つ以上の非アミノ酸化学単位によって分離された１つ以上のアミノ酸を含み得る。ペプチド模倣化学部分は、その化学構造のいずれの部分にも、ペプチド結合によって連結された２つ以上の隣接アミノ酸を含有しない。本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン又はシトルリンを意味する。

特定の実施形態では、ペプチド模倣体は、ＳＯＸ２１の機能的等価フラグメントである。

本明細書で使用される場合、「シンク」又は「トラップ」としてデコイとしても知られる「機能的等価物」は、ＴＧＦβ２に結合することができ、それによってＳＯＸ２１とのその相互作用を妨げる化合物である。ＳＯＸ２１のこのようなペプチド共融物は不活化形態である。本明細書で使用される場合、「シンク」又は「トラップ」としてデコイ又は「デコイ受容体」としても知られる「機能的等価物」は、ＴＧＦβ２に結合することができ、それによってＳＯＸ２１とのその相互作用を妨げる化合物である。より具体的には、それは、リガンドに結合するが、構造的にアゴニストをシグナル伝達受容体複合体にシグナル伝達又は提示することができない化合物である。デコイは、リガンドの分子トラップとして作用し、それによってリガンドがその機能性受容体に結合するのを防ぐ。デコイは、ＳＯＸ２１ペプチド模倣体又はその断片であり得る。したがって、「機能的に等価なフラグメント」という用語は、タンパク質類似体が可溶性ＴＧＦβ２に結合する能力を保持するように、例えば１つ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加によってアミノ酸配列を改変することによって得られるＳＯＸ２１の任意の等価物を含む。アミノ酸置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点突然変異によって行われ得る。機能的等価物には、ＴＧＦβ２に結合する分子が含まれる。

「変異体」という用語は、ペプチド模倣体に関して、アミノ酸配列の１つ以上の変化によってそれが由来するペプチド模倣体と比較して異なるペプチド模倣体として理解されるべきである。タンパク質変異体が由来するペプチド模倣体は、親ポリペプチドとしても知られている。典型的には、変異体は人工的に、好ましくは遺伝子技術的手段によって構築される。典型的には、親ポリペプチドは、野生型タンパク質又は野生型タンパク質ドメインである。本発明で使用可能な変異体はまた、親ポリペプチドのホモログ、オルソログ又はパラログに由来し得る。アミノ酸配列の変化は、１つ又はいくつかの部位で起こり得るアミノ酸交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断若しくはＣ末端切断、又はこれらの変化の任意の組み合わせであり得る。特定の実施形態では、本発明で使用可能な変異体は、アミノ酸配列（すなわち、交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断及び／又はＣ末端切断）の総数で最大２００（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００まで）の変化を示す。アミノ酸交換は、保存的及び／又は非保存的であり得る。好ましい実施形態では、本発明で使用可能な変異体は、それが由来するタンパク質又はドメインと、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００個のアミノ酸交換、好ましくは保存的アミノ酸変化によって異なる。代替的又は追加的に、本明細書で使用される「変異体」は、それが由来する親ポリペプチドとある程度の配列同一性によって特徴付けることができる。より正確には、本発明の文脈におけるタンパク質変異体は、その親ポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を示す。特に、タンパク質変異体の配列同一性は、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００又はそれ以上のアミノ酸の連続ストレッチにわたって、より好ましくは参照ポリペプチド（親ポリペプチド）の全長にわたってである。「少なくとも８０％の配列同一性」という用語は、ポリペプチド配列比較に関して本明細書全体を通して使用される。この発現は、特に、それぞれの参照ポリペプチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を指す。特に、問題のポリペプチド及び参照ポリペプチドは、上記の連続ストレッチにわたって示された配列同一性を示す。

本発明の「変異体」ペプチド模倣体の配列同一性は、ＳＯＸ２１のアミノ酸配列の同定された範囲にわたって、又は同定されたＳＯＸ２１デコイペプチド模倣体のアミノ酸配列全体を参照して決定することができる。変異ペプチド模倣体のパーセント配列同一性を決定する場合、配列アラインメントは、具体的に除外されたアミノ酸残基を除外し得る。例えば、配列番号２のアミノ酸に対して少なくとも８０％の配列同一性を示すＳＯＸ２１デコイペプチド模倣体の変異体ペプチド模倣体の場合、比較のための配列アラインメントは、アミノ酸のみにわたって行われてもよく、又は全長ＳＯＸ２１デコイペプチド模倣体内のアミノ酸配列の２つ以上の同定された範囲を考慮してもよい。

特定の実施形態では、ＳＯＸ２１のインヒビターは有機小分子である。「小有機分子」という用語は、医薬品に一般的に使用される有機分子に匹敵するサイズの分子を指す。この用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい小有機分子は、最大約５０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、最も好ましくは最大約１０００Ｄａのサイズの範囲である。

いくつかの態様において、ＳＯＸ２１のインヒビターは抗体である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を包含する。この用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂｓ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆｄ、線状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ、トリボディ（ｓｃＦｖ－Ｆａｂ融合物、それぞれ二重特異性又は三重特異性）、ｓｃ－ダイアボディ；κ（λ）体（ｓｃＦｖ－ＣＬ融合物）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞を引き付けるｓｃＦｖ－ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ－Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性フォーマット）；ＳＩＰ（ミニボディの一種である小免疫タンパク質）；ＳＭＩＰ（「小型モジュール式免疫医薬」ｓｃＦｖ－Ｆｃ二量体；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「二重親和性リターゲティング」）；１つ以上のＣＤＲなどを含む小型抗体模倣物、などの抗原結合ドメインを含む抗体断片を含む。様々な抗体ベースの構築物及び断片を調製及び使用するための技術は、当技術分野で周知である（参照により本明細書に具体的に援用される（Kabat et al.,1991）を参照されたい）。ダイアボディは、特に、欧州特許出願公開第４０４，０９７号明細書及び国際公開第９３／１１１６１号に更に記載されている。一方、線状抗体は、（Zapata et al.,1995）に更に記載されている。抗体は、従来の技術を使用して断片化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。得られたＦ（ａｂ’）２断片を処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ’断片を生成することができる。パパイン消化は、Ｆａｂフラグメントの形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片及び他の断片も、組換え技術によって合成することができ、又は化学的に合成することができる。抗体断片を産生するための技術は周知であり、当技術分野に記載されている。例えば、（Beckman et al.,2007；Holliger&Hudson,2005；Le Gall et al.,2004；Reff&Heard,2001；Reiter et al.,1996；Young et al.,1995）の各々は、有効な抗体断片の産生を更に記載し、可能にする。いくつかの実施形態では、抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載の「キメラ」抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、例えば、米国特許第６，９８２，３２１号明細書及び同第７，０８７，４０９号明細書に記載のヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。米国特許第６，０７５，１８１号明細書及び同第６，１５０，５８４号明細書に記載されているような「ヒト抗体」。いくつかの実施形態では、抗体は、欧州特許出願公開第０３６８６８４号明細書、国際公開第０６／０３０２２０号及び同第０６／００３３８８号に記載されているような単一ドメイン抗体である。

特定の実施形態では、ＳＯＸ２１のインヒビターはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製及び単離することができる。産生及び単離のための技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない。

特に、インヒビターは、ＳＯＸ２１に対する特異性を有するイントラボディである。本明細書で使用される場合、「細胞内抗体」という用語は、一般に、細胞内抗体又は抗体断片を指す。抗体、特に一本鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）は、細胞内局在化のために修飾することができる。そのような改変は、例えば、安定な細胞内タンパク質（例えば、マルトース結合タンパク質など）への融合、又は細胞内輸送／局在化ペプチド配列（例えば、小胞体保持など）の付加を伴い得る。いくつかの態様において、イントラボディは単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、本発明による抗体は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」という用語は、軽鎖を天然に欠くラクダ科哺乳動物に見られ得るタイプの抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは、「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。本発明によれば、ｓｄＡｂは特にラマｓｄＡｂであり得る。

特定の実施形態では、ＳＯＸ２１のインヒビターはアプタマーである。アプタマーは、分子認識に関して抗体の代替物を表す分子のクラスである。アプタマーは、実質的に任意のクラスの標的分子を高い親和性及び特異性で認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。

更なる実施形態では、上記のＳＯＸ２１遺伝子発現及び／又は活性のインヒビターが、単独で、又はウイルスベクターと組み合わせて送達される、本発明による方法。

典型的には、本発明は、それを必要とする対象において眼疾患を処置する方法であって、ＳＯＸ２１遺伝子発現及び／又は活性のインヒビターを含む処置有効量のベクターを当該対象に投与する工程を含む方法に関する。

特定の実施形態では、ベクターが上記の核酸分子を含む、本発明による方法。

特定の実施形態では、ベクターに含まれる核酸分子は、ＳＯＸ２１に特異的な酸核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又はエンドヌクレアーゼ）をコードする。

別の実施形態において、ベクターに含まれる核酸分子は、ＴＧＦβ２のイントロン１に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする。

特定の実施形態では、核酸分子がプロモーター配列（ミオシリン又はｄｃｔプロモーターなど）に作動可能に連結されている、本発明による方法。

特定の実施形態では、ベクターがウイルスベクターである、本発明による方法。

特定の実施形態では、ウイルスベクターがレンチウイルス（ＬＶ）である、本発明による方法。

本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、約１２０nmのサイズを測定するエンベロープＲＮＡ粒子が効率的な薬物送達ツール、より具体的には遺伝子送達ツールであることを指す。ＬＶは、その偽型を付与するそのエンベロープタンパク質に結合し、それを介して標的細胞に入る。ＬＶが細胞に入ると、それはカプシド成分を放出し、レンチウイルスＲＮＡの逆転写を受けた後、プロウイルスＤＮＡを標的細胞のゲノムに組み込む。非組込み型レンチウイルスベクターは、ベクター組込み機構の特性を改変することによって作製されており、一過性遺伝子発現に使用することができる。プロウイルスを欠くウイルス様粒子も作製されており、タンパク質又はメッセンジャーＲＮＡを送達するために使用することができる。ＬＶは、例えば、遺伝子付加、ＲＮＡ干渉、エクソンスキッピング又は遺伝子編集に使用することができる。これらのアプローチはすべて、偽型を介したＬＶの組織又は細胞標的化によって促進され得る。

レンチウイルス様粒子は、例えば（Aoki et al.,2011；Kaczmarczyk et al.,2011；McBurney et al.,2006；Muratori et al.,2010）に記載されている。レンチウイルス様粒子の例は、ｇａｇ融合タンパク質（目的の遺伝子と融合したＧａｇ）とシンシチンタンパク質をプロデューサー細胞で共発現させることによって生成されたＶＬＰである。薬物及び／又はシンシチンは、粒子の表面に表示されてもよく、又は粒子に封入（パッケージング）されてもよい。シンシチンタンパク質は、有利には、粒子にカップリングされるか、又は（エンベロープ）ウイルス粒子若しくはウイルス様粒子のエンベロープに組み込まれて、偽型エンベロープウイルス粒子若しくはウイルス様粒子を形成するなど、粒子の表面に提示される。薬物は、粒子に結合されるか、又は粒子にパッケージングされる。例えば、薬物は、ウイルスキャプシドにカップリングされるか、又はウイルスキャプシドにパッケージングされ、前記ウイルスキャプシドは、エンベロープ、好ましくはシンシチンでシュードタイプ化されたエンベロープを更に含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、薬物は、シンシチンタンパク質でシュードタイプ化された粒子にパッケージングされる。粒子にパッケージングされる薬物は、有利には、ウイルスベクター粒子、好ましくはレトロウイルスベクター粒子、より好ましくはレンチウイルスベクター粒子にパッケージングされる目的の異種遺伝子である。

特定の実施形態では、ウイルスベクターがアデノウイルスである、本発明による方法。

本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」という用語は、二本鎖ＤＮＡゲノムを含有する正二十面体ヌクレオカプシドを有する中サイズ（９０～１００nm）のエンベロープのない（外側脂質二重層を含まない）ウイルスを指す。

特定の実施形態では、ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、本発明による方法。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、アデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルス自体又はその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、天然に存在する形態及び操作された形態の両方のすべての血清型及び変異体を包含する。本発明によれば、「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ １型（ＡＡＶ－１）、ＡＡＶ ２型（ＡＡＶ－２）、ＡＡＶ ３型（ＡＡＶ－３）、ＡＡＶ ４型（ＡＡＶ－４）、ＡＡＶ ５型（ＡＡＶ－５）、ＡＡＶ ６型（ＡＡＶ－６）、ＡＡＶ ７型（ＡＡＶ－７）並びにＡＡＶ ８型（ＡＡＶ－８）及びＡＡＶ ９型（ＡＡＶ９）を指す。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、並びに天然末端反復配列（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で公知である。そのような配列は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ－２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ－２）及びＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ－５）を参照されたい。本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶベクター」は、目的のポリヌクレオチド（すなわち、ＳＯＸ２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含むＡＡＶベクターを指す。ｒＡＡＶベクターは、５’及び３’アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、標的細胞におけるその発現を調節する配列に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドとを含む。

本発明のＡＡＶベクターは、典型的には、コードされた分子ポリペプチド（すなわち、ＳＯＸ２１ペプチド模倣物）の発現及び分泌を可能にする調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列などを含む。これに関して、ベクターは、感染細胞におけるタンパク質の発現を引き起こす又は改善するために、目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター領域を含む。そのようなプロモーターは、感染組織におけるタンパク質の効率的かつ適切な産生を可能にするために、遍在性、組織特異的、強、弱、調節、キメラ、誘導性などであり得る。プロモーターは、コードされたタンパク質と相同であってもよく、又は細胞、ウイルス、真菌、植物若しくは合成プロモーターを含む異種であってもよい。そのような調節されたプロモーターの例としては、限定されないが、Ｔｅｔオン／オフ要素含有プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター及びメタロチオネインプロモーターが挙げられる。遍在性プロモーターの例としては、ウイルスプロモーター、特にＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶエンハンサーを有するニワトリβアクチンプロモーター）、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど、及びＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターなどの細胞プロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、シナプシン若しくはＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）プロモーター（又は遍在性ＰＧＫプロモーターの上流に配置されたＮＲＳＥ（ニューロン制限サイレンサー要素）配列）などの神経特異的プロモーター、又はＤＣＴなどの虹彩細胞型若しくはＭＹＯＣなどの線維柱帯、又はＲＰＥ６５、ＢＥＳＴ１、ロドプシン若しくはコーンアレスチンプロモーターなどの網膜細胞型に特異的なプロモーターであり得る。ベクターはまた、非所望細胞における導入遺伝子発現の抑制を達成するｍｉＲＮＡのための標的配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、コードされたタンパク質の分泌を可能にするリーダー配列を含む。目的のポリヌクレオチドと分泌シグナルペプチドをコードする配列（通常、分泌されたポリペプチドのＮ末端に位置する）との融合は、形質導入された細胞から分泌され得る形態の処置用タンパク質の産生を可能にする。そのようなシグナルペプチドの例としては、アルブミン、β－グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ又はフィブロネクチン分泌シグナルペプチドが挙げられる。

本発明の組換えＡＡＶベクターは、当技術分野で周知の方法を使用して作製される。手短に言えば、本方法は、一般に、（ａ）ｒＡＡＶベクターの宿主細胞への導入、（ｂ）ｒＡＡＶベクターに欠けているウイルス機能を含むＡＡＶヘルパー構築物の宿主細胞への導入、及び（ｃ）ヘルパーウイルスの宿主細胞への導入を含む。ｒＡＡＶビリオンへのｒＡＡＶベクターの複製及びパッケージングを達成するために、ｒＡＡＶビリオンの複製及びパッケージングのためのすべての機能が存在する必要がある。宿主細胞への導入は、標準的なウイルス学的技法を使用して同時に又は順次に行うことができる。最後に、宿主細胞を培養してｒＡＡＶビリオンを作製し、ＣｓＣｌ勾配などの標準的な技術を用いて精製する。残留ヘルパーウイルス活性は、例えば熱不活性化などの公知の方法を使用して不活性化することができる。次いで、精製されたｒＡＡＶベクターを本発明の方法で使用する準備が整う。

特定の実施形態では、ＡＡＶベクターが、眼細胞に対する指向性及び高い形質導入効率を有するＡＡＶ血清型に由来するベクターから選択される、本発明による方法。

特定の実施形態では、ＡＡＶベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９である、本発明による方法。

特定の実施形態では、ＡＡＶベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、８又はＡＡＶ９である、本発明による方法。

本明細書で使用される場合、「投与する」又は「投与」という用語は、体外（例えば、ネイキッドな又はウイルスベクターを有するＳＯＸ２１のインヒビター）に存在する物質を対象に注入するか、そうでなければ物理的に送達する行為、静脈内、硝子体内、皮下の投与（例えば、注入又は点滴によって）を指す。疾患又はその症状が処置されている場合、物質の投与は、典型的には、疾患又はその症状の発症後に行われる。疾患又はその症状が予防されている場合、物質の投与は、典型的には、疾患又はその症状の発症前に行われる。

本発明の組換えＡＡＶベクターを対象に投与することは、好ましくは静脈内、硝子体内、皮下送達によって行われる。いくつかの実施形態では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、硝子体内注入によって対象に投与される。

特定の実施形態では、本発明による方法、本発明によるネイキッドな又はウイルスベクターを有するＳＯＸ２１のインヒビターは、硝子体内、皮下、静脈内、点眼又は眼軟膏送達によって送達される。

別の実施形態では、本発明によるネイキッドな又はウイルスベクターを有するＳＯＸ２１のインヒビターは、点眼又は眼軟膏用に送達される。

更なる実施形態では、本発明によるＳＯＸ２１のインヒビターをネイキッドで又はウイルスベクターとともに、エレクトロポレーション又はソノポレーションによって送達する。

特定の実施形態では、本発明によるネイキッドな又はウイルスベクターを有するＳＯＸ２１のインヒビターは、虹彩、毛様体、房水又は線維柱帯に送達される。

ＳＯＸ２１遺伝子発現及び／又は活性のインヒビター単独又は上記のウイルスベクター（例えばＡＡＶ）と組み合わせたインヒビターの「処置有効量」とは、眼疾患（緑内障、ＯＡＧ、ＰＯＡＧ、近視）の処置のための十分な量のインヒビター単独又はウイルスベクターと組み合わせたインヒビターを意味する。しかしながら、本発明のＡＡＶベクターの総投与量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。任意の特定の対象に対する具体的な処置有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度、使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事；使用される特定の化合物の投与時間、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；及び医学分野で周知の同様の要因を含む種々の因子に依存するであろう。例えば、所望の処置効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは十分に当業者の範囲内である。典型的には、１０^８～１０^１０のウイルスゲノム（vg）がマウスにおいて用量あたり投与される。典型的には、ヒトに投与されるＡＡＶベクターの用量は、１０^１０～１０^１２vgの範囲であり得る。

医薬組成物
上記のＳＯＸ２１発現及び／又は活性のインヒビター（単独で又はベクターと共に）を、薬学的に許容され得る賦形剤、及び場合により徐放性マトリックス（例えば、生分解性ポリマーなど）と組み合わせて、薬学的組成物を形成することができる。

したがって、本発明は、ＳＯＸ２１発現及び／又は活性のインヒビターを含む医薬組成物に関する。

特定の実施形態では、医薬組成物は、単独で又はウイルスベクターと組み合わせてＳＯＸ２１発現及び／又は活性のインヒビターを含む。

特定の実施形態では、眼疾患の処置に使用するための本発明による医薬組成物。

より詳細には、ＭＣＯＲの処置に使用するための本発明による医薬組成物。

更なる実施形態では、緑内障の処置に使用するための本発明による医薬組成物。

特定の実施形態では、ＰＯＡＧを含むＯＡＧの処置に使用するための本発明による医薬組成物。

特定の実施形態では、近視の処置に使用するための本発明による医薬組成物。

本明細書で使用される場合、「薬学的に」又は「薬学的に許容される」という用語は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与した場合に有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤補助剤を指す。静脈内送達、硝子体内送達又は皮下送達のための本発明の医薬組成物は、単独で又は別の有効成分と組み合わせて、従来の薬学的支持体との混合物として単位投与形態で動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、静脈内、硝子体内及び皮下投与形態を含む。典型的には、医薬組成物は、注入可能な製剤に対して薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に等張性の滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水又は生理食塩水を添加すると注入可能な溶液の構成を可能にする乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。注入可能な使用に適した医薬形態には、滅菌水溶液又は分散液が含まれる。ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；滅菌注入可能溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末。すべての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射針通過性（syringability）が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中及び油中で調製することもできる。保存及び使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。ポリペプチド（又はそれをコードする核酸）は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注入可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物における使用によってもたらされ得る。滅菌注入可能溶液は、必要量の活性ポリペプチドを、必要に応じて上に列挙した他の成分のいくつかと共に適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。

製剤化すると、溶液は、投与製剤と適合する様式で、処置上有効な量で投与される。製剤は、上記の注入可能な溶液の種類などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤は、まず十分な生理食塩水又はグルコースで等張性にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、１つの投与量を１mLの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００mLの皮下注入液に添加するか、又は提案された注入部位に注入することができる。処置される対象の状態に応じて、投与量のいくらかの変動が必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の対象に対する適切な用量を決定する。

特定の実施形態では、（本発明のネイキッドな又はベクターを有する）本発明によるＳＯＸ２１のインヒビターは、（本発明のネイキッドな又はベクターを有する）インヒビターが、角膜及び眼の内部領域、例えば前房、後房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、レンズ、脈絡膜／網膜及び強膜を透過することができるように、薬学的に許容される眼科用ビヒクル中で送達され得る。薬学的に許容される眼科用ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油又は封入材料であり得る。

或いは、本発明によるＳＯＸ２１のインヒビター（例えば、網膜剥離後）を、硝子体、房水、虹彩、１若しくは複数の毛様体組織、又は細胞、及び／又は眼外筋、網膜に、又は更には上脈絡膜腔内に直接注入してもよい。エレクトロポレーション又はソノポレーション手段はまた、本発明によるＳＯＸ２１のインヒビターを（単独で又は本発明のベクターと共に）送達するのに適している場合がある。更なる実施形態では、ＳＯＸ２１のインヒビターは、ネイキッドで又はウイルスベクターとともに、点眼又は眼軟膏用の薬学的に許容される眼科用ビヒクル中に製剤化される。

スクリーニング方法
本発明の更なる目的は、眼疾患（緑内障、ＯＡＧ、ＰＯＡＧ及び／又は近視）の処置に適した薬物をスクリーニングする方法であって、ｉ）試験化合物を提供する工程と、ｉｉ）ＳＯＸ２１の発現及び／又は活性を阻害する前記試験化合物の能力を決定する工程とを含む方法に関する。

当技術分野で周知の任意の生物学的アッセイは、試験化合物がＳＯＸ２１の発現及び／又は活性を阻害する能力を決定するのに適し得る。

いくつかの実施形態では、アッセイは、試験化合物がＳＯＸ２１遺伝子、そのｍＲＮＡ又はその産物に結合する能力を最初に決定することを含む。いくつかの実施形態において、アッセイは、試験化合物がＴＧＦβ２のイントロン１に結合する能力を最初に決定することを含む。いくつかの態様では、次いで、試験化合物がＳＯＸ２１の発現及び／又は活性を阻害する能力を決定するために、細胞の集団を接触させ、活性化する。特に、試験化合物によって引き起こされる効果は、試験化合物の非存在下又はいずれも陰性対照条件に類似する対照剤の存在下で並行してインキュベートされた免疫細胞の集団の効果に対して決定される。本明細書で使用される「対照物質」、「対照剤」又は「対照化合物」という用語は、不活性であるか、又は生物学的活性若しくは発現を調節する能力に関する活性を有さない分子を指す。本明細書中に記載されるインビトロ方法を使用して求められる場合、ＳＯＸ２１の発現及び／又は活性を阻害することができる試験化合物は、インビボでの適用において同様の調節能力を示す可能性が高いことが理解されるべきである。典型的には、試験化合物は、ペプチド、ペチドミメティック、有機小分子、アプタマー又は核酸からなる群において選択される。例えば、本発明による試験化合物は、以前に合成された化合物のライブラリー、又は構造がデータベースで決定されている化合物のライブラリーから、又はデノボで合成された化合物のライブラリーから選択され得る。いくつかの実施形態では、試験化合物は、アンチセンスなどの核酸から選択され得る。

本発明を以下の図及び実施例によって更に説明する。しかしながら、これらの実施例及び図は、如何なる様式でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきものではない。

実施例１：
材料及び方法

マウス系統
遺伝子導入マウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してImagine Transgenic Platformによって作製した。すべての動物手順は、高等教育研究革新省及びパリ・デカルト大学の倫理委員会の承認を得て実施された。ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ、表１）をＣＲＩＳＰＯＲ（http://crispor.tefor.net/）によって設計し、配列を以下の表に列挙する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（４週齢）に、５ ＩＵのＰＭＳＧ（ＳＹＮＣＲＯ－ＰＡＲＴ（登録商標）ＰＭＳＧ ６００ ＵＩ、Ceva）、続いて５ ＩＵのｈＣＧ（Chorulon 1500 UI,Intervet）を４６時間～４８時間の間隔で腹腔内注射することによって過剰排卵させ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスと交配させた。翌日、卵管から接合体を回収し、ヒアルロニダーゼ（Ｈ３８８４、Sigma-Aldrich）に曝露して卵丘細胞を除去し、次いで、ＣＯ２インキュベーター（５％ ＣＯ２、３７℃）内のＭ２培地（Ｍ７１６７、Sigma-Aldrich）に入れた。ＳｇＲＮＡをｃａｓ９（ＷＴ）タンパク質とハイブリダイズさせ、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ接合体の前核に注入した。生存している接合子をＫＳＯＭ培地（ＭＲ－１０６－Ｄ、Merck-Millipore）に入れ、二細胞期まで一晩培養し、次いでＢ６ＣＢＡＦ１偽妊娠雌の卵管に移した。生成されたトランスジェニックマウスを、潮汐ＴＩＤＥ分析と組み合わせたサンガーシーケンシングによって検証した（https://tide-calculator.nki.nl/；データは示さず）。すべてのマウスをＣ５７ＢＬ／６ｊマウスと戻し交配して、潜在的なオフターゲットを除去した。子孫を、適切なプライマーを用いたＰＣＲ遺伝子型決定によって更に確認した。

円形染色体コンフォメーション捕捉シークエンシング（４Ｃ－ｓｅｑ）。
ｃΔＭＣＯＲマウスに特異的な潜在的な活性エンハンサー及びサイレンサーを、４Ｃ－ｓｅｑ技術を使用することによってＳｏｘ２１プロモーターとの相互作用の獲得又は喪失について評価した。本発明者らは、Ｓｏｘ２１調節領域を取り囲む２kbの観点から４Ｃ－ｓｅｑを、胚並びにＷＴマウス及びｃΔＭＣＯＲマウス（Ｅ９．５）に由来するマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において行った。簡潔には、van de Werken et al.,2012及びLupianez et al.,2015に記載されているように、ゲノム相互作用を、２回の消化（すなわち、ＤｐｎＩＩ及びＣｓｐ６Ｉ；New England Biolabs）、短い消化断片のライゲーション誘導性環状化、視点断片を標的とするように設計されたプライマー（５’ｔｇｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔａｔｇｔｔｃａｇａｔｃ ３’（配列番号３５）及び５’ｇｔｇｃａａａｃｃａａｔｔｃａｔｇｔｔａ ３’（配列番号３６）を使用した逆ＰＣＲ増幅、並びにそのライゲーションされたパートナーの増幅を受ける架橋及びクロマチン凝集体によって捕捉した。合計１．６mgの各ライブラリーをＰＣＲ増幅し、バーコード化して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａ－ｓｅｑ技術を用いた５０bpシングルエンド読み出しシーケンシングを可能にした。視点の周りのシス接触プロファイルの配列抽出、マッピング、正規化、及びプロットを可能にする４Ｃｓｅｑｐｉｐｅを使用することによって、視点を囲む２Mb領域内の高解像度接触プロファイルを生成した（van de Werken et al.2012を参照されたい）。手短に言えば、４Ｃ－ｓｅｑリードを逆多重化し、プライマー配列をクリーニングした。トリミングしたリードをヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８（デフォルト設定でＢｏｗｔｉｅ ２ ２．２．３）に対してマッピングし、マッピングの質が低く、ユニークでない配列（マッピングスコアＭＡＰＱ＜３０；Ｓａｍｔｏｏｌｓ ０．１．１９）については除外した。リードカウントプロファイルを計算するために、視点及び隣接するフラグメント１．５kbの上方及び下流を除去した。１０Ｋｂのスライド窓を使用してデータを平滑化した。視点を含む染色体にマッピングされたすべてのリードをスケーリングすることによって４Ｃ－ｓｅｑライブラリーの配列決定の深さを説明するために、データを１００万個当たりのリードに正規化した（ＲＰＭ）。異なるサンプルの相互作用プロファイルを比較するために、正規化リードの各ウィンドウに対するｌｏｇ２倍変化を計算した。比を得るために、ＲＰＭ正規化で使用されるスケーリングパラメータの計算のために重複領域を除外した。調整Ｐ値を得るために、胚及びＭＥＦにおけるＢ６．ＷＴとＢ６．ｃＤＭＣＯＲとの間の差次的接触を比較するために、多重比較を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用した。各群の結果を計算し、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて統計学的有意性について評価した。

瞳孔測定
２月齢マウス（８ ＷＴ及び８ ｃΔＭＣＯＲ）を一晩暗順応させた。瞳孔径は、Kostic et al 2016によって以前に記載されたように記録した。簡単に言うと、光開始前の５００msの間の平均瞳孔径として基準瞳孔径が設定され、その後、すべての瞳孔サイズをベースライン値の関数である相対サイズに変換した。以下の光刺激配列を使用した：５０ms（－２．２、－１、０．５）logW/m²白色光及び２０ｓ ０ logW/m²青色光。瞳孔径は、Neuroptics A2000,Inc.softwareによって自動的に決定された。１元配置／２元配置ＡＮＯＶＡ分析を使用して有意差を同定した。

ＲＮＡ配列
ＷＴマウス及びｃΔＭＣＯＲマウスからの全虹彩ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen）を使用して抽出した。ＲＮＡｓｅｑをImagineのGenomic Platformで行った。簡単に記載すると、全ＲＮＡ（２００ｎｇ）を精製し、断片化し、逆転写し、バーコード化した。ｃＤＮＡライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡサンプル調製キットを製造者の推奨（Illumina）に従って使用して４つのＷＴサンプル及び４つのｃΔＭＣＯＲサンプルから調製した。インデックス付けされたｃＤＮＡライブラリーをプールし、コードＲＮＡ領域に特異的なビオチン標識プローブにハイブリダイズさせた。結合したｃＤＮＡを、ストレプトアビジン－ビーズ媒介精製を使用して回収し、ＨｉＳｅｑ ２０００（Illumina）でのクラスター生成及び配列決定によるクローン増幅の前に、第２の濃縮反応のためにハイブリダイゼーションした。ＲＮＡ－ｓｅｑデータの分析は、ImagineのBioinformatics Platformにおいて、品質評価（ＦａｓｔＱＣ ０．１１．５）、品質フィルタリング（Trimmomatic）、ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ ３８に対するリードマッピング（STAR aligner）、リードカウント（GENCODE v24 http://www.gencodegenes.org/からの注釈付きＨＴＳｅｑソフトウェア）を含む標準的なワークフローを用いて行った。遺伝子発現レベルを正規化し、LimmaVoom、ＤＥＳｅｑ ２及びｅｄｇｅＲを使用してサンプル間で比較した。ＷＴ群と比較してｃΔＭＣＯＲ群において少なくとも１．５倍の変化（ｐ＜０．０５）を示す遺伝子の平均発現値を、ＡＮＯＶＡ及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙ ＰａｔｈｗａｙＡｎａｌｙｓｉｓ（http://www.ingenuity.com）モジュールを含むＰａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ ６．６を使用して、階層的及び機能的クラスター化について分析した。

ＲＴ－ｑＰＣＲ分析
成体マウスを頸椎脱臼によって供死し、眼球摘出した。眼を慎重に切開して虹彩及びＣＢを回収した。ＷＴ型マウス及びｃΔＭＣＯＲマウスからの虹彩全ＲＮＡ（２００ng）を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen）を使用して抽出し、製造者の説明書（Roche）に従ってＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ ｋｉｔにより逆転写した。Ｓｏｘ２１及びＤｃｔ ｍＲＮＡの存在量は、特定のプライマー、すなわち、Ｓｏｘ２１（５’－ｇａｔｇｃａｃａａｃｔｃｇｇａｇａｔｃａ－３’（配列番号３７）／５’－ｇｇｃｇａａｃｔｔｇｔｃｃｔｔｔｔｔｇａ－３’（配列番号３８）及びＤｃｔ（５’－ａａｔｔｃｔｔｃａａｃｃｇｇａｃａｔｇｃ－３’（配列番号３９）／５’－ｔｔｇｃｇｔｇｇｔｇａｔｃａｃｇｔａｇｔ－３’（配列番号４０）を使用して測定した。ＧｕｓＢ（５’－ｃｔｇｃｇｇｔｔｇｔｇａｔｇｔｇｇｔｃｔｇｔ－３’（配列番号４１）／５’－ｔｇｔｇｇｇｔｇａｔｃａｇｃｇｔｃｔｔａａａｇｔ－３’（配列番号４２）及びＨｐｒｔ１（５’－ｇｔｔｇｇａｔａｃａｇｇｃｃａｇａｃｔｔｔｇｔｔ－３’（配列番号４３）／５’－ａａａｃｇｔｇａｔｔｃａａａｔｃｃｃｔｇａａｇｔａ－３’（配列番号４４）を使用してデータを正規化し、Ａｌｂ（５－ｇｇｇａｃａｇｔｇａｇｔａｃｃｃａｇａｃａｔｃｔａ－３’（配列番号４５）／５’－ｃｃａｇａｃｔｔｇｇｔｇｔｔｇｇａｔｇｃｔｔ－３’（配列番号４６）を使用して、ゲノムＤＮＡによるｃＤＮＡの非汚染を制御した。各試料のｃＤＮＡ（ＲＮＡｓｅを含まないＨ_２Ｏで１：２５に希釈した溶液５μl）を、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Life Technologies）及び３００nMフォワードプライマー及びリバースプライマーを含有する緩衝液（２０μl）中で、以下の条件で、リアルタイムでＰＣＲ増幅に供した：Ｔａｑポリメラーゼの活性化及び９５℃で１０分間の変性、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の５０サイクル。増幅産物の特異性は、９５℃で１５秒間、次いで６０℃～９５℃で２０分間の段階的な熱増加を用いて、各増幅の最後に実行された融解曲線の分析後に決定された。データ分析及び方法論は、Gerard et al 2012によって以前に記載されたように実行された。

イムノブロッティング
成体マウスを頸椎脱臼によって供死し、眼球摘出した。眼を慎重に切開して虹彩及びＣＢを回収した。組織を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ、Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼインヒビターカクテル１Ｘ（ThermoScientific）及び２５Ｕ／ｍｌ Ｐｉｅｒｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ThermoScientific）を含有する低洗剤溶解緩衝液中での反復均質化によって１時間氷上で溶解した。溶解物を遠心分離し（４℃で１５分間、２００００ｇ）、上清を回収し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いてタンパク質を定量した。ウエスタンブロット分析のために、タンパク質（２５μg）を供給者の推奨に従って４～１５％ポリアクリルアミドゲル（mini-PROTEAN TGX、Bio-Rad、Marnes-la-Coquette、フランス）によって分離した。すべての溶解物を、装填前に９５℃で１０分間加熱した。タンパク質を、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Bio-Rad）を使用してＰＶＤＦ ０．２μM膜（Bio-Rad）に転写し、次いで、免疫ブロットのために処理した。膜をＳｏｘ２１ヤギのポリクローナル抗体（１：２０００、ＡＦ３５３８ Ｒ＆Ｄシステム）及びモノクローナルマウス抗β－アクチン（１：２０００、Abcam、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）一次抗体でプローブし、次いで、それぞれロバ抗ヤギＩｇＧ－ＨＲＰ（１：２０００、ThermoScientific）及びロバ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体（１：４０００、ThermoScientific）とインキュベートした。ブロットを、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Bio-Rad）及びＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Bio-Rad）を使用して発色させた。ウエスタンブロット画像を取得し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア３．０．１ビルド１８（Bio-Rad）で分析した。

免疫蛍光標識
免疫組織化学のために、Ｄｃｔ（Ｓｗｉｓｓ－ａｌｂｉｎｏ、ＣＦＷ）を発現するアルビノバックグラウンドでＣ５７ＢＬ／６Ｊ ｃΔＭＣＯＲマウスを誘導した。成体マウスを頸椎脱臼によって供死し、眼球摘出した。眼をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で切開し、４％パラホルムアルデヒド中で４℃にて一晩固定し、１Ｘ ＰＢＳで１５分かけて３回洗浄した。眼をＯＣＴ（商標）化合物に包埋し、－８０℃で保存した。矢状切片（１０μm）を最初に、熱誘導エピトープ回収（１０mMクエン酸ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ６）のための緩衝溶液に３０分間浸漬し、次いで、室温で３０分間冷却し、５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ １Ｘで１時間ブロッキングした。一晩の一次抗体インキュベーション（ＳＯＸ２１ヤギポリクローナル、ＡＦ３５３８ Ｒ＆Ｄシステム１：１００及びＤＣＴウサギ抗マウス、ａｂ７４０７３ Ａｂｃａｍ １：２００）を４℃で行い、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ二次抗体インキュベーションを室温で１時間行った（ロバ抗ヤギ６４７ Ａ ２１４４７及びロバウサギ５５５ Ａ３１５７２の１：１０００希釈）。核の可視化のために、すべての切片をＤａｐｉ（Ｓｉｇｍａ１０２３６２７６００１）で対比染色した。スピンディスク（Zeiss）蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影し、画像Ｊ解析システムを使用して画像を解析した。

視神経乳頭におけるグリア核計数。
１歳のＷＴ及びｃΔＭＣＯＲマウスを頸椎脱臼によって供死し、眼球摘出した。視神経（ＯＮ）を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、厚さ４μmの断面に切断した湾曲ハサミを使用することによって眼球から解剖した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Wayne Rasband,NIH、米国）を使用して複数の切片（ＷＴ及びｃΔＭＣＯＲについてそれぞれｎ＝３５及び３８）でカウントしたグリア細胞の核を標識するために、ヘマトキシリン－エオジンを使用して切片を染色した。切片あたりの核の平均を、両側性ヘテロダスティックスチューデント検定を用いて比較した。

ＥＬＩＳＡ房水中のＴＧＦβ２濃度の投薬量
成体マウスを供死して房水（ＡＨ）収集を可能にした（５μl）。一人のＭＣＯＲ個体及び１１人の対照において、老人性白内障手術の過程でヒトＡＨ（約１００μl）を回収した。Ｍｏｕｓｅ ＴＧＦβ２ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（R&D Systems）及びｈｕｍａｎ ＴＧＦβ２ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（カタログＮｏ ＤＢ２５０ R&D Systems）を利用して、マウス及びヒトＡＨにおける総ＴＧＦβ２レベルを定量した（それぞれ最終１００μl中１０μl及び３０μl）。サンプルを酸活性化（１Ｎ ＨＣｌ）及び中和（１．２Ｎ ＮａＯＨ／０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ）に供した後、製造業者（R&D Systems）によって推奨されるように、４５０nmの波長で５７０nmの波長補正を伴うマイクロプレートリーダーを使用して総ＴＧＦβ２濃度を定量した（du lecteur de plaque参照）。対応のない両側スチューデントのｔ検定を使用して、２群間の統計的有意性を分析した。ｐ≦０．０５を統計的に有意であると見なした。

結果
染色体１３ｑ３２への疾患遺伝子座の一次マッピングは、１９９０年代末（Rouillac et al.,1998）にパリのネッカー病院で、１９６０年代に確認された５世代Ｂｒｅｔｏｎファミリーの全ゲノム連鎖解析によって達成された。他のＭＣＯＲファミリーにおける遺伝子分析は、１つのＭＣＯＲ遺伝子座のみが存在することを示唆している（Fares-Taie et al.,2015；Pozza et al.,2020；Ramprasad et al.,2005；Sergouniotis et al.,2017）。一貫して、多世代のＢｒｅｔｏｎ系統及び本発明者らに委ねられた５つの他の系統、１つのフランス人、２つのメキシコ人及び２つの日本人の系統を研究することにより、本発明者らは、すべての場合を、顕微鏡下で重複する１３ｑ３２．１欠失に帰することができた（Fares-Taie et al.,2015）。メキシコ人の家族は同じ欠失を共有しており、創始者効果を示唆している。他のすべてのファミリーは、特有の異常を示した。欠失はサイズが可変（３５～８５kb）であったが、ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ遺伝子、ＴＧＤＳ及びＧＰＲ１８０を常に包含又は中断していた。ＴＤＰ－グルコース４、６－デヒドラターゼをコードするＴＧＤＳの劣性変異は、ｏｒｏ－ｆａｃｉｏ－ｄｉｇｉｔａｌ奇形を引き起こす（Ｃａｔｅｌ－Ｍａｎｚｋｅ症候群、ＣＭＳ；ＭＩＭ６１６１４５）。本発明者らの病院からのＴＧＤＳ関連ＣＭＳに罹患した個体の眼科検査により、虹彩異常がないことが明らかになり、ＭＣＯＲにおけるこの遺伝子の役割の欠如が示唆された。未知の機能のＧタンパク質共役受容体１８０をコードするＧＰＲ１８０は、平滑筋細胞増殖の調節に関与している（Iida et al.,2003）。しかしながら、ノックアウトマウス及びヘテロ接合ＧＰＲ１８０ナンセンス変異を有する２世代ファミリーからの個体を研究すると、本発明者らは虹彩散大筋異常を観察しなかった（Fares-Taie et al.,2015）。１６歳から６２歳までのＧＲＰ１８０機能喪失変異を有する家族は、正常なＩＯＰを有するいくつかの軽度の虹彩－角膜角異常（虹彩針様体）を示した（Fares-Taie et al.,2015）。別の６９Kb重複欠失が、少なくとも３人の４０歳を超える年齢で虹彩角膜角異常を有する５人の罹患個体を含む英国の三世代家族において報告されており、そのうちの２人（母親及び息子）は若年性ＧＬＣを有していた（Sergouniotis et al.,2017）。最近、正常な前房隅角を有するモザイクの母及びその娘において、ＴＧＤＳ及びＧＰＲ１８０を含む１１個の遺伝子を包含する相互の２８９kb重複が同定された（Pozza et al.,2020）。まとめると、これらの観察結果は、ＧＰＲ１８０の喪失が角度異常に寄与し得るが、１３ｑ３２．１調節ランドスケープの変化に起因する可能性が高い疾患を説明するには不十分であることを示唆している。

ＨｉＣ配列決定データは、ＭＣＯＲ遺伝子座が、ユーメラニンの生合成経路においてチロシナーゼの下流で作用するドーパクロム互変異性体をコードするＤｃｔから、小胞体内の折り畳まれていない糖タンパク質を選択的に再グルコシル化するＵＤＰ－グルコース糖タンパク質グルコシルトランスフェラーゼ２をコードするＵｇｇｔ２までの領域を含む１Mbトポロジー的会合ドメイン（ＴＡＤ）に含まれることを示唆している（Bonev et al.,2017）。この領域及びその３Ｄ構造は、染色体１４ｑＥ４上のマウスシンテン領域において高度に保存されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９方法論を使用して、本発明者らは、その調節構造を特徴付け、虹彩発達、ＯＡＧ及び高度近視に対するその関係を理解するために、重要なＭＣＯＲ欠失（ｃΔ；３５Kb）又は重要な領域内又は重要な領域外のより小さな欠失を有するトランスジェニックマウスを作製した（データは示さず）。

得られた表現型を研究して、本発明者らは、ホモ接合性におけるＴｇｄｓの喪失が、神経堤遊走及び分化異常（少なくとも部分的に）に起因するＥ９．５での胚死亡を引き起こしたことを観察した。対照的に、ヘテロ接合性における重大な欠失を有するマウス（ｃΔＭＣＯＲマウス）は生存可能であり、ＷＴ型同腹子と比較して、ベースライン瞳孔サイズの中程度の減少を伴って存在する（ｐ＜０．０１）（図１Ａ）。新生ｃΔＭＣＯＲ及びＷＴ虹彩から生成されたＲＮＡｓｅｑデータセットからＴＡＤ（図１Ｂ）内のｃΔに隣接する遺伝子の発現レベルを分析すると、本発明者らはＳＯＸ２１の異所性発現を観察した。ｃΔに隣接する他の遺伝子のいずれも調節解除されなかった（図１Ｂ）。ＳＯＸ２１ ｍＲＮＡ（ＲＴｑＰＣＲ）及びその産物（ウエスタンブロット）が、Ｅ１６から成体期まで（図１及び図示されていないデータ）ｃΔＭＣＯＲマウスの虹彩で検出されたが（図示せず）、ＷＴでは検出できなかった。

ＳＯＸ２１は、ＳＲＹ関連ＨＭＧ－ｂｏｘ（ＳＯＸ）ファミリーの転写因子をコードし、これは、眼における既知の機能のみが、ヒヨコ及びゼブラフィッシュにおける研究からもたらされる（Lan et al.,2011；Uchikawa et al.,1999）。ヒヨコにおいて、ＳＯＸ２１は、水晶体及び網膜における眼胞の形態形成及び仕様の初期段階の間に一過性に活性化されるが、その後はもはや発現されない（Uchikawa et al.,1999）。ＳＯＸ２１の眼発現は、虹彩が発達し始める前に停止する。ゼブラフィッシュにおけるように、ヒヨコにおけるその機能喪失は、正常な水晶体発達を妨げる（Pauls et al.,2012）。

ＣＴＣＦとしても公知のＣＣＣＴＣ含有タンパク質は、クロマチンに結合し、結合部位間のループ形成を介してその３Ｄ構成を媒介する高度に保存されたジンクフィンガータンパク質である。それは、転写活性化因子、リプレッサー又はインシュレータタンパク質として機能し、エンハンサーとプロモーターとの間の通信を遮断することができる（Holwerda&de Laat,2013）。本発明者らは、３５Kbの重要なＭＣＯＲ領域内に４つのＣＴＣＦ結合部位を同定した（データは示さず）。それらのうちの１つ又はいくつかの喪失が、近傍の活性なエンハンサーのＳＯＸ２１のプロモーターによる採用を促進し得るかどうかを評価するために、本発明者らは、マウスにおいてそれらを個別に又は組み合わせてアブレーションした（データは示さず）。ＲＴｑＰＣＲによって判定したところ、得られたマウス系統のいずれの虹彩もＳＯＸ２１発現を示さなかった（データは示さず）。この観察は、ｃΔＭＣＯＲマウスの虹彩におけるＳＯＸ２１の異所性発現が絶縁体の喪失によるものではないという見解を裏付けている。更に、本発明者らは、ｃΔＭＣＯＲがＳＯＸ２１と活性エンハンサーとの間のクロマチン相互作用にどのように影響するかを調査し、新しい相互作用を探索するために、ＳＯＸ２１プロモーターを取り囲む２kbの観点から４Ｃシーケンシング（４Ｃｓｅｑ）を行った。ＷＴ及びｃΔＭＣＯＲの全胚及び胚性線維芽細胞（Ｅ９．５）から単離された核の４Ｃｓｅｑは、遺伝子座で報告された１MbのＴＡＤのクロマチン構造と一致していた（Bonev et al.,2017）。興味深いことに、４Ｃ－ｓｅｑにより、ＳＯＸ２１を包含するＤＮＡ領域（２kb）が、ＳＯＸ２１を発現しないｃΔＭＣＯＲ対応物及びＷＴ対応物の両方においてＴＡＤ全体にわたって相互作用することが明らかにされ（データは示されず）、このことから、虹彩特異的相互作用又は近傍のエンハンサーに対するＳＯＸ２１プロモーター能力の欠失による改変のいずれかが示唆される。新生仔ＷＴマウスの虹彩における転写的に活性なクロマチン部位（Raisner et al.,2018）を示すＨ３ｋ２７ａｃマークのＣＨＩＰＳｅｑを使用して、本発明者らは、欠失の上流の２つの高活性エンハンサー、色素性虹彩細胞において高度に発現されるＤｃｔ付近（データは示さず）を同定した（データは示さず）。ＳＯＸ２１プロモーターは、欠失又は重複によってＴＡＤ内のゲノム距離を減少させることによって、１つ又は２つのエンハンサーを採用する可能性が高い。

ｃΔＭＣＯＲにおける免疫組織化学（ＩＨＣ）分析は、強い虹彩色素沈着によって妨げられる。色素脱離プロトコルは、虹彩組織の完全性の維持を可能にしなかった。したがって、本発明者らは、チロシナーゼ（ｔｙｒ）陰性アルビノバックグラウンド上の系統を導出した。ＲＴｑＰＣＲ分析により、２月齢ｃ．ΔＭＣＯＲマウスの虹彩におけるＳＯＸ２１異所性発現が確認された（データは示さず）。ＩＨＣは、ＤＣＴに特異的な抗体を使用して染色した虹彩ＰＥＬ及びＣＢにおいてＳＯＸ２１発現を示した（ＤｃｔはｃΔＭＣＯＲ及びＷＴの両方において内因的に高度に発現される）（データは示さず）。ＳＯＸ２１は、散大筋を形成する虹彩ＡＥＬでは検出できなかった。これは、虹彩のＰＥＬ及びＣＢにおける異常な遺伝子発現の虹彩のＡＥＬに対する遠隔効果を示唆し得る。しかしながら、瞳孔測定分析はｃΔＭＣＯＲマウスの瞳孔サイズの減少を示したが、予備的なＩＨＣ分析は、ＷＴと比較して目に見える差がないｃΔＭＣＯＲ虹彩の散大筋領域にＳＭＡ陽性線維が存在するため、散大筋異常の実体を許容しなかった（図示せず）。モデルにおいて瞳孔サイズが中程度にしか減少しないことを考慮すると、ＳＭＡ陽性繊維の存在は予想外ではない。

新しく生まれたｃΔＭＣＯＲ及びＷＴからの虹彩のＲＮＡｓｅｑからのデータを分析して、本発明者らは、ｃΔＭＣＯＲモデルにおいて２５００個の調節解除された遺伝子（≧１．５倍、ｐ＜０．０５）を同定した。それらの多くは、ＭＣＯＲ疾患の症状及び／又は虹彩の発達に関連しており、例えば、ＭＣＯＲに罹患した患者の虹彩のＡＥＬを欠くデスミン中間径フィラメントをコードするＤｅｓ（０．４９、ｐ＝０．０１２）、虹彩前駆細胞を非ニューロン（筋上皮）運命に特定するために極めて重要なＷｔｎ２ｂ（２．３５ ｐ＜０．０１）、虹彩平滑筋生成部位の細胞によって高度に発現されるＢｍｐ７（１．４７ ｐ＜０．０５）、並びにＧＬＣ（Checa-Casalengua et al.,2011；Kasetti et al.,2017；Prendes et al.,2013）及び近視性の高い（Jia et al.,2017）に関与する２つの密接に関連する成長因子をコードするＴｇｆβ２及びＧｄｎｆ（それぞれ１．６及び１．７、ｐ＜０．０１）である。興味深いことに、高度に特異的なＳＯＸ２１抗体（Matsuda et al.,2012）を使用した新生ｃΔＭＣＯＲマウスの虹彩のＣＨＩＰｓｅｑ分析は、ゲノム全体の２６個のＤＮＡ領域上のＳＯＸ２１の結合を示した。ｃΔＭＣＯＲ及びＷＴ虹彩からのＲＮＡｓｅｑデータセットに戻ると、本発明者らは、ｃΔＭＣＯＲ：Ｔｇｆβ２及びＧｄｎｆにおいて脱調節された（ｐ＜０．０５で≧１．５倍）遺伝子に２／２６の結合領域が含まれることを観察した。他の２４個のＤＮＡ領域は、ｃΔＭＣＯＲ虹彩において調節解除されなかった遺伝子（１１／２４）、又はｃΔＭＣＯＲ及びの虹彩において発現されなかった遺伝子（１３／２４）にある。ＷＴ動物。ＳＯＸ２１のＴｇｆβ２への結合は明確であり（ｐ＜０．００５）、ＣＨＩＰｓｅｑ（ｃｈｒ１：１８６，６９８，３０４～１８６，６９８，５５５；ＧＲＣｍ３８／mm１０アセンブリ；５．９kb長のイントロン１のコンセンサスドナースプライス部位の下流１６kb）によって同定される２５２bpイントロン領域におけるコンセンサスＳＯＸ２１結合配列を検索するＪＡＳＰＡＲ分析によって強く支持された（図２Ａ）。この配列は、多くの潜在的な転写因子結合部位を含むヒトＴＧＦβ２イントロン１オーソロガス領域（ＧＲＣｈ３７；ｃｈｒ１：２１８５１７８６５－２１８５２７７４０）（図２Ｂ）に保存されている。

多くの研究が、培養された緑内障細胞株及び単離されたヒト緑内障ＴＭ組織におけるＰＯＡＧ（Agarwal et al.,2015；Wordinger et al.,2014）を有する個体の房水中のＴＧＦβ２のレベルの有意な上昇を報告している（Wordinger et al.,2014）。緑内障眼におけるＴＧＦβ２蓄積の原因及び細胞源は解明されていないが、ＴＭ細胞が活性ＴＧＦβ受容体複合体を発現し、細胞外マトリックスタンパク質合成を増加させる外因性ＴＧＦβ２に応答することは明らかである。ＴＭにおける過度のＥＣＭ合成は、房水流出に対する抵抗性を増大させ、ＩＯＰ上昇をもたらす（Prendes et al.,2013）。ヒト及びマウスでは、高ＩＯＰは、視神経乳頭の慢性及び進行性の変形をもたらす事象のカスケードを開始し、これは、視神経円板の掘削又はカッピングとして観察されるシナリオである（Quigley,2011；Zeimer et al.,1998）。ＯＮ頭部の変形は、ＯＮ軸索の慢性変性を引き起こすか又はそれに寄与し、最終的に網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のアポトーシス死をもたらす（Munemasa&Kitaoka,2013）。（ｉ）ＳＯＸ２１が、房水が産生されるＣＢにおいて異所的に発現され、（ｉｉ）ＳＯＸ２１が、Ｔｇｆβ２遺伝子の調節領域において結合し、（ｉｉｉ）Ｔｇｆβ２発現が、ＭＣＯＲマウスモデルの虹彩においてアップレギュレートされることを考慮して、本発明者らは、ｃΔＭＣＯＲマウスの房水におけるＴＧＦβ２蓄積を探すことを検討した。本発明者らは、ＷＴ対応物と比較して、重篤なＭＣＯＲ欠失を有するマウスの房水におけるＴＧＦβ２濃度の有意な増加を示すことによって蓄積を確認した（１．８倍変化、ｐ＜０．０１；図３Ａ）。ｃΔＭＣＯＲマウスのＴＭにおけるＴＧＦβ２媒介性ＩＯＰ増加及びＥＣＭ蓄積は分析されていない。しかし、１歳の動物の視神経乳頭の予備検査はＲＧＣ軸索の喪失を示唆しており、これは房水におけるＴＧＦβ２の濃度上昇から予想される（図３Ｃ）。同様に、本発明者らは、老人性白内障手術の過程で、Brettonファミリーの１人の非緑内障性成人ＭＣＯＲ個体の房水を採取する稀な機会を得た。ＴＧＦβ２濃度の投与量は、１１の対照と比較して有意な上昇を明らかにした（老人性白内障手術の過程で、すべての房水を同日に収集した）（図３Ｂ）。

要約すると、先天小瞳孔のマウスモデルを研究することによって、本発明者らは、この極めて稀で純粋に眼の疾患が、遺伝子発現の３Ｄ調節に関連する予想外の複雑な機構に起因することを示唆する。本発明者らは、疾患が、１又は複数のＤＣＴエンハンサーの採用によって誘導される転写因子ＳＯＸ２１の不正な発現に起因することを提案する。本発明者らは、ＳＯＸ２１がＴｇｆβ２遺伝子の調節領域に結合することを示し、本発明者らは、ＰＯＡＧ患者及び本発明者らのＭＣＯＲ患者の１人において観察された蓄積を再現する最小のＭＣＯＲ欠失を有するマウスの虹彩におけるこの栄養因子の過剰発現及び房水におけるその産物の蓄積を実証する。房水中のＴＧＦβ２蓄積と開放隅角ＧＬＣとの間の関連を実証した研究と一致して、本発明者らの予備的結果は、ＰＯＡＧを含むＧＬＣの特徴である視神経分解を示す。総合すると、これらの観察結果は、ＭＣＯＲにおけるＧＬＣが虹彩角膜異常の結果ではなく、むしろＰＯＡＧのようにＴＧＦβ２過剰発現の直接的な結果であると思われるという見解を更に支持する。更に、ＴＧＦβ２が眼球の軸方向伸長における重要な因子として作用し得ることを知ると（Jia et al.,2017）、その過剰発現はまた、ＭＣＯＲにおける高い近視の原因となり得る。最後に、ＳＯＸ２１は、散大筋（dilator）を生じさせる虹彩前色素上皮において発現されないので、本発明者らは、ＴＧＦβ２の過剰発現がパラクリンシグナル伝達による散大筋の発達を損なうことを提案し、これは、ＭＣＯＲに罹患したヒト個体において報告された組織病理学的虹彩散大筋提示の高い変動性の観察と一致する。したがって、本発明者らは、ＴＧＦβ２の過剰発現が先天小瞳孔における虹彩奇形、近視及びＧＬＣと関連し、ＭＣＯＲを眼の発達及び一般的なＰＯＡＧの機構を分析するための非常に価値のあるモデルにすることを提案する。更に、本発明者らの予備データは、ＭＣＯＲ及びＰＯＡＧの両方におけるＧＬＣの潜在的な処置標的としてＳＯＸ２１を含むＴＧＦβ２調節の新規経路を開示する。

実施例２：重要なＭＣＯＲを引き起こす欠失は、虹彩のヒト後上皮細胞におけるＳＯＸ２１発現を誘導する。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＲＮＡガイドは、ヒト５’ｇａｇｇａｔａｔａｃｔａａｃａａａｇａｇ ３’における３５KB重篤ＭＣＯＲ誘発性欠失の５’及び３’境界に特異的である（配列番号４９）；５’ｇｇｇａｇｃｔｇｇｇｃａｇｇｔａａｇａａ ３’（配列番号５０）を設計し、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰ及びｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドにそれぞれクローニングした。

ＳＶ４０不死化ヒト虹彩色素上皮細胞（ＨＩＰＥｐｉＣ）をｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰ及びＲＮＡガイドをコードする－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドでコトランスフェクトし、二重ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をフローサイトメトリーによって選別し、培養ウェル室カバーガラスに播種し、タンパク質発現を可能にするためにＥＰｉＣＭ培養培地（P60106,Innoprot；SV40-HIPEpiC）で４８時間維持した。編集されていないＳＶ４０－ＨＩＰＥｐｉＣ及びＧＦＰ／ｍｃｈｅｒｒｙ陽性ＳＶ４０－ＨＩＰＥｐｉＣを、それぞれヒトＳＯＸ２１及びＤＣＴタンパク質（ＣＬ４６８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びａｂ７４０７３、Abcam）に特異的な抗体を使用する免疫細胞化学によって分析した。未編集及びＧＦＰ／ｍｃｈｅｒｒｙ陽性ＳＶ４０－ＨＩＰＥｐｉＣ細胞の両方で陽性ＤＣＴ染色が観察された。対照的に、編集されていないＳＶ４０－ＨＩＰＥｐｉＣ細胞はいずれもＳＯＸ２１を発現しなかったが、本発明者らは、共トランスフェクト細胞の２％において陽性核染色を観察した（図４）。

テロメラーゼ不死化網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ１）並びに眼脈絡膜黒色腫、ブドウ膜黒色腫及び神経膠腫に由来するヒトｏｃｍ－１、ｍｐ４１及びＵ２５１細胞を編集し、同じストラテジーを使用して二重ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をフロー選別した。ユニークな二重ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ陽性ＲＰＥ１、ｏｃｍ－１、ｍｐ４１及びＵ２５１細胞を播種してクローン集団を得た。それぞれ、ゲノムＤＮＡのサンガーシーケンシング及びｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲによって、重要な欠失並びにＳＯＸ２１及びＤＣＴ発現の存在についてクローンを分析した。編集されていない神経膠腫細胞及び編集された神経膠腫細胞の両方が、ＤＣＴ及びＳＯＸ２１を発現した（陽性対照；図５）。対照的に、編集されていないＲＰＥ１、ｏｃｍ－１、ｍｐ４１の行は、ＤＣＴを発現したが、ＳＯＸ２１を発現しなかった。

まとめると、これらのデータは、重大なＭＣＯＲ欠失が、ヒト及びマウスの両方において虹彩の後上皮におけるＳＯＸ２１の異所性発現を引き起こすことを強く裏付けている。

参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術水準を記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に援用される。

Claims (13)

1. それを必要とする対象において眼疾患を処置するための方法であって、処置量のＳＯＸ２１遺伝子発現及び／又は活性のインヒビターを該対象に投与する工程を含む、方法。
2. 眼疾患が、ＴＧＦβ２発現及び／又は活性の増加に関連する、請求項１に記載の方法。
3. 眼疾患が、先天小瞳孔（ＭＣＯＲ）、緑内障、開放隅角緑内障（ＡＯＧ、ＰＯＡＧ）又は近視からなるがこれらに限定されない群において選択される、請求項１～２に記載の方法。
4. ＳＯＸ２１遺伝子発現のインヒビターが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、転写因子デコイ又はリボザイムである、請求項１～３に記載の方法。
5. ＳＯＸ２１活性のインヒビターが、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、有機小分子、抗体又はアプタマーである、請求項１～３に記載の方法。
6. ＳＯＸ２１遺伝子発現のインヒビターが、単独で、又はウイルスベクターとともに、送達される、請求項１～５に記載の方法。
7. ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項６に記載の方法。
8. ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９である、請求項７に記載の方法。
9. ネイキッドな又はウイルスベクターを有するＳＯＸ２１遺伝子発現及び／又は活性のインヒビターが、硝子体内、皮下、静脈内、点眼又は眼軟膏送達によって送達される、請求項１～８に記載の方法。
10. ネイキッドな又はウイルスベクターを有するＳＯＸ２１遺伝子発現及び／又は活性のインヒビターが、硝子体、房水、虹彩、１若しくは複数の毛様体組織、又は細胞、及び／又は眼外筋、網膜（例えば、網膜剥離後）に、又は更には上脈絡膜腔内に、直接注入される、請求項１～９に記載の方法。
11. ＳＯＸ２１発現及び／又は活性のインヒビターを単独で又はウイルスベクターとともに含む、医薬組成物。
12. 眼疾患の処置に使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 眼疾患が、先天小瞳孔（ＭＣＯＲ）、緑内障、開放隅角緑内障（ＡＯＧ、ＰＯＡＧ）又は近視からなるがこれらに限定されない群において選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。

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