KR20190008229A - 강력하고 균형 잡힌 양방향성 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터 및 하나의 방향으로 제1 트랜스진에, 그리고 반대 방향으로 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 바이러스를 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 재조합 벡터 및 재조합 바이러스의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

Description

강력하고 균형 잡힌 양방향성 프로모터

본 발명은 의학 분야, 및 백신 접종 및 유전자 요법에서의 응용을 위한 유전자 전달 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 재조합 벡터, 예컨대 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 및 재조합 바이러스를 이용한 2가지 트랜스진의 발현을 위한 강력하고 균형 잡힌 양방향성 프로모터에 관한 것이다.

재조합 벡터는 예를 들어, 유전자 요법 및 백신 접종에서의 그의 응용을 비롯하여 이종 단백질의 발현을 위한 다양한 분자 생물학 응용에서 널리 사용된다. 이러한 유전자 요법 및 백신 접종 응용에 있어서, 바이러스 벡터를 포함하는 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 관심의 대상이 되는 유전자(들)를 위한 캐리어로 사용된다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 원하는 항원을 코딩하는 유전자 또는 이의 일부를 발현시켜 면역 반응을 야기하는 데 사용될 수 있다.

초기의 바이러스 벡터는 전형적으로 하나의 트랜스진을 포함할 뿐이었으며, 초기 세대 벡터에 대하여 많은 계획이 공개되어 있다. 예를 들어, 공개된 계획은 다양한 상이한 아데노바이러스(rAd) 벡터의 사용을 보고하고 있으며, 트랜스진 발현 카세트가 rAd의 상이한 영역들 내에, 예를 들어 E1 영역, E3 영역 내에, 또는 E4와 우측 ITR 사이에 위치될 수 있음을 보여준다. 그러나, 백신 목적을 위하여, 종종 하나 초과의 항원 또는 몇몇 상이한 주로부터 유래된 동일 항원이 보호 및 넓은 커버리지(coverage)의 달성에 요구된다. 따라서, 특정한 경우에, 적어도 2가지의 항원을 하나의 벡터로부터 발현시키는 것이 바람직하다. 하나의 바이러스 벡터에서의 2가지 항원의 코딩을 위한 상이한 접근법들이 개시되었다.

rAd를 이용한 처음의 2가지 항원 접근법에서, 하나의 항원 발현 카세트는 E1 영역 내에 위치되고, 두 번째의 것은 E3 영역 내에 위치되었다(예를 들어 (Vogels et al., 2007)). rAd를 이용한 상이한 2가지 항원 접근법에서, 하나의 항원 발현 카세트는 E1 영역 내에 위치되고, 두 번째의 것은 E4와 우측 ITR 사이에 위치되었다(예를 들어 (Holman et al., 2007; Pham et al., 2009; Schepp-Berglind et al., 2007)). rAd를 이용한 또 다른 2가지 항원 접근법은 재조합에 의한 유전자 불안정성을 방지하기 위하여 2개의 상이한 프로모터 서열을 이용하여 헤드-투-테일(head-to-tail) 방식으로 E1 영역 내에 위치된 2개의 항원 발현 카세트를 사용하는 것이다(예를 들어 (Belousova et al., 2006; C. D. Harro et al., 2009)).

2가지 항원 접근법의 또 다른 예로는 2가지 단백질로 번역되는 단일 전사체를 생성하도록 예를 들어 뇌심근염 바이러스(EMCV)로부터 유래된 포지티브-가닥(positive-stranded) RNA 바이러스의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하는 것이 있다(예를 들어 (Amendola, Venneri, Biffi, Vigna, & Naldini, 2005; Na & Fan, 2010)). 다른 예는 숙주 세포 스플라이싱 기구의 이용, 또는 포지티브-가닥 RNA 바이러스로부터 유래된 "절단" 펩티드, 예컨대 구제역 2A 서열 또는 두 단백질로 절단되는 폴리단백질을 생성하는 다른 바이러스 유래의 등가물의 사용을 포함한다. 공개된 보고서에 따르면, 이러한 계획 전부가 동일하게 유용하고 성공적일 수 있다.

대안적으로, 양방향성 프로모터의 사용이 바이러스 벡터를 이용한 2가지 항원 발현에 대한 또 다른 접근법이다. 예를 들어, 상이한 양방향성 프로모터들이 렌티바이러스 벡터 (Heilbronn & Weger, 2010) 및 아데노바이러스 벡터 (Na & Fan, 2010; Post & Van Meir, 2001; Robbins & Ghivizzani, 1998; Walther & Stein, 2000)용으로 기술되었다.

일반적으로, 2가지 상이한 유형의 양방향성 프로모터, 즉 양방향 특성을 갖는 천연 발생 서열 및 합성 설계 양방향성 프로모터가 사용용으로 공지되어 있다. 양방향 특성을 갖는 천연 발생 서열이 바이러스, 식물 또는 포유류 게놈에서 발견될 수 있다(Andrianaki, Siapati, Hirata, Russell, & Vassilopoulos, 2010; Barski, Siller-Lopez, Bohren, Gabbay, & Aguilar-Cordova, 2004). 예를 들어, 인간 게놈 내의 많은 프로모터가 약간의 양방향 특성을 갖는 것으로 보고되었다. 양방향 특성을 갖는 인간 프로모터는 GABP 부위의 과다표현이 특징이다(Collins, Kobayashi, Nguyen, Trinklein, & Myers, 2007).

천연 발생 서열과는 대조적으로, 합성 양방향성 프로모터는 상이한 단일방향성 프로모터들의 바람직한 특성들을 이용하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, Amendola 등은 인간 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 최소 프로모터(minCMV)를 인간 포스포글리세레이트 키나아제 프로모터(PGK) 또는 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBI C)와 조합함으로써 렌티바이러스 벡터에서 사용하기 위한 2가지 상이한 합성 양방향성 프로모터를 생성하였다(Amendola et al., 2005). 양방향성 프로모터를 구축하기 위하여, 단일방향성 프로모터는 하나의 인핸서만을 이용하여 반대되는 배향(헤드 투 헤드)으로 구성되었다. Amendola 등에 따르면, 강한 최소 프로모터가 이러한 구성으로 포유류 전체 프로모터와 조합되었을 때 그 결과는 양측으로부터의 동조적 발현이었다. 그러나, 발현 능력(potency) 및 균형의 분석은 공지된 강한 단일방향성 프로모터, 예컨대 전체 인핸서-함유 인간 CMV 프로모터와의 철저한 비교를 포함하지 않았다. 실제로, 하나의 벡터 내에 2가지의 항원을 코딩하는 다가 바이러스 벡터를 사용한 대부분의 공개된 계획에 있어서, 1가 벡터의 중대한 특징이 충실히 유지됨을 보장하기 위한 체계적인 분석은 없었다. 새롭게 생성된 다가 벡터의 중요한 특징은 예를 들어 규모 확대 동안의 유전자 안정성, 대규모에서의 벡터의 생산성, 항원들 둘 다의 강력한 발현, 항원들 둘 다의 균형 잡힌 발현, 및 삽입된 발현 카세트로부터 발현된 항원들 둘 다의 면역원성을 포함한다.

이전에 개시된 방법과 비교하여 특히 양호한 결과를 생성한 최근에 개시된 계획에서는 2가지 트랜스진의 발현을 위하여 양방향성 마우스 사이토메갈로바이러스(mCMV) 프로모터가 사용되었다(국제 공개 제2016/166088 A1호). 제1 트랜스진이 하나의 방향으로 양방향성 mCMV 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 제2 트랜스진이 다른 하나의 방향으로 양방향성 mCMV 프로모터에 작동가능하게 연결되었다. 양방향성 mCMV 프로모터를 갖는 rAd는 유전적으로 안정하여서, 단일 트랜스진만을 갖는 rAd에 비견되는 유전자 안정성을 제공하는 것으로 결정되었다. 더욱이, 트랜스진들 둘 다는, T-세포 및 B-세포 반응과 관련하여 발현 항원들의 면역원성의 ELISPOT 및 ELISA 분석을 기반으로 하면, 항원들 둘 다에 대하여 면역원성 반응을 생성하기에 충분히 발현된 것으로 결정되었다. 이와 같이 mCMV 양방향성 프로모터는 이전에 개시된 몇몇의 다른 계획보다 우수한 것으로 기술되었다. 그러나, mCMV 프로모터의 양쪽간의 발현 수준의 균형이 더 개선될 수 있는 것으로 결정되었다. 양방향성 mCMV 프로모터의 좌측(5'말단)에 위치된 항원과 비교하여 상기 프로모터의 우측(3'말단)에 위치된 항원의 발현이 대략 10배 더 높았다. 상기 두 코딩 항원의 발현의 불균형은 더 낮게 발현된 항원과 비교하여 더 높게 발현된 항원에 대하여 유도된 면역 반응이 더 강하게 한다. 이러한 종류의 차등 발현은 특정한 응용에는 유용할 수 있었지만, 다른 응용에는 더 균형 잡힌 발현을 갖는 mCMV 프로모터의 몇몇 장점들이 조합된 계획, 즉, 강력하면서도 상기 양방향성 mCMV 프로모터 및 문헌에 기술된 다른 양방향성 프로모터보다 더 균형 잡힌 양방향성 프로모터를 갖는 것이 또한 바람직하다.

따라서, 강력하면서도 상기 mCMV 양방향성 프로모터와 비교하여 양측으로부터의 발현에서의 균형이 개선된 양방향성 프로모터를 확인하고, 2가지 트랜스진의 발현이 강력하고 균형 잡힌, 유전적으로 안정한 재조합 바이러스를 제공할 필요성이 여전히 남아 있다.

본 발명은 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터 및 벡터(예를 들어, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터를 포함함)를 포함하는 재조합 핵산 분자, 및 이 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 바이러스를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터는 2가지 트랜스진을 포함하며, 여기서, hCMV-CAG4 양방향성 프로모터의 hCMV 부분 및 CAG 부분의 전사 방향(5'에서 3'으로)은 서로를 가리키고(헤드 투 헤드 구성), 제1 트랜스진은 하나의 방향으로 좌측에 작동가능하게 연결되어 있으며(이때 발현은 양방향성 프로모터의 hCMV 부분에 의해 제어됨), 제2 트랜스진은 반대 방향으로 우측에 작동가능하게 연결된다(이때 발현은 양방향성 프로모터의 CAG 부분에 의해 제어됨). hCMV 인핸서는 hCMV 프로모터 부분 쪽으로 가리키고 있는 상기 두 상이한 프로모터들 사이의 중간에 위치된다. 인핸서들은 배향-독립적일 수 있기 때문에, 인핸서는 양방향성 프로모터의 hCMV 부분 및 CAG 부분에 작동가능하게 연결된 트랜스진들 둘 다의 동조적 발현을 제공한다. 예를 들어, 도 1d는 대표적인 hCMV-CAG4 프로모터의 상이한 빌딩 블록들의 아이덴티티(identity) 및 배향을 도시함을 참조한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 hCMV-CAG4 프로모터는 서열 번호 4의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 최대 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

특정 실시 형태에서, 재조합 바이러스 및 재조합 바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스(rAd) 및 rAd 벡터이다. 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 생성된 rAd는 유전적으로 안정하며(이때 PCR 분석에 의하면 계대 13(p13)까지 결실 밴드가 검출되지 않음), 그에 따라 단일 트랜스진만을 갖는 바이러스에 비견되는 유전자 안정성을 제공하게 된다. 더욱이, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 단일방향성 프로모터로부터의 발현에 비견되는 2가지 트랜스진의 강력하고 균형 잡힌 발현을 제공한다. 따라서, 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 균형 잡히고 강력한 발현이 중요한 재조합 (바이러스) 벡터를 이용한 유전자 요법 및 백신 응용에서 사용하기에 적합하다.

일반적인 실시 형태 및 바람직한 실시 형태는 각각 본원에 첨부된 독립항 및 종속항에 의해 정의되는데, 이는 간결성을 위해 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 양태의 다른 바람직한 실시 형태, 특징, 및 장점은 첨부된 도면과 함께 취해지는 하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]으로부터 명백해질 것이다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 좌측에 hCMV 프로모터를 포함하고 우측에 CAG 프로모터를 포함하는 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 제공하며, 여기서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 좌측에서 하나의 방향으로 제1 트랜스진에 작동가능하게 연결되어 있고 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 우측에서 다른 하나의 방향으로 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결되어 있다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 또한 제1 및 제2 트랜스진을 포함하는 재조합 바이러스의 생성 방법을 제공하며, 본 방법은 하나의 방향으로 제1 트랜스진에, 그리고 반대 방향으로 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 구축물을 제조하는 단계, 및 상기 구축물을 재조합 바이러스의 게놈 내로 포함시키는 단계를 포함한다.

특정 실시 형태에서, 재조합 바이러스는 재조합 아데노바이러스이다.

특정 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스는 E1 영역에서의 결실을 가지며, 특정 실시 형태에서 이 E1 영역 내에 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터 및 제1 및 제2 트랜스진을 포함한다. 대안적으로, 재조합 아데노바이러스의 다른 영역이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 양방향성 프로모터 발현 카세트는 또한 재조합 아데노바이러스의 E4-rITR 영역 내에 위치될 수 있다.

특정 실시 형태에서, 제1 및 제2 트랜스진은 상이하며, 이들 중 적어도 하나는 항원을 코딩한다. 특정 실시 형태에서, 이들 둘 다는 상이한 항원을 코딩한다.

특정 실시 형태에서, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 26 또는 인간 아데노바이러스 혈청형 35이다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 또한 세포에서의 적어도 2가지의 트랜스진의 발현 방법을 제공하며, 본 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 또한 적어도 2가지의 항원에 대한 면역 반응의 유도 방법을 제공하며, 본 방법은 대상체에게 본 발명에 따른 재조합 벡터를 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스의 게놈을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터, 예컨대 재조합 아데노바이러스, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 제약 조성물은 백신이다.

도 1: 상이한 양방향성 프로모터 서열들을 위한 빌딩 블록의 아이덴티티 및 배향에 대한 주석을 포함하는 hCMV-CAG4 프로모터 및 기타 양방향성 프로모터 구축물의 개략도. P: 프로모터, Enh: 인핸서, I: 인트론.
도 2: HEK293 세포에서의 일시적 형질감염에 의해 평가된 상이한 양방향성 프로모터 구축물들에 의한 루시퍼라아제 및 eGFP의 발현. 루시퍼라아제 발현은 상대적 광 단위(RLU)로 측정되며 eGFP 발현은 평균 형광 강도(MFI)로 측정된다(FACS에 의해). 상이한 프로모터 구축물들을 스크리닝하는 3가지 상이한 실험의 결과가 예시되어 있다. (도 1a) 상이한 양방향성 프로모터의 좌측으로부터의 루시퍼라아제 발현 및 우측으로부터의 eGFP 발현의 결과의 막대 그래프가 도시되어 있다. 각각의 막대 그래프 형태의 결과는 좌측에서 우측으로 순서대로 rat-CMV-bidir-2, rCMV- hEF1α I, rCMV- hEF1α II, 및 rhCMV-CAG1에 대하여 예시되어 있으며, 이는 단일방향성 hCMV 프로모터의 제어 하의 루시퍼라아제 또는 eGFP의 양성 대조구 및 비형질감염 세포의 음성 대조구와 비교된 것이다. (도 1b) 상이한 양방향성 프로모터의 좌측으로부터의 루시퍼라아제 발현 및 우측으로부터의 eGFP 발현의 결과의 막대 그래프가 도시되어 있다. 각각의 그래프 형태의 결과는 좌측에서 우측으로 순서대로 rCMV bidir 1.1, rCMV-CAG, 및 hCMV-CAG4에 대하여 예시되어 있으며, 이는 단일방향성 hCMV 프로모터의 제어 하의 루시퍼라아제 또는 eGFP의 양성 대조구 및 비형질감염 세포의 음성 대조구와 비교된 것이다. (도 1c) 상이한 양방향성 프로모터의 좌측으로부터의 루시퍼라아제 발현 및 우측으로부터의 eGFP 발현의 결과의 막대 그래프가 도시되어 있다. 각각의 그래프 형태의 결과는 좌측에서 우측으로 순서대로 hCMV-CAG4, rhCMV-CAG2, 및 rCMV bidir1에 대하여 예시되어 있으며, 이는 단일방향성 hCMV 프로모터의 제어 하의 루시퍼라아제 또는 eGFP의 양성 대조구 및 비형질감염 세포의 음성 대조구와 비교된 것이다.
도 3: (도 3a) 양방향성 프로모터 구축물의 양측에 트랜스진들을 삽입하는 데 사용되는 제한효소 부위의 아이덴티티 및 위치를 포함하는, pshuttle26에서의 양방향성 프로모터 hCMV-CAG4를 위한 양방향성 발현 카세트의 구조. P: 프로모터, Enh: 인핸서, I: 인트론, TG: 트랜스진, pA: SV40(우측) 또는 소 성장 호르몬(BGH)(좌측)으로부터 유래된 폴리아데닐화 신호. 플라스미드 벡터 pshuttle26에서 표시되어 있다. 상기 양방향성 발현 카세트 구조가 pAdapt35에서 사용되었다. (3b) 빌딩 블록의 뉴클레오티드 위치를 포함하는 hCMV-CAG4 양방향성 프로모터의 개략도. 화살표는 전사 방향을 나타낸다.
도 4: A549 세포에서의 감염(세포당 1000개의 VP)에 의한 Ad26 rAd 벡터(도 4a) 및 Ad35 rAd 벡터(도 4b)에서의 양방향성 프로모터 구축물들의 좌측 또는 우측에서의 루시퍼라아제 및 eGFP 트랜스진의 발현. 루시퍼라아제 발현은 상대적 광 단위(RLU)로 측정되며 eGFP 발현은 평균 형광 강도(MFI)로 측정된다(FACS에 의해). 상이한 hCMV-CAG4 양방향성 프로모터 구축물들의 결과는 단일방향성 hCMV 프로모터의 제어 하의 루시퍼라아제 또는 eGFP의 경우 100개의 VP/세포 및 1000개의 VP/세포의 양성 대조구, 및 공벡터로 감염된 세포와 비교된다. Ad26 rAd 벡터에 있어서, hCMV-CAG4가 부가적으로 양방향성 mCMV 프로모터와 비교된다.
도 5: 연속 증식, 이어서 E1 영역 내에 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 가지며 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 우측 또는 좌측에 eGFP 및 루시퍼라아제를 코딩하는 Ad26 벡터 게놈에서의 PCR에 의한 유전자 안정성 테스트. PER.C6 세포를 P5, P10, 및 P13으로 연속 증식시킨 후의 벡터당 5개의 플라크에 대한 PCR 생성물이 상부로부터 하부로의 패널에 예시되어 있다. 각각의 패널에서의 레인 1 내지 레인 5는 좌측에 루시퍼라아제, 및 우측에 eGFP를 갖는 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 나타낸다. 각각의 패널에서의 레인 6 내지 레인 10은 좌측에 eGFP, 및 우측에 루시퍼라아제를 갖는 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 나타낸다. 레인 11은 kB 마커를 나타낸다. 레인 12는 Ad26.Luc.hCMV-CAG4.eGFP에 대한 플라스미드 양성 대조구를 나타낸다. 레인 13은 rAd26.eGFP.hCMV-CAG4.Luc에 대한 플라스미드 양성 대조구를 나타낸다. 레인 14는 트랜스진을 포함하지 않는 발현 카세트의 PCR 생성물 크기의 플라스미드 대조구를 나타낸다. 레인 15는 물의 PCR의 음성 대조구를 나타낸다. 라벨링: P5, P10, P13: 바이러스 계대수, 예상된 PCR 생성물 외에 추가 밴드는 AG 프로모터 부분의 GC-풍부 프로모터 서열에 의해 야기된 불특정 PCR 생성물임, 주: 결실 밴드의 부재가 과다노광된 사진에서 확인되었다.

능력 및 균형에 대하여 새로운 양방향성 프로모터 구축물들을 비교한 실험 결과가 본원에서 개시된다. 그 결과는, 하나의 방향으로 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 트랜스진 및 다른 하나의 방향으로 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 트랜스진을 갖는 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 rAd26 및 rAd35를 이용한 바이러스 감염 및 HEK293에서의 pAdApt 플라스미드 벡터를 이용한 일시적 형질감염을 기반으로 하면, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터가 2가지 트랜스진의 강력하고 균형 잡힌 발현을 제공함을 보여준다. 더욱이, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 rAd는 유전적으로 안정하며(이때 PCR 분석에 의하면 계대 13(p13)까지 결실 밴드가 검출되지 않음), 그에 따라 단일 트랜스진만을 갖는 바이러스에 비견되는 유전자 안정성을 제공하게 된다. 따라서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 본 발명의 rAd는 균형 잡히고 강력한 발현이 우선인 유전자 요법 및 백신 응용에서 사용하기에 적합하다.

따라서 본 발명은 하나의 방향으로 제1 트랜스진에 작동가능하게 연결되고 반대 방향으로 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서, hCMV-CAG4 양방향성 프로모터의 hCMV 부분 및 CAG 부분의 전사 방향(5'에서 3'으로)은 서로를 가리키고, 좌측으로부터의 발현은 양방향성 프로모터의 hCMV 부분에 의해 제어되며 우측으로부터의 발현은 양방향성 프로모터의 CAG 부분에 의해 제어된다. 특정 실시 형태에서, 본 발명은 세포에서의 2가지 트랜스진의 발현을 위한 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 벡터, 바이러스 벡터, 및 바이러스의 사용에 관한 것이다.

특정 실시 형태에서, 본 발명은 숙주 세포가 이종 단백질을 생성하는 것을 가능하게 하는 데 사용하기 위한 플라스미드 벡터에 관한 것이다. 예를 들어, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 플라스미드 벡터는 헤테로머형 다중-서브유닛 단백질 복합체의 2가지 상이한 구성요소의 발현에 사용될 수 있다. 그러한 플라스미드 벡터는 예를 들어 다음을 포함하는 DNA 서열일 수 있다: (1) 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터; (2) 각각의 트랜스진을 위한 리보솜 결합 부위를 갖는 mRNA를 제공하는 서열; (3) 각각의 트랜스진의 코딩 서열, 즉, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 서열; (4) 번역 개시를 위한 각각의 트랜스진을 위한 코작 콘센서스(Kozak consensus) 서열; (5) 각각의 트랜스진의 전체 코드가 판독되었을 때 번역이 종결되게 하는 각각의 트랜스진을 위한 종결 서열; 및 (6) 벡터가 게놈 내로 직접적으로 삽입된 것이 아닐 경우, 일단 벡터가 세포 내에 있으면 전체 벡터가 복제되게 하는 복제 기점. 그 후, 예를 들어 형질감염 또는 전기천공에 의해 숙주 세포가 벡터를 포함하도록 유도하는 것, 및 숙주 세포의 기능의 일부로서 그 2가지 트랜스진이 발현되게 하는 것과 같은 방식으로 숙주 세포를 성장시키는 것이 남아 있다.

특정 실시 형태에서, 본 발명은 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 rAd 및 rAd 벡터, 및 상기 rAd 및 rAd 벡터의 제조 및 사용 방법에 관한 것이며, 여기서, rAd 및 rAd 벡터는 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터 및 2가지 트랜스진을 포함하고, 제1 트랜스진은 하나의 방향으로 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터에 작동가능하게 연결되며 제2 트랜스진은 다른 하나의 방향으로 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 rAd는 대량으로, 또는 배치(batch)로 생성된다. rAd의 '배치'는 단일 생성 용기 내에서 한 번의 생성 조업에서 생성된 조성물이거나, 대안적으로는, 단일 용기(예를 들어, 생물반응기, 백(bag), 플라스크, 병, 다회 투여 용량 바이알(multi-dose vial), 단회 투여 용량 바이알(single-dose vial), 주사기 등) 내에 존재하는 조성물 중 복수의 rAd 입자를 지칭할 수 있다. 본 발명에 따른 rAd의 배치 또는 본 발명에 따른 rAd를 포함하는 조성물은 바람직하게는 적어도 10⁷개의 rAd 입자를 포함하며, 특정한 실시 형태에서, (예를 들어 단일 생성 조업에서 대규모 생물반응기에서 생성된 바와 같이) 적어도 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷, 10¹⁸개의 또는 이보다 더 많은 rAd 입자, 최대 10²⁰개의 rAd 입자를 포함한다. 배치 또는 조성물은 rAd 외에 추가의 관련 성분들을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 재조합 아데노바이러스에 있어서의 '재조합'이라는 용어는 이것이 야생형 아데노바이러스와는 대조적으로 사람 손에 의해 변형되었음을, 예를 들어 이것이 이종 유전자, 유전자들, 또는 이들의 부분 및 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함함을 내포한다.

본원에서 서열들은 본 기술 분야의 관행인 바와 같이, 5'에서 3'의 방향으로 제공된다.

"아데노바이러스 캡시드 단백질"은 특정 아데노바이러스의 혈청형 및/또는 친화성(tropism)을 결정하는데 연루된 아데노바이러스의 캡시드 상의 단백질을 지칭한다. 아데노바이러스 캡시드 단백질들은 전형적으로 섬유, 펜톤(penton) 및/또는 헥손(hexon) 단백질들을 포함한다. 본 발명에 따른 특정 혈청형의 (또는 '이를 기반으로 하는') rAd는 전형적으로 그 특정한 혈청형의 섬유, 펜톤 및/또는 헥손 단백질들을 포함하고, 바람직하게는 그 특정한 혈청형의 섬유, 펜톤 및 헥손 단백질을 포함한다. 이 단백질들은 전형적으로 재조합 rAd의 게놈에 의해 코딩된다. 특정한 혈청형의 rAd는 다른 아데노바이러스 혈청형들로부터의 다른 단백질들을 선택적으로 포함하고/하거나 코딩할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, rAd는 야생형으로부터의 유도에 의해 적어도 서열 면에서 아데노바이러스를 '기반으로 한다'. 이는 시작 물질로서 야생형 게놈 또는 그의 부분들을 이용하여, 분자 클로닝에 의해 달성될 수 있다. DNA 합성 및/또는 분자 클로닝 분야에서 사업을 하는 서비스 업체들(예를 들어, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins)에 의해 일상적인 절차들을 이용하여 수행될 수 있는 DNA 합성에 의해 드노보로(de novo) 게놈(의 부분들)을 생성하도록 야생형 아데노바이러스 게놈의 알려진 서열을 이용하는 것도 가능하다. 따라서, 비제한적 예로서, Ad35의 헥손, 펜톤 및 섬유를 포함하는 rAd는 Ad35를 기반으로 하는 rAd 등으로 간주된다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 rAd 벡터로 지칭된다. rAd 벡터들의 제조는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.

특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 rAd 벡터는 바이러스 복제에 요구되는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역, 예를 들어 E1a 영역 및/또는 E1b 영역의 적어도 하나의 필수적인 유전자 기능이 결핍되어 있다. 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 필수적이지 않은 E3 영역의 적어도 일부가 결핍되어 있다. 특정 실시 형태에서, 벡터는 E1 영역의 적어도 하나의 필수 유전자 기능 및 필수적이지 않은 E3 영역의 적어도 일부가 결핍되어 있다. 아데노바이러스 벡터는 "다중적으로 결핍"될 수 있는데, 이는 아데노바이러스 벡터가 아데노바이러스 게놈의 둘 이상의 영역들 각각에서 하나 이상의 필수적인 유전자 기능들이 결핍되어 있음을 의미한다. 예를 들어, 상기 E1-결핍된 또는 E1-, E3-결핍된 아데노바이러스 벡터들은 E4 영역의 적어도 하나의 필수적인 유전자 및/또는 E2 영역(예를 들어, E2A 영역 및/또는 E2B 영역)의 적어도 하나의 필수적인 유전자가 더 결핍되어 있을 수 있다.

아데노바이러스 벡터, 이의 구축 방법 및 이의 증식 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,559,099호, 제5,837,511호, 제5,846,782호, 제5,851,806호, 제5,994,106호, 제5,994,128호, 제5,965,541호, 제5,981,225호, 제6,040,174호, 제6,020,191호, 제6,113,913호 및 제8,932,607호, 및 문헌[Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", 각각 Virology의 67장 및 68장], 문헌[B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996)], 및 여기에 언급된 다른 참고문헌에 기술되어 있다. 전형적으로, 아데노바이러스 벡터는 본 기술 분야에 잘 알려진 표준 분자 생물학 기술, 예컨대 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)], 문헌[Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992)], 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995)], 및 여기에 언급된 다른 참고문헌에 기술된 것의 사용을 포함한다.

본 발명에 따른 아데노바이러스는 아데노바이러스 과(family of the Adenoviridae)에 속하고, 바람직하게는 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus) 속에 속하는 것이다. 이는 인간 아데노바이러스뿐만 아니라, 소 아데노바이러스(예를 들어, 소 아데노바이러스 3, BAdV3), 개 아데노바이러스(예를 들어, CAdV2), 돼지 아데노바이러스(예를 들어, PAdV3 또는 5), 또는 유인원 아데노바이러스(이는 원숭이 아데노바이러스 및 영장류 아데노바이러스, 예컨대 침팬지 아데노바이러스 또는 고릴라 아데노바이러스를 포함함)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 종들을 감염시키는 아데노바이러스일 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스(HAdV, 또는 AdHu; 본 발명에서, 인간 아데노바이러스는 종의 표시 없이 Ad로 지칭되는 경우를 의미하고, 예를 들어, "Ad5"라는 간결한 표기는 인간 아데노바이러스 혈청형 5인 HAdV5와 동일한 것을 의미함) 또는 유인원 아데노바이러스, 예컨대 침팬지 또는 고릴라 아데노바이러스(ChAd, AdCh, 또는 SAdV)이다.

인간 아데노바이러스들을 이용함으로써 가장 진보된 연구들이 수행되었으며, 본 발명의 특정한 양태들에 따르면 인간 아데노바이러스들이 바람직하다. 바람직한 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스를 기반으로 한다. 바람직한 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 또는 50을 기반으로 한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시 형태에 따르면, 아데노바이러스는 혈청형 26 및 35 중 하나의 인간 아데노바이러스이다. 이러한 혈청형들의 장점은 인간 집단에서 낮은 혈청 양성률 및/또는 낮은 기존 중성 항체 역가이다. rAd26 벡터의 제조는 예를 들어 국제 공개 제2007/104792호 및 (Abbink et al., 2007)에 기술되어 있다. Ad26의 예시적 게놈 서열은 GenBank 등록 EF 153474 및 국제 공개 제2007/104792호의 서열 번호 1에서 발견된다. rAd35 벡터의 제조는 예를 들어 미국 특허 제7,270,811호, 국제 공개 제00/70071호, 및 (Vogels et al., 2003)에 기술되어 있다. Ad35의 예시적 게놈 서열은 GenBank 등록 AC_000019 및 국제 공개 제00/70071호의 도 6에서 발견된다.

일반적으로 유인원 아데노바이러스도 인간 집단에서 낮은 혈청 양성률 및/또는 낮은 기존 중화 항체 역가를 가지며, 침팬지 아데노바이러스 벡터를 사용한 상당한 양의 연구가 보고되었다(예를 들어 미국 특허 제6,083,716호; 및 국제 공개 제2005/071093호; 국제 공개 제2010/086189호; 및 국제 공개 제2010085984호; (Bangari & Mittal, 2006; Cohen et al., 2002; Farina et al., 2001; Kobinger et al., 2006; Lasaro & Ertl, 2009; Tatsis et al., 2007). 그러므로, 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 유인원 아데노바이러스, 예를 들어 침팬지 아데노바이러스를 기반으로 한다. 특정한 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스는 유인원 아데노바이러스 1형, 7형, 8형, 21형, 22형, 23형, 24형, 25형, 26형, 27.1형, 28.1형, 29형, 30형, 31.1형, 32형, 33형, 34형, 35.1형, 36형, 37.2형, 39형, 40.1형, 41.1형, 42.1형, 43형, 44형, 45형, 46형, 48형, 49형, 50형 또는 SA7P형을 기반으로 한다. 또한 레수스(rhesus) 원숭이 아데노바이러스 벡터가 유용한 후보 벡터로 기술되었다(예를 들어(Abbink et al., 2015); 국제 공개 제2014/078688호). 따라서, 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 레수스 원숭이 아데노바이러스, 예를 들어 비제한적 예인 RhAd51, RhAd52 또는 RhAd53(또는 sAd4287, sAd4310A 또는 sAd4312; 예를 들어 (Abbink et al., 2015) 및 국제 공개 제2014/078688호 참조) 중 하나를 기반으로 한다.

아데노바이러스에 더하여, 당업자라면 다른 바이러스도 본 발명의 양방향성 프로모터를 사용하는 바이러스 벡터로서 사용하기에 적합함을 인식할 것이다. 예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV), 단순 포진 바이러스(HSV), 폭스바이러스 및 렌티바이러스도 본 발명의 양방향성 프로모터를 포함하도록 엔지니어링될 수 있다. 예를 들어 (Heilbronn & Weger, 2010; Robbins & Ghivizzani, 1998; Walther & Stein, 2000)에 논의된 바와 같이 상이한 벡터들에 관한 개관을 참조한다.

대부분의 상기 인간 및 비-인간 아데노바이러스의 서열은 알려져 있으며, 기타의 것에 대한 서열은 일상적인 절차를 이용하여 획득될 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 복제-적격성(replication-competent) 또는 복제-결함성(replication-deficient)일 수 있다.

특정 실시 형태에서 아데노바이러스는, 예를 들어 게놈의 E1 영역에서의 결실을 포함하기 때문에, 복제 결함성이다. "E1 영역에서의 결실"은 야생형 아데노바이러스와 비교할 경우 이 영역에서의 결실을 의미하며, E1A, E1B 55K 또는 E1B 21K 코딩 영역 중 적어도 하나에서의 결실, 바람직하게는 E1A, E1B 55K 및 E1B21K 코딩 영역의 결실을 의미한다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 아데노바이러스 게놈으로부터의 필수 영역의 결실의 경우, 이들 영역에 의해 코딩되는 기능은 트랜스로(in trans), 바람직하게는 생산자 세포에 의해 제공되어야 하며, 즉, E1, E2 및/또는 E4 영역의 일부 또는 전체가 아데노바이러스로부터 결실될 때, 이들은 생산자 세포에 존재해야 하거나, 예를 들어 이의 게놈에 통합되어야 하거나, 또는 소위 헬퍼 아데노바이러스 또는 헬퍼 플라스미드의 형태로 존재하여야 한다. 아데노바이러스는 또한 복제에 불필요한 E3 영역에서의 결실을 가질 수 있고, 따라서 이러한 결실은 보완될 필요가 없다.

이용될 수 있는 생산자 세포(때때로 본 기술 분야 및 본원에서 '패키징 세포(packaging cell)' 또는 '보완 세포(complementing cell)' 또는 '숙주 세포'로도 지칭됨)는 원하는 아데노바이러스가 증식될 수 있는 임의의 생산자 세포일 수 있다. 예를 들어, 재조합 아데노바이러스 벡터의 증식은 아데노바이러스의 결함을 보완하는 생산자 세포에서 이루어진다. 이러한 생산자 세포는 바람직하게는 이들의 게놈에 적어도 아데노바이러스 E1 서열을 갖고, 이에 의해 E1 영역에서 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스를 보완할 수 있다. 임의의 E1-보완 생산자 세포, 예컨대 E1에 의해 불멸화된 인간 망막 세포, 예를 들어 911 또는 PER.C6 세포(예를 들어, 미국 특허 제5,994,128호 참조), E1-형질전환된 양수세포(예를 들어, 유럽 특허 제1230354호 참조), E1-형질전환된 A549 세포(예를 들어 국제 공개 제98/39411호, 미국 특허 제5,891,690호 참조), GH329:HeLa 세포 (Gao, Engdahl, & Wilson, 2000), 293 세포 등이 이용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 생산자 세포는, 예를 들어 HEK293 세포, 또는 PER.C6 세포, 또는 911 세포, 또는 IT293SF 세포 등이다.

하위그룹(subgroup) C 또는 E 아데노바이러스로부터 유도되지 않은 E1-결함 아데노바이러스에 있어서, 비-하위그룹 C 또는 E 아데노바이러스의 E4-orf6 코딩 서열을 Ad5와 같은 하위그룹 C의 아데노바이러스의 E4-orf6으로 교환하는 것이 바람직하다. 이것은 Ad5의 E1 유전자를 발현하는 잘 알려진 보완 세포주, 예를 들어 293 세포 또는 PER.C6 세포에서의 그러한 아데노바이러스의 증식을 허용한다(예를 들어 (Havenga et al., 2006); 국제 공개 제03/104467호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨) 참조).

대안적인 실시 형태에서, 아데노바이러스 벡터 내에 (예를 들어 Ad5의) 이종성 E4orf6 영역을 위치시킬 필요가 전혀 없으며, 대신, E1 및 양립가능한 E4orf6 둘 다를 발현하는 세포주, 예를 들어 Ad5 유래의 E1 및 E4orf6 둘 다를 발현하는 293-ORF6 세포주에서 E1-결함성 비-하위그룹 C 또는 E 벡터를 증식시킨다(예를 들어 293-ORF6 세포의 생성을 설명하는 (Brough, Lizonova, Hsu, Kulesa, & Kovesdi, 1996); 각각이 그러한 세포주를 사용한 E1 결실 비-하위그룹 C 아데노바이러스 벡터의 생성을 설명하는 (Abrahamsen et al., 1997; Nan et al., 2003) 참조).

대안적으로, 증식 대상이 되는 혈청형으로부터 E1을 발현시키는 보완 세포가 이용될 수 있다(예를 들어 국제 공개 제00/70071호, 국제 공개 제02/40665호 참조).

E1 영역에서의 결실을 갖는 Ad35와 같은 하위그룹 B 아데노바이러스에 있어서, 아데노바이러스에서의 E1B 55K 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 3' 말단, 예를 들어 pIX 오픈 리딩 프레임의 바로 상류의 166 bp 또는 이를 포함하는 단편, 예컨대 pIX 개시 코돈(Ad35 게놈에서 5' 말단에 Bsu36I 제한효소 부위에 의해 표시됨)의 바로 상류의 243 bp 단편을 유지하는 것이 바람직하며, 그 이유는 이것이, pIX 유전자의 프로모터가 부분적으로 이 영역 내에 있음으로 인해, 아데노바이러스의 안정성을 증가시키기 때문이다(예를 들어 (Havenga et al., 2006); 국제 공개 제2004/001032호(본원에 참고로 포함됨) 참조).

본 발명의 벡터 또는 (아데노)바이러스에서의 "이종 핵산" (본원에서 '트랜스진'으로도 칭해짐)은 본 벡터 또는 (아데노)바이러스에 천연적으로 존재하는 것이 아닌 핵산이다. 이종 핵산은 예를 들어 표준 분자 생물학 기술에 의해 본 벡터 또는 (아데노)바이러스 내로 도입된다. 특정한 실시 형태에서, 이종 핵산은 관심의 대상이 되는 단백질 또는 이의 부분을 코딩할 수 있다. 이종 핵산은 예를 들어 아데노바이러스 벡터의 결실된 E1 또는 E3 영역 내로 클로닝될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 제어 하의 2가지 트랜스진을 갖는 발현 카세트는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역 내에 위치된다. 트랜스유전자는 일반적으로 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 이것은 예를 들어 트랜스진(들)을 코딩하는 핵산을 프로모터의 제어 하에 위치시킴으로써 행해질 수 있다. 많은 프로모터들이 트랜스진(들)의 발현에 이용될 수 있고, 당업자에게 알려져 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "프로모터" 또는 "프로모터 영역" 또는 "프로모터 요소"라는 용어는 상호교환가능하게 사용되며, 핵산 서열(그러나 전형적으로 DNA에 한정되는 것은 아님)의 절편으로서 그 핵산 서열의 전사를 제어하는 절편을 나타내는데, 상기 핵산 서열에 상기 절편이 작동가능하게 연결되어 있다. 프로모터 영역은 RNA 폴리머라아제의 인식, 결합 및 전사 개시에 충분한 특정 서열들을 포함한다. 게다가, 프로모터 영역은 RNA 폴리머라아제의 이러한 인식, 결합 및 전사 개시 활성을 조절하는 서열들을 선택적으로 포함할 수 있다. 이러산 서열들은 시스-작용성(cis-acting)일 수 있거나 트랜스-작용(trans-acting) 인자에 대하여 반응성일 수 있다. 더욱이, 프로모터는 조절의 성질에 따라 구성적 프로모터 또는 조절 프로모터일 수 있다.

당업자라면 프로모터가 핵산 서열의 스트레치(stretch)로부터 만들어지고 종종 핵산 서열의 상기 스트레치 내에 요소 또는 기능성 단위, 예컨대 전사 개시 부위, RNA 폴리머라아제의 결합 부위, 일반 전사 인자 결합 부위, 예컨대 TATA 박스, 특정 전사 인자 결합 부위 등을 포함함을 알 것이다. 추가의 조절 서열, 예컨대 인핸서, 및 때때로 프로모터 서열의 말단에 인트론이 또한 존재할 수 있다. 본원에서 그러한 기능성 단위들은 아래에서 '빌딩 블록'으로 지칭되며, 상기 단위들은 기능성 프로모터 서열을 만들도록 핵산 스트레치에서 조합될 수 있다. 빌딩 블록들은 서로에 바로 인접할 수 있지만 또한 프로모터 기능에서 직접적인 역할이 없는 핵산의 스트레치에 의해 분리되어 있을 수 있다. 당업자라면 핵산의 스트레치에서의 뉴클레오티드들이 프로모터 기능에 관련이 있는지를 테스트하는 방법, 및 예를 들어 프로모터 활성을 유지하면서 프로모터의 길이를 최소화하거나 활성을 최적화하기 위하여 빌딩 블록 및/또는 뉴클레오티드를 주어진 프로모터 서열 내로 부가하거나 제거하는 방법(표준 분자 생물학적 방법에 의해)을 알고 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "인핸서" 또는 "인핸서 빌딩 블록"이라는 용어는 유전자 또는 몇몇 유전자들의 전사를 자극하거나 향상시키는 단백질(활성화 단백질(activator protein))이 결합될 수 있는 조절 DNA 서열, 예를 들어 50 내지 1500 bp를 지칭한다. 이러한 활성화 단백질(전사 인자로도 공지됨)은 매개 복합체(mediator complex)와 상호작용하여 폴리머라아제 II 및 일반 전사 인자를 모집하는데, 그 후 이것은 유전자를 전사시키기 시작한다. 일반적으로 인핸서는 시스-작용성이지만, 그가 조절하는 유전자(들)의 시작 부위의 상류 또는 하류 중 어느 하나에 위치할 수 있다. 더욱이, 인핸서는 정방향 또는 역방향 중 어느 하나일 수 있고, 전사에 영향을 주도록 전사 개시 부위 근처에 위치하는 것이 필요한 것은 아니며, 그 이유는 일부가 상기 개시 부위에서 수 십만개 염기쌍의 상류 또는 하류에 위치함이 발견되었기 때문이다. 인핸서는 또한 인트론 내에서 발견될 수 있다.

"양방향성 프로모터"라는 용어는 본원에 기술된 바와 같이 빌딩 블록들에 의해 정해지며 프로모터 요소들 외에 인핸서 요소들 및 인트론 요소들을 포함할 수 있는 연속 유전자 조절 서열들을 지칭한다. 이러한 양방향성 프로모터들은 양방향 방식으로 유전자 발현을 지시하여 양방향성 프로모터 서열의 양측에 위치된 트랜스진들의 발현을 제어한다. 예를 들어, 본 발명의 양방향성 프로모터는 2가지 상이한 트랜스진의 전사를 양방향 방식으로 지시하며, 측면 한쪽에 제1 프로모터 빌딩 블록 및 측면의 다른 한쪽에 제2 프로모터 빌딩 블록이 위치하는 인핸서 빌딩 블록을 포함하여서(이때 인트론 빌딩 블록은 양방향성 프로모터의 각 말단에, 그리고 프로모터 빌딩 블록들에 인접하여 위치함), 인트론들은 각각의 프로모터들의 하류 및 각각의 트랜스진들의 상류에 있게 된다. 측면에 있고 인접한다는 것은, 빌딩 블록들 사이에 약간의 추가 뉴클레오티드가 있을 수 있지만 바람직하게는 너무 많은 추가 서열은 부가되지 않아서 양방향성 프로모터가 콤팩트 사이즈(compact size)를 유지하게 됨에 따라 반드시 직접적으로 연접함을 의미할 필요는 없음을 주지하라. 또한, '상류' 및 '하류'라는 용어는 본 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 전사 방향과 관련됨을 주지하라. 예를 들어, 관례상 상류 및 하류라는 용어는 RNA 전사가 일어나는 5'에서 3'으로의 방향에 관련된다. 상류는 RNA 분자의 5' 말단 쪽이며 하류는 3' 말단 쪽이다. 이중 가닥 DNA를 고려할 때, 상류는 당해 유전자의 코딩 가닥의 5' 말단 쪽이며 하류는 3' 말단 쪽이다. DNA의 역평행 성질로 인하여, 이것은 주형 가닥의 3' 말단이 유전자의 상류에 있고 5' 말단이 하류에 있음을 의미한다. 예를 들어 도 1d를 참조하는데, 도 1d는 제1 프로모터 빌딩 블록으로서 사이토메갈로바이러스 주요 급초기 프로모터(hCMV 프로모터), 및 제2 프로모터 빌딩 블록으로서 닭 베타 액틴 프로모터가 측면에 있는 인핸서 빌딩 블록으로서의 사이토메갈로바이러스 주요 급초기 인핸서(hCMV 인핸서)를 포함하는 바람직한 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 도시하며, 이때 제1 인트론 빌딩 블록으로서의 닭 베타 액틴 / 토끼 베타 글로빈 인트론 하이브리드는 닭 베타 액틴 프로모터에 인접하여 그 하류에 있고(닭 베타 액틴 프로모터 및 하이브리드 인트론은 함께 'CAG' 프로모터 부분으로 칭해짐) 제2 인트론 빌딩 블록으로서의 인간 아포리포단백질 A-1 인트론(hApoA1인트론)은 hCMV 프로모터 빌딩 블록에 인접하여 그 하류에 있다. 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 제1 트랜스진이 hCMV 프로모터 빌딩 블록에 작동가능하게 연결되고 제2 트랜스진이 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 2가지의 트랜스진에 작동가능하게 연결되어서, 상기 제1 및 제2 트랜스진 각각이 각각의 프로모터 및 인트론 쌍의 하류에 위치하되게 하고, 상기 제1 및 제2 트랜스진이 hCMV 인핸서로부터 바깥 방향으로 전사되게 한다.

본 발명의 바람직한 양방향성 프로모터는 서열 번호 4의 서열을 포함하는 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터이지만(이때 상이한 요소들의 서열 위치는 도 3b에 표시된 바와 같음), 당업자라면 상이한 빌딩 블록들의 서열들 및 개재 서열들의 길이 또는 아이덴티티는 본질적으로 유사한 결과가 얻어질 수 있도록 어느 정도까지 변화될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, (Richardson et al., 2009)는 CAG 프로모터의 5' 비번역 영역(UTR) 내의 인트론은 더 큰 삽입체 및 CAG 프로모터를 수용하도록 절단될 수 있음을 보여 주었으며, 이때 절단된 인트론은 증가된 발현을 제공하였다. 여기서는 상기 절단된 버전의 닭 베타 액틴 / 토끼 베타 글로빈 인트론 하이브리드가 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터에서 사용되었다. (Quilici et al., 2013)는 또한 hCMV 프로모터의 인트론 A의 결실이 발현을 향상시킴을 보여 주었다. 따라서, 당업자라면 본질적으로 유사한 결과가 얻어질 수 있도록 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 인트론 서열 및/또는 개재 서열을 변경할 수 있었다. 이와 유사하게, 상이한 인핸서들을 치환에 대하여 테스트할 수 있고/있거나 인핸서 서열을 변경할 수 있어서 본질적으로 유사한 발현이 얻어질 수 있었다. 이와 마찬가지로, hApoA1 인트론은 다른 인트론에 의해 대체될 수 있었으며, 양방향성 프로모터는 여전히 활성을 가질 것으로 예상된다. 본원에 나타낸 인핸서 및 인트론이 바람직한데, 이는 적합한 크기의 것이고, 균형 잡힌 발현을 야기하고, 안정한 구축물이다(아데노바이러스 벡터의 맥락에서). 이와 같이 본 발명의 양방향성 프로모터의 빌딩 블록들은 개별적으로 공지되어 있었던 것일 수 있지만, 조합되지도 않았고 심지어 발명의 무리에서 조합이 제안되지도 않았는데, 조합은 강하고, 균형 잡힌 양방향성 프로모터를 생성한다. 본원에 예시된 바와 같이, 놀랍게도 이러한 조합은 상기 2가지의 작동가능하게 연결된 트랜스진들 각각의 전사를 강한 단일방향성 hCMV 프로모터와 비교하여 유사한 정도까지 지시할 수 있는 한편 이와 동시에 복잡한 맥락의 아데노바이러스 벡터에서 트랜스진들이 결부된 양방향성 프로모터의 안정한 구성은 유지하는 것으로 밝혀졌다. 본원에 제시된 데이터는, 몇몇 다른 유사하게 설계된 양방향성 프로모터가 강한 프로모터 활성이 결여되고/되거나 불균형 발현을 초래함에 의해 양방향성 프로모터의 한 부분에 작동가능하게 연결된 트랜스진의 발현이 그러한 양방향성 프로모터의 다른 한 부분에 작동가능하게 연결된 트랜스진과 비교하여 유의하게 더 강하게(예를 들어, 적어도 5배의 차이) 발현되었다는 점에서, 공지된 유사 빌딩 블록들을 기반으로 한 그러한 양방향성 프로모터의 생성이 예기치 못한 것이었음을 보여 준다. 양측으로부터의 유사한 발현 수준(예를 들어, 양측으로부터의 발현간에 2배 미만의 차이) 및 안정성(아데노바이러스 벡터의 맥락에서)의 요건을 충족시키는 프로모터가 달성가능할 것인지는 선험적인 것으로서, 예측가능한 것이 아니었다. 놀랍게도 본 발명은 이러한 요건들을 충족시키는 양방향성 프로모터를 제공한다.

추가의 조절 서열이 본 발명의 양방향성 프로모터를 포함하는 구축물에 또한 부가될 수 있다. "조절 서열"이라는 용어는 본원에서 "조절 요소"와 상호교환가능하게 사용되고, 핵산 (그러나 전형적으로 DNA에 한정되는 것은 아님)의 절편으로서 그 핵산 서열(상기 핵산 서열에 상기 절편이 작동가능하게 연결됨)의 전사를 조절하고 그에 따라 전사 조절자로서 작용하는 절편을 나타낸다. 조절 서열은 종종 전사 단백질(transcriptional protein) 및/또는 전사 인자의 핵산-결합 도메인에 의해 인식되는 전사 결합 도메인인 핵산 서열, 인핸서 또는 리프레서 등을 포함한다. 예를 들어, 조절 서열은 발현이 테트라사이클린 오페론 리프레서 단백질(tetR)의 존재 하에서는 저해되도록 하나 이상의 테트라사이클린 오페론 오퍼레이터 서열(tetO)을 포함할 수 있다. 테트라사이클린의 부재 하에 tetR 단백질은 tetO 부위에 결합하여 tetO 부위에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 억제하는 것이 가능하다. 그러나, 테트라사이클린의 존재 하에서는, tetR 단백질에서의 형태 변화가 오퍼레이터 서열에의 상기 tetR 단백질의 결합을 방지하여, 작동가능하게 연결된 유전자의 전사가 일어나게 한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 rAd는 tetO가 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 선택적으로 포함할 수 있어서, tetR 단백질이 발현되는 생산자 세포에서 생성되는 벡터에서의 하나 이상의 트랜스진의 발현이 저해된다. 후속적으로, 발현은 벡터가 tetR 단백질을 발현하지 않는 대상체 또는 세포 내로 도입되는 경우 저해되지 않는다(예를 들어, 국제 공개 제07/073513호 참조). 특정한 다른 실시 형태에서, 본 발명의 벡터는 큐메이트 유전자-스위치 시스템을 선택적으로 포함할 수 있으며, 여기서, 발현의 조절은 프로모터의 하류에 위치된 오퍼레이터 부위(CuO)에의 리프레서(CymR)의 결합에 의해 매개된다(예를 들어, (Mullick et al., 2006) 참조).

본원에 사용되는 바와 같이, "리프레서"라는 용어는 재조합 발현 벡터의 이종 단백질 산물의 생성을 저해, 방해, 지연 및/또는 억제하는 능력을 갖는 실체(예를 들어, 단백질 또는 기타 분자)를 지칭한다. 예를 들어, 이는 발현 카세트에서와 같이, 발현 벡터를 따라 적절한 위치에서 결합 부위를 방해함에 의한 것이다. 리프레서의 예는 tetR, CymR, lac 리프레서, trp 리프레서, gal 리프레서, 람다 리프레서, 및 본 기술 분야에 알려진 다른 적절한 리프레서를 포함한다.

더욱이, 본 발명의 재조합 벡터, 바이러스 또는 아데노바이러스는 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하며, 여기서, hCMV-CAG4 양방향성 프로모터의 hCMV 부분 및 CAG 부분의 전사 방향(5'에서 3'으로)은 서로를 가리키며, hCMV-CAG4 양방향성 프로모터는 하나의 방향으로 제1 트랜스진에, 그리고 반대 방향으로 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결되어 있다. 따라서 양방향성 프로모터는 벡터 또는 (아데노)바이러스 게놈의 제1 말단 쪽으로의 제1 트랜스진의 발현 및 벡터 또는 (아데노)바이러스 게놈의 다른 하나의 말단 쪽으로의 제2 트랜스진의 발현을 구동시킬 것이다. 당업자라면 일상적인 방법에 의해 돌연변이가 제공 서열 내에 만들어질 수 있고 프로모터 활성에 대하여 테스트될 수 있음을 알고 있을 것이다. 전형적으로, 표시된 프로모터 서열(인핸서 및 인트론 서열은 포함하지 않음)과의 동일성이 적어도 90%인 서열은 여전히 기능적 활성을 가질 것이며 따라서 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터로 간주될 것이다. 따라서, 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 바람직하게는 표시된 프로모터 서열(인핸서 및 인터론 서열 이외의 것)과의 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 바람직하게는, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 서열 번호 4의 서열과의 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열을 포함한다. 바람직한 특정 실시 형태에서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 도 1d에 도시된 바와 같은 빌딩 블록을 포함하며, 여기서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 제1 프로모터 빌딩 블록으로서 hCMV 프로모터, 및 제2 프로모터 빌딩 블록으로서 닭 베타 액틴 프로모터가 측면에 있는 인핸서 빌딩 블록으로서의 hCMV 인핸서를 포함하며, 이때 제1 인트론 빌딩 블록으로서의 닭 베타 액틴 / 토끼 베타 글로빈 인트론 하이브리드는 닭 베타 액틴 프로모터에 인접하고 제2 인트론 빌딩 블록으로서의 hApoA1인트론은 hCMV 프로모터 빌딩 블록에 인접한다. 특정한 다른 바람직한 실시 형태에서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 서열 번호 4의 서열과 100% 동일하지만(이때 상이한 요소들의 서열 위치는 도 3에 표시된 바와 같음), 당업자라면 상이한 빌딩 블록들의 서열들 및 개재 서열들의 길이가 어느 정도까지 변화될 수 있고 인핸서 및 인트론 요소의 아이덴티티도 변화될 수 있어서 본질적으로 유사한 결과가 얻어질 수 있음을 인식할 것이다.

"작동가능하게 연결된" 또는 "작동되게 연결된"이라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 핵산 서열들과 뉴클레오티드의 조절 서열들, 예컨대 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 종결 부위, 및 기타 신호 서열과의 기능적 관계를 지칭하고, 둘 이상의 DNA 절편이 함께 연결되어서 이들이 그의 의도된 목적을 위하여 협력하여 기능함을 나타낸다. 예를 들어, 조절 서열 또는 프로모터 영역에의 핵산 서열들, 전형적으로 DNA의 작동적 연결은 상기 DNA와 조절 서열 또는 프로모터 사이의 물리적이고 기능적인 관계를 지칭하여서 그러한 DNA의 전사는 특이적으로 상기 DNA를 인식하고, 이에 결합하고 이를 전사시키는 RNA 폴리머라아제에 의해 조절 서열 또는 프로모터로부터 개시되게 한다. 발현 및/또는 시험관 내 전사의 최적화를 위하여, 핵산 또는 DNA의 발현을 위한 조절 서열을 상기 핵산 또는 DNA가 발현되는 세포 유형에서 변형시키는 것이 필요할 수 있다. 그러한 변형의 바람직함 또는 필요성은 경험적으로 결정될 수 있다.

발현은 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 어느 하나의 부분에 의해 제어되며 트랜스진은 강력하게 발현된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "강력하게 발현되는" 또는 "강력 발현"은 예를 들어 상이한 단백질 검출 기술들, 예컨대 웨스턴 블롯(Western Blot), FACS 분석, 또는 발광 또는 형광을 사용하는 다른 분석법으로 측정할 경우 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 어느 한 부분으로부터의 발현이 hCMV 프로모터의 제어 하에 단일 트랜스진을 발현하는 1가 벡터로부터의 발현에 비견되거나 이보다 훨씬 더 양호함을 의미한다. hCMV 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스의 주요 급초기(mIE) 영역으로부터 유래되며, 백신 및 유전자 요법용 벡터에서의 강력한 단일방향성 유전자 발현에 빈번하게 사용된다. 예를 들어, hCMV 프로모터 서열은 hCMV AD169 주(strain) mIE 유전자좌(X03922)로부터 유래될 수 있으며, NF1 결합 부위, 인핸서 영역, TATA 박스 및 제1 엑손의 일부를 포함할 수 있다. 더 짧을 수 있는(예를 들어, 단지 인핸서 및 프로모터 영역을 포함하고 NF1 결합 부위가 결여됨) 또는 더 길 수 있는(예를 들어 추가 세포 인자 결합 부위 및 제1 인트론 서열을 포함함) 다른 hCMV 프로모터 서열이 공지되어 있다. 길이가 상이한 이러한 hCMV 프로모터들은 모두 강력한 편재적 활성 프로모터인 것으로 밝혀졌다. 본원에 기술된 바와 같이 발현 수준의 비교를 위하여, hCMV 프로모터 서열은 서열 번호 9의 서열이었다. 예를 들어, rAd에서의 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 어느 한 부분으로부터의 발현 수준은 바람직하게는 서열 번호 9의 hCMV 프로모터를 갖는 1가 rAd로부터의 발현 수준의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%이다. 특정 실시 형태에서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 어느 한 부분으로부터의 발현 수준은 서열 번호 9의 hCMV 프로모터를 갖는 1가 rAd로부터의 발현 수준의 약 100%이다. 더욱이, 발현이 유의한 T-세포 및 B-세포 면역 반응을 생성하기에 충분함이 hCMV 프로모터의 제어 하에 단일 항원을 발현하는 rAd로부터 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터에 의해 발현되는 2가지 트랜스진의 강력한 발현은 이들 둘 다의 트랜스진에 대한 유의한 T-세포 및 B-세포 면역 반응을 생성할 것으로 예상된다. 예를 들어, 상기 2가지 트랜스진이 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 일으키는 항원을 코딩할 경우, 강력한 발현이 상기 둘 다의 항원에 대한 측정가능한 면역 반응을 생성할 것이며, 상기 둘 다의 항원에 대한 그 면역 반응은 바람직하게는 hCMV 프로모터의 제어 하에 단일 항원을 발현하는 상응하는 1가 벡터 또는 rAd에 의해 생성되는 면역 반응과 동일하거나 이보다 더 양호할 것이다.

상기 발현은 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 양측으로부터 균형 잡힌 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "균형 잡힌 발현", "발현의 균형", "발현 균형", 또는 발현을 지칭할 때의 "균형 잡힌"은 예를 들어 상이한 단백질 발현 검출 기술들, 예컨대 웨스턴 블롯, FACS 분석, 또는 발광 또는 형광을 사용하는 다른 분석법으로 측정할 경우 양방향성 프로모터의 한쪽으로부터의 발현이 양방향성 프로모터의 다른 한쪽으로부터의 발현에 비견됨을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 한쪽으로부터의 발현 수준은 바람직하게는 상기 양방향성 프로모터의 다른 한쪽으로부터의 발현 수준의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%이다. 특정 실시 형태에서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 한쪽으로부터의 발현 수준은 상기 양방향성 프로모터의 다른 한쪽으로부터의 발현 수준의 약 100%이다. 또 다른 예에서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 양측으로부터의 발현의 비는 1/1, 1.1/1, 1.2/1, 1.3/1, 1.4/1, 1.5/1, 1.6/1, 1.7/1, 1.8/1, 1.9/1, 및 2/1의 범위이다. 더욱이, 발현이 유의한 T-세포 및 B-세포 면역 반응을 생성하기에 충분함이 hCMV 프로모터의 제어 하에 단일 항원을 발현하는 rAd로부터 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터에 의해 발현되는 2가지 항원의 균형 잡힌 발현은 이들 둘 다의 항원에 대한 비견되는 T-세포 및 B-세포 면역 반응을 생성할 것으로 예상된다. 예를 들어, hCMV-CAG4 프로모터의 한쪽으로부터 발현되는 항원에 의한 면역 반응은 바람직하게는 상기 양방향성 프로모터의 다른 한쪽으로부터 발현되는 항원에 대한 면역 반응의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%이다. 특정 실시 형태에서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 한쪽으로부터 발현되는 항원에 대한 면역 반응은 상기 양방향성 프로모터의 다른 한쪽으로부터 발현되는 항원에 대한 면역 반응의 약 100%이다. 따라서, 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 mCMV 양방향성 프로모터와 비교하여 발현의 균형이 개선된 것이다. (국제 공개 제2016/166088호에 기술된) 양방향성 mCMV 프로모터의 좌측(5'말단)에 위치된 항원과 비교하여 양방향성 mCMV 프로모터의의 우측(3'말단)에 위치된 항원의 발현이 대략 10배 더 높았다.

"코딩 서열", "~을 코딩하는 서열" 또는 "~을 코딩하는"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있을 때 시험관 내에서 또는 생체 내에서 전사되고(DNA) 번역되는(mRNA) 핵산 서열을 지칭한다.

폴리아데닐화 신호, 예를 들어 소 성장 호르몬 폴리A 신호(미국 특허 제5,122,458호)가 트랜스진 뒤에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 각각의 트랜스진은 폴리A 신호를 가지며, 바람직하게는 제1 트랜스진을 위한 폴리A 신호는 제2 트랜스진을 위한 폴리A 신호와는 상이하다. 일 실시 형태에서, 제1 폴리A 신호는 SV40 폴리A 신호이며, 제2 폴리A 신호는 소 성장 호르몬 폴리A 신호이다.

인트론을 포함하는 서열은 본 발명의 양방향성 프로모터의 양 말단에 존재한다. 이러한 인트론들은 동일할 수 있지만 바람직하게는 상이하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 인트론은 본 기술 분야에 공지된 바와 같은 정상적인 기능 및 구조를 가지며, 단백질 합성에 대한 정보를 코딩하지 않는 핵산에서의 폴리뉴클레오티드 서열로서 스플라이싱으로 공지된 과정에 의해 메신저 RNA의 번역 전에 제거된다. 인트론은 스플라이스 공여 부위(인트론의 5'말단, 통상적으로 GU 서열) 및 스플라이스 수용 부위(인트론의 3'말단, 통상적으로 GA 서열)를 포함한다. 다양한 상이한 인트론들이 본 발명에 따라 잠재적으로 사용될 수 있지만, 더 많은 공간이 재조합 아데노바이러스에서 트랜스진에 대하여 남아있도록 바이러스 벡터 내에서 너무 많은 공간을 차지하지 않도록 하기 위하여 상대적으로 짧은 인트론 및 더 짧은 인트론으로 되도록 변형된 인트론을 사용하는 것이 바람직하다. 양방향성 프로모터의 한쪽에 제1 인트론, 그리고 양방향성 프로모터의 다른 한쪽에 상이한 제2 인트론을 사용하는 것이 바람직하며, 즉, 각각의 트랜스진에는 상이한 인트론 서열이 선행된다. 특정 실시 형태에서, 인트론은 키메라 인트론일 수 있다. 당업자라면 많은 상이한 인트론들이 이용가능하며 사용될 수 있음을 알고 있다. 인트론은 특히 생체 내에서 단백질 발현을 증가시킬 수 있음이 공지되어 있다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 프로모터는 닭 베타 액틴 프로모터 빌딩 블록에 인접한 제1 인트론으로서의 닭 베타 액틴 / 토끼 베타 글로빈 인트론 하이브리드를 포함한다. 일 실시 형태에서 본 발명의 프로모터는 hCMV 프로모터 빌딩 블록에 인접한 제2 인트론으로서의 hApoA1인트론을 포함한다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 프로모터는 닭 베타 액틴 프로모터 빌딩 블록에 인접한 제1 인트론으로서의 닭 베타 액틴 / 토끼 베타 글로빈 인트론 하이브리드, 및 hCMV 프로모터 빌딩 블록에 인접한 제2 인트론으로서의 hApoA1인트론을 포함한다.

본원에 설명된 실험에서의 예시된 파라미터들 중 하나는 면역원성인데, 이는 백신 응용에서 항원과 관계가 있다. 그러나, 균형 잡힌 트랜스진 발현 수준들은 또한 면역 반응이 일차 목표가 아닌 트랜스진, 예를 들어 유전자 요법 목적, 이종 단백질 복합체의 발현, 또는 2개의 항체 사슬의 비례적 발현에 사용되는 2가지 상이한 트랜스진과 관계가 있을 수 있음이 당업자에게 즉각적으로 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 단일 재조합 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터로부터의 발현이 요망되는 트랜스진들의 임의의 조합에 의해 실행될 수 있다. 따라서, 트랜스진의 아이덴티티는 본 발명에 중요하지 않은데, 이는 예를 들어 임의의 트랜스진을 포함하는 벡터 또는 아데노바이러스에 적합하다. 적합한 트랜스진은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 트랜스진 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 치료 효과를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(예를 들어, 유전자 요법 목적을 위한 것임), 또는 면역 반응이 요망되는 폴리펩티드(rAd 벡터가 백신 접종 목적에 사용될 때)를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 이종 핵산들은 항원성 결정부위들(이에 대하여 면역 반응이 일어날 필요가 있음)을 코딩하는 관심의 대상이 되는 유전자들이다. 그러한 항원성 결정부위도 전형적으로 항원으로 지칭된다. 재조합 아데노바이러스가 대상체에게 투여될 때, 면역 반응이 항원(들)에 대하여 일어날 것이다. 임의의 원하는 항원은 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명에 따른 전형적인 실시 형태에서, 항원들은 질환 또는 병태를 야기할 수 있는 유기체 유래의 펩티드들, 폴리펩티드들 또는 단백질들이다. 그러므로, 추가의 바람직한 실시 형태에서, 상기 관심의 대상이 되는 이종 핵산은 면역원성(또는 항원성) 결정부위를 코딩한다. 더 바람직하게는, 상기 면역원성 결정부위는 박테리아, 바이러스, 효모 또는 기생충 유래의 항원이다. 그러한 유기체들에 의해 야기된 질환들은 일반적으로 '감염성 질환'으로 지칭된다(그리고 그에 따라, 숙주를 '감염시키는' 유기체들에 한정되지 않고, 숙주에 들어와서 질환을 야기하는 것들도 포함한다). 소위 '자기-항원', 예를 들어, 종양 항원이 또한 선행 기술의 일부를 형성하며, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스에서의 이종 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 항원성 결정부위들(또는 항원들)이 취해지는 비제한적 예로는 플라스모듐팔시파룸(Plasmodium falciparum)과 같은 말라리아-유발 유기체들, 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 같은 결핵-유발 유기체, 효모들 또는 바이러스들이 있다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 플라비바이러스들(예를 들어, 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus), C형 간염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스), 에볼라 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 마르부르크 바이러스(Marburg virus)와 같은 바이러스로부터 유래된 항원들이 본 발명에 따른 조성물들에서 이용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 항원은 피. 팔시파룸 유래의 CS 단백질 또는 이의 면역원성 부분이다(예를 들어, CS를 코딩하는 아데노바이러스 벡터의 것, 예를 들어 (Havenga et al., 2006; Ophorst et al., 2006); 국제 공개 제2004/055187호(이들 전부는 본원에 그 전체가 참고로 포함됨) 참조). 또 다른 실시 형태에서, 항원성 결정부위는 엠. 투베르쿨로시스 유래의 하나의 항원의 단백질, 또는 몇몇 항원들의 융합 단백질, 예컨대 Ag85A, Ag85B 및/또는 TB10.4 단백질 또는 이의 면역원성 부분(들)이다(그러한 TB 백신 바이러스의 구축 및 생성에 대해서는 예를 들어 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제2006/053871호 참조). 또 다른 실시 형태에서, 상기 항원성 결정부위는 필로바이러스, 예컨대 에볼라 바이러스 또는 마르부르크 바이러스 유래의 GP와 같은 바이러스 당단백질 또는 이의 면역원성 부분이다(예를 들어 (Geisbert et al., 2011; Sullivan et al., 2006; Sullivan et al., 2003). 다른 추가 실시 형태에서, 상기 면역성 결정부위는 gag, pol, env, nef 또는 이들의 변이체들과 같은 HIV 단백질로부터 유래된 것이다(예를 들어, 아데노바이러스계 HIV 백신의 것, 예를 들어 국제 공개 제2009/026183호, 국제 공개 제2010/096561호, 국제 공개 제2006/120034호, 국제 공개 제02/22080호, 국제 공개 제01/02607호 참조). 다른 실시 형태에서, 상기 항원성 결정부위는 인플루엔자 바이러스 유래의 HA, NA, M, 또는 NP 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 부분이다(예를 들어 (Hu et al., 2011; Zhou et al., 2010); (Vemula & Mittal, 2010)에 의한 개관). 다른 실시 형태에서, 항원성 결정부위는 홍역 바이러스 유래의 HA 단백질 또는 이의 면역원성 부분이다(예를 들어 국제 공개 제2004/037294호). 다른 실시 형태에서, 항원성 결정부위는 광견병 바이러스 당단백질이다(예를 들어 (Zhou, Cun, Li, Xiang, & Ertl, 2006)). 추가 실시 형태에서, 항원은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 예를 들어 RSV F 단백질(예를 들어 국제 공개 제2013/139911호 및 국제 공개 제2013/139916호 참조), 또는 RSV G 단백질, 또는 이들 둘 다의 것, 또는 기타 RSV 단백질로부터 유래된 것이다. 다른 실시 형태에서, 항원은 또 다른 바이러스, 예컨대 인간 파필로마바이러스 또는 기타 바이러스 등으로부터 유래된 것이다. 재조합 아데노바이러스는 동일 유기체 유래의 2가지 상이한 항원을 코딩할 수 있다. 또한 재조합 아데노바이러스는 상이한 유기체들 유래의 항원들의 조합, 예를 들어 제1 유기체 유래의 제1 항원 및 제2 유기체 유래의 제2 항원을 코딩할 수 있다. 항원 및 예를 들어 아쥬반트(동일 아데노바이러스 내), 예를 들어 항원 및 Toll-유사-수용체(TLR) 작용제, 예컨대 TLR3 작용체, 예컨대 dsRNA 또는 이의 모방체 등을 코딩하는 것이 또한 가능하다(예를 들어 국제 공개 제2007/100908호). 특정 실시 형태에서, 재조합 벡터, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 각각이 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 제어 하에 있는 2가지 상이한 항원을 코딩한다. 다른 실시 형태에서, 벡터 또는 재조합 (아데노)바이러스는 각각이 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 제어 하에 있는 항원 및 면역 조절제를 코딩한다. 특정 실시 형태에서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 제어 하에 있는 제1 및 제2 트랜스진 외에, 추가의 이종 서열 또는 트랜스진이 벡터 또는 재조합 (아데노)바이러스에 존재할 수 있다.

또한 본 발명은 아데노바이러스가 표적 세포를 감염시킬 때 각각이 강력하게 발현되는 제1 및 제2 트랜스진을 포함하는 유전적으로 안정한 재조합 아데노바이러스의 생성 방법을 제공하며, 본 방법은 하나의 방향으로 제1 트랜스진에, 그리고 반대 방향으로 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 포함하는 구축물을 제조하는 단계, 및 상기 구축물을 재조합 아데노바이러스의 게놈 내로 포함시키는 단계를 포함한다. 이와 같이 구축물의 제조는 잘 알려진 표준 분자 클로닝 방법의 이용을 포함하며(예를 들어 (Holterman et al., 2004; Lemckert et al., 2006; Vogels et al., 2003); Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al, eds, 1987; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995 참조), 이는 당업자에게 공지되고 재조합 아데노바이러스 기술 분야에서 일상적으로 수행되고 본원에 예시된 바와 같다. 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 상기에 설명된 특징을 가지며, 일상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 편의상, 당업자는 아데노바이러스 게놈을 더 작은 단편, 예를 들어 플라스미드 형태에서의 트랜스진들의 용이한 조작 및 도입을 위한 상기 게놈의 좌측 부분에서 E1 영역까지를 위한 제1 부분, 및 제1 부분과의 재조합시 전 아데노바이러스 게놈을 생성할 수 있는 나머지 게놈을 위한 더 큰 제2 부분으로 클로닝함으로써 조작할 수 있다(예를 들어 국제 공개 제99/55132호 참조).

본 발명의 rAd는 종래 기술에서 제공된 2가지 트랜스진 발현을 위한 다양한 대안적인 접근법에 의해 제조된 아데노바이러스와는 달리, 2가지 트랜스진을 발현할 수 있고 유전적으로 안정한 채로 있는 한편 양방향성 프로모터에 의해 구동되는 상기 2가지 트랜스진의 균형 잡힌 발현도 제공한다는 장점을 갖는다. 따라서, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 2가지 트랜스진을 발현하는 아데노바이러스의 유전자 불안정성 및 상기 2가지 트랜스진의 불균형 발현의 문제를 해결한다.

유전자 안정성의 테스트를 위하여, rAd는 구제되고(rescued) 증식된다(적절한 세포주, 예를 들어 헬퍼 세포주 PER.C6^®에서). 바이러스 DNA는 특정 계대수에서 단리되며, rAd 게놈의 완전성은 하기 중 하나 이상에 의해 분석될 수 있다: 트랜스진 영역의 존재 또는 결실 밴드의 부재에 대한 PCR 분석, 제한효소 단편들의 차이의 존재 또는 부재에 대한 rAd 게놈의 제한효소 절단, 및/또는 rAd 서열에서의 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 rAd 게놈 또는 rAd 게놈의 PCR 생성물의 서열결정. 본 발명의 rAd와 관련하여, "유전적으로 안정한"은, 대규모 배치 생성에 적합한 바와 같이 2가지 트랜스진을 발현하는 rAd가 단일 트랜스진(예를 들어, hCMV 프로모터 뒤)을 갖는 비견되는 rAd와 동일한 유전자 안정성을 갖도록, 뉴클레오티드 서열이 rAd의 생성에 사용된 플라스미드로부터 rAd의 이후의 생성 단계까지 변화되지 않음을 의미한다. 예를 들어, 발현 카세트 측면에 위치하는 프라이머를 사용한 PCR 분석에 의하면 더 빠른 계대수의 rAd 또는 출발 재료와 비교하여 결실 단편(밴드)이 나타나지 않고/않거나 E1, E3 및 E4 영역의 PCR 생성물의 서열결정은 뉴클레오티드 서열이 변화되지 않음을 확인해준다. 바람직하게는 양방향성 프로모터를 갖는 발현 카세트를 포함하는 영역의 서열결정은 발현 카세트를 포함하는 영역에서 뉴클레오티드 서열이 변화되지 않음을 확인해준다.

유전자 안정성은 이 연구에서 다른 테스트 방법, 예컨대 단일 생성 바이러스 배치에서의 테스트용 절단과 비교하여 철저히 평가된다. 상기 분석법의 민감성은 하기 수단에 의해 증가된다: 몇몇 바이러스 집단(플라크)이 단리되고 연장된 계대가 가해진다. 발현 카세트의 측면에 위치하는 프라이머를 사용한 PCR 분석과 조합된 연장된 계대는 다른 방법을 사용할 경우 간과될 수 있는 rAd 집단에서의 작은 비율의 결실 돌연변이체의 검출을 허용한다. 또한, 서열결정 분석은 트랜스진의 오픈 리딩 프레임에서의 종결 코돈의 도입과 같은 점돌연변이의 출현을 배제하도록 수행된다. 더 구체적으로, 바이러스 돌연변이는 항상 우연한 사건을 나타내기 때문에 한 플라크는 안정할 수 있는 반면 또 다른 것은 결실 밴드를 나타낼 수 있다. 따라서, 유전자 안정성을 올바르게 평가하기 위하여, 몇몇 바이러스 집단(플라크)를 테스트할 필요가 있다. 벡터가 모 벡터보다 더 효율적으로 복제될 수 있게 하는 돌연변이가 일어나는 경우, 이것은 돌연변이 버전의 생장을 초래할 수 있는데, 이는 종종 단지 이 연구에서 설명된 바와 같이 연장된 계대 후 관찰된다. 바람직하게는, 본 발명의 rAd는 사용된 테스트 시스템에서 적어도 10회까지의 계대 동안, 그리고 더욱 더 바람직하게는 적어도 13회까지의 계대 동안 유전적으로 안정하여서, 바이러스는 대규모 생산 캠페인에 충분히 안정하다. 양방향성 mCMV 프로모터의 제어 하에 있는 2가지 트랜스진을 갖는 재조합 아데노바이러스는 유전적으로 안정함이 최근에 밝혀졌으며, 예를 들어 국제 공개 제2016/166088호를 참조한다. 본 출원은 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 제어 하에 있는 2가지의 트랜스진을 갖는 재조합 아데노바이러스가 또한 유전적으로 안정하며, 게다가 양방향성 mCMV 프로모터의 제어 하에 상기 트랜스진들이 있는 상황과 비교하여 상기 2가지 트랜스진들의 더 균형 잡힌 발현을 가짐을 보여준다.

본 발명의 방법에 따라 생성된 재조합 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스에 대하여 상기에 설명된 실시 형태에 따라 제조될 수 있다.

또한 본 발명은 세포에서의 적어도 2가지의 트랜스진의 발현 방법을 제공하며, 본 방법은 본 발명에 따른 벡터 또는 재조합 바이러스, 예를 들어 재조합 아데노바이러스를 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 재조합 아데노바이러스를 포함하는 세포의 제공은 대상체에게 아데노바이러스를 투여하는 것을 통하여, 또는 시험관 내에서 또는 생체 외에서 아데노바이러스를 세포 내로 도입하는 것(예를 들어 감염)을 통하여 행해질 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 발명은 예를 들어 재조합 아데노바이러스를 대상체에게 투여함으로써 세포에서 적어도 2가지의 트랜스진을 발현시키는 데 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 적어도 2가지의 항원에 대한 면역 반응의 유도 방법을 제공하며, 이는 대상체에게 본 발명에 따른 벡터, 예를 들어 재조합 (아데노)바이러스를 투여하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명은 적어도 2가지의 항원에 대한 면역 반응의 유도에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 벡터 또는 재조합 (아데노)바이러스를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터 또는 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 게놈을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 당업자라면 이것이 또한 본 발명의 단일 재조합 DNA 분자를 함께 형성할 수 있는 적어도 2가지의 상이한 재조합 DNA 분자들의 조합일 수 있음을 알 것이다. 그러한 분자는 게놈의 조작 및 신규 재조합 아데노바이러스의 생성에 유용하다. 게놈은 허용(permissive) 세포에서의 아데노바이러스의 복제 및 패키징에 요구되는 단백질을 코딩한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 수치에 대하여 '약'이라는 용어는 수치 ± 10%를 의미한다.

생산자 세포를 배양하여 세포 및 바이러스 수 및/또는 바이러스 역가를 증가시킨다. 세포 배양을 행하여 세포가 본 발명에 따른 관심의 대상이 되는 바이러스를 물질대사시키고/시키거나 성장시키고/시키거나 분열시키고/시키거나 생성할 수 있도록 한다. 이는 당업자에게 잘 알려진 것과 같은 방법에 의해 달성될 수 있으며, 예를 들어 적절한 배양 배지 내에서 세포에 영양분을 제공하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 배양 배지는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 일반적으로 상업적 공급처로부터 대량으로 획득될 수 있거나 표준 프로토콜에 따라 주문 제작될 수 있다. 배양은, 예를 들어 디쉬, 롤러 보틀 또는 생물반응기에서 배치식, 유가식, 연속식 시스템 등을 사용하여 행해질 수 있다. 세포 배양에 적합한 조건은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)], 및 문헌[R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)] 참조).

전형적으로, 아데노바이러스는 배양물 내에서 적절한 생산자 세포에 노출되어 바이러스의 섭취가 가능하게 될 것이다. 통상적으로, 최적 교반은 약 50 내지 300 rpm, 전형적으로 약 100 내지 200, 예를 들어 약 150이며, 전형적인 DO는 20 내지 60%, 예를 들어 40%이며, 최적 pH는 6.7 내지 7.7이며, 최적 온도는 30 내지 39℃, 예를 들어 34 내지 37℃이며, 최적 MOI는 5 내지 1000, 예를 들어 약 50 내지 300이다. 전형적으로, 아데노바이러스는 생산자 세포를 자발적으로 감염시키며, 생산자 세포를 rAd 입자와 접촉시키는 것이 상기 세포의 감염에 충분하다. 일반적으로, 아데노바이러스 시드 스톡(seed stock)을 배양물에 첨가하여 감염을 개시하고, 후속적으로 아데노바이러스를 생산자 세포에서 증식시킨다. 이는 당업자에게 모두 일상적인 것이다.

아데노바이러스의 감염 후에, 상기 바이러스는 세포 내부에서 복제되고, 이에 의해 증폭되는데, 이 공정은 본원에서 아데노바이러스의 증식으로 지칭된다. 아데노바이러스 감염은 최종적으로는 감염된 세포들의 용해로 이어진다. 그러므로, 아데노바이러스의 용해 특성들은 바이러스 생산의 2가지 상이한 양식을 가능하게 한다. 제1 양식은 바이러스를 수확한 후 세포 용해를 하는 것이며, 이는 세포를 용해시키는 외부 인자를 이용한다. 제2 양식은 생산된 바이러스에 의한 (거의) 완전한 세포 용해 후 바이러스 상청액을 수확하는 것이다(예를 들어, 외부 인자에 의한 숙주 세포의 용해 없이 아데노바이러스를 수확하는 것이 개시된 미국 특허 제6,485,958호 참조). 아데노바이러스를 수확하기 위하여 세포를 활발하게 용해시키는 외부 인자를 이용하는 것이 바람직하다.

활발한 세포 용해에 사용될 수 있는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 국제 공개 제98/22588호, 28 내지 35면에서 토의되었다. 이와 관련하여 유용한 방법으로는 예를 들어 냉동-해동, 고체 전단(solid shear), 고장성 및/또는 저장성 용해, 액체 전단(liquid shear), 초음파 처리, 고압 압출, 세제 용해(detergent lysis), 상기의 조합들 등이 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 세포는 적어도 하나의 세제를 이용하여 용해된다. 용해를 위한 세제의 사용은 이것이 용이한 방법이고 용이하게 확장 축소가능할 수 있다는 장점이 있다.

이용될 수 있는 세제 및 이것이 이용되는 방식은 일반적으로 당업자에게 알려져 있다. 몇몇 예가 예를 들어 국제 공개 제98/22588호, 29 내지 33면에 토의되어 있다. 세제는 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성 및 비이온성 세제를 포함할 수 있다. 세제의 농도는 예를 들어 약 0.1% 내지 5%(w/w)의 범위 내에서 변할 수 있다. 일 실시 형태에서, 사용된 세제는 Triton X-100이다.

오염시키는 즉, 대부분 생산자 세포로부터의 핵산들을 제거하기 위하여 뉴클레아제(nuclease)를 사용할 수 있다. 본 발명에서의 용도에 적합한 예시적인 뉴클레아제는 Benzonase^®, Pulmozyme^® 또는 본 기술 분야 내에서 일반적으로 이용되는 임의의 다른 DNase 및/또는 RNase를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 뉴클레아제는 특정한 뉴클레오티드들 사이의 내부 포스포디에스테르 결합들을 가수분해함으로써 핵산들을 빠르게 가수분해하여 세포 용해물의 점도를 감소시키는 Benzonase^®이다. Benzonase^®는 Merck KGaA(코드 W214950)로부터 상업적으로 획득될 수 있다. 뉴클레아제가 이용된 농도는 바람직하게는 1 내지 100 유닛/㎖의 범위 내에 있다. 뉴클레아제 처리에 대안적으로, 또는 더하여, 도미펜 브로마이드와 같은 선택적인 침전제들을 이용하여, 아데노바이러스 정제 동안 아데노바이러스 제제로부터 숙주 세포 DNA를 선택적으로 침전시키는 것이 또한 가능하다(예를 들어 미국 특허 제7,326,555호; (Goerke, To, Lee, Sagar, & Konz, 2005); 국제 공개 제2011/045378호; 국제 공개 제2011/045381호 참조).

생산자 세포들의 배양물로부터 아데노바이러스를 수확하는 방법들은 국제 공개 제2005/080556호에 광범위하게 기재되어 있다.

특정한 실시 형태에서, 수확된 아데노바이러스는 더 정제된다. 아데노바이러스의 정제는 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제05/080556호에 기재된 바와 같이 청징, 한외여과, 정용여과 또는 분리(크로마토그래피를 이용함)를 포함하는 수 개의 단계들로 수행될 수 있다. 청징은 여과 단계에 의해 수행되어, 세포 용해물로부터 세포 잔사 및 다른 불순물들을 제거할 수 있다. 한외여과는 바이러스 용액을 농축시키는데 이용된다. 정용여과, 또는 울트라필터(ultrafilter)를 이용한 완충액 교환은 염, 당 등의 제거 및 교환을 위한 방법이다. 당업자는 각 정제 단계에 대한 최적 조건들을 찾는 법을 안다. 또한, 본원에 그 전체가 참고로 포함된 국제 공개 제98/22588호에는 아데노바이러스 벡터들의 생산 및 정제 방법이 기재되어 있다. 이 방법들은 숙주 세포들을 성장시키는 단계, 숙주 세포들을 아데노바이러스로 감염시키는 단계, 숙주 세포들을 수확하고 용해시키는 단계, 조 용해물을 농축시키는 단계, 조 용해물의 완충액을 교환하는 단계, 용해물을 뉴클레아제로 처리하는 단계 및 크로마토그래피를 이용하여 바이러스를 더 정제하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 정제는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계를 이용하며, 이는 예를 들어 국제 공개 제98/22588호, 61 내지 70면에서 토의된 바와 같다. 아데노바이러스의 추가적인 정제를 위해 많은 공정들이 기재되어 있으며, 크로마토그래피 단계들이 이 공정에 포함된다. 당업자라면 이러한 공정들을 알고 있을 것이며, 크로마토그래피 단계들을 이용하여 공정을 최적화하는 정확한 방법을 변화시킬 수 있다. 예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피 단계들에 의하여 아데노바이러스를 정제할 수 있으며, 예를 들어 국제 공개 제2005/080556호를 참조한다. 많은 다른 아데노바이러스 정제 방법들이 기재되어 있으며, 당업자의 역량 내에 있다. 아데노바이러스의 생산 및 정제를 위한 추가의 방법이 예를 들어 국제 공개 제00/32754호, 국제 공개 제04/020971호, 국제 공개 제2006/108707호, 및 미국 특허 제5,837,520호 및 미국 특허 제6,261,823호에 개시되어 있는데, 이들 전부는 본원에 참고로 포함된다.

인간에 투여하는 경우, 본 발명은 본 벡터 또는 재조합 바이러스, 예를 들어 rAd, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 이용할 수 있다. 본 맥락에서, 용어 "제약상 허용가능한"은 담체 또는 부형제가 이용되는 투여량 및 농도에서 이들이 투여되는 대상체에게 원하지 않거나 유해한 효과를 전혀 야기하지 않을 것임을 의미한다. 이러한 제약상 허용가능한 담체 및 부형제는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]]; 문헌[Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]]; 및 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]] 참조). 정제된 rAd는 바람직하게는 살균 용액으로 제형화되어 투여되지만 동결건조된 제제를 이용하는 것이 또한 가능하다. 살균 용액은 살균 여과에 의해 또는 본 기술 분야에 그 자체 공지된 다른 방법에 의해 제조된다. 이어서, 상기 용액은 동결건조되거나 약제 투약 용기에 채워진다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0 내지 9.5, 예를 들어 pH 5.0 내지 7.5의 범위이다. rAd는 전형적으로 적합한 완충액을 갖는 용액 내에 있으며, rAd의 용액은 염도 함유할 수 있다. 선택적으로 알부민과 같은 안정화제가 존재할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 세정제가 첨가된다. 특정 실시 형태에서, rAd는 주사가능한 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 제형들은 rAd의 유효량을 함유하고, 살균 액체 용액, 액체 현탁액 또는 동결건조된 버전 중 어느 하나이며, 선택적으로 안정화제 또는 부형제를 함유한다. 아데노바이러스 백신은 또한 비강내 투여를 위해 에어로졸화될 수 있다(예를 들어 국제 공개 제2009/117134호 참조).

예를 들어 아데노바이러스는 아데노바이러스 세계 표준용으로도 이용되는 완충액 내에 보관될 수 있다(Hoganson et al., 2002):20 mM 트리스 pH 8, 25 mM NaCl, 2.5% 글리세롤. 인간에게 투여하기에 적합한 또 다른 유용한 제형화 완충액은 20 mM 트리스, 2 mM MgCl₂, 25 mM NaCl, 수크로스 10%(w/v), 폴리소르베이트-80 0.02%(w/v)이다. 재조합 아데노바이러스에 적합한 또 다른 제형화 완충액은 10 내지 25 mM 시트레이트 완충액(pH 5.9 내지 6.2), 4 내지 6%(w/w) 히드록시프로필-β-시클로덱스트린(HBCD), 70 내지 100 mM NaCl, 0.018 내지 0.035%(w/w) 폴리소르베이트-80, 및 선택적으로 0.3 내지 0.45%(w/w) 에탄올을 포함한다. 명백하게는, 많은 다른 완충액들이 이용될 수 있으며, 정제된 (아데노)바이러스 제제들의 약학적 투여 및 보관을 위한 적합한 제형들의 몇 가지 예들은 공지되어 있으며, 이는 예를 들어 유럽 특허 제0853660호, 미국 특허 제6,225,289호 및 국제 공개 제99/41416호, 국제 공개 제99/12568호, 국제 공개 제00/29024호, 국제 공개 제01/66137호, 국제 공개 제03/049763호, 국제 공개 제03/078592호, 국제 공개 제03/061708호에서 발견될 수 있는 것을 포함한다.

특정한 실시 형태에서, 아데노바이러스를 포함하는 조성물은 하나 이상의 아쥬반트를 더 포함한다. 적용된 항원성 결정부위에 대한 면역 반응을 더 증가시키는 아쥬반트가 본 기술 분야에 알려져 있으며, 아데노바이러스 및 적합한 아쥬반트를 포함하는 제약 조성물들은 예를 들어, 본원에 참고로 포함되어 있는 국제 공개 제2007/110409호에 개시되어 있다. 용어 "아쥬반트" 및 "면역 자극제"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 면역계의 자극을 야기하는 하나 이상의 물질로서 정의된다. 이와 관련하여, 아쥬반트는 본 발명의 아데노바이러스 벡터들에 대한 면역 반응을 향상시키는 데 이용된다. 적합한 아쥬반트의 예는 수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄 염; MF59(예를 들어, 국제 공개 제90/14837호 참조)와 같은 스쿠알렌-물 에멀젼을 비롯한 오일-에멀젼 조성물(또는 수중유 조성물); 예를 들어 QS21 및 면역 자극 복합체(ISCOMS)(예를 들어, 미국 특허 제5,057,540호; 및 국제 공개 제90/03184호, 국제 공개 제96/11711호, 국제 공개 제2004/004762호, 국제 공개 제2005/002620호 참조)와 같은 사포닌 제형; 박테리아 또는 미생물 유도체(이의 예로는 모노포스포릴 지질 A(MPL), 3-O-탈아실화 MPL(3dMPL), CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드, ADP-리보실화 박테리아 독소 또는 이의 돌연변이체, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 열 불안정성 장독소 LT, 콜레라 독소 CT 등이 있음)를 포함한다. 예를 들어 관심의 대상이 되는 항원에의 C4-결합 단백질(C4bp)의 올리고머화 도메인의 융합물을 코딩하는 이종 핵산(Ogun, Dumon-Seignovert, Marchand, Holder, & Hill, 2008), 또는 dsRNA와 같은 TLR3 작용제와 같은 toll-유사 수용체(TLR) 작용제를 코딩하는 이종 핵산을 이용함으로써 벡터-코딩된 아쥬반트를 이용하는 것이 또한 가능하다. 본 발명에 따른 그러한 rAd는 예를 들어 양방향성 프로모터의 한쪽에 관심의 대상이 되는 항원, 및 양방향성 프로모터의 다른 한쪽에 TLR3 작용제를 코딩할 수 있다. 그러한 rAd는 점막 경로를 통한 투여, 예를 들어 경구 투여에 특히 적합하다(예를 들어 국제 공개 제2007/100908호 참조). 특정 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 아쥬반트로서 알루미늄을, 예를 들어 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 인산알루미늄칼륨, 또는 이의 조합의 형태로, 용량 당 알루미늄 함량 0.05 내지 5 mg, 예를 들어, 0.075 내지 1.0 mg의 농도로 포함한다.

다른 실시 형태에서, 조성물은 아쥬반트를 포함하지 않는다.

특정 실시 형태에서 본 발명에 따른 제약 조성물은 백신일 수 있다.

아데노바이러스 조성물들은 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 일 회 투여시 대상체에게 제공된 아데노바이러스의 총 용량은 당업자에게 알려진 바와 같이 변할 수 있으며, 일반적으로 1x10⁷개의 바이러스 입자(vp) 내지 1x10¹² vp, 바람직하게는 1x10⁸ vp 내지 1x10¹¹ vp, 예를 들어 3x10⁸ 내지 5x10¹⁰ vp, 예를 들어 10⁹ 내지 3x10¹⁰ vp이다.

아데노바이러스 조성물들의 투여는 표준 투여 경로를 이용하여 수행될 수 있다. 비제한적 실시 형태는 주사, 예를 들어 피내, 근육내 주사 등에 의한 것과 같은 비경구 투여, 또는 피하 또는 피하 또는 경피, 또는 점막 투여, 예를 들어 비강내, 경구 투여 등을 포함한다. 일 실시 형태에서 조성물은 근육내 주사에 의해, 예를 들어 팔의 삼각근 또는 허벅지의 외측 광근 내로 투여된다. 당업자는 백신에서 항원(들)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 조성물, 예를 들어 백신을 투여하기 위한 다양한 가능성을 알고 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체는 바람직하게는 포유류, 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스, 또는 비-인간 영장류, 또는 인간이다. 바람직하게는, 대상체는 인간 대상체이다.

하나 이상의 아데노바이러스 백신들의 하나 이상의 추가 투여(booster administration)를 제공하는 것이 또한 가능하다. 추가 백신 접종이 수행되면, 전형적으로, 그러한 추가 백신 접종은 조성물을 대상체에게 최초로 투여(그러한 경우에 있어서, '최초 백신 접종(priming vaccination)'이라고 지칭함)한 이후에 동일한 대상체에게 1 주와 1년 사이, 바람직하게는 2주와 4개월 사이의 어느 한 순간에 투여될 것이다. 대안적인 부스팅 요법에서, 상이한 벡터들, 예를 들어 상이한 혈청형의 하나 이상의 아데노바이러스, 또는 다른 벡터, 예컨대 MVA, 또는 DNA, 또는 단백질을 최초 또는 추가 백신 접종으로서 대상체에 투여하는 것이 또한 가능하다.

특허, 공개된 출원, 기술 문헌 및 학술 문헌을 포함할 수 있는 다양한 간행물이 명세서 전체에 걸쳐 괄호 안에 인용되고, 각각의 전체 인용은 본 명세서 끝에서 발견될 수 있다. 이들 인용된 간행물 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

실시예

추가의 설명 없이, 당업자라면 상기 설명 및 하기의 예시적인 방법 및 실시예를 사용하여 본 발명을 만들고 이용하고, 청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서 하기 실시예는 본 발명의 특정 실시 형태, 특징 및 장점을 구체적으로 나타내고, 어떠한 방식으로도 나머지 개시를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 단지 본 발명을 명확하게 하는 역할을 한다.

방법

세포 배양:

PER.C6^® 세포(Fallaux et al., 1998)를 10 mM MgCl₂가 보충된 10% 우태 혈청(FBS)을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에서 유지하였다.

pAdApt35 및 pshuttle26 플라스미드에서의 아데노바이러스 벡터 구축

상이한 양방향성 프로모터 구축물들을 pAdApt35(Vogels et al. 2007) 또는 pshuttle26 플라스미드 내로 클로닝하였다. Pshuttle26은 이전에 개시된 pAdapt26 플라스미드를 기반으로 하여 구축되었다(Abbink et al., 2007). Ad26 벡터 게놈의 우측 부분을 포함하는 2-Kb 단편을 합성하고, pAdApt26.Luc(이의 CMV 프로모터 내의 SpeI 부위를 먼저 단일 bp 치환의 도입에 의해 파괴하였음) 내로 서브클로닝하였다. 그 결과, Ad26 코스미드와의 상동 재조합에 의해 또는 Ad26 전장 게놈 플라스미드와의 상동 재조합에 의해 pshuttle26을 사용하여 아데노바이러스 벡터를 구축할 수 있다.

pAdapt35 및 pshuttle26 플라스미드는 하나의 프로모터 및 하나의 SV40 유래된 폴리A 신호를 포함하는 표준 단일방향성 발현 카세트만을 갖고 있기 때문에, 또 다른 트랜스진 + BGH 폴리A 신호를 배치하기 위한 제한효소 부위를 융합 PCR에 의해 부가하였다. SpeI, NotI - BGH polyA - EcoRI- 루시퍼라아제 - KpnI, SalI, AvrII를 포함하는 융합 PCR 생성물을 SpeI 및 AvrII 제한효소 부위를 통한 분자적 클로닝에 의해 올바른 배향으로 상기 플라스미드들 내로 삽입하였다. 그 결과, 단일방향성 hCMV 프로모터를 측면 제한효소 부위 AvrII 및 HindIII을 이용하여 양방향성 프로모터 서열에 의해 대체할 수 있었다. 트랜스진들을 한쪽의 HindIII 및 XbaI 제한효소 부위 및 다른 한쪽의 AvrII, SalI 또는 KpnI을 이용하여 양방향성 프로모터의 양측에 위치시켰다(도 3a). AvrII, SalI 또는 KpnI의 선택은 플라스미드 서열 내의 제한효소 부위들의 독특함에 의존적이었다. 상이한 양방향성 프로모터 구축물들을 포함하는 전 양방향성 발현 카세트들을 pShuttle26 플라스미드 내에 클로닝하고 pAdapt35 플라스미드로 옮겼다(SpeI 또는 NotI 및 XbaI 제한효소 부위를 이용함). Kozak 서열(5' GCCACC 3')을 각각의 ATG 개시 코돈 바로 앞에 포함시키고, 두 개의 종결 코돈(5' TGA TAA 3')을 각각의 코딩 서열의 말단에 부가하였다. 본원에 기술된 바와 같이, 재조합 아데노바이러스 및 벡터는 일반적으로 rAd 또는 rAd 벡터, 그리고 더 구체적으로 rAd35 또는 rAd26 및 관련 벡터로 지칭된다.

아데노바이러스의 생성, 감염 및 증식.

모든 아데노바이러스들을 상동 재조합에 의해 PER.C6 세포에서 생성하고, 이전에 기술된 바와 같이 생산하였다(rAd35에 대해: (Havenga et al., 2006); rAd26에 대해: (Abbink et al., 2007)). 간략하게는, 제조업체(Life Technologies)가 제공한 설명서에 따라 리포펙타민을 사용하여 PER.C6 세포를 rAd 벡터 코딩 플라스미드로 형질감염시켰다. rAd35 벡터의 구제를 위하여, pAdApt35 플라스미드 및 pWE/Ad35.pIX-rITR.dE3.5orf6 코스미드를 사용하였으며, 반면에 rAd26 벡터를 위해서는, pShuttle26 플라스미드 및 pWE.Ad26.dE3.5orf6 코스미드를 사용하였다. 세포를 완전 세포병변 효과(CPE) 1일 후 수확하고, 냉동-해동하고, 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, -20℃에서 보관하였다. 다음, 바이러스를 플라크 정제하고, 멀티웰 24 조직 배양 플레이트의 단일 웰에서 배양한 PER.C6 세포에서 증폭시켰다. T25 조직 배양 플라스크를 사용하여 배양한 PER.C6 세포에서 추가 증폭을 실시하였다.

발현 분석

발현의 능력 및 발현 균형을 평가하기 위하여, 강화 녹색 형광 단백질(eGFP 단백질 등록 번호 AAB02572.1) 및 반딧불이 루시퍼라아제(루시퍼라아제 단백질 등록 번호 ACH53166)를 코딩하는 리포터 유전자를 이용하여 바이러스 벡터를 생성하였다. 상대적 eGFP 평균 형광 강도(MFI) 및 루시퍼라아제의 상대적 광 단위(RLU)를 HEK293 세포(pAdApt 벡터 또는 pshuttle 벡터를 이용한 일시적 형질감염) 또는 A549 세포(바이러스 감염)를 이용하여 각각의 프로모터 및 리포터 유전자 조합에 대하여 기록하였다. 루시퍼라아제 활성을 Luminoskan™ Ascent 마이크로플레이트 광도계에서 0.1% DTT(1 M)의 존재 하에 세포 용해물에서 측정하였다. 세포 펠렛을 트립신 처리하고, 원심분리하고, PBS/1%FBS(비-바이러스 물질) 또는 CellFix(바이러스 물질)에 재현탁시킴으로써 유세포 분석법(FACS)에서 eGFP 형광을 측정하였다.

PER.C6 세포에서의 아데노바이러스 벡터의 유전자 안정성 테스트.

백신용 벡터의 유전자 안정성 테스트를 수행하여 생산 공정에서의 유전자 안정성을 보장하였는데, 상기 생산 공정은 PER.C6 세포에서의 몇 회의 계대를 포함한다. 백신용 재조합 벡터의 생성, 플라크 정제, 및 T25 포맷으로의 확장을 상기에 설명한 바와 같이 성취하였다. 간략하게는, 재조합 바이러스를 E1-상보성 세포주 PER.C6에서의 플라스미드 형질감염에 의해 생성하고, 플라크 정제하였다. 5개의 플라크를 멀티웰 24(MW24)로부터 T25 플라스크로의 규모 확대용으로 선발하였다. 후속적으로, 새로운 PER.C6 세포를 바이러스 계대수 13까지 T25 포맷에서 감염시켰다. 감염 2일 후 완전 세포병변 효과를 주는 소정의 감염 볼륨을 이용하여 바이러스의 증식을 수행하였는데, 이는 소급해 보면 rAd35의 경우 50, 그리고 rAd26의 경우 900의 세포당 바이러스 입자의 비의 범위 내에 있는 것으로 결정되었다. 바이러스 DNA를 p13 물질로부터 단리하고, PCR 분석에 의해 전 트랜스진 발현 카세트의 존재에 대하여 테스트하였다. 백신용 벡터를 PER.C6 세포에서 계대수 13까지 증식시켰다. 상기 증식은 감염 2일 후 완전 CPE를 제공하는 방식으로 수행하였다. rAd35 바이러스를 완전 CPE 2일 후 수확하였으며, 반면에 rAd26 바이러스는 완전 CPE 1일 후 수확하였다. 바이러스 DNA를 계대 2, 계대 5, 계대 10 및 계대 13에서 단리하고, 결실의 부재를 트랜스진 발현 카세트의 측면에 위치하는 프라이머들을 이용한 PCR 분석에 의해 테스트하였다. 결실 돌연변이체의 부재를 하기 파라미터에 의해 규정하였다:PCR 생성물의 밴드 크기가 양성 대조구(바이러스 구제에 사용한 플라스미드의 PCR 생성물)에 상응함, (불특정 PCR 생성물이 또한 양성 대조구에 존재하기 때문에 추가 밴드가 불특정 PCR 생성물인 것으로 나타나는 것이 아니라면) 예상되는 PCR 생성물 아래의 추가 밴드는 없음), 승인된 분석: PCR용 H₂O 대조구에서 밴드 없음. 유전자 안정성을 추가로 확인하기 위하여, 일부 플라크의 측면 영역들 + 발현 카세트의 PCR 생성물을 서열결정하였다.

실시예 1: 양방향성 프로모터 구축물의 설계

강력한 양방향성 마우스 CMV(mCMV) 프로모터는, 이전의 연구(국제 공개 제2016/166088호)에서 아데노바이러스 벡터의 E1 영역 내의 양방향성 발현 카세트로부터의 2가지 항원의 발현에 유용한 프로모터로 확인되었다. mCMV 양방향성 프로모터를 갖고 있는 벡터에 의해 발현된 항원들은 유전적으로 안정하고, 코딩된 둘 다의 항원에 대한 면역 반응을 유도한 반면, 항원 발현 및 유도된 면역 반응은 하기에 설명된 바와 같이 균형 잡힌 것이 아니었다. 상기 양방향성 프로모터의 우측에 위치된 항원의 발현이 상기 양방향성 프로모터의 좌측에 위치된 항원의 발현보다 더 높아서, 상기 양방향성 프로모터의 우측에 위치된 항원에 대한 면역 반응이 더 높았다. 양방향성 mCMV에 있어서의 발현 수준의 차이는 대략 10배였다. 그러나, 하나의 항원만을 발현하는 두 벡터들의 믹스를 대체하기 위하여, 특정 응용에 있어서, 균형 잡힌 양방향성 프로모터가 바람직한데, 이는 둘 다의 항원의 비견되는 항원 발현 수준을 유도한다.

강력하고 더 균형 잡힌 양방향성 프로모터를 확인하기 위하여, 새로운 양방향성 프로모터들의 패널을 설계하였다. 아데노바이러스 벡터의 전체 크기 제한으로 인하여 항원에 충분한 공간을 유지하기 위하여 최대 크기가 2 kB인 작은 크기를 갖는 양방향성 프로모터 설계가 바람직하다. 또한, 아데노바이러스 벡터에서의 상동 재조합에 의한 결실을 방지하기 위하여 서열 아이덴티티의 광범위한 스트레치를 포함하지 않는 빌딩 블록(15개 미만의 뉴클레오티드)이 바람직하다. 본 발명의 양방향성 프로모터들은 양방향 방식으로 유전자 발현을 지시하여 양방향성 프로모터 서열의 양측에 위치된 유전자들의 발현을 제어한다. 이러한 양방향성 프로모터들은 본원에 기술된 바와 같이 빌딩 블록들에 의해 정해지며 프로모터 요소들 외에 인핸서 요소들 및 인트론 요소들을 포함하는 연속 유전자 조절 서열들이다. 합성 양방향성 프로모터의 설계에 사용한 빌딩 블록은 공지된 강력한 단일방향성 프로모터, 인핸서 및 인트론 서열로부터 유래된다. 프로모터는 프로모터 서열의 하류에 위치된 하나의 유전자의 발현을 구동시키며, 전형적으로 TATA 박스 서열 및 전사 개시 부위(TSS)를 포함한다. 인핸서 서열은 프로모터로부터의 유전자 발현을 향상시킬 수 있다. 인트론 서열은 시험관 내에서, 그리고 특히 생체 내에서 유전자 발현을 증가시키는 것으로 기술되었다.

양방향성 프로모터 구축물들의 하기 패널을 설계하고 테스트하였다:

1. rCMV-hEF1α I (도 1a, 서열 번호 1)

2. rCMV- hEF1α II (도 1b, 서열 번호 2)

3. rhCMV-CAG1 (도 1c, 서열 번호 3)

4. hCMV - CAG4 (도 1d, 서열 번호 4)

5. rCMV-CAG (도 1e, 서열 번호 5)

6. rhCMV-CAG2 (도 1f, 서열 번호 6)

7. rCMV bidir 1 (도 1g, 서열 번호 10)

8. rCMV bidir 2 (도 1h, 서열 번호 8)

9. rCMV bidir 1.1 (도 1i, 서열 번호 7)

다른 양방향성 프로모터 구축물들이 이전의 특허 출원(국제 공개 제2016/166088호)에서 또한 테스트되었다 :

1. mCMV bidir.

2. hCMV-CAG

3. mCMV-CAG

양방향성 프로모터의 설계 및 이의 빌딩 블록의 개략도가 도 1에 도시되어 있으며 하기에 더 상세하게 기술되어 있다:

상이한 설계들에서 사용한 프로모터 및 인핸서 빌딩 블록은 사이토메갈로바이러스 급초기(IE) 영역(전형적으로 본원에서 hCMV 프로모터 및 hCMV 인핸서로 지칭되며, 때때로 hCMV IE로도 지칭됨), 닭 베타 액틴/토끼 베타 글로빈 프로모터 서열 및 인간 신장 인자 1 α 프로모터(hEF1α 프로모터) 서열로부터 유래된다. 인트론은 키메라 닭 베타 액틴/ 토끼 베타 글로빈 서열, hEF1α 제1 인트론 및 인간 아포리포단백질 A-1 인트론(hApoA1 인트론)으로부터 유래된다.

인간 사이토메갈로바이러스 주요 급초기 프로모터는 다양한 포유류 세포주에서 강력한 프로모터로 공지되어 있다(Boshart et al., 1985). hCMV 및 기타 헤르페스바이러스는 세 시기, 즉 급초기(IE), 초기 및 말기의 유전자를 발현한다. 주요 급초기 프로모터는 다양한 포유류 세포주에서 이종 유전자를 고수준으로 활성화시킨다.

인간 사이토메갈로바이러스 주요 급초기 프로모터 및 인핸서가 트랜스진 발현 카세트의 설계에서 가장 빈번하게 사용되는 반면(Addison, Hitt, Kunsken, & Graham, 1997; C. Harro et al., 2009), 마우스(mCMV)(Addison et al., 1997; Chatellard et al., 2007; C. Harro et al., 2009), 래트(rCMV)(Sandford & Burns, 1996; Voigt, Sandford, Hayward, & Burns, 2005) 및 레수스 원숭이(rhCMV) (Barry, Alcendor, Power, Kerr, & Luciw, 1996; Chan, Chiou, Huang, & Hayward, 1996; Chang et al., 1993; Hansen, Strelow, Franchi, Anders, & Wong, 2003)와 같은 다른 종을 감염시키는 사이토메갈로바이러스의 주요 급초기 프로모터 및 인핸서가 또한 공지되어 있으며 강력한 발현 카세트의 설계에서 사용될 수 있다. 또한 hEF1α 프로모터가 포유류 세포에서의 이종 유전자 발현을 위한 강력한 프로모터 서열인 것으로 기술되어 있다(Kim, Uetsuki, Kaziro, Yamaguchi, & Sugano, 1990).

hCMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터(A) 및 닭 베타 액틴 / 토끼 베타 글로빈 인트론 (G) 서열 하이브리드로 이루어진 키메라 프로모터 CAG는 이종 유전자의 발현을 위한 강력한 프로모터인 것으로 기술되어 있으며, 축소될 수 있고 항원의 발현에 이용될 수 있다(Richardson et al., 2009). Richardson 등의 연구는 상기 하이브리드 인트론이 유의하게 축소된 Δ829CAG 프로모터 버전을 생성하는 CAG 프로모터의 변형을 기술하고 있다. 이러한 Δ829CAG 프로모터 버전(hCMV 인핸서를 포함하지 않음(Δ829AG))을 양방향성 프로모터의 설계를 위한 빌딩 블록으로 사용하고, 도면에서 AG 부분으로 나타냈지만 양방향성 프로모터의 명칭에서 CAG로 지칭하고 텍스트 전체에 걸쳐 CAG 또는 AG로 지칭하였다.

하기에서, 양방향성 프로모터 서열을 설계하기 위한 빌딩 블록들의 배치를 설명한다:

축소된 AG 프로모터 및 hEF1α 프로모터는 기술된 강력한 조절 서열의 중요 부분으로서 인트론을 갖는다. AG 프로모터 또는 hEF1α 프로모터를 양방향성 프로모터 설계에서 사용할 경우, 양방향성 프로모터 설계의 반대쪽에 이종 인트론 서열을 또한 배치하였다. rCMV 급초기 프로모터의 상이한 잠재적 양방향성 프로모터 설계들을 마우스 CMV 프로모터의 천연 양방향성을 기반으로 하여 만들었다.

hEF1α 유래된 인트론 및 mCMV 프로모터 서열의 합성에 의한 조합이 강력한 조절 서열을 생성함이 이전에 기술되어 있었다. 따라서, hEF1α 서열을 rCMV 프로모터(mCMV와 같은 뮤로메갈로바이러스로부터 유래된 또 다른 프로모터)의 요소 및 인핸서와 조합하여 양방향성 프로모터 서열 rCMV- hEF1α I 및 rCMV- hEF1α II를 설계하였다(예를 들어, 도 1a 및 도 1b 참조). hEF1α 인트론은 발현 수준을 증가시키는 것으로 기술되어 있지만 매우 긴 서열이기 때문에, 본 발명자의 설계는 hEF1α 인트론 서열을 유의하게 축소시키려는 것이었으며, 이는 CAG 프로모터에 대한 실험적 접근법에 의해 설명된 바와 같다(Richardson et al., 2009). 이것을 위하여, 인트론 서열의 부분을 제거하는 한편 기술된 스플라이스 공여자, 스플라이스 수용자 및 추정 분기점 부위 + 기술된 세포 인자 결합 부위는 보존하였다. 프로모터 / 인트론 조합 hEF1α I이 프로모터 / 인트론 조합 hEF1α II보다 더 많은 부위가 보존된 2가지 상이한 버전의 축소된 인트론을 설계하여 양방향성 프로모터 rCMV- hEF1α I 및 rCMV- hEF1α II를 생성하였다.

추가의 양방향성 프로모터 설계는 레수스 CMV(rhCMV), 래트 CMV(rCMV) 및 인간 CMV(hCMV)를 포함하여 상이한 종들로부터 유래된 사이토메갈로바이러스 주요 급초기 프로모터의 인핸서 및 프로모터 서열과 조합된 축소된 AG 프로모터를 기반으로 한다. 이러한 양방향성 프로모터는 rhCMV-CAG1, rhCMV-CAG2, hCMV-CAG4 및 rCMV-CAG로 칭해진다. rhCMV-CAG1과 rhCMV-CAG2 사이의 차이는 rhCMV 인핸서 서열의 배향이다.

합성 양방향성 프로모터 설계 외에, rCMV mIE 영역으로부터 유래된 잠재적 천연 양방향성 프로모터를 양방향성 프로모터 서열 rCMV bidir 1 및 rCMV bidir 2 및 rCMV bidir 1.1을 위한 기반으로 사용하였다. 모든 3가지 양방향성 프로모터 설계는 추정 최소 rCMV 프로모터 및 추정 최소 rCMV vOX2 프로모터(rCMV 인핸서 서열 측면에 위치함)를 갖는 한편, 상기 설계들은 인핸서 단편의 길이 및 인핸서 단편의 배향이 상이하다. vOX2 프로모터는 MIE 영역의 바로 우측의 래트 세포 CD200(vOX2) 유전자의 전사를 구동시킨다(Voigt et al., 2005).

실시예 2: 리포터 유전자들의 강력하고 균형 잡힌 발현을 위한 상이한 프로모터 구축물들의 스크리닝

제1 스크리닝 실험에서, 정량적 능력 판독을 위하여 리포터 유전자인 루시퍼라아제 및 eGFP를 사용하여 HEK293에서의 일시적 형질감염에 의해 상이한 양방향성 프로모터 구축물들로부터의 발현을 평가하였다. pAdapt35 플라스미드의 일시적 형질감염을 위하여, 양방향성 프로모터는 양방향성 프로모터의 좌측에 루시퍼라아제 트랜스진, 그리고 우측에 eGFP 트랜스진을 가졌다.

상이한 양방향성 프로모터 설계들을 갖는 플라스미드들을 이용하여 3가지의 독립적인 형질감염 실험을 수행하였다. 실험 1(도 2a)에서, 프로모터 rCMV bidir.2, rCMV- hEF1α II, rhCMV- hEF1α I 및 rhCMV-CAG1을 테스트하였다. rCMV bidir.2, rCMV-EF1 α II 및 rhCMV-CAG1은, 단일방향성 대조구를 갖는 hCMV 프로모터(서열 번호 9)보다는 덜 강력하다 해도, 변함없이 양방향성 프로모터 기능을 나타내지만, rCMV- hEF1α I은 eGFP 발현에 대해서는 음성 대조구보다 큰 프로모터 능력은 나타내지 않고 루시퍼라아제 발현에 대해서는 매우 불량한 프로모터 능력을 나타낸다. 실험 1에서 rhCMV-CAG1은 가장 강력한 양방향성 프로모터이지만, eGFP 및 루시퍼라아제 둘 다는 강력한 단일방향성 hCMV 프로모터에 의해 구동되는 각각의 양성 대조구보다 더 낮은 수준으로 발현된다. 스크리닝 실험 2(도 2b)에서, 프로모터 rCMV bidir.1.1, rCMV-CAG 및 hCMV-CAG4를 테스트하였다. rCMV bidir.1.1 프로모터는 양측에서 낮은 프로모터 능력 내지 검출불가능한 프로모터 능력을 나타냈다. rCMV-CAG는, hCMV 단일방향성 대조구보다 더 낮기는 하지만, 양방향성 프로모터 능력을 나타낸다. 이와는 대조적으로, 그리고 놀랍게도, hCMV-CAG4는 hCMV 단일방향성 대조구에 비견되는, 좌측 및 우측 둘 다에서 더 높은 능력을 갖는 강력한 양방향성 프로모터이다. 제3 스크리닝 실험에서, rhCMV-CAG2 및 rCMV bidir.1을 hCMV-CAG4와 함께 테스트하였다. 테스트한 양방향성 프로모터 구축물들의 세트로부터 hCMV-CAG4를 가장 유망한 후보로 확인하였다. 상이한 단일방향성 프로모터 빌딩 블록들로 이루어진 다른 합성 양방향성 프로모터 설계들은 양호한 양방향성 프로모터 기능을 나타냈지만, 리포터 유전자들의 발현은 단일방향성 hCMV 프로모터 대조구에 의해 구동된 것보다 더 낮았다. 마우스 CMV 양방향성 프로모터에 비견되는, rCMV 급초기 프로모터를 양방향성 프로모터로서 설계할 수 있지만, 이는 덜 강력하다. 그 결과는 빌딩 블록들의 어느 조합이 양방향성 프로모터의 양호한 기능성(양방향으로 강력한 발현, 즉, hCMV 단일방향성 프로모터의 제어 하의 발현과 유사)을 제공하는지는 예측불가능함을 보여준다.

빌딩 블록들의 아이덴티티 및 배향에 대한 주석을 포함하는 hCMV-CAG4의 개략도가 도 3에 도시되어 있다. 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 우측은 Richardson 등에 의해 개시된 축소된 CAG 프로모터 부분으로 이루어지며, 이는 닭 베타 액틴 인트론을 포함하고 hCMV 인핸서 부분은 배제된다. 그러나 hCMV 인핸서 부분은 hCMV 인핸서를 포함하는 hCMV 프로모터로 이루어진 양방향성 프로모터의 좌측을 가리키는 배향으로 역전되어 존재한다. 상기 프로모터의 우측에서의 내재성 인트론의 존재에 더하여, 인간 아포리포단백질 A-1(hApoA1) 유래의 짧은 이종 인트론을 양방향성 프로모터의 좌측에 위치시켰다. 여기서 "좌측" 및 "우측"이라는 용어는 설명의 용이함을 위하여 사용되는 반면, 당업자라면 양방향성 프로모터 구축물이 또한 돌려져서 반대 배향으로 사용될 수 있음을 즉각적으로 인식할 것이다. hCMV-CAG4 프로모터는, 약 1.4 kb의 그의 상대적으로 작은 크기에 의해, 재조합 아데노바이러스 벡터에서 양방향성 프로모터로 사용하기에 매우 적합하다.

실시예 3: hCMV - CAG4 발현 카세트를 갖는 아데노바이러스 벡터로부터의 트랜스진 발현의 능력 및 균형

아데노바이러스 벡터의 E1 영역으로부터의 발현의 능력 및 균형을 추가로 평가하기 위하여, E1 영역 내에 hCMV-CAG4 양방향성 발현 카세트를 갖는 Ad26 및 Ad35 벡터를 생성하였다. 4가지 상이한 벡터, viz. Ad26.eGFP.hCMV-CAG4.Luc, Ad26.Luc.hCMV-CAG4.eGFP, Ad35.eGFP.hCMV-CAG4.Luc 및 Ad35.Luc.hCMV-CAG4.eGFP를 생성하여, 비-상보성 A549 세포의 형질도입시의 리포터 유전자 발현의 능력 및 균형을 평가하였다. 형질도입을 100 VP/세포 및 1000 VP/세포로 수행하였다. 상기 둘 다의 VP/세포 비에서의 결과는 유사하였기 때문에, 1000 VP/세포의 형질도입에 대한 결과만을 도 3에 도시한다. 100 VP/세포 및 1000 VP/세포의 발현에서의 10배 차이를 추산하기 위하여, 단일방향성 hCMV 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자들을 발현하는 양성 대조 벡터 Ad.Luc 및 Ad.eGFP의 형질도입이 예시되어 있다. 패널 4a는 hCMV-CAG4가 Ad26 E1 양방향성 발현 카세트로부터의 상기 둘 다의 리포터 유전자의 강력한 발현을 유도함을 보여주며, 이때 발현 수준은 Ad26.Luc 및 Ad26.eGFP 대조 벡터로부터의 발현 수준에 비견되거나 이보다 약간 더 낮았다(1000 VP/세포에서). Ad26.Luc.hCMV-CAG4.eGFP는 추가로 직접적으로 Ad26.Luc.mCMV bidir.eGFP와 비교되며, mCMV bidir.과 비교하여 eGFP의 감소된 트랜스진 발현을 나타내지만, 또한 전체적으로 더 균형 잡힌 트랜스진 발현을 나타낸다. 패널 4b는 Ad35 벡터에서의 hCMV-CAG4 양방향성 발현 카세트로부터의 트랜스진 발현을 나타낸다. 흥미롭게도, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터의 CAG쪽에 의해 구동된 발현은 Ad26 벡터에서보다 Ad35 벡터에서 더 감소된 것으로 보인다. 따라서, 강력한 양방향성 프로모터는 상이한 혈청형들로부터 유래된 rAdV에서 사용될 수 있는 반면, 상이한 프로모터가 하나의 rAdV에서 또 다른 것에 비하여 사용에 최적일 수 있으며, 이는 프로모터 및 발현 카세트의 복합한 설계가 최적 바이러스 벡터에 요구됨을 추가로 예시하는 것이다.

실시예 4: E1 영역 내에 hCMV - CAG4 양방향성 발현 카세트를 갖는 아데노바이러스 벡터의 유전자 안정성 테스트

트랜스진 발현 외에, AdV 생성 동안의 유전자 안정성이 2가지 항원을 발현하는 유용한 AdV에 있어서 중요한 파라미터이다. 따라서, 유전자 안정성을 이전의 출원, 국제 공개 제2016/166088호에 기술된 바와 같이 테스트하였다. 간략하게는, 벡터 Ad26.Luc.hCMV-CAG4.eGFP 및 Ad26.eGFP.hCMV-CAG4.Luc를 PER.C6 세포에서의 플라스미드 형질감염에 의해 생성하고, 바이러스 집단을 플라크 피킹(picking)에 의해 단리하였다. 벡터당 10개의 플라크를 바이러스 계대수(vpn) 3까지 증식시켰다. 거기서부터 5개의 플라크를 vpn 13까지의 연장된 계대를 위하여 선발하였다. E1 발현 카세트 영역(도 4), 및 E3 및 E4 영역(E3 및 E4 PCR의 데이터는 예시되어 있지 않음)에서의 아이덴티티 PCR에 의해 유전자 안정성을 평가하였다. 작은 결실 또는 점돌연변이의 부재를 vpn 13의 E1 PCR 생성물의 표준 생어(Sanger) 서열결정에 의해 확인하였다. Ad26.Luc.hCMV-CAG4.eGFP 및 Ad26.eGFP.hCMV-CAG4.Luc 둘 다의 5개의 플라크 중 5개가 vpn 13까지 유전적으로 안정한 채로 있었다. 주목할 만하게는, 일부 추가 밴드가 겔 사진에서 보이는데, 이는 결실 밴드를 나타내는 것이 아니라 고도 GC 풍부 GAG 프로모터 서열에 의해 야기되는 불특정 PCR 밴드를 나타낸다.

결론

위에 기술된 바와 같이, 새로운 양방향성 프로모터 구축물들의 패널을 스크리닝함으로써, 양방향성 프로모터 구축물들이 원하는 프로모터 특성을 제공한다는 것은 예측불가능한 것으로 결정되었다. 실제로, 심지어 매우 유사한 것으로 보이는 양방향성 프로모터 구축물들도 반드시 동일 결과를 제공할 필요는 없다. 예를 들어, 좌측에 인간 CMV 프로모터, 그리고 우측에 CAG 프로모터를 갖는 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 rAd26 및 rAd35 벡터의 E1 영역으로부터의 2가지 상이한 트랜스진들의 발현의 능력 및 균형 둘 다에 있어서 특히 양호한 결과를 나타냈다. 선험적으로 hCMV-CAG4와 매우 유사한 것으로 여겨진 테스트한 구축물들은 rhCMV-CAG2 및 rCMV-CAG를 포함하였다. 이러한 구축물들은, 상이한 종들로부터 유래된 것이기는 하지만 좌측에 CMV 프로모터 부분을 또한 가지며, 우측에 CAG 프로모터 부분을 또한 갖는다. 이러한 구축물들이 코딩된 리포터 유전자들의 대등한 발현을 나타냈지만, 놀랍게도 상기 발현은 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터로부터의 발현보다 덜 강력하면서도 덜 균형 잡힌 것이었다. 더욱이, 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터를 갖는 rAd는 심지어 PER.C6 세포에서의 P13까지의 연속 계대 후에도 유전적으로 안정한 것으로 결정되었다. 따라서, 예기치 못하게, 본 발명의 양방향성 hCMV-CAG4 프로모터는 균형 잡히고 강력한 발현이 요망되는 유전자 요법 또는 백신에서 사용될 수 있는 재조합 바이러스 벡터에서 사용하기에 놀랍도록 바람직한 특성을 갖는 프로모터이다.

참고 문헌

미국 특허 문서:

유럽 특허 문서:

국제 특허출원 공보:

기타 참고 문헌:

책

저널

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Vaccines & Prevention B.V. <120> Potent and Balanced Bidirectional Promoter <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1769 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCMV-hEF1a I <400> 1 cacggccaag gtcagcaccg cagcttttat cctgaagggc cgtgggggac ctggaggaga 60 agaagggcct ggctgagtgg gtgccttcag tatgcagaag ccccgtgctc cccgaactca 120 gttgcagcca ggtgaggaga agggcacaga gcgggagaag acctcaggta ccagaggccc 180 ggcctggggc aaggcctgaa ccttgagctg gggagccaga gtgaccgggg caggcagcag 240 gacgcacctc cttctcgcag tctctaagca gccagctctt gcagggccta tttatgtatc 300 cgaagactgt gactgcccga acggcgttag gagatttata cctacgtctg acggtcatcg 360 tccaatagaa atcggagttt tgtaggtcat ctgtggggat tttccacagt ttagacgaaa 420 aattggcaga aaaaccagac cagatgtcga ggtcatctga gtcaacgtga ctcttatgca 480 gtttcggtgt ccttaacgag cgggcgtcac gtattctcag aataagagga acataaaatg 540 acaaagtctg caattaaaat tagagaaata agcagaaaca gatggtaggt cgttgacttt 600 tggctgactt atgaggtttc tatggagatt tggcttacaa tgttgctgaa ttgggtgttt 660 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1635 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCMV-CAG <400> 5 cacggccaag gtcagcaccg cagcttttat cctgaagggc cgtgggggac ctggaggaga 60 agaagggcct ggctgagtgg gtgccttcag tatgcagaag ccccgtgctc cccgaactca 120 gttgcagcca ggtgaggaga agggcacaga gcgggagaag acctcaggta ccagaggccc 180 ggcctggggc aaggcctgaa ccttgagctg gggagccaga gtgaccgggg caggcagcag 240 gacgcacctc cttctcgcag tctctaagca gccagctctt gcagggccta tttatgtatc 300 cgaagactgt gactgcccga acggcgttag gagatttata cctacgtctg acggtcatcg 360 tccaatagaa atcggagttt tgtaggtcat ctgtggggat tttccacagt ttagacgaaa 420 aattggcaga aaaaccagac cagatgtcga ggtcatctga gtcaacgtga ctcttatgca 480 gtttcggtgt ccttaacgag cgggcgtcac gtattctcag aataagagga acataaaatg 540 acaaagtctg caattaaaat tagagaaata agcagaaaca gatggtaggt cgttgacttt 600 tggctgactt atgaggtttc tatggagatt tggcttacaa tgttgctgaa ttgggtgttt 660 ccatagtgaa atgaccttaa tagttgcttt atttggcata gtcatagtga cttggcctta 720 aaagttgctt aactcgatat attttggtca aagaagttgc aaaacgggcc gttcccatag 780 cgatttcccg ggaaatcgtc 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<211> 1655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rhCMV-CAG2 <400> 6 cacggccaag gtcagcaccg cagcttttat cctgaagggc cgtgggggac ctggaggaga 60 agaagggcct ggctgagtgg gtgccttcag tatgcagaag ccccgtgctc cccgaactca 120 gttgcagcca ggtgaggaga agggcacaga gcgggagaag acctcaggta ccagaggccc 180 ggcctggggc aaggcctgaa ccttgagctg gggagccaga gtgaccgggg caggcagcag 240 gacgcacctc cttctcgcag tctctaagca gccagctctt gcagggccta tttatgtctt 300 ggcaagctct atccgcattc caatgcaccg tccccggcta tggaggctgg atcggtcccg 360 gtctcttcca atggagctcc tccgacgtcc ccaggcagaa tggcggttcc ctaaacgagc 420 attgcttata tagacctccc attaggcacg cctaccgcca tttacgtcaa tggaacgccc 480 atttgcgtca ttgccccttc ccattgacgt caatggggat gttgtacttg gcagccatgc 540 cgggccattt accgccattg acgtcaatgg gagtacctgc caatgtaccc ttggcgtact 600 tgccaatagt aatgtacttg ccaagttact attaatagat attgatggta ccatcgatgg 660 ccgcattgaa ttggcatggt gccaataatg gcggccatat tggctatatg ccaggatcaa 720 tatataggca atatccaata tggccctatg ccaatatggc tattggccag gttcaatact 780 atgtattggc 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Claims (16)

1. 하나의 방향으로 제1 트랜스진에, 그리고 반대 방향으로 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 4의 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 양방향성 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 양방향성 프로모터는 서열 번호 4의 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 트랜스진과 제2 트랜스진은 상이하며, 이들 중 적어도 하나는 항원을 코딩하는 재조합 핵산 분자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 또는 재조합 바이러스.
5. 제4항에 있어서, 플라스미드 벡터인 재조합 벡터.
6. 제4항에 있어서, 아데노바이러스인 재조합 바이러스.
7. 제6항에 있어서, E1 영역에서의 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 인간 아데노바이러스 혈청형 35 또는 인간 아데노바이러스 혈청형 26인 재조합 아데노바이러스.
9. 아데노바이러스가 표적 세포를 감염시킬 때 각각이 강력하게 발현되는 제1 트랜스진 및 제2 트랜스진을 포함하는 유전적으로 안정한 재조합 아데노바이러스를 제조하는 방법으로서,
   a) 하나의 방향으로 제1 트랜스진에, 그리고 반대 방향으로 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제1항의 양방향성 프로모터를 포함하는 구축물을 제조하는 단계; 및
   b) 상기 구축물을 재조합 아데노바이러스의 게놈 내로 포함시키는 단계를 포함하는, 방법.
10. 제9항에 있어서, 재조합 아데노바이러스는 그의 게놈의 E1 영역에서의 결실을 갖는 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 제1 트랜스진과 제2 트랜스진은 상이하며, 이들 중 적어도 하나는 항원을 코딩하는 방법.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 35 또는 인간 아데노바이러스 혈청형 26인 방법.
13. 세포에서 2가지 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법으로서, 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터 또는 재조합 바이러스를 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
14. 2가지 이상의 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 대상체에게 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터 또는 재조합 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
15. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스의 게놈을 포함하는 재조합 DNA 분자.
16. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터 또는 재조합 바이러스 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.

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