CN116218844A - 一种双向启动子及其过表达载体、慢病毒表达质粒和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因工程技术领域，提供了一种双向启动子及其过表达载体、慢病毒表达质粒和应用，所述双向启动子包括第一启动单元和第二启动单元，分别与所述第一启动单元和第二启动单元连接的外源基因的延伸方向从5′至3′相反；或所述双向启动子由以下启动子元件组成：启动子EF1、增强子CMV enhancer和启动子CBH，在所述增强子CMV enhancer的序列中插入有Poly（A）序列，分别与所述启动子EF1和启动子CBH连接的外源基因的延伸方向从5′至3′相反。本申请双启动子构建的慢病毒表达质粒具有启动平衡和滴度高的特点。
Description
技术领域
本申请属于基因工程技术领域，特别是一种双向启动子及其过表达载体、慢病毒表达质粒和应用。
背景技术
启动子(Promoter)是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，能够与RNA聚合酶和其它转录因子结合并进而调节其下游目的基因转录起始和转录效率。启动子在用于设计和制备基因工程产品和基因治疗药物等方面，具有重要的应用价值。
基因治疗(genetherapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的，因此操纵基因表达、基因治疗等都是从构建质粒载体开始。慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的一种病毒载体，可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。慢病毒载体具有携带的外源基因在宿主中表达时间长、毒性低、可携带的外源基因片段大、不易诱发宿主免疫反应等优点，是一种理想的基因转移载体，已经被广泛的应用于基因治疗、疫苗生产、转基因动物、基因敲除、药物研究、生产目的蛋白细胞系等科学研究领域，如CAR-T(嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)需要使用慢病毒感染T细胞，科研中使用慢病毒作为工具病毒构建细胞系。然而慢病毒因其为RNA病毒，难以添加稳定RNA结构的polyA(多聚腺苷酸)序列，导致其载体容量有限，当需要表达两个基因时，如果使用两个启动子，启动子可能直接互相干扰而影响基因的表达，存在重组病毒的滴度低的缺陷，难以达到体内应用的需求。而选择使用IRES或2A连接基因，总有表达不稳定，添加额外蛋白序列的问题。具体为：①使用IRES串联2个基因，IRES引入了一个新的核糖体结合位点，以不依赖帽的方式翻译第二个基因，然而IRES导致第二个基因的表达降低。②使用2A序列连接两个基因，2A肽会自解离断裂为2个蛋白，然而2A序列会在第一个蛋白后额外添加序列，为了去除多余的氨基酸，可以将弗林蛋白酶切割位点整合到2A序列中，然而仍有不完全切割的风险。
基于慢病毒载体表达两个基因存在的缺陷，利用双向启动子将是一种比较理想的解决方案。双向启动子(BidirectionalPromoter)属于一种特殊类别的启动子，是位于两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段DNA序列。由于其具有能够同时驱动其两侧邻近的排列方向相反的两个基因的转录，相比传动的单向启动子，不仅可以实现单个外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，还可以同时实现两个外源基因或外源的shRNA在宿主体内的表达，因此，在慢病毒载体中利用双向启动子进行两个基因的表达则可以有效的避免IRES或2A连接基因带来的表达缺陷。
但是申请人发现在普通载体中表现良好的双向启动子在慢病毒中具有出毒效率低的问题，主要原因可能是慢病毒为RNA病毒，病毒包装过程与双向启动子的启动有冲突有关。因此，提供一种能够平衡调控相反转录方向的两个基因表达的双向启动子，对于双基因慢病毒载体在基因工程产品和基因治疗药物中的应用具有重要的推动作用。
发明内容
针对现有技术的双向启动子在慢病毒载体的应用中存在病毒滴度低的缺陷，本申请的目的旨在提供一种双向启动子及含有该双向启动子的慢病毒表达质粒，该慢病毒表达质粒在双向启动子的作用下，可以同时以相反的方向转录表达两个目的基因，该慢病毒表达质粒具有启动平衡和滴度高的特点。另外该双向启动子及含有其的慢病毒表达质粒在基因工程产品和基因治疗药物中的应用也在本申请的范围之内。
为了达到本申请的技术目的，本申请具体通过以下技术方案实现：
作为本申请的第一个实施方案，提供了一种双向启动子，所述双向启动子的结构如a)或b)：
a)所述双向启动子包括第一启动单元和第二启动单元，分别与所述第一启动单元和第二启动单元连接的外源基因的延伸方向从5′至3′相反；
所述第一启动单元由以下启动子元件组成：启动子CMV、增强子CMV enhancer和启动子EF1；所述增强子CMV enhancer位于启动子CMV转录方向的上游；
所述第二启动单元为启动子EF1；
所述第一启动单元和第二启动单元之间插入有相互连接的pause site终止转录元件和Poly(A)元件，所述pause site终止转录元件的另一侧连接至所述增强子CMVenhancer，所述Poly(A)元件的另一侧连接至所述启动子EF1。
b)所述双向启动子由以下启动子元件组成：启动子EF1、增强子CMV enhancer和启动子CBH，在所述增强子CMV enhancer的序列中插入有Poly(A)序列，分别与所述启动子EF1和启动子CBH连接的外源基因的延伸方向从5′至3′相反。
在上述方案中，申请人通过在启动子中插入Poly(A)和/或pau se site终止转录元件中的一种或两种，实现了在慢病毒载体中双外源基因的表达平衡，使得连接于所述双向启动子两侧的相同或不同外源基因的表达互相不产生影响，且对外源基因的表达量相比现有技术的双向启动子具有显著的提高。
进一步的，上述a)结构的双向启动子的核苷酸序列如下(a1)或(a2)所示：
(a1)具有如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
(a2)将(a1)中所述DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
上述b)结构的双向启动子的核苷酸序列如下(b1)或(b2)所示：
(b1)具有如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
(b2)将(b1)中所述DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子。
在本实施方案中，在表达载体构建过程中，所述双向启动子的两侧可操作的连接待表达的外源基因，所述双向启动子两侧的外源基因可相同或不同，且与启动子不存在固定的对应关系，两个所述外源基因的延伸方向彼此远离。
在本实施方案中，上述任一种所述双向启动子的核苷酸序列可用于设计和制备基因工程产品和基因治疗药物。具体的，将外源基因和报告基因分别克隆连接于所述双向启动子两侧，位于启动子的下游，并连接至出发载体，转化至合适的宿主细胞，使外源基因表达，以制备基因工程产品或基因治疗药物；或将不同的外源基因分别克隆连接于所述双向启动子两侧，位于启动子的下游，并与不同的出发载体连接，转化至合适的宿主细胞，使外源基因表达，以制备基因工程产品或基因治疗药物。
在本实施方案中，所述外源基因可以是任何目的基因或报告基因，具体的，所述外源基因可以是表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF2、睫状细胞因子CNTF、GDNF、BDNF、LEDGF、EPO、NT-3、NT-4、RdCVF、白介素等，也可以是氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β半乳糖苷酶、荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、荧光蛋白(GFP、BFP、RFP)等。
作为本申请的第二个实施方案，提供了一种包含上述双向启动子的过表达载体，通过将所述双向启动子可操作的插入于出发载体得到，转化至感受态细胞，筛选并挑取单菌落提取质粒既得所述过表达载体。
在本实施方案中，所述出发载体是指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子，是一种人工创建的核酸分子，其适用于目标核苷酸序列的操作、增殖和/或表达。该出发载体具有复制起始位点，能使插入的外源目的基因或DNA片段在宿主细胞内进行独立并且稳定的自我复制，以及在DNA复制的非必需区具有多种限制酶的单一识别位点，能被各种限制酶所识别并插入外源DNA片段。
具体的，所述出发载体可通过质粒、人工染色体、噬菌粒、粘粒或遗传改造的病毒构建，然而并不局限于此。
在本实施方案中所述出发载体优选为通过慢病毒载体构建。所述慢病毒载体是以灵长类免疫缺陷病毒为来源的病毒载体，例如可以是重组人免疫缺陷病毒载体(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)或重组猴免疫缺陷病毒载体(simian immunodeficiencyvirus，SIV)；或所述慢病毒载体是以非灵长类免疫缺陷病毒为来源的病毒载体，例如可以是重组马感染性贫血病毒(equine infectious anemia virus，EIAV)或重组猫科免疫缺陷型病毒(feline immunodeficiency virus，FIV)或重组羊关节炎脑炎病毒(caprinearthritis-encephalitis virus，CAEV)。
所述的人免疫缺陷病毒(HIV)载体是指病毒颗粒中的核酸分子内，作为病毒载体功能所必需的序列为HIV基因组由来序列的载体。进一步的，人免疫缺陷病毒包括有HIV的所有株以及其亚型，主要分为HIV-1和HIV-2两种毒株，其中，HIV-1分为M、O、N亚型组，M亚型组包括A、A2、B、C、D、E、F1、F2、G、H、J、K亚型；HIV-2分为A、B、C、D、E、F、G亚型，它的生物学特性与HIV-1相似，但毒力较弱。
所述的猴免疫缺陷病毒(SIV)载体是指在病毒颗粒中的核酸分子内，作为病毒载体功能所必需的序列为SIV基因组由来序列的载体。猴免疫缺陷病毒包括含有SIV基因的所有株以及其亚型。作为SIV单离株来说，可以例举出SIVagm、SIVcpz、SIVmac、SIVmnd、SIVsm、SIVsnm、SIVsyk等，但并不仅仅局限于这些病毒株。
另外，在一些实施方案中，并不排除所述出发载体还可以是腺病毒相关病毒(AAV)载体、嵌合AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、DNA病毒载体、单纯性疱疹病毒载体、杆状病毒载体或其任何突变体或衍生体。其中，AAV载体是指源自腺病毒相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8和AAV-9。
进一步的，所述过表达载体为PGMLV-rev[PA-MCS-CMV-PA]-EF1-ZsGreen1-WPRE或PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-MCS1-PA)-CMV hancer-CBH-MCS2-CW3SL。
其中，针对所述过表达载体PGMLV-rev[PA-MCS-CMV-PA]-EF1-ZsGreen1-WPRE，当表达一个外源基因时，利用基因工程的手段将外源基因插入在载体的MCS处即可，同时ZsGreen1作为报告基因存在，可以用以显示插入的外源基因的表达情况；当需要表达两个外援基因时，在降外源基因插入MCS处的同时，需要将另一外源基因利用基因工程的手段替换掉ZsGreen1，这时即可完成两个外源基因的表达。
针对载体PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-MCS1-PA)-CMV hancer-CBH-MCS2-CW3SL，当表达两个外源基因时，将需要表达的基因分别插入于MCS1和MCS2处即可；当表达一个外源基因时，将外源基因插入MCS1或MCS2处，另一MCS1或MCS2处可以插入报告基因，用于显示插入的外源基因的表达情况。
具体的，所述过表达载体PGMLV-rev[PA-MCS-CMV-PA]-EF1-ZsGreen1-WPRE通过以下方法构建得到：将含有SEQ ID NO.1启动子的片段rev[PA-MCS-CMV-PA](SEQ ID NO.4)合成在puc57载体上作为模板扩增，将扩增产物与出发载体产物进行无缝克隆连接既得。
其中，扩增引物为AGCAGAGATCCAGTTTATCGATCCATAGAGCCCACCGCATCC和GAGCGATCGCAGATCCTTGGATCTGTATTGGACAGGCCGC，酶切体系采用Bsu15I-BamHI双酶切。
所述出发载体为PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro-WPRE，通过以下方案构建得到：将MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro(SEQ ID NO.3)片段合成在puc57载体上作为模板扩增，将扩增产物与出发载体产物进行无缝克隆连接既得。
其中，扩增引物为AAGACACCGACTCTACTAGAACCGGTGCGGCCGCGAATTC和AATCCAGAGGTTGATTGTTCCGGCGCGCCGACTGCGTCTGT，酶切体系采用EcoRI-MluI双酶切。
所述过表达载体GMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-MCS1-PA)-CMV hancer-CBH-MCS2-CW3SL通过以下方法构建得到：将rev(EF1-CMV EN-PA)-CMV hancer-CBH(SEQ IDNO.2)片段合成在puc57载体上作为模板扩增，将扩增产物与出发载体产物进行无缝克隆连接既得。
其中，扩增引物为AGCAGAGATCCAGTTTATCGATCCATAGAGCCCACCGCATCC和GTCATTGGTCTTAAAGGTACCTGAGGTG，酶切体系采用Bsu15I-BamHI双酶切，所述出发载体为PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro-WPRE。
作为本申请的第三个实施方案，提供了基于所述双向启动子的慢病毒表达质粒，通过将外源基因插入所述过表达载体中，经转染提取质粒既得。
外源基因插入所述过表达载体的方法采用一步快速克隆法，具体为设计引物扩增得到外源基因核酸片段，对所述过表达载体进行酶切，将线性化载体片段PCR产物进行无缝克隆连接，转染至感受态细胞进行培养，挑单菌落扩大培养，进行质粒提取既得。
作为本申请的第四个实施方案，提供了所述双向启动子及包含所述双向启动子的过表达载体在外源基因克隆或表达中的应用。
进一步的，所述双向启动子及包含所述双向启动子的过表达载体可以用于制备基因工程产品和基因治疗药物，例如用于制备诱导两种抗原免疫应答的药物。
本申请的有益效果为：
本申请提供了一种双向启动子结构，该结构通过Poly(A)元件的利用，构建的表达载体及慢病毒表达质粒可以双向表达相同或不同外源基因，且外源基因之间不产生影响，具有启动平衡，而且提高了慢病毒表达质粒的滴度，弥补了双向启动子在慢病毒中出毒效率低的缺陷，对于双基因慢病毒载体在基因工程产品和基因治疗药物中的应用具有重要的推动作用。
附图说明
图1是本申请实施例的双向启动子的结构，其中A为rev(CMV-CMV enhancer-pausesite-PA)-EF1；B为rev(EF1-CMV EN-PA)-CMV hancer-CBH；
图2是本申请实施例中双向启动子慢病毒表达质粒的转染的效果比较；
图3是本申请实施例中luc+Rluc的启动平衡比较，luc/Rluc为PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-LUC-PA)-CMV hancer-CBH-RLUC-CW3SL质粒相对表达量，Rluc/luc为PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-RLUC-PA)-CMV hancer-CBH-LUC-CW3SL质粒相对表达量；
图4是本申请实施例H_G115 Vγ9-Vδ2的表达效果，其中A为PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-H_G115 Vγ9-PA)-CMV hancer-CBH-H_G115 Vδ2-CW3SL流式表达图；B为PGMLV-rev(CMV-H_G115Vγ9-PA)-EF1-H_G115 Vδ2流式表达图；
图5是本申请实施例CD19 CAR-T+IL2的表达效果；
图6是本申请实施例IL2感染T细胞激活报告基因效果。
具体实施方式
下面将结合本申请具体的实施例，对本申请技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
如图1所示，本申请实施例提供了一种双向启动子结构，具体如rev(EF1-CMV EN-PA)-CMV hancer-CBH和rev(CMV-CMV enhancer-pause site-PA)-EF1，在rev(EF1-CMV EN-PA)-CMV hancer-CBH和rev(CMV-CMV enhancer-pause site-PA)-EF1的两侧可分别连接相同或不同的外源基因的编码基因。
具体的所述rev(EF1-CMV EN-PA)-CMV hancer-CBH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述rev(CMV-CMV enhancer-pause site-PA)-EF1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
本申请基于上述双向启动子构建了其的过表达载体，所述过表达载体的构建步骤如下：
1)构建载体PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro-WPRE
表1 PCR体系
表2 PCR程序
将MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro(SEQ ID NO.3)片段合成在puc57载体上作为模板，使用引物1和引物2按照表1和表2体系进行PCR扩增，将载体pLVX-IRES-ZsGreen1进行EcoRI-MluI双酶切，使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit一步快速克隆试剂盒(来源于Yeasen)将酶切的线性化载体片段和PCR产物进行无缝克隆连接，得到载体PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro-WPRE。
表3引物序列
2)外源基因片段的扩增
以质粒为模板，采用表1和表2相同的PCR体系和反应程序，利用表4引物扩增。
表4引物序列
3)连接、转化
①将出发载体(PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro-WPRE)利用酶切系统在37℃条件下处理2h，然后进行胶回收获得线性化载体片段。
②使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit一步快速克隆试剂盒(来源于Yeasen)将获得的线性化载体片段和外源基因进行无缝克隆连接。
连接反应体系如下：5×CE Buffer 4μl，载体0.3ul，DNA片段0.2ul，无缝克隆酶2ul，ddH2O 13.5ul，于50度连接20min。
具体为：将rev(PA-MCS-CMV-PA)(SEQ ID NO.4)片段合成在puc57载体上作为模板，使用引物3和引物4按照表1和表2体系进行PCR扩增，将载体PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro-WPRE进行Bsu15I-BamHI双酶切，使用Hieff CloneTM Plus One StepCloning Kit一步快速克隆试剂盒(来源于Yeasen)将酶切的线性化载体片段和PCR产物进行无缝克隆连接，得到载体PGMLV-rev[PA-MCS-CMV-PA]-EF1-ZsGreen1-WPRE，该载体含有双向启动子rev(CMV-CMV enhancer-pause site-PA)-EF1。
或将rev(EF1-CMV EN-PA)-CMV hancer-CBH片段合成在puc57载体上作为模板，使用引物5和引物6按照表1和表2体系进行PCR扩增，将载体PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro-WPRE进行Bsu15I-BamHI双酶切，使用Hieff CloneTM Plus One Step CloningKit一步快速克隆试剂盒(来源于Yeasen)将酶切的线性化载体片段和PCR产物进行无缝克隆连接，得到载体PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-MCS1-PA)-CMV hancer-CBH-MCS2-CW3SL，该载体含有双向启动子rev(EF1-CMV EN-PA)-CMV hancer-CBH。
③将连接后的带有外源基因的出发载体转化至感受态细胞stbl3中，涂含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现，分离抗氨苄青霉素的转化体。
④挑取单菌落扩大培养并使用天根的无内毒素质粒小量制备试剂盒(目录号：GK2007-20)进行质粒小提。
⑤鉴定质粒构建成功：提好的质粒进行双酶切鉴定，且经测序验证基因的插入位点、方向和序列完全正确，测序正确的质粒即为所构建的目的质粒。
具体的，通过上述方法构建得到的过表达载体如下：
i)PGMLV-rev(PA-CMV-M_GSDMD-PA)-EF1-ZsGreen1载体构建，M_GSDMD片段扩增使用引物7和引物8；出发载体使用PGMLV-rev[PA-MCS-CMV-PA]-EF1-ZsGreen1-WPRE，酶切体系EcoRI-BamHI，经酶切和测序验证正确，此质粒构建成功；
ii)PGMLV-rev(CMV-M_GSDMD-PA)-EF1-ZsGreen1质粒构建，M_GSDMD片段扩增使用引物9和引物10，CMV片段扩增使用引物11和引物12；载体使用PGMLV-rev[PA-MCS-CMV-PA]-EF1-ZsGreen1-WPRE，酶切体系Bsu15I-BamHI，酶切和测序验证正确，此质粒构建成功。
iii)PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-LUC-PA)-CMV hancer-CBH-RLUC-CW3SL质粒构建，LUC片段扩增使用引物13和引物14；RLUC片段扩增使用引物15和16；载体使用PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-MCS1-PA)-CMV hancer-CBH-MCS2-CW3SL，酶切体系ApaI-AgeI-EcoRI-XbaI，经酶切和测序验证，此质粒构建成功。
iv)PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-RLUC-PA)-CMV hancer-CBH-LUC-CW3SL质粒构建，RLUC片段扩增使用引物17和引物18；LUC片段扩增使用引物19和20；载体使用PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-MCS1-PA)-CMV hancer-CBH-MCS2-CW3SL，酶切体系ApaI-AgeI-EcoRI-XbaI，经酶切和测序验证，此质粒构建成功。
v)PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-H_G115 Vγ9-PA)-CMV hancer-CBH-H_G115 Vδ2-CW3SL质粒构建，H_G115 Vγ9片段扩增使用引物21和引物22；H_G115 Vδ2片段扩增使用引物23和24；载体使用PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-MCS1-PA)-CMV hancer-CBH-MCS2-CW3SL，酶切体系ApaI-AgeI-EcoRI-XbaI，经酶切和测序验证，此质粒构建成功。
vi)PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-H_G115 Vδ2-PA)-CMV hancer-CBH-H_G115 Vγ9-CW3SL质粒构建，H_G115 Vδ2片段扩增使用引物25和引物26；LUC H_G115 Vγ9片段扩增使用引物27和28；载体使用PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-MCS1-PA)-CMV hancer-CBH-MCS2-CW3SL，酶切体系ApaI-AgeI-EcoRI-XbaI，经酶切和测序验证，此质粒构建成功。
vii)PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-CD19 CAR-T-PA)-CMV hancer-CBH-H_IL2-CW3SL质粒构建，CD19 CAR-T片段扩增使用引物29和引物30；IL2片段扩增使用引物31和32；载体使用PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-MCS1-PA)-CMV hancer-CBH-MCS2-CW3SL，酶切体系ApaI-AgeI-EcoRI-XbaI，经酶切和测序验证，此质粒构建成功。
viii)PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-H_IL2-PA)-CMV hancer-CBH-CD19 CAR-T-CW3SL质粒构建，IL2片段扩增使用引物33和引物34；CD19 CAR-T片段扩增使用引物35和36；载体使用PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-MCS1-PA)-CMV hancer-CBH-MCS2-CW3SL，酶切体系ApaI-AgeI-EcoRI-XbaI，经酶切和测序验证，此质粒构建成功。
下面结合构建得到的过表达载体，验证本申请双向启动子调控外源基因的表达情况。
实施例1慢病毒表达质粒的转染效果
将构建得到的过表达质粒PGMLV-CMV-M_GSDMD-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro、PGMLV-rev(PA-CMV-M_GSDMD-PA)-EF1-ZsGreen1和PGMLV-rev(CMV-M_GSDMD-PA)-EF1-ZsGreen1分别转染至293T细胞，评价不同结构的慢病毒表达质粒的转染效率。
转染方法：用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于5％CO2，37℃恒温培养293T细胞(购于美国ATCC细胞库)。取对数期细胞以5×105个/孔接种到35mm培养皿中培养。待细胞融合度达到80％左右时更换成Opti-MEM培养基，1小时后将过表达质粒2ug经转染试剂HGtransgene reagent 6ul转染到293T细胞中，转染48h后，荧光显微镜下观察转染效果。
结果如图2所示，过表达质粒PGMLV-rev(CMV-M_GSDMD-PA)-EF1-ZsGreen1中荧光表达量基本不受影响。
实施例2Luc/Rluc系统的表达平衡
将构建的质粒PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-LUC-PA)-miniPA-CMV EN-CBH-RLUC-CW3SL和PGMLV-rev(miniPA-CMVEN-EF1-RLUC-PA)-miniPA-CMV EN-CBH-LUC-CW3SL分别取2ug，瞬时转染293T细胞，并提取细胞总RNA，经反转录后，qPCR检测Luc/Rluc的表达情况。
具体如下：
1)细胞样品总RNA提取
(a)细胞瞬时转染48h后，轻轻吸净培养液，用PBS轻洗两遍，每孔细胞样品中各加入1ml Trizol液，用枪头吹吸混匀，尽量让细胞全部裂解，室温放置5min；
(b)每管中各加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，反复颠倒混匀15秒，12000g，4℃离心10min；
(c)取上层水相于一新的离心管中，每管中各加0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，12000g，4℃离心10min；
(d)弃去上清液，每管中加入1ml的75％的酒精轻轻洗涤沉淀，12000g，4℃离心10min；
(e)小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，55℃-60℃水溶10min。
2)反转录cDNA
取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，每个样本加入如下组分：RNA 500ng，
ⅡSuperMix 5μl，RNase free ddH2O To 10μl，轻轻混匀后，25℃孵育5min。42℃孵育30min，85℃孵育5min终止反应，所得到的cDNA保存在-20℃备用。/>
3)qPCR检测
luc基因使用引物37和38，Rluc基因使用引物39和引物40，内参基因GAPDH引物使用引物41和引物42。
表5目的基因的检测用引物序列
以cDNA为模板，进行实时定量PCR。
表6 PCR体系
表7 PCR反应条件
通过qPCR检测细胞样品中目的基因和内参基因的表达量，根据qPCR反应曲线得到各样品目的基因和内参基因的Ct值，采用△△Ct的方法进行相对定量。
结果如图3所示，质粒PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-LUC-PA)-miniPA-CMV EN-CBH-RLUC-CW3SL和PGMLV-rev(miniPA-CMVEN-EF1-RLUC-PA)-miniPA-CMV EN-CBH-LUC-CW3SL中luc和RLUC表达量互不影响，启动平衡。
实施例3慢病毒表达质粒滴度的测定
慢病毒包装：慢病毒包装细胞采用293T贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。转染前一天，将已经长好的细胞以合适的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到70％～80％时准备转染。转染前1～2h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，12ml/10cm皿。取无菌的1.5ml EP管，DMEM 1ml、质粒10μg、10μlLenti-HG Mix和HG transgenereagent 60μl混匀，室温放置15min-20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于CO2培养箱中培养，转染10～12h后，均匀滴加100×Enhancing buffer(120μl/皿)促进转染，转染18～20h后，吸掉细胞培养液，加15ml新鲜的细胞培养基继续培养。
病毒收集：换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃4500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到浓缩装置中，4℃4500g离心10min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃4500g离心20min，此时可见滤器上层中的液体即为病毒浓缩液。
Lentivirus滴度测定：细胞胰酶消化处于对数生长期的293T细胞，按照8000/孔细胞接种96孔板，37度培养过夜，第二天感染时细胞长至30～50％的融合密度。病毒液使用含有10％FBS的细胞培养液进行梯度稀释，选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，取90μl混匀的慢病毒稀释液加入每孔细胞中，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养；第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100μl的完全培养基；第五天，使用RT-PCR测毒滴度。其中，稀释方法具体为：1号稀释液：10μl病毒液+90μl病毒稀释用培养基；2号稀释液：10μl 1号稀释液+90μl病毒稀释用培养基。
RT-PCR测滴度体系和程序如下：
表8PCR体系
表9反应条件
RT-PCR测滴度使用引物：
表10 RT-PCR检测目的基因的检测用引物序列(5’-3’)
表11内参基因的检测用引物序列(5’-3’)
滴度结果如表12：
表12滴度结果
实施例4H_G115 Vγ9-Vδ2的表达效果
慢病毒包装：将PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-H_G115 Vγ9-PA)-CMV hancer-CBH-H_G115 Vδ2-CW3SL和PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-H_G115 Vδ2-PA)-CMV hancer-CBH-H_G115 Vγ9-CW3SL质粒进行慢病毒包装和滴度测定(具体方法同实施例3)；PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-H_G115 Vγ9-PA)-CMV hancer-CBH-H_G115 Vδ2-CW3SL滴度为1×108TU/ml，PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-H_G115 Vδ2-PA)-CMV hancer-CBH-H_G115 Vγ9-CW3SL滴度为1×108TU/ml。
慢病毒感染：第一天，接种2×105个HEK-293细胞于6孔板中。感染前，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用1200μL完全培养基按MOI＝10稀释病毒原液，吸除处理组原有的培养基，含有慢病毒液稀释液的1000μL培养基加到处理组细胞中。第三天，更换培养液，在感染16h后将含有慢病毒的培养液全量更换成2mL完全培养液。第五天，选择合适的真核抗性筛选细胞(Blasticidin全致死浓度8μg/mL，维持浓度4μg/mL)，一般药筛两轮(1轮2天，由抗生素预实验决定)，细胞即可稳定，稳定后使用DMEM+10％FBS+1％Pen/Strep+0.75μg/mL Puromycin+4μg/mL Blasticidin完全培养基维持细胞。
流式测TCR aβ表达
①去除细胞培养液，用胰酶消化细胞，制备单细胞悬液。400g离心5min，弃上清，加入500μL预冷的1％BSA/PBS清洗，离心收集细胞沉淀。
②使用1％BSA/PBS将一抗稀释到最佳浓度，然后在该溶液中对细胞进行重悬，4℃避光孵育1h；
③使用1mL 1％PBS/BSA清洗细胞，400g离心5min，弃上清，重复此步骤两次；
④使用1％BSA/PBS将荧光染料标记二抗稀释到最佳浓度，然后在该溶液中对细胞进行重悬，4℃避光孵育30min；
⑤细胞洗涤3次，400g离心5min，弃上清。最后将细胞重悬于1％BSA/PBS预冷的溶液中(注意避光保存)。
如图4所示，结果如图4(A)和图4(B)所示，rev(miniPA-CMVEN-EF1-H_G115 Vγ9-PA)-CMV hancer-CBH-H_G115 Vδ2-CW3SL与PGMLV-rev(CMV-H_G115 Vγ9-PA)-EF1-H_G115Vδ2表达量更高。
实施例5CD19 CAR-T+IL2感染T细胞效果
采用慢病毒表达质粒PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-CD19CAR-T-PA)-CMVhancer-CBH-IL2-CW3SL和PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-IL2-PA)-CMV hancer-CBH-CD19CAR-T-CW3SL进行慢病毒包装和滴度测定。PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-CD19 CAR-T-PA)-CMV hancer-CBH-IL2-CW3SL滴度值为1×108TU/ml，PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-IL2-PA)-CMV hancer-CBH-CD19 CAR-T-CW3SL滴度值为1×108TU/ml。
慢病毒感染：第一天，接种2×105个HEK-293细胞于6孔板中。用1200μL完全培养基按MOI＝10稀释融化后的病毒原液，吸除处理组原有的培养基，含有慢病毒液稀释液的1000μL培养基加到处理组细胞中。第三天，在感染16h后将含有慢病毒的培养液全量更换成2mL完全培养液。第五天，选择合适的真核抗性筛选细胞(Blasticidin全致死浓度8μg/mL，维持浓度4μg/mL)，细胞即可稳定，稳定后使用DMEM+10％FBS+1％Pen/Strep+0.75μg/mLPuromycin+4μg/mLBlasticidin完全培养基维持细胞。
流式测CD19 CAR-T和IL2表达
①去除细胞培养液，用胰酶消化细胞，制备单细胞悬液。400g离心5min，弃上清，加入500μL预冷的1％BSA/PBS清洗，离心收集细胞沉淀。
②使用1％BSA/PBS将一抗稀释到最佳浓度，然后在该溶液中对细胞进行重悬，4℃避光孵育1h；
③使用1mL 1％PBS/BSA清洗细胞，400g离心5min，弃上清，重复此步骤两次；
④使用1％BSA/PBS将荧光染料标记二抗稀释到最佳浓度，然后在该溶液中对细胞进行重悬，4℃避光孵育30min；
⑤细胞洗涤3次，400g离心5min，弃上清。最后将细胞重悬于1％BSA/PBS预冷的溶液中(注意避光保存)。
结果如图5所示，流式验证PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-IL2-PA)-CMV hancer-CBH-CD19 CAR-T-CW3SL感染细胞后的表达效果，结果显示，双向启动子启动CAR的效果较好，表达476倍；图6所示，使用IL2报告基因细胞验证PGMLV-rev(miniPA-CMV EN-EF1-IL2-PA)-CMV hancer-CBH-CD19 CAR-T-CW3SL感染细胞后IL2的表达效果，结果显示，IL2活性较强，EC50值为1.3μL。
Claims (9)
1.一种双向启动子，其特征在于，所述双向启动子的结构如a)或b)：
a)所述双向启动子包括第一启动单元和第二启动单元，分别与所述第一启动单元和第二启动单元连接的外源基因的延伸方向从5′至3′相反；
所述第一启动单元由以下启动子元件组成：启动子CMV及其增强子CMV enhancer和启动子EF1；所述增强子CMV enhancer位于启动子CMV转录方向的上游；
所述第二启动单元为启动子EF1；
所述第一启动单元和第二启动单元之间插入有相互连接的pause site终止转录元件和Poly(A)元件，所述pause site终止转录元件的另一侧连接至所述增强子CMV enhancer，所述Poly(A)元件的另一侧连接至所述启动子EF1；
b)所述双向启动子由以下启动子元件组成：启动子EF1、增强子CMV enhancer和启动子CBH，在所述增强子CMV enhancer的序列中插入有Poly(A)序列，分别与所述启动子EF1和启动子CBH连接的外源基因的延伸方向从5′至3′相反。
2.根据权利要求1所述的一种双向启动子，其特征在于，如a)结构的双向启动子的核苷酸序列如下(a1)或(a2)所示：
(a1)具有如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
(a2)将(a1)中所述DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
如b)结构的双向启动子的核苷酸序列如下(b1)或(b2)所示：
(b1)具有如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
(b2)将(b1)中所述DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子。
3.一种过表达载体，其特征在于，所述过表达载体包含权利要求1所述的双向启动子。
4.根据权利要求3所述的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体通过以下方法构建得到：
将如SEQ ID NO.4的片段合成在puc57载体上作为模板扩增，将扩增产物与出发载体产物进行无缝克隆连接既得；
其中，扩增引物为AGCAGAGATCCAGTTTATCGATCCATAGAGCCCACCGCATCC和GAGCGATCGCAGATCCTTGGATCTGTATTGGACAGGCCGC，酶切体系采用Bsu15I-BamHI双酶切。
5.根据权利要求3所述的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体通过以下方法构建得到：
将如SEQ ID NO.2的片段合成在puc57载体上作为模板扩增，将扩增产物与出发载体产物进行无缝克隆连接既得；
其中，扩增引物为AGCAGAGATCCAGTTTATCGATCCATAGAGCCCACCGCATCC和GTCATTGGTCTTAAAGGTACCTGAGGTG，酶切体系采用Bsu15I-BamHI双酶切。
6.根据权利要求4或5所述的过表达载体，其特征在于，所述出发载体通过以下方案构建得到：将如SEQ ID NO.3的片段合成在puc57载体上作为模板扩增，将扩增产物与出发载体产物进行无缝克隆连接既得。
其中，扩增引物为AAGACACCGACTCTACTAGAACCGGTGCGGCCGCGAATTC和AATCCAGAGGTTGATTGTTCCGGCGCGCCGACTGCGTCTGT，酶切体系采用EcoRI-MluI双酶切。
7.一种慢病毒表达质粒，其特征在于，通过将外源基因插入权利要求3～6中任一所述过表达载体，经转染提取质粒既得。
8.权利要求1所述的双向启动子在外源基因克隆或表达中的应用。
9.权利要求1所述的双向启动子在制备诱导两种抗原免疫应答的药物中的应用。
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