CN113621611B - 一种髓系特异性启动子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种髓系特异性启动子及其应用。所述髓系特异性启动子包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核酸序列。所述髓系特异性启动子具备髓系组织特异性，能够在髓系细胞中高效启动基因表达，而在非髓系细胞中调控基因表达的效率则较低，从而能够调控基因在髓系组织特异性表达，将所述髓系特异性启动子和CYBB基因插入慢病毒载体，所构建的慢病毒表达载体具备髓系组织特异性，能够有效恢复gp91‑phox蛋白的表达，恢复活性氧(ROS)生成功能，对于治疗慢性肉芽肿并具有重要意义。

Description

一种髓系特异性启动子及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种髓系特异性启动子及其应用。
背景技术
慢性肉芽肿病(chronic granulomatous disease，CGD)是一种中性粒细胞和单核细胞中，由于NADPH氧化酶功能缺失引起的遗传性原发免疫缺陷病，其特点是病人会发生反复严重的感染、炎症及自身免疫。
NADPH氧化酶由膜结合蛋白和细胞质蛋白组成，它们在吞噬细胞活化时起协同作用，协助产生活性氧(reactive oxygen species，Ros)杀灭细菌和真菌。NADPH氧化酶的五个亚基中的任何一个亚基突变，都会导致CGD综合征，其中跨膜糖蛋白gp91-phox亚基由X染色体上CYBB基因编码，约67％的CGD病例是由该基因缺陷引发的。
造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是目前治疗CGD的主要方法，该方案需要彻底的清髓预处理，且需要找到异体HLA匹配的供者，但绝大多数情况下，患者很难找到HLA匹配的供者，而且HSCT也有发生移植物抗宿主病(GVHD)的风险，HSCT除了可能伴有移植失败、高死亡率和供体嵌合率低等问题，还可能会引发患者的免疫排斥反应，使造血干细胞的再次移植变得十分困难。
基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。基因治疗CGD起始于20世纪90年代末期，人们尝试将腺病毒载体用于CGD基因治疗，除了无法高效、连续地表达外源基因外，该方法还存在载体引起免疫应答的问题。
人们也使用γ逆转录病毒载体(γRV)进行治疗，仅取得了有限的治疗效果，Kang等人利用γRV介导gp91-Phox表达，对三名年龄在19-23岁之间的X-CGD患者进行基因治疗临床试验。经过病毒载体转染之后，最初的阳性细胞百分比在25-73％之间。基因治疗后在第7个月，患者1外周血中功能修正细胞百分比由24％降低至1％，患者2在第11个月从4％降低至0.03％，4周后患者3的外周血中无法检测到修正的细胞(参见：Hyoung,Jin,Kang,etal.Retroviral Gene Therapy for X-linked Chronic Granulomatous Disease:ResultsFrom Phase I/II Trial[J].Molecular Therapy,2011,19,2092-2101.)。
Ravin等人利用CRISPR-Cas9修复CGD患者的CYBB突变基因，然而，CRISPR-Cas9系统基因编辑存在效率低和潜在的安全隐患等问题，此外，该方法要求条件严格，成本高，结果不稳定(参见：De Ravin et al.CRISPR-Cas9gene repair of hematopoieticstemcells from patients with X-linked chronic granulomatousdisease.ScienceTranslational Medicine,2017,9,eaah3480.)。
此外，NADPH氧化酶的功能是产生ROS，细胞中ROS过量表达可能影响细胞正常功能，基因治疗可以恢复造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)中ROS的产生，但ROS又对造血干细胞的静息、复制、增殖和分化等过程之间的平衡产生很大的影响，非组织特异性启动子介导的NADPH氧化酶异位表达，会在造血干细胞中过表达ROS，而过量的ROS会促进静息状态下的造血干细胞凋亡，诱导造血干细胞分化，降低造血干细胞的自我更新能力，导致造血干细胞池明显衰竭。
综上所述，腺病毒载体、逆转录病毒载体和CRISPR-Cas9系统在安全性、基因传递效率和长期表达等方面存在缺陷，还存在NADPH氧化酶非特异性的过表达引起造血干细胞凋亡等问题，因此，提供一种高基因传递效率、适合靶向干细胞的病毒载体，以提高对CGD的治疗效果，对于CGD治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种髓系特异性启动子及其应用，所述髓系特异性启动子具备髓系组织特异性，能够在髓系细胞中高效启动基因表达，而在非髓系细胞中调控基因表达的效率则较低。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种髓系特异性启动子，所述髓系特异性启动子包括SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
本发明的髓系特异性启动子具备髓系组织特异性，能够在髓系细胞中高效启动基因表达，而在非髓系细胞中调控基因表达的效率则较低，从而能够调控基因在髓系组织特异性表达，对于基因治疗领域具有重要意义。
SEQ ID NO:1：
acttgtacagcttcacagggctccatgcttagaaggaccccacacttagtttaatgttctgctgtcatcatcttgatattcttaatttttaaataaagggcctatcgttttcattttttactgggccttgcaaattatgtagctggttctgtatgccaggagagaagttggaagtaaaatggtattccaggaccaggaggcattctggcagagtgaaagaacatgtgatttggagtccatggggatgggtttaaatttcagctttccactaatttgctttgtgatactgagtatttccttttatccctcagaggctctgtttctcaattttgactacgggttttttcattagataatgtctcagttctggtattccaggtttccctcaattattctgggaaaacctccttgacccacaggcagagcctagggcagccaggtgctttctactctctctctctctgcagcttggaaagttagtgtctgttgaaggtcagctgggagttggtggaggcagggcagtggcctgctactattgctgcagtagcagaccctttcacaacagcattgttttgtcattttgcatccagatttccgttggctaacctcagtcttatcttcctcatttctgtttcctgttgaagacaccaagggcccttcaaaacacagaagcttcttgctcacggcagaaagcccaattccatctggcccctgcaggttggctcagcactggggaatcagagtcccctccatgaccaaggcaccactccactgacag。
SEQ ID NO:2：
tagccatttgctggaccaaatctggagggagaacccctaaaacccctaagtgaggttgcccagggggttgtccccaggtggggggaagcaggggagagaaaatggtagccatttttacattgttttgtatagtatttattgattcaggaaacaaacacaaaattctgattataatgacttggaaactgcctgtttgggcttctcatttcttacctccccttccctctcccacctgctactgggtgcatctctgctccccccttccccagcagatggttacctttgggctgttgctttcttgtcaccatctgagttctcagacgctggaaagccatgttctcggctctgtgaatgacaatgctgactggagtgctgcccctctgtaaagggctgggtgtggatggtcacaagcccctcacatgcctcagccaagaggaagtagtacaggggtcagcccagaggtccaggggaaaggagtggaaaccgatttccccaccaagggaggggcctgtacctcagctgttcccatagctacttgccacaactgccaagcaagtttcgctgagtttgacacatggaaccctgtggatcaactgccctaggactccgtttgcacccatgtgacactgttgactttgccctgatgaagcagggccaacagtcccctaacttaattacaaaaactaatgactaagagagaggtggctagagctgaggcccctgagtcaggctgtgggtgggatcatctccagtacaggaagtgagactttcatttcctcctttccaagagagggctgagggagcagggttgagcaactggtgcagacagcctagctggactttgggtgaggcggttcagcc。
第二方面，本发明提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包括第一方面所述的髓系特异性启动子。
优选地，所述重组表达载体包括含有第一方面所述的髓系特异性启动子的病毒载体或质粒载体。
优选地，所述病毒载体包括pTYF慢病毒载体。
优选地，所述重组表达载体还包括CYBB基因。
优选地，所述CYBB基因包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
SEQ ID NO:3：
tagccatttgctggaccaaatctggagggagaacccctaaaacccctaagtgaggttgcccagggggttgtccccaggtggggggaagcaggggagagaaaatggtagccatttttacattgttttgtatagtatttattgattcaggaaacaaacacaaaattctgattataatgacttggaaactgcctgtttgggcttctcatttcttacctccccttccctctcccacctgctactgggtgcatctctgctccccccttccccagcagatggttacctttgggctgttgctttcttgtcaccatctgagttctcagacgctggaaagccatgttctcggctctgtgaatgacaatgctgactggagtgctgcccctctgtaaagggctgggtgtggatggtcacaagcccctcacatgcctcagccaagaggaagtagtacaggggtcagcccagaggtccaggggaaaggagtggaaaccgatttccccaccaagggaggggcctgtacctcagctgttcccatagctacttgccacaactgccaagcaagtttcgctgagtttgacacatggaaccctgtggatcaactgccctaggactccgtttgcacccatgtgacactgttgactttgccctgatgaagcagggccaacagtcccctaacttaattacaaaaactaatgactaagagagaggtggctagagctgaggcccctgagtcaggctgtgggtgggatcatctccagtacaggaagtgagactttcatttcctcctttccaagagagggctgagggagcagggttgagcaactggtgcagacagcctagctggactttgggtgaggcggttcagcc。
优选地，所述的髓系特异性启动子启动所述CYBB基因的表达。
本发明中，采用慢病毒载体，转染血液干细胞或体细胞效率更高，稳定性更强，安全性更好，能够更高效地完成基因治疗过程中基因的传递，同时采用髓系特异性启动子，使得慢病毒载体特异性地在髓系细胞表达CYBB基因，从而能够有效实现对X染色体上基因突变的慢性肉芽肿基因的治疗。
第三方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒含有第二方面所述的重组表达载体。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有第一方面所述的髓系特异性启动子。
优选地，所述重组细胞含有第二方面所述的重组表达载体。
优选地，所述重组细胞含有第三方面所述的重组慢病毒。
第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的重组细胞的制备方法，所述方法包括：
将第二方面所述的重组表达载体或第三方面所述的重组慢病毒转入宿主细胞，得到所述重组细胞。
优选地，所述导入的方法包括电转导、病毒载体系统、非病毒载体系统或基因枪注射中的任意一种。
优选地，所述宿主细胞包括造血干细胞。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)构建慢病毒载体；
(2)将步骤(1)所述的慢病毒载体与包装质粒共转染哺乳动物细胞，进行慢病毒包装；
(3)将步骤(2)包装的慢病毒转化入宿主细胞，得到所述重组细胞。
优选地，步骤(1)所述构建慢病毒载体包括将第一方面所述的髓系特异性启动子和CYBB基因插入pTYF慢病毒载体。
优选地，步骤(2)所述包装质粒包括pNHP和pHEF-VSVG。
优选地，步骤(2)所述哺乳动物细胞包括293T细胞。
第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的髓系特异性启动子、第二方面所述的重组表达载体、第三方面所述的重组慢病毒或第四方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供如第一方面所述的髓系特异性启动子、第二方面所述的重组表达载体、第三方面所述的重组慢病毒、第四方面所述的重组细胞或第六方面所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用。
优选地，所述疾病包括慢性肉芽肿病。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的髓系特异性启动子具备髓系组织特异性，能够在髓系细胞中高效启动基因表达，而在非髓系细胞中调控基因表达的效率则较低，从而能够调控基因在髓系组织特异性表达；
(2)本发明将髓系特异性启动子插入慢病毒载体，得到的慢病毒载体转染效率高，稳定性强，安全性好，且能在髓细胞中特异性表达；
(3)本发明将髓系特异性启动子和CYBB基因插入慢病毒载体，所构建的慢病毒表达载体具备髓系组织特异性，能够有效恢复gp91-phox蛋白的表达，恢复活性氧(ROS)生成功能，对于治疗慢性肉芽肿并具有重要意义。
附图说明
图1为C57小鼠骨髓造血干细胞病毒载体拷贝数结果图；
图2为C57小鼠造血干细胞转染慢病毒第5天和14天细胞绿色荧光表达情况图；
图3为C57小鼠造血干细胞转染慢病毒第5天和14天细胞中绿色荧光表达百分比图；
图4为X-CGD小鼠造血干细胞CYBB基因表达结果图；
图5为X-CGD小鼠造血干细胞中活性氧自由基(ROS)生成水平图；
图6为诱导第14天小鼠造血干细胞分化为髓系细胞百分比图；
图7为吞噬E.coli实验结果图；
图8为慢病毒转染X-CGD小鼠造血干细胞中载体拷贝数结果图；
图9为小鼠体内细胞中CYBB基因表达结果图；
图10为小鼠体内细胞中活性氧自由基(ROS)生成水平结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例制备重组慢病毒，所述重组慢病毒的制备方法包括以下步骤：
(1)构建慢病毒载体
1)将pTYF慢病毒载体的野生型5’剪接供体位点GT突变为CA，将U3区中的增强子删除，具体的改造方法可参见“Cui Y,Iwakuma T,Chang L J.Contributions ofViralSplice Sites and cis-Regulatory Elements to Lentivirus Vector Function[J].Journal of Virology,1999,73(7):6171.”，具体如下：
野生型5’剪接供体位点SEQ ID NO.4：
GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
突变型5’剪接供体位点SEQ ID NO.5：
GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGCAGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
2)通过全基因合成CYBB基因cDNA序列(SEQ ID NO.3)以及miR223启动子序列(SEQID NO.1)和CD68启动子序列(SEQ ID NO.2)，将其经限制性酶切位点连接入慢病毒载体TYF中，得到miR223+CYBB的慢病毒载体和CD68+CYBB的慢病毒载体；
(2)慢病毒包装与浓缩
1)将293T细胞接种于含有10％FBS的新鲜DMEM培养基，培养17小时；
2)分别步骤(1)制备的2种慢病毒载体与DMEM培养基、pNHP、pHEF-VSV-G依次加入无菌离心管中，进行涡旋混匀，再向离心管中加入Superfect转导试剂(QIAGEN)，室温静置8min；
3)将离心管中配制好的混合物滴加到293T细胞中，于37℃、5％CO2条件下孵育5小时；
4)吸掉细胞培养液，冲洗细胞，加入新鲜培养基继续培养；
5)收集细胞培养液，冲洗细胞，更换新鲜培养基，放回5％CO2培养箱中孵育过夜，再收取细胞培养液，置于-80℃保存；
6)将包装好的慢病毒于1000×g离心5min，去掉细胞碎片，置于-80℃保存；
7)将慢病毒上清液加入离心滤管中，2500×g离心30min，将浓缩的病毒收集到离心管中，置于-80℃保存，得到表达CYBB的慢病毒LV-miR223和LV-CD68。
实施例2
本实施例在C57小鼠造血干细胞中验证基因传递效率及启动子特异性。
使用表达CYBB的慢病毒LV-EF1α、LV-miR223、LV-CD68和LV-VEC分别转染C57系列小鼠骨髓造血干细胞，其中，LV-EF1α为携带广泛表达强哺乳动物启动子慢病毒，LV-VEC为携带内皮细胞特异性启动子慢病毒，以未经慢病毒转染的细胞作为阴性对照(NC)。
转染C57小鼠造血干细胞的方法为：
(1)从C57小鼠胫骨取骨髓，使用STEMCELL公司的EasySepTMMouse HematopoieticProgenitor Cell Isolation Kit分离提取小鼠造血干细胞；
(2)将1×106个小鼠造血干细胞重悬在100μL含有细胞因子(包括：干细胞生长因子(SCF)50ng/mL、FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3-L)50ng/mL、白介素6(IL6)10ng/mL和促血小板生成素(TPO)50ng/mL，购自Biotech公司)的培养基(StemSpan SFEM Medium，购自STEMCELL公司)中刺激培养17小时；
(3)吸掉50μL培养基，添加50μL新的含有细胞因子的培养基重悬细胞，加入8μg/mL的聚凝胺(polybrene)，加入慢病毒混匀，转染MOI＝200，连续转染2次，1次/天，室温下100×g离心100min；
(4)转染结束后，收集细胞，经20ng/mL小鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF细胞因子，PeproTech公司)诱导分化髓系细胞，分别在第5天和第14天收集细胞流式测定绿色荧光的表达情况。
病毒转染后使用q-PCR测定细胞内的载体拷贝数，结果如图1所示，慢病毒LV-miR223和慢病毒LV-CD68转染后病毒载体拷贝数(VCN)分别为：206.33％和196.87％，表明本发明构建的含有髓特异性启动子的慢病毒载体可以有效地转染细胞，满足基因治疗需求。
慢病毒载体携带绿色荧光(GFP)荧光基因，拍照并进行流式细胞仪测定绿色荧光表达百分比，进而分析慢病毒载体表达情况，对比第5天(未分化为髓系细胞，undiff)和第14天(分化为髓系细胞，diff)绿色荧光蛋白的表达情况，分析两种启动子的髓系特异性。
结果如图2和图3所示，图2为诱导分化第5天和14天细胞绿色荧光表达情况图，其中第一列为荧光照片，第二列为白光照片，图3为C57小鼠造血干细胞转染慢病毒第5天和14天细胞中绿色荧光表达百分比图，undiff与diff细胞中，EF1α组荧光蛋白表达百分比分别为84.72％和85.35％，表达情况相近；undiff与diff细胞中，VEC组荧光蛋白表达百分比分别为28.28％和32.22％，表达情况相近；undiff与diff细胞中，miR223介导的荧光蛋白表达百分比分别为26.42％和89.16％，表达存在明显差异；undiff与diff细胞中CD86介导的荧光蛋白表达百分比58.10％和77.49％，表达存在明显差异；可见miR223启动子和CD86启动子在髓系细胞中启动基因表达的效率比在非髓系细胞中更高，即具有髓系特异性，且miR223启动子的表达差异更大，即特异性更强。
实施例3
本实施例在慢性肉芽肿病小鼠(X-CGD小鼠，B6.129S-Cyb btm1Din/J)造血干细胞中验证基因传递效率，比较启动子启动CYBB基因表达、恢复NADPH氧化酶功能及启动子特异性。
转染X-CGD小鼠造血干细胞的方法为：
(1)从X-CGD小鼠胫骨取骨髓，使用STEMCELL公司的EasySepTMMouseHematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit分离提取小鼠造血干细胞；
(2)将1×106个小鼠造血干细胞重悬在100μL含有细胞因子(包括：SCF 50ng/mL、FLT3-L 50ng/mL、IL610 ng/mL和TPO 50ng/mL，购自Biotech公司)的培养基(StemSpanSFEM Medium，购自STEMCELL公司)中刺激培养17小时；
(3)吸掉50μL培养基，添加50μL新的含有细胞因子的培养基重悬细胞，加入8μg/mL的聚凝胺(polybrene)，加入病毒载体混匀，转染MOI＝200，连续转染2次，1次/天，室温下100×g离心100min；
(4)转染结束后，收集细胞，经20ng/mL小鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF细胞因子，PeproTech公司)诱导分化髓系细胞。
分别在第5天和第14天检测CYBB基因(表达gp91-phox蛋白)的表达情况，即使用流式细胞术测定第5天(undiff)和第14(diff)天细胞中gp91-phox阳性百分比，结果如图4所示，其中，NC为未经转染慢病毒的X-CGD小鼠造血干细胞，CGD为未经转染慢病毒的X-CGD小鼠造血干细胞，但使用抗gp91-phox抗体进行染色，WT为野生型小鼠细胞。
由图4可知，diff与undiff细胞中，WT组gp91-phox蛋白表达百分比分别为72.58％和64.38％；EF1α组gp91-phox蛋白表达百分比分别为80.28％和81.7％；miR223组gp91-phox蛋白表达百分比分别为71.17％和54.17％；CD68组gp91-phox蛋白表达百分比分别为70.8％和65.9％，综上可知，miR223启动子和CD86启动子在髓系细胞中启动基因表达的效率比在非髓系细胞中更高，具有髓系特异性，且miR223启动子的的特异性更强。
使用佛波酯(PMA)刺激细胞，二氢罗丹明(DHR123)染色，流式细胞术测定第14天时细胞中活性氧自由基(ROS)生成水平，进一步验证CYBB基因的表达情况，结果如图5所示，WT组DHR123+％为72.97％；EF1α组DHR123+％为62.99％；miR223组DHR123+％为62.76％；CD68组DHR123+％为53.58％，可见本发明构建的慢病毒载体能够有效表达CYBB基因，即有效恢复慢性肉芽肿病细胞活性氧自由基(ROS)生成水平，使其接近正常野生型细胞。
实施例4
本实施例测定病毒载体对X-CGD小鼠造血干细胞分化能力的影响。
转染X-CGD小鼠造血干细胞的方法为：
(1)从X-CGD小鼠胫骨取骨髓，使用STEMCELL公司的EasySepTMMouseHematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit分离提取小鼠造血干细胞；
(2)将1×106个小鼠造血干细胞重悬在100μL含有细胞因子(包括：SCF 50ng/mL、FLT3-L 50ng/mL、IL6 10ng/mL和TPO 50ng/mL，购自Biotech公司)的培养基(StemSpanSFEM Medium，购自STEMCELL公司)中刺激培养17小时；
(3)吸掉50μL培养基，添加50μL新的含有细胞因子的培养基重悬细胞，加入8μg/mL的聚凝胺(polybrene)，加入病毒载体混匀，转染MOI＝200，连续转染2次，1次/天，室温下100×g离心100min；
(4)转染结束后，收集细胞，并接种于含有20％FBS的新鲜RPMI1640培养基中，加入20μg/mL小鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF细胞因子，PeproTech公司)，进行诱导分化，每2天换一次培养基，培养14天。
小鼠造血干细胞经小鼠粒细胞集落刺激因子诱导后能够分化为髓系细胞(吞噬细胞、中性粒细胞)，CD11b为髓系细胞的重要标记物，流式检测细胞CD11b阳性百分比即可测定细胞的分化情况，结果如图6所示，以isotype抗体处理未进行慢病毒转染的细胞作为阴性对照(ISO)。
由图6可知，WT组CD11b+％为85.8％，miR223组CD11b+％为97.26％，CD68组83.86％，表明本发明构建的慢病毒载体转染细胞后并不会影响细胞的分化能力，即所述慢病毒载体具备安全性。
实施例5
本实施例测定慢病毒载体对X-CGD小鼠造血干细胞分化后吞噬功能影响。
慢病毒转染及分化诱导实验同实施例4所述，取诱导分化完全的细胞，使用PBS清洗、计数，按照细胞/E.coli-GFP+为1:100进行实验，培养基为含有20％FBS的新鲜RPMI1640培养基，共培养2.5小时，PBS清洗细胞，使用流式细胞仪检测FITC荧光，结果如图7所示。
由图7可知，其中野生型细胞(WT组)的CD11b+％为83.27％，E.coli-GFP+％为87.07％；转染慢病毒LV-miR223细胞(miR223组)的CD11b+％为89.76％，E.coli-GFP+％为84.59％；转染慢病毒LV-CD68细胞(CD68组)的CD11b+％为83.99％，E.coli-GFP+％为82.77％，经过比较可知，本发明设计的慢病毒转染造血干细胞后，对造血干细胞向髓系分化及分化后的细胞吞噬功能没有影响，证明了本发明设计的慢病毒载体的安全性。
实施例6
本实施例在X-CGD小鼠体内评估慢病毒载体校正吞噬细胞、中性粒细胞功能。
以感染复数(MOI)为200，取细胞1.5×106个，分别将慢病毒LV-miR223、慢病毒LV-CD86和慢病毒LV-EF1α体外转染X-CGD小鼠造血干细胞，转染X-CGD小鼠造血干细胞方法同实施例4所述。
对X-CGD小鼠进行辐照清髓预处理，放射剂量为4.5Gy，处理后第四天进行尾静脉移植上述慢病毒转染细胞，4周后取外周血检测，包括qPCR检测载体拷贝数，流式检测CYBB基因表达以及通过二氢罗丹明(DHR123)染色，测定第细胞中活性氧自由基(ROS)生成水平。
图8为载体拷贝数结果图，图9为CYBB基因表达结果图，图10为细胞中活性氧自由基(ROS)生成水平结果图，图8表明慢病毒能够高效转染，由图9和图10可知，同型的野生型C57小鼠(WT组)的gp91-phox+％为59.37％，Rhodamine123+％为68.59％；移植野生型C57小鼠造血干细胞的CGD小鼠(WT-trans组)：gp91-phox+％为57.14％，Rhodamine123+％为61.26％；移植LV-miR223转染的造血干细胞的CGD小鼠(miR223组)：gp91-phox+％为58.98％，Rhodamine123+％为58.29％；移植LV-CD68转染的造血干细胞的CGD小鼠(CD68组)：gp91-phox+％为58.29％，Rhodamine123+％为61.35％，经过比较发现，本发明设计的慢病毒载体转染的造血干细胞移植回X-CGD小鼠后能够有效的恢复gp91-phox蛋白的表达，并且能够恢复活性氧(ROS)生成功能，证明了本发明设计的慢病毒载体的有效性。
综上所述，本发明将髓系特异性启动子和CYBB基因插入慢病毒表达载体，所构建慢病毒表达载体具备高转染效率、稳定表达能力和安全性，且具备髓系特异性，在髓系细胞中高效表达，能够有效恢复gp91-phox蛋白的表达，恢复活性氧(ROS)生成功能，对于治疗慢性肉芽肿并具有重要意义。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京美康基免生物科技有限公司
<120> 一种髓系特异性启动子及其应用
<130> 20210425
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 778
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acttgtacag cttcacaggg ctccatgctt agaaggaccc cacacttagt ttaatgttct 60
gctgtcatca tcttgatatt cttaattttt aaataaaggg cctatcgttt tcatttttta 120
ctgggccttg caaattatgt agctggttct gtatgccagg agagaagttg gaagtaaaat 180
ggtattccag gaccaggagg cattctggca gagtgaaaga acatgtgatt tggagtccat 240
ggggatgggt ttaaatttca gctttccact aatttgcttt gtgatactga gtatttcctt 300
ttatccctca gaggctctgt ttctcaattt tgactacggg ttttttcatt agataatgtc 360
tcagttctgg tattccaggt ttccctcaat tattctggga aaacctcctt gacccacagg 420
cagagcctag ggcagccagg tgctttctac tctctctctc tctgcagctt ggaaagttag 480
tgtctgttga aggtcagctg ggagttggtg gaggcagggc agtggcctgc tactattgct 540
gcagtagcag accctttcac aacagcattg ttttgtcatt ttgcatccag atttccgttg 600
gctaacctca gtcttatctt cctcatttct gtttcctgtt gaagacacca agggcccttc 660
aaaacacaga agcttcttgc tcacggcaga aagcccaatt ccatctggcc cctgcaggtt 720
ggctcagcac tggggaatca gagtcccctc catgaccaag gcaccactcc actgacag 778
<210> 2
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tagccatttg ctggaccaaa tctggaggga gaacccctaa aacccctaag tgaggttgcc 60
cagggggttg tccccaggtg gggggaagca ggggagagaa aatggtagcc atttttacat 120
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gggtgcatct ctgctccccc cttccccagc agatggttac ctttgggctg ttgctttctt 300
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Claims (19)

1.一种髓系特异性启动子，其特征在于，所述髓系特异性启动子为SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括权利要求1所述的髓系特异性启动子。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括含有权利要求1所述的髓系特异性启动子的病毒载体或质粒载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述病毒载体包括pTYF慢病毒载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包括CYBB基因。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述CYBB基因包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述的髓系特异性启动子启动所述CYBB基因的表达。
8.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒含有权利要求2-7任一项所述的重组表达载体。
9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求1所述的髓系特异性启动子。
10.根据权利要求9所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求2-7任一项所述的重组表达载体。
11.根据权利要求10所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求8所述的重组慢病毒。
12.一种如权利要求9-11任一项所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将权利要求2-7任一项所述的重组表达载体或权利要求8所述的重组慢病毒导入宿主细胞，得到所述重组细胞。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述导入的方法包括电转导、病毒载体系统、非病毒载体系统或基因枪注射中的任意一种。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞包括造血干细胞。
15.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)构建慢病毒载体；
(2)将步骤(1)所述的慢病毒载体与包装质粒共转染哺乳动物细胞，进行慢病毒包装；
(3)将步骤(2)包装的慢病毒转化入宿主细胞，得到所述重组细胞。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述构建慢病毒载体包括将权利要求1所述的髓系特异性启动子和CYBB基因插入pTYF慢病毒载体；
步骤(2)所述包装质粒包括pNHP和pHEF-VSVG；
步骤(2)所述哺乳动物细胞包括293T细胞。
17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的髓系特异性启动子、权利要求2-7任一项所述的重组表达载体、权利要求8所述的重组慢病毒或权利要求9-11任一项所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
19.如权利要求1所述的髓系特异性启动子、权利要求2-7任一项所述的重组表达载体、权利要求8所述的重组慢病毒、权利要求9-11任一项所述的重组细胞或权利要求17或18所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用；
所述疾病包括慢性肉芽肿病。
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