JP2016129524A - 改善された遺伝子治療方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】改善された遺伝子治療方法の提供。【解決手段】本発明は、一般に、改善された遺伝子治療ベクター、細胞に基づく組成物、およびそれを遺伝子治療の方法において使用する方法を提供する。本発明は、造血細胞を増大させるための改善された遺伝子治療組成物、ならびにサラセミアおよび貧血などの造血系の疾患、障害、および状態を処置するための関連する方法をさらに提供する。種々の実施形態では、本発明は、一部において、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、目的の遺伝子に作動可能に連結した造血細胞発現制御配列と、切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した遍在発現制御配列と、右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むベクターを意図している。【選択図】図３

Description

配列表に関する陳述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称はＢＬＢＤ＿００５＿００ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは９５ＫＢであり、２０１１年９月２３日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
背景
技術分野
本発明は、一般に、細胞を増大させるため、および遺伝子治療を用いて障害を処置するために使用する組成物に関する。より詳細には、本発明は、造血細胞を増大させるための改善された遺伝子治療組成物、ならびに造血系の疾患、障害、および状態を処置するための関連する方法に関する。
先行技術の説明
遺伝子治療の分野における最近の進歩により、βサラセミアおよび鎌状赤血球貧血などの異常ヘモグロビン症を患っている患者が新規の治療的手法から恩恵を受けることになるという期待が高まっている。β−グロビン遺伝子を保有するレンチウイルスベクターを用いて改変した造血細胞（ＨＣ）を移植することにより、ヘモグロビン障害のいくつかのマウスモデルの長期にわたる調整（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）がもたらされた（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）が、対照的に、わずか１名のβサラセミア患者で輸血非依存性が導かれた（非特許文献５）。遺伝子改変された自己細胞を注入することの主要な利点は、ＧＶＨＤおよび免疫抑制性移植前処置のリスクを回避すること、ならびに適合するドナーの不足に対処することであるが、現行の療法では、少なくとも３つの実質的な警告：毒性の骨髄破壊が必要条件であること（非特許文献６）；現行の遺伝子移入方法では造血幹細胞（ＨＳＣ）をほんの一部しか形質導入することができないこと（非特許文献７）；ならびに、利用可能な種々のｉｎ ｖｉｖｏ選択戦略は有効性および安全性が最適以下になること（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）に直面する。
例えば、βサラセミアレシピエントマウスでは、安定な生着および表現型の改善を実現するために、少なくとも２００ラドの放射線照射および非常に高用量の骨髄細胞（＞２０×１０６）が必要であった（非特許文献１１。しかし、放射線を照射したマウスレピシエント（非特許文献１２）ならびに骨髄破壊されていないマウスレシピエント（非特許文献１３）におけるサイトカイン増大骨髄細胞の長期再増殖能は欠陥があり、その結果、移植前順化レジメンの非存在下ではマウスおよび患者におけるレトロウイルスにより形質導入された細胞の生着が低レベルになる（非特許文献１４）。
したがって、当技術分野において、造血障害を処置または予防するための改善された遺伝子治療の方法が必要である。本発明は、当技術分野で厄介なこれらおよび他の問題に対する解決を提供する。
Ｉｍｒｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００２年；９９巻（２２号）：１４３８０〜１４３８５頁 Ｍａｌｉｋら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ２００５年；１０５４巻：２３８〜２４９頁 Ｍａｙら、Ｎａｔｕｒｅ． ２０００年；４０６巻（６７９１号）：８２〜８６頁 Ｐａｗｌｉｕｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００１年；２９４巻（５５５０号）：２３６８〜２３７１頁 Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、Ｎａｔｕｒｅ． ２０１０年；４６７巻（７３１３号）：３１８〜３２２頁 Ｄｕｎｂａｒら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９８年；９巻（１７号）：２６２９〜２６４０頁 Ｓａｎｔｏｎｉ ｄｅ ＳｉｏおよびＮａｌｄｉｎｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９年；５０６巻：５９〜７０頁 Ｂｅａｒｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１０年；１２０巻（７号）：２３４５〜２３５４頁 Ｃｏｒｎｅｔｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００６年；１３巻（９号）：８８６〜８９５頁 Ｍｉｌｓｏｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００８年；６８巻（１５号）：６１７１〜６１８０頁 Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ２００２年；８巻（８号）：４５３〜４６１頁 Ｐｅｔｅｒｓら、Ｂｌｏｏｄ． １９９６年；８７巻（１号）：３０〜３７頁 Ｒａｍｓｈａｗら、Ｂｌｏｏｄ． １９９５年；８６巻（３号）：９２４〜９２９頁 Ｄｕｎｂａｒら、１９９８年；Ｋｉｔｔｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ． １９９７年；９０巻（２号）：８６５〜８７２頁
簡単な要旨
本発明は、細胞を増大させるためおよび遺伝子治療を用いて障害を処置するための組成物を提供する。種々の実施形態では、本発明は、造血細胞を増大させるための改善された遺伝子治療組成物、ならびに造血系の疾患、障害、および状態を処置するための関連する方法を提供する。
種々の実施形態では、本発明は、一部において、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、目的の遺伝子に作動可能に連結した造血細胞発現制御配列と、切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した遍在発現制御配列と、右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むベクターを意図している。
特定の実施形態では、造血細胞発現制御配列は造血幹細胞プロモーターまたは造血前駆細胞プロモーターである。
ある実施形態では、造血細胞発現制御配列は、赤血球系細胞特異的プロモーターおよび必要に応じて赤血球系細胞特異的エンハンサーを含む。
さらなる実施形態では、造血細胞発現制御配列は、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される。
追加的な実施形態では、遍在発現制御配列は、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン−Ｃプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、およびシミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）からなる群から選択される。
特定の一実施形態では、目的の遺伝子は、ヒトβ−グロビン、ヒトδ−グロビン、およびヒトγ−グロビンからなる群から選択される。
別の特定の実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子は、コドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である。
ある特定の実施形態では、ｔＥｐｏＲはＣ末端切断を含む。
特定の追加的な実施形態では、Ｃ末端切断により、ｔＥｐｏＲのターンオーバーは内因性のエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）と比較して低下する。
さらなる特定の実施形態では、Ｃ末端切断により、ｔＥｐｏＲの半減期は内因性のエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）と比較して増加する。
種々の実施形態では、本発明は、一部において、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、目的の遺伝子に作動可能に連結した第１の赤血球系細胞特異的発現制御配列と、ｔＥｐｏＲに作動可能に連結した第２の赤血球系細胞特異的発現制御配列と、右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むベクターを意図している。
一実施形態では、第１の赤血球系細胞特異的発現制御配列は、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される。
特定の実施形態では、第２の赤血球系細胞特異的発現制御配列は、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される。
ある実施形態では、目的の遺伝子は、ヒトβ−グロビン、ヒトδ−グロビン、およびヒトγ−グロビンからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子、イントロン配列の１つまたは複数の欠失を含む欠失ヒトβ−グロビン遺伝子、および少なくとも１つの抗鎌状赤血球化アミノ酸残基をコードする変異ヒトβ−グロビン遺伝子からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子は、コドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である。
さらなる特定の実施形態では、ｔＥｐｏＲはＣ末端切断を含む。
追加的な実施形態では、ｔＥｐｏＲは約１０〜約１００アミノ酸のＣ末端切断を含む。
さらなる追加的な実施形態では、ｔＥｐｏＲは５０〜６０アミノ酸のＣ末端切断を含む。
特定の一実施形態では、ｔＥｐｏＲは８０〜９０アミノ酸のＣ末端切断を含む。
別の特定の実施形態では、ｔＥｐｏＲは８５〜９５アミノ酸のＣ末端切断を含む。
さらに別の特定の実施形態では、ｔＥｐｏＲは、約５５アミノ酸、約８３アミノ酸、または約９１アミノ酸のＣ末端切断を含む。
種々の実施形態では、本発明は、一部において、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、目的の遺伝子に作動可能に連結したβ−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した発現制御配列と、右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むベクターを意図している。
一実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、レンチウイルスベクターである。
ある実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、レンチウイルス由来の５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲ、すなわち、１つのレンチウイルスＬＴＲを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、レンチウイルス由来の５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ、すなわち、複数のレンチウイルスＬＴＲを含む。
あるさらなる実施形態では、レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択される。
ある追加的な実施形態では、レンチウイルスはＨＩＶ−１である。
特定の追加的な実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターは異種プロモーターで置き換えられる。
特定のさらなる実施形態では、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
ある特定の実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、１つまたは複数の改変を含む３’ＬＴＲを含む。
特定の実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、１つまたは複数の欠失を含む３’ＬＴＲを含む。
特定の一実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、自己不活性化（ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）（ＳＩＮ）ＬＴＲである３’ＬＴＲを含む。
一実施形態では、β−グロビンプロモーターはヒトβ−グロビンプロモーターである。
別の実施形態では、β−グロビンＬＣＲは、ヒトβ−グロビンＬＣＲ由来のＤＮＡアーゼＩ高感受性部位２、３および４のうちの１つまたは複数を含む。
追加的な実施形態では、目的の遺伝子はグロビン遺伝子である。
さらなる実施形態では、グロビン遺伝子は、ヒトβ−グロビン、ヒトδ−グロビン、およびヒトγ−グロビンからなる群から選択される。
ある実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子、イントロン配列の１つまたは複数の欠失を含む欠失ヒトβ−グロビン遺伝子、および少なくとも１つの抗鎌状赤血球化アミノ酸残基をコードする変異ヒトβ−グロビン遺伝子からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子はコドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である。
特定の一実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、ヒトβ−グロビン３’エンハンサーエレメントをさらに含む。
さらなる実施形態では、発現制御配列は、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン−Ｃプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、およびシミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）からなる群から選択される遍在発現制御配列である。
特定の実施形態では、発現制御配列は、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される赤血球特異的発現制御配列である。
ある特定の実施形態では、赤血球特異的発現制御配列はヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターを含む。
特定の実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、セントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）／ＤＮＡフラップ（ＤＮＡ ｆｌａｐ）（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメント（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｅｘｐｏｒｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）と、転写後調節エレメントと、インスレーターエレメントと、ポリアデニル化配列と、選択マーカーと、細胞自殺遺伝子のうちの１つまたは複数とを含む。
ある実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメントと、インスレーターエレメントと、ポリアデニル化配列とを含む。
さらなる実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）であるレトロウイルス輸送エレメントを含む。
追加的な実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、ＨＩＶ−１由来のｃＰＰＴ／ＦＬＡＰを含む。
一実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、最適化されたコザック配列を含む目的の遺伝子を含む。
種々の実施形態では、ｔＥｐｏＲは、最適化されたコザック配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書において意図されているベクターはいずれも、最適なコザック配列（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧを含み、ここで、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である。
追加的な実施形態では、３’ＬＴＲは、少なくとも１つのインスレーターエレメントを含む。
ある追加的な実施形態では、３’ＬＴＲは、２つのインスレーターエレメントを含む。
特定の追加的な実施形態では、インスレーターは、配列番号３７または配列番号３８に記載のポリヌクレオチド配列を含む。
さらなる追加的な実施形態では、インスレーターは、配列番号３７のヌクレオチド８〜４９に記載のポリヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態では、ポリアデニル化配列は、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、およびウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）からなる群から選択される。
一実施形態においては、ｔＥｐｏＲは、Ｃ末端切断を含む。
別の実施形態では、ｔＥｐｏＲは、約１０〜約１００アミノ酸のＣ末端切断を含む。
さらに別の実施形態では、ｔＥｐｏＲは、５０〜６０アミノ酸のＣ末端切断を含む。
なおさらに別の実施形態では、ｔＥｐｏＲは、８０〜９０アミノ酸のＣ末端切断を含む。
特定の一実施形態では、ｔＥｐｏＲは、８５〜９５アミノ酸のＣ末端切断を含む。
さらなる実施形態では、ｔＥｐｏＲは、約５５アミノ酸、約８３アミノ酸、または約９１アミノ酸のＣ末端切断を含む。
種々の実施形態では、本発明は、一部において、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメントと、目的の遺伝子に作動可能に連結したβ−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した赤血球系細胞特異的発現制御配列と、１つまたは複数のインスレーターエレメント、またはポリアデニル化配列を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むベクターを意図している。
種々の特定の実施形態では、本発明は、一部において、左側の（５’）ＨＩＶ−１ ＬＴＲと、プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、ＨＩＶ−１セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、目的の遺伝子に作動可能に連結したβ−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した赤血球系細胞特異的発現制御配列と、１つまたは複数のインスレーターエレメント、およびウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むレンチウイルスベクターを意図している。
種々の他の実施形態では、本発明は、一部において、本明細書において意図されているベクターのいずれかを含む組成物を意図している。
一実施形態では、組成物は細胞を含む。
追加的な実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、成体前駆細胞、および分化した成体細胞からなる群から選択される。
特定の実施形態では、細胞は造血幹細胞または造血前駆細胞である。
さらなる実施形態では、幹細胞または前駆細胞の供給源は骨髄、臍帯血、胎盤血、または末梢血である。
ある実施形態では、細胞は、ベクターを用いて形質導入される。
別の実施形態では、ベクターは、エピソームベクターであるまたは細胞のゲノムに組み込まれない。
特定の実施形態では、ベクターは細胞のゲノムに組み込まれる。
特定の一実施形態では、組み込みはゲノムにおける位置を標的にする。
種々の実施形態では、本発明は、一部において、形質導入された細胞を被験体に提供する方法であって、本明細書において意図されているベクターのいずれかを用いて形質導入された細胞を含む細胞の集団を投与する工程を含む方法を意図している。
特定の実施形態では、形質導入された細胞は造血幹細胞を含む。
ある実施形態では、形質導入された細胞は造血前駆細胞を含む。
ある実施形態では、細胞の集団は、本明細書において意図されているベクターのいずれかを用いて形質導入された細胞を５％含む。
さらなる実施形態では、細胞の集団は、本明細書において意図されているベクターのいずれかを用いて形質導入された細胞を１０％含む。
関連する特定の実施形態では、細胞の集団は、本明細書において意図されているベクターのいずれかを用いて形質導入された細胞を２５％含む。
種々の実施形態では、形質導入された細胞を被験体に提供する方法は、エリスロポエチンを該被験体に投与する工程をさらに含む。
一実施形態では、細胞の集団およびエリスロポエチンを非経口的に投与する。
ある実施形態では、非経口投与は静脈内投与である。
追加的な実施形態では、エリスロポエチンを上記被験体に投与する前に細胞の集団を該被験体に投与する。
一実施形態では、被験体は異常ヘモグロビン症を有する。
特定の実施形態では、異常ヘモグロビン症は、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、サラセミアメジャー、中等症サラセミア、α−サラセミア、およびヘモグロビンＨ症からなる群から選択される。
種々の他の実施形態では、本発明は、一部において、被験体における異常ヘモグロビン症を処置する方法であって、本明細書において意図されているベクターのいずれかを用いて形質導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞の集団を投与する工程を含み、ここで、造血幹細胞または造血前駆細胞あるいは造血幹細胞または造血前駆細胞の後代細胞が、エリスロポエチンを投与した後の該被験体において、エリスロポエチンを投与する前の該被験体における造血幹細胞または造血前駆細胞あるいは後代細胞と比較して増加する方法を意図している。
特定の実施形態では、細胞の集団は骨髄、臍帯血、胎盤血、または末梢血から単離された。
追加的な実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞の５％は形質導入されている。
ある実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞の１０％は形質導入されている。
さらなる実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞の２５％は形質導入されている。
特定の実施形態では、被験体における異常ヘモグロビン症を処置する方法は、エリスロポエチンを該被験体に投与する工程を含む。
一実施形態では、細胞の集団およびエリスロポエチンを血管内に投与する。
さらなる実施形態では、投与は静脈内である。
別の実施形態では、異常ヘモグロビン症は、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、サラセミアメジャー、中等症サラセミア、α−サラセミア、およびヘモグロビンＨ症からなる群から選択される。
別の特定の実施形態では、異常ヘモグロビン症はβ−サラセミアである。
ある特定の実施形態では、被験体は、骨髄切除化学療法もしくは放射線照射を受けたまたは骨髄切除化学療法もしくは放射線照射を受けている。
特定のさらなる実施形態では、被験体において増加した後代細胞は赤血球系細胞を含む。
追加的な特定の実施形態では、赤血球系細胞は赤血球前駆細胞である。
一実施形態では、赤血球系細胞は赤血球である。
一実施形態では、赤血球系細胞は、エリスロポエチンを投与した後に、エリスロポエチンを投与する前の被験体における赤血球系細胞と比較して少なくとも１０倍増加する。
別の実施形態では、赤血球系細胞は、エリスロポエチンを投与した後に、エリスロポエチンを投与する前の被験体における赤血球系細胞と比較して少なくとも２５倍増加する。
さらに別の実施形態では、赤血球系細胞は、エリスロポエチンを投与した後に、エリスロポエチンを投与する前の被験体における赤血球系細胞と比較して少なくとも５０倍増加する。
なおさらに別の実施形態では、赤血球系細胞は、エリスロポエチンを投与した後に、エリスロポエチンを投与する前の被験体における赤血球系細胞と比較して少なくとも１００倍増加する。
特定の実施形態では、赤血球系細胞は、エリスロポエチンを投与した後に、被験体における非赤血球系細胞と比較して少なくとも２５倍増加する。
別の特定の実施形態では、赤血球系細胞は、エリスロポエチンを投与した後に、被験体における非赤血球系細胞と比較して少なくとも５０倍増加する。
なおさらに別の特定の実施形態では、赤血球系細胞は、エリスロポエチンを投与した後に、被験体における非赤血球系細胞と比較して少なくとも１００倍増加する。
なおさらに別の特定の実施形態では、赤血球系細胞は、エリスロポエチンを投与した後に、被験体における非赤血球系細胞と比較して少なくとも１５０倍増加する。
種々の他の実施形態では、本発明は、一部において、被験体における赤血球系細胞の数を選択的に増大させる方法であって、本明細書において意図されているベクターのいずれかを用いて形質導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞の集団を投与する工程を含み、ここで該被験体において造血幹細胞の赤血球系後代細胞の数が増大する方法を意図している。
種々の特定の実施形態では、本発明は、一部において、被験体において白血球と比較して赤血球の割合を増加させる方法であって、本明細書において意図されているベクターのいずれかを用いて形質導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞の集団を投与する工程、エリスロポエチンを該被験体に投与する工程を含み、ここで、該被験体において、造血幹細胞の白血球後代細胞と比較して造血幹細胞の赤血球後代細胞の割合が増加する方法を意図している。
特定の実施形態では、被験体における赤血球系細胞の数を選択的に増大させる方法は、エリスロポエチンを該被験体に投与する工程を含む。
特定の実施形態では、被験体において白血球と比較して赤血球の割合を増加させる方法は、エリスロポエチンを該被験体に投与する工程を含む。
ある実施形態では、細胞の集団は骨髄、臍帯血、胎盤血、または末梢血から単離された。
一実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞の５％は形質導入されている。
別の実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞の１０％は形質導入されている。
さらに別の実施形態では、造血幹細胞または造血前駆細胞の２５％は形質導入されている。
ある実施形態では、細胞の集団およびエリスロポエチンを血管内に投与する。
別のある実施形態では、投与は静脈内である。
さらなる実施形態では、被験体は異常ヘモグロビン症を有する。
さらなる特定の実施形態では、異常ヘモグロビン症は、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、サラセミアメジャー、中等症サラセミア、α−サラセミア、およびヘモグロビンＨ症からなる群から選択される。
さらなる追加的な実施形態では、異常ヘモグロビン症はβ−サラセミアである。
さらなるある実施形態では、被験体は、骨髄切除化学療法もしくは放射線照射を受けたまたは骨髄切除化学療法もしくは放射線照射を受けている。
一実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、赤血球系後代細胞はエリスロポエチンを投与する前の被験体における赤血球系後代細胞と比較して少なくとも１０倍増加する。
別の実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、赤血球系後代細胞はエリスロポエチンを投与する前の被験体における赤血球系後代細胞と比較して少なくとも２５倍増加する。
さらに別の実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、赤血球系後代細胞はエリスロポエチンを投与する前の被験体における赤血球系後代細胞と比較して少なくとも５０倍増加する。
なおさらに別の実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、赤血球系後代細胞はエリスロポエチンを投与する前の被験体における赤血球系後代細胞と比較して少なくとも１００倍増加する。
特定の実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、被験体において、赤血球系後代細胞は非赤血球系細胞と比較して２５倍増加する。
別の特定の実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、被験体において、赤血球系後代細胞は非赤血球系細胞と比較して５０倍増加する。
さらに別の特定の実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、被験体において、赤血球系後代細胞は非赤血球系細胞と比較して１００倍増加する。
なおさらに別の特定の実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、被験体において、赤血球系細胞後代は非赤血球系細胞と比較して１５０倍増加する。
種々の実施形態では、赤血球系後代細胞は赤血球を含む。
ある実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、被験体において、ＲＢＣはＷＢＣと比較して少なくとも２５倍増加する。
別のある実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、被験体において、ＲＢＣはＷＢＣと比較して少なくとも５０倍増加する。
さらに別のある実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、被験体において、ＲＢＣはＷＢＣと比較して少なくとも１００倍増加する。
なおさらに別の実施形態では、エリスロポエチンを投与した後に、被験体においてＲＢＣがＷＢＣと比較して少なくとも１５０倍増加する。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ａ）左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、
ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結した造血細胞発現制御配列と、
ｃ）切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した遍在発現制御配列と、
ｄ）右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと
を含むベクター。
（項目２）
前記造血細胞発現制御配列が造血幹細胞プロモーターまたは造血前駆細胞プロモーターである、項目１に記載のベクター。
（項目３）
前記造血細胞発現制御配列が、赤血球系細胞特異的プロモーターおよび必要に応じて赤血球系細胞特異的エンハンサーを含む、項目１に記載のベクター。
（項目４）
前記造血細胞発現制御配列が、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される、項目３に記載のベクター。
（項目５）
前記遍在発現制御配列が、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン−Ｃプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、およびシミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）からなる群から選択される、項目１に記載のベクター。
（項目６）
前記目的の遺伝子が、ヒトβ−グロビン、ヒトδ−グロビン、およびヒトγ−グロビンからなる群から選択される、項目１に記載のベクター。
（項目７）
前記ヒトβ−グロビン遺伝子が、コドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である、項目６に記載のベクター。
（項目８）
前記ｔＥｐｏＲがＣ末端切断を含む、項目１に記載のベクター。
（項目９）
前記Ｃ末端切断により、前記ｔＥｐｏＲのターンオーバーが内因性のエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）と比較して低下する、項目８に記載のベクター。
（項目１０）
前記Ｃ末端切断により、前記ｔＥｐｏＲの半減期が内因性のエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）と比較して増加する、項目８に記載のベクター。
（項目１１）
ａ）左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、
ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結した第１の赤血球系細胞特異的発現制御配列と、
ｃ）ｔＥｐｏＲに作動可能に連結した第２の赤血球系細胞特異的発現制御配列と、
ｄ）右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと
を含むベクター。
（項目１２）
前記第１の赤血球系細胞特異的発現制御配列が、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される、項目１１に記載のベクター。
（項目１３）
前記第２の赤血球系細胞特異的発現制御配列が、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される、項目１１に記載のベクター。
（項目１４）
前記目的の遺伝子が、ヒトβ−グロビン、ヒトδ−グロビン、およびヒトγ−グロビンからなる群から選択される、項目１１に記載のベクター。
（項目１５）
前記ヒトβ−グロビン遺伝子が、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子、イントロン配列の１つまたは複数の欠失を含む欠失ヒトβ−グロビン遺伝子、および少なくとも１つの抗鎌状赤血球化アミノ酸残基をコードする変異ヒトβ−グロビン遺伝子からなる群から選択される、項目１４に記載のベクター。
（項目１６）
前記ヒトβ−グロビン遺伝子が、コドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である、項目１５に記載のベクター。
（項目１７）
前記ｔＥｐｏＲがＣ末端切断を含む、項目１１に記載のベクター。
（項目１８）
前記ｔＥｐｏＲが約１０〜約１００アミノ酸のＣ末端切断を含む、項目１１に記載のベクター。
（項目１９）
前記ｔＥｐｏＲが５０〜６０アミノ酸のＣ末端切断を含む、項目１１に記載のベクター。
（項目２０）
前記ｔＥｐｏＲが８０〜９０アミノ酸のＣ末端切断を含む、項目１１に記載のベクター。
（項目２１）
前記ｔＥｐｏＲが８５〜９５アミノ酸のＣ末端切断を含む、項目１１に記載のベクター。
（項目２２）
前記ｔＥｐｏＲが約５５アミノ酸、約８３アミノ酸、または約９１アミノ酸のＣ末端切断を含む、項目１１に記載のベクター。
（項目２３）
ａ）左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、
ｂ）目的の遺伝子に作動可能に連結したβ−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、
ｃ）切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した発現制御配列と、
ｄ）右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと
を含むベクター。
（項目２４）
レンチウイルスベクターである、項目１から２３までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目２５）
前記５’ＬＴＲまたは前記３’ＬＴＲがレンチウイルスＬＴＲである、項目１から２４までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目２６）
前記５’ＬＴＲおよび前記３’ＬＴＲがレンチウイルスＬＴＲである、項目１から２４までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目２７）
前記レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択される、項目２４から２６までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目２８）
前記レンチウイルスがＨＩＶ−１である、項目２４から２６までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目２９）
前記５’ＬＴＲのプロモーターが異種プロモーターと置き換えられている、項目１から２８までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目３０）
前記異種プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである、項目２９に記載のベクター。
（項目３１）
前記３’ＬＴＲが１つまたは複数の改変を含む、項目１から３０までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目３２）
前記３’ＬＴＲが１つまたは複数の欠失を含む、項目１から３１までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目３３）
前記３’ＬＴＲが自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである、項目１から３２までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目３４）
前記β−グロビンプロモーターがヒトβ−グロビンプロモーターである、項目２３に記載のベクター。
（項目３５）
前記β−グロビンＬＣＲが、ヒトβ−グロビンＬＣＲ由来のＤＮＡアーゼＩ高感受性部位２、３および４のうちの１つまたは複数を含む、項目２３に記載のベクター。
（項目３６）
前記目的の遺伝子がグロビン遺伝子である、項目２３に記載のベクター。
（項目３７）
前記グロビン遺伝子が、ヒトβ−グロビン、ヒトδ−グロビン、およびヒトγ−グロビンからなる群から選択される、項目３６に記載のベクター。
（項目３８）
前記ヒトβ−グロビン遺伝子が、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子、イントロン配列の１つまたは複数の欠失を含む欠失ヒトβ−グロビン遺伝子、および少なくとも１つの抗鎌状赤血球化アミノ酸残基をコードする変異ヒトβ−グロビン遺伝子からなる群から選択される、項目３７に記載のベクター。
（項目３９）
前記ヒトβ−グロビン遺伝子が、コドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である、項目３７に記載のベクター。
（項目４０）
ヒトβ−グロビン３’エンハンサーエレメントをさらに含む、項目２３に記載のベクター。
（項目４１）
前記発現制御配列が、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン−Ｃプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、およびシミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）からなる群から選択される遍在発現制御配列である、項目２３に記載のベクター。
（項目４２）
前記発現制御配列が、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される赤血球特異的発現制御配列である、項目２３に記載のベクター。
（項目４３）
前記赤血球特異的発現制御配列がヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターを含む、項目２３に記載のベクター。
（項目４４）
プサイパッケージング配列（Ψ＋）、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送エレメント、転写後調節エレメント、インスレーターエレメント、ポリアデニル化配列、選択マーカー、および細胞自殺遺伝子のうちの１つまたは複数をさらに含む、項目１から４３までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目４５）
プサイパッケージング配列（Ψ＋）、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送エレメント、インスレーターエレメント、およびポリアデニル化配列を含む、項目１から４３までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目４６）
前記レトロウイルス輸送エレメントがｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）である、項目１から４５までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目４７）
前記ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰがＨＩＶ−１由来である、項目１から４６までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目４８）
前記目的の遺伝子が、最適化されたコザック配列を含む、項目１から４６までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目４９）
前記ｔＥｐｏＲが、最適化されたコザック配列を含む、項目２３に記載のベクター。
（項目５０）
前記最適なコザック配列が（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧであり、ここで、Ｒがプリン（ＡまたはＧ）である、項目１から４７までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目５１）
前記３’ＬＴＲが、少なくとも１つのインスレーターエレメントを含む、項目４４から４５までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目５２）
前記３’ＬＴＲが、２つのインスレーターエレメントを含む、項目４４から４５までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目５３）
配列番号３７のヌクレオチド８〜４９に記載のインスレーター配列を含む、項目５１または項目５２に記載のベクター。
（項目５４）
配列番号３８に記載のインスレーター配列を含む、項目５１または項目５２に記載のベクター。
（項目５５）
前記ポリアデニル化配列が、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、およびウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）からなる群から選択される、項目４４または項目４５に記載のベクター。
（項目５６）
前記ｔＥｐｏＲが、Ｃ末端切断を含む、項目２３に記載のベクター。
（項目５７）
前記ｔＥｐｏＲが、約１０〜約１００アミノ酸のＣ末端切断を含む、項目２３に記載のベクター。
（項目５８）
前記ｔＥｐｏＲが、５０〜６０アミノ酸のＣ末端切断を含む、項目２３に記載のベクター。
（項目５９）
前記ｔＥｐｏＲが、８０〜９０アミノ酸のＣ末端切断を含む、項目２３に記載のベクター。
（項目６０）
前記ｔＥｐｏＲが、８５〜９５アミノ酸のＣ末端切断を含む、項目２３に記載のベクター。
（項目６１）
前記ｔＥｐｏＲが、約５５アミノ酸、約８３アミノ酸、または約９１アミノ酸のＣ末端切断を含む、項目２３に記載のベクター。
（項目６２）
ａ）左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、
ｂ）プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、
ｃ）セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、
ｄ）レトロウイルス輸送エレメントと、
ｅ）目的の遺伝子に作動可能に連結したβ−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、
ｆ）切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した赤血球系細胞特異的発現制御配列と、
ｇ）
ｉ）１つまたは複数のインスレーターエレメント、または
ｉｉ）ポリアデニル化配列
を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと
を含むベクター。
（項目６３）
ａ）左側の（５’）ＨＩＶ−１ ＬＴＲと、
ｂ）プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、
ｃ）ＨＩＶ−１セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、
ｄ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、
ｅ）目的の遺伝子に作動可能に連結したβ−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、
ｆ）切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した赤血球系細胞特異的発現制御配列と、
ｇ）
ｉ）１つまたは複数のインスレーターエレメント、および
ｉｉ）ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）
を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと
を含むレンチウイルスベクター。
（項目６４）
項目１から６３までのいずれか一項に記載のベクターを含む組成物。
（項目６５）
細胞を含む、項目６４に記載の組成物。
（項目６６）
前記細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、成体前駆細胞、および分化した成体細胞からなる群から選択される、項目６５に記載の組成物。
（項目６７）
前記細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、項目６５に記載の組成物。
（項目６８）
前記幹細胞または前記前駆細胞の供給源が骨髄、臍帯血、胎盤血、または末梢血である、項目６７に記載の組成物。
（項目６９）
前記細胞が、前記ベクターを用いて形質導入されている、項目６５に記載の組成物。
（項目７０）
前記ベクターが、エピソームベクターであるまたは前記細胞のゲノムに組み込まれない、項目６５に記載の組成物。
（項目７１）
前記ベクターが前記細胞のゲノムに組み込まれる、項目６５に記載の組成物。
（項目７２）
前記組み込みが前記ゲノムにおける位置を標的にしている、項目７１に記載の組成物。
（項目７３）
形質導入された細胞を被験体に提供する方法であって、項目１から６３までのいずれか一項に記載のベクターを用いて形質導入された細胞を含む細胞の集団を投与する工程を含む方法。
（項目７４）
前記形質導入された細胞が造血幹細胞を含む、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記形質導入された細胞が造血前駆細胞を含む、項目７３に記載の方法。
（項目７６）
前記細胞の集団が、項目１から６３までのいずれか一項に記載のベクターを用いて形質導入された細胞を５％含む、項目７３から７５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記細胞の集団が、項目１から６３までのいずれか一項に記載のベクターを用いて形質導入された細胞を１０％含む、項目７３から７５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記細胞の集団が、項目１から６３までのいずれか一項に記載のベクターを用いて形質導入された細胞を２５％含む、項目７３から７５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
エリスロポエチンを前記被験体に投与する工程をさらに含む、項目７３から７８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記細胞の集団およびエリスロポエチンを非経口的に投与する、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記非経口投与が静脈内投与である、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記エリスロポエチンを前記被験体に投与する前に前記細胞の集団を該被験体に投与する、項目７９に記載の方法。
（項目８３）
前記被験体が異常ヘモグロビン症を有する、項目７３に記載の方法。
（項目８４）
前記異常ヘモグロビン症が、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、サラセミアメジャー、中等症サラセミア、α−サラセミア、およびヘモグロビンＨ症からなる群から選択される、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
被験体における異常ヘモグロビン症を処置する方法であって、項目２３、６２、または６３のいずれか一項に記載のベクターを用いて形質導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞の集団を投与する工程を含み、ここで、該造血幹細胞または造血前駆細胞あるいは該造血幹細胞または造血前駆細胞の後代細胞が、エリスロポエチンを投与した後の該被験体において、エリスロポエチンを投与する前の該被験体における造血幹細胞または造血前駆細胞あるいは後代細胞と比較して増加する方法。
（項目８６）
前記細胞の集団が骨髄、臍帯血、胎盤血、または末梢血から単離された、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記造血幹細胞または前記造血前駆細胞の５％が形質導入されている、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記造血幹細胞または前記造血前駆細胞の１０％が形質導入されている、項目８５に記載の方法。
（項目８９）
前記造血幹細胞または前記造血前駆細胞の２５％が形質導入されている、項目８５に記載の方法。
（項目９０）
エリスロポエチンを前記被験体に投与する工程を含む、項目８５に記載の方法。
（項目９１）
前記細胞の集団およびエリスロポエチンを血管内に投与する、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記投与が静脈内投与である、項目９０または９１に記載の方法。
（項目９３）
前記異常ヘモグロビン症が、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、サラセミアメジャー、中等症サラセミア、α−サラセミア、およびヘモグロビンＨ症からなる群から選択される、項目８５または項目９０に記載の方法。
（項目９４）
前記異常ヘモグロビン症がβ−サラセミアである、項目８５または項目９０に記載の方法。
（項目９５）
前記被験体が、骨髄切除化学療法もしくは放射線照射を受けたまたは骨髄切除化学療法もしくは放射線照射を受けている、項目８５または項目９０に記載の方法。
（項目９６）
前記被験体において増加した前記後代細胞が赤血球系細胞を含む、項目８５または項目９０に記載の方法。
（項目９７）
前記赤血球系細胞が赤血球前駆細胞である、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記赤血球系細胞が赤血球である、項目９６に記載の方法。
（項目９９）
前記赤血球系細胞が、エリスロポエチンを投与した後に、エリスロポエチンを投与する前の前記被験体における該赤血球系細胞と比較して少なくとも１０倍増加する、項目９６に記載の方法。
（項目１００）
前記赤血球系細胞が、エリスロポエチンを投与した後に、エリスロポエチンを投与する前の前記被験体における該赤血球系細胞と比較して少なくとも２５倍増加する、項目９６に記載の方法。
（項目１０１）
前記赤血球系細胞が、エリスロポエチンを投与した後に、エリスロポエチンを投与する前の前記被験体における該赤血球系細胞と比較して少なくとも５０倍増加する、項目９６に記載の方法。
（項目１０２）
前記赤血球系細胞が、エリスロポエチンを投与した後に、エリスロポエチンを投与する前の前記被験体における該赤血球系細胞と比較して少なくとも１００倍増加する、項目９６に記載の方法。
（項目１０３）
前記赤血球系細胞が、エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体における非赤血球系細胞と比較して少なくとも２５倍増加する、項目９６に記載の方法。
（項目１０４）
前記赤血球系細胞が、エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体における非赤血球系細胞と比較して少なくとも５０倍増加する、項目９６に記載の方法。
（項目１０５）
前記赤血球系細胞が、エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体における非赤血球系細胞と比較して少なくとも１００倍増加する、項目９６に記載の方法。
（項目１０６）
前記赤血球系細胞が、エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体における非赤血球系細胞と比較して少なくとも１５０倍増加する、項目９６に記載の方法。
（項目１０７）
被験体における赤血球系細胞の数を選択的に増大させる方法であって、項目２３、６２、または６３のいずれか一項に記載のベクターを用いて形質導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞の集団を投与する工程を含み、ここで、該被験体において該造血幹細胞の赤血球系後代細胞の数が増大する方法。
（項目１０８）
被験体において白血球と比較して赤血球の割合を増加させる方法であって、項目２３、６２、または６３のいずれか一項に記載のベクターを用いて形質導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞の集団を投与する工程、エリスロポエチンを該被験体に投与する工程を含み、ここで、該被験体において、該造血幹細胞の白血球後代細胞と比較して該造血幹細胞の赤血球後代細胞の割合が増加する方法。
（項目１０９）
エリスロポエチンを前記被験体に投与する工程を含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１１０）
エリスロポエチンを前記被験体に投与する工程を含む、項目１０８に記載の方法。
（項目１１１）
前記細胞の集団が骨髄、臍帯血、胎盤血、または末梢血から単離された、項目１０７から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記造血幹細胞または前記造血前駆細胞の５％が形質導入されている、項目１０７から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記造血幹細胞または前記造血前駆細胞の１０％が形質導入されている、項目１０７から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記造血幹細胞または前記造血前駆細胞の２５％が形質導入されている、項目１０７から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
前記細胞の集団およびエリスロポエチンを血管内に投与する、項目１０７から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記投与が静脈内である、項目１０７から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記被験体が異常ヘモグロビン症を有する、項目１０７から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記異常ヘモグロビン症が、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、サラセミアメジャー、中等症サラセミア、α−サラセミア、およびヘモグロビンＨ症からなる群から選択される、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記異常ヘモグロビン症がβ−サラセミアである、項目１１７に記載の方法。
（項目１２０）
前記被験体が、骨髄切除化学療法もしくは放射線照射を受けたまたは骨髄切除化学療法もしくは放射線照射を受けている、項目１０７から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
エリスロポエチンを投与した後に、前記赤血球系後代細胞がエリスロポエチンを投与する前の前記被験体における該赤血球系後代細胞と比較して少なくとも１０倍増加する、項目１０９に記載の方法。
（項目１２２）
エリスロポエチンを投与した後に、前記赤血球系後代細胞がエリスロポエチンを投与する前の前記被験体における該赤血球系後代細胞と比較して少なくとも２５倍増加する、項目１０９に記載の方法。
（項目１２３）
エリスロポエチンを投与した後に、前記赤血球系後代細胞がエリスロポエチンを投与する前の前記被験体における該赤血球系後代細胞と比較して少なくとも５０倍増加する、項目１０９に記載の方法。
（項目１２４）
エリスロポエチンを投与した後に、前記赤血球系後代細胞がエリスロポエチンを投与する前の前記被験体における該赤血球系後代細胞と比較して少なくとも１００倍増加する、項目１０９に記載の方法。
（項目１２５）
エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体において、前記赤血球系後代細胞が非赤血球系細胞と比較して２５倍増加する、項目１０９に記載の方法。
（項目１２６）
エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体において、前記赤血球系後代細胞が非赤血球系細胞と比較して５０倍増加する、項目１０９に記載の方法。
（項目１２７）
エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体において、前記赤血球系後代細胞が非赤血球系細胞と比較して１００倍増加する、項目１０９に記載の方法。
（項目１２８）
エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体において、前記赤血球系細胞後代が非赤血球系細胞と比較して１５０倍増加する、項目１０９に記載の方法。
（項目１２９）
前記赤血球系後代細胞が赤血球を含む、項目１２１から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体において、前記ＲＢＣがＷＢＣと比較して少なくとも２５倍増加する、項目１１０に記載の方法。
（項目１３１）
エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体において、前記ＲＢＣがＷＢＣと比較して少なくとも５０倍増加する、項目１１０に記載の方法。
（項目１３２）
エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体において、前記ＲＢＣがＷＢＣと比較して少なくとも１００倍増加する、項目１１０に記載の方法。
（項目１３３）
エリスロポエチンを投与した後に、前記被験体において、前記ＲＢＣがＷＢＣと比較して少なくとも１５０倍増加する、項目１１０に記載の方法。
図１は、本明細書に記載の特定の実験において使用したいくつかのウイルスベクター構築物およびマウスエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）を示す。（Ａ）ＭＳＣＶ（マウス幹細胞ウイルス）ＬＴＲ（長い末端反復）プロモーターの制御下にある、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により駆動される増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子を含有するマウスガンマレトロウイルスベクター（γＲＶ）。ＥｐｏＲ ｃＤＮＡをＩＲＥＳの前にクローニングした。（Ｂ）ヒトβ−グロビンプロモーターの制御下にある改変β−グロビン（βＡＴ８７Ｑ）鎖および遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）をコードするＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ（ＬＧ）ベクター。ＬＧベクターは、右側の長い末端反復（ＬＴＲ）のＵ３領域の欠失、ウサギβ−グロビンポリＡシグナル、および高感受性部位４（ＨＳ４）ニワトリβ−グロビン遺伝子座の２つの２５０ｂｐのクロマチンインスレーターも含有する。ＬＧ／ＨＡ−Ｙ１は、ヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターの制御下にある切断型ＥｐｏＲ−Ｙ１ ｃＤＮＡを含有する。ＬＧ／ＨＡ−ｅＧＦＰは、ＥｐｏＲＹ１の代わりにｅＧＦＰを含有する。ＨＰＶ５７０は、ＥＦ１αプロモーターの制御下にあるｅＧＦＰを含有する。（Ｃ）マウスの野生型ＥｐｏＲ（ＥｐｏＲＹ１−８）および切断型ＥｐｏＲ（ＥｐｏＲＹ１−７〜ＥｐｏＲＹ１）。疎水性のリーダー配列を構成する最初の２４アミノ酸は存在せず、番号付けには考慮されていない。チロシン（Ｙ）３４３、４０１、４２９，４３１、４４３、４６０、４６４および４７９が示されている。ＥｐｏＲＹ１およびＥｐｏＲＹ１−２では、Ｙ４０１およびＹ４２９が終止コドンで置き換えられている。（Ｄ）ヒトの野生型ＥｐｏＲ（ｈＥｐｏＲＹ１−８）および切断型ＥｐｏＲ（ｈＥｐｏＲＹ１−７〜ＥｐｏＲＹ１）。疎水性のリーダー配列を構成する最初の２４アミノ酸は存在せず、番号付けには考慮されていない。チロシン（Ｙ）３４４、４０２、４３０、４３２、４４４、４６１、４６５および４８０が示されている。 図１は、本明細書に記載の特定の実験において使用したいくつかのウイルスベクター構築物およびマウスエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）を示す。（Ａ）ＭＳＣＶ（マウス幹細胞ウイルス）ＬＴＲ（長い末端反復）プロモーターの制御下にある、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により駆動される増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子を含有するマウスガンマレトロウイルスベクター（γＲＶ）。ＥｐｏＲ ｃＤＮＡをＩＲＥＳの前にクローニングした。（Ｂ）ヒトβ−グロビンプロモーターの制御下にある改変β−グロビン（βＡＴ８７Ｑ）鎖および遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）をコードするＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ（ＬＧ）ベクター。ＬＧベクターは、右側の長い末端反復（ＬＴＲ）のＵ３領域の欠失、ウサギβ−グロビンポリＡシグナル、および高感受性部位４（ＨＳ４）ニワトリβ−グロビン遺伝子座の２つの２５０ｂｐのクロマチンインスレーターも含有する。ＬＧ／ＨＡ−Ｙ１は、ヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターの制御下にある切断型ＥｐｏＲ−Ｙ１ ｃＤＮＡを含有する。ＬＧ／ＨＡ−ｅＧＦＰは、ＥｐｏＲＹ１の代わりにｅＧＦＰを含有する。ＨＰＶ５７０は、ＥＦ１αプロモーターの制御下にあるｅＧＦＰを含有する。（Ｃ）マウスの野生型ＥｐｏＲ（ＥｐｏＲＹ１−８）および切断型ＥｐｏＲ（ＥｐｏＲＹ１−７〜ＥｐｏＲＹ１）。疎水性のリーダー配列を構成する最初の２４アミノ酸は存在せず、番号付けには考慮されていない。チロシン（Ｙ）３４３、４０１、４２９，４３１、４４３、４６０、４６４および４７９が示されている。ＥｐｏＲＹ１およびＥｐｏＲＹ１−２では、Ｙ４０１およびＹ４２９が終止コドンで置き換えられている。（Ｄ）ヒトの野生型ＥｐｏＲ（ｈＥｐｏＲＹ１−８）および切断型ＥｐｏＲ（ｈＥｐｏＲＹ１−７〜ＥｐｏＲＹ１）。疎水性のリーダー配列を構成する最初の２４アミノ酸は存在せず、番号付けには考慮されていない。チロシン（Ｙ）３４４、４０２、４３０、４３２、４４４、４６１、４６５および４８０が示されている。 図１は、本明細書に記載の特定の実験において使用したいくつかのウイルスベクター構築物およびマウスエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）を示す。（Ａ）ＭＳＣＶ（マウス幹細胞ウイルス）ＬＴＲ（長い末端反復）プロモーターの制御下にある、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により駆動される増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子を含有するマウスガンマレトロウイルスベクター（γＲＶ）。ＥｐｏＲ ｃＤＮＡをＩＲＥＳの前にクローニングした。（Ｂ）ヒトβ−グロビンプロモーターの制御下にある改変β−グロビン（βＡＴ８７Ｑ）鎖および遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）をコードするＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ（ＬＧ）ベクター。ＬＧベクターは、右側の長い末端反復（ＬＴＲ）のＵ３領域の欠失、ウサギβ−グロビンポリＡシグナル、および高感受性部位４（ＨＳ４）ニワトリβ−グロビン遺伝子座の２つの２５０ｂｐのクロマチンインスレーターも含有する。ＬＧ／ＨＡ−Ｙ１は、ヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターの制御下にある切断型ＥｐｏＲ−Ｙ１ ｃＤＮＡを含有する。ＬＧ／ＨＡ−ｅＧＦＰは、ＥｐｏＲＹ１の代わりにｅＧＦＰを含有する。ＨＰＶ５７０は、ＥＦ１αプロモーターの制御下にあるｅＧＦＰを含有する。（Ｃ）マウスの野生型ＥｐｏＲ（ＥｐｏＲＹ１−８）および切断型ＥｐｏＲ（ＥｐｏＲＹ１−７〜ＥｐｏＲＹ１）。疎水性のリーダー配列を構成する最初の２４アミノ酸は存在せず、番号付けには考慮されていない。チロシン（Ｙ）３４３、４０１、４２９，４３１、４４３、４６０、４６４および４７９が示されている。ＥｐｏＲＹ１およびＥｐｏＲＹ１−２では、Ｙ４０１およびＹ４２９が終止コドンで置き換えられている。（Ｄ）ヒトの野生型ＥｐｏＲ（ｈＥｐｏＲＹ１−８）および切断型ＥｐｏＲ（ｈＥｐｏＲＹ１−７〜ＥｐｏＲＹ１）。疎水性のリーダー配列を構成する最初の２４アミノ酸は存在せず、番号付けには考慮されていない。チロシン（Ｙ）３４４、４０２、４３０、４３２、４４４、４６１、４６５および４８０が示されている。 図２は、移植の２０週間後の、ｔＥｐｏＲによって改変された末梢血液細胞の割合の増加を示す。（Ａ）ｅＧＦＰ陽性のＲＢＣおよびＷＢＣの平均百分率、標準誤差、および個々の値。γＲＶレトロウイルスベクター（１）、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１レトロウイルスベクター（２）、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−２レトロウイルスベクター（３）、またはγＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−８レトロウイルスベクター（４）によって造血細胞（ＨＣ）に形質導入した。（Ｂ）同じマウスにおいて測定された平均血漿中Ｅｐｏレベルおよび標準誤差。＊群１および群４と比較してＰ＜０．０５。 図３は、ＬＧベクター内のＨＡプロモーターによって付与されたｅＧＦＰの厳密な赤血球系の特異的発現を示す。ＬＧ／ＨＡ−ｅＧＦＰを形質導入した細胞を移植した正常なマウス（上）またはＨＰＶ５７０（ＥＦ１α−ｅＧＦＰ）を形質導入した細胞を移植した正常なマウス（下）のＢＭ（Ｂリンパ球系［Ｂ］、骨髄系［Ｍ］、および赤血球系［Ｅ］）、胸腺（Ｔリンパ球系［Ｔ］）、ならびに末梢血（Ｂ、Ｍ、Ｔ、およびＲＢＣ）におけるｅＧＦＰ陽性細胞の平均百分率および個々の値。白血球については、ＣＤ４５．２抗原発現によってドナー細胞を同定した。 図４は、ｔＥｐｏＲにより赤血球系細胞の増幅が媒介されることを示す。（Ａ〜Ｂ）ＬＧマウス（■）およびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウス（□）の末梢血中の改変されたＲＢＣの百分率と形質導入されたＷＢＣの百分率の間の関係。改変された白血球に対するｔＥｐｏＲの最小の影響を仮定すると、改変された赤血球系細胞の１倍、１０倍、５０倍、および２００倍の優先的増大（ＦＥ率）に対応する４つの理論曲線が方程式３（Ａ）および２（Ｂ）から導かれる。直線の湾曲が大きいこと（Ａ）および直線が左側にシフトしていること（Ｂ）は、改変された赤血球系細胞の、改変されていない細胞よりも大きな利点に対応する。（Ｃ〜Ｄ）囲み枠の下の境界および上の境界は、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルを示す。囲み枠の上および下のウィスカー（エラーバー）は、９０パーセンタイルおよび１０パーセンタイルを示す。囲み枠内の線は中央値を示す。（Ｃ）ＬＧマウス（■）およびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウス（□）における赤血球の増幅率ＦＥの中央値および個々の赤血球の増幅率ＦＥ。（Ｄ）ＬＧマウス（■）およびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウス（□）における、移植前の遺伝子改変された白血球（ＷＢＣ）画分とｅｘ ｖｉｖｏにおける改変されたＨＣ画分の間の比率の中央値および個々の比率。 図５は、貧血および赤血球形成異常の調整が、ベクターにおけるｔＥｐｏＲの存在とは関係なく、改変されたＲＢＣのレベルに一部依存することを示す。ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１を形質導入した骨髄細胞を移植したマウス（□）またはＬＧを形質導入した骨髄細胞を移植したマウス（■）。（Ａ）移植を受けたβサラセミアマウスの、全ヘモグロビン濃度およびヒトヘモグロビン濃度（Ｈｂ）、赤血球数（ＲＢＣ）、網状赤血球の百分率（Ｒｅｔｉｃ）および脾臓の重量と改変されたＲＢＣとの相関を示す。回帰直線および９５％信頼区間（破線）をＲＢＣの割合が４０％を超えるＬＧマウスから得た。水平方向および垂直方向に網掛けされた囲み枠の下の境界および上の境界は、βサラセミアのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの値の平均±ＳＤを示す。ヘモグロビンについて、下の回帰直線および上の回帰直線は、それぞれ治療用（ヒト）ヘモグロビンおよび全ヘモグロビンに対応する。（Ｂ）脾臓の重量と脾臓における赤血球系細胞の百分率の相関。全てのマウスからのデータを用いて回帰直線および９５％信頼区間をプロットした。モック形質導入細胞（ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｓ）を受けたマウス３匹を含めた（●）。 図６は、ｔＥｐｏＲを治療用グロビン遺伝子と共発現させると、より低レベルの改変されたＷＢＣで貧血が調整されることを示す。ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１を形質導入した骨髄細胞を移植したマウス（□）またはＬＧを形質導入した骨髄細胞を移植したマウス（■）。（Ａ）移植を受けたβサラセミアマウスの、改変されたＲＢＣ（ＲＢＣ）、ヘマトクリット値（Ｈｃ）、全ヘモグロビン濃度（Ｈｂ）、および網状赤血球の百分率（Ｒｅｔｉｃ）と改変されたＷＢＣ（ＷＢＣ）との相関。斜線によりＷＢＣが２０％を下回るデータとＷＢＣが２０％を上回るデータが分離されている。（Ｂ）ＷＢＣが２０％を下回るマウスとＷＢＣが２０％を上回るマウスの改変されたＲＢＣの百分率、ヘマトクリット値、全ヘモグロビン濃度、および網状赤血球の百分率の平均±ＳＤおよび個々の値。グラフの下の数字は改変されたＷＢＣの平均百分率を示す。 図６は、ｔＥｐｏＲを治療用グロビン遺伝子と共発現させると、より低レベルの改変されたＷＢＣで貧血が調整されることを示す。ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１を形質導入した骨髄細胞を移植したマウス（□）またはＬＧを形質導入した骨髄細胞を移植したマウス（■）。（Ａ）移植を受けたβサラセミアマウスの、改変されたＲＢＣ（ＲＢＣ）、ヘマトクリット値（Ｈｃ）、全ヘモグロビン濃度（Ｈｂ）、および網状赤血球の百分率（Ｒｅｔｉｃ）と改変されたＷＢＣ（ＷＢＣ）との相関。斜線によりＷＢＣが２０％を下回るデータとＷＢＣが２０％を上回るデータが分離されている。（Ｂ）ＷＢＣが２０％を下回るマウスとＷＢＣが２０％を上回るマウスの改変されたＲＢＣの百分率、ヘマトクリット値、全ヘモグロビン濃度、および網状赤血球の百分率の平均±ＳＤおよび個々の値。グラフの下の数字は改変されたＷＢＣの平均百分率を示す。 図７は、移植の１０カ月後にＢＭ恒常性が維持されることを示す。（Ａ）ＬＧマウス（塗りつぶしの棒）およびＬＧ／ＨＡ−Ｙ１マウス（白抜きの棒）の末梢血（ＰＢ）および骨髄（ＢＭ）におけるＣＤ４５．２陽性白血球の中での骨髄系細胞（Ｍ）、Ｂリンパ系細胞（Ｂ）、およびＴリンパ系細胞（Ｔ）の割合。（Ｂ）血漿中Ｅｐｏとヒト調整ＲＢＣ（ＲＢＣ）の対数。回帰直線および９５％信頼区間（破線）をＲＢＣの割合が４０％を超えるＬＧマウスから得た。水平方向および垂直方向に網掛けされた囲み枠の下の境界および上の境界は、それぞれβサラセミアのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの値の平均ＳＤを示す。（Ｃ）ＬＧマウス（■）およびＬＧ／ＨＡ−Ｙ１マウス（□）の末梢血における白血球数および血小板数の平均ＳＤおよび個々の白血球数および血小板数。 図８は、赤血球系細胞の増大後にＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１ベクター組み込み部位（ＩＳ）と癌原遺伝子の関連性がないことを示す。マウス４匹全てからの組み込み部位をこの分析のためにプールした。Ｔｅｒ１１９＋ＢＭ細胞（Ａ）およびＣＤ４５＋ＢＭ細胞（Ｂ）から単離された組み込み部位が最も近いＲｅｆＳｅｑ遺伝子に従って標識される。相対的なクローンサイズをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭｕＡトランスポザーゼによって触媒される独立した組み込み事象でそれが単離される回数によって数量化した。ａｌｌＯｎｃｏデータベースにおいてアノテートされた癌原遺伝子がアスタリスクによって示されている。最も近い遺伝子が癌遺伝子であるＩＳの発生頻度は、赤血球系細胞と非赤血球系細胞の間で統計学的に差がない（Ｐ＝０．５５２３）。（Ｃ）癌原遺伝子の近傍の組み込み部位。癌原遺伝子から＞５０ｋｂの組み込み部位および＜５０ｋｂの組み込み部位の割合が示されている。この試験で同定された組み込み部位と、移植の前後の、ＬＧベクターを用いて形質導入されたＨＣを特徴とするＩＳの間で、癌原遺伝子から＜５０ｋｂに見いだされる組み込み部位の数に有意差は見いだされなかった（両側フィッシャー直接確率検定を用いてＰ＞０．０５）。 図８は、赤血球系細胞の増大後にＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１ベクター組み込み部位（ＩＳ）と癌原遺伝子の関連性がないことを示す。マウス４匹全てからの組み込み部位をこの分析のためにプールした。Ｔｅｒ１１９＋ＢＭ細胞（Ａ）およびＣＤ４５＋ＢＭ細胞（Ｂ）から単離された組み込み部位が最も近いＲｅｆＳｅｑ遺伝子に従って標識される。相対的なクローンサイズをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭｕＡトランスポザーゼによって触媒される独立した組み込み事象でそれが単離される回数によって数量化した。ａｌｌＯｎｃｏデータベースにおいてアノテートされた癌原遺伝子がアスタリスクによって示されている。最も近い遺伝子が癌遺伝子であるＩＳの発生頻度は、赤血球系細胞と非赤血球系細胞の間で統計学的に差がない（Ｐ＝０．５５２３）。（Ｃ）癌原遺伝子の近傍の組み込み部位。癌原遺伝子から＞５０ｋｂの組み込み部位および＜５０ｋｂの組み込み部位の割合が示されている。この試験で同定された組み込み部位と、移植の前後の、ＬＧベクターを用いて形質導入されたＨＣを特徴とするＩＳの間で、癌原遺伝子から＜５０ｋｂに見いだされる組み込み部位の数に有意差は見いだされなかった（両側フィッシャー直接確率検定を用いてＰ＞０．０５）。 図９は、移植の２０週間後に、ｔＥｐｏＲにより、高い割合のｅＧＦＰ＋赤血球系細胞、リンパ系細胞および骨髄系細胞が誘導されることを示す。赤血球系（ＲＢＣ）系、白血球（ＷＢＣ）区画、リンパ系細胞（ｌｙｍｐｈｏ）区画および骨髄系細胞（ＧＭ：顆粒球／単球）区画におけるｅＧＦＰ陽性細胞の平均および中央値の百分率（それぞれ青色の線および赤色の線）、標準誤差（青色のエラーバー）、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイル（囲み枠の下の境界および上の境界）および個々の百分率（灰色の丸）。γＲＶレトロウイルスベクター、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１（Ｙ１）レトロウイルスベクター、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−２（Ｙ１−２）レトロウイルスベクターまたはγＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−８（Ｙ１−８）レトロウイルスベクターによって造血細胞に形質導入した。 図１０は、最高レベルのｅＧＦＰを発現している骨髄系細胞が、ｔＥｐｏＲによって改変された細胞を移植したマウスにおいて選択されることを示す。移植前の造血細胞（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、およびリンパ系細胞（ｌｙｍｐｈｏ）区画および骨髄系細胞（ＧＭ）区画における平均蛍光強度の平均（ヒストグラム）、標準偏差（青色のエラーバー）、および個々のＭＦＩ（灰色の丸。γＲＶレトロウイルスベクター、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１（Ｙ１）レトロウイルスベクター、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−２（Ｙ１−２）レトロウイルスベクターまたはγＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−８（Ｙ１−８）レトロウイルスベクターによって造血細胞に形質導入した。 図１１は、ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウス４匹のＣＤ４５＋骨髄細胞およびＴｅｒ１１９＋骨髄細胞から単離された組み込み部位の分布を示す。組み込み部位が、最も近いＲｅｆＳｅｑ遺伝子に従って標識される。回収部位の割合をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭｕＡトランスポザーゼによって触媒される独立した組み込み事象でそれが単離される回数によって数量化した。単離された組み込み部位の２％未満を占める回収部位はまとめて低発生頻度群とした。クローンの存在量を反映する独立したＭｕ転位事象の数が各マウスの各細胞型の下に示されている。
配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、ヒトアルファグロビンｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、ヒトアルファグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、マウスアルファグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、ラットアルファグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ヒトベータグロビンｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号６は、ヒトベータグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、変異ヒトベータグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、マウスベータグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ラットベータグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ヒトガンマグロビンｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１は、ヒトガンマグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、マウスガンマグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ラットガンマグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、ヒトデルタグロビンｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５は、ヒトデルタグロビンポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ヒトエリスロポエチン受容体ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７は、マウスエリスロポエチン受容体ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１８は、ラットエリスロポエチン受容体ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１９は、ヒトエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、切断型ヒトエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、切断型ヒトエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、２４アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠くヒトエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、２４アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠く切断型ヒトエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、２４アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠く切断型ヒトエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、マウスエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、切断型マウスエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、切断型マウスエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、２４アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠くマウスエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、２４アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠く切断型マウスエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、２４アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠く切断型マウスエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ラットエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、切断型ラットエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、切断型ラットエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、２４アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠くラットエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、２４アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠く切断型ラットエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、２４アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠く切断型ラットエリスロポエチン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、インスレーター配列を含むポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号３８は、インスレーター配列を含むポリヌクレオチド配列を示す。
詳細な説明
Ａ．概要
本発明は、一般に、改善された遺伝子治療ベクター、および遺伝的障害を処置する、予防する、または軽減するためにそれを使用する方法に関する。遺伝子治療に関する１つの著しい難題は、調整された細胞が非形質導入細胞に対する内因性の選択的利点を有さない場合に、移植を受けている被験体において調整された細胞集団を維持し、かつ／または増大させることである。例えば、遺伝性造血障害、例えば、鎌状赤血球症およびβ−サラセミアでは、制限として、これだけに限定されないが、造血幹細胞または造血前駆細胞の形質導入が非効率的であること、毒性の骨髄抑制療法または骨髄破壊療法が必要条件であること、および形質導入された細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて選択するための最適な方法がないことが挙げられる。
本発明は、一部において、本発明の遺伝子治療ベクターを用いて、治療用細胞の数をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて選択的にまたは特異的に増大または増加させて、遺伝子治療の有効性および特異性をさらに増加させることができるという予想外の発見に基づく。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明は、一部において、本発明のベクターを保有する治療用細胞を実質的に増大させることができるので、遺伝子治療を受けている被験体に治療的、予防的、または軽減的エンドポイントをもたらすのに必要な細胞がより少ないことを意図している。さらに、本発明のベクターを保有する細胞の全てまたは少なくとも一部分は他の細胞よりも増殖的利点を有するので、治療的、予防的、または軽減的エンドポイントを実現するために骨髄抑制療法または骨髄破壊療法が必ずしも必要としない。
したがって、本発明は、細胞の一部のみが有効にベクターの標的になるが、治療的、予防的、または軽減的効果を付与するためには不十分なレベルである、遺伝病の処置における遺伝子治療の有効性を改善する、まだ満たされていない臨床的必要性に取り組む。本発明は、具体的には、所望の転帰を容易にするための、ベクター、遺伝子操作された細胞、および遺伝子操作された細胞またはその細胞の集団のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける選択的な増大に関する。
本発明の実施では、特に反対のことが示されなければ、分子生物学の従来の方法および当技術分野の技術の範囲内の組換えＤＮＡ技法が用いられ、その多くが例示のために下に記載されている。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ． Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ編、１９８４年）を参照されたい。
本明細書において引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｂ．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的に関して、以下の用語が下で定義されている。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状の二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合により組み込むＲＮＡウイルスを指す。レトロウイルスは遺伝子を送達するための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ． ３５７巻：４５５〜４６０頁）。ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれたら、そのウイルスは「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型としての機能を果たし、新しいウイルス粒子を産生するために必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を導く。
例示的なレトロウイルスとしては、これだけに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））およびレンチウイルスが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、これだけに限定されないが、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型、およびＨＩＶ２型を含めたヒト免疫不全ウイルス）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。一実施形態では、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。
レトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターを本発明の実施において使用することができる。したがって、「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」を包含するものとする。
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移行または運搬することができる核酸分子を指すために使用される。移行される核酸は、一般に、ベクター核酸分子と連結している、例えば、それに挿入されている。ベクターは、細胞における自律複製を導く配列を含んでもよく、宿主細胞のＤＮＡへの組み込みを可能にするために十分な配列を含んでもよい。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌性人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損性のレトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
当業者には明らかになる通り、「ウイルスベクター」という用語は、広く使用されており、一般には核酸分子の移行または細胞のゲノムへの組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、移行プラスミド）、または核酸の移行を媒介するウイルス粒子のいずれかを指す。ウイルス粒子は、一般には、種々のウイルスの構成成分を含み、時には核酸（複数可）に加えて宿主細胞の構成成分も含む。
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に移行することができるウイルスもしくはウイルス粒子、または移行された核酸自体のいずれかを指す場合がある。ウイルスベクターおよび移行プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的遺伝エレメントおよび／または機能的遺伝エレメントを含有する。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的遺伝エレメントおよび機能的遺伝エレメントまたはそれらの部分を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含めた構造的遺伝エレメントおよび機能的遺伝エレメントまたはそれらの部分を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッド」という用語は、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列と非レンチウイルスのウイルス配列の両方を含有するベクター、ＬＴＲまたは他の核酸を指す。一実施形態では、ハイブリッドベクターとは、逆転写、複製、組み込みおよび／またはパッケージングのためのレトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列を含むベクターまたは移行プラスミドを指す。
特定の実施形態では、「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス移行プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用することができる。本明細書において、クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに言及している場合、これらのエレメントの配列は、本発明のレンチウイルス粒子ではＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミドではＤＮＡ形態で存在することが理解されるべきである。
プロウイルスの各末端は「長い末端反復」または「ＬＴＲ」と称される構造である。「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列の状況では、直接反復であり、Ｕ３領域、Ｒ領域およびＵ５領域を含有する、レトロウイルスのＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。ＬＴＲにより、一般に、レトロウイルスの遺伝子の発現（例えば、促進、開始および遺伝子転写物のポリアデニル化）およびウイルス複製の基礎をなす機能がもたらされる。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナルおよびウイルスのゲノムの複製および組み込みのために必要な配列を含めた多数の調節シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの領域に分けられる。Ｕ３領域はエンハンサーエレメントおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域はプライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域にはＵ３領域およびＵ５領域が隣接する。ＬＴＲは、Ｕ３領域、Ｒ領域およびＵ５領域で構成され、ウイルスのゲノムの５’末端および３’末端の両方に出現する。５’ＬＴＲにはゲノムの逆転写のために必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージングのために必要な配列（プサイ部位）が近接している。
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子内へのウイルスＲＮＡの挿入のために必要な、レトロウイルスのゲノム内に位置する配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒら、１９９５年 Ｊ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６９巻、４号；２１０１〜２１０９頁を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスのゲノムのキャプシド形成のために必要な最小のパッケージングシグナル（プサイ［Ψ］配列とも称される）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プサイ」という用語および「Ψ」という符号は、ウイルス粒子形成の間のレトロウイルスのＲＮＡ鎖のキャプシド形成のために必要な非コード配列への言及に使用される。
種々の実施形態では、ベクターは、改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、ウイルスを複製欠損性にすることによってレンチウイルス系またはレトロウイルス系の安全性を改善するために行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損性」という用語は、完全な、有効な複製ができず、したがって、感染性ビリオンが産生されない（例えば、複製欠損性レンチウイルス後代）ウイルスを指す。「複製コンピテント」という用語は、複製することができ、したがって、ウイルスのウイルス複製により感染性ビリオン（例えば、複製コンピテントレンチウイルス後代）を産生することができる野生型ウイルスまたはバリアントウイルスを指す。
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターとは、１回目のウイルス複製を越えてウイルスが転写されることを防ぐために、Ｕ３領域として公知の右側の（３’）ＬＴＲのエンハンサー−プロモーター領域が改変された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、ウイルス複製の間に右側の（３’）ＬＴＲのＵ３領域が左側の（５’）ＬＴＲのＵ３領域の鋳型として使用され、したがって、ウイルスの転写物はＵ３エンハンサー−プロモーターなしでは生じ得ないことに起因する。本発明の別の実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、理想的なポリ（Ａ）配列に置き換わるように改変されている。ＬＴＲに対する改変、例えば、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’ＬＴＲと５’ＬＴＲの両方に対する改変なども、本発明に包含されることに留意するべきである。
５’ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生の間にウイルスのゲノムの転写を駆動するための異種プロモーターで置き換えることによって、さらなる安全性の増強がもたらされる。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性のシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔに依存しない様式で高レベルの転写を駆動することができる。この置き換えにより、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しないので、複製コンピテントウイルスが生成される組換えの可能性が低下する。ある実施形態では、異種プロモーターは、ウイルスのゲノムが転写される様式の制御において追加的な利点を有する。例えば、異種プロモーターは、誘導性であり得、したがって、誘導因子が存在する場合にのみウイルスのゲノムの全部または一部の転写が起こる。誘導因子としては、これだけに限定されないが、１つまたは複数の化合物または宿主細胞が培養される温度もしくはｐＨなどの生理的条件が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＴＡＲエレメントを含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）のＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化反応」遺伝エレメントを指す。このエレメントは、レンチウイルスのトランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝エレメントと相互作用して、ウイルス複製を増強する。しかし、このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターで置き換えられている実施形態では必要ない。
「Ｒ領域」とは、レトロウイルスＬＴＲ内の、キャップ形成基の開始点（すなわち、転写の開始点）で始まり、ポリＡトラクトの開始点の直前で終わる領域を指す。Ｒ領域は、Ｕ３領域およびＵ５領域と隣接しているとも定義される。Ｒ領域は、逆転写の間に新生ＤＮＡをゲノムの一方の末端から他方の末端まで移行させることにおいて役割を果たす。
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」という用語は、その配列がレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のセントラルポリプリントラクトおよび中心終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰエレメントは米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕら、２０００年、Ｃｅｌｌ、１０１巻：１７３頁に記載されている。ＨＩＶ−１の逆転写の間、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）にあるプラス鎖ＤＮＡの中心開始点および中心終結配列（ＣＴＳ）にある中心終結点により、３本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中心ＤＮＡフラップの形成が導かれる。いかなる理論に縛られることも望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスのゲノム核内移行のシス活性決定因子として働く可能性があり、かつ／またはウイルスの力価を増大させる可能性がある。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内の、目的の異種遺伝子の上流または下流の１つまたは複数のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の実施形態では、移行プラスミドはＦＬＡＰエレメントを含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
一実施形態では、レトロウイルス移行ベクターまたはレンチウイルス移行ベクターは、１つまたは複数の輸送エレメントを含む。「輸送エレメント」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ輸送エレメントの例としては、これだけに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えばＣｕｌｌｅｎら、１９９１年 Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５巻：１０５３頁；Ｃｕｌｌｅｎら、１９９１年 Ｃｅｌｌ ５８巻：４２３頁を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。一般に、ＲＮＡ輸送エレメントは遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは多数のコピーとして挿入することができる。
特定の実施形態では、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および必要に応じて、転写終結シグナルをベクターに組み入れることによって増大する。種々の転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９年、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７３巻：２８８６頁）；Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、５巻：３８６４頁）；および同様のもの（Ｌｉｕら、１９９５年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、９巻：１７６６頁）により、タンパク質における異種核酸の発現が増大し得る。いくつかの場合には、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントにより、細胞の形質転換のリスクが増大し、かつ／またはｍＲＮＡ転写物の量が実質的にもしくは有意に増大しない、またはｍＲＮＡの安定性が増大しないので、特定の実施形態では、本発明のベクターはこれらのエレメントを欠くまたはそれを含まない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、追加的な安全対策としてＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くまたはそれを含まない。
異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を導くエレメントにより、異種性の遺伝子発現が増加する。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見いだされる。特定の実施形態では、ベクターは、発現させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’のポリアデニル化配列を含む。「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を指す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡ尾部を付加することによりｍＲＮＡの安定性を促進することができ、したがって、翻訳効率の増大に寄与する。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、急速に分解されるので、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。本発明のベクターにおいて使用することができるポリＡシグナルの実例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当技術分野で公知の別の適切な異種性または内在性のポリＡ配列が挙げられる。
ある実施形態では、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターは、１つまたは複数のインスレーターエレメントをさらに含む。インスレーターエレメントは、レンチウイルスにより発現された配列、例えば、治療用ポリペプチドを、ゲノムＤＮＡ内に存在するシス作用性エレメントによって媒介され、移行した配列（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の調節解除された発現をもたらす可能性がある組み込み部位の影響（すなわち、位置の影響；例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅら、２００２年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９９巻：１６４３３頁；Ｚｈａｎら、２００１年、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、１０９巻：４７１頁を参照されたい）から保護することに寄与し得る。いくつかの実施形態では、移行ベクターは、３’ＬＴＲに１つまたは複数のインスレーターエレメントを含み、プロウイルスを宿主ゲノムに組み込む際に、プロウイルスは、３’ＬＴＲの重複によって５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲの両方に１つまたは複数のインスレーターを含む。本発明において使用するための適切なインスレーターとしては、これだけに限定されないが、ニワトリβ−グロビンインスレーター（参照により本明細書に組み込まれるＣｈｕｎｇら、１９９３年、Ｃｅｌｌ ７４巻：５０５頁；Ｃｈｕｎｇら、１９９７年、ＰＮＡＳ ９４巻：５７５頁；およびＢｅｌｌら、１９９９年、Ｃｅｌｌ ９８巻：３８７頁を参照されたい）が挙げられる。インスレーターエレメントの例としては、これだけに限定されないが、ニワトリＨＳ４などのβ−グロビン遺伝子座由来のインスレーターが挙げられる。
本発明の特定の実施形態によると、ウイルスベクターの骨格配列の大部分または全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかし、レンチウイルスの配列の多くの異なる供給源を用いることができ、特定のレンチウイルスの配列における多数の置換および変更を、移行ベクターの本明細書に記載の機能を行う能力を損なうことなく適応させることができることが理解されるべきである。さらに、種々のレンチウイルスベクターが当技術分野で公知であり、その多くが本発明のウイルスベクターまたは移行プラスミドを作製するために適合させることができる。Ｎａｌｄｉｎｉら、（１９９６年ａ、１９９６年ｂ、および１９９８年）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９７年）；Ｄｕｌｌら、１９９８年、米国特許第６，０１３，５１６号；および同第５，９９４，１３６号を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の参照配列（例えば、配列表を参照されたい）のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはバリアントを包含し、一般にはバリアントが参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持することが好ましい。種々の例示的な実施形態では、本発明は、一部において、ウイルスベクターおよび移行プラスミドのポリヌクレオチド配列、ならびにそれを含む組成物を意図している。特定の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または他の目的の遺伝子を提供する。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列、または参照配列と下で定義されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して１つまたは複数のヌクレオチドが付加もしくは欠失している、または異なるヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドを包含する。この点について、参照ポリヌクレオチドに、変更されたポリヌクレオチドに参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性が保持される変異、付加、欠失および置換を含めた特定の変更を行うことができることが当技術分野ではよく理解されている。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、そのネイティブな状態では通常それに付随する構成成分を実質的にまたは基本的に含まない材料、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞を意味する。特定の実施形態では、「得られた」または「由来する」という用語は、単離されたと同義に使用される。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常はその断片に近接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。
ポリヌクレオチドの方向を説明する用語としては、５’（通常、ポリヌクレオチドの遊離ホスフェート基を有する末端）および３’（通常、ポリヌクレオチドの遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有する末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向または３’から５’の方向にアノテートされ得る。
「相補的な」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は多くの場合、逆相補体として左側に５’末端、右側に３’末端の５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’と書かれる。その逆相補体と等しい配列は、パリンドローム配列であると言える。相補性は、塩基対合規則に従って核酸の塩基の一部のみがマッチする場合、「部分的」であり得る。または、核酸間には「完全な」または「全体的な」相補性があり得る。
「核酸カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ、その後、ポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態では、核酸カセットは、目的の遺伝子（複数可）、例えば、目的のポリヌクレオチド（複数可）を含有する。別の実施形態では、核酸カセットは、１つまたは複数の発現制御配列および目的の遺伝子（複数可）、例えば、目的のポリヌクレオチド（複数可）を含有する。ベクターは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの核酸カセットを含んでよい。核酸カセットは、ベクター内で位置的におよび逐次的に特定の方向に向けられ、したがって、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要な適切な翻訳後改変を受け、適切な細胞内区画にターゲティングされるまたは細胞外区画に分泌されることによって生物活性について適した区画に転置され得る。カセットは、ベクターへの迅速な挿入に適した３’末端および５’末端を有することが好ましく、例えば、カセットは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。本発明の好ましい実施形態では、核酸カセットは、造血障害などの遺伝的障害を処置する、予防する、または軽減するために使用する治療用遺伝子の配列を含有する。カセットは、単一の単位としてプラスミドまたはウイルスベクターから除去することおよびそれに挿入することができる。
ポリヌクレオチドとは目的のポリヌクレオチド（複数可）を包含する。本明細書で使用される場合、「目的のポリヌクレオチド（複数可）」という用語は、１つまたは複数のポリヌクレオチド、例えば、発現することが望まれる発現ベクターに挿入された、ポリペプチド（すなわち、目的のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。好ましい実施形態では、本発明のベクターおよび／またはプラスミドは、１つまたは複数の目的のポリヌクレオチド、または発現することが望まれるポリペプチド、例えば、切断型エリスロポエチン受容体をコードする他のポリヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、目的のポリヌクレオチド、例えばグロビン遺伝子は、疾患または障害の処置、予防、または軽減において治療効果をもたらすポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは、「治療用ポリペプチド」と称することができる。例えば、配列番号２〜４、配列番号６〜９、配列番号１１〜１３、および配列番号１５を参照されたい。
本明細書で使用される「グロビン」という用語は、ヘム部分と共有結合または非共有結合することができ、したがって、酸素を輸送または貯蔵することができる全てのタンパク質またはタンパク質サブユニットを意味する。脊椎動物および無脊椎動物のヘモグロビンのサブユニット、脊椎動物および無脊椎動物のミオグロビンまたはその変異体はグロビンという用語に含まれる。グロビンの例としては、α−グロビンまたはそのバリアント、β−グロビンまたはそのバリアント、γ−グロビンまたはそのバリアント、およびδ−グロビンが挙げられる。
一実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、異常ヘモグロビン症を処置するための治療的機能をもたらすポリペプチド、例えば、α−グロビン、β−グロビンまたはβ−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑをコードする遺伝子である。目的のポリヌクレオチド、およびそれにコードされるポリペプチドとは、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその機能的なバリアントおよび断片をどちらも包含する。特定の実施形態では、機能的なバリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある実施形態では、機能的なバリアントまたは断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を有する。本発明において使用するために適した代表的なポリヌクレオチド配列としては、これだけに限定されないが、α−グロビン、β−グロビン、β−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑ、および種々の切断型エリスロポエチン受容体、例えば、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、および配列番号３６をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、他のＤＮＡ配列、例えば、本明細書の他の箇所で開示されているまたは当技術分野で公知のプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、およびＡｔｔ部位）、終結コドン、転写終結シグナル、および自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどと組み合わせることができ、したがって、それらの全体の長さは相当に変動してよい。したがって、ほぼどんな長さのポリヌクレオチド断片も用いることができ、全長は調製の容易さおよび意図された組換えＤＮＡプロトコールにおける使用によって限定されることが好ましいことが意図されている。
「発現制御配列」という用語は、作用的に連結したポリヌクレオチドの転写または発現を導くこと、増大させること、調節すること、または制御することができる１つまたは複数のプロモーター、エンハンサー、または他の転写制御エレメントまたはそれらの組み合わせを含むポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、本発明のベクターは、特定の細胞、細胞型、または細胞系列、例えば、標的細胞に特異的な１つまたは複数の発現制御配列を含む、すなわち、特定の細胞、細胞型、または細胞系列に特異的な発現制御配列に作用的に連結したポリヌクレオチドの発現は、標的細胞では発現され、他の非標的細胞では発現されない。細胞特異的である、ベクターにおける１つまたは複数の発現制御配列のひとつひとつは、所望の療法に応じて、同じ細胞型または異なる細胞型において発現し得る。好ましい実施形態では、ベクターは、造血幹細胞または造血前駆細胞などの造血細胞に特異的な１つまたは複数の発現制御配列を含む。他の好ましい実施形態では、ベクターは、赤血球系細胞に特異的な１つまたは複数の発現制御配列を含む。
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことができる配列を含有し、いくつかの場合には別の制御配列に対するその方向とは独立して機能することができるＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協同的または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方をもたらすことができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
特定の実施形態では、本発明のベクターは、外因性、内在性、または異種性の制御配列、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。「内在性の」制御配列とは、ゲノムにおける所与の遺伝子と天然に連結している制御配列である。「外因性の」制御配列とは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子の近位に配置され、したがってその遺伝子の転写が、連結したエンハンサー／プロモーターによって導かれるような制御配列である。「異種性の」制御配列は、遺伝的に操作される細胞とは異なる種由来の外因性の配列である。
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成成分が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、および／またはエンハンサー、または他の発現制御配列）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドとの間の機能的な連結であって、ここで、該発現制御配列により、第２の配列に対応する核酸の転写が導かれる連結を指す。
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよく、制限されたいろいろの種類の細胞および組織型の発現をそれぞれ可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」「細胞系列特異的」または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。例示的な遍在する発現制御配列としては、これだけに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性のシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５プロモーター、Ｐ７．５プロモーター、およびＰ１１プロモーター、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５巻、１４７７〜１４８２頁（２００７年））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、およびβ−アクチンプロモーターが挙げられる。
特定の実施形態では、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、系列特異的、または組織特異的な発現を実現する（例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸を細胞型、細胞系列、もしくは組織のあるサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階に発現させる）ために、細胞、細胞型、細胞系列または組織特異的な発現制御配列を使用することが望ましい場合がある。細胞、細胞型、細胞系列または組織特異的な発現制御配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｂ２９プロモーター（Ｂ細胞での発現）、ｒｕｎｔ転写因子（ＣＢＦａ２）プロモーター（幹細胞での発現）、ＣＤ１４プロモーター（単核球細胞での発現）、ＣＤ４３プロモーター（白血球および血小板での発現）、ＣＤ４５プロモーター（造血細胞での発現）、ＣＤ６８プロモーター（マクロファージでの発現）、エンドグリンプロモーター（内皮細胞での発現）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）プロモーター（内皮細胞での発現）、インテグリン、アルファ２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモーター（巨核球での発現）、細胞内接着分子２（ＩＣＡＭ−２）プロモーター（内皮細胞での発現）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）プロモーター（造血細胞での発現）、β−グロビンＬＣＲ（赤血球系細胞での発現）、グロビンプロモーター（赤血球系細胞での発現）、β−グロビンプロモーター（赤血球系細胞での発現）、α−グロビンＨＳ４０エンハンサー（赤血球系細胞での発現）、アンキリン−１プロモーター（赤血球系細胞での発現）、およびウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）プロモーター（造血細胞での発現）が挙げられる。
一実施形態では、本発明のベクターは、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される１つまたは複数の細胞または組織特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。
本明細書で使用される場合、「条件発現」とは、これだけに限定されないが、誘導性発現；抑圧可能な発現；特定の生理的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などを含めた任意の種類の条件発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的な発現を排除するものではない。本発明のある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的のポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現の増大または減少を引き起こす処理または条件に供することによって発現が制御される、目的のポリヌクレオチドの条件発現を提供する。
誘導性プロモーター／系の実例としては、これだけに限定されないが、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなど（対応するホルモンで処理することによって誘導される）、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属で処理することによって誘導される）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導される）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎら、２００３年、Ｇｅｎｅ、３２３巻：６７頁）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられる。
条件発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって実現することもできる。本発明のある特定の実施形態によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための部位を少なくとも１つ（一般には２つ）含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であってよい、１箇所または複数箇所の組換え部位（例えば、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、７箇所、１０箇所、１２箇所、１５箇所、２０箇所、３０箇所、５０箇所など）が関与する組換え反応に関与する切除的または統合的なタンパク質、酵素、補因子または関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３巻：６９９〜７０７頁（１９９３年）を参照されたい）、またはその変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、およびバリアントを包含する。本発明の特定の実施形態において使用するために適したリコンビナーゼの実例としては、これだけに限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられる。
ベクターは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１箇所または複数箇所の組換え部位を含んでよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みのために必要な任意の部位（複数可）に加えたものであることが理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」または「部位特異的な組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの組換え部位は、８塩基対のコア配列と隣接した１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす）を２つ含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ， Ｂ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５巻：５２１〜５２７頁（１９９４年）の図１を参照されたい）。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、これだけに限定されないが、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓら、１９９６年；ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ、１９９７年）、ｌｏｘ５１７１（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８年）、ｌｏｘ２２７２（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８年）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒら、２００２年）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５年）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５年）が挙げられる。
ＦＬＰリコンビナーゼのために適切な認識部位としては、これだけに限定されないが、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４年）、Ｆ４、Ｆ５（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４年）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８年）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８年）が挙げられる。
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配列、ａｔｔＬ配列、およびａｔｔＲ配列であり、これらはリコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えばフィーｃ３１によって認識される。φＣ３１ＳＳＲは、ヘテロタイプの部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）の間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈら、２０００年）。ａｔｔＢおよびａｔｔＰは、それぞれ、細菌ゲノムおよびファージゲノムに対するファージインテグラーゼの付着部位に対して名づけられ、どちらも、φＣ３１ホモ二量体が結合する可能性がある不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈら、２０００年）。産物の部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対して有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３年）、それにより反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムのａｔｔＰ部位へのａｔｔＢを有するＤＮＡの挿入が、ゲノムのａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位の挿入よりも容易であることが見いだされている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、２００１年；Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３年）。したがって、典型的な戦略では、相同組換えによってａｔｔＰを有する「ドッキング部位」を定義済みの遺伝子座に位置づけ、次いでそれを挿入のために、ａｔｔＢを有する入ってくる配列とパートナーにする。
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、ＡＴＧなどの開始コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接内部リボソーム侵入を促進し、それにより、キャップに依存しない遺伝子の翻訳を導くエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０年Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５巻（１２号）：４７７〜８３頁）およびＪａｃｋｓｏｎおよびＫａｍｉｎｓｋｉ． １９９５年 ＲＮＡ １巻（１０号）：９８５〜１０００頁を参照されたい。特定の実施形態では、本発明によって意図されているベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の目的のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を実現するために、ポリヌクレオチド配列を１つまたは複数のＩＲＥＳ配列または自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離することができる。
本明細書で使用される場合、「コザック配列」という用語は、ｍＲＮＡのリボソームの小サブユニットへの最初の結合を著しく容易にし、翻訳を増大させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧであり、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ、１９８６年 Ｃｅｌｌ． ４４巻（２号）：２８３〜９２頁、およびＫｏｚａｋ、１９８７年 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５巻（２０号）：８１２５〜４８頁）。特定の実施形態では、本発明によって意図されているベクターは、コンセンサスコザック配列を有するポリヌクレオチドおよび所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、ベクターは、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、メトトレキセート、ゼオシン、ブラストサイジン、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地からは入手不可能な重大な栄養分を供給するタンパク質をコードする（例えば、バチルス属のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することができる。それらとしては、これだけに限定されないが、それぞれｔｋ細胞またはａｐｒｔ細胞において使用することができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７年 Ｃｅｌｌ １１巻：２２３〜２３２頁）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、１９９０年 Ｃｅｌｌ ２２巻：８１７〜８２３頁）が挙げられる。
種々の実施形態では、本発明のベクターを使用して、細胞における１つまたは複数のポリペプチド、例えば、グロビン、ＥｐｏＲの発現を増大させる、確立するおよび／または維持する。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーならびにそのバリアントおよび合成類似体を指す。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーに当てはまる。
本発明の特定の実施形態は、ポリペプチド「バリアント」も包含する。ポリペプチド「バリアント」という記述は、参照ポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、切断、および／または置換によって区別され、生物活性を保持するポリペプチドを指す。ある実施形態では、当技術分野で公知の通り、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドと、保存されていても保存されていなくてもよい１つまたは複数の置換によって区別される。
ある実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドの対応する配列に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、アミノ酸の付加または欠失は参照ポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端において起こる。ある実施形態では、アミノ酸の欠失は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、または約１７５またはそれより多くのアミノ酸（その間の全てのアミノ酸の数、例えば、２５、２６、２７、２９、３０．．．１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５．．．１７０、１７１、１７２、１７３、１７４などを含む）のＣ末端切断を含む。
上記の通り、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断、および挿入を含めた種々のやり方で変更することができる。そのような操作のための方法は当技術分野で一般に、公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡの変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列の変更のための方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８２巻：４８８〜４９２頁）、Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４巻：３６７〜３８２頁）、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，８７３，１９２、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ． Ｄ．ら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、第４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７年）およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、Ｄａｙｈｏｆｆら、（１９７８年）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見いだすことができる。
「宿主細胞」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトする、感染させる、または形質導入する細胞を包含する。宿主細胞は、パッケージング細胞、産生細胞、およびウイルスベクターを感染させた細胞を含んでよい。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターを感染させた宿主細胞を、治療を必要とする被験体に投与する。ある実施形態では、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と互換的に使用され、トランスフェクトする、感染させる、または形質導入する、所望の細胞型の細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞である。
妥当なウイルス力価を実現するためには、多くの場合、大規模なウイルス粒子産生が必要である。ウイルス粒子は、移行ベクターをウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｔａｔ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子、ｖｐｕ遺伝子、ｖｐｘ遺伝子、またはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルスの遺伝子を含むパッケージング細胞系にトランスフェクトすることによって産生される。
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くのウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。一般には、パッケージングベクターはパッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入または感染によって細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は当業者に周知である。本発明のレトロウイルス／レンチウイルス移行ベクターを、トランスフェクション、形質導入または感染によってパッケージング細胞系に導入して、産生細胞または産生細胞系を生成することができる。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を含めた標準の方法によってヒト細胞または細胞系に導入することができる。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターを、優性選択マーカー、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎ合成酵素またはＡＤＡなどと一緒に細胞に導入し、その後、適切な薬物の存在下でクローンを選択し、単離することができる。選択マーカー遺伝子は、コード遺伝子に、パッケージングベクターによって、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断性ウイルスペプチドによって物理的に連結させることができる。
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）により、細胞系から生成される組換えレトロウイルスによって最終的に感染させ、形質転換することができる宿主細胞の範囲が決定される。レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶなどの場合では、ｅｎｖタンパク質としてはｇｐ４１およびｇｐ１２０が挙げられる。以前に記載されている通り、本発明のパッケージング細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、ウイルスのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子とは別のベクター上にコードされることが好ましい。
本発明において使用することができるレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の実例としては、これだけに限定されないが、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、Ｅｂｏｌａ、Ｓｅｎｄａｉ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、およびインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられる。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のＲＮＡウイルス）由来のエンベロープならびにＤＮＡウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ科、およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ科）由来のエンベロープをコードする遺伝子を利用することができる。代表例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、およびＥＩＡＶが挙げられる。
他の実施形態では、本発明のウイルスをシュードタイピングするためのエンベロープタンパク質としては、これだけに限定されないが、以下のウイルスのいずれかが挙げられる：Ａ型インフルエンザ、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）など、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂａｔ ｖｉｒｕｓ）１＆２およびオーストラリアコウモリウイルス（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｂａｔ ｖｉｒｕｓ）など、エフェメロウイルス、ベシクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型および８型など、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス（Ｓａｂｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）など、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ科、例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候群を伴う出血熱を引き起こすウイルス、リフトバレー熱ウイルスなど、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含めたＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科（フィロウイルス）、キャサヌール森林病（Ｋａｙｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎を引き起こすウイルスを含めたＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科ならびにＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ヘンドラウイルスおよびニパーウイルスなど、大痘瘡、小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、任意の脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｌｔｉｓ）を引き起こすウイルスなど。
一実施形態では、本発明は、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質でシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を保有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングすることができ、これにより、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞にターゲティングするので、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することが可能になる。本発明の好ましい実施形態では、レンチウイルスのエンベロープタンパク質はＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされている。一実施形態では、本発明は、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞系」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要であるウイルスの構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現する細胞系への言及において使用される。本発明のパッケージング細胞を調製するために、任意の適切な細胞系を使用することができる。一般に、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞系を作製するために使用される細胞はヒト細胞である。使用することができる適切な細胞系としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞はＡ５４９細胞である。
本明細書で使用される場合、「産生細胞系」という用語は、パッケージング細胞系およびパッケージングシグナルを含む移行ベクター構築物を含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞系を指す。感染性のウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を用いて行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｙ． Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５年）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３巻：６２８〜６３３頁、およびＮ． Ｒ． Ｌａｎｄａｕら（１９９２年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６巻：５１１０〜５１１３頁によって例示されている。感染性ウイルス粒子はパッケージング細胞から従来の技法を用いて収集することができる。例えば、感染性粒子は、当技術分野で公知の通り、細胞溶解、または細胞培養物の上清を収集することによって収集することができる。必要に応じて、収集されたウイルス粒子は、所望であれば精製することができる。適切な精製技法は当業者に周知である。
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用し、トランスフェクションではなくウイルス感染によって遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列を送達することは、「形質導入」と称される。一実施形態では、感染およびプロウイルスの組み込みによってレトロウイルスベクターを細胞に形質導入する。ある実施形態では、細胞、例えば、標的細胞は、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用して感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合に「形質導入される」。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、その細胞のゲノムに、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターによって送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を１つまたは複数含む。
特定の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドを発現する、本発明のウイルスベクターを用いて形質導入された宿主細胞を被験体に投与して、造血疾患、障害、または状態を処置および／または予防する。本発明のある実施形態に従って利用することができる、遺伝子治療におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法は、例えば、Ｋａｙ， Ｍ． Ａ．（１９９７年）Ｃｈｅｓｔ １１１（６ Ｓｕｐｐ．）：１３８Ｓ〜１４２Ｓ頁；Ｆｅｒｒｙ， Ｎ．およびＨｅａｒｄ， Ｊ． Ｍ．（１９９８年）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９巻：１９７５〜８１頁；Ｓｈｉｒａｔｏｒｙ， Ｙ．ら（１９９９年）Ｌｉｖｅｒ １９巻：２６５〜７４頁；Ｏｋａ， Ｋ．ら（２０００年）Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ． Ｌｉｐｉｄｏｌ． １１巻：１７９〜８６頁；Ｔｈｕｌｅ， Ｐ． Ｍ．およびＬｉｕ， Ｊ． Ｍ．（２０００年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７巻：１７４４〜５２頁；Ｙａｎｇ， Ｎ． Ｓ．（１９９２年）Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２巻：３３５〜５６頁；Ａｌｔ， Ｍ．（１９９５年）Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ． ２３巻：７４６〜５８頁；Ｂｒｏｄｙ， Ｓ． Ｌ．およびＣｒｙｓｔａｌ， Ｒ． Ｇ．（１９９４年）Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７１６巻：９０〜１０１頁；Ｓｔｒａｙｅｒ， Ｄ． Ｓ．（１９９９年）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． Ｄｒｕｇｓ ８巻：２１５９〜２１７２頁；Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ， Ｊ． Ｒ．およびＢａｒｔｌｅｔｔ， Ｊ． Ｓ．（２００１年）Ｃｕｒｒ． Ｃａｒｄｉｏｌ． Ｒｅｐ． ３巻：４３〜４９頁；およびＬｅｅ， Ｈ． Ｃ．ら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ ４０８巻：４８３〜８頁に見いだすことができる。
「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「促進する（ｐｒｏｍｏｔｅ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増大させる（ｅｘｐａｎｄ）」とは、一般に、本発明のベクターまたは本発明のベクターを用いて形質導入された宿主細胞により、特定の細胞型または特定の細胞系列において、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または他の細胞型または特定の細胞系列において引き起こされる応答と比較してより大きな生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせる、引き出す、または引き起こすことができることを指す。測定可能な生理応答は、当技術分野における理解および本明細書における記載から明らかなものの中でも、細胞の増大、生着、生存能力、ホーミング、および／または自己再生の増加を含んでよい。本発明のベクターを用いて形質導入された造血幹細胞により前駆細胞が生じる一実施形態では、増加は、１つの系列、例えば、赤血球系列の前駆細胞の数を他の細胞系列と比較して増加させることを含む。造血幹細胞および／または造血前駆細胞の生着、生存能力、ホーミング、自己再生および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増大の増加は、とりわけ、遺伝子発現、ＣＦＵ−Ｃアッセイ、ＣＦＵ−Ｓアッセイ、ＣＡＦＣアッセイ、および細胞表面タンパク質発現などの当技術分野で公知の方法を用いて確認することができる。「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」量とは、一般には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によって生じる応答、または特定の細胞系列における応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍またはそれを超える倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（間に入る１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である増加を含んでよい。
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低減する（ｌｏｗｅｒ）」または「減る（ｌｅｓｓｅｎ）」または「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「弱める（ａｂａｔｅ）」とは、一般に、本発明のベクターまたは本発明のベクターを用いて形質導入された宿主細胞により、特定の細胞型または特定の細胞系列において、ビヒクルもしくは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または他の細胞型もしくは特定の細胞系列において引き起こされる応答と比較してより少ない生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせる、引き出す、または引き起こすことができることを指す。「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」量とは、一般には「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によって生じる応答（参照応答）、または特定の細胞系列における応答の１．１分の１、１．２分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１またはそれ未満（例えば、５００分の１、１０００分の１）（間に入る１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である減少を含んでよい。
「維持する（ｍａｉｎｔａｉｎ）」または「保全する（ｐｒｅｓｅｒｖｅ）」または「維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）」または「変化なし（ｎｏ ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な変化なし（ｎｏ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な減少なし（ｎｏ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｄｅｃｒｅａｓｅ）」とは、一般に、本発明のベクターまたは本発明のベクターを用いて形質導入された宿主細胞により、細胞において、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答と比較して、より少ない生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせる、引き出す、または引き起こすことができることを指す。匹敵する応答とは、参照応答と有意差がないまたは測定可能には異ならない応答である。
冠詞「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、本明細書では、その冠詞の文法上の目的語の１つ、または１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「ａｎ（１つの）エレメント」とは、１つのエレメントまたは１つより多いエレメントを意味する。
選択肢（例えば、「ｏｒ（または）」）の使用は、その選択肢のいずれか一方、その両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義に使用される。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％だけ変動する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、明記されているステップもしくはエレメントまたはステップもしくはエレメントの群を包含するが、任意の他のステップもしくはエレメントまたはステップもしくはエレメントの群を排除するものではないと理解されたい。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句に続くいかなるものも含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句は、列挙されているエレメントが必要または必須であること、および他のエレメントは存在してはならないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、この句の後に列挙されている任意のエレメントを包含し、列挙されているエレメントに関する本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他のエレメントに限定されるものとする。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という句は、列挙されているエレメントが必要または必須であるが、他のエレメントは任意選択ではなく、それらが列挙されているエレメントの活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在するかもしれないし、存在しないかもしれないことを示す。
本明細書全体を通して「一実施形態」、「一つの実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加的な実施形態」または「さらなる実施形態」またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の箇所における前述の句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に言及しているのではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を任意の適切な様式で１つまたは複数の実施形態に組み合わせることができる。
以下の説明において、特定の詳細は、本発明の種々の実施形態の徹底的な理解をもたらさすために記載されている。しかし、当業者には、これらの詳細なしで本発明を実施することができることが理解されよう。さらに、本明細書に記載の構造および置換基の種々の組み合わせに由来する個々のベクター、またはベクターの群が、各ベクターまたはベクターの群が個別に記載されているのと同じ程度に本出願により開示されていることが理解されるべきである。したがって、特定のベクター構造または特定の置換基の選択は本開示の範囲内である。
Ｃ．ウイルスベクター
レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは試験され、目的の遺伝子を広範囲の標的細胞のゲノムに安定に導入するための適切な送達ビヒクルであることが見いだされている。本発明は、一部において、遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞における発現を増加させるため、およびベクターを含む細胞の特定の集団または系列を増加または増大させるために、１つまたは複数の遺伝子を細胞に送達するために使用することができる遺伝子治療ベクターを意図している。このように、本発明のベクターにより、細胞におけるポリペプチドの発現の増加およびベクターを含む特定の細胞系列の増加を同時に行わない現存するベクターと比較して多数の治療的利点、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｔｉｃ）利点、および軽減的利点がもたらされる。
本発明は、本発明の方法を実施するために使用することができる移行ベクターをさらに提供する。そのような移行ベクターは種々の異なるウイルスベクターを使用して作製することができることが当業者には理解されるが、特定の実施形態では、レンチウイルスベクターがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのどちらにおいても非分裂細胞への導入遺伝子の効率的な送達、組み込みおよび長期発現をもたらすことができることに一部起因して、移行ベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。種々のレンチウイルスベクターが当技術分野で公知であり、いずれも本発明の移行ベクターを作製するために適合させることができる。Ｎａｌｄｉｎｉら、（１９９６年ａ、１９９６年ｂ、および１９９８年）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９７年）；Ｄｕｌｌら、１９９８年、米国特許第６，０１３，５１６号；および同第５，９９４，１３６号を参照されたい。一般に、これらのベクターは、プラスミドに基づくかウイルスに基づき、治療用ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞内に移行させるために必須な配列を有するように構成されている。
例示的な実施形態では、レンチウイルスベクターはＨＩＶベクターである。したがって、ベクターは、ヒト免疫不全−１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全−２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などに由来してよい。本発明の大部分の態様に関して、ＨＩＶに基づく構築物がヒト細胞の形質導入において最も効率的であるという点で、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶのシス作用性配列エレメントならびにＨＩＶのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｒｅｖ遺伝子）が一般に好ましい。
特定の例示的な実施形態は、造血障害、例えば、異常ヘモグロビン症を調整するために使用するベクター、組成物および方法についてのより詳細な記載を含むが、本発明は、本開示によって限定されるものと解釈されるべきではない。本明細書において例示されている原理を、他の系、例えば、眼、中枢神経系、および末梢神経系を含めた神経系；循環系；筋肉系；骨格系；および皮膚、心臓、肺、膵臓、肝臓、腎臓、腸を含めた器官などにおける遺伝子治療に適用することができることは当業者には容易に理解されよう。
一実施形態では、本発明は、特定の細胞型または細胞系列において目的のポリヌクレオチドの発現を導く発現制御配列、および切断型エリスロポエチン受容体に作動可能に連結した別の発現制御配列を含むベクター、例えば、レンチウイルスベクターを提供する。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明は、一部において、切断型エリスロポエチン受容体に作用的に連結した発現制御配列が、適切なＥｐｏＲアゴニストの存在下で、切断型エリスロポエチン受容体を発現する細胞の増大または増加を可能にすることを意図している。さらに、細胞型または細胞系列の発現制御配列を使用することにより、ポリヌクレオチドの発現を単一の系列における細胞分化の所望の段階に制限することにおいて安全性の利点がもたらされ、したがって、本発明のベクターにより、望ましくない細胞型におけるポリペプチドの異所性発現に対処する懸念が緩和される。
一実施形態では、治療用遺伝子または目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結した発現制御配列は、切断型エリスロポエチン受容体に作動可能に連結した発現制御配列と同じ発現制御配列、または同じ細胞型または細胞系列において発現を引き出す発現制御配列である必要はない。別の実施形態では、治療用遺伝子または目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結した発現制御配列により、切断型エリスロポエチン受容体に作動可能に連結した異なる発現制御配列と同じ細胞型または細胞系列において発現が引き出される。さらなる実施形態では、治療用遺伝子または目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結した発現制御配列により、切断型エリスロポエチン受容体に作動可能に連結した同じ発現制御配列と同じである同じ細胞型または細胞系列における発現が引き出される。
１つの非限定的な例では、エリスロポエチン受容体の遍在的発現により、それが発現される細胞、すなわち、全ての細胞を増大または増加させることが可能になる。切断型エリスロポエチン受容体の遍在的発現を導く例示的な遍在的発現制御配列としては、これだけに限定されないが、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン−Ｃプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、およびシミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）が挙げられる。
別の非限定的な例では、エリスロポエチン受容体の条件的発現により、それが条件的に発現される細胞を増大または増加させることが可能になる。
さらに別の非限定的な例では、切断型エリスロポエチン受容体の幹細胞特異的発現により、それが発現される幹細胞（および幹細胞に由来する全ての細胞系列）、例えば、造血幹細胞を増大または増加させることが可能になる。切断型エリスロポエチン受容体の幹細胞特異的発現を導く例示的な幹細胞特異的発現制御配列としては、これだけに限定されないが、胚性幹細胞プロモーター、神経幹細胞プロモーター、間葉幹細胞プロモーター、肝幹細胞プロモーター、膵幹細胞プロモーター、心臓幹細胞プロモーター、腎幹細胞プロモーター、および造血幹細胞プロモーターが挙げられる。
さらに別の非限定的な例では、切断型エリスロポエチン受容体の細胞型または細胞系列に特異的な発現により、それが発現される特定の細胞型または細胞系列、例えば、標的細胞型または細胞系列を、別の細胞型または細胞系列、例えば、非標的細胞型または細胞系列と比較して増大または増加させることが可能になる。切断型エリスロポエチン受容体の発現を導く例示的な細胞型または細胞系列に特異的な発現制御配列としては、これだけに限定されないが、造血幹細胞プロモーター、造血前駆細胞プロモーター、骨髄系細胞プロモーター、リンパ系細胞プロモーター、血小板新生系列プロモーター、肥満細胞プロモーター、赤血球生成系列プロモーター、顆粒球形成系列プロモーター、および単核球形成系列プロモーターが挙げられる。
例示的な標的細胞系列としては、造血細胞系列、骨髄系列、リンパ球系列、血小板新生系列、赤血球生成系列、顆粒球形成系列プロモーター、および単核球形成系列が挙げられる。好ましい実施形態では、標的細胞系列は赤血球生成細胞系列である。
例示的な標的細胞型としては、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系前駆体、リンパ球系前駆体、血小板新生前駆体、赤血球前駆体、顆粒球形成前駆体、単核球形成前駆体、巨核芽球、前巨核球、巨核球、栓球／血小板、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染赤芽球、正染性赤芽球、多染赤血球、赤血球（ＲＢＣ）、好塩基性前骨髄球、好塩基性骨髄球、好塩基性後骨髄球、好塩基球、好中性前骨髄球、好中性骨髄球、好中性後骨髄球、好中球、好酸性前骨髄球、好酸性骨髄球、マクロファージ、樹状細胞、リンパ芽球、前リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、およびリンパ球系樹状細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、標的細胞型は、１つまたは複数の赤血球系細胞、例えば、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染赤芽球、正染性赤芽球、多染赤血球、および赤血球（ＲＢＣ）である。
特定の実施形態では、本発明のベクターを用いて、ポリヌクレオチド、例えば、１つまたは複数または全ての造血細胞における目的の遺伝子の発現を増加させ、１つまたは複数の細胞型、例えば、造血幹細胞の数を増幅または増加させることができる。一実施形態では、ベクターは、目的の遺伝子に作動可能に連結した造血細胞プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーと、切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した遍在する、条件的な、または細胞型もしくは細胞系列に特異的なプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーとを含む。別の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数のレトロウイルスＬＴＲと、目的の遺伝子に作動可能に連結した造血細胞発現制御配列と、切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した遍在する、条件的な、または細胞系列特異的な発現制御配列とを含む。
適切な細胞型または細胞系列に特異的な発現制御配列としては、これだけに限定されないが、例えば、造血幹細胞プロモーター、および造血前駆細胞プロモーターなどの造血細胞発現制御配列が挙げられる。１つまたは複数の赤血球系細胞における目的の遺伝子および／またはｔＥｐｏＲの発現が望まれる実施形態では、適切な造血細胞発現制御配列として、これだけに限定されないが、赤血球系細胞特異的プロモーターおよび必要に応じて赤血球系細胞特異的エンハンサー、ヒトβ−グロビンプロモーター、ヒトβ−グロビンＬＣＲ、またはヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターを挙げることができる。
細胞型または細胞系列発現制御配列を使用することにより、ポリヌクレオチドの発現を単一の系列における細胞分化の所望の段階に制限することにおいて安全性の利点がもたらされ、したがって、本発明のベクターにより、望ましくない細胞型におけるポリペプチドの異所性発現に対処する懸念が緩和される。一実施形態では、本発明は、１つまたは複数のＬＴＲと、目的の遺伝子に作動可能に連結した第１の赤血球系細胞特異的発現制御配列と、ｔＥｐｏＲに作動可能に連結した第２の赤血球系細胞特異的発現制御配列とを含むベクターを提供する。第１の赤血球系細胞特異的発現制御配列および第２の赤血球系細胞特異的発現制御配列は、それぞれ独立に、ヒトβ−グロビンプロモーター；ヒトβ−グロビンＬＣＲ；ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択することができる。
種々の実施形態では、ベクターの設計は、特定の造血疾患、障害、または状態を処置する、予防するまたは軽減することを目的として行う。例えば、本発明は、ヒトα−グロビン、ヒトβ−グロビン、ヒトδ−グロビン、およびヒトγ−グロビンまたはその生物学的なバリアントもしくは断片からなる群から選択される目的の遺伝子を含む、異常ヘモグロビン症の遺伝子治療のためのベクターを意図している。一実施形態では、グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子、イントロン配列の１つまたは複数の欠失を含む欠失ヒトβ−グロビン遺伝子、および少なくとも１つの抗鎌状赤血球化アミノ酸残基をコードする変異ヒトβ−グロビン遺伝子からなる群から選択される。
処置されている状態が鎌状赤血球異常ヘモグロビン症である特定の実施形態では、目的の遺伝子は抗鎌状赤血球化タンパク質であってよい。本明細書で使用される場合、「抗鎌状赤血球化タンパク質」とは、鎌状赤血球の状態における赤血球の鎌状化を導く病理学的事象を予防するまたは逆転させるポリペプチドを指す。本発明の一実施形態では、本発明の形質導入された細胞を使用して、抗鎌状赤血球化タンパク質を異常血色素症の状態を有する被験体に送達する。抗鎌状赤血球化タンパク質は、抗鎌状赤血球化アミノ酸残基を含む変異したβ−グロビン遺伝子も包含する。
好ましい実施形態では、そのようなグロビンバリアントの１つはコドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子、またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である。他の抗鎌状赤血球化アミノ酸残基は当技術分野で公知であり、本発明において有用であり得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０５１，４０２号；米国特許第５，８６１，４８８号；米国特許第６，６７０，３２３号；米国特許第５，８６４，０２９号；米国特許第５，８７７，２８８号；およびＬｅｖａｓｓｅｕｒら、Ｂｌｏｏｄ １０２巻：４３１２〜４３１９頁（２００３年）を参照されたい。
ある実施形態では、赤血球特異的発現制御配列を含むベクターを使用して、異常ヘモグロビン症を優に超える膨大な数の障害を処置する、予防する、または軽減する。赤血球前駆体は、循環中に分泌させ、したがって、全身に送達することができるポリペプチドを発現させるために有用な細胞集団である。そのようなｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質の送達の例は、血友病Ｂの患者において欠けている凝固因子であるヒト第ＩＸ因子である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＡ． Ｈ． Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８年）を参照されたい。
一実施形態では、本発明のベクターを用いて形質導入された細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、タンパク質を分泌させるための「工場」として使用することができる。例えば、赤血球系細胞特異的発現制御配列を含むベクターを、ＨＳＣから分化した赤血球系細胞から、または胚性幹細胞からタンパク質を大規模にｉｎ ｖｉｔｒｏ生成するために使用することができる。
このように発現させることができる目的のポリヌクレオチドとしては、これだけに限定されないが、リソソーム蓄積症に影響を及ぼす酵素であるアデノシンデアミナーゼ、アポリポタンパク質Ｅ、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ−６）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、ＣＤ２２、ＣＤ４０、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＣＣＬ１−ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１−ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ドーパミン、エリスロポエチン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エストロゲン、ＦＡＳ−リガンド、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ−４）、線維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ−５）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ−６）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−７）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１０）、Ｆｌｔ−３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長ホルモン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−ａ）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−ｂ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）、インスリン、グルカゴン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン１９（ＩＬ−１９）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質３ａ（ＭＩＰ−３ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質３ｂ（ＭＩＰ−３ｂ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、副甲状腺ホルモン、血小板由来増殖因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、血小板由来増殖因子ＣＣ（ＰＤＧＦ−ＣＣ）、血小板由来増殖因子ＤＤ（ＰＤＧＦ−ＤＤ）、ＲＡＮＴＥＳ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、テストステロン、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−ａ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−ａ）、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１６、ソニックヘッジホッグ、デザートヘッジホッグ、およびインディアンヘッジホッグが挙げられる。
種々の実施形態では、本発明のベクターは、切断型エリスロポエチン受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した発現制御配列を含む。
特定の好ましい実施形態では、本発明のベクターは、ｔＥｐｏＲのターンオーバーを内因性のエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）と比較して低下させ、ｔＥｐｏＲの半減期を内因性のエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）と比較して増加させ、かつ／またはマイトジェン活性化シグナル伝達経路、例えば、ＭＡＰＫ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＲＡＳの持続時間を増加させるＣ末端切断を有するｔＥｐｏＲを含む。したがって、ＥｐｏＲアゴニストと結合すると、ｔＥｐｏＲは、分裂誘発経路の活性化をもたらし、ＥｐｏＲ発現細胞またはいかなるＥｐｏＲも発現しない細胞と比較して細胞増殖または細胞の増大を増加させる。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、ＥｐｏＲアゴニスト、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）がＥｐｏＲと結合することにより、２つの受容体サブユニットの二量体形成およびその後の関連するＪａｎｕｓキナーゼ（Ｊａｋ）２の活性化が誘導されると考えられている（Ｗｉｔｔｈｕｈｎら、１９９３年）。これにより、ＥｐｏＲのいくつかのチロシン残基がリン酸化され、ＳＨ２を含有するタンパク質が動員され、その結果、シグナル伝達経路のいくつかのカスケード、特にＲａｓ／細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｒｋ）／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）（Ｔｏｒｔｉら、１９９２年）経路およびホスファチジルイノシトール３キナーゼ／Ａｋｔキナーゼ経路（Ｄａｍｅｎら、１９９５年）が活性化される。Ｊａｋ２により、シグナル伝達性転写活性化因子（Ｓｔａｔ）５およびＳｔａｔ３（Ｋｉｒｉｔｏら、１９９７年）もリン酸化され、次いでそれが核に転置して転写因子としての機能を果たし、ＥｐｏＲの分裂誘発効果を媒介する。
いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明は、切断型エリスロポエチン受容体を細胞において発現させることにより、全長のエリスロポエチン受容体を発現している細胞またはエリスロポエチン受容体を全く発現していない細胞に対する増殖的利点をもたらすことを意図している。ｔＥｐｏＲポリペプチドは全長のＥｐｏＲよりも効率的に細胞表面に輸送される。さらに、本発明のｔＥｐｏＲポリペプチドは、Ｃ末端の１つまたは複数の保存されたチロシン（Ｔｙｒ）リン酸化部位および／またはタンパク質結合部位を欠く。ｔＥｐｏＲの１つの帰結は、ｔＥｐｏＲはそれでもなお分裂誘発経路を活性化することができるが、通常は急速に脱リン酸化し、ＥｐｏＲの発現を下方制御するホスファターゼを効率的に動員することはできないことである。その結果、正常なＥｐｏＲと比較してｔＥｐｏＲを通じた細胞内シグナル伝達が増加し、細胞の増殖または増大を増加させるマイトジェン活性化経路の活性化が増加する。
代表的な全長のＥｐｏＲのアミノ酸配列は、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１および配列番号３４に記載されている。切断型ＥｐｏＲは、当技術分野で公知の組換え技法を用いて作製することができる。Ｃ末端のＴｙｒ残基またはその近くに終止コドンを挿入することによって特定の切断型ＥｐｏＲを作製し、したがって、切断型ＥｐｏＲを創製するプロセスにおいてＴｙｒ残基が除去されるまたは変異する。
例示的なヒトｔＥｐｏＲ受容体は、Ｃ末端のＴｙｒ残基、またはその近く、１アミノ酸以内、２アミノ酸以内、３アミノ酸以内、４アミノ酸以内、５アミノ酸以内、６アミノ酸以内、７アミノ酸以内、８アミノ酸以内、９アミノ酸以内、１０アミノ酸以内、１１アミノ酸以内、１２アミノ酸以内、１３アミノ酸以内、１４アミノ酸以内、１５アミノ酸以内、１６アミノ酸以内、１７アミノ酸以内、１８アミノ酸以内、１９アミノ酸以内、または２０アミノ酸以内に終止コドンが導入される１つまたは複数の変異を含む。例示的なＣ末端のＴｙｒ残基としては、配列番号２２に記載のＴｙｒ（Ｙ）３４４、４０２、４３０、４３２、４４４、４６１、４６５および４８０が挙げられる（配列番号２２は配列番号１９に記載の全長のヒトＥｐｏＲの疎水性のリーダー配列を構成する最初の２４アミノ酸を欠くことに留意されたい）。
例示的なマウスｔＥｐｏＲ受容体は、Ｃ末端のＴｙｒ残基、またはその近く、１アミノ酸以内、２アミノ酸以内、３アミノ酸以内、４アミノ酸以内、５アミノ酸以内、６アミノ酸以内、７アミノ酸以内、８アミノ酸以内、９アミノ酸以内、１０アミノ酸以内、１１アミノ酸以内、１２アミノ酸以内、１３アミノ酸以内、１４アミノ酸以内、１５アミノ酸以内、１６アミノ酸以内、１７アミノ酸以内、１８アミノ酸以内、１９アミノ酸以内、または２０アミノ酸以内に終止コドンが導入される１つまたは複数の変異を含む。例示的なＣ末端のＴｙｒ残基としては、配列番号２８に記載のＴｙｒ（Ｙ）３４３、４０１、４２９、４３１、４４２、４６０、４６４および４７９が挙げられる（配列番号２８は配列番号２５に記載の全長のマウスＥｐｏＲの疎水性のリーダー配列を構成する最初の２４アミノ酸を欠くことに留意されたい）。
例示的なラットｔＥｐｏＲ受容体は、Ｃ末端のＴｙｒ残基、またはその近く、１アミノ酸以内、２アミノ酸以内、３アミノ酸以内、４アミノ酸以内、５アミノ酸以内、６アミノ酸以内、７アミノ酸以内、８アミノ酸以内、９アミノ酸以内、１０アミノ酸以内、１１アミノ酸以内、１２アミノ酸以内、１３アミノ酸以内、１４アミノ酸以内、１５アミノ酸以内、１６アミノ酸以内、１７アミノ酸以内、１８アミノ酸以内、１９アミノ酸以内、または２０アミノ酸以内に終止コドンが導入される１つまたは複数の変異を含む。例示的なＣ末端のＴｙｒ残基としては、配列番号３４に記載のＴｙｒ（Ｙ）３４３、４０１、４２９、４３１、４４２、４６０、４６４および４７９が挙げられる（配列番号３４は配列番号３１に記載の全長のラットＥｐｏＲの疎水性のリーダー配列を構成する最初の２４アミノ酸を欠くことに留意されたい）。
生物活性のある切断型ＥｐｏＲの特定の例としては、これだけに限定されないが、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、および配列番号３４に記載のアミノ酸配列のアミノ酸１〜３３５、１〜３３６、１〜３３７、１〜３３８、１〜３３９、１〜３４０、１〜３４１、１〜３４２、１〜３４３、１〜３４４、１〜３４５、１〜３４６、１〜３４７、１〜３４８、１〜３４９、１〜３５０、１〜３５１、１〜３５２、１〜３５３、１〜３５４、１〜３５５、１〜３５６、１〜３５７、１〜３５８、１〜３５９、１〜３６０、１〜３６１、１〜３６２、１〜３６３、１〜３６４、１〜３６５、１〜３６６、１〜３６７、１〜３６８、１〜３６９、１〜３７０、１〜３７１、１〜３７２、１〜３７３、１〜３７４、１〜３７５、１〜３７６、１〜３７７、１〜３７８、１〜３７９、１〜３８０、１〜３８１、１〜３８２、１〜３８３、１〜３８４、１〜３８５、１〜３８６、１〜３８７、１〜３８８、１〜３８９、１〜３９０、１〜３９１、１〜３９２、１〜３９３、１〜３９４、１〜３９５、１〜３９６、１〜３９７、１〜３９８、１〜３９９、１〜４００、１〜４０１、１〜４０２、１〜４０３、１〜４０４、１〜４０５、１〜４０６、１〜４０７、１〜４０８、１〜４０９、１〜４１０、１〜４１１、１〜４１２、１〜４１３、１〜４１４、１〜４１５、１〜４１６、１〜４１７、１〜４１８、１〜４１９、１〜４２０、１〜４２１、１〜４２２、１〜４２３、１〜４２４、１〜４２５、１〜５２６、１〜４２７、１〜４２８、１〜４２９、１〜４３０、１〜４３１、１〜４３２、１〜４３３、１〜４３４、１〜４３５、１〜４３６、１〜４３７、１〜４３８、１〜４３９、１〜４４０、１〜４４１、１〜４４２、１〜４４３、１〜４４４、１〜４４５、１〜４４６、１〜４４７、１〜４４８、１〜４４９、１〜４５０、１〜４５１、１〜４５２、１〜４５３、１〜４５４、１〜４５５、１〜４５６、１〜４５７、１〜４５８、１〜４５９、１〜４６０、１〜４６１、１〜４６２、１〜４６３、１〜４６４、１〜４６５、１〜４６６、１〜４６７、１〜４６８、１〜４６９、１〜４７０、１〜４７１、１〜４７２、１〜４７３、１〜４７４、１〜４７５、１〜４７６、１〜４７７、１〜４７８、１〜４７９、１〜４８０、１〜４８１、１〜４８２、１〜４８３、１〜４８４、１〜４８５、１〜４８６、１〜４８７、１〜４８８、１〜４８９、１〜４９０、１〜４９１、１〜４９２、１〜４９３、１〜４９４、１〜４９５、１〜４９６、１〜４９７、１〜４９８、１〜４９９、または１〜５００を含む、またはそれからなるＣ末端切断型ＥｐｏＲおよびそのバリアントが挙げられる。ある実施形態では、本発明のｔＥｐｏＲポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞を増殖させるまたは細胞を増大させることができる全長のＥｐｏＲポリペプチドの最小の活性断片を含む。
ｔＥｐｏＲポリペプチドバリアントの特定の例としては、例えば、配列番号２２に記載のＴｙｒ（Ｙ）３４４、４０２、４３０、４３２、４４４、４６１、４６５および４８０、ならびに配列番号２８または配列番号３４に記載のＴｙｒ（Ｙ）３４３、４０１、４２９、４３１、４４２、４６０、４６４および４７９からなる群から選択されるＣ末端のＴｙｒ残基に１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するｔＥｐｏＲポリペプチドが挙げられる。
好ましい実施形態では、本発明のベクターは、約５０〜約６０アミノ酸、約８０〜約９０アミノ酸、または約８５〜約９５アミノ酸、または約５５アミノ酸、約８３アミノ酸、または約９１アミノ酸のＣ末端切断を含むｔＥｐｏＲを含む。
一実施形態では、本発明のベクターは、少なくとも１つの改変されたまたは改変されていないレトロウイルスＬＴＲ、例えば、レンチウイルスＬＴＲと、目的の遺伝子に作動可能に連結したβ−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した発現制御配列とを含む。ＬＴＲの適切な改変としては、これだけに限定されないが、５’ＬＴＲを異種プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターで置き換えること、および本明細書の他の箇所で考察されている３’ＬＴＲの１つまたは複数の改変、付加、および／または欠失が挙げられる。
特定の実施形態では、ヒトβ−グロビンプロモーター、ヒトβ−グロビンＬＣＲ由来のＤＮＡアーゼＩ高感受性部位２、３および４のうちの１つまたは複数を含むβ−グロビンＬＣＲ、および／またはヒトβ−グロビン３’エンハンサーエレメントを使用して、ポリヌクレオチドの赤血球での発現を実現する。
種々の実施形態では、本発明のベクターは、本明細書の他の箇所で考察されている通り、プサイパッケージング配列（Ψ＋）、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送エレメント、転写後調節エレメント、インスレーターエレメント、ポリアデニル化配列、選択マーカー、および細胞自殺遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数のエレメントを含む。
一実施形態では、ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメントと、β−グロビンプロモーターと、β−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、必要に応じて目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結した３’β−グロビンエンハンサーと、切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した赤血球系細胞特異的発現制御配列と、１つまたは複数のインスレーターエレメント、またはポリアデニル化配列を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含む。
特定の実施形態では、本発明のベクターは、左側の（５’）ＨＩＶ−１ ＬＴＲと、プサイパッケージング配列（Ψ＋）と、ＨＩＶ−１セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と、β−グロビンプロモーターと、β−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、必要に応じて目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結した３’β−グロビンエンハンサーと、切断型エリスロポエチン受容体（ｔＥｐｏＲ）に作動可能に連結した赤血球系細胞特異的発現制御配列と、１つまたは複数のインスレーターエレメント、およびウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むレンチウイルスベクターである。
多くの他の異なる実施形態を本発明の現行の実施形態から適合させ得、したがって、治療用導入遺伝子または目的の遺伝子を標的細胞型または細胞系列において発現させること、およびｔＥｐｏＲを、増大させようとする同じおよび／または異なる標的細胞型または細胞系列において発現させることが当業者には理解されよう。
Ｄ．組成物および製剤
本発明は、本明細書に記載の方法に従って作製された形質導入された細胞と、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物をさらに含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるキャリア」とは、薬学的に許容される細胞培養培地を含めた生理的に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを包含する。一実施形態では、キャリアを含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内投与（静脈内投与または動脈内投与）、腹腔内投与または筋肉内投与に適している。薬学的に許容されるキャリアとしては、滅菌注射用液剤または分散剤を即時調製するための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質へのそのような媒体および作用剤（ａｇｅｎｔ）の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または作用剤が形質導入された細胞と適合しない場合を除く限りでは、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が意図されている。
本発明の組成物は、細胞または動物に投与するために、単独で、または１つまたは複数の他の療法のモダリティと組み合わせて、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される液剤に製剤化される、本明細書に記載の１つまたは複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、形質導入された細胞などを含んでよい。所望であれば、本発明の組成物は、他の作用剤、例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、小分子または種々の薬学的に活性な作用剤などとも組み合わせて投与することができることも理解されよう。同様に組成物に含めることができる他の構成成分に対する限定は、追加的な作用剤が、意図された遺伝子治療を送達する組成物の能力に悪影響を及ぼさないのであれば、実質的に存在しない。
本発明の医薬組成物では、薬学的に許容される賦形剤およびキャリア溶液の処方は、本明細書に記載の特定の組成物を、例えば、経口的、非経口的、静脈内、鼻腔内、および筋肉内への投与および処方を含めた種々の治療レジメンにおいて使用するための適切な投薬および治療レジメンの開発と同様に当業者に周知である。
ある特定の状況では、本明細書に開示されている組成物を、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号（そのそれぞれの全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）に記載の通り、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、またはさらには腹腔内に送達することが望ましい。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中に調製することができる。分散物をグリセロール、液体ポリエチレングリコール、ならびにそれらの混合物中に、および油中に調製することもできる。通常の保管および使用の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を予防するために防腐剤を含有する。
注射による使用に適した医薬形態としては、滅菌水溶液または分散物、および滅菌の注射可能な溶液または分散物を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる（米国特許第５，４６６，４６８号、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）。全ての場合において、形態は滅菌されているべきであり、また、容易に注射可能である程度まで流体であるべきである。形態は製造および保管の条件下で安定であるべきであり、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、ならびに／または植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒度を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって容易にすることができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによってもたらすことができる。
水溶液中で非経口投与するためには、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝されているべきであり、液体希釈剤は最初に十分な食塩水またはグルコースを用いて等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は本開示を考慮すれば当業者に公知になろう。例えば、１投与量を、等張性のＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解させ、皮下注入用流体１０００ｍｌに添加するか、提唱された注入部位に注射することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００年を参照されたい）。治療されている被験体の状態に応じて、投与量にいくらかの変動が必ず生じる。いずれにしても、投与に関与する人が個々の被験体に対する適切な用量を決定する。さらに、ヒトに投与するためには、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓにより必要とされる滅菌、発熱性、および一般的な安全性および純度の標準に適うべきである。
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙されている種々の他の成分を含む適切な溶媒中に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と、それに加えて任意の追加的な所望の成分を、予め滅菌濾過したその溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技法である。
本明細書に開示されている組成物は、中性の形態または塩の形態に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基と形成される）が挙げられ、これは、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離のカルボキシル基と形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることができる。製剤化の際、溶液を投与製剤と適合する様式および治療的に有効な量で投与する。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル剤などの種々の剤形で容易に投与される。
本明細書で使用される場合、「キャリア」とは、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁物、コロイドなどを包含する。薬学的に活性な物質へのそのような媒体および作用物質の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性成分と適合しない場合を除く限りでは、治療用組成物におけるその使用が意図されている。補足的な活性成分も組成物に組み入れることができる。
「薬学的に許容される」という句は、ヒトに投与された際にアレルギー性または同様の不都合な応答を生じさせない分子実体および組成物を指す。タンパク質を活性成分として含有する水性組成物の調製は当技術分野ではよく理解されている。一般には、そのような組成物は、液体の溶液または懸濁物のいずれかとしての注射剤として調製され、注射前に液体での溶液、または液体での懸濁物に適した固体形態も調製することができる。調製物は乳化されていてもよい。
ある特定の実施形態では、組成物は、鼻腔内噴霧、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達することができる。遺伝子、ポリヌクレオチド、およびペプチド組成物を経鼻エアロゾル噴霧によって肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号（そのそれぞれの全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）に記載されている。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８年）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）を使用した薬物の送達も、製薬技術分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ある特定の実施形態では、送達は、本発明の組成物を適切な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞を、必要に応じて、ＣＰＰポリペプチドなどと混合して使用することによって起こり得る。具体的には、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子などのいずれかに封入して送達するために製剤化することができる。そのような送達ビヒクルの製剤化および使用は、公知かつ従来の技法を用いて行うことができる。本発明の製剤および組成物は、細胞または動物に投与するために、単独で、または１つまたは複数の他の療法のモダリティと組み合わせて、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化された、本明細書に記載の任意の数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および小分子の組み合わせで構成される１つまたは複数の抑制因子および／または活性化因子を含んでよい。所望であれば、本発明の組成物は、他の作用物質、例えば、細胞、他のタンパク質またはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な作用物質などとも組み合わせて投与することができることも理解されよう。
特定の実施形態では、本発明による製剤または組成物は、本明細書に記載の任意の数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および小分子の組み合わせと接触した細胞を含む。
ある特定の態様では、本発明は、これだけに限定されないが、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターを含めたウイルスベクター系を送達するため（すなわち、ウイルス媒介性形質導入）に適した製剤または組成物を提供する。
ｅｘ ｖｉｖｏ送達のための例示的な製剤は、当技術分野で公知の種々のトランスフェクション薬剤、例えば、リン酸カルシウム、電気穿孔、熱ショックおよび種々のリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介性トランスフェクション）などの使用も含んでよい。下でより詳細に説明されている通り、リポソームは、水性流体の画分が閉じ込められた脂質二重層である。ＤＮＡは、自発的にカチオン性リポソームの外面と会合し（その電荷によって）、これらのリポソームは細胞膜と相互作用する。
ある特定の態様では、本発明は、１種または複数種の薬学的に許容されるキャリア（添加物）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化された治療有効量の本明細書に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む薬学的に許容される組成物を提供する。
本発明の特定の実施形態は、他の製剤、例えば、製薬技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版 Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００年に記載されているものなどを含んでよい。
Ｅ．遺伝子治療の方法
レトロウイルスベクターにより、遺伝子治療の改善された方法がもたらされる。本明細書で使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、遺伝子および／または遺伝子の発現を回復させる、調整する、または改変する、細胞のゲノムへのポリヌクレオチドの導入を指す。種々の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、単一遺伝子の疾患、障害、もしくは状態または造血系の疾患、障害、もしくは状態を有すると診断された被験体またはそれを有する疑いがある被験体に治癒的、予防的、または軽減的利益をもたらすポリペプチドをコードする治療用導入遺伝子を発現する造血発現制御配列を含む。さらに、本発明のベクターは、特定の細胞の集団または系列、例えば、赤血球系細胞を増加または増大させるために、細胞において切断型エリスロポエチン受容体を発現する別の発現制御配列を含む。ウイルスを、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞に感染させ、それに形質導入することができる。ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実施形態では、次いで、形質導入された細胞を、治療を必要とする被験体に投与することができる。本発明は、本発明のベクター系、ウイルス粒子、および形質導入された細胞を使用して、被験体における単一遺伝子の疾患、障害、もしくは状態または造血系の疾患、障害、もしくは状態、例えば、異常ヘモグロビン症を処置する、予防する、および／または軽減することを意図している。
本明細書で使用される場合、「造血」とは、前駆細胞からの血液細胞の形成および発達ならびに幹細胞からの前駆細胞の形成を指す。血液細胞としては、これだけに限定されないが、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ）、網状赤血球、単球、好中球、巨核球、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、マクロファージ、顆粒球、肥満細胞、栓球、および白血球が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「異常ヘモグロビン症」または「異常ヘモグロビン症の状態」という用語は、血液中に異常なヘモグロビン分子が存在することを伴う任意の障害を包含する。異常ヘモグロビン症の例としては、これだけに限定されないが、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアが挙げられる。血液中に異常なヘモグロビンの組み合わせが存在する異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球／Ｈｂ−Ｃ症）も包含される。
「鎌状赤血球貧血」または「鎌状赤血球症」という用語は、本明細書では、赤血球の鎌状化に起因する任意の症候性の貧血性の状態を包含すると定義される。鎌状赤血球症の徴候としては、貧血；疼痛；ならびに／または臓器機能障害、例えば、腎不全、網膜症、急性胸部症候群、虚血、持続勃起症および脳卒中が挙げられる。本明細書で使用される場合、「鎌状赤血球症」という用語は、特にＨｂＳにおける鎌状赤血球置換についてホモ接合体である被験体における鎌状赤血球貧血に伴う種々の臨床的問題を指す。本明細書において鎌状赤血球症という用語を使用することによって言及される体質性徴候としては、成長および発達の遅延、特に肺炎球菌に起因する重篤な感染症が発生する傾向の増加、再発性梗塞および最終的な脾組織の破壊を伴う、循環している細菌の有効なクリアランスが妨げられる脾機能の著しい欠陥がある。「鎌状赤血球症」という用語には、主に腰椎、腹部、および大腿骨幹（ｆｅｍｏｒａｌ ｓｈａｆｔ）に影響を及ぼし、機構および重症度が減圧痛と同様である筋骨格痛の急性エピソードも包含される。成人では、そのような発作（ａｔｔａｃｋ）は、一般に、数週間または数カ月ごとに持続時間の短い軽度または中程度の発作（ｂｏｕｔ）として顕在化し、その間に平均で１年に約１回、５〜７日間続く苦痛な発作（ａｔｔａｃｋ）に襲われる。そのような発症のトリガーとなることが公知の事象はアシドーシス、低酸素症および脱水であり、これらは全て細胞内でのＨｂＳの重合を増強する（Ｊ． Ｈ． Ｊａｎｄｌ、Ｂｌｏｏｄ： Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、第２版、Ｌｉｔｔｌｅ， Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｂｏｓｔｏｎ、１９９６年、５４４〜５４５頁）。本明細書で使用される場合、「サラセミア」という用語は、ヘモグロビンの合成に影響を及ぼす変異に起因して起こる遺伝性貧血を包含する。したがって、この用語は、重度のまたはβサラセミア、サラセミアメジャー、中等症サラセミア、ヘモグロビンＨ症などのαサラセミアなどのサラセミアの状態によって生じる任意の症候性貧血を包含する。
本明細書で使用される場合、「サラセミア」とは、ヘモグロビンの生成の欠陥を特徴とする遺伝性障害を指す。サラセミアの例としては、αサラセミアおよびβサラセミアが挙げられる。βサラセミアは、ベータグロビン鎖の変異によって引き起こされ、重症型または軽症型で（ｉｎ ａ ｍａｊｏｒ ｏｒ ｍｉｎｏｒ ｆｏｒｍ）起こり得る。重症型のβサラセミアでは、出生時には小児は正常であるが、生後１年間で貧血を発症する。軽度の型のβサラセミアでは、小さな赤血球が産生され、グロビン鎖由来の１つまたは複数の遺伝子の欠失によってサラセミアが引き起こされる。
αサラセミアは、一般には、ＨＢＡ１遺伝子およびＨＢＡ２遺伝子が関与する欠失によって生じる。これらの遺伝子はどちらも、ヘモグロビンの構成成分（サブユニット）であるα−グロビンをコードする。各細胞のゲノムにはＨＢＡ１遺伝子の２つのコピーおよびＨＢＡ２遺伝子の２つのコピーが存在する。結果として、α−グロビンを産生する４つの対立遺伝子が存在する。種々の種類のαサラセミアがこれらの対立遺伝子の一部または全部の喪失に起因する。αサラセミアの最も重度の型であるＨｂ Ｂａｒｔ症候群は、α−グロビン対立遺伝子４つ全てが喪失することによって生じる。ＨｂＨ症は、α−グロビン対立遺伝子４つのうち３つが喪失することによって引き起こされる。これらの２つの状態では、α−グロビンの不足により、細胞が正常なヘモグロビンを作ることが妨げられる。その代わりに、細胞は、ヘモグロビンＢａｒｔ（Ｈｂ Ｂａｒｔ）またはヘモグロビンＨ（ＨｂＨ）と称される異常な形態のヘモグロビンを産生する。これらの異常なヘモグロビン分子は酸素を体の組織に有効に運搬することができない。Ｈｂ ＢａｒｔまたはＨｂＨで正常なヘモグロビンが置換されることにより、αサラセミアに関連する貧血および他の重篤な健康問題が引き起こされる。
好ましい実施形態では、本発明の遺伝子治療の方法を用いて、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β−サラセミア、サラセミメジャーア、中等症サラセミア、α−サラセミア、およびヘモグロビンＨ症からなる群から選択される異常ヘモグロビン症を処置する、予防する、または軽減する。
種々の実施形態では、レトロウイルスベクターを、遺伝子治療を必要とする被験体の細胞、組織、または器官にｉｎ ｖｉｖｏで直接注射することによって投与する。種々の他の実施形態では、細胞に、本発明のベクターを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで形質導入し、必要に応じてｅｘ ｖｉｖｏで増大させる。次いで、形質導入された細胞を、遺伝子治療を必要とする被験体に投与する。
本発明の遺伝子治療の方法における形質導入および投与に適した細胞としては、これだけに限定されないが、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられる。ある実施形態では、形質導入される細胞は胚性幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、胎盤幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、心臓幹細胞、腎幹細胞、造血幹細胞である。
種々の実施形態では、幹細胞を使用することが好ましく、これは、幹細胞がｉｎ ｖｉｖｏで特定の生物学的ニッシェに投与されると適切な細胞型に分化する能力を有するためである。「幹細胞」という用語は、（１）長期にわたって自己再生できること、または元の細胞と同一のコピーを少なくとも１つ生成することができること、（２）単一細胞レベルで、多数の、またいくつかの例ではただ１つの特殊化した細胞型に分化することができること、および（３）ｉｎ ｖｉｖｏで組織の機能的再生をすることができる未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、それらの発生上の能力に従って、全能性、多能性、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）および少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）／単能性に細分類される。「自己再生」とは、変更されていない娘細胞を産生する独特の能力および特殊化した細胞型を生成する独特の能力（潜在力）を有する細胞を指す。自己再生は、２つのやり方で実現することができる。非対称細胞分裂により、親の細胞と同一である娘細胞が１つと、親の細胞とは異なり、前駆細胞または分化細胞である娘細胞が１つ産生される。非対称細胞分裂では細胞の数は増大しない。対称細胞分裂により、同一の娘細胞が２つ産生される。細胞の「増殖」または「拡大」とは、対称的に分裂する細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、細胞の、体または体質（すなわち、胚本体（ｅｍｂｒｙｏ ｐｒｏｐｅｒ））の全ての系列を形成する能力を意味する。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、および内胚葉のそれぞれから細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。本明細書で使用される場合、「多分化能」という用語は、成体幹細胞の、１つの系列の多数の細胞型を形成する能力を指す。例えば、造血幹細胞は、血液細胞系列の全ての細胞、例えば、リンパ系細胞および骨髄性細胞を形成することができる。
本明細書で使用される場合、「前駆体」または「前駆細胞」という用語は、自己再生する能力、およびより成熟した細胞に分化する能力を有する細胞を指す。前駆細胞の効力は多能性幹細胞および多分化能性幹細胞と比較して低下する。多くの前駆細胞は単一の系列に沿って分化するが、かなり広範囲の増殖能力も有し得る。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生物体の生存期間にわたって成熟血液細胞のレパートリー全体を生成することができる拘束された造血前駆細胞（ＨＰＣ）を生じさせる。「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、骨髄系列（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系列（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、および当技術分野で公知のその他の系列を含めた、生物体の血液細胞の種類の全てを生じさせる多分化能性幹細胞を指す（Ｆｅｉ， Ｒ．ら、米国特許第５，６３５，３８７号；ＭｃＧｌａｖｅら、米国特許第５，４６０，９６４号；Ｓｉｍｍｏｎｓ， Ｐ．ら、米国特許第５，６７７，１３６号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７５０，３９７号；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、米国特許第５，７５９，７９３号；ＤｉＧｕｉｓｔｏら、米国特許第５，６８１，５９９号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７１６，８２７号を参照されたい）。致死的に放射線照射した動物またはヒトに移植すると、造血幹細胞および前駆細胞は赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球およびリンパ系の造血細胞プールを再配置させることができる。
好ましい実施形態では、形質導入される細胞は、骨髄、臍帯血、または末梢循環から単離された造血幹細胞および／または造血前駆細胞である。特に好ましい実施形態では、形質導入される細胞は、骨髄、臍帯血、または末梢循環から単離された造血幹細胞である。
ＨＳＣは、特定の表現型マーカーまたは遺伝子型マーカーに応じて同定することができる。例えば、ＨＳＣは、それらのサイズが小さいこと、系列（ｌｉｎ）マーカーを欠くこと、生体染色色素、例えば、ローダミン１２３（ローダミンＤＵＬＬ、ｒｈｏｌｏとも称される）またはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２での染色性が低いこと（サイドポピュレーション）、およびそれらの表面上に、その多くが分化シリーズのクラスターに属する種々の抗原マーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、Ｔｅｒ１１９、およびｃ−ｋｉｔ、幹細胞因子の受容体）が存在することによって同定することができる。ＨＳＣは、系列拘束を検出するために一般に使用されるマーカーについて主に陰性であり、したがって、多くの場合、Ｌｉｎ（−）細胞と称される。
一実施形態では、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、およびＬｉｎ（−）と特徴付けることができる。しかし、特定のＨＳＣはＣＤ３４−／ＣＤ３８−であるので、全ての幹細胞がこれらの組み合わせに包含されるとは限らない。いくつかの試験では、最初期の幹細胞は細胞表面上のｃ−ｋｉｔを欠く場合があることも示唆されている。ヒトＨＳＣに関しては、ＣＤ３４＋ＨＳＣおよびＣＤ３４−ＨＳＣはどちらもＣＤ１３３＋であることが示されているので、ＣＤ１３３は初期のマーカーを意味することができる。ＣＤ３４＋細胞およびＬｉｎ（−）細胞は、造血前駆細胞も含むことは当技術分野で公知である。
別の実施形態では、造血階層をＳＬＡＭコードによって決定する。ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）ファミリーは、遺伝子が、第１染色体（マウス）上の単一の遺伝子座に大部分がタンデムに位置し、全てが免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのサブセットに属し、最初はＴ細胞刺激に関与すると考えられていた＞１０分子の群である。このファミリーは、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４などを含み、ＣＤ１５０は創始メンバー（ｆｏｕｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ）であり、したがって、ｓｌａｍＦ１、すなわち、ＳＬＡＭファミリーメンバー１とも称される。造血階層についてのサインＳＬＡＭコードは、造血幹細胞（ＨＳＣ）−ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ２４４−；多分化能性前駆細胞（ＭＰＰｓ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８−ＣＤ２４４＋；系列制限前駆細胞（ＬＲＰｓ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８＋ＣＤ２４４＋；一般的な骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｍｉｄ；顆粒球−マクロファージ前駆体（ＧＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｈｉ；および巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４−ＣＤ１６／３２ｌｏｗである。
マウスでは、スタンフォード大学のＩｒｖｉｎｇ Ｗｅｉｓｓｍａｎのグループが１９８８年にマウス造血幹細胞を初めて単離し、マウス造血階層を区別するためのマーカーも初めて解明した。造血階層に関するマーカーは、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）−ＣＤ３４−、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏ、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋；短期造血幹細胞（ＳＴ−ＨＳＣ）−ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏ、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５−、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）ｌｏ；初期多分化能性前駆体−（初期ＭＰＰ）−ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１−、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５＋、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０−、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）ｌｏ、ＣＤ４ｌｏ；および後期多分化能性前駆体（後期ＭＰＰ）−ＣＤ３４＋、ＳＣＡ−１＋、Ｔｈｙ１．１−、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、ＣＤ１３５ｈｉｇｈ、Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０−、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）ｌｏ、ＣＤ４ｌｏである。
一実施形態では、造血細胞はＣＤ１０５＋Ｓｃａ１＋細胞である。
本発明の細胞は、自己由来／自源性（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）（「自己」）であっても非自己由来（「非自己」、例えば、同種異系、同系または異種）であってもよい。「自己由来」とは、本明細書で使用される場合、同じ被験体由来の細胞を指す。「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。「同系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞と遺伝的に同一である、異なる被験体の細胞を指す。「異種」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、本発明の細胞は同種異系のものである。
「被験体」とは、本明細書で使用される場合、本明細書の他の箇所で開示されている遺伝子治療ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法を用いて処置することができる単一遺伝子の疾患、障害、または状態の症状を示す任意の動物を包含する。好ましい実施形態では、被験体として、本明細書の他の箇所で開示されている遺伝子治療ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法を用いて処置することができる造血系の疾患、障害、または状態、例えば、異常ヘモグロビン症の症状を示す任意の動物が挙げられる。適切な被験体（例えば、患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、農場動物、および家畜動物または愛玩動物（例えば、ネコまたはイヌ）が挙げられる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な被験体としては、遺伝子治療によって調節することができる１つまたは複数の生理的活性の量が異常である（「正常な」または「健常な」被験体よりも少量または多量である）動物が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、疾患または病的状態の症状または病態に対する任意の有益なまたは望ましい効果を包含し、また、治療されている疾患または状態の１種または複数種の測定可能なマーカーの最低限の減少でさえ含んでよい。治療は、必要に応じて、疾患もしくは状態の症状の軽減もしくは改善、または疾患もしくは状態の進行の遅延を含んでよい。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、必ずしも疾患もしくは状態、またはそれに付随する症状の完全な根絶もしくは治癒を示すものではない。
本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および同様の単語、例えば、「予防される（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などは、疾患または状態の発生または再発を予防するため、阻害するため、またはその可能性を低下させるための手法を指す。この用語は、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは状態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および同様の単語は、疾患または状態が発症または再発する前に、疾患または状態の強さ、影響、症状および／または負荷を軽減することも包含する。
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含めた有益なまたは所望の予防結果または治療結果を実現するためのウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「有効な量（ａｎ ａｍｏｕｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「有効量（ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」を指す。
「予防有効量」とは、所望の予防結果を実現するために有効なウイルスまたは形質導入された治療用細胞の量を指す。必ずではないが一般には、予防的な用量は疾患の前に、または疾患のより早い段階で被験体に用いられるので、予防有効量は治療有効量よりも少ない。
ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに、幹細胞および前駆細胞の個体における所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて変動してよい。治療有効量は、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞のいかなる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「治療有効量」という用語は、被験体（例えば、患者）を「治療する」ために有効な量を包含する。
一実施形態では、本発明は、形質導入された細胞を被験体に提供する方法であって、目的の遺伝子に作動可能に連結した細胞型もしくは細胞系列に特異的なプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサー、およびｔＥｐｏＲに作動可能に連結した、遍在するプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーまたはｔＥｐｏＲに作動可能に連結した、細胞型もしくは細胞系列に特異的なプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーを含むベクター、または本明細書の他の箇所で考察されている本発明の別の適切なベクターを用いて形質導入された１つまたは複数の細胞を、例えば、非経口的に投与する工程を含む方法を提供する。
特定の実施形態では、被験体における異常ヘモグロビン症を処置する方法が提供される。該方法は、目的の遺伝子に作動可能に連結した造血細胞特異的プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサー、およびｔＥｐｏＲに作動可能に連結した、遍在するプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーまたはｔＥｐｏＲに作動可能に連結した、細胞型もしくは細胞系列に特異的なプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーを含むベクター、または本明細書の他の箇所で考察されている本発明の別の適切なベクターを用いて形質導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞の集団を投与する工程を含む。
一実施形態では、本発明は、被験体における赤血球系細胞の数を選択的に増大させる方法であって、目的の遺伝子に作動可能に連結した造血細胞特異的プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサー、およびｔＥｐｏＲに作動可能に連結した、遍在するプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーまたはｔＥｐｏＲに作動可能に連結した、細胞型もしくは細胞系列に特異的なプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーを含むベクター、または本明細書の他の箇所で考察されている本発明の別の適切なベクターを用いて形質導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞の集団を投与する工程を含み、ここで、該被験体において造血幹細胞の赤血球系後代細胞の数が増大する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、被験体における白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）と比較した赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）の割合を増加させる方法を提供する。該方法は、目的の遺伝子に作動可能に連結した造血細胞プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーおよびｔＥｐｏＲに作動可能に連結した、遍在するプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーまたはｔＥｐｏＲに作動可能に連結した、細胞型もしくは細胞系列に特異的なプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーを含むベクター、または本明細書の他の箇所で考察されている本発明の別の適切なベクターを用いて形質導入された造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞の集団を投与する工程であって、ここで、該被験体において、造血幹細胞の白血球後代細胞と比較して造血幹細胞の赤血球後代細胞の割合が増加する工程を含む。
特定の実施形態では、上記被験体にＥＰＯを投与せず、切断型ＥｐｏＲによって媒介される細胞の増大の有効性は該被験体における内在性のＥＰＯ産生に起因する。いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明は、一部において、サラセミアなどの異常ヘモグロビン症に罹患している特定の被験体が、例えば、正常な被験体と比較して構成的に高レベル、例えば、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、または約５０倍またはそれを超える血漿中ＥＰＯを有することを意図している。したがって、ｔＥｐｏＲを発現する細胞の数を、ｔＥｐｏＲを発現しない細胞および／または内因性のＥｐｏＲを発現する細胞と比較して約５倍、約１０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍または約２５０倍またはそれを超えて増加または増大させるために十分に高レベルのＥＰＯ。別の実施形態では、ｔＥｐｏＲを発現する細胞の数を、ｔＥｐｏＲを発現しない細胞および／または内因性のＥｐｏＲを発現する細胞と比較して少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍または少なくとも２５０倍またはそれを超えて増加または増大させるために十分に高レベルのＥＰＯ。
ある実施形態では、被験体に、ＥｐｏＲアゴニスト、例えば、ＥＰＯも、形質導入された細胞の投与に先立って、それと同時に、および／またはその後に投与する。本明細書で使用される場合、「エリスロポエチン」または「ＥＰＯ」という用語は、赤血球の産生（赤血球生成）の刺激に関与する主要なホルモンである、腎臓で産生される糖タンパク質を指す。ＥＰＯは、骨髄における関係する赤血球前駆体の分裂および分化を刺激する。正常な血漿中エリスロポエチンレベルは０．０１〜０．０３単位／ｍＬにわたり、低酸素症または貧血の間には１００〜１，０００倍増加し得る。ＧｒａｂｅｒおよびＫｒａｎｔｚ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ２９巻：５１頁（１９７８年）；ＥｓｃｈｂａｃｈおよびＡｄａｍｓｏｎ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ． ２８巻：１頁（１９８５年）。組換えヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥｐｏまたはエポエチン（ｅｐｏｉｅｔｉｎ）アルファ）はＥＰＯＧＥＮ（登録商標）（エポエチンアルファ、組換えヒトエリスロポエチン）（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、Ｃａｌｉｆ．）として、およびＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標）（エポエチンアルファ、組換えヒトエリスロポエチン）（Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｒａｒｉｔａｎ、Ｎ．Ｊ．）として市販されている。
好ましい実施形態では、被験体にＥＰＯを投与する。
例示的な実施形態では、形質導入された細胞を上記被験体に投与した後、該被験体に、１日ごと、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、または７日ごと、毎週、隔週、毎月、隔月、１カ月ごと、２カ月ごと、３カ月ごと、４カ月ごと、５カ月ごと、または６カ月ごと、または年に１回、または間の任意の時間の頻度で処置の期間にわたってＥＰＯを投与する。特定の例示的な実施形態では、被験体に投与するＥＰＯの用量は、これだけに限定することなく、１週間当たり約１００〜約５００００単位（ＩＵ；国際単位）、１週間当たり約２００〜約４００００ＩＵ、１週間当たり約５００〜約３００００ＩＵ、１週間当たり約１０００〜約４００００ＩＵ、１週間当たり約１０００〜約３００００ＩＵ、１週間当たり約１０００〜約２００００ＩＵ、１週間当たり約５０００〜約４００００ＩＵ、１週間当たり約５０００〜約３００００ＩＵ、１週間当たり約５０００〜約２００００ＩＵ、１週間当たり約１００００〜約４００００ＩＵ、１週間当たり約１００００〜約３００００ＩＵ、１週間当たり約１００００〜約２００００ＩＵ、または、１週間当たり、任意の間の範囲のＩＵである。
特定の例示的な実施形態では、上記被験体に投与するＥＰＯの用量は、これだけに限定することなく、１週間当たり少なくとも約１００単位、１週間当たり少なくとも約２００単位、１週間当たり少なくとも約５００単位、１週間当たり少なくとも約１０００単位、１週間当たり少なくとも約５０００単位、１週間当たり少なくとも約１００００単位、１週間当たり少なくとも約２００００単位、１週間当たり少なくとも約３００００単位、１週間当たり少なくとも約４００００単位、１週間当たり少なくとも約５００００単位、または、１週間当たり、任意の間の範囲のＩＵである。
特定の例示的な実施形態では、上記被験体に投与するＥＰＯの用量は、これだけに限定することなく、１週間当たり体重１ｋｇ当たり約１〜約５００ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり約１０〜約５００ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり約２５〜約５００ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり約５０〜約５００ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり約１００〜約５００ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり約１００〜約２５０ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり約２５０〜約５００ＩＵ、または、１週間当たり体重１ｋｇ当たり、任意の間の範囲のＩＵである。
特定の例示的な実施形態では、上記被験体に投与するＥＰＯの用量は、これだけに限定することなく、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約１０ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約２５ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約５０ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約７５ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約１００ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約２００ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約２５０ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約３００ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約３５０ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約４００ＩＵ、１週間当たり体重１ｋｇ当たり少なくとも約５００ＩＵ、または、１週間当たり体重１ｋｇ当たり、任意の間の範囲のＩＵである。
本発明により提供される種々の方法では、ＥＰＯまたは別のＥｐｏＲアゴニストの存在下でｔＥｐｏＲを発現させることにより、ｔＥｐｏＲを発現している細胞の集団がｔＥｐｏＲを発現しない細胞および／または正常なＥｐｏＲを発現する細胞と比較して増加または増大する。本明細書の他の箇所で言及されている通り、全ての細胞においてｔＥｐｏＲ受容体を発現させる発現制御配列（遍在発現または条件的発現）、または特定の細胞型または細胞系列においてｔＥｐｏＲ受容体を発現させる発現制御配列により、ｔＥｐｏＲ発現細胞がｔＥｐｏＲを発現しない細胞および／または正常なＥｐｏＲを発現する細胞と比較して増大する。
本発明のベクターおよび方法を用いて増大させる例示的な細胞としては、これだけに限定されないが、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、胎盤幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、心臓幹細胞、腎幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系前駆体、リンパ球系前駆体、血小板新生前駆体、赤血球前駆体、顆粒球形成前駆体、単核球形成前駆体、巨核芽球、前巨核球、巨核球、栓球／血小板、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染赤芽球、正染性赤芽球、多染赤血球、赤血球（ＲＢＣ）、好塩基性前骨髄球、好塩基性骨髄球、好塩基性後骨髄球、好塩基球、好中性前骨髄球、好中性骨髄球、好中性後骨髄球、好中球、好酸性前骨髄球、好酸性骨髄球、マクロファージ、樹状細胞、リンパ芽球、前リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、およびリンパ球系樹状細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、標的細胞型は、１つまたは複数の赤血球系細胞、例えば、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染赤芽球、正染性赤芽球、多染赤血球、および赤血球（ＲＢＣ）である。
好ましい実施形態では、本発明のベクターおよび方法を用いて増大させる細胞としては、これだけに限定されないが、造血幹細胞または造血前駆細胞、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染赤芽球、正染性赤芽球、多染性血球、および赤血球（ＲＢＣ）、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
一実施形態では、ＥＰＯを投与した後、ｔＥｐｏＲを発現している細胞が、 ＥＰＯを投与する前の被験体におけるｔＥｐｏＲを発現している細胞と比較して、またはｔＥｐｏＲを発現していない細胞および／または内因性のＥｐｏＲを発現している細胞と比較して約５倍、約１０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍または約２５０倍またはそれを超えて増大する。
別の実施形態では、ＥＰＯを投与した後、ｔＥｐｏＲを発現している細胞が、ＥＰＯを投与する前の被験体におけるｔＥｐｏＲを発現している細胞と比較して、またはｔＥｐｏＲを発現していない細胞および／または内因性のＥｐｏＲを発現している細胞と比較して少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍または少なくとも２５０倍またはそれを超えて増大する。
特定の実施形態では、ＥＰＯを投与した後、ｔＥｐｏＲを発現している赤血球系細胞が、ＥＰＯを投与する前の被験体におけるｔＥｐｏＲを発現している赤血球系細胞と比較して、またはｔＥｐｏＲベクターを含むがｔＥｐｏＲを発現しない非赤血球系細胞と比較して約５倍、約１０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍または約２５０倍またはそれを超えて増大する。
別の実施形態では、ＥＰＯを投与した後、ｔＥｐｏＲを発現している赤血球系細胞が、ＥＰＯを投与する前の被験体におけるｔＥｐｏＲを発現している赤血球系細胞と比較して、またはｔＥｐｏＲベクターを含むがｔＥｐｏＲを発現しない非赤血球系細胞と比較して少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍または少なくとも２５０倍またはそれを超えて増大する。
いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明のベクター、組成物、および方法によってもたらされる重要な利点は、既存の方法と比較して低い百分率の形質導入された細胞を含む細胞の集団を投与することによって実現することができる、遺伝子治療の有効性の高さである。これにより、形質導入された細胞における細胞の遺伝子の有害な変異、形質転換、または癌遺伝子活性化の機会が低下することに関連する重要な安全性の利点がもたらされる。
形質導入された細胞は、骨髄切除療法を受けた個体または受けていない個体において骨髄移植または臍帯血移植の一部として投与することができる。一実施形態では、本発明の形質導入された細胞を、化学的切除（ｃｈｅｍｏａｂｌａｔｉｖｅ）または放射線切除（ｒａｄｉｏａｂｌａｔｉｖｅ）骨髄療法を受けた個体に骨髄移植において投与する。
一実施形態では、ある用量の形質導入された細胞を被験体に静脈内送達する。好ましい実施形態では、形質導入された造血幹細胞を被験体に静脈内投与する。
特定の実施形態では、患者は、１ｋｇ当たり細胞約１×１０５個、１ｋｇ当たり細胞約５×１０５個、１ｋｇ当たり細胞約１×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約２×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約３×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約４×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約５×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約６×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約７×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約８×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約９×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約１×１０７個、１ｋｇ当たり細胞約５×１０７個、１ｋｇ当たり細胞約１×１０８個、またはそれより多くの用量の形質導入された細胞、例えば、造血幹細胞を１回の単回静脈内用量で受ける。ある実施形態では、患者は、１ｋｇ当たり少なくとも細胞１×１０５個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞５×１０５個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞１×１０６個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞２×１０６個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞３×１０６個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞４×１０６個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞５×１０６個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞６×１０６個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞７×１０６個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞８×１０６個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞９×１０６個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞１×１０７個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞５×１０７個、１ｋｇ当たり少なくとも細胞１×１０８個、またはそれより多くの用量の形質導入された細胞、例えば、造血幹細胞を１回の単回静脈内用量で受ける。
追加的な実施形態では、患者は、１ｋｇ当たり細胞約１×１０５個〜１ｋｇ当たり細胞約１×１０８個、１ｋｇ当たり細胞約１×１０６個〜１ｋｇ当たり細胞約１×１０８個、１ｋｇ当たり細胞約１×１０６個〜１ｋｇ当たり細胞約９×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約２×１０６個〜１ｋｇ当たり細胞約８×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約２×１０６個〜１ｋｇ当たり細胞約８×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約２×１０６個〜１ｋｇ当たり細胞約５×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約３×１０６個〜１ｋｇ当たり細胞約５×１０６個、１ｋｇ当たり細胞約３×１０６個〜１ｋｇ当たり細胞約４×１０８個、または１ｋｇ当たりの細胞の任意の間の用量の形質導入された細胞、例えば、造血幹細胞を受ける。
種々の実施形態では、本発明の方法は、既存の方法よりも頑強かつ安全な遺伝子治療であって、形質導入された細胞を約５％、形質導入された細胞を約１０％、形質導入された細胞を約１５％、形質導入された細胞を約２０％、形質導入された細胞を約２５％、形質導入された細胞を約３０％、形質導入された細胞を約３５％、形質導入された細胞を約４０％、形質導入された細胞を約４５％、または形質導入された細胞を約５０％含む細胞の集団または用量を被験体に投与する工程を含む遺伝子治療を提供する。
好ましい一実施形態では、本発明は、赤血球系細胞の集団が増大または増加する潜在性を有する形質導入された細胞、例えば、幹細胞、例えば、造血幹細胞を提供する。特定の実施形態では、造血幹細胞を、本発明のベクターを用いて形質導入し、異常ヘモグロビン症に対する治療を必要とする個体に投与する。造血幹細胞は赤血球系細胞を起源とし、したがって好ましい。
種々の実施形態では、本発明のベクター、組成物、および方法により、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療および自家移植を用いた遺伝子治療の方法の改善がもたらされる。１つの非限定的な例では、本発明は、どちらも赤血球特異的転写性制御下にあるヒトβ−グロビンおよび切断型エリスロポエチン受容体をコードするレンチウイルスベクターを提供する。この切断型受容体により、ヒト保有者においてｔＥｐｏＲを発現している細胞に対して、エリスロポエチンに対する感受性の増強、および良性増殖的利点が付与される。ベクターを用いて形質導入された細胞を、異常ヘモグロビン症を有し、血漿中ＥＰＯレベルが上昇しているか組換えＥＰＯを投与されたかいずれかの被験体に移植することにより、たとえ形質導入された細胞／形質導入されていない細胞の比が低くても、疾患が長期にわたって調整される。
ここで、本発明を以下の実施例によってより詳細に記載する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全なものになるよう、また本発明の範囲が当業者に十分に伝わるように提供される。
（実施例１）
細胞培養、形質導入、および骨髄細胞移植
いくつかの実施形態では５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）細胞とも称される造血幹細胞（ＨＳＣ）を、４日前に１５０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射した雄のドナーマウスの骨髄（ＢＭ）細胞から得、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ密度勾配精製（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）にかけた。特定の実施形態では、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して雄のマウスＢＭからＣＤ１０５＋Ｓｃａ１＋細胞を選別することによってＨＳＣを精製した。髄質のリンパ骨髄性（ｌｙｍｐｈｏｍｙｅｌｏｉｄ）細胞および赤血球系細胞を、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＣＤ４５抗原の存在または非存在に基づいて精製した。純度を、ＣＤ４５抗原およびＴｅｒ１１９抗原に対する抗体を用いた血球計算によって確認した。
異所性シュードタイピングされたレトロウイルスベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してＢＯＳＣ２３細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質導入した２日後に異所性レトロウイルスベクターの力価をフローサイトメトリーによって評価した。水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質−Ｇでシュードタイピングされた組換えレンチウイルスベクターを作製した。力価は、ウイルスの上清１ミリリットル当たり約２×１０８形質導入単位であった。
形質導入する前に、細胞を洗浄し、１５％ＦＣＳ、１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、６．２５ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−３、および１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−６を含有するアルファ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１ｍＬ当たり細胞１〜２×１０６個の最終濃度で懸濁させ、３７℃で成長させた。サイトカインは全てＰｅｐｒｏｔｅｃｈからのものであった。組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ；３Ｕ／ｍＬ；Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ）を赤血球系細胞培養物に加えた。
ガンマレトロウイルスベクター（ＲＶ）を用いた５−ＦＵ細胞への形質導入を４０時間後に開始した。細胞を、２４時間離して２回、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ）でコーティングしたペトリ皿上、８ｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、補体除去した血清、およびサイトカインを含有するアルファ−ＭＥＭ培地中、希釈していないレトロウイルスの上清に曝露させた。形質導入した２日後に、増強緑色蛍光タンパク質−（ｅＧＦＰ）陽性細胞の百分率（フローサイトメトリーによって決定されたところ２４％〜３２％、４日後に変化せず）を、モック形質導入細胞を用いて１０％に設定した。細胞４００万個（ｅＧＦＰ発現細胞４×１０５個を含む）を致死的に放射線照射したβサラセミアの雌のマウスＨｂｂｔｈ−１／ｔｈ−１に静脈内注射した。本実験では、ＭＯＩは１（２回）であった。βサラセミアのレシピエントに、１１００ラド（３時間にわたって５５０ラドの分割線量）の全身照射を受けさせた。
細胞を単離した１６時間後に、レンチウイルスベクターを用いて細胞に形質導入した。５−ＦＵ細胞を、レトロネクチンでコーティングしたペトリ皿上、硫酸プロタミンおよびサイトカインを補充したＳｔｅｍＰｒｏ−３４無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、ベクターに曝露した。６時後に、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）および細胞スクレーパーを使用することによって細胞を収集した。合計５００，０００〜７５０，０００個の形質導入された５−ＦＵ細胞を、全身照射を受けたβサラセミアの雌のレシピエントのそれぞれに静脈内注射した。
実験１では、ＭＯＩは２０であり、βサラセミアのレシピエントに、６００ラド（単回線量）を受けさせた。
実験２では、３群のマウスに、それぞれ０．３、２、または１０のＭＯＩ、および１１００ラド（３時間にわたって５５０ラドの分割線量）で形質導入された細胞を受けさせた。ＬＧマウスおよびＬＧ／ＨＡ−Ｙ１マウスを用いて形質導入された細胞の移植を受けたβサラセミアマウスをそれぞれＬＧマウスおよびＬＧ／ＨＡ−Ｙ１マウスと名付けた。
第３の実験では、２００ラドの線量を単回照射した後に、βサラセミアマウス４匹にそれぞれＣＤ１０５＋Ｓｃａ１＋細胞２５，０００個を注射した。ＬＧ／ＨＡ−Ｙ１を２０のＭＯＩで用いて細胞に形質導入した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のために、ＬＧ／ＨＡ−Ｙ１を５０のＭＯＩで用いて骨髄赤血球系（ＣＤ４５−）細胞およびリンパ／骨髄性（ＣＤ４５＋）細胞に形質導入した。２日後にＲＮＡを抽出した。
血液パラメータ
血液試料を、自動細胞計数器（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ３７００；Ａｂｂｏｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を使用してヘモグロビンおよび血液細胞数について分析した。ヘマトクリット値を手動の遠心分離法によって得た。全ヘモグロビンに対する可溶性ヘモグロビンの割合を、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて全溶血物、および遠心分離した（２０，０００ｇで５分間）溶血物の上清におけるヘモグロビンを測定することによって決定した。エリスロポエチン濃度を、ヒトＥｐｏ標準物質を用い、Ｅｐｏモノクローナル酵素イムノアッセイキット（Ｍｅｄａｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）を使用することによって決定した。マウスヘモグロビンおよびヒトヘモグロビンを陽イオン交換ＨＰＬＣによって分離した。溶血物をＰｏｌｙＣＡＴ Ａカラム（ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ）に注入した。２種のトリス緩衝液（緩衝液Ａ：４０ｍＭのトリス、３ｍＭのＫＣＮ、酢酸を用いてｐＨ６．５に調整；緩衝液Ｂ：４０ｍＭのトリス、３ｍＭのＫＣＮ、２００ｍＭのＮａＣｌ、酢酸を用いてｐＨ６．５に調整）を用い、１５分間で７％〜７０％の緩衝液Ｂの直線勾配で溶出を実現した。ヘモグロビンを４１８ｎｍの波長で検出した。
フローサイトメトリー
ｅＧＦＰ陽性ＷＢＣを、ＲＢＣを溶解させ、ＣＤ４５．２に対するビオチン化抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて標識付けした後に検出した。細胞内ヒトβ−グロビンを検出するために、ＲＢＣを洗浄し、２％ホルムアルデヒド中に３０分間固定し、５０％メタノールおよび５０％アセトン中で３０秒間透過処理し、ヒトＨｂＡを特異的に認識するＦＩＴＣ標識抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＷａｌｌａｃ）を用いて染色した。ビオチン化した抗ＣＤ４５．２、およびＰＥ抗マウスＧＲ１／Ｍａｃ１、抗マウスＣＤ３、または抗マウスＢ２２０（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来）のいずれか、その後ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７による標識付けによって骨髄系およびリンパ球系ＢＭ細胞を検出した。抗マウスＴｅｒ１１９およびＣＤ７１抗原を使用することによって赤血球前駆細胞を同定した。
定量的ＰＣＲおよびＲＴ−定量的ＰＣＲ分析
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｂｌｏｏｄキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。白血球の中でのドナー雄細胞の画分（Ｄ）およびベクターのコピー数（Ｖ）を定量的ＰＣＲによって決定し、結果を、雄の細胞および雌の細胞由来のゲノムＤＮＡの段階希釈物ならびに一倍体ゲノム当たり１コピーのベクターが組み込まれたマウス細胞系由来のゲノムＤＮＡの段階希釈物についての結果と比較した。７３００ＡＢＩプリズム検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＲＯＸ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を含有する２×定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）ＭａｓｔｅｒＭｉｘを使用し、９５℃で１０分間の活性化ステップ後の９４℃で１５秒間の変性ならびに６０℃で１分間のアニーリングおよび伸長を伴う４０サイクルにわたってリアルタイムＰＣＲを実施した。プライマーおよびプローブが表１に記載されている。
表１．リアルタイムＰＣＲのために使用したプライマーおよびプローブ
ＥｐｏＲはエリスロポエチン受容体を示し、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセインエステルであり、ＬＶはレンチウイルスベクターであり、ＮＦＱは非蛍光クエンチャーであり、ＭＧＢは副溝結合物質（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）であり、ＳＲＹは性決定領域Ｙであり、ＴＡＭＲＡはテトラメチル−６−カルボキシローダミンである。＊Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。
Ｐｕｒｅｌｉｎｋ ｍｉｃｒｏ ｔｏ ｍｉｄｉ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｕｐｅｒ ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。マウス（ｍ）ＥｐｏＲ、ｍＧＡＰＤＨ、および１８ｓ ｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを用いて数量化した（表１）。比較Ｃｔ法（ΔΔＣＴ）を用いて、細胞型間でｍＥｐｏＲの生成レベルを比較した。逆転写酵素または試料を省いた対照試料を含めた。
改変された赤血球系細胞の増幅率
ｔＥｐｏＲおよびβ−グロビンの赤血球系細胞の増大に対する効果を、末梢血における改変されたＷＢＣの百分率と改変されたＲＢＣの百分率の間の比較に基づいて算出した。改変されたＲＢＣの百分率（％ＲＢＣ）を、抗ヒトＨｂＡ抗体を用いたフローサイトメトリーによって決定した。改変されたＷＢＣ（％ＷＢＣ）の百分率を、白血球当たりのベクターのコピー数（Ｖ）およびドナー雄細胞の画分（Ｄ）から決定した。以下の通り算出した：
・ドナー白血球当たりのベクターのコピー数Ｖｄ＝Ｖ／Ｄ；
・ドナー細胞の中での改変されたＷＢＣの百分率％ＷＢＣ＋ｄは、ポアソン則に従ってＶｄから決定した：％ＷＢＣ＋ｄ＝［１−ｅｘｐ（−Ｖｄ）］×１００；および
・全ての白血球の中での改変されたＷＢＣの百分率
％ＷＢＣ＋＝％ＷＢＣ＋ｄ×Ｄ。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、改変されたＷＢＣには改変されていないＷＢＣに対する利点または不都合がないと仮定して、骨髄における改変された赤血球にもたらされる生存的利益および改変された赤血球系細胞に付与される産生的利点に起因する改変された赤血球系細胞の増幅率（ＦＥ）を以下の通り算出した：
ＦＥ＝（％ＲＢＣ＋／％ＲＢＣ−）／（％ＷＢＣ＋／％ＷＢＣ−）（方程式１）
結果として、（％ＲＢＣ＋／％ＲＢＣ−）＝ＦＥ（％ＷＢＣ＋／％ＷＢＣ−）（方程式２）
また、％ＲＢＣ＋と％ＷＢＣ＋の間の双曲線形相関は、以下により説明される：
％ＲＢＣ＋＝｛ＦＥ［（１００／（ＦＥ−１）］×％ＷＢＣ＋｝／｛［１００／（ＦＥ−１）］＋％ＷＢＣ＋｝（方程式３）
この数学的モデルはＲｏｂｅｒｔｓら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ２００５年；１０５４巻：４２３〜４２８頁により導かれ、ＷＢＣおよびＲＢＣの破壊と生成の定常状態の平衡を仮定するものである。
改変された白血球がｔＥｐｏＲの影響を受けなかったことを評価するために、ｉｎ ｖｉｖｏにおける改変されたＷＢＣの画分およびｅｘ ｖｉｖｏにおける改変されたＨＣの画分を算出し、割り算し（ｄｉｖｉｄｅｄ）、ＬＧで形質導入された細胞を移植されたマウスとＬＧ／ＨＡ−Ｙ１で形質導入された細胞を移植されたマウスの間で比較した。
組み込み部位分析
ベクターを感染させた細胞由来のゲノムＤＮＡを精製し、ファージＭｕＡトランスポザーゼおよびＭｕＡ認識部位を含有する合成オリゴヌクレオチドで処理することによってＰＣＲ用のリンカーを付加した。次いで、組み込まれたベクターに近接するゲノムＤＮＡを、ベクターＤＮＡ末端およびリンカーと相補的なＰＣＲプライマーを使用することによって増幅した。ＰＣＲ産物の配列を、４５４／Ｒｏｃｈｅパイロシークエンシングによって決定し、データを精選し、分析した。Ｍｕ転位法により、存在量の推定値がもたらされ、単一のＭｕ部位の単離をもたらすｉｎ ｖｉｔｒｏにおける独立したＭｕ組み込み事象の数により、相対的な存在量が報告される。少数の場合では、２匹以上のマウスにおいて組み込み部位が見いだされた。これらの場合は、移植前に形質導入された細胞が成長したことに起因するか、またはＰＣＲの間の交差に起因する可能性がある。これらの場合では、組み込み部位を相対的な存在量に基づいて単一のマウスに割り当てた。組み込み部位の癌原遺伝子との近傍性を、ａｌｌＯｎｃｏデータベース（Ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｄａｔａ ｓｅｔｓ．ｍｉｃｒｏｂ２３０．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｃａｎｃｅｒ−ｇｅｎｅｓ．ｈｔｍｌで入手可能。２０１１年４月５日にアクセスした）と比較することによって決定した。
統計解析
２群比較のためにスチューデントｔ検定またはマンホイットニー順位和検定を用いた。３群以上を比較するためには一元配置分散分析およびホルムシダックまたはクラスカルワリスの順位に基づく方法を用いた。相関係数（Ｒ２）およびＰ値の決定を伴うデータには線形回帰を適用した。全ての試験を、ＳｉｇｍａＰｌｏｔバージョン１０．０ソフトウェアを用いて実施した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
（実施例２）
ｔＥｐｏＲを発現しているＨＣはβサラセミアマウスにおいて増殖的利点を有する
背景
血漿中Ｅｐｏのレベルが構成的に上昇している（正常なマウス値の２０〜５０倍）β−サラセミアマウスモデルを用いて、同系のレシピエントに移植した、ｔＥｐｏＲを遍在的に発現させるベクターを用いて形質導入した骨髄細胞の増大を検査した。
ＥｐｏＲ ｃＤＮＡおよびｅＧＦＰを遍在的に発現させるガンマレトロウイルスベクター（γＲＶ）を構築した。これらのγＲＶは、全長のマウスＥｐｏＲ（ｍＥｐｏＲＹ１−８）、２つの切断型受容体（ｍＥｐｏＲＹ１−２またはｍＥｐｏＲＹ１）のいずれか、またはｅＧＦＰのみをコードする（図１Ａ〜１Ｃ）。全ての構築物が、Ｂａ／Ｆ３細胞において効率的なＥｐｏ受容体を発現することが示された。ｍＥｐｏＲＹ１−８は、ＵＴ７−ＧＭ細胞において機能的であることも示された。
βサラセミアドナー由来のＢＭ細胞に、上記の４種のγＲＶを用いて形質導入した。遺伝子改変された細胞を１０％含む細胞４００万個を致死的に放射線照射したβサラセミアのレシピエントに注射した。
結果
移植した２０週間後に、対照γＲＶによって改変された細胞を移植したマウスの血液では、それぞれ５．５％および３．１％のｅＧＦＰ陽性のＲＢＣおよびＷＢＣが検出された（図２Ａ）。
γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−８で形質導入された細胞を受けているマウスではそれらのｅＧＦＰ陽性ＲＢＣ集団（２．７％）およびｅＧＦＰ陽性ＷＢＣ集団（４．１％）に対照マウスと比較して有意な増幅は示されなかった。リンパ球系区画および骨髄性系区画の別々の分析でも、特定の造血細胞型の増幅は示されなかった（図９および表２）。
表２
対照群（ＲＶ）と他の群のマウスの、白血球（ＷＢＣ）、リンパ系細胞（ＬＹＭＰＨＯ）、骨髄細胞（ＧＭ）および赤血球（ＲＢＣ）におけるｅＧＦＰ陽性細胞の平均、標準偏差（ＳＤ）、標準誤差（ＳＥ）、中央値、２５パーセンタイル、７５パーセンタイルおよび百分率の平均または中央値の差異の有意性（ｐ値）。
γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１で形質導入された細胞を受けているマウスでは、ｅＧＦＰ陽性のＲＢＣおよびＷＢＣがそれぞれ３９．２％および３０．８％増幅した。これにより、改変されたＲＢＣおよびＷＢＣの割合が対照群と比較してそれぞれ７倍（Ｐ＝０．０２１）および１０倍（Ｐ＝０．００１）増加したことが示された。γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−２を受けているマウスでは、改変されたＲＢＣおよびＷＢＣの平均増幅レベルの割合はそれぞれ８倍および６倍であった。
したがって、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１マウスおよびγＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−２マウスにおけるｅＧＦＰ陽性細胞の平均百分率は、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−８で形質導入された群において観察された平均値とは有意に異なった。
骨髄細胞を検査して、ｅＧＦＰ陽性細胞の割合がＷＢＣよりもＲＢＣにおいて高かったことが、レシピエントの放射線抵抗性メモリーリンパ系細胞が持続されたことに起因するかどうかを決定した。ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率の中央値には、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−２マウス（Ｐ＝０．００９）およびγＲＶ／ＥｐｏＲＹ１動物において、リンパ球よりも顆粒球／単球で値が大きくなる傾向が示された。ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率は赤血球系区画と骨髄系区画の間では統計的に異ならず（表３）、これは、ｔＥｐｏＲが赤血球系細胞において骨髄細胞よりも優先的な効果を発揮しなかったことを示している。
表３
ＲＢＣと、白血球（ＷＢＣ）、リンパ系細胞（ＬＹＭＰＨＯ）および骨髄細胞（ＧＭ）におけるＧＦＰ陽性細胞の百分率の平均または中央値の統計的差異の有意性（ｐ値）。
ＥｐｏＲが切断型受容体よりも低いレベルで発現したかどうかを決定するために、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで成長させた、移植後の形質導入されたＨＣのｅＧＦＰ平均蛍光強度（ＭＦＩ）を比較した。移植前の形質導入された細胞のＭＦＩは全てのベクターで同等であった（図１０）。形質導入の１０日後にｅＧＦＰ発現について選別したＣＤ４５＋細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって数量化したＥｐｏＲＹ１およびＥｐｏＲＹ１−８のｍＲＮＡは同様であった。しかし、マウスでは、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１とγＲＶの間（Ｐ＝０．０３１）、およびγＲＶ／ＥｐｏＲＹ１とγＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−８の間（Ｐ＝０．０１７）で、骨髄系区画においてＭＦＩに統計的有意差があった。顆粒球におけるＭＦＩが最大であったマウス４匹では、改変された骨髄細胞の百分率が最大であった。γＲＶマウスとγＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−８マウスの間で、任意の細胞型において差異は観察されなかった。
まとめると、これらの結果により、野生型ＥｐｏＲが選択されなかったことが、ＥｐｏＲの発現のレベルがより低いことに起因するのではないこと、しかし、最大レベルのＥｐｏＲ−Ｙ１を発現している骨髄細胞が、より低レベルの切断型ＥｐｏＲを発現している細胞よりも優先されたことが示された。血球数（表４）は群間で統計的に異ならなかった。しかし、血漿中Ｅｐｏレベルは、γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１を移植したマウスおよびγＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−２を移植したマウスでは他の２つの群の２．５分の１であった（Ｐ＝０．００５）（図２Ｂ）。
表４
２０週前に移植したマウスの４つの群におけるヘマトクリット値（Ｈｃ）、赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロビン濃度（Ｈｂ）、白血球数（ＷＢＣ）および特異的な細胞サブセット、平均血球体積（ＭＣＶ）、平均血球ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ）、平均血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板数および血漿中エリスロポエチンレベル（Ｅｐｏ）の平均、標準偏差（ＳＤ）、標準誤差（ＳＥ）、範囲、最大値、最小値、中央値、２５パーセンタイル、７５パーセンタイル
（実施例３）
キメラＨＳ４０／アンキリンプロモーターは、β−グロビン／ＬＣＲレンチウイルスベクター内で赤血球特異的である
背景
細胞の増大をＲＢＣ区画に制限するために、ｔＥｐｏＲを赤血球系細胞特異的に発現させるようにレンチウイルスベクターを設計した。赤血球特異的β−グロビンプロモーター／ＬＣＲエンハンサーに駆動されるヒトβ−グロビン遺伝子およびｔＥｐｏＲ ｃＤＮＡ発現カセットの両方を含有する緻密なレンチウイルスのプロウイルス内の転写干渉の可能性のある影響を評価した。ｔＥｐｏＲを発現させるために、ヒトβ−グロビンＨＳ４０エンハンサーをＨＡと称されるアンキリン−１プロモーターに連結した（Ｍｏｒｅａｕ−Ｇａｕｄｒｙら、Ｂｌｏｏｄ、２００１年；９８巻（９号）：２６６４〜２６７２頁）。
赤血球特異性のレベルを評価するために、まずｅＧＦＰをグロビン／ＬＣＲレンチウイルスベクターＬＧ（図１Ｂ）に導入し、ＬＧ／ＨＡ−ｅＧＦＰベクターを得た。レンチウイルスベクターＨＰＶ５７０を、ｅＧＦＰを遍在的に発現させる対照ベクターとして使用した。正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＣＤ４５．２マウス由来のＢＭ細胞にこれらのベクターを用いて形質導入し、コンジェニックＣ５７ＢＬ／６ＪＣＤ４５．１マウスに注射した。
結果
ＬＧベクターとの関連で、ＨＡプロモーターは、β−グロビン／ＬＣＲカセットから干渉されることなく高程度の赤血球特異性を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて成長させた細胞を分析することにより、ＬＧ／ＨＡ−ｅＧＦＰおよびＨＰＶ５７０について、それぞれ細胞当たり０．１４個および１．５０個のプロウイルスのコピーが明らかになった。移植の５カ月後の循環ＷＢＣにおけるドナーキメラ現象は同様であった（およそ９０％のＣＤ４５．２陽性ＷＢＣ）。同時点で、ｅＧＦＰ陽性のＷＢＣ末梢サブセット（骨髄系、Ｔリンパ球系、およびＢリンパ球系）ならびにｅＧＦＰ陽性ＲＢＣの百分率をフローサイトメトリーによって決定した。移植の６カ月後に、ＢＭ由来の細胞および胸腺由来の細胞を、同じ抗体ならびに赤血球系列に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって分析した。ｅＧＦＰ陽性の骨髄系細胞、リンパ球系細胞、および赤血球系細胞の百分率は、ＨＰＶ５７０で改変された細胞の移植を受けたマウスのものと同等であったが、ｅＧＦＰ陽性の赤芽球およびＲＢＣの百分率は、ＬＧ／ＨＡ−ｅＧＦＰで改変された細胞の移植を受けたマウスにおける骨髄系ｅＧＦＰ細胞およびリンパ球系ｅＧＦＰ細胞の百分率をはるかに超えた（図３）。
ｅＧＦＰをｔＥｐｏＲで置き換えると赤血球特異的発現が維持された。改変された赤血球系細胞および非赤血球系細胞におけるｔＥｐｏＲの発現を比較した。非βサラセミアマウス由来のＢＭ細胞を汎白血球ＣＤ４５抗原の存在または非存在に基づいて精製し、次いで、ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１ベクターを用いて形質導入した。２日後にＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ｑＰＣＲによって分析した。形質導入された赤血球系ＣＤ４５−（＞９９％Ｔｅｒ１１９＋）細胞におけるｔＥｐｏＲＹ１の発現は形質導入されたＣＤ４５＋（＜１％Ｔｅｒ１１９＋）細胞における発現よりも１００倍超大きかった（ＧＡＰＤＨおよびリボソーム１８ｓ ＲＮＡに対して正規化した場合、それぞれ１４７倍および１０９倍）。この方法では形質導入されていないＣＤ４５＋細胞においても形質導入されていないＣＤ４５−細胞においても内因性のＥｐｏＲ ｍＲＮＡは検出不可能であり、これは、非赤血球系細胞に対して赤血球系細胞において観察されたＥｐｏＲ ｍＲＮＡの１００倍の増加が、トランスジェニックＥｐｏＲに由来し、アンキリンプロモーターの特異性に起因することを示している。
（実施例４）
移植を受けたβサラセミアマウスにおける赤血球特異的ｔＥｐｏＲとβ−グロビンの共発現および赤血球系細胞の選択的な増大
背景
γＲＶ／ＥｐｏＲＹ１ベクターとγＲＶ／ＥｐｏＲＹ１−２ベクターの実質的に同様の効果を考慮して（図１）、ＥｐｏＲＹ１をその後のＬＧベクターを用いたマウス移植実験用にした。
ＬＧベクターまたはＬＧ／ＨＡ−Ｙ１ベクターのいずれかを用いて形質導入された同系のβサラセミアの骨髄細胞を移植したβサラセミアマウスにおけるＲＢＣおよびＷＢＣの百分率を比較した。血液細胞数、ＲＢＣを発現しているヒトＨｂの百分率、ヒトβ−グロビン発現のレベル、ドナーキメラ現象の程度、およびベクターのコピー数を移植の４０週間後または３５週間後に決定した。
結果
ＲＢＣの百分率とＷＢＣの百分率の間の関係が示されている（図４Ａ〜Ｂ）。値を、改変されたＲＢＣの理論的な増大（ＦＥ）が改変されたＷＢＣの増大の１倍、１０倍、５０倍、または２００倍である４つの理論曲線（実施例１の「改変された赤血球系細胞の増幅率」のセクションに記載されている方程式２および方程式３から導かれた）と比較した。ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウスの大部分について、ＲＢＣ＋はＷＢＣ＋と比較して５０倍および２００倍に増大したが、ＬＧマウスのＲＢＣ＋の増大はＷＢＣ＋のたった１倍から１０倍の間であった。ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウスおよびＬＧマウスについての赤血球の増幅率ＦＥの中央値はそれぞれ９７．２（範囲、８．２〜７２９．７）および５．０（範囲、０．５〜１４．４）であった（図４Ｃ）。
ｔＥｐｏＲで改変された赤血球系細胞についての明らかな利点は、赤血球系細胞に特異的であり、改変されたＷＢＣに不都合が付与されないことと決定された。さらに、ｔＥｐｏＲで改変されたＷＢＣは改変されていないＷＢＣ細胞に対する利点を有さないことが決定された。ドナーＷＢＣの中でのＷＢＣ＋の画分を決定し、移植前（形質導入の１０日後、組換えヒトＥｐｏを加えず；図４Ｄ）の形質導入されたバルクＨＣの画分と比較した。画分の中央値の比は同等であり（Ｐ＝０．２１）、１に近く、これは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、改変されたＷＢＣには改変されていないドナーＷＢＣ細胞に対する不都合も利益もなかったことを示している。Ｅｐｏを用いて成長させたＨＣにおけるコピー数も測定し、これはＥｐｏを用いずに成長させた細胞において決定されたものと同様であり、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｅｐｏにより、形質導入された細胞に増殖的利点が付与されなかったことを示している。
（実施例５）
βサラセミアの表現型の調整は、治療用ヒトβ−グロビンを発現する循環ＲＢＣの割合と相関する
背景
ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１ベクターにより、β−サラセミア症の表現型が調整される。β−サラセミア症の表現型を、ＬＧマウスおよびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウス（すなわち、ＬＧで形質導入された骨髄細胞またはＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１で形質導入された骨髄細胞を投与したマウス）の両方における循環ＲＢＣの所与の割合について評価した。ＬＧマウスおよびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウスの血液のパラメータ、Ｈｂ濃度、ならびにＲＢＣおよび網状赤血球の数をＲＢＣに応じて記録した。ＲＢＣ＋の百分率が＞４０％であれば、ＬＧベクターを用いたβ−サラセミアの表現型の調整が明らかになることが以前示されている。
結果
３匹を除いた全てのマウスにおいて、閾値の４０％超のＲＢＣ＋を有するＬＧマウスから得られたデータに線形回帰を適用した。ＬＧで形質導入された骨髄細胞を受けているマウス群（図６Ａ）内で、ＲＢＣ＋のレベルと、（１）総Ｈｂの濃度、（２）ヒトβ−グロビンＡＴ８７Ｑの濃度、（３）ＲＢＣ数、（４）網状赤血球数、および（５）脾臓の重量の正規化の間で有意な相関（図５）が見いだされた。
閾値の４０％超のＲＢＣ＋を有するＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウスから得られたデータに線形回帰を適用した。
移植を受けているＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウスにおいて測定された血液の値の大部分が、測定されたパラメータ全てに対応する当てはめた回帰直線について９５％信頼度バンド内に入った。
次いで、ＬＧ移植マウス５匹、ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１移植マウス５匹、およびモック移植マウス３匹の脾臓内の赤血球系細胞の百分率を測定した。
マウスの両群において、脾臓サイズの減少は脾臓の赤血球系細胞の百分率の減少と関連し、これは、赤血球形成異常の減少および最終赤血球系細胞分化の効率の改善と一致した（図５Ｂ）。まとめると、これらのデータにより、βサラセミアの表現型の調整が、治療用ヒトβ−グロビンをＬＧマウス群およびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウス群のどちらでも同様の割合で発現した循環ＲＢＣの割合と相関し、ｔＥｐｏＲの発現によってもたらされる付属的な利益が伴うことが示された。
（実施例６）
ＲＢＣの増大は、最小のレンチウイルス移入および二次的な移植後に系列に制限された治療的なものになる
背景
治療用β−グロビンＡＴ８７ＱとｔＥｐｏＲの共発現により、β−サラセミアにおいてＥｐｏの血漿中濃度の上昇との関連でＲＢＣの増大が誘導され、その結果、ＬＧマウスに対してＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウスにおいて低い割合のＷＢＣ＋で表現型の調整の程度が増加する。＜２０％のＷＢＣ＋で、実質的に全てのＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウスが調整された表現型を有した（図６Ａ）。８．３％のＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１ ＷＢＣ＋で改変された赤血球前駆細胞から８１．６％のＲＢＣが生じ、一方、１０．４％のＬＧ
ＷＢＣ＋により２７％以下のＲＢＣ＋が生じた（図６Ｂ）。
したがって、平均のＷＢＣ＋の割合が８．３％で、ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウスの平均ヘマトクリット値（４０．１％）およびヘモグロビン濃度（１２．７ｇ／ｄＬ）が同等の百分率（１０．４％）のＷＢＣ＋を有するＬＧマウスにおける値をはるかに超えた（図６Ｂ）。ＬＧマウスにおいて同様の調整が得られた（平均ヘマトクリット値、４０．２％；ヘモグロビン濃度、１２．５ｇ／ｄＬ）が、より大きな割合のＷＢＣ＋が必要であった（４２．６％）。ＷＢＣ＋の割合が最低であったＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１群のマウス４匹（３．３％±１．４％）の平均ヒトβ−グロビンＡＴ８７Ｑレベルは７８．４％±２０．１％のＲＢＣに分布して３３．１％±５．６％であったが、一方、改変されたＷＢＣの割合が最低であったＬＧマウス４匹（０．９％、６．８％、１１．２％、および１３．３％）の中では、２匹のマウスのみが、検出可能なヒトβ−グロビンＡＴ８７Ｑを発現した最も高い割合のＷＢＣ＋を有し（２３．８％および１２．２％）、改変されたＲＢＣの百分率はそれぞれ１．０％、６．０％、４２．３％、および２１．３％であった。
再増殖性ＨＳＣが枯渇したかどうかを評価するため、および長期試験において改変されたＨＣの割合をさらに減少させるために、一次移植の４０週間後に一次移植したマウスＨＣを用いて二次的なＢＭ移植を実施した。致死的に放射線照射した雌のマウス１１匹に、モック移植を受けている一次マウス３匹、ＬＧの一次レシピエント４匹、およびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１の一次雌マウス４匹由来の骨髄細胞５００万個を受けさせた。ＬＧマウスおよびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウスのＨＣを、モック形質導入細胞を移植したマウスのうちの１匹由来の細胞で希釈して、移植を受けた二次動物におけるＷＢＣ＋の割合を減少させた（表５）。
結果
二次移植後にＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１を用いて改変された赤血球系細胞の増幅がＬＧベクターと比較して増加したことを示すデータが表５に要約されている。データは、二次移植の１０週間後の、ＬＧで改変された細胞を二次移植されたマウス（群２）およびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１で改変された細胞を二次移植されたマウス（群３）それぞれについて示されている。移植の１０週間後の増幅率ＦＥは、ＬＧマウスおよびＬＧ／ＨＡ−Ｙ１マウスについて、それぞれ０〜１２および４８〜２３７４にわたった。ＬＧ群およびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１群では、実際に、ＷＢＣの平均理論的百分率はＷＢＣの平均実測百分率と同様であった。
表５
希釈は、モック形質導入細胞を移植したマウス由来の細胞を用いた希釈率を示し、ＦＥは改変された白血球に対する改変された赤血球系細胞の増幅率であり、一次は、一次ドナーのＢＭにおける改変された有核細胞の百分率であり、ＲＢＣは、ヒトヘモグロビンを含有するＲＢＣの百分率であり、ＷＢＣ（ｔｈｅｏ）は、ドナー細胞を用いた１００％の再構成を仮定する改変されたＷＢＣの理論的百分率であり；ＷＢＣは、ドナー細胞を用いた１００％の再構成を仮定し、コピー数から推定される二次移植における改変されたＷＢＣの百分率である。
ＷＢＣにおけるベクターのコピー数は、ＬＧマウスとＬＧ／ＨＡ−Ｙ１マウスの間で統計的に異ならなかった（表６）。しかし、ヒトβ−グロビンＡＴ８７Ｑを発現しているＲＢＣの平均百分率およびβ−グロビンＡＴ８７Ｑの血中濃度は、ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１ベクターの存在下ではＬＧベクター（１７．８％の赤血球中に５．９％のヒトβ−グロビンＡＴ８７Ｑが分布）よりも大きかった（７５．９％の赤血球中に２６．１％のヒトβ−グロビンＡＴ８７Ｑが分布）。算出により、差異は、ハイブリッドヘモグロビン（ヒトβ−グロビンＡＴ８７Ｑとマウスβ−グロビンで構成される）における血球内ＲＢＣ含有量はＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウス群およびＬＧマウス群のどちらとも同様であったので（それぞれ４．８ｐｇおよび４．６ｐｇ）、ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１ベクターの場合では、ＲＢＣ＋集団が増大したことに起因することが示された。驚いたことに、貧血および他のパラメータの高度に効率的な調整がＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１を移植したβサラセミアマウスにおいて観察されたが、ＬＧベクターを移植したβサラセミアマウスでは観察されなかった（表６）。さらに、二次移植実験により、広範囲にわたるＨＣ分裂後でさえも赤血球系列に制限されたままの細胞の増大がもたらされたことも同じく予想外であった。
表６
モック改変細胞（１）、ＬＧで改変された細胞（２）、およびＬＧ／ＨＡ−Ｙ１で改変された細胞（３）を二次移植したレシピエントの群における、二次移植の１０週間後の平均の血液学的パラメータおよびＳＤである。コピーは、細胞当たりの末梢血コピー数を示し、ＲＢＣはヒトヘモグロビンを含有するＲＢＣ（％）であり、ｈｕ−ｇｌｏはヒトβ−グロビン（％）であり、Ｈｂはヘモグロビン（ｇ／ｄＬ）であり、Ｈｃはヘマトクリット値（％）であり、ＲＴＣは網状赤血球（％）であり、ＲＢＣは赤血球（１０１２／Ｌ）であり、ＭＣＶは平均血球体積（ｆＬ）であり、ＭＣＨは平均血球ヘモグロビン（ｐｇ）であり、ＭＣｈｕＨは改変されたＲＢＣ中の平均血球ヒトヘモグロビン（ｐｇ）であり、；ｓｏｌ Ｈｂは可溶性ヘモグロビン（ｇ／ｄＬ）であり、ＷＢＣは白血球（１０９／Ｌ）である。多重比較およびペアワイズ比較を、それぞれ一元配置分散分析およびホルムシダック法を用いることによって行う。全体的な有意水準＜０．０５（Ｐ値）が得られる場合、統計的有意性は、群１と群２の間（Ｓ１−２）、群１と群３の間（Ｓ１−３）、および群２と群３の間（Ｓ２−３）で、あり（Ｙ）またはなし（Ｎ）で示される。
（実施例７）
赤血球系細胞の増大は自己制御される
背景
ＬＧベクターを用いて形質導入された細胞およびＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１ベクターを用いて形質導入された細胞の移植を受けたβサラセミアマウスの末梢血およびＢＭにおいて、種々の造血系列を、系列特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
結果
ＣＤ４５．２陽性細胞の中でのＴリンパ球系、Ｂリンパ球系、および骨髄細胞の平均百分率は、移植を受けたＬＧマウスとＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１マウスの間で統計的に異ならなかった（図７Ａ）。血漿中Ｅｐｏ濃度およびＲＢＣ＋の数はｔＥｐｏＲの存在または非存在とは関係なく逆相関し（図７Ｂ）、これは、ｔＥｐｏＲの存在により、血漿中Ｅｐｏによる改変された赤血球系細胞の産生の制御が損なわれなかったことを示す。
ＲＢＣ＋の百分率とＷＢＣ数または血小板数の間の相関も観察されず（示されていない）、マウスの２つの群の間のＷＢＣ数（Ｐ＝０．１２５）と血小板数（Ｐ＝０．２５４）の有意差も観察されなかった（図７Ｃ）。マウスの脾臓、肝臓、肺、腎臓、心臓、ＢＭ、および胸腺の組織切片を移植の１０カ月後に分析した。新生細胞浸潤は観察されなかった。
ベクター組み込みの細胞増殖に対する可能性のある影響を調査するために、５カ月前にＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１ベクターによって形質導入された細胞の移植を受けたβサラセミアマウス４匹由来の細胞に対して挿入部位分析を実施した。細胞増殖に対する圧力を最大にし、それにより、細胞の増殖または生存を促進する遺伝子の挿入活性化の影響が検出される機会を最大にするために低用量の放射線照射（２００ラド）を用いて前処置した後に比較的少数のＨＳＣの移植をマウスに行った。移植の５カ月後に、各マウスのリンパ性骨髄（ＣＤ４５＋）細胞および赤血球系（ＣＤ４５−）細胞を選別し、ゲノムＤＮＡを抽出し、組み込み部位配列を決定した。
組み込み部位を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭｕ媒介性転位を用いて分析した。精製されたＭｕトランスポザーゼタンパク質の標的配列特異性は最小であるので、制限酵素を用いてゲノムＤＮＡを切断することを伴う標準の方法よりも組み込み部位の回収の偏りははるかに少ない。さらなる有利な点は、各組み込み部位に関連づけられる独立したＭｕ転位事象の数により、元の試料中の細胞クローンの割合の推定値がもたらされることである。
４５４／Ｒｏｃｈｅパイロシークエンスを用いて合計２５１０の配列読み取りを生成した。最初に接種した少数の細胞に対応する４７の独特の組み込み部位を含め、合計１０７０の独立したＭｕ転位事象から部位を回収した。リンパ性骨髄細胞試料および赤血球系細胞試料における組み込み部位分布の比較により、マウスの中で系列間の種々の程度の共通性が示され（図１１）、これは、おそらくサンプリングが少数であることの確率論的影響に起因する。
挿入事象の分析により、ＬＧ／Ｈａ−ＥｐｏＲＹ１ベクターの使用が安全な治療モダリティであること、および改変された赤血球系細胞の成長が、細胞の成長または増殖に促進される特定の細胞クローンの増生に関与する遺伝子の近くへの組み込みに起因するものではないことが示された。クローン増大をもたらすＥｐｏＲシグナル伝達と癌原遺伝子の挿入活性化の間の相互作用は観察されなかった。細胞の成長に関連する単一の遺伝子の近くへの組み込み部位の濃縮の例はなかった。さらに、癌に関連した遺伝子の一覧（ａｌｌＯｎｃｏデータベース）に対する最も豊富な細胞クローンの分布（組み込み部位によって印付けられる）を分析し、クローンの存在量と癌に関連した遺伝子に対する近傍性との間に関連は見いだされなかった（図８Ａ〜Ｂ）。
移植前および移植の９カ月後にβサラセミアマウスにおいて、ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１細胞における癌遺伝子から５０ｋｂ以内の組み込み部位の割合と、ＬＧベクターによって改変されたマウスＨＣにおいて同定された挿入部位（ＩＳ）の割合を以前の試験に記載の通り比較した（Ｒｏｎｅｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２０１１年３月８日にオンライン公開）。フィッシャーの直接確率検定によると、癌に関連した遺伝子に対する近傍性について設定間で統計的有意差は見いだされなかった（図８Ｃ）。
さらに、ＬＧ／ＨＡ−ＥｐｏＲＹ１で処理した細胞由来の部位を、ＬＧで形質導入された細胞由来の部位と比較したところ、他の種類のゲノムの特徴と比較して組み込みの偏りを検出することはできなかった。２つのベクター間で挿入部位に強力な差異を示したゲノムのアノテーションの形態はなかった。
したがって、これらのデータでは、細胞の成長または増殖に関与する遺伝子の近くへの組み込みにより、特定の細胞クローンの増生が促進されるという観念は支持されない。
上記の種々の実施形態を組み合わせて別の実施形態をもたらすことができる。本明細書において参照され、かつ／または本出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。必要であれば、実施形態の態様を、種々の特許、出願および刊行物の概念を用いるように改変して、さらに別の実施形態をもたらすことができる。
これらおよび他の変化は、上記の発明の詳細な説明を踏まえて実施形態に行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、可能性のある実施形態の全てをそのような特許請求の範囲に権利が与えられる等価物の全範囲と一緒に包含するものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。

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  1. 明細書に記載された発明。
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