CN104711293A - 一种重组慢病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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万晓春
阮庆国
王绍文
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Abstract

本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体是在pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处插入了萤火虫荧光素酶编码基因序列。本发明还涉及含上述载体的宿主细胞、上述载体的构建方法及其在分析哺乳动物细胞启动子和/或增强子的功能或调控作用中的用途。本发明为寻找、分析、应用调控目标蛋白表达量或表达水平的启动子和/或增强子提供了一种快速、高效、直观、简单易行的方法。

Description

一种重组慢病毒载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组慢病毒载体及其制备方法和应用。
背景技术
目前常用的基于质粒的转录报告载体由于其染色体外游离的特性，会干扰研究的报告网络。而基于慢病毒的报告载体可以整合到细胞染色体中，从而为研究转录激活以及表观遗传学效应提供较为精确的模型。
Clontech公司的pLVX-DD-ZsGreen1慢病毒报告载体是一种无启动子报告载体，其报告基因为绿色荧光蛋白DD-ZsGreen1，可有效转导正在分裂和非分裂的哺乳动物细胞，用于检测不同启动子的转录活性。然而该载体用于筛选稳定转染细胞株的标记为嘌呤霉素（puromycin），它对细胞的毒性较大，容易造成细胞死亡。
Clontech公司的pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体（Catalog No.632187）含有组成型活性人类巨细胞病毒立即早期启动子（PCMV IE），在该启动子上游多克隆位点可以插入感兴趣的蛋白编码序列，这样利用同一启动子表达一个双顺反子mRNA转录产物，从而同时产生两种蛋白质。因此，该表达载体不能用于研究调控元件如启动子和/或增强子的转录活性等功能。
因此，有必要提供一种对细胞毒性小、能用于分析启动子和/或增强子的功能或调控作用的慢病毒报告载体，尤其有必要提供一种对细胞毒性小、能用于分析启动子和/或增强子转录活性的慢病毒报告载体。
发明内容
为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体是在pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处内插入了萤火虫荧光素酶编码基因序列。该重组慢病毒载体含有ZsGreen绿色荧光蛋白编码基因和萤火虫荧光素酶编码基因双荧光标记，该重组慢病毒载体在分析启动子和/或增强子的功能或调控作用的应用中对细胞的毒性较小。本发明提供的重组慢病毒载体尤其适用于分析启动子和/或增强子的转录活性。
本发明第二方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第一方面所述的重组慢病毒载体。本发明第三方面提供了一种重组载体的制备方法。本发明第五方面提供了一种重组慢病毒载体的应用。
第一方面，本发明提供了一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体是在pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处内插入了萤火虫荧光素酶编码基因序列。
萤火虫荧光素酶能够催化不同底物氧化发光，荧光素酶浓度在10-16mol/L到10-8mol/L的范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比，其检测灵敏度高，半衰期短，所以，调控萤火虫荧光素酶的启动子的活性改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积累，检测荧光信号强度的变化即可反映启动子和/或增强子的活性的变化。
本发明在pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处内插入了萤火虫荧光素酶编码基因序列，构建了专门用于分析启动子和/或增强子的功能或调控作用的重组慢病毒载体，该载体具有ZsGreen1和萤火虫荧光素酶双荧光标记，适用于分析启动子和/或增强子的功能或调控作用，尤其适用于分析启动子和/或增强子的转录活性。
本发明采用的pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体含有ZsGreen绿色荧光蛋白的突变体，该ZsGreen绿色荧光蛋白的突变体可作为用于细胞株稳定转染的筛选标记，对细胞毒性小。克服了pLVX-DD-ZsGreen1采用嘌呤霉素（puromycin）作为筛选标记导致的对细胞的毒性较大，容易造成细胞死亡的缺点。
IRES序列为核糖体提供不依赖帽子结构的核糖体结合位点，翻译时，不经过mRNA的5’端扫描，也不需要宿主细胞的某些关键因子的参与，具有IRES序列的病毒可逃脱宿主通过这些关键因子的下调或失活来抑制病毒基因的表达。因此，pLVX-IRES-ZsGreen1含有脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES），该IRES位于MCS与ZsGreen1之间，帮助不依赖于帽子的ZsGreen1从IRES/ZsGreen1结合处的一个内部起始位点进行翻译，能进一步提高ZsGreen1报告蛋白的表达效率。
优选地，所述萤火虫荧光素酶编码基因序列是luc或Renilla荧光素酶的编码基因序列。
优选地，所述萤火虫荧光素酶编码基因序列是核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子。
优选地，所述pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处内还插入有待分析的启动子和/或调控目标蛋白的调控序列，所述待分析的启动子和/或调控目标蛋白的调控序列插入在所述萤火虫荧光素酶编码基因序列的上游。
优选地，所述萤火虫荧光素酶编码基因序列插入在pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的ClaI酶切位点。
本发明采用pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体为基础载体构建含萤火虫荧光素酶编码基因的重组慢病毒载体，该重组慢病毒载体含有pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体和含萤火虫荧光素酶编码基因的双重优势。除上述含萤火虫荧光素酶编码基因带来的优势外，pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体带来的优势如下：
1、含有产生非复制性慢病毒的所有的病毒加工元件，也含有改善病毒滴度、转基因表达和整个载体功能的元件。如：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）启动RNA的加工并增强病毒RNA的出核运输，使得从细胞中包装的病毒滴度增加；而且，载体含有Rev应答元件（RRE），通过增强非剪接病毒RNA的出核运输来进一步增加病毒滴度；另外，载体还含有一个关键多嘌呤片段/关键终止序列元件（cPPT/CTS），在靶细胞感染过程中，这个元件可以产生一种关键DNA震动结构，增加病毒基因组的入核转运，使得载体整合以及转导效率增加。
2、载体含有pUC复制起始位点和E.coli氨苄青霉素抗性基因（Ampr）可用于细菌筛选标记。
第二方面，本发明提供了一种宿主细胞，包含如第一方面所述的重组慢病毒载体。
优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
优选地，所述宿主细胞为Jurkat细胞。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的重组慢病毒载体的制备方法，包括如下步骤：
（1）、提供或制备萤火虫荧光素酶编码基因的上游引物和下游引物，及萤火虫荧光素酶编码基因的模板，然后采用PCR扩增萤火虫荧光素酶编码基因；
（2）、取pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体，将步骤（1）扩增得到的萤火虫荧光素酶编码基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处，得到所述重组慢病毒载体。
优选地，所述步骤（1）中，所述上游引物和下游引物的碱基序列分别如SEQID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述步骤（1）中，所述萤火虫荧光素酶编码基因的模板为含有萤火虫荧光素酶编码基因序列的重组载体pGL4.10。
优选地，所述步骤（2）中，为采用In-fusion重组的方法将步骤（1）扩增得到的萤火虫荧光素酶编码基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处。
优选地，所述步骤（2）中，将步骤（1）扩增得到的萤火虫荧光素酶编码基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的ClaI酶切位点。
具体地，所述如SEQ ID NO:2所示的上游引物具体为：
5’-CTCCCAAGCTTATCGATGGCCTAACTGGCCGGTACCTG-3’
所述如SEQ ID NO:3所示的下游引物具体为：
5’-AGATCCAGTTTATCGATTACCACATTTGTAGAGGTTTTAC-3’
该上游引物和下游引物中的非下划线部分分别与萤火虫荧光素酶编码基因的两端特异性互补，该上游引物和下游引物中的下划线部分分别与pLVX-IRES-ZsGreen1病毒表达载体ClaI酶切位点处的序列特异性互补；采用该对引物进行PCR得到的萤火虫荧光素酶编码基因产物可采用In-Fusion重组方法克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1的ClaI酶切位点中。
优选地，采用Takara公司提供的In-Fusion克隆试剂盒将PCR得到的萤火虫荧光素酶编码基因克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1的ClaI酶切位点中。
第五方面，本发明提供了如第一方面所述的重组慢病毒载体在分析启动子和/或增强子的功能或调控作用中的应用。
优选地，如第一方面所述的重组慢病毒载体在分析启动子的功能或调控作用中的应用。
优选地，如第一方面所述的重组慢病毒载体在分析增强子的功能或调控作用中的应用。
优选地，如第一方面所述的重组慢病毒载体在分析启动子和增强子的功能或调控作用中的应用。
优选地，所述启动子和/或增强子的功能或调控作用为启动子和/或增强子的转录活性。
此外，本发明提供的重组慢病毒载体以及宿主细胞可用于研究包括原代细胞、分裂以及非分裂细胞、干细胞、末端分化细胞和神经元细胞等的多种细胞类型中启动子和/或增强子对报告基因的转录调控作用。
本发明提供了的重组慢病毒载体及其制备方法和应用具有如下有益效果：
（1）本发明提供的重组慢病毒载体具有ZsGreen1和萤火虫荧光素酶双荧光标记，适用于分析启动子和/或增强子的功能或调控作用，尤其适用于分析启动子和/或增强子的转录活性；
（2）本发明提供的重组慢病毒载体对细胞的毒性小；
（3）本发明提供的重组慢病毒载体的制备方法简便，易于工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例扩增的萤火虫荧光素酶编码基因的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例提供的样品酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明实施例制备的重组质粒经PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为本发明实施例制得的重组载体的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold SpringHarbor）。所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。
本发明实施例所使用的pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体购自Clontech，含pGL4.10[luc2]质粒菌种购自promega，所使用的DH5α为市售商品，所使用的试剂均为市售商品。
本发明实施例提供了一种重组慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
（1）萤火虫荧光素酶基因的克隆
a）提供上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的碱基序列如SEQ IDNO:2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；
b）按照TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0（宝生物工程（大连）有限公司）试剂盒说明书中的步骤提取pGL4.10[luc2]质粒，用Nanodrop2000c测定其浓度为463ng/μl，将该pGL4.10[luc2]质粒作为DNA模板，采用PCR扩增luc基因，配置扩增体系如下，体系中的引物采用步骤（1）所述的上游引物和下游引物：
PCR反应体系
PCR扩增程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后,72℃延伸10min。取5μL反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，图1为PCR扩增萤火虫荧光素酶编码基因的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为PCR产物，泳道2为DNA Marker（D2000plus，Genstar）由图2可知，泳道1在2000bp左右具有明显条带，与目的片段大小（2008bp）一致，表明本发明实施例成功扩增出了萤火虫荧光素酶编码基因。鉴定正确后，胶回收PCR产物。
（2）含luc基因的重组慢病毒载体pZsGreen1-Luc的构建
1.pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的酶切；
按照TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0（宝生物工程（大连）有限公司）试剂盒说明书中的步骤提取pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体，用Nanodrop2000c测定其浓度为385ng/μl，再采用ClaI酶切进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，用Nanodrop2000c测定其浓度，其中，所述ClaI酶切进行酶切的酶切体系如下：
2.luc基因和pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的连接；
取50ng步骤1酶切后回收的pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体，与25ng步骤（1）胶回收的PCR产物采用HD Cloning Kit（Takara）说明书中的步骤进行重组连接，得到连接产物。
3.酶切以及测序鉴定
将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含Amp的LB固体平板培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒并XhoI单酶切鉴定，此外，本发明实施例还提供了pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的XhoI单酶切对照组，分别配置酶切体系如下：
37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，酶切后的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，在图2中，泳道M为DNA分子量marker（1Kb Plus DNA Ladder，invitrogen），泳道1为pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体进行XhoI单酶切结果，泳道2为构建的重组慢病毒载体pZsGreen1-Luc进行XhoI单酶切结果，其中，泳道2的线性化载体（约10200bp）明显比泳道1线性化载体（约8200bp）大，说明萤火虫荧光素酶编码基因已成功插入pLVX-IRES-ZsGreen1中。
本实施例还采用PCR扩增重组慢病毒载体pZsGreen1-Luc进行鉴定，结果如图3所示，图3为PCR鉴定萤火虫荧光素酶编码基因的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为DNA Marker（D2000plus，Genstar）泳道2为PCR产物，由图3可知，泳道2在2000bp左右具有明显条带，与目的片段大小（2008bp）一致，进一步表明萤火虫荧光素酶编码基因成功构建到pLVX-IRES-ZsGreen1中。图4为本发明实施例制得的重组载体pZsGreen1-Luc的质粒图谱。

Claims (10)

1.一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体是在pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处插入了萤火虫荧光素酶编码基因序列。
2.如权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述萤火虫荧光素酶编码基因序列是核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子。
3.如权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处还插入有待分析的启动子和/或调控目标蛋白的调控序列，所述待分析的启动子和/或调控目标蛋白的调控序列插入在所述萤火虫荧光素酶编码基因序列的上游。
4.如权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述萤火虫荧光素酶编码基因序列插入在pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的ClaI酶切位点。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求1所述的重组慢病毒载体。
6.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为Jurkat细胞。
7.一种如权利要求1所述的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）、提供或制备萤火虫荧光素酶编码基因的上游引物和下游引物，及萤火虫荧光素酶编码基因的模板，然后采用PCR扩增萤火虫荧光素酶编码基因；
（2）、取pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体，将步骤（1）扩增得到的萤火虫荧光素酶编码基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处，得到所述重组慢病毒载体。
8.如权利要求1所述的一种重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，
所述步骤（1）中，所述上游引物和下游引物的碱基序列分别如SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示；所述萤火虫荧光素酶编码基因的模板为含有萤火虫荧光素酶编码基因序列的重组载体pGL4.10；
所述步骤（2）中，为采用In-fusion重组的方法将步骤（1）扩增得到的萤火虫荧光素酶编码基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处。
9.如权利要求8所述的一种重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，将步骤（1）扩增得到的萤火虫荧光素酶编码基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的ClaI酶切位点。
10.如权利要求1所述的重组慢病毒载体在分析启动子和/或增强子的功能或调控作用中的应用。
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