CN105039410A - 一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，步骤如下：第一步，pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒的构建；第二步，慢病毒介导的luciferase过表达系统的建立；第三步，稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系的建立；第四步，裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立；第五步，炎症模型的建立；第六步，具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立：继续饲养裸鼠30天，在裸鼠体内即建立具有炎症基础的胰腺癌模型。通过以上步骤建立得到的胰腺癌动物模型，可以通过使用的Luciferase，催化底物发光，被相应仪器设备检测到后就可以评估肿瘤的大小。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法。
背景技术
流行病学和临床研究证实大约25%的成人肿瘤由慢性炎症引起。例如，胃、肝脏及宫颈的慢性病毒或细菌感染、以及肺长期暴露于烟草烟雾或其它环境化合物，均会明显促使这些器官的慢性组织损伤及随后的肿瘤发生[1]。慢性炎症与胰腺癌的发生发展密切相关[2]。普通人群胰腺癌发病率约为0.007%[3]，慢性胰腺炎患者的胰腺癌的发病率增至4%，而遗传性胰腺炎患者的胰腺癌的发病率则高达40%[4]。抗炎制剂的应用与结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌及胃癌发病率的降低有关[1]。尽管炎症与癌症的关系已经明确，且被称为“癌症的第七大特征”[1]，但慢性炎症在癌症中发挥作用的潜在机制仍未明了，慢性炎症促进肿瘤细胞迁移、侵袭及转移的分子机制仍有待深入研究。目前关于炎症促进胰腺癌生长转移的研究仍局限于体外细胞水平，即采用各种炎症因子处理胰腺癌细胞，观察对细胞生长转移能力的影响。但体外细胞水平的研究具有一定的局限性，首先，炎症因子种类众多，单一的炎症因子刺激或几种炎症因子的组合均难以反映活体内的真实情况；其次，体外培养环境与体内的真实情况差异巨大，体内环境中，肿瘤细胞处于三维生长状态，且受到间质细胞、新生血管生成、多种炎症细胞浸润等诸多因素的影响。因此，研究炎症对胰腺癌生长转移的影响，有必要建立活体的动物模型，但目前尚无成功的范例。
建立用于研究慢性炎症对胰腺癌演进过程影响的动物模型，需要从两方面入手，一方面，需在实验动物的胰腺组织上诱导出或移植入胰腺癌，建立胰腺原位的肿瘤模型；另一方面，需要在实验动物上诱导出胰腺炎。两方面相结合，方可建立具有炎症基础的胰腺癌动物模型。裸鼠胰腺原位移植瘤模型，是目前比较经典的胰腺原位肿瘤模型[5]。通过将人胰腺癌细胞注入裸鼠胰腺包膜下，可在裸鼠胰腺上生长出胰腺癌。二丁基二氯化锡（dibutyltindichloride，DBTC）尾静脉注射，是目前常用的动物胰腺炎诱导方法[6]。其原理在于，DBTC是一种脂溶性物质，可经肝脏、胆囊排泄至胰管，引起胰管的细胞坏死和上皮增生，进而阻塞胰管，诱发胰腺炎。目前已证实的能够被DBTC诱导出胰腺炎的实验动物包括Sprague-Dawley（SD）大鼠和C57BL/6（B6）小鼠。但目前尚未证实裸鼠能否被DBTC诱导出胰腺炎。
发明内容
解决的技术问题：针对目前尚未证实裸鼠能否被DBTC诱导出胰腺炎，本发明提供一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，该方法证实了裸鼠能够被DBTC诱导出胰腺炎，并确定了裸鼠中DBTC的使用的合适剂量，在此基础上，将裸鼠胰腺原位移植瘤模型与DBTC诱导的裸鼠胰腺炎模型相结合，成功建立了具有炎症基础的胰腺癌模型。
技术方案：一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，步骤如下：
第一步，pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒的构建：
1)通过下列反应体系和条件制备得到pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物和pGL3-Basic酶切产物，其中DNA为pLVX-IRES-ZsGreen1和pGL3-Basic质粒，
反应体系：
DNA，1μg
10×NEbuffer4+BSA，3μL
内切酶XhoI，1单位
内切酶XbaI，1单位
加灭菌超纯水至体积30μL
反应条件：37℃水浴2h
2)将pGL3-Basic酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含1700bp大小的DNA片段的凝胶块，并采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到luciferaseDNA片段，
3)将pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含8400bp大小的DNA片段，并采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物，
4)采用T4DNA连接酶和快速连接试剂盒，将luciferaseDNA片段与纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物进行连接，得到连接产物，
5)将连接产物转化入感受态大肠杆菌细胞，并进行抗性筛选，得到抗性筛选后的单克隆菌落，
6)将抗性筛选后的菌落进行阳性克隆筛选，得到pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒；
第二步，慢病毒介导的luciferase过表达系统的建立：
将pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒与辅助包装原件载体质粒pspax2和pMD2G用Lipofectamine3000转染试剂转染293T细胞，即得慢病毒介导的luciferase过表达系统；
第三步，稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系的建立：
将慢病毒介导的luciferase过表达系统加入胰腺癌细胞培养液中，感染细胞，受感染的细胞，luciferase基因可整合至细胞基因组中，形成稳定表达luciferase的细胞，以终浓度4μg/mL嘌呤霉素筛选稳定表达luciferase的细胞，建立稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系；
第四步，裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立：
①将1×107个稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系，重悬于DMEM培养液中，调整体积为100μL，细胞密度为1×107/100μL，再与100μLMatrigel等体积混合，得到细胞悬液，至于冰上备用，
②采用胰岛素注射器，将50μL细胞悬液注射入裸鼠胰腺包膜下，即得裸鼠胰腺原位移植瘤模型；
第五步，炎症模型的建立：
以浓度为80%的乙醇为溶剂溶解DBTC，配制成3.2mg/mL的母液，在裸鼠胰腺原位移植瘤模型建立后第三天，将母液用等体积PBS稀释后进行DBTC尾静脉注射，即得炎症模型，其中按2mg/kg体重计算DBTC用量；
第六步，具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立：
继续饲养裸鼠30天，在裸鼠体内即建立具有炎症基础的胰腺癌模型。
上述所述的第一步的2)和3)中采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化的步骤相同，具体步骤是：
①在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；
②将凝胶放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合直至凝胶块完全熔化；
③再加入0.5个凝胶体积的BufferDE-B，混合均匀，得到混合液；
④吸取步骤③中的混合液，转移到DNA制备管中，将制备管置于2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑤将制备管置回2mL离心管，加入500μLBufferW1，在12,000×g离心力下离心30s，弃滤液；
⑥再将制备管置回2mL离心管，加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心30s，弃滤液，再加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑦将制备管置回2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min；
⑧将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25-30μLEluent或去离子水，室温静置1min，在12,000×g离心力下离心1min洗脱DNA，即完成纯化。
上述所述的第一步的4)中将luciferaseDNA片段与纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物进行连接的具体步骤是：
①将50ng纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物和3倍摩尔量的luciferaseDNA片段混合，加蒸馏水至总体积为10μl；
②加入10μl2×QuickLigationBuffer，混匀；
③加入1μlQuickT4DNA连接酶，混匀；
④在室温下作用5分钟后即得连接产物，链接产物贮存于-20℃的环境中。
上述所述的第一步的5)中抗性删选的具体步骤是：
①取一管感受态大肠杆菌细胞，在冰上溶解后加入3μL连接产物，混匀，冰浴30min；
②将管静置于42℃中水浴90s后，迅速转移至冰中，冰浴1-2min；
③在管中加入900μLLB，在37℃中水浴10min；
④将管置于摇床中，在37℃、转速210rpm下摇菌45min；
⑤将100μL已转化的细胞涂布于氨苄青霉素平板上；
⑥倒置平板，在37℃培养16-20h，即完成抗性筛选。
上述所述的第一步的6)中阳性克隆筛选的具体步骤是：
(1)菌落PCR筛选：
挑取单克隆菌落，置于300μL含氨苄青霉素的LB中，在37℃、转速280rpm下摇菌6-8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTARHSDNApolymerase进行PCR筛选，得到菌落PCR结果阳性的克隆；
(2)酶切鉴定：
取菌落PCR结果阳性的克隆，采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒，并采用XhoI和XbaI限制性内切酶进行酶切，能切出1700bp片段的即为酶切鉴定阳性的克隆；
(3)测序鉴定：
取酶切鉴定阳性的克隆，进行测序，测序结果采用Clustalx软件与luciferase序列进行比对，序列匹配即构建成功，即得到pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒。
上述所述的(2)中采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒的具体步骤是：
①取1-4mL在LB培养基中培养过夜的菌落PCR结果阳性的克隆的菌液，在12,000×g离心力下离心1min，弃尽上清液；
②加入250μLBufferS1悬浮细菌进行沉淀；
③加入250μLBufferS2，上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；
④加350μLBufferS3，上下翻转混合6-8次，在12,000×g离心力下离心10min；
⑤吸取步骤④中的离心上清液并转移到制备管中，将制备管置于2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑥将制备管置回离心管，加入500μLBufferW1，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑦将制备管置回离心管，加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液，再加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑧将制备管置回2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min；
⑨将制备管移入1.5mL离心管中，在制备管膜中央加60-80μLEluent或去离子水，室温静置1min，在12,000×g离心力下离心1min，即完成质粒的提取。
上述所述的第二步中慢病毒介导的luciferase过表达系统建立的具体步骤是：
①接种293T细胞至汇合度为70-90%时转染，得到细胞培养液；
②使用无血清培养基稀释Lipofectamine3000试剂；
③使用无血清培养基稀释pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒，然后添加P3000试剂，混匀，得到预混液；
④在已稀释的Lipofectamine3000试剂中加入等量的预混液，室温孵育5min，得到DNA-脂质体复合物；
⑤将DNA-脂质体复合物加入细胞培养液中；
⑥转染后培养24、48、72h，分别收集富含慢病毒颗粒的上清液，上清液通过超离心浓缩病毒，即得到慢病毒介导的luciferase过表达系统。
上述所述的具有炎症基础的胰腺癌动物模型，其应用价值还在于，可以在体内水平研究某个基因是否参与了炎症促进胰腺癌生长转移的过程。具体来说，先在胰腺癌细胞系中对目的基因进行干预（采用敲除、敲减、过表达等方法改变目的基因的表达水平，或对目的基因进行基因突变），再将干预后和未干预的细胞分别植入裸鼠胰腺，并用DBTC诱导胰腺炎。通过比较进行和未进行目的基因干预的胰腺癌生长转移能力的差异，即可证实目的基因是否参与了炎症促进胰腺癌生长转移的过程。
有益效果：本发明提供的一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，该建立方法中使用的Luciferase能够催化底物发光，因此当实验动物体内注入荧光素底物（D-luciferin）时，稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系形成的肿瘤能够产生荧光，其发光强度并可被相应仪器设备（小动物活体成像系统，IVIS;LuminaII,PerkinElmer公司）检测到，从而能够证实肿瘤的存在，并评估肿瘤的大小。
附图说明
图1为采用小动物活体成像系统检测炎症组和对照组对肿瘤生长的影响检测结果图。
图2为处死炎症组和对照组的裸鼠取出胰腺肿瘤后的称重结果图。
具体实施方式
以下实施例中所使用的pLVX-IRES-ZsGreen1质粒购自Clontech公司，含萤火虫荧光素酶（luciferase）基因的pGL3-Basic质粒购自Promega公司，酶切反应采用NEB公司限制性内切酶。
AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。
T4DNA连接酶和快速连接试剂盒购自NEB公司。
感受态大肠杆菌细胞购自Tiangeng公司。
PrimerSTARHSDNApolymerase购自TAKARA公司，质粒小量DNA提取试剂盒购自AXYGEN公司。
Lipofectamine3000试剂购自Lifetechnologies公司。
实施例1
一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，步骤如下：
第一步，pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒的构建：
1)通过下列反应体系和条件制备得到pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物和pGL3-Basic酶切产物，
反应体系：
DNA（pLVX-IRES-ZsGreen1、pGL3-Basic质粒），1μg
10×NEbuffer4（+BSA），3μL
内切酶XhoI，1单位
内切酶XbaI，1单位
加灭菌超纯水至体积30μL
反应条件：37℃水浴2h。
2)将pGL3-Basic酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含1700bp大小的DNA片段的凝胶块，并采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到luciferaseDNA片段，其中采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化的具体步骤是：
①在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；
②将凝胶放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合直至凝胶块完全熔化；
③再加入0.5个凝胶体积的BufferDE-B，混合均匀，得到混合液；
④吸取步骤③中的混合液，转移到DNA制备管中，将制备管置于2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑤将制备管置回2mL离心管，加入500μLBufferW1，在12,000×g离心力下离心30s，弃滤液；
⑥再将制备管置回2mL离心管，加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心30s，弃滤液，再加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑦将制备管置回2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min；
⑧将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25-30μLEluent或去离子水，室温静置1min，在12,000×g离心力下离心1min洗脱DNA，即完成纯化。
3)将pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含8400bp大小的DNA片段，并采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物，其中采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化的具体步骤与2)中相同。
4)采用T4DNA连接酶和快速连接试剂盒，将luciferaseDNA片段与纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物进行连接，得到连接产物，其中将luciferaseDNA片段与纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物进行连接的具体步骤是：
①将50ng纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物和3倍摩尔量的luciferaseDNA片段混合，加蒸馏水至总体积为10μl；
②加入10μl2×QuickLigationBuffer，混匀；
③加入1μlQuickT4DNA连接酶，混匀；
④在室温下作用5分钟后即得连接产物，链接产物贮存于-20℃的环境中。
5)将连接产物转化入感受态大肠杆菌细胞，并进行抗性筛选，得到抗性筛选后的单克隆菌落，其中抗性删选的具体步骤是：
①取一管感受态大肠杆菌细胞，在冰上溶解后加入3μL连接产物，混匀，冰浴30min；
②将管静置于42℃中水浴90s后，迅速转移至冰中，冰浴1-2min；
③在管中加入900μLLB，在37℃中水浴10min；
④将管置于摇床中，在37℃、转速210rpm下摇菌45min；
⑤将100μL已转化的细胞涂布于氨苄青霉素平板上；
⑥倒置平板，在37℃培养16-20h，即完成抗性筛选。
6)将抗性筛选后的菌落进行阳性克隆筛选，得到pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒，其中阳性克隆筛选的具体步骤是：
(1)菌落PCR筛选：
挑取单克隆菌落，置于300μL含氨苄青霉素的LB中，在37℃、转速280rpm下摇菌6-8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTARHSDNApolymerase进行PCR筛选，得到菌落PCR结果阳性的克隆。
(2)酶切鉴定：
取菌落PCR结果阳性的克隆，采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒，并采用XhoI和XbaI限制性内切酶进行酶切，能切出1700bp片段的即为酶切鉴定阳性的克隆，其中采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒的具体步骤是：
①取1-4mL在LB培养基中培养过夜的菌落PCR结果阳性的克隆的菌液，在12,000×g离心力下离心1min，弃尽上清液；
②加入250μLBufferS1悬浮细菌进行沉淀；
③加入250μLBufferS2，上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；
④加350μLBufferS3，上下翻转混合6-8次，在12,000×g离心力下离心10min；
⑤吸取步骤④中的离心上清液并转移到制备管中，将制备管置于2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑥将制备管置回离心管，加入500μLBufferW1，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑦将制备管置回离心管，加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液，再加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑧将制备管置回2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min；
⑨将制备管移入1.5mL离心管中，在制备管膜中央加60-80μLEluent或去离子水，室温静置1min，在12,000×g离心力下离心1min，即完成质粒的提取。
(3)测序鉴定：
取酶切鉴定阳性的克隆，进行测序，测序结果采用Clustalx软件与luciferase序列进行比对，序列匹配即构建成功，即得到pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒。
第二步，慢病毒介导的luciferase过表达系统的建立：
具体步骤如下：
①接种293T细胞至汇合度为70-90%时转染，得到细胞培养液；
②使用无血清培养基稀释Lipofectamine3000试剂；
③使用无血清培养基稀释pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒，然后添加P3000试剂，混匀，得到预混液；
④在已稀释的Lipofectamine3000试剂中加入等量的预混液，室温孵育5min，得到DNA-脂质体复合物；
⑤将DNA-脂质体复合物加入细胞培养液中；
⑥转染后培养24、48、72h，分别收集富含慢病毒颗粒的上清液，上清液通过超离心浓缩病毒，即得到慢病毒介导的luciferase过表达系统。
第三步，稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系的建立：
将慢病毒介导的luciferase过表达系统加入胰腺癌细胞培养液中，感染细胞，受感染的细胞，luciferase基因可整合至细胞基因组中，形成稳定表达luciferase的细胞，以终浓度4μg/mL嘌呤霉素筛选稳定表达luciferase的细胞，建立稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系；
第四步，裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立：
①将1×107个稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系，重悬于DMEM培养液中，调整体积为100μL，细胞密度为1×107/100μL，再与100μLMatrigel等体积混合，得到细胞悬液，至于冰上备用，
②采用胰岛素注射器，将50μL细胞悬液注射入裸鼠胰腺包膜下，即得裸鼠胰腺原位移植瘤模型；
第五步，炎症模型的建立：
以浓度为80%的乙醇为溶剂溶解DBTC，配制成3.2mg/mL的母液，在裸鼠胰腺原位移植瘤模型建立后第三天，将母液用等体积PBS稀释后进行DBTC尾静脉注射，即得炎症模型，其中按2mg/kg体重计算DBTC用量；
第六步，具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立：
继续饲养裸鼠30天，在裸鼠体内即建立具有炎症基础的胰腺癌模型。
对比例1
本对比例直接在裸鼠的胰腺包膜下注射胰腺癌细胞，不进行尾静脉注射DBTC（即不诱导形成炎症）。
将实施例1中的进行实验的裸鼠命名为炎症组，对比例1中进行实验的裸鼠命名为对照组，炎症组和对照组进行实验的裸鼠各为25只。
采用小动物活体成像系统检测炎症对肿瘤生长的影响。得到的检测结果如图1所示。由图1可知，炎症组肿瘤体积明显大于对照组。说明炎症促进胰腺癌生长。（**P<0.01，与对照组有统计学差异。）。
处死裸鼠后，取出胰腺肿瘤并称重。称重结果如图2所示，炎症组肿瘤明显大于对照组。说明炎症促进胰腺癌生长。（**P<0.01，与对照组有统计学差异。）。
剖腹探查发现，炎症组实验动物均出现肿瘤腹腔淋巴结转移，而对照组均未见肿瘤转移。说明炎症促进胰腺癌转移。
Claims (7)
1.一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，其特征在于步骤如下：
第一步，pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒的构建：
1)通过下列反应体系和条件制备得到pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物和pGL3-Basic酶切产物，其中DNA为pLVX-IRES-ZsGreen1和pGL3-Basic质粒，
反应体系：
DNA，1μg
10×NEbuffer4+BSA，3μL
内切酶XhoI，1单位
内切酶XbaI，1单位
加灭菌超纯水至体积30μL
反应条件：37℃水浴2h
2)将pGL3-Basic酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含1700bp大小的DNA片段的凝胶块，并采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到luciferaseDNA片段，
3)将pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含8400bp大小的DNA片段，并采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物，
4)采用T4DNA连接酶和快速连接试剂盒，将luciferaseDNA片段与纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物进行连接，得到连接产物，
5)将连接产物转化入感受态大肠杆菌细胞，并进行抗性筛选，得到抗性筛选后的单克隆菌落，
6)将抗性筛选后的菌落进行阳性克隆筛选，得到pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒；
第二步，慢病毒介导的luciferase过表达系统的建立：
将pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒与辅助包装原件载体质粒pspax2和pMD2G用Lipofectamine3000转染试剂转染293T细胞，即得慢病毒介导的luciferase过表达系统；
第三步，稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系的建立：
将慢病毒介导的luciferase过表达系统加入胰腺癌细胞培养液中，感染细胞，受感染的细胞，luciferase基因可整合至细胞基因组中，形成稳定表达luciferase的细胞，以终浓度4μg/mL嘌呤霉素筛选稳定表达luciferase的细胞，建立稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系；
第四步，裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立：
①将1×107个稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系，重悬于DMEM培养液中，调整体积为100μL，细胞密度为1×107/100μL，再与100μLMatrigel等体积混合，得到细胞悬液，至于冰上备用，
②采用胰岛素注射器，将50μL细胞悬液注射入裸鼠胰腺包膜下，即得裸鼠胰腺原位移植瘤模型；
第五步，炎症模型的建立：
以浓度为80%的乙醇为溶剂溶解DBTC，配制成3.2mg/mL的母液，在裸鼠胰腺原位移植瘤模型建立后第三天，将母液用等体积PBS稀释后进行DBTC尾静脉注射，即得炎症模型，其中按2mg/kg体重计算DBTC用量；
第六步，具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立：
继续饲养裸鼠30天，在裸鼠体内即建立具有炎症基础的胰腺癌模型。
2.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的2)和3)中采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化的步骤相同，具体步骤是：
①在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；
②将凝胶放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合直至凝胶块完全熔化；
③再加入0.5个凝胶体积的BufferDE-B，混合均匀，得到混合液；
④吸取步骤③中的混合液，转移到DNA制备管中，将制备管置于2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑤将制备管置回2mL离心管，加入500μLBufferW1，在12,000×g离心力下离心30s，弃滤液；
⑥再将制备管置回2mL离心管，加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心30s，弃滤液，再加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑦将制备管置回2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min；
⑧将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25-30μLEluent或去离子水，室温静置1min，在12,000×g离心力下离心1min洗脱DNA，即完成纯化。
3.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的4)中将luciferaseDNA片段与纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物进行连接的具体步骤是：
①将50ng纯化后的pLVX-IRES-ZsGreen1酶切产物和3倍摩尔量的luciferaseDNA片段混合，加蒸馏水至总体积为10μl；
②加入10μl2×QuickLigationBuffer，混匀；
③加入1μlQuickT4DNA连接酶，混匀；
④在室温下作用5分钟后即得连接产物，链接产物贮存于-20℃的环境中。
4.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的5)中抗性删选的具体步骤是：
①取一管感受态大肠杆菌细胞，在冰上溶解后加入3μL连接产物，混匀，冰浴30min；
②将管静置于42℃中水浴90s后，迅速转移至冰中，冰浴1-2min；
③在管中加入900μLLB，在37℃中水浴10min；
④将管置于摇床中，在37℃、转速210rpm下摇菌45min；
⑤将100μL已转化的细胞涂布于氨苄青霉素平板上；
⑥倒置平板，在37℃培养16-20h，即完成抗性筛选。
5.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的6)中阳性克隆筛选的具体步骤是：
(1)菌落PCR筛选：
挑取单克隆菌落，置于300μL含氨苄青霉素的LB中，在37℃、转速280rpm下摇菌6-8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTARHSDNApolymerase进行PCR筛选，得到菌落PCR结果阳性的克隆；
(2)酶切鉴定：
取菌落PCR结果阳性的克隆，采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒，并采用XhoI和XbaI限制性内切酶进行酶切，能切出1700bp片段的即为酶切鉴定阳性的克隆；
(3)测序鉴定：
取酶切鉴定阳性的克隆，进行测序，测序结果采用Clustalx软件与luciferase序列进行比对，序列匹配即构建成功，即得到pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒。
6.根据权利要求5所述的一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述(2)中采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒的具体步骤是：
①取1-4mL在LB培养基中培养过夜的菌落PCR结果阳性的克隆的菌液，在12,000×g离心力下离心1min，弃尽上清液；
②加入250μLBufferS1悬浮细菌进行沉淀；
③加入250μLBufferS2，上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；
④加350μLBufferS3，上下翻转混合6-8次，在12,000×g离心力下离心10min；
⑤吸取步骤④中的离心上清液并转移到制备管中，将制备管置于2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑥将制备管置回离心管，加入500μLBufferW1，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑦将制备管置回离心管，加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液，再加入700μLBufferW2，在12,000×g离心力下离心1min，弃滤液；
⑧将制备管置回2mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1min；
⑨将制备管移入1.5mL离心管中，在制备管膜中央加60-80μLEluent或去离子水，室温静置1min，在12,000×g离心力下离心1min，即完成质粒的提取。
7.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第二步中慢病毒介导的luciferase过表达系统建立的具体步骤是：
①接种293T细胞至汇合度为70-90%时转染，得到细胞培养液；
②使用无血清培养基稀释Lipofectamine3000试剂；
③使用无血清培养基稀释pLVX-luciferase-IRES-ZsGreen1质粒，然后添加P3000试剂，混匀，得到预混液；
④在已稀释的Lipofectamine3000试剂中加入等量的预混液，室温孵育5min，得到DNA-脂质体复合物；
⑤将DNA-脂质体复合物加入细胞培养液中；
⑥转染后培养24、48、72h，分别收集富含慢病毒颗粒的上清液，上清液通过超离心浓缩病毒，即得到慢病毒介导的luciferase过表达系统。
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