CN106086076A - 一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法 - Google Patents

一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，步骤如下：第一步，pBabe‑CMV‑EGFP‑puro质粒的构建；第二步，逆转录病毒介导的EGFP过表达系统的建立；第三步，稳定表达EGFP的肺癌细胞系的建立；第四步，炎症模型的建立；第五步，具有炎症基础的肺癌动物模型的建立：将1×107个稳定表达EGFP的肺癌细胞系制成细胞悬液，采用胰岛素注射器，将75μL细胞悬液自背部肋间隙注射入具有肺部炎症的裸鼠的左肺，继续饲养2周，即为具有炎症基础的肺癌动物模型。该建立方法中使用的EGFP能够产生荧光，发光强度并可被相应仪器设备检测到，从而能够证实肿瘤的存在。

Description

一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法。
背景技术
流行病学和临床研究证实大约25%的成人肿瘤由慢性炎症引起。例如，胃、肝脏及宫颈的慢性病毒或细菌感染、以及肺长期暴露于烟草烟雾或其它环境化合物，均会明显促使这些器官的慢性组织损伤及随后的肿瘤发生。
尽管炎症与癌症的关系已经明确，且被称为“癌症的第七大特征”，但慢性炎症在癌症中发挥作用的潜在机制仍未明了，慢性炎症促进肿瘤细胞迁移、侵袭及转移的分子机制仍有待深入研究。目前关于炎症促进肺癌生长转移的研究仍局限于体外细胞水平，即采用各种炎症因子处理肺癌细胞，观察对细胞生长转移能力的影响。但体外细胞水平的研究具有一定的局限性，首先，炎症因子种类众多，单一的炎症因子刺激或几种炎症因子的组合均难以反映活体内的真实情况；其次，体外培养环境与体内的真实情况差异巨大，体内环境中，肿瘤细胞处于三维生长状态，且受到间质细胞、新生血管生成、多种炎症细胞浸润等诸多因素的影响。因此，研究炎症对肺癌生长转移的影响，有必要建立活体的动物模型，但目前尚无成功的范例。
建立用于研究慢性炎症对肺癌演进过程影响的动物模型，需要从两方面入手，一方面，需在实验动物的肺组织上诱导出或移植入肺癌，建立肺原位的肿瘤模型；另一方面，需要在实验动物上诱导出肺慢性炎症。两方面相结合，方可建立具有炎症基础的肺癌动物模型。
通过将人肺癌细胞注入裸鼠肺内，可在裸鼠肺内生长出肺癌癌。目前诱导肺慢性炎症较常用的是猪胰弹性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE），可导致肺内结构蛋白的降解，进而导致肺气肿和慢性阻塞性肺炎。
发明内容
解决的技术问题：针对现有的诱导肺慢性炎症常用的猪胰弹性蛋白酶可导致肺内结构蛋白的降解、进而导致肺气肿和慢性阻塞性肺炎的缺点，本发明提供一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，该方法将裸鼠肺原位移植瘤模型与PPE诱导的慢性肺炎模型相结合，成功建立了具有炎症基础的肺癌模型。
技术方案：一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，步骤如下：
第一步，pBabe-CMV-EGFP-puro质粒的构建：
1) 通过下列反应体系和条件制备得到pBabe-puro 酶切产物，其中DNA为pBabe-puro质粒，
反应体系：
DNA，1 μg
10×NEbuffer3+BSA，3 μL
内切酶BamHI，1单位
内切酶EcoRI，1单位
加灭菌超纯水至体积30 μL
反应条件：37℃水浴2h
2) 将pBabe-puro 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含5100 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的pBabe-puro 酶切产物，
3) 通过下列PCR反应体系和条件制备得到CMV-EGFP DNA片段，其中DNA模板为pEGFP-C1质粒，
PCR反应体系如下：
5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）,10 μL
dNTP Mixture（各2.5 mM）,4 μL
正向引物1：5'CCGGATCCTAATAGTAATCAATTACGGG3'（10 μM）,1 μL
反向引物2：5'AAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3'（10 μM）,1 μL
DNA模板,100 ng
PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μl）,0.5 μL
加灭菌超纯水至体积50 μL
反应条件：
98℃ 10 sec
55℃ 15 sec
72℃ 1 min/kbp
30 Cycles
产物：1400bp
4) 将CMV-EGFP DNA片段采用AxyPrep PCR 清洁试剂盒进行纯化，得到尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，
5) 通过下列反应体系和条件制备得到CMV-EGFP酶切产物，其中DNA为尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，
反应体系：
DNA，1 μg
10×NEbuffer3+BSA，3 μL
内切酶BamHI，1单位
内切酶EcoRI，1单位
加灭菌超纯水至体积30 μL
反应条件：37℃水浴2h
6) 将CMV-EGFP酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含1400 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的CMV-EGFP酶切产物，
7) 采用T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒，将纯化后的CMV-EGFP 酶切产物与纯化后的pBabe-puro 酶切产物进行连接，得到连接产物，
8) 将连接产物转化入感受态大肠杆菌细胞，并进行抗性筛选，得到抗性筛选后的单克隆菌落，
9) 将抗性筛选后的菌落进行阳性克隆筛选，得到pBabe-CMV-EGFP-puro质粒；
第二步，逆转录病毒介导的EGFP过表达系统的建立：
将pBabe-CMV-EGFP-puro质粒与辅助包装原件载体质粒VSVG和pMDL g/p RRE用Lipofectamine 3000转染试剂转染293T细胞，即得逆转录病毒介导的EGFP过表达系统，其中质粒的质量比例如下：pBabe-CMV-EGFP-puro：VSVG：pMDL g/p RRE=2:1:1；
第三步，稳定表达EGFP的肺癌细胞系的建立：
将逆转录病毒介导的EGFP过表达系统加入肺癌细胞培养液中，感染细胞，受感染的细胞的EGFP基因可整合至细胞基因组中，形成稳定表达EGFP的细胞，以终浓度4μg/mL嘌呤霉素筛选稳定表达EGFP的细胞，建立得到稳定表达EGFP的肺癌细胞系；
第四步，炎症模型的建立：
① 称取猪胰弹性蛋白酶粉剂0.01g溶于1mL生理盐水中，即为PPE工作液，其中PPE工作液的工作浓度为0.125mg/50μL，适用于重量为20-35g裸鼠，
② 采用胰岛素注射器，将50μL PPE工作液于裸鼠环甲膜处注入裸鼠气管，继续饲养2周，即得到具有肺部炎症的裸鼠，即为炎症模型；
第五步，具有炎症基础的肺癌动物模型的建立：
① 将1×107个稳定表达EGFP的肺癌细胞系，重悬于DMEM培养液中，调整体积为50μL，细胞密度为1×107/50μL，再与50μL Matrigel等体积混合，得到细胞悬液，至于冰上备用，
② 采用胰岛素注射器，将75μL细胞悬液自背部肋间隙注射入具有肺部炎症的裸鼠的左肺，继续饲养2周，即在裸鼠体内建立具有炎症基础的肺癌模型，即为具有炎症基础的肺癌动物模型。
上述所述的第一步的2)中采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化的具体步骤是：
①在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；
②将凝胶放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3 个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃ 加热，间断混合直至凝胶块完全熔化；
③再加入0.5 个凝胶体积的Buffer DE-B，混合均匀，得到混合液；
④吸取步骤③中的混合液，转移到DNA 制备管中，将制备管置于2 mL 离心管中，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑤将制备管置回2 mL 离心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g 离心力下离心30s，弃滤液；
⑥再将制备管置回2 mL 离心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 离心力下离心30 s，弃滤液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 离心力下离心1 min，弃滤液；
⑦将制备管置回2mL 离心管中，在12,000×g 离心力下离心1 min；
⑧将制备管置于洁净的1.5 mL 离心管中，在制备膜中央加入25-30 μL Eluent 或去离子水，室温静置1 min，在12,000×g 离心力下离心1min 洗脱DNA，即完成纯化。
上述所述的第一步的4) 中采用AxyPrep PCR 清洁试剂盒进行纯化的具体步骤是：
① 在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加3个体积的Buffer PCR-A，Buffer PCR-A，不足100 μL时加至100 μL，接着混匀，转移到制备管中，将制备管置于2 mL离心管中，12,000×g 离心1 min，弃滤液；
② 将制备管置回2 mL离心管，加700 μLBuffer W2，12,000×g 离心1 min，弃滤液；
③ 将制备管置于离心管中，将制备管置回 2 mL离心管，加 400 μL Buffer W2，12,000×g 离心1 min；
④ 将制备管置于洁净的1.5 mL离心管中，在制备管膜中央加25-30 μLEluent或去离子水，室温静置1 min，12,000×g 离心1 min 洗脱DNA。
上述所述的第一步的7)中将纯化后的CMV-EGFP酶切产物与纯化后的pBabe-puro酶切产物进行连接的具体步骤是：
①将50 ng纯化后的pBabe-puro酶切产物和3倍摩尔量的纯化后的CMV-EGFP酶切产物混合，加蒸馏水至总体积为10 µl；
②加入10 µl 2×Quick Ligation Buffer，混匀；
③加入1 µl Quick T4 DNA连接酶，混匀；
④在室温下作用5分钟后即得连接产物，链接产物贮存于-20℃的环境中。
上述所述的第一步的8)中抗性删选的具体步骤是：
①取一管感受态大肠杆菌细胞，在冰上溶解后加入3μL连接产物，混匀，冰浴30min；
②将管静置于42℃中水浴90s后，迅速转移至冰中，冰浴1-2min；
③在管中加入900 μL LB，在37℃中水浴10min；
④将管置于摇床中，在37℃、转速210 rpm下摇菌45min；
⑤将100 μL已转化的细胞涂布于氨苄青霉素平板上；
⑥倒置平板，在37℃培养16-20h，即完成抗性筛选。
上述所述的第一步的9)中阳性克隆筛选的具体步骤是：
(1) 菌落PCR筛选：
挑取单克隆菌落，置于300μL含氨苄青霉素的LB中，在37℃、转速280 rpm下摇菌 6-8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTAR HS DNA polymerase进行PCR筛选，得到菌落PCR结果阳性的克隆；
(2) 酶切鉴定：
取菌落PCR结果阳性的克隆，采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒，并采用BamHI和EcoRI限制性内切酶进行酶切，能切出1400bp片段的即为酶切鉴定阳性的克隆；
(3) 测序鉴定：
取酶切鉴定阳性的克隆，进行测序，测序结果采用Clustalx软件与EGFP序列进行比对，序列匹配即构建成功，即得到pBabe-CMV-EGFP-puro质粒。
上述所述的 (2)中采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒的具体步骤是：
①取1-4 mL在LB培养基中培养过夜的菌落PCR结果阳性的克隆的菌液，在12,000×g离心力下离心1 min，弃尽上清液；
②加入250 μL Buffer S1 悬浮细菌进行沉淀；
③加入250 μL Buffer S2，上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；
④加350 μL Buffer S3，上下翻转混合6-8次，在12,000×g离心力下离心10 min；
⑤吸取步骤④中的离心上清液并转移到制备管中，将制备管置于2 mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑥将制备管置回离心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑦将制备管置回离心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑧将制备管置回2 mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1 min；
⑨将制备管移入1.5 mL离心管中，在制备管膜中央加60-80 μL Eluent或去离子水，室温静置1 min，在12,000×g离心力下离心1 min，即完成质粒的提取。
上述所述的第二步中逆转录病毒介导的EGFP过表达系统建立的具体步骤是：
①接种293T细胞至汇合度为70-90%时转染，得到细胞培养液；
②使用无血清培养基稀释Lipofectamine 3000试剂；
③使用无血清培养基稀释pBabe-CMV-EGFP-puro质粒、VSVG质粒和pMDL g/p RRE质粒，然后添加P3000试剂，混匀，得到预混液；
④在已稀释的Lipofectamine 3000试剂中加入等量的预混液，室温孵育5min，得到DNA-脂质体复合物；
⑤将DNA-脂质体复合物加入细胞培养液中；
⑥转染后培养24、48、72h，分别收集富含逆转录病毒颗粒的上清液，上清液通过超离心浓缩病毒，即得到逆转录病毒介导的EGFP过表达系统。
上述所述的具有炎症基础的肺癌动物模型，其应用价值还在于，可以在体内水平研究某个基因是否参与了炎症促进肺癌生长转移的过程。具体来说，先在肺癌细胞系中对目的基因进行干预（采用敲除、敲减、过表达等方法改变目的基因的表达水平，或对目的基因进行基因突变），再将干预后和未干预的细胞分别植入裸鼠建立移植瘤模型，并用PPE诱导慢性炎症。通过比较进行和未进行目的基因干预的肺癌生长转移能力的差异，即可证实目的基因是否参与了炎症促进肺癌生长转移的过程。
有益效果：本发明提供的一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，该建立方法中使用的EGFP能够被激光器激发产生荧光，其发光强度并可被相应仪器设备（小动物活体成像系统，IVIS; Lumina II, PerkinElmer公司）检测到，从而能够证实肿瘤的存在，并评估肿瘤的大小。
附图说明
图1为采用小动物活体成像系统检测炎症组和对照组对肿瘤生长的影响检测结果图。
图2为处死炎症组和对照组的裸鼠取出肿瘤后的称重结果图。
具体实施方式
以下实施例中所使用的pBabe-puro 质粒购自Addgene公司，酶切反应采用NEB公司限制性内切酶。
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。
pEGFP-C1质粒购自Clontech公司，PCR反应采用TAKARA公司的PrimerSTAR HS DNApolymerase，PrimerSTAR HS DNA polymerase购自TAKARA公司。
AxyPrep PCR 清洁试剂盒购自AXYGEN公司。
尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段以pEGFP-C1质粒为模板，用PCR反应体系做出。
T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒购自NEB公司。
感受态大肠杆菌细胞购自Tiangeng公司。
质粒小量DNA提取试剂盒购自AXYGEN公司。
质粒VSVG和pMDL g/p RRE购自Addgene公司，Lipofectamine 3000转染试剂购自Lifetechnologies公司。
猪胰弹性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）购自solarbio公司（活性：≥30u/mg，为粉剂）。
实施例1
一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，步骤如下：
第一步，pBabe-CMV-EGFP-puro质粒的构建：
1) 通过下列反应体系和条件制备得到pBabe-puro 酶切产物，其中DNA为pBabe-puro质粒，
反应体系：
DNA，1 μg
10×NEbuffer3+BSA，3 μL
内切酶BamHI，1单位
内切酶EcoRI，1单位
加灭菌超纯水至体积30 μL
反应条件：37℃水浴2h；
2) 将pBabe-puro 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含5100 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的pBabe-puro 酶切产物，其中采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化的具体步骤是：
①在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；
②将凝胶放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3 个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃ 加热，间断混合直至凝胶块完全熔化；
③再加入0.5 个凝胶体积的Buffer DE-B，混合均匀，得到混合液；
④吸取步骤③中的混合液，转移到DNA 制备管中，将制备管置于2 mL 离心管中，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑤将制备管置回2 mL 离心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g 离心力下离心30s，弃滤液；
⑥再将制备管置回2 mL 离心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 离心力下离心30 s，弃滤液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 离心力下离心1 min，弃滤液；
⑦将制备管置回2mL 离心管中，在12,000×g 离心力下离心1 min；
⑧将制备管置于洁净的1.5 mL 离心管中，在制备膜中央加入25-30 μL Eluent 或去离子水，室温静置1 min，在12,000×g 离心力下离心1min 洗脱DNA，即完成纯化；
3) 通过下列PCR反应体系和条件制备得到CMV-EGFP DNA片段，其中DNA模板为pEGFP-C1质粒，
PCR反应体系如下：
5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）,10 μL
dNTP Mixture（各2.5 mM）,4 μL
正向引物1：5'CCGGATCCTAATAGTAATCAATTACGGG3'（10 μM）,1 μL
反向引物2：5'AAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3'（10 μM）,1 μL
DNA模板,100 ng
PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μl）,0.5 μL
加灭菌超纯水至体积50 μL
反应条件：
98℃ 10 sec
55℃ 15 sec
72℃ 1 min/kbp
30 Cycles
产物：1400bp；
4) 将CMV-EGFP DNA片段采用AxyPrep-96 PCR 清洁试剂盒进行纯化，得到尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，其中采用AxyPrep PCR 清洁试剂盒进行纯化的具体步骤是：
① 在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加3个体积的Buffer PCR-A，Buffer PCR-A，不足100 μL时加至100 μL，接着混匀，转移到制备管中，将制备管置于2 mL离心管中，12,000×g 离心1 min，弃滤液；
② 将制备管置回2 mL离心管，加700 μLBuffer W2，12,000×g 离心1 min，弃滤液；
③ 将制备管置于离心管中，将制备管置回 2 mL离心管，加 400 μL Buffer W2，12,000×g 离心1 min；
④ 将制备管置于洁净的1.5 mL离心管中，在制备管膜中央加25-30 μLEluent或去离子水，室温静置1 min，12,000×g 离心1 min 洗脱DNA；
5) 通过下列反应体系和条件制备得到CMV-EGFP酶切产物，其中DNA为尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，
反应体系：
DNA，1 μg
10×NEbuffer3+BSA，3 μL
内切酶BamHI，1单位
内切酶EcoRI，1单位
加灭菌超纯水至体积30 μL
反应条件：37℃水浴2h；
6) 将CMV-EGFP酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含1400 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的CMV-EGFP酶切产物；
7) 采用T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒，将纯化后的CMV-EGFP 酶切产物与纯化后的pBabe-puro 酶切产物进行连接，得到连接产物，其中将纯化后的CMV-EGFP酶切产物与纯化后的pBabe-puro酶切产物进行连接的具体步骤是：
①将50 ng纯化后的pBabe-puro酶切产物和3倍摩尔量的纯化后的CMV-EGFP酶切产物混合，加蒸馏水至总体积为10 µl；
②加入10 µl 2×Quick Ligation Buffer，混匀；
③加入1 µl Quick T4 DNA连接酶，混匀；
④在室温下作用5分钟后即得连接产物，链接产物贮存于-20℃的环境中；
8) 将连接产物转化入感受态大肠杆菌细胞，并进行抗性筛选，得到抗性筛选后的单克隆菌落，其中抗性删选的具体步骤是：
①取一管感受态大肠杆菌细胞，在冰上溶解后加入3μL连接产物，混匀，冰浴30min；
②将管静置于42℃中水浴90s后，迅速转移至冰中，冰浴1-2min；
③在管中加入900 μL LB，在37℃中水浴10min；
④将管置于摇床中，在37℃、转速210 rpm下摇菌45min；
⑤将100 μL已转化的细胞涂布于氨苄青霉素平板上；
⑥倒置平板，在37℃培养16-20h，即完成抗性筛选；
9) 将抗性筛选后的菌落进行阳性克隆筛选，得到pBabe-CMV-EGFP-puro质粒，其中阳性克隆筛选的具体步骤是：
(1) 菌落PCR筛选：
挑取单克隆菌落，置于300μL含氨苄青霉素的LB中，在37℃、转速280 rpm下摇菌 6-8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTAR HS DNA polymerase进行PCR筛选，得到菌落PCR结果阳性的克隆；
(2) 酶切鉴定：
取菌落PCR结果阳性的克隆，采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒，并采用BamHI和EcoRI限制性内切酶进行酶切，能切出1400bp片段的即为酶切鉴定阳性的克隆，其中采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒的具体步骤是：
①取1-4 mL在LB培养基中培养过夜的菌落PCR结果阳性的克隆的菌液，在12,000×g离心力下离心1 min，弃尽上清液；
②加入250 μL Buffer S1 悬浮细菌进行沉淀；
③加入250 μL Buffer S2，上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；
④加350 μL Buffer S3，上下翻转混合6-8次，在12,000×g离心力下离心10 min；
⑤吸取步骤④中的离心上清液并转移到制备管中，将制备管置于2 mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑥将制备管置回离心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑦将制备管置回离心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑧将制备管置回2 mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1 min；
⑨将制备管移入1.5 mL离心管中，在制备管膜中央加60-80 μL Eluent或去离子水，室温静置1 min，在12,000×g离心力下离心1 min，即完成质粒的提取；
(3) 测序鉴定：
取酶切鉴定阳性的克隆，进行测序，测序结果采用Clustalx软件与EGFP序列进行比对，序列匹配即构建成功，即得到pBabe-CMV-EGFP-puro质粒。
第二步，逆转录病毒介导的EGFP过表达系统的建立：
①接种293T细胞至汇合度为70-90%时转染；
②使用无血清培养基稀释Lipofectamine 3000试剂；
③使用无血清培养基稀释pBabe-CMV-EGFP-puro质粒、VSVG质粒和pMDL g/p RRE质粒，然后添加P3000试剂，混匀，得到预混液，其中质粒的质量比例如下：pBabe-CMV-EGFP-puro：VSVG：pMDL g/p RRE=2:1:1；
④在已稀释的Lipofectamine 3000试剂中加入等量的预混液，室温孵育5min，得到DNA-脂质体复合物；
⑤将DNA-脂质体复合物加入细胞培养液中；
⑥转染后培养24、48、72h，分别收集富含逆转录病毒颗粒的上清液，上清液通过超离心浓缩病毒，即得到逆转录病毒介导的EGFP过表达系统。
第三步，稳定表达EGFP的肺癌细胞系的建立：
将逆转录病毒介导的EGFP过表达系统加入肺癌细胞培养液中，感染细胞，受感染的细胞的EGFP基因可整合至细胞基因组中，形成稳定表达EGFP的细胞，以终浓度4μg/mL嘌呤霉素筛选稳定表达EGFP的细胞，建立得到稳定表达EGFP的肺癌细胞系；
第四步，炎症模型的建立：
① 称取猪胰弹性蛋白酶粉剂0.01g溶于1mL生理盐水中，即为PPE工作液，其中PPE工作液的工作浓度为0.125mg/50μL，适用于重量为20-35g裸鼠，
② 采用胰岛素注射器，将50μL PPE工作液于裸鼠环甲膜处注入裸鼠气管，继续饲养2周，即得到具有肺部炎症的裸鼠，即为炎症模型；
第五步，具有炎症基础的肺癌动物模型的建立：
① 将1×107个稳定表达EGFP的肺癌细胞系，重悬于DMEM培养液中，调整体积为50μL，细胞密度为1×107/50μL，再与50μL Matrigel等体积混合，得到细胞悬液，至于冰上备用，
② 采用胰岛素注射器，将75μL细胞悬液自背部肋间隙注射入具有肺部炎症的裸鼠的左肺，继续饲养2周，即在裸鼠体内建立具有炎症基础的肺癌模型，即为具有炎症基础的肺癌动物模型。
对比例1
本对比例直接在裸鼠肺接种肿瘤胞，未进行PPE处理（即不诱导形成炎症）。
将实施例1中的进行PPE处理的裸鼠命名为炎症组，对比例1中进行实验的未进行PPE处理的裸鼠命名为对照组，炎症组和对照组进行实验的裸鼠各为25只。
采用小动物活体成像系统检测炎症对肿瘤生长的影响。得到的检测结果如图1所示。由图1可知，炎症组肿瘤体积明显大于对照组。说明炎症促进肺癌生长。（**P<0.01，与对照组有统计学差异。）
处死裸鼠后，取出肿瘤并称重。称重结果如图2所示，炎症组肿瘤明显大于对照组。说明炎症促进肺癌生长。（**P<0.01，与对照组有统计学差异。）。

Claims (8)

1.一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，其特征在于步骤如下：
第一步，pBabe-CMV-EGFP-puro质粒的构建：
1) 通过下列反应体系和条件制备得到pBabe-puro 酶切产物，其中DNA为pBabe-puro质粒，
反应体系：
DNA，1 μg
10×NEbuffer3+BSA，3 μL
内切酶BamHI，1单位
内切酶EcoRI，1单位
加灭菌超纯水至体积30 μL
反应条件：37℃水浴2h
2) 将pBabe-puro 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含5100 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的pBabe-puro 酶切产物，
3) 通过下列PCR反应体系和条件制备得到CMV-EGFP DNA片段，其中DNA模板为pEGFP-C1质粒，
PCR反应体系如下：
5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）,10 μL
dNTP Mixture（各2.5 mM）,4 μL
正向引物1：5'CCGGATCCTAATAGTAATCAATTACGGG3'（10 μM）,1 μL
反向引物2：5'AAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3'（10 μM）,1 μL
DNA模板,100 ng
PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μl）,0.5 μL
加灭菌超纯水至体积50 μL
反应条件：
98℃ 10 sec
55℃ 15 sec
72℃ 1 min/kbp
30 Cycles
产物：1400bp
4) 将CMV-EGFP DNA片段采用AxyPrep PCR 清洁试剂盒进行纯化，得到尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，
5) 通过下列反应体系和条件制备得到CMV-EGFP酶切产物，其中DNA为尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，
反应体系：
DNA，1 μg
10×NEbuffer3+BSA，3 μL
内切酶BamHI，1单位
内切酶EcoRI，1单位
加灭菌超纯水至体积30 μL
反应条件：37℃水浴2h
6) 将CMV-EGFP酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含1400 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的CMV-EGFP酶切产物，
7) 采用T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒，将纯化后的CMV-EGFP 酶切产物与纯化后的pBabe-puro 酶切产物进行连接，得到连接产物，
8) 将连接产物转化入感受态大肠杆菌细胞，并进行抗性筛选，得到抗性筛选后的单克隆菌落，
9) 将抗性筛选后的菌落进行阳性克隆筛选，得到pBabe-CMV-EGFP-puro质粒；
第二步，逆转录病毒介导的EGFP过表达系统的建立：
将pBabe-CMV-EGFP-puro质粒与辅助包装原件载体质粒VSVG和pMDL g/p RRE用Lipofectamine 3000转染试剂转染293T细胞，即得逆转录病毒介导的EGFP过表达系统，其中质粒的质量比例如下：pBabe-CMV-EGFP-puro:VSVG:pMDL g/p RRE=2:1:1；
第三步，稳定表达EGFP的肺癌细胞系的建立：
将逆转录病毒介导的EGFP过表达系统加入肺癌细胞培养液中，感染细胞，受感染的细胞的EGFP基因可整合至细胞基因组中，形成稳定表达EGFP的细胞，以终浓度4μg/mL嘌呤霉素筛选稳定表达EGFP的细胞，建立得到稳定表达EGFP的肺癌细胞系；
第四步，炎症模型的建立：
① 称取猪胰弹性蛋白酶粉剂0.01g溶于1mL生理盐水中，即为PPE工作液，其中PPE工作液的工作浓度为0.125mg/50μL，适用于重量为20-35g裸鼠，
② 采用胰岛素注射器，将50μL PPE工作液于裸鼠环甲膜处注入裸鼠气管，继续饲养2周，即得到具有肺部炎症的裸鼠，即为炎症模型；
第五步，具有炎症基础的肺癌动物模型的建立：
① 将1×107个稳定表达EGFP的肺癌细胞系，重悬于DMEM培养液中，调整体积为50μL，细胞密度为1×107/50μL，再与50μL Matrigel等体积混合，得到细胞悬液，至于冰上备用，
② 采用胰岛素注射器，将75μL细胞悬液自背部肋间隙注射入具有肺部炎症的裸鼠的左肺，继续饲养2周，即在裸鼠体内建立具有炎症基础的肺癌模型，即为具有炎症基础的肺癌动物模型。
2.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的2)中采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化的具体步骤是：
①在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；
②将凝胶放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3 个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃ 加热，间断混合直至凝胶块完全熔化；
③再加入0.5 个凝胶体积的Buffer DE-B，混合均匀，得到混合液；
④吸取步骤③中的混合液，转移到DNA 制备管中，将制备管置于2 mL 离心管中，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑤将制备管置回2 mL 离心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g 离心力下离心30s，弃滤液；
⑥再将制备管置回2 mL 离心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 离心力下离心30 s，弃滤液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 离心力下离心1 min，弃滤液；
⑦将制备管置回2mL 离心管中，在12,000×g 离心力下离心1 min；
⑧将制备管置于洁净的1.5 mL 离心管中，在制备膜中央加入25-30 μL Eluent 或去离子水，室温静置1 min，在12,000×g 离心力下离心1min 洗脱DNA，即完成纯化。
3.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的4) 中采用AxyPrep PCR 清洁试剂盒进行纯化的具体步骤是：
① 在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加3个体积的Buffer PCR-A，Buffer PCR-A，不足100 μL时加至100 μL，接着混匀，转移到制备管中，将制备管置于2 mL离心管中，12,000×g 离心1 min，弃滤液；
② 将制备管置回2 mL离心管，加700 μLBuffer W2，12,000×g 离心1 min，弃滤液；
③ 将制备管置于离心管中，将制备管置回 2 mL离心管，加 400 μL Buffer W2，12,000×g 离心1 min；
④ 将制备管置于洁净的1.5 mL离心管中，在制备管膜中央加25-30 μLEluent或去离子水，室温静置1 min，12,000×g 离心1 min 洗脱DNA。
4.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的7)中将纯化后的CMV-EGFP酶切产物与纯化后的pBabe-puro酶切产物进行连接的具体步骤是：
①将50 ng纯化后的pBabe-puro酶切产物和3倍摩尔量的纯化后的CMV-EGFP酶切产物混合，加蒸馏水至总体积为10 µl；
②加入10 µl 2×Quick Ligation Buffer，混匀；
③加入1 µl Quick T4 DNA连接酶，混匀；
④在室温下作用5分钟后即得连接产物，链接产物贮存于-20℃的环境中。
5.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的8)中抗性删选的具体步骤是：
①取一管感受态大肠杆菌细胞，在冰上溶解后加入3μL连接产物，混匀，冰浴30min；
②将管静置于42℃中水浴90s后，迅速转移至冰中，冰浴1-2min；
③在管中加入900 μL LB，在37℃中水浴10min；
④将管置于摇床中，在37℃、转速210 rpm下摇菌45min；
⑤将100 μL已转化的细胞涂布于氨苄青霉素平板上；
⑥倒置平板，在37℃培养16-20h，即完成抗性筛选。
6.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的9)中阳性克隆筛选的具体步骤是：
(1) 菌落PCR筛选：
挑取单克隆菌落，置于300μL含氨苄青霉素的LB中，在37℃、转速280 rpm下摇菌 6-8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTAR HS DNA polymerase进行PCR筛选，得到菌落PCR结果阳性的克隆；
(2) 酶切鉴定：
取菌落PCR结果阳性的克隆，采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒，并采用BamHI和EcoRI限制性内切酶进行酶切，能切出1400bp片段的即为酶切鉴定阳性的克隆；
(3) 测序鉴定：
取酶切鉴定阳性的克隆，进行测序，测序结果采用Clustalx软件与EGFP序列进行比对，序列匹配即构建成功，即得到pBabe-CMV-EGFP-puro质粒。
7.根据权利要求5所述的一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述(2)中采用质粒小量DNA提取试剂盒提取质粒的具体步骤是：
①取1-4 mL在LB培养基中培养过夜的菌落PCR结果阳性的克隆的菌液，在12,000×g离心力下离心1 min，弃尽上清液；
②加入250 μL Buffer S1 悬浮细菌进行沉淀；
③加入250 μL Buffer S2，上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；
④加350 μL Buffer S3，上下翻转混合6-8次，在12,000×g离心力下离心10 min；
⑤吸取步骤④中的离心上清液并转移到制备管中，将制备管置于2 mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑥将制备管置回离心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑦将制备管置回离心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g离心力下离心1 min，弃滤液；
⑧将制备管置回2 mL离心管中，在12,000×g离心力下离心1 min；
⑨将制备管移入1.5 mL离心管中，在制备管膜中央加60-80 μL Eluent或去离子水，室温静置1 min，在12,000×g离心力下离心1 min，即完成质粒的提取。
8.根据权利要求1所述的一种具有炎症基础的肺癌动物模型的建立方法，其特征在于所述第二步中逆转录病毒介导的EGFP过表达系统建立的具体步骤是：
①接种293T细胞至汇合度为70-90%时转染；
②使用无血清培养基稀释Lipofectamine 3000试剂；
③使用无血清培养基稀释pBabe-CMV-EGFP-puro质粒、VSVG质粒和pMDL g/p RRE质粒，然后添加P3000试剂，混匀，得到预混液；
④在已稀释的Lipofectamine 3000试剂中加入等量的预混液，室温孵育5min，得到DNA-脂质体复合物；
⑤将DNA-脂质体复合物加入细胞培养液中；
⑥转染后培养24、48、72h，分别收集富含逆转录病毒颗粒的上清液，上清液通过超离心浓缩病毒，即得到逆转录病毒介导的EGFP过表达系统。
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