CN105463023A - 一种猪札幌病毒抗原的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪札幌病毒抗原的制备方法，以SaV？CH430株的RNA为模板，通过RT-PCR扩增出全衣壳蛋白VP1基因，将其克隆到真核表达载体pFastBacTMHTB中，并将成功构建的阳性质粒转入含有DH10杆状病毒骨架的感受态细胞中，通过含有卡那霉素、庆大霉素、四环素三种抗性的培养基筛选出携带SaV？VP1基因的重组杆状病毒质粒的细胞，将获得的携带SaV？VP1基因的重组杆状病毒质粒转染sf9细胞得到P1代杆状病毒和P2代杆状病毒，将P2代病毒液感染sf9细胞，72h后收获细胞，获得猪札幌病毒VP1衣壳蛋白以及组装的病毒样颗粒抗原(VLP)，VLP与PoSaV天然病毒结构相似。通过本发明可以获得PoSaV？VP1蛋白及其VLP抗原，为亚单位疫苗的研究奠定了基础。

Description

一种猪札幌病毒抗原的制备方法
技术领域
本领域涉及生物医药领域，具体涉及一种猪札幌病毒抗原的制备方法。
背景技术
在仔猪中，SaV引起严重的病毒性肠胃炎，尤其是在集中养殖区一旦临床症状出现危害就比较严重，同时会造成一定的经济损失，并对公众健康构成潜在威胁。到现在为止，还没有合适的细胞系能用于培养目前的流行毒株，无法大量获得该病毒抗原，也就没有疫苗成功地防治该病，因此，如何获得价廉、高效的抗原对于猪札幌病毒防制具有重要意义。迄今为止，已经有一些VLP疫苗得到商品化和商业许可。这就意味着，新疫苗的开发显得尤为迫切。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种猪札幌病毒抗原的制备方法，以获得猪札幌病毒的主要抗原衣壳蛋白VP1及其病毒样颗粒抗原，并且为亚单位疫苗的研究奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪札幌病毒抗原的制备方法，包括如下步骤：
S1以SaVCH430株的RNA为模板，通过RT-PCR扩增出全衣壳蛋白VP1基因；
S2将步骤S1得到的VP1基因克隆到真核表达载体pFastBacTMHTB中，构建阳性重组质粒；
S3将步骤S2中成功构建的阳性重组质粒转入含有DH10杆状病毒骨架的感受态细胞中，然后通过含有卡那霉素、庆大霉素、四环素三种抗性的培养基筛选出阳性菌株，再通过M13引物鉴定得到阳性重组杆状病毒质粒；
S4将步骤S3得到的阳性重组杆状病毒质粒转染sf9细胞，收集病变细胞上清作为P1代病毒液，再将P1代病毒液感染sf9细胞，制备P2代病毒液；
S5将P2代病毒液感染sf9细胞，72h后收获细胞上清，通过蔗糖密度梯度离心纯化，得到猪札幌病毒VP1衣壳蛋白及病毒样颗粒抗原。
需要说明的是，步骤S1中，扩增VP1基因的特异性引物序列如下：
VP1-fw：5′-CGGGATCCATGGAGGCGCCTGCCC-3′
VP1-rev：5′-GCGTCGACTCATCGTGAGCTGTGAAGGGAC-3′。
需要说明的是，步骤S2的具体方法为：
2.1)将步骤S1得到的VP1纯化回收后与pMD19-Tsimple连接转化入JM109感受态细胞内，挑取单个菌落培养后提质粒进行PCR以及酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒命名为VP1-Tsimple，并和载体pFastBacTMHTB用BamHI和SalI酶切，回收VP1和线性化载体pFastBacTMHTB；
2.2)用T4连接酶将步骤2.1)的回收产物连接并转入JM109感受态细胞中，再进行酶切和PCR鉴定，将初步鉴定为阳性的重组质粒进行测序鉴定，并且将阳性的重组质粒命名为pFastBacTMHTB-SaV-VP1。
需要说明的是，步骤S3具体实施如下：
3.1)在冰上解冻DH10Bac感受态细胞；
3.2)加入步骤S2最终成功构建到的阳性重组质粒至感受态细胞中，轻轻混匀，然后冰孵30分钟，在42℃热激细胞45秒后，立即转移至冰上，冷却2分钟；
3.3)添加900μL的室温S.O.C.培养基，37℃下，225rpm振荡试管4小时；
3.4)使用S.O.C.培养基制备10倍连续稀释的步骤3.3)中得到的细胞，稀释度分别为10-1、10-2、10-3；
3.5)将步骤3.4)中得到的各种稀释度的细胞各取100μL分别接种在含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mLBluo-gal和40μg/mLIPTG的LB琼脂板上，37℃培养至由单个菌落生成并观察蓝白斑的生长情况，发生转座后的DH10Bac因其LacZ基因被插入失活，而使含有杆状病毒质粒(Bacmid)的大肠杆菌菌落成为白色；挑取单个白色菌落提取重组杆状病毒质粒DNA，并用PCR的方法进行鉴定，引物为M13，鉴定正确的阳性重组杆状病毒质粒命名为DH10-VP1。
需要说明的是，步骤S3中的M13引物序列如下：
M13-fw：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′
M13-rev：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。
需要说明的是，步骤S4的具体方法如下：
4.1)使用不含添加剂的Grace昆虫培养基将sf9细胞培养在直径为15mm的培养皿上，室温贴壁1小时；
4.2)混匀CellfectionII转染试剂，取8μL稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中，轻轻混匀，室温下放置30分钟；
4.3)取1μg步骤S3得到的阳性重组杆状病毒质粒稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中，轻轻混匀；然后将稀释后的阳性重组杆状病毒质粒与步骤4.2)所得的稀释的CellfectionII混合，轻轻混匀并在室温下孵育15-30分钟，得到转染混合物；
4.4)逐滴将步骤4.3)中所得的转染混合物加入至步骤4.1)室温贴壁的细胞中，28℃孵育细胞3-5小时；
4.5)吸出转染混合物加入2mL完全培养基在28℃孵育细胞72小时，直至观察到病毒感染现象；
4.6)将培养基上清收集离心后作为P1代病毒液4℃避光保存或-80℃长期保存；
4.7)将P1代病毒液感染sf9细胞，制备P2代病毒液。
需要说明的是，步骤S5的具体方法如下：
5.1)将sf9细胞培养在175cm2细胞培养瓶中，并感染步骤S4中所得的P2代病毒液；
5.2)将细胞冻融三次后超声破碎，经处理后的细胞裂解液在5000rpm离心30分钟，离心两次后收集上清，经过0.45μm的滤器过滤，离心后收集上清，并分别加入1mL上清至2mL20％、2mL30％、3mL45％、3mL60％的蔗糖密度梯度中，35000rpm4℃离心3小时，得到的产物即为猪札幌病毒VP1衣壳蛋白及其病毒样颗粒抗原(VLPs)。
本发明的有益效果在于：VP1是SaV的衣壳蛋白，可以同时诱发机体的体液免疫与细胞免疫，本发明提供了一种有效的猪札幌病毒抗原的制备方法，利用昆虫杆状病毒表达系统可以获得猪札幌病毒的主要抗原衣壳蛋白VP1及其病毒样颗粒抗原(VLPs)，对于该病的防制具有重要意义，并且为亚单位疫苗的研究奠定了基础；经过实验证明通过本发明方法制备的病毒样颗粒与PoSaV天然病毒结构相似。
附图说明
图1为重组克隆质粒pFastBacTMHTB-SaV-VP1的双酶切(BamHI和Sa1I)和PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析结果示意图；
图2为重组杆状病毒以M13通用引物进行PCR扩增结果示意图；
图3为转染后sf9细胞的变化示意图，其中，图3(a)所示为正常细胞，图3(b)所示为病变细胞(72h)，图3(c)所示为病变后期(120h以后)；
图4为Western-Blot以及免疫荧光检测示意图；
图5为抗VP1单抗检测示意图，其中，图5(a)所示为野生型病毒感染sf9细胞，图5(b)所示为DH10-VP1重组杆状病毒P2代毒感染的sf9细胞；
图6为对重组病毒纯化后的蛋白样品进行电镜观察结果示意图，其中图6(a)和图6(b)均为在电镜下观察到的病毒样颗粒示意图；
图7为动物实验结果示意图，其中图7(a)所示为免疫后groupA和groupB的平均抗体生成情况，图7(b)所示为groupA的5只小猪抗体效价的测定结果。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
一种猪札幌病毒抗原的制备方法，包括如下步骤：
S1以SaVCH430株的RNA为模板，通过RT-PCR扩增出全衣壳蛋白VP1基因；
S2将步骤S1得到的VP1基因克隆到真核表达载体pFastBacTMHTB中，构建阳性重组质粒；
S3将步骤S2中成功构建的阳性重组质粒转入含有DH10杆状病毒骨架的感受态细胞中，然后通过含有卡那霉素、庆大霉素、四环素三种抗性的培养基筛选出阳性菌株，再通过M13引物鉴定得到阳性重组杆状病毒质粒；
S4将步骤S3得到的阳性重组杆状病毒质粒转染sf9细胞，收集病变细胞上清作为P1代病毒液，再将P1代病毒液感染sf9细胞，制备P2代病毒液；
S5将P2代病毒液感染sf9细胞，72h后收获细胞上清，通过蔗糖密度梯度离心纯化，得到猪札幌病毒VP1衣壳蛋白及病毒样颗粒抗原。
需要说明的是，步骤S1中，扩增VP1基因的特异性引物序列如下：
VP1-fw：5′-CGGGATCCATGGAGGCGCCTGCCC-3′
VP1-rev：5′-GCGTCGACTCATCGTGAGCTGTGAAGGGAC-3′。
需要说明的是，步骤S2的具体方法为：
2.1)将步骤S1得到的VP1纯化回收后与pMD19-Tsimple连接转化入JM109感受态细胞内，挑取单个菌落培养后提质粒进行PCR以及酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒命名为VP1-Tsimple，并和载体pFastBacTMHTB用BamHI和Sa1I酶切，回收VP1和线性化载体pFastBacTMHTB；
2.2)用T4连接酶将步骤2.1)的回收产物连接并转入JM109感受态细胞中，再进行酶切和PCR鉴定，将初步鉴定为阳性的重组质粒进行测序鉴定，并且将阳性的重组质粒命名为pFastBacTMHTB-SaV-VP1。
需要说明的是，步骤S3具体实施如下：
3.1)在冰上解冻DH10Bac感受态细胞；
3.2)加入步骤S2最终成功构建到的阳性重组质粒至感受态细胞中，轻轻混匀，然后冰孵30分钟，在42℃热激细胞45秒后，立即转移至冰上，冷却2分钟；
3.3)添加900μL的室温S.O.C.培养基，37℃下，225rpm振荡试管4小时；
3.4)使用S.O.C.培养基制备10倍连续稀释的步骤3.3)中得到的细胞，稀释度分别为10-1、10-2、10-3；
3.5)将步骤3.4)中得到的各种稀释度的细胞各取100μL分别接种在含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mLBluo-gal和40μg/mLIPTG的LB琼脂板上，37℃培养至由单个菌落生成并观察蓝白斑的生长情况，发生转座后的DH10Bac因其LacZ基因被插入失活，而使含有杆状病毒质粒(Bacmid)的大肠杆菌菌落成为白色；挑取单个白色菌落提取重组杆状病毒质粒DNA，并用PCR的方法进行鉴定，引物为M13，鉴定正确的阳性重组杆状病毒质粒命名为DH10-VP1。
需要说明的是，步骤S3中的M13引物序列如下：
M13-fw：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′
M13-rev：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。
需要说明的是，步骤S4的具体方法如下：
4.1)使用不含添加剂的Grace昆虫培养基将sf9细胞培养在直径为15mm的培养皿上，室温贴壁1小时；
4.2)混匀CellfectionII转染试剂，取8μL稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中，轻轻混匀，室温下放置30分钟；
4.3)取1μg步骤S3得到的阳性重组杆状病毒质粒稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中，轻轻混匀；然后将稀释后的阳性重组杆状病毒质粒与步骤4.2)所得的稀释的CellfectionII混合，轻轻混匀并在室温下孵育15-30分钟，得到转染混合物；
4.4)逐滴将步骤4.3)中所得的转染混合物加入至步骤4.1)室温贴壁的细胞中，28℃孵育细胞3-5小时；
4.5)吸出转染混合物加入2mL完全培养基在28℃孵育细胞72小时，直至观察到病毒感染现象；
4.6)将培养基上清收集离心后作为P1代病毒液4℃避光保存或-80℃长期保存；
4.7)将P1代病毒液感染sf9细胞，制备P2代病毒液。
需要说明的是，步骤S5的具体方法如下：
5.1)将sf9细胞培养在175cm2细胞培养瓶中，并感染步骤S4中所得的P2代病毒液；
5.2)将细胞冻融三次后超声破碎，经处理后的细胞裂解液在5000rpm离心30分钟，离心两次后收集上清，经过0.45μm的滤器过滤，离心后收集上清，并分别加入1mL上清至2mL20％、2mL30％、3mL45％、3mL60％的蔗糖密度梯度中，35000rpm4℃离心3小时，得到的产物即为猪札幌病毒VP1衣壳蛋白及其病毒样颗粒抗原(VLPs)。
以下将通过实验对本发明的性能作进一步的描述。
一、材料和方法
1、载体和细胞
pFastBacTMHTB、DH10杆状病毒感受态细胞；
2、主要试剂
RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司，PrimeScriptTMOnestepRT-PCRKit，2×PCRSolutionPremixTaq及JM109感受态细胞、T-VectorpMD19(simple)为大连宝生物公司(Takara)产品；彩色预染蛋白Marker以及5×蛋白上样buffer均购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自AXYGEN公司；核酸Marker及限制性内切酶T4DNA连接酶购自NEB公司；猪札幌病毒衣壳蛋白VP1的单克隆抗体由北京金唯智生物科技有限公司制备；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔的免疫球蛋白IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；昆虫细胞培养基Sf-900IISFM和杆状病毒转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；其余常规试剂均为实验室分析纯试剂。
3、引物
扩增VP1基因的特异性引物序列如下：
VP1-fw：5′-CGGGATCCATGGAGGCGCCTGCCC-3′
VP1-rev：5′-GCGTCGACTCATCGTGAGCTGTGAAGGGAC-3′
M13引物序列如下：
M13-fw：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′
M13-rev：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。
4、重组转移载体的构建
以SaVCH430株的RNA为模板，通过RT-PCR扩增出全衣壳蛋白VP1基因；
VP1纯化回收后与pMD19-Tsimple连接转化入JM109感受态细胞内，挑取单个菌落培养后提质粒进行PCR以及酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒命名为VP1-Tsimple，并和载体pFastBacTMHTB用BamHI和Sa1I酶切，回收VP1和线性化载体pFastBacTMHTB；用T4连接酶将回收产物连接并转入JM109感受态细胞中，再进行酶切和PCR鉴定，将初步鉴定为阳性的重组质粒进行测序鉴定，并且将阳性的重组质粒命名为pFastBacTMHTB-SaV-VP1。
5、重组杆状病毒的构建以及转染昆虫细胞
在冰上解冻MAXDH10BacTM感受态细胞。加入适量的阳性质粒pFastBacTMHTB-SaV-VP1至感受态细胞中，轻轻混匀。冰孵细胞30分钟，在42℃热激细胞45秒后，立即将试管转移至冰上，冷却2分钟。添加900μl的室温S.O.C.培养基37℃下，225rpm振荡试管4小时。使用S.O.C.培养基制备10倍连续稀释的细胞(10-1、10-2、10-3)。
将100μl各种稀释度的细胞接种在含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mLBluo-ga1和40μg/mLIPTG的LB琼脂板上，37℃培养至由单个菌落生成并观察蓝白斑的生长情况，发生转座后的DH10Bac因其LacZ基因被插入失活，而使含有Bacmid的大肠杆菌菌落成为白色。挑取单个白色菌落提取重组BacmidDNA，并用PCR的方法进行鉴定，引物为M13。鉴定正确的阳性重组Bacmid命名为DH10-VP1。
使用不含添加剂的Grace昆虫培养基将sf9细胞培养在直径为15mm的培养皿，室温贴壁1小时。混匀CellfectionII转染试剂，取8μL稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中，轻轻混匀，室温下放置30分钟。取1μgDH10-VP1稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中，轻轻混匀。然后将稀释后的DH10-VP1与稀释的CellfectionII混合，轻轻混匀并在室温下孵育15-30分钟。逐滴加入转染混合物至之前室温贴壁的细胞中，28℃孵育细胞3-5小时。之后吸出转染混合物加入2mL完全培养基在28度孵育细胞72小时，直至观察到病毒感染现象。将培养基上清收集离心后作为P1代病毒液4℃避光保存或-80℃长期保存。
6、重组杆状病毒的TCID50测定
将阳性质粒转染sf9细胞5天后，收集病变细胞上清作为P1代病毒液，再将P1代病毒储液感染sf9细胞，制备P2代病毒液。在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。然后，将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μl。在每孔加入sf9细胞悬液100μl，使细胞量达到2-3×105个/mL。设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。(100μl生长液+100μl细胞悬液)。逐日观察病变孔数并记录结果，观察5-7天。结果按Reed-Muench两氏法计算并分析。
7、重组蛋白表达的检测
将病变细胞冻融三次，并超声破碎5min，5000rpm离心30min，离心两次后取上清进行SDS-PAGE电泳，然后用湿转仪电流180mA3h电转印至NC膜上，从阳极到阴极的顺序按四层滤纸、NC膜、凝胶块、四层滤纸的顺序摆放整齐，转印完后用5％脱脂奶粉中室温封闭3h，TBST洗膜3-4次(每次10min)，然后用1∶2000稀释的单克隆抗体室温孵育2h，TBST洗膜3-4次(每次10min)，再用1∶5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠的免疫球蛋白IgG室温孵育1.5h，最后用ECL的方法底物显色。
为了确认VP1蛋白的表达以及目的蛋白的定位，将病变96h的Sf9细胞用PBS洗4次，并固定在4％多聚甲醛20min。洗涤四次后用0.1％的TritonX-100穿孔15min，洗涤后。用VP1蛋白单克隆抗体(1∶1000)孵育1h洗涤。然后，用FITC标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗孵育(1∶5000)1h，洗涤四次后通过荧光显微镜进行分析。
8、病毒样颗粒抗原(VLPa)的纯化以及电镜观察
将sf9细胞培养在175cm2细胞培养瓶中，并P2代病毒液。将细胞冻融三次后超声破碎，经处理后的细胞裂解液在5000rpm离心30分钟，离心两次后收集上清，经过0.45μm的滤器过滤，离心后收集上清1mL加入2毫升20％，2毫升30％，3毫升45％，3毫升60％蔗糖密度梯度中，35000rpm4℃离心3小时。将离心后的样品平均分成10份，并通过Western-blot对每层进行分析。取2μL待测液滴于使用福尔膜制成的铜网，吸附1min，滤纸吸除剩余液，2％磷钨酸钠(pH7.0)负染2min，应用JEM100-CXII在电压100KV下观察。
9、免疫以及攻毒实验
将sf9细胞粗提物与相同体积的免疫佐剂ISA206混合乳化，颈部注射健康的2-3周龄乳猪。实验设为两组：VLP120μg(groupA，n＝5)和PBS(B组，n＝5)，首次免疫14天后加强免疫一次。分别在0、7、14、21、28、35天收集血清，用ELISA方法检测特异性的抗体的生成。一个月后，将免疫后和未免疫的两组小猪进行病毒悬液灌服，每只小猪2mL(1mL病毒悬+1mLPBS)。然后，分别在灌服前(0天)和灌服后(1天-7天)收集这10只小猪粪便放于离心管中。收集80份样品后，将粪便用适量的PBS稀释，用试剂盒提取RNA(QIAGEN)，通过一步法PCR进行病毒扩增检测，扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测攻毒后10只小猪的排毒情况(内引物扩增产物为265bp，外引物扩增产物为845bp)，并将实验结果进行分析。
二、结果
2.1转移载体的构建
如图1所示，重组克隆质粒pFastBacTMHTB-SaV-VP1的双酶切(BamHI和SalI)和PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见的目的基因片段(1635bp)和载体片段(4856bp)，大小与预期相符，经测序结果与GenBank中登录的已知序列一致。图1中，M表示DL5000DNAMarker，1表示pFastBacTMHTB-SaV-VP1酶切鉴定，2表示pFastBacTMHTB-SaV-VP1PCR鉴定。
2.2重组后PCR鉴定
如图2所示，重组杆状病毒以M13通用引物进行PCR扩增，可见约4000bp左右的片段，大小均与理论值一致。阴性Bacmid扩增结果为300bp。图2中，M表示DL5000DNAMarker，1表示DH10空杆粒PCR结果，2表示DH10-VP1PCR鉴定。
2.3转染后sf9细胞的变化
如图3所示，转染后，病变细胞早期细胞直径变大，细胞核体积变大，可以观察到细胞直径增大25-50％，细胞核充满整个细胞。到病变后期细胞生长停滞，病毒出现出芽征象；细胞呈囊泡状。细胞从培养板或培养瓶上解离下来。病变5天以后，细胞开始裂解，单层细胞出现透明征象。其中，图3(a)所示为正常细胞，图3(b)所示为病变细胞(72h)，图3(c)所示为病变后期(120h以后)。
2.4Western-Blot以及免疫荧光检测
如图4所示，检测结果显示，表达的VP1蛋白可与抗SaV-VP1单克隆抗体发生特异性反应，在相对分子质量约58-61kDa处可见反应条带，与目的蛋白大小一致。其中，1表示收集的冻融三次后的P3代病变细胞(即感染P2代病毒液后的病变细胞)，2表示收集的P3代病变细胞培养基上清，3表示正常的培养基，4表示冻融三次后的正常细胞，5表示空DH10杆状病毒转染后病变细胞，6表示收集的冻融三次并超声破碎后的P3代病变细胞。
如图5所示，P2代DH10-VP1杆状病毒感染的细胞用抗VP1单抗检测有特异的绿色荧光产生，而对应的野生型病毒感染对照细胞没有检测到绿色荧光，说明VP1在sf9细胞中得到了表达。其中，图5(a)所示为野生型病毒感染sf9细胞，图5(b)所示为DH10-VP1重组杆状病毒P2代毒感染的sf9细胞。
2.5电镜
如图6(a)和图6(b)所示，对重组病毒纯化后的蛋白样品进行电镜观察，发现明显的病毒样颗粒(VLPs)。中间呈现空心状，病毒样颗粒的边缘表面具有刺状突起结构，整个VLP结构完整，与天然的形态、大小皆相似(38-43nm)。
2.6动物实验结果
如图7(a)和图7(b)所示，免疫组groupA的5只小猪均可以在一定时间内产生特异性抗体，对照组groupB的5只小猪血清呈阴性。免疫组抗体效价均可达到28左右，说明制备的VLPs粗提物可以产生针对PoSaVVP1的特异性抗体。攻毒后，免疫组groupA在三天后可以抑制病毒在肠道内的复制，而对照组则连续7天均排毒。
三、讨论
在仔猪中，SaV引起严重的病毒性肠胃炎，尤其是在集中养殖区一旦临床症状出现危害是比较严重的，同时会造成一定的经济损失，以及对公众健康构成潜在威胁。VP1是SaV的衣壳蛋白，不仅可以起到保护病毒核酸作用，而且可以同时诱发机体的体液免疫与细胞免疫。到现在为止，没有合适的细胞系对病毒进行培养，因此，还没有疫苗成功地防治该病，对更便宜和好免疫原性的PoSaV疫苗还有迫切的需求。此外，传统的灭活疫苗改变了病毒的抗原表位，从而降低了免疫原性并导致其他潜在问题。有一些VLP疫苗已经得到商品化和商业许可。这就意味着，新疫苗的开发显得尤为迫切。
本发明通过杆状病毒表达系统在sf9细胞中成功产生了PoSaV的VLP。通过共聚焦显微镜可以观察到病变后的sf9细胞核变大，VP1蛋白主要在细胞质中均匀分布。通过透射电镜可以明显的观察到胞内组装的SaV-VLP，与天然病毒粒子大小相近，并且模拟天然病毒结构。在动物实验中，通过ELISA方法检测到了特异性抗体的产生，说明VLP免疫仔猪，能够在第2次免疫后激发机体体液免疫，并在一定时间内达到较高的抗体效价。
病毒抑制实验表明，注射了VLP的仔猪产生了中和抗体，免疫组所有仔猪均在3天左右的时间抑制了病毒的侵染和复制，而对照组所有仔猪从第2天开始连续七天均排毒。中和抗体是病毒进入细胞前破坏病毒颗粒的。从而表明，VLP刺激机体产生的中和抗体能够阻止机体组织与病毒表面的抗原结合，阻止病毒黏附靶细胞受体，防止侵入细胞，从而起到保护的作用。本发明旨在研制出在短时间内能够产生高效价的中和抗体的疫苗。SaV-VLP疫苗对于PoSaV的防治具有良好的前景，可以作为预防PoSaV的疫苗之一。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种想要的改变和变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种猪札幌病毒抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1以SaVCH430株的RNA为模板，通过RT-PCR扩增出全衣壳蛋白VP1基因；
S2将步骤S1得到的VP1基因克隆到真核表达载体pFastBacTMHTB中，构建阳性重组质粒；
S3将步骤S2中成功构建的阳性重组质粒转入到含有DH10杆状病毒骨架的感受态细胞中，然后通过含有卡那霉素、庆大霉素、四环素三种抗性的培养基筛选出阳性菌株，再通过M13引物鉴定得到阳性重组杆状病毒质粒，命名为DH10-VP1；
S4将步骤S3得到的阳性重组杆状病毒质粒DH10-VP1转染sf9细胞，收集病变细胞上清作为P1代病毒液，再将P1代病毒液感染sf9细胞，制备P2代病毒液；
S5将P2代病毒液感染sf9细胞，72h后收获细胞上清，通过蔗糖密度梯度离心纯化，得到猪札幌病毒VP1衣壳蛋白及病毒样颗粒抗原。
2.根据权利要求1所述的猪札幌病毒抗原的制备方法，其特征在于，步骤S1中，扩增VP1基因的特异性引物序列如下：
VP1-fw：5′-CGGGATCCATGGAGGCGCCTGCCC-3′
VP1-rev：5′-GCGTCGACTCATCGTGAGCTGTGAAGGGAC-3′。
3.根据权利要求1所述的猪札幌病毒抗原的制备方法，其特征在于，步骤S2的具体方法为：
2.1)将步骤S1得到的VP1纯化回收后与pMD19-Tsimple连接转化入JM109感受态细胞内，挑取单个菌落培养后提质粒进行PCR以及酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒命名为VP1-Tsimple，并和载体pFastBacTMHTB用BamHI和SalT酶切，回收VP1和线性化载体pFastBacTMHTB；
2.2)用T4连接酶将步骤2.1)的回收产物连接并转入JM109感受态细胞中，再进行酶切和PCR鉴定，将初步鉴定为阳性的重组质粒进行测序鉴定，并且将阳性的重组质粒命名为pFastBacTMHTB-SaV-VP1。
4.根据权利要求1所述的猪札幌病毒抗原的制备方法，其特征在于，步骤S3具体实施如下：
3.1)在冰上解冻DH10Bac感受态细胞；
3.2)加入步骤S2最终成功构建到的阳性重组质粒至感受态细胞中，轻轻混匀，然后冰孵30分钟，在42℃热激细胞45秒后，立即转移至冰上，冷却2分钟；
3.3)添加900μL的室温S.O.C.培养基，37℃下，225rpm振荡试管4小时；
3.4)使用S.O.C.培养基制备10倍连续稀释的步骤3.3)中得到的细胞，稀释度分别为10-1、10-2、10-3；
3.5)将步骤3.4)中得到的各种稀释度的细胞各取100μL分别接种在含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mLBluo-gal和40μg/mLIPTG的LB琼脂板上，37℃培养至由单个菌落生成并观察蓝白斑的生长情况，发生转座后的DH10Bac因其LacZ基因被插入失活，而使含有杆状病毒质粒(Bacmid)的大肠杆菌菌落成为白色；挑取单个白色菌落提取重组杆状病毒质粒DNA，并用PCR的方法进行鉴定，引物为M13，鉴定正确的阳性重组杆状病毒质粒命名为DH10-VP1。
5.根据权利要求1或4所述的猪札幌病毒抗原的制备方法，其特征在于，步骤S3中的M13引物序列如下：
M13-fw：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′
M13-rev：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。
6.根据权利要求1所述的猪札幌病毒抗原的制备方法，其特征在于，步骤S4的具体方法如下：
4.1)使用不含添加剂的Grace昆虫培养基将sf9细胞培养在直径为15mm的培养皿上，室温贴壁1小时；
4.2)混匀CellfectionII转染试剂，取8μL稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中，轻轻混匀，室温下放置30分钟；
4.3)取1μg步骤S3得到的阳性重组杆状病毒质粒稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中，轻轻混匀；然后将稀释后的阳性重组杆状病毒质粒与步骤4.2)所得的稀释的CellfectionII混合，轻轻混匀并在室温下孵育15-30分钟，得到转染混合物；
4.4)逐滴将步骤4.3)中所得的转染混合物加入至步骤4.1)室温贴壁的细胞中，28℃孵育细胞3-5小时；
4.5)吸出转染混合物加入2mL完全培养基在28℃孵育细胞72小时，直至观察到病毒感染现象；
4.6)将培养基上清收集离心后作为P1代病毒液4℃避光保存或-80℃长期保存；
4.7)将P1代病毒液感染sf9细胞，制备P2代病毒液。
7.根据权利要求1所述的猪札幌病毒抗原的制备方法，其特征在于，步骤S5的具体方法如下：
5.1)将sf9细胞培养在175cm2细胞培养瓶中，并感染步骤S4中所得的P2代病毒液；
5.2)将细胞冻融三次后超声破碎，经处理后的细胞裂解液在5000rpm离心30分钟，离心两次后收集上清，经过0.45μm的滤器过滤，离心后收集上清，并分别加入1mL上清至2mL20％、2mL30％、3mL45％、3mL60％的蔗糖密度梯度中，35000rpm4℃离心3小时，得到的产物即为猪札幌病毒VP1衣壳蛋白及其病毒样颗粒抗原(VLPs)。
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