CN103201286B - 用于诊断和治疗抗间变性淋巴瘤激酶(alk)激酶抑制剂的癌症的方法和组合物 - Google Patents

用于诊断和治疗抗间变性淋巴瘤激酶(alk)激酶抑制剂的癌症的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于诊断和治疗抗至少一种间变性淋巴瘤激酶(ALK)激酶抑制剂的癌症的组合物和方法。本发明基于发现ALK中赋予对至少一种ALK激酶抑制剂的抗性的突变。提供了具有至少一个ALK抑制剂抗性突变的多核苷酸和多肽并且发现在用于诊断、预后和/或治疗ALK活性异常相关疾病，尤其是，抗至少一种ALK激酶抑制剂的疾病的方法和组合物中的用途。还提供了用于鉴定可抑制激酶活性和/或降低ALK抗性突变体的表达水平的试剂的方法和组合物。

Description

用于诊断和治疗抗间变性淋巴瘤激酶(ALK)激酶抑制剂的癌 症的方法和组合物
联邦科研资助研究或开发
本发明是由美国政府支持的基于美国国家健康研究所分部国家癌症研究所授予的授权号CA69129产生。美国政府具有本发明的某些权利。
参考通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表
序列表的正式文本通过EFS-Web作为2011年4月12日创建的文件名为404108SEQLIST.TXT并且大小为951kb的ASCII格式化序列表以电子方式提交并且与说明书同时提交。该ASCII格式化文档中所含的序列表是说明书的一部分并且通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明通常涉及抗间变性淋巴瘤激酶(ALK)激酶抑制剂的癌症的检测和治疗。
发明背景
间变性淋巴瘤激酶(ALK)是在间变性大细胞淋巴瘤中最初鉴定的呈其组成型活化的致癌融合形式之一-核磷酸蛋白(NPM)-ALK的胰岛素受体超家族中的受体酪氨酸激酶(RTK)(Morris等(1994)Science263:1281-1284；Morris等(1997)Oncogene 14:2175-2188)。随后的研究已鉴定了弥漫性大B细胞淋巴瘤、恶性组织细胞增生症、炎性肌纤维母细胞瘤肉瘤、食管鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌和非小细胞肺癌亚类中的ALK融合(查阅Webb等(2009)Expert Rev Anticancer Ther9:331-356)。最近，已经证明ALK的基因组DNA扩增和蛋白质过表达以及激活点突变引起成神经细胞瘤(Webb等(2009)ExpertRevAnticancer Ther 9:331-356；George等(2008)Nature 455:975-979)。除证实ALK活性异常对其有决定性作用的这些癌症外，更多间接联系通过牵涉具有报道的ALK配体、多效生长因子和中期因子的自分泌和/或旁分泌生长环的受体活化机制使ALK牵连于其它恶性肿瘤(例如成胶质细胞瘤)的发生中(Webb等(2009)Expert Rev Anticancer Ther9:331-356)。
在这广泛的癌症中牵涉ALK的组成型活化形式突变体已经引起制药和生物科技公司对研究类似于分别靶向Abelson(ABL)激酶和表皮生长因子受体(EGFR)激酶的小分子激酶抑制剂伊马替尼(Gleevec,Novartis)和埃罗替尼(Tarceva,Genentech/OSI)的ALK抑制剂相当大的兴趣。自2001年以来，美国已经批准将8种ATP竞争性小分子激酶抑制剂(包括伊马替尼和埃罗替尼)用于各种癌症适应证中(查阅Webb等(2009)Expert Rev AnticancerTher 9:331-356)。虽然这些药物已经证实作为抗癌剂极其有价值—也许最好的例子就是在慢性骨髓性白血病(CML)和胃肠道间质瘤(GIST)患者中在施用甲磺酸伊马替尼(Gleevec,Novartis)后实现的疗效，但是这些抑制剂在临床上的使用已经导致抗药性肿瘤的发生(O’Hare等(2007)Blood 110:2242-2249；Engelman和Settleman(2008)Curr OpinGenet Dev 18:1-7；Bikker等(2009)JMed Chem 52:1493-1509)。已将这种抗性归因于许多机制，包括编码致癌激酶的基因扩增以及替代性信号通路的激活；然而，最常见的介导ATP竞争性激酶抑制剂抗性的机制是在激酶靶的激酶催化结构域内或附近发生个别或成群的突变(O’Hare等(2007)Blood110:2242-2249；Engelman和Settleman(2008)Curr OpinGenet Dev18:1-7；Bikker等(2009)J Med Chem 52:1493-1509)。这些突变阻止抑制剂与其激酶靶的高亲和力相互作用，然而使其催化结构域结合的ATP完整。对激酶抑制剂临床抗性的发生和鉴定赋予此类抗性的激酶结构域突变已引起设计和研究后续药物以治疗肿瘤不再对用第一代试剂治疗反应的患者。
对于临床应用而言需要检测ALK激酶结构域中抗性突变的存在的有力诊断测定以确认变得对用ALK激酶抑制剂治疗有抗性的癌症患者的抗性机制，并且允许医师知情选择第二代抑制剂以管理有第一代抑制剂抗性肿瘤的患者。目前不存在检测ALK抑制剂抗性的测定。这些肿瘤的鉴定还将用于指导知情设计和合成发展为抑制抗第一代抑制剂的ALK的这些突变形式的ALK第二代和新一代抑制剂。
发明概述
提供了用于鉴定、预后、诊断和治疗抗ALK激酶抑制剂或从遗传学角度易于抗ALK激酶抑制剂的癌症的组合物和方法。本发明基于在ALK中发现赋予对ALK激酶抑制剂，例如PF-0234166的抗性的新型突变。提供了包含ALK抑制剂抗性突变的多肽和编码所述多肽的多核苷酸并且发现作为生物标记物用于检测抗性突变和诊断那些抗ALK激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症的方法中的用途。本文还提供了特异性结合包含公开的抗性突变的ALK多肽的抗体，包含所述抗体的试剂盒和包含能够特异性检测或特异性扩增编码具有ALK抑制剂抗性突变的ALK的多核苷酸的多核苷酸的试剂盒用于检测生物样品中的抗性突变。进一步提供了鉴定特异性结合包含抗性突变的ALK或ALK致癌融合蛋白和/或抑制其活性的方法。
本发明涵盖以下实施方案：
1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、25、27、29、31、98、100或102中所示的核苷酸序列；
b)编码SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、28、30、32、99、101或103中所示氨基酸序列的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO:5具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:6具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置具有丝氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种间变性淋巴瘤激酶(ALK)小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
d)与SEQ ID NO:7具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:8具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置具有丙氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
e)与SEQ ID NO:9具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:10具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在其与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1129相对应的位置具有缬氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
f)与SEQ ID NO:11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:12具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1132相对应的位置具有赖氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
g)与SEQ ID NO:13具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:14具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1151相对应的位置具有蛋氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
h)与SEQ ID NO:15具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:16具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1156相对应的位置具有酪氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
i)与SEQ ID NO:17具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:18具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有半胱氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
j)与SEQ ID NO:19具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:20具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有异亮氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
k)与SEQ ID NO:21具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:22具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有缬氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
l)与SEQ ID NO:25具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:26具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置具有精氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
m)与SEQ ID NO:27具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:28具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1203相对应的位置具有天冬酰胺残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
n)与SEQ ID NO:29具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:30具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1210相对应的位置具有赖氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
o)与SEQ ID NO:31具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:32具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1269相对应的位置具有丙氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
p)与SEQ ID NO:98具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:99具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1406相对应的位置具有赖氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
q)与SEQ ID NO:100具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:101具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1408相对应的位置具有赖氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；和
r)与SEQ ID NO:102具有至少90%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:103具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有亮氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽。
2.根据实施方案1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)与SEQ ID NO:5具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:6具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置具有丝氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种间变性淋巴瘤激酶(ALK)小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
b)与SEQ ID NO:7具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:8具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置具有丙氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
c)与SEQ ID NO:9具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:10具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在其与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1129相对应的位置具有缬氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
d)与SEQ ID NO:11具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:12具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1132相对应的位置具有赖氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
e)与SEQ ID NO:13具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:14具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1151相对应的位置具有蛋氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
f)与SEQ ID NO:15具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:16具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1156相对应的位置具有酪氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
g)与SEQ ID NO:17具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:18具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有半胱氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
h)与SEQ ID NO:19具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:20具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有异亮氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
i)与SEQ ID NO:21具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:22具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有缬氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
j)与SEQ ID NO:25具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:26具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置具有精氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
k)与SEQ ID NO:27具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:28具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1203相对应的位置具有天冬酰胺残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
l)与SEQ ID NO:29具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:30具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1210相对应的位置具有赖氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
m)与SEQ ID NO:31具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:32具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1269相对应的位置具有丙氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
n)与SEQ ID NO:98具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:99具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1406相对应的位置具有赖氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；
o)与SEQ ID NO:100具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:101具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1408相对应的位置具有赖氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；和，
p)与SEQ ID NO:102具有至少95%序列同一性的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:103具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有亮氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽。
3.根据实施方案1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO:33、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63或104中所示的核苷酸序列；
b)编码SEQ ID NO:34、36、38、40、42、44、46、48、50、54、56、58、60、62、64或105中所示氨基酸序列的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO:33、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63或104具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；和
d)编码具有与SEQ ID NO:34、36、38、40、42、44、46、48、50、54、56、58、60、62、64或105具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽。
4.根据实施方案3所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步包含编码ALK致癌融合蛋白伴侣的核苷酸序列，并且其中所述多核苷酸编码ALK致癌融合蛋白。
5.根据实施方案4所述的分离的多核苷酸，其中所述ALK致癌融合蛋白伴侣选自核磷酸蛋白(NPM)、非肌肉原肌球蛋白3(TPM3)、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、网格蛋白重链(CLTC)、TRK融合基因(TFG)、非肌肉原肌球蛋白4(TPM4)、膜突蛋白(MSN)、Ran结合蛋白2(RanBP2)、棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)、半胱氨酰-tRNA合成酶(CARS)、驱动蛋白家族成员5B(KIF5B)、非肌肉肌球蛋白重链9(MYH9)、SEC31同系物A(SEC31L1)和染色体17(ALO17)上的环指蛋白213(RNF213)/ALK淋巴瘤寡聚伴侣。
6.根据实施方案5所述的分离的多核苷酸，其中所述ALK致癌融合蛋白伴侣具有SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列。
7.根据实施方案1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO:65、67、69、71、73、75、77、79、81、85、87、89、91、93、95或106中所示的核苷酸序列；
b)编码SEQ ID NO:66、68、70、72、74、76、78、80、82、86、88、90、92、94、96或107中所示氨基酸序列的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO:65、67、69、71、73、75、77、79、81、85、87、89、91、93、95或106具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽；和
d)编码具有与SEQ ID NO:66、68、70、72、74、76、78、80、82、86、88、90、92、94、96或107具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述ALK小分子激酶抑制剂选自PF-0234166、NVP-TAE684、星孢菌素、7-羟基星孢菌素、CEP-14083、CEP-14513、CEP-28122、吡啶酮14、吡啶酮15、CRL151104A和WZ-5-126。
9.根据实施方案8所述的分离的多核苷酸，其中所述ALK小分子激酶抑制剂为PF-02341066。
10.一种表达盒，所述表达盒包含根据实施方案1-9中任一项所述与启动子可操作地连接的分离的多核苷酸。
11.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案10所述的表达盒。
12.一种分离的多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、28、30、32、99、101、103中所示的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO:6具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置具有丝氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种间变性淋巴瘤激酶(ALK)小分子激酶抑制剂的激酶活性；
c)与SEQ ID NO:8具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置具有丙氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
d)与SEQ ID NO:10具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1129相对应的位置具有缬氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
e)与SEQ ID NO:12具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1132相对应的位置具有赖氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
f)与SEQ ID NO:14具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1151相对应的位置具有蛋氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
g)与SEQ ID NO:16具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1156相对应的位置具有酪氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
h)与SEQ ID NO:18具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有半胱氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
i)与SEQ ID NO:20具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有异亮氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
j)与SEQ ID NO:22具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有缬氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
k)与SEQ ID NO:26具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置具有精氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
l)与SEQ ID NO:28具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1203相对应的位置具有天冬酰胺残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
m)与SEQ ID NO:30具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1210相对应的位置具有赖氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
n)与SEQ ID NO:32具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1269相对应的位置具有丙氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
o)与SEQ ID NO:99具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1406相对应的位置具有赖氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
p)与SEQ ID NO:101具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1408相对应的位置具有赖氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；和，
q)与SEQ ID NO:103具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有亮氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性。
13.根据实施方案12所述的分离的多肽，其中所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)与SEQ ID NO:6具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置具有丝氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种间变性淋巴瘤激酶(ALK)小分子激酶抑制剂的激酶活性；
b)与SEQ ID NO:8具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置具有丙氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
c)与SEQ ID NO:10具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1129相对应的位置具有缬氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
d)与SEQ ID NO:12具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1132相对应的位置具有赖氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
e)与SEQ ID NO:14具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1151相对应的位置具有蛋氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
f)与SEQ ID NO:16具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1156相对应的位置具有酪氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
g)与SEQ ID NO:18具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有半胱氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
h)与SEQ ID NO:20具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有异亮氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
i)与SEQ ID NO:22具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有缬氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
j)与SEQ ID NO:26具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置具有精氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
k)与SEQ ID NO:28具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1203相对应的位置具有天冬酰胺残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
l)与SEQ ID NO:30具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1210相对应的位置具有赖氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
m)与SEQ ID NO:32具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1269相对应的位置具有丙氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
n)与SEQ ID NO:99具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1406相对应的位置具有赖氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；
o)与SEQ ID NO:101具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1408相对应的位置具有赖氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性；和
p)与SEQ ID NO:103具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置具有亮氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性。
14.根据实施方案12所述的分离的多肽，其中所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:34、36、38、40、42、44、46、48、50、54、56、58、60、62、64或105中所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:34、36、38、40、42、44、46、48、50、54、56、58、60、62、64或105具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性。
15.根据实施方案14所述的分离的多肽，其中所述多肽进一步包含ALK致癌融合蛋白伴侣，从而形成ALK致癌基因融合蛋白。
16.根据实施方案15所述的分离的多肽，其中所述ALK致癌融合蛋白伴侣选自核磷酸蛋白(NPM)、非肌肉原肌球蛋白3(TPM3)、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、网格蛋白重链(CLTC)、TRK融合基因(TFG)、非肌肉原肌球蛋白4(TPM4)、膜突蛋白(MSN)、Ran结合蛋白2(RanBP2)、棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)、半胱氨酰-tRNA合成酶(CARS)、驱动蛋白家族成员5B(KIF5B)、非肌肉肌球蛋白重链9(MYH9)、SEC31同系物A(SEC31L1)和染色体17(ALO17)上的环指蛋白213(RNF213)/ALK淋巴瘤寡聚伴侣。
17.根据实施方案16所述的分离的多肽，其中所述ALK致癌融合蛋白伴侣具有SEQID NO:97中所示的氨基酸序列。
18.根据实施方案12所述的分离的多肽，其中所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:66、68、70、72、74、76、78、80、82、86、88、90、92、94、96或107中所示氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:66、68、70、72、74、76、78、80、82、86、88、90、92、94、96或107具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性。
19.根据实施方案12-18中任一项所述的分离的多肽，其中所述ALK小分子激酶抑制剂选自PF-0234166、NVP-TAE684、星孢菌素、7-羟基星孢菌素、CEP-14083、CEP-14513、CEP-28122、吡啶酮14、吡啶酮15、CRL151104A和WZ-5-126。
20.根据实施方案19所述的分离的多肽，其中所述ALK小分子激酶抑制剂为PF-02341066。
21.一种已被改变为表达抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的ALK抗性突变体多肽的非人转基因动物，其中所述ALK抗性突变体多肽具有至少一个选自以下的ALK激酶抑制剂抗性突变体残基：
a)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丝氨酸残基；
b)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丙氨酸残基；
c)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1129相对应的位置的缬氨酸残基；
d)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1132相对应的位置的赖氨酸残基；
e)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1151相对应的位置的蛋氨酸残基；
f)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1156相对应的位置的酪氨酸残基；
g)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的半胱氨酸残基；
h)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的异亮氨酸残基；
i)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的缬氨酸残基；
j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的亮氨酸残基；
k)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置的精氨酸残基；
l)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1203相对应的位置的天冬酰胺残基；
m)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1210相对应的位置的赖氨酸残基；
n)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1269相对应的位置的丙氨酸残基；
o)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1406相对应的位置的赖氨酸残基；和
p)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1408相对应的位置的赖氨酸残基。
22.一种特异性结合抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的ALK抗性突变体多肽的抗体，其中所述ALK抗性突变体多肽具有至少一个选自以下的ALK激酶抑制剂抗性突变体残基：
a)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丝氨酸残基；
b)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丙氨酸残基；
c)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1129相对应的位置的缬氨酸残基；
d)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1132相对应的位置的赖氨酸残基；
e)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1151相对应的位置的蛋氨酸残基；
f)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1156相对应的位置的酪氨酸残基；
g)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的半胱氨酸残基；
h)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的异亮氨酸残基；
i)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的缬氨酸残基；
j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的亮氨酸残基；
k)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置的精氨酸残基；
l)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1203相对应的位置的天冬酰胺残基；
m)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1210相对应的位置的赖氨酸残基；
n)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1269相对应的位置的丙氨酸残基；
o)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1406相对应的位置的赖氨酸残基；和，
p)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1408相对应的位置的赖氨酸残基。
23.根据实施方案22所述的抗体，其中所述ALK抗性突变体多肽包含根据实施方案12-20中任一项所述的分离的多肽。
24.一种用于检测生物样品中ALK抑制剂抗性突变的试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案22或23所述的抗体。
25.根据实施方案24所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含用于检测与ALK结合的抗体的化学药品。
26.一种用于检测生物样品中ALK抑制剂抗性突变的试剂盒，所述试剂盒包含含至少一种可特异性检测或特异性扩增具有ALK抑制剂抗性突变的ALK抗性突变体多核苷酸的多核苷酸的试剂，其中所述ALK抗性突变体多核苷酸编码抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的ALK抗性突变体多肽，其中所述ALK抗性突变体多肽具有至少一个选自以下的ALK激酶抑制剂抗性突变体残基：
a)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丝氨酸残基；
b)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丙氨酸残基；
c)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1129相对应的位置的缬氨酸残基；
d)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1132相对应的位置的赖氨酸残基；
e)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1151相对应的位置的蛋氨酸残基；
f)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1156相对应的位置的酪氨酸残基；
g)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的半胱氨酸残基；
h)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的异亮氨酸残基；
i)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的缬氨酸残基；
j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的亮氨酸残基；
k)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置的精氨酸残基；
l)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1203相对应的位置的天冬酰胺残基；
m)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1210相对应的位置的赖氨酸残基；
n)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1269相对应的位置的丙氨酸残基；
o)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1406相对应的位置的赖氨酸残基；和，
p)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1408相对应的位置的赖氨酸残基。
27.根据实施方案26所述的试剂盒，其中所述至少一种可特异性检测或特异性扩增ALK抗性突变体多核苷酸的多核苷酸能够特异性检测或特异性扩增根据实施方案1-9中任一项所述的多核苷酸。
28.根据实施方案26所述的试剂盒，其中所述试剂包含一对扩增包含所述ALK抑制剂抗性突变的扩增子的引物。
29.根据实施方案26所述的试剂盒，其中所述试剂包含至少一种探针，所述探针包含在严格条件下与所述ALK抗性突变体多核苷酸杂交并从而检测ALK抑制剂抗性突变的多核苷酸序列。
30.一种测定生物样品的ALK抑制剂抗性突变的方法，所述方法包括使所述生物样品与根据实施方案22所述的抗体接触并检测所述抗体与具有所述ALK抑制剂抗性突变的ALK的结合。
31.一种诊断患有ALK活性异常相关癌症的患者中抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症的方法，所述方法包括测定来自所述患者的生物样品中ALK抑制剂抗性突变的存在，所述方法包括使所述生物样品与根据实施方案22所述的抗体接触，并检测所述抗体与具有所述ALK抑制剂抗性突变的ALK的结合，其中具有所述ALK抑制剂抗性突变的所述ALK的存在表明所述患者患有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症。
32.一种测定生物样品的ALK抑制剂抗性突变的方法，所述方法包括使所述生物样品与包含至少一种可特异性检测或特异性扩增具有ALK抑制剂抗性突变的ALK抗性突变体多核苷酸的多核苷酸的试剂接触，其中所述ALK抗性突变体多核苷酸编码抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的ALK抗性突变体多肽，其中所述ALK抗性突变体多肽具有至少一个选自以下的ALK激酶抑制剂抗性突变体残基：
a)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丝氨酸残基；
b)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丙氨酸残基；
c)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1129相对应的位置的缬氨酸残基；
d)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1132相对应的位置的赖氨酸残基；
e)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1151相对应的位置的蛋氨酸残基；
f)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1156相对应的位置的酪氨酸残基；
g)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的半胱氨酸残基；
h)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的异亮氨酸残基；
i)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的缬氨酸残基；
j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的亮氨酸残基；
k)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置的精氨酸残基；
l)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1203相对应的位置的天冬酰胺残基；
m)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1210相对应的位置的赖氨酸残基；
n)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1269相对应的位置的丙氨酸残基；
o)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1406相对应的位置的赖氨酸残基；和，
p)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1408相对应的位置的赖氨酸残基。
33.一种诊断患有ALK活性异常相关癌症的患者中抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症的方法，所述方法包括测定来自所述患者的生物样品中ALK抑制剂抗性突变的存在，所述方法包括使所述生物样品与包含至少一种可特异性检测或特异性扩增具有ALK抑制剂抗性突变的ALK抗性突变体多核苷酸的多核苷酸的试剂接触，其中所述ALK抗性突变体多核苷酸编码抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的ALK抗性突变体多肽，其中所述ALK抗性突变体多肽具有至少一个选自以下的ALK激酶抑制剂抗性突变体残基：
a)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丝氨酸残基；
b)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丙氨酸残基；
c)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1129相对应的位置的缬氨酸残基；
d)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1132相对应的位置的赖氨酸残基；
e)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1151相对应的位置的蛋氨酸残基；
f)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1156相对应的位置的酪氨酸残基；
g)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的半胱氨酸残基；
h)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的异亮氨酸残基；
i)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的缬氨酸残基；
j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的亮氨酸残基；
k)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置的精氨酸残基；
l)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1203相对应的位置的天冬酰胺残基；
m)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1210相对应的位置的赖氨酸残基；
n)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1269相对应的位置的丙氨酸残基；
o)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1406相对应的位置的赖氨酸残基；和，
p)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1408相对应的位置的赖氨酸残基；
并检测所述生物样品中所述ALK抑制剂抗性突变的存在或不存在，其中所述ALK抑制剂抗性突变的存在表明所述患者患有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症。
34.根据实施方案32或33所述的方法，其中所述至少一种可特异性检测或特异性扩增ALK抗性突变体多核苷酸的多核苷酸能够特异性检测或特异性扩增根据实施方案1-9中任一项所述的多核苷酸。
35.一种诊断受试者中抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的生物样品中具有ALK抑制剂抗性突变的ALK致癌融合蛋白的存在，所述方法包括使所述生物样品与特异性结合根据实施方案15-17中任一项所述的多肽的抗体接触；并检测所述抗体与具有ALK抗性突变的所述ALK致癌融合蛋白的结合；其中具有ALK抑制剂抗性突变的所述ALK致癌融合蛋白的存在表明所述受试者患有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症。
36.一种诊断受试者中抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的生物样品中编码具有ALK抑制剂抗性突变的ALK致癌融合蛋白的多核苷酸的存在，所述方法包括使所述生物样品与包含至少一种可特异性检测或特异性扩增编码具有ALK抑制剂抗性突变的ALK致癌融合蛋白的多核苷酸的多核苷酸的试剂接触，其中所述至少一种多核苷酸能够特异性检测或特异性扩增根据实施方案4-6中任一项所述的多核苷酸；并检测所述生物样品中编码具有所述ALK抑制剂抗性突变的ALK致癌融合蛋白的所述多核苷酸的存在或不存在；其中编码具有所述ALK抑制剂抗性突变的所述ALK致癌融合蛋白的所述多核苷酸的存在表明所述受试者患有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症。
37.根据实施方案30-36中任一项所述的方法，其中所述ALK小分子激酶抑制剂选自PF-0234166、NVP-TAE684、星孢菌素、7-羟基星孢菌素、CEP-14083、CEP-14513、CEP-28122、吡啶酮14、吡啶酮15、CRL151104A和WZ-5-126。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述ALK小分子激酶抑制剂为PF-02341066。
39.一种诊断患有ALK活性异常相关癌症的患者中抗PF-02341066或很可能发展对其的抗性的癌症的方法，所述方法包括测定来自所述患者的生物样品中ALK抑制剂抗性突变的存在，所述方法包括使所述生物样品与特异性结合抗PF-02341066的ALK抗性突变体多肽结合的抗体接触，其中所述ALK抗性突变体多肽在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1196相对应的位置具有蛋氨酸残基；并检测所述抗体与具有所述ALK抗性突变的ALK的结合，其中具有所述ALK抑制剂抗性突变的所述ALK的存在表明所述患者患有抗PF-02341066或很可能发展对其的抗性的癌症。
40.根据实施方案39所述的方法，其中所述ALK抗性突变体多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:24具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1196相对应的位置具有蛋氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗PF-02341066的激酶活性；
41.根据实施方案39所述的方法，其中所述ALK抗性突变体多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:52具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有抗PF-02341066的激酶活性。
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述ALK抗性突变体多肽进一步包含ALK致癌融合蛋白伴侣，从而包含ALK致癌融合蛋白。
43.根据实施方案39所述的方法，其中所述ALK抗性突变体多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:84中所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:84具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有抗PF-02341066的激酶活性。
44.一种诊断患有ALK活性异常相关癌症的患者中抗PF-02341066或很可能发展对其的抗性的癌症的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的生物样品中ALK抑制剂抗性突变的存在，所述方法包括：
a)使所述生物样品与包含至少一种可特异性检测或特异性扩增编码具有ALK抑制剂抗性突变的ALK抗性突变体多核苷酸的多核苷酸的试剂接触，其中所述ALK抗性突变体多核苷酸编码抗PF-02341066的ALK抗性突变体多肽，其中所述ALK抗性突变体多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1196相对应的位置具有蛋氨酸残基；以及，
b)检测所述生物样品中所述ALK抑制剂抗性突变的存在或不存在，其中所述ALK抑制剂抗性突变的存在表明所述患者患有抗PF-02341066或很可能发展对其的抗性的癌症。
45.根据实施方案44所述的方法，其中所述ALK抗性突变体多核苷酸包含选自以下的多核苷酸：
a)具有SEQ ID NO:23、51或83中所示核苷酸序列的多核苷酸；
b)编码SEQ ID NO:24、52或84中所示氨基酸序列的多核苷酸；
c)与SEQ ID NO:23、51或83具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或编码与SEQ IDNO:24、52或84具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置具有蛋氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗PF-02341066的激酶活性的多肽。
46.一种诊断受试者中抗PF-02341066或很可能发展对其的抗性的癌症的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的生物样品中具有ALK抑制剂抗性突变的ALK致癌融合蛋白的存在，所述方法包括：
a)使所述生物样品与特异性结合包含选自以下的多肽的ALK致癌融合蛋白的抗体接触：
i)SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列；和
ii)与SEQ ID NO:52具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有抗PF-02341066的激酶活性；以及，
b)检测所述抗体与具有ALK抗性突变的所述ALK致癌融合蛋白的结合；其中具有ALK抑制剂抗性突变的所述ALK致癌融合蛋白的存在表明所述受试者患有抗PF-02341066或很可能发展对其的抗性的癌症。
47.一种诊断受试者中抗PF-02341066或很可能发展对其的抗性的癌症的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的生物样品中编码具有ALK抑制剂抗性突变的ALK致癌融合蛋白的多核苷酸的存在，所述方法包括：
a)使所述生物样品与包含至少一种可特异性检测或特异性扩增编码ALK致癌融合蛋白的多核苷酸的多核苷酸的试剂接触，其中编码ALK致癌融合蛋白的所述多核苷酸包含选自以下的多核苷酸：
i)具有SEQ ID NO:51中所示核苷酸序列的多核苷酸；
ii)编码SEQ ID NO:52中所示氨基酸序列的多核苷酸；
iii)与SEQ ID NO:51具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或编码与SEQ ID NO:52具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置具有蛋氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗PF-02341066的激酶活性的多肽；以及，
b)检测所述生物样品中编码具有所述ALK抑制剂抗性突变的ALK致癌融合蛋白的所述多核苷酸的存在或不存在；其中编码具有所述ALK抑制剂抗性突变的所述ALK致癌融合蛋白的所述多核苷酸的存在表明所述受试者患有抗PF-02341066或很可能发展对其的抗性的癌症。
48.根据实施方案46或47所述的方法，其中所述ALK致癌融合蛋白包含选自以下的ALK致癌融合蛋白伴侣：核磷酸蛋白(NPM)、非肌肉原肌球蛋白3(TPM3)、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、网格蛋白重链(CLTC)、TRK融合基因(TFG)、非肌肉原肌球蛋白4(TPM4)、膜突蛋白(MSN)、Ran结合蛋白2(RanBP2)、棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)、半胱氨酰-tRNA合成酶(CARS)、驱动蛋白家族成员5B(KIF5B)、非肌肉肌球蛋白重链9(MYH9)、SEC31同系物A(SEC31L1)和染色体17(ALO17)上的环指蛋白213(RNF213)/ALK淋巴瘤寡聚伴侣。
49.根据实施方案48所述的方法，其中所述致癌融合蛋白伴侣具有SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列。
50.根据实施方案32-34、36、44、45和47中任一项所述的方法，其中检测所述多核苷酸包括核酸测序技术、核酸扩增法或核酸杂交技术。
51.根据实施方案31、33、35、36和39-49中任一项所述的方法，其中所述癌症选自大B细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、恶性组织细胞增生症、炎性肌纤维母细胞瘤肉瘤、食管鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、成神经细胞瘤、膀胱癌、肾癌和成胶质细胞瘤。
52.根据实施方案31、33、35、36和39-49中任一项所述的方法，所述方法进一步包含为所述患者选择疗法。
53.一种特异性减少抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的ALK抗性突变体的表达的方法，所述方法包括将靶向编码所述ALK抗性突变体的基因的沉默元件引入表达所述ALK抗性突变体的细胞中，其中所述沉默元件的引入或表达特异性减少所述ALK抗性突变体的表达，其中所述ALK抗性突变体为根据实施方案12-20中任一项所述的多肽。
54.一种治疗抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的ALK活性异常相关癌症的方法，所述方法包括施用有效量的靶向编码抗所述至少一种ALK小分子激酶抑制剂的ALK抗性突变体的基因的沉默元件，其中所述沉默元件的引入或表达特异性减少所述ALK抗性突变体的表达，其中所述ALK抗性突变体为根据实施方案12-20中任一项所述的多肽。
55.一种治疗抗PF-02341066的ALK活性异常相关癌症的方法，所述方法包括施用有效量的靶向编码抗PF-02341066的ALK抗性突变体的基因的沉默元件，其中所述沉默元件的引入或表达特异性减少所述ALK抗性突变体的表达，其中所述ALK抗性突变体为包含选自以下的氨基酸序列的多肽：
a)SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:24具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽在与SEQID NO:2的氨基酸残基位置1196相对应的位置具有蛋氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗PF-02341066的激酶活性。
56.根据实施方案55所述的方法，其中所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:52具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有抗PF-02341066的激酶活性。
57.根据实施方案56所述的方法，其中所述多肽进一步包含ALK致癌融合蛋白伴侣，从而包含ALK致癌融合蛋白。
58.根据实施方案55所述的方法，其中所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:84中所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:84具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有抗PF-02341066的激酶活性。
59.根据实施方案54-58中任一项所述的方法，其中所述癌症选自大B细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、恶性组织细胞增生症、炎性肌纤维母细胞瘤肉瘤、食管鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、成神经细胞瘤、膀胱癌、肾癌和成胶质细胞瘤。
60.一种鉴定能够抑制ALK抗性突变体或ALK融合蛋白的激酶活性的试剂的方法，所述方法包括：
a)使候选试剂与根据实施方案12-20中任一项所述的多肽接触；以及
b)确定所述候选试剂是否抑制所述多肽的激酶活性。
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述多肽在真核细胞中表达；其中所述多肽为根据实施方案15-17中任一项所述的多肽；并且其中确定所述试剂是否抑制所述多肽的激酶活性包括监测所述细胞在选自以下的细胞活性上的至少一种变化：
a)抑制细胞生长；
b)刺激细胞死亡；
c)抑制锚定非依赖生长；和，
d)抑制细胞迁移或侵袭；
其中鉴定诱导细胞活性的所述变化的至少一种的试剂为ALK抗性突变体的抑制剂。
62.根据实施方案60所述的方法，其中非人动物已被改变为表达所述多肽或其中已经将表达所述多肽的真核细胞引入非人动物体内；其中所述多肽为根据实施方案15-17中任一项所述的多肽；其中确定所述试剂是否抑制所述多肽的激酶活性包括监测所述非人动物的肿瘤生长；并且其中肿瘤生长的减缓表明试剂抑制所述多肽的激酶活性。
63.根据实施方案60所述的方法，其中所述多肽在真核细胞中表达；其中所述多肽为根据实施方案12或18所述的分离的多肽；其中所述多肽的激酶活性被激活；并且其中确定所述试剂是否抑制所述多肽的激酶活性包括监测所述细胞在选自以下的细胞活性上的至少一种变化：
a)抑制细胞生长；
b)刺激细胞死亡；
c)抑制锚定非依赖生长；和，
d)抑制细胞迁移或侵袭；
其中鉴定诱导细胞活性的所述变化的至少一种的试剂为ALK抗性突变体的抑制剂。
64.一种鉴定能够特异性结合根据实施方案12-20中任一项所述的多肽的试剂的方法，所述方法包括步骤：
a)使候选试剂与根据实施方案13-21中任一项所述的多肽接触；以及，
b)确定所述候选试剂是否特异性结合所述多肽。
65.根据实施方案64所述的方法，其中所述多肽呈活性或非活性状态。
在以下给出的本发明的描述中更详细地公开了本发明的这些和其它方面。
附图简述
图1示出了如先前所述(Lagisetti等(2009)J Med Chem52:6979-6990)对表达天然NPM-ALK(“NPM-ALK/BaF3”）或工程化为激酶结构域中含有3种抑制剂抗性突变(L1196M、G1202R或D1203N)的其中一种的NPM-ALK的BaF3细胞克隆进行72小时XTT测定，对PF-02341066反应的死亡曲线结果。还作为正常、非ALK依赖性细胞对照试验了亲本BaF3细胞(“BaF3”)。PF-02341066对每种细胞克隆的IC50值可在表3中找到。
发明详述
本发明的组合物包括ALK多肽、编码ALK多肽的多核苷酸及其抗ALK小分子激酶抑制剂的变异体和片段。也称为群名称CD246的ALK或间变性淋巴瘤激酶是受体酪氨酸激酶的胰岛素受体超家族的成员。ALK多肽为包含细胞外配体结合区、跨膜结构域和细胞质激酶催化区的单链跨膜蛋白。ALK由人体内的染色体带2p23(Morris等(1994)Science 263:1281-1284；Shiota等(1994)Oncogene9:1567-1574)和远端鼠染色体17(Mathew等(1995)Cytogenet.Cell.Genet.70:143-144)上找到的基因座编码。
在本领域中已知各种物种的ALK多核苷酸和多肽。Genbank登记号NC_000002.11中示出了人ALK的基因组序列。可在Genbank登记号U62540中找到人ALK的编码序列并示于SEQID NO:1中并且编码的人ALK多肽示于SEQ ID NO:2中。小鼠和果蝇ALK cDNA的Genbank登记号分别为D83002和AAF36990。人ALK为1620-氨基酸(aa)多肽，然而小鼠ALK长度为1621个aa并且果蝇ALK多肽为1701个aa。人ALK cDNA编码177-kDa的多肽，但是具有翻译后修饰，例如N-糖基化，成熟ALK为大约200-220kDa。
ALK多肽包含各种保守结构域。人ALK的1030个氨基酸长的细胞外结构域含有几个基序，包括26个氨基酸的氨基端信号肽序列和内源配体多效生长因子和中期因子的结合位点(位于残基391-401处)。28个氨基酸跨膜结构域(位于SEQ ID NO:2的残基1031-1058处)的后面为包含与IR底物-1进行磷酸酪氨酸依赖的相互作用的结合位点(位于残基1093-1096)的64个氨基酸的细胞质近膜片段。最小的激酶结构域(残基1116-1383)在其活化环中包括含3个酪氨酸的基序(酪氨酸1278、1282和1283)。这些酪氨酸残基是调控活化环构象的自体磷酸化位点，阻止ATP进入呈非磷酸化态的ATP结合囊中并向外摆动远离结合囊以使在磷酸化三联酪氨酸后的激酶活化过程中ATP的进入不受阻碍(Tartari等(2008)J BiolChem 283:3743-3750)。虽然ALK的残基1116-1383涵盖了最小的激酶结构域，但是对于最佳活性而言需要残基E1406和E1408并且被视为扩大的激酶结构域的一部分。244个氨基酸的ALK羧基端含有用于含Src同源2结构域(SHC)的底物蛋白的磷酸酪氨酸依赖性结合位点(残基1504-1507)和用于磷脂酶C-γ的磷酸酪氨酸依赖性结合的相互作用位点(残基1603-1606)。
ALK的神经系统主导表达谱表明激酶在神经系统的发育或作用中起作用；然而，ALK敲除小鼠可存活并不表现出易于显见的异常(Iwahara等(1997)Oncogene 14:439-449；Morris等(1997)Oncogene14:2175-2188；Loren等(2001)Genes Cells 6:531-544；Pulford等(1997)Blood 89:1394-1404)。对ALK敲除小鼠的进一步研究显示小鼠表现出“抗抑郁性质”，表明ALK可能牵涉于认知和/或情绪性病症的病理生理学(Bilsland等(2008)Neuropsychopharmacology 33:684-700)。
虽然已经证明ALK的基因组DNA扩增和蛋白质过表达以及激活点突变引起成神经细胞瘤(Webb等(2009)Expert Rev AnticancerTher 9:331-356；George等(2008)Nature455:975-979)并且全长ALK已牵连于其它恶性肿瘤(例如成胶质细胞瘤)的发生中(Webb等(2009)Expert Rev Anticancer Ther 9:331-356)，但是ALK活性异常相关的多数癌症是由于形成表现出组成型激酶活性的致癌ALK融合蛋白。因此，用于检测目前公开的抗性突变的方法中，用于诊断那些抗ALK激酶抑制剂或可能发展对其的抗性的癌症和用于鉴定特异性结合包含抗性突变的ALK或ALK致癌融合蛋白和/或抑制其活性的试剂的方法中的ALK多核苷酸和多肽包括那些包含激酶结构域的ALK多核苷酸和多肽、全长ALK或ALK致癌融合蛋白。
“ALK致癌融合”或“ALK致癌融合蛋白”是包含氨基端融合伴侣和羧基端的ALK多肽片段的多肽。两种蛋白质的融合导致通过氨基端融合伴侣中寡聚化结构域介导的寡聚化组成型活化ALK的激酶活性并且随后组成型传输促生长细胞信号。ALK活化引起细胞增殖和细胞凋亡增加，至少部分由于蛋白激酶C(PKC)、有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷酸肌醇3激酶(PI3K)途径的活化。另外，ALK的活化增强了细胞迁移和侵袭并促进细胞的锚定非依赖生长。在一些实施方案中，氨基端伴侣蛋白是在正常细胞中广泛表达的一种蛋白并且其启动子是造成编码的融合蛋白异常表达的原因。自然存在的ALK致癌融合是染色体易位的结果。
如本文所使用，“ALK致癌融合伴侣”或“ALK致癌融合蛋白伴侣”指包含寡聚化结构域的ALK致癌融合的氨基端片段。
自然存在的致癌融合伴侣在本领域中已知并且包括但不限于核磷酸蛋白(NPM)、、非肌肉原肌球蛋白3(TPM3)、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、网格蛋白重链(CLTC)、TRK融合基因(TFG)、非肌肉原肌球蛋白4(TPM4)、膜突蛋白(MSN)、Ran结合蛋白2(RanBP2)、棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)、半胱氨酰-tRNA合成酶(CARS)、驱动蛋白家族成员5B(KIF5B)、非肌肉肌球蛋白重链9(MYH9)、SEC31同系物A(SEC31L1)和染色体17(ALO17)上的环指蛋白213(RNF213)/ALK淋巴瘤寡聚伴侣(见Webb等(2009)Expert Rev Anticancer Ther9:331-356，其通过引用整体并入本文以供查阅)。表1提供了每种ALK致癌融合伴侣的基因组和编码序列的登记号，连同对与ALK融合的片段的编码序列的参考。
表1.ALK致癌融合伴侣
大约60%的间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)和约60%的炎性肌纤维母细胞瘤(IMT)，一种主要影响儿童和年轻成人的缓慢生长肉瘤，具有NPM-ALK融合蛋白。(Armitage等(2001)Cancer:Principle andPractice of Oncology，第6版，2256-2316；Kutok和Aster(2002)J.Clin.Oncol.20:3691-3702；Lawrence等(2000)Am.J.Pathol.157:377-384)。NPM-ALK融合的核苷酸和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:3和4中，并且NPM-ALK致癌融合蛋白中与ALK融合的NPM片段示于SEQ ID NO:97中。除MSN-ALK和TPM3/TPM4-ALK(在并入其中的ALK部分方面与所有其它ALK融合仅略微不同)外，所有已知的嵌合ALK蛋白含有与ALK(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基1058-1620相对应的ALK整个胞质内部分。本文将此ALK片段称为“ALK融合片段”。
本文描述了抗ALK激酶抑制剂的ALK突变体，本文也称为ALK抑制剂抗性突变体或ALK抗性突变体。ALK抗性突变体多肽包括SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、28、30、32(突变的ALK激酶结构域)；SEQ ID NO:34、36、38、40、42、44、46、48、50、54、56、58、60、62、64(突变的ALK融合片段)；和SEQ IDNO:66、68、70、72、74、76、78、80、82、86、88、90、92、94和96(突变的全长ALK多肽)中所示的氨基酸序列及其变异体和片段。同样，ALK抗性突变体多核苷酸包括SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、25、27、29、31(突变的ALK激酶结构域)；SEQ IDNO:33、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63(突变的ALK融合片段)；和SEQ ID NO:65、67、69、71、73、75、77、79、81、85、87、89、91、93和95(突变的全长ALK多核苷酸)中所示的核苷酸序列及其变异体和片段以及编码SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、86、88、90、92、94和96中所示ALK抗性突变体多肽的多核苷酸及其变异体和片段。
“ALK抗性突变”或“ALK抑制剂抗性突变”是赋予ALK多肽对至少一种ALK激酶抑制剂的抗性的天然ALK核苷酸序列或氨基酸序列中的改变。表1中公开了多核苷酸和多肽水平的经鉴定的ALK抗性突变(引起单个氨基酸残基取代的点突变)。据了解，由于密码子简并性，另外的多核苷酸突变可能引起相同的氨基酸取代。
如本文所使用，术语“多核苷酸”旨在涵盖单数核酸以及复数核酸，并且指核酸分子或构造，例如信使RNA(mRNA)、质粒DNA(pDNA)或短干扰RNA(siRNA)。多核苷酸可为单链或双链、直链或环状并且可由DNA、RNA或其组合构成。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如，诸如在肽核酸(PNA)中找到的酰胺键)。术语“核酸”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。“多核苷酸”可含有经修饰的核酸，例如硫代磷酸、磷酸盐、环原子修饰的衍生物等。“多核苷酸”可为自然存在的多核苷酸(即，无人为干预的自然界中存在的多核苷酸)、重组多核苷酸(即，仅经人为干预存在的多核苷酸)或合成衍生的多核苷酸。
多核苷酸可编码多肽或蛋白质。至于指定的核酸，“编码”或“编码的”指包含转录为RNA的信息并且在一些实施方案中，指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可能在核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如，内含子)，或可能缺乏此类插入的非翻译序列(例如，在cDNA中)。通过利用密码子指定用于编码蛋白质的信息。通常，由核酸使用“通用”遗传密码编码氨基酸序列。然而，例如一些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)(Yamao等(1985)Proc.Natl Acad.Sci.USA 82:2306-9)或纤毛虫大核原生动物(Macronucleus)中存在的通用密码变异体在使用这些生物体表达核酸时可使用。
如本文所使用，术语“多肽”或“蛋白质”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指两个或更多个氨基酸的任一条或多条链，并不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其它术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于代替这些术语中的任一个或与之互换使用。
“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质或其生物活性部分大体上或基本上不含通常与在其自然存在环境中找到的多核苷酸或蛋白质共存或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质当通过重组技术生成时大体上不含其它细胞物质或培养基，或当化学合成时大体上不含化学前体或其它化学药品。最佳的是，“分离的”多核苷酸不含自然位于所述多核苷酸源自其中的生物体的基因组DNA中多核苷酸侧面的序列(即，位于多核苷酸5’和3’末端的序列)。例如，在各个实施方案中，分离的多核苷酸可含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的自然位于所述多核苷酸源自其中的细胞基因组DNA中多核苷酸侧面的核苷酸序列。大体上不含细胞物质的蛋白质包括具有小于约30%、20%、10%、5%或1%(按干重计)的污染蛋白质的蛋白制剂。当通过重组生成本发明的蛋白质或其生物活性部分时，最佳的是培养基表示小于约30%、20%、10%、5%或1%(按干重计)的化学前体或非目标蛋白化学药品。
编码ALK抗性突变体多肽和多肽自身的片段和变异体的多核苷酸的片段和变异体可用于本发明的各种方法和组合物中，包括ALK抗性突变体多肽的生物活性变异体和片段。此类活性变异体和片段将保留抗至少一种ALK激酶抑制剂的功能性激酶结构域。测定激酶活性的方法已知并且在本文其它地方进行描述。
“片段”意指多核苷酸的一部分和因此由其编码的蛋白质或多肽的一部分。多核苷酸的片段可能编码保持ALK抗性突变体蛋白的生物活性并且因此具有抗至少一种ALK激酶抑制剂的激酶活性的蛋白质片段。因此，多核苷酸的片段可能范围为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500个连续核苷酸，并且达到编码ALK抗性突变体多肽的全长多核苷酸。
编码ALK抗性突变体多肽的生物活性部分的多核苷酸片段将编码至少约15、约25、约30、约50、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600个连续氨基酸，或达到全长ALK抗性突变体多肽中存在的氨基酸总数。
可通过分离编码ALK抗性突变体多肽的所述部分的其中一个多核苷酸的一部分并且表达编码的多肽部分(例如，通过体外重组表达)，和评估ALK多肽所述部分的活性来制备ALK抗性突变体多肽的生物活性部分。编码ALK抗性突变体多肽片段的多核苷酸可包含含包含至少15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500个连续核苷酸或达到本文公开的全长ALK抗性突变体核苷酸序列中存在的核苷酸数量的核苷酸序列。
“变异体”序列具有高度序列相似性。对于多核苷酸而言，保守性变异体包括那些由于遗传密码的简并性，编码其中一种ALK抗性突变体多肽的氨基酸序列的序列。诸如这些的变异体可使用已知分子生物学技术鉴定，例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变异体多核苷酸还包括合成衍生的核苷酸序列，例如通过使用定点诱变产生的，但是仍编码ALK抗性突变体多肽的核苷酸序列。通常，通过本文其它地方描述的序列比对程序和参数确定，特殊多核苷酸的变异体与特殊多核苷酸将具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。
也可通过比较由变异体多核苷酸编码的多肽和由参考多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比评估特殊多核苷酸的变异体。因此，变异体包括(例如)编码与本文所示ALK多肽具有给定序列同一性百分比的多肽的分离多核苷酸。可使用本文所述的序列比对程序和参数计算任两个多肽之间的序列同一性百分比。通过比较任何给定多核苷酸对编码的两个多肽共有的序列同一性百分比评估给定多核苷酸对时，编码的两个多肽之间的序列同一性百分比为至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。
“变异体”多肽意指通过多肽的N端和/或C端缺失(所谓的截短)或添加一个或多个氨基酸；在多肽中的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或在多肽中的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸由ALK抗性突变体多肽衍生的多肽。变异体ALK抗性突变体多肽具有生物活性，即它们持续具有抗至少一种ALK激酶抑制剂的激酶活性。此类变异体可能由(例如)遗传多态性或人为操作产生。通过本文其它地方描述的序列比对程序和参数确定，ALK抗性突变体多肽的生物活性变异体与ALK抗性突变体多肽的氨基酸序列将具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。多肽的生物活性变异体与所述多肽可能仅有1-15个氨基酸残基，仅有1-10个，例如6-10个，仅有5个，仅有4、3、2或甚至1个氨基酸残基不同。
ALK抗性突变体多肽的生物活性变异体和片段保留了造成对至少一种ALK激酶抑制剂的抗性的点突变。因此，ALK抗性突变体多肽的变异体和片段包含至少一个以下的氨基酸残基：
a)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丝氨酸残基或其保守性取代；
b)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1123相对应的位置的丙氨酸残基或其保守性取代；
c)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1129相对应的位置的缬氨酸残基或其保守性取代；
d)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1132相对应的位置的赖氨酸残基或其保守性取代；
e)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1151相对应的位置的蛋氨酸残基或其保守性取代；
f)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1156相对应的位置的酪氨酸残基或其保守性取代；
g)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的半胱氨酸残基或其保守性取代；
h)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的异亮氨酸残基或其保守性取代；
i)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的缬氨酸残基或其保守性取代；
j)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1174相对应的位置的亮氨酸残基或其保守性取代；
k)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1196相对应的位置的蛋氨酸残基或其保守性取代；
l)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置的精氨酸残基或其保守性取代；
m)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1203相对应的位置的天冬酰胺残基或其保守性取代；
n)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1210相对应的位置的赖氨酸残基或其保守性取代；
o)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1269相对应的位置的丙氨酸残基或其保守性取代；
p)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1406相对应的位置的赖氨酸残基或其保守性取代；和，
q)在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1408相对应的位置的赖氨酸残基或其保守性取代。
同样，变异体ALK抗性突变体多核苷酸可为编码此类变异体ALK抗性突变体多肽的多核苷酸。
如本文所使用，氨基酸残基的“保守性取代”包含大小和/或电荷与另一氨基酸残基相似的其它氨基酸残基。氨基酸残基的保守性取代不涵盖在天然ALK序列(SEQ ID NO:2中公开)中的特殊位置找到的氨基酸残基。
如本文所使用，ALK突变体多肽在与天然ALK(SEQ ID NO:2)的特殊氨基酸残基相对应的位置的氨基酸残基指当使用比对程序，例如本领域中已知的比对程序(例如，GCG软件包中的GAP程序，使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵)比对ALK突变体序列和天然ALK序列(SEQ ID NO:2)的最大同源性时，ALK突变体多肽中出现的与天然ALK序列中特殊位置的氨基酸残基相对的氨基酸残基。
可通过各种方式改变多肽，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。此类操作的方法通常在本领域中已知。例如，可通过DNA中的突变制备ALK抗性突变体多肽的氨基酸序列变异体。诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中众所周知。见，例如，Kunkel(1985)Proc.NatlAcad.Sci.USA 82:488-492；Kunkel等(1987)Methods in Enzymol.154:367-382；美国专利No.4,873,192；Walker和Gaastra编(1983)Techniques in MolecularBiology(MacMillan Publishing Company，NewYork)和其中引用的参考文献。在通过引用并入本文的Dayhoff等(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中可找到关于不影响目标多肽生物活性的适当氨基酸取代的指导。可优选保守性取代，例如用具有相似性质的氨基酸取代另一氨基酸。
因此，用于本发明中的多核苷酸可包括自然存在的序列以及经合成衍生或修饰的序列。同样，用于本发明方法中的多肽涵盖自然存在的多肽及其变异和修饰形式。通常，在编码变异体多肽的多核苷酸中产生的突变不得将序列置于阅读框外，和/或产生可生成mRNA二级结构的互补区。见，欧洲专利申请公布No.75,444。
不期望本文涵盖的多肽序列的缺失、插入和取代使多肽的特性产生根本性变化。然而，当这样做之前难以预测取代、缺失或插入的确切作用时，本领域的技术人员将了解将通过常规筛选测定评估作用。
变异体多核苷酸和多肽还涵盖源自诸如DNA改组的诱变和重组发生过程的序列和多肽。用此过程，可操作一个或多个不同ALK抗性突变体编码序列产生拥有所需性质的新ALK抗性突变体多肽。以这种方式，由一群包含具有大体序列同一性并且可在体外或体内同源重组的序列区域的相关序列多核苷酸生成重组多核苷酸库。此类DNA改组策略在本领域中已知。见，例如，Stemmer(1994)Proc.NatlAcad.Sci.USA 91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370:389-391；Crameri等(1997)Nature Biotech.15:436-438；Moore等(1997)J.MolBiol.272:336-347；Zhang等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509;Crameri等(1998)Nature 391:288-291；和美国专利No.5,605,793和5,837,458。
如本文所使用，在两个多核苷酸或多肽序列的情况下的“序列同一性”或“同一性”提到比对指定比较窗口的最高一致度时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分比用于提到蛋白质时，人们认为不相同的残基位置往往由于保守性氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基取代为具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基并且因此不改变分子的功能性质。当序列的不同之处在于保守性取代时，可上调序列同一性百分比以校正取代的保守性。由于保守性取代而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调控的方式对于本领域的技术人员而言众所周知。通常这包括将保守性取代评分为部分而非完全错配，从而提高序列同一性百分比。因此，例如，给相同氨基酸1分而给非保守性取代0分时，给保守性取代0-1之间的分数。例如，在程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView，California)中实现计算保守性取代的评分。
如本文所述，“序列同一性百分比”指通过对比较窗口上两个最佳比对序列进行比较确定的值，其中对于两个序列的最佳比对而言，与参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列部分可能包含添加或缺失(即，空位)。百分比通过以下计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量以获得匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100以获得序列同一性百分比。
除非另有规定，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10，使用以下参数获得的值：使用GAP权重为50且长度权重为3和nwsgapdna.cmp评分矩阵获得的核苷酸序列的%同一性和%相似性；使用GAP权重为8且长度权重为2和BLOSUM62评分矩阵获得的氨基酸序列的%同一性和%相似性；或其等效程序。“等效程序”意指对于讨论中的任两个序列而言，当与用GAP版本10产生的相应比对相比时，产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分比的比对的任何序列比较程序。
本文公开了ALK中赋予对ALK激酶抑制剂的抗性的新型突变。如本文所使用，“ALK激酶抑制剂”是能够抑制ALK多肽的激酶活性的化合物。在一些实施方案中，ALK突变体抗ALK小分子激酶抑制剂。如本文所使用，“小分子”指尺寸足够小，以致其可易于独立通过细胞膜的化学化合物。一般而言，虽然术语可涵盖能够容易地穿过细胞膜的小聚合物，但是小分子指并非聚合物(例如核酸、多肽或多糖)的化学化合物。
ALK的激酶活性指ALK磷酸化自然存在或合成的包括ALK自身和其它下游底物(例如，SHC)的底物的酪氨酸残基的能力。一旦寡聚化，ALK自体磷酸化3个ALK酪氨酸残基，从而充分活化酶，使ALK磷酸化另外的底物，例如SHC。ALK激酶抑制剂抑制ALK多肽的激酶活性，这意味着与不存在抑制剂化合物时的激酶相比，激酶活性部分或完全降低。在一些实施方案中，当与不存在抑制剂时激酶的活性相比，ALK激酶抑制剂使ALK激酶活性降低至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或约100%。
测定ALK多肽的激酶活性的方法在本领域中已知并且包括体外激酶测定法，其中通过亲和纯化或免疫沉淀分离ALK多肽并且在ATP存在下测量ALK的自体磷酸化或底物蛋白或肽的磷酸化。也可使用基于细胞的测定法，其中使用(例如)免疫印迹或酶联免疫测定确定ALK自体磷酸化或ALK底物的磷酸化。可在各自通过引用整体并入本文的美国申请公布No.2008/0090776和2009/0099193中找到分析ALK激酶活性的方法的非限制性实例。
ALK激酶抑制剂可与非活性形式的ALK或活性自体磷酸化形式的ALK结合，其中活化环中3个酪氨酸残基未磷酸化。ALK激酶抑制剂抑制激酶的自体磷酸化和另外底物的磷酸化。为了在临床上有用，许多ALK激酶抑制剂对ALK相当有特异性，然而，术语ALK激酶抑制剂涵盖也能够抑制其它激酶，例如MET激酶的抑制剂。
本领域中已知的ALK激酶抑制剂的非限制性实例包括PF-0234166(Zou等(2007)Cancer Res 67:4408-4417；Christensen等(2007)Mol Cancer Ther 6:3314-3322；美国申请公布No.2008/0051419)、NVP-TAE684(Galkin等(2007)Proc Natl Acad Sci USA104:270-275)、星孢菌素、7-羟基星孢菌素、CEP-14083、CEP-14513、CEP-28122(Wan等(2006)Blood 107:1617-1623；Piva等(2006)J ClinInvest 116:3171-31821)、吡啶酮14(Li等(2006)J Med Chem49:1006-1015)、吡啶酮15、CRL151104A(美国申请公布No.2008/0171769)和WZ-5-126(McDermott 等(2008)Cancer Res68:3389-3395)，各自通过引用整体并入本文。在特定实施方案中，目前公开的ALK抗性突变赋予对PF-0234166的抗性。
可在表达盒中找到ALK抗性突变体多核苷酸。表达盒可包含一个或多个与ALK抗性突变体多核苷酸可操作地连接，促进多核苷酸表达的调控序列。“调控序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。见，例如，Goeddel(1990)，GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185中(Academic Press,San Diego,California)。调控序列可能包括启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。
调控序列与编码序列可操作地连接以允许由编码序列编码的多肽表达。“可操作地连接”意指编码序列以允许核苷酸序列表达的方式与调控序列功能性连接。可操作连接的元件可连续或非连续。多核苷酸可在有义或反义方向与调控序列可操作地连接。
调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或编码多核苷酸可与天然的/与引入多核苷酸的细胞类似或相互类似。可选地，调控区和/或编码多核苷酸可与引入多核苷酸的细胞异源或相互异源。
如本文所使用，关于序列的“异源”为源于外来物种的序列，或者，如果源于相同物种，通过有意人为干预由其天然形式在组成和/或基因座上经大体上修饰。例如，与异源多核苷酸可操作地连接的启动子来自与多核苷酸源自其中的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似物种，一种或二种由其原有形式和/或基因座经大体上修饰，或启动子并非可操作连接的多核苷酸的天然启动子。
调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的调控序列和仅在某些宿主细胞(例如，组织特异性调控序列)中或在发育/分化的特殊阶段(例如，发育特异性调控序列)指导核苷酸序列的表达的调控序列，或化学诱导的调控序列。本领域的技术人员将了解，表达盒的设计可取决于诸如待引入多核苷酸的宿主细胞的选择、预期的多肽表达水平等因素。此类表达盒通常包括一个或多个适当定位的限制性酶位点，以便将核酸引入载体。
将进一步了解，可易于选择适当的启动子和/或调控元件以允许编码序列在目标细胞中和在特殊发育/分化状态下表达。在一些实施方案中，可使用RNA聚合酶II识别的启动子。
调控序列也可由病毒调控元件提供。例如，常用启动子源自多瘤病、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40。真核细胞的其它适合表达系统，见Sambrook等(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview，New York)的第16和17章。见，Goeddel(1990)，Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology 185中(Academic Press,San Diego,California)。
已知各种组成型启动子。例如，在各实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒长末端重复序列、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶可用于获得目标编码序列的高水平表达。本领域中众所周知的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子的使用可用于实现目标编码序列的表达。可使用的启动子包括但不限于如Squinto等(1991)Cell 65:120)中所述的长末端重复序列；SV40早期启动子区(Bemoist和Chambon(1981)Nature 290:304310)、CMV启动子、M-MuLV 5’末端重复序列、劳斯氏肉瘤病毒的3’长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等(1980)Cell 22:787797)和疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441445)。
诱导型启动子也已知。诱导型启动子及其诱导物的非限制性实例包括MT II/佛波酯(TPA)(Palmiter等(1982)Nature 300:611)和重金属(Haslinger和Karin(1985)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA.82:8572；Searle等(1985)Mol Cell.Biol.5:1480；Stuart等(1985)Nature 317:828；Imagawa等(1987)Cell 51:251；Karin等(1987)Mol Cell Biol 7:606；Angel等(1987)Cell 49:729；McNeall等(1989)Gene 76:8)；MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)/糖皮质激素(Huang等(1981)Cell 27:245；Lee等(1981)Nature 294:228；Majors和Varmus(1983)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA.80:5866；Chandler等(1983)Cell 33:489；Ponta等(1985)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA.82:1020；Sakai等(1988)Genes and Dev.2:1144)；β-干扰素/聚(rI)X和聚(rc)(Tavernier等(1983)Nature 301:634)；腺病毒5E2/E1A(Imperiale和Nevins(1984)Mol.Cell Biol.4:875)；c-jun/佛波酯(TPA)、H2O2；胶原酶/佛波酯(TPA)(Angel等(1987)Mol.Cell Biol.7:2256)；基质分解素/佛波酯(TPA)、IL-1(Angel等(1987)Cell 49:729)；SV40/佛波酯(TPA)(Angel等(1987)Cell 49:729)；鼠MX基因/干扰素、新城疫病毒；GRP78基因/A23187(Resendez Jr.等(1988)Mol.Cell Biol.8:4579)；α-2-巨球蛋白/IL-6；波形蛋白/血清(Kunz等(1989)Nucl.Acids Res.17:1121)；MHC I类基因H-2kB/干扰素(Blanar等(1989)EMBO J.8:1139)；HSP70/ela、SV40大T抗原(Taylor和Kingston(1990)Mol.CellBiol.10:165；Taylor和Kingston(1990)Mol.Cell Biol.10:176；Taylor等1989)J.BiolChem.264:15160)；多育曲菌素/佛波酯-TPA(Mordacq和Linzer(1989)Genesand Dev.3:760)；肿瘤坏死因子/PMA(Hensel等(1989)Lymphokine Res.8:347)；促甲状腺激素α基因/甲状腺激素(Chatterjee等(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA.86:9114)；和胰岛素E盒/葡萄糖。
对于本领域的普通技术人员而言，各种翻译控制元件已知并且可用于目前公开的方法和组合物中。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和源自小核糖核酸病毒的元件(尤其是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。
一般而言，重组DNA技术中利用的表达载体常常呈质粒(载体)形式。然而，本发明旨在包括其它表达载体形式，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒)。见，例如，通过引用并入本文的美国公布2005214851。通过在与细胞接触之前将载体包裹至病毒体中转导逆转录病毒载体，尤其是慢病毒载体。
表达盒可进一步包含筛选标记物。如本文所使用，术语“筛选标记物”包含当在细胞内表达时允许筛选具有载体的转化细胞的任何多核苷酸。例如，筛选标记物可赋予对药物、营养需要或细胞毒性药物的抗性。筛选标记物也可诱导可选表型，例如荧光或颜色沉积。“阳性筛选标记物”使表达标记物的细胞抗筛选剂存活并因此赋予表达该标记物的细胞阳性筛选特征。阳性筛选标记物/筛选剂包括，例如，neo/G418、neo/卡那霉素、hyg/潮霉素、hisD/组氨醇、gpt/黄嘌呤、ble/博莱霉素、HPRT/次黄嘌呤。其它阳性筛选标记物包括编码膜结合多肽的DNA序列。对于本领域的技术人员而言此类多肽众所周知并且可包含，例如，分泌序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。当表达为阳性筛选标记物时，此类多肽与细胞膜相关。然后对胞外结构域有特异性的荧光标记抗体可用于荧光活化细胞分选仪(FACS)中以筛选表达膜结合多肽的细胞。在表达盒进一步包含可选标记物的一些实施方案中，内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列，可用于分离可选标记物的编码序列和目标多肽，从而允许在相同启动子序列的控制下同时转录两个序列，但是将转录物单独翻译为多肽。
本发明的宿主细胞也可用于产生非人转基因动物。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞为已经引入了编码ALK抗性突变体多肽的序列的受精卵母细胞或胚胎干细胞。然后可将此类宿主细胞用于产生已经将编码ALK抗性突变体多肽的外源序列引入其基因组的非人转基因动物或同源重组动物。在一些实施方案中，ALK抗性突变体是ALK致癌融合蛋白的一部分。此类动物用于使用本文其它地方描述的测定法筛选抑制ALK抗性突变体的候选试剂，以鉴定能够抑制目前公开的ALK抗性突变体的试剂或进一步验证新型抑制剂抑制抗至少一种ALK激酶抑制剂的ALK活性异常相关癌症的生长的能力。
如本文所使用，“转基因动物”为非人动物，在特定实施方案中为哺乳动物、啮齿动物例如大鼠或小鼠，其中动物的一个或多个细胞包括转基因。转基因动物的其它实例包括非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、山羊、鸡、两栖动物等。转基因为并入转基因动物从中发育并且保持成熟动物的基因组的细胞基因组中，从而指导转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中编码基因产物的表达的外源DNA。如本文所使用，“同源重组动物”为非人动物，在特定实施方案中为哺乳动物，在其它实施方案中为小鼠，其中在动物发育之前，已经通过内源基因和引入动物细胞(例如，动物的胚细胞)的外源DNA分子之间的同源重组改变了内源ALK基因。
可通过(例如)显微注射、逆转录病毒感染将ALK抗性突变体多肽编码核酸引入受精卵母细胞的雌性生殖核中，并且使卵母细胞在假孕雌性寄养动物体内发育产生本发明的转基因动物。此类序列可作为转基因引入非人动物的基因组中。转基因中也可包括内含子序列和聚腺苷酸化信号以提高转基因的表达效率。组织特异性调控序列可与转基因可操作地连接以指导序列特殊细胞的表达。通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物，尤其是诸如小鼠的动物的方法在本领域中已成为常规，并且在(例如)美国专利No.4,736,866、4,870,009和4,873,191和Hogan(1986)Manipulating the Mouse Embryo(Cold SpringHarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，1986)中进行描述。相似方法用于生产其它转基因动物。可基于其基因组中包含ALK抗性突变的ALK抗性突变体蛋白或多核苷酸的存在和/或动物组织或细胞中此类序列的mRNA的表达鉴定转基因创始动物。然后可将转基因创始动物用于繁殖另外的携带转基因的动物。而且，可进一步将携带转基因的转基因动物培育为携带其它转基因的其它转基因动物。
为产生同源重组动物，人们制备了含有编码ALK抗性突变体多肽的序列的至少一部分的载体，从而允许ALK抗性突变体多肽表达。在一个实施方案中，同源重组载体，ALK基因的改变部分在其5’和3’末端两侧为ALK基因另外的核酸，以允许在载体携带的外源ALK基因和胚胎干细胞中的内源ALK基因之间发生同源重组。另外的侧接ALK核酸足够长以与内源基因成功同源重组。通常，载体中包括数千碱基的侧接DNA(在5’和3’末端)(见，例如，Thomas和Capecchi(1987)Cell 51:503对同源重组载体的描述)。将载体引入胚胎干细胞系(例如，通过电穿孔)，并且选择其中引入的ALK基因已经与内源ALK基因同源重组的细胞(见，例如，Li等(1992)Cell 69:915)。然后将所选细胞注射至动物(例如，小鼠)的胚泡中形成聚集嵌合体(见，例如，Bradley(1987)，Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:APractical Approach,Robertson编(IRL,Oxford第113-152页)。然后可将嵌合胚植入适合的假孕雌性寄养动物体内并且使胚胎长到足月。通过转基因的种系传递，在其生殖细胞中隐匿有同源重组DNA的后代可用于繁殖动物的所有细胞均含有同源重组DNA的动物。Bradley(1991)Current Opinion in Bio/Technology 2:823-829和PCT公布No.WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169中进一步描述了构建同源重组载体和同源重组动物的方法。
在另一实施方案中，可生产含有允许转基因调控表达的所选系统的非人转基因动物。此类系统的一个实例为噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。cre/loxP重组酶系统的描述，见，例如，Lakso等(1992)Proc.NatlAcad.Sci.USA 89:6232-6236。重组酶系统的另一实例为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP重组酶系统(O'Gorman等(1991)Science251:1351-1355)。如果cre/loxP重组酶系统用于调控转基因的表达，需要含有编码Cre重组酶和所选蛋白质的转基因的动物。此类动物可通过构建“双”转基因动物提供，例如，通过使两只转基因动物交配，一只含有编码所选蛋白质的转基因，另一只含有编码重组酶的转基因。
也可根据Wilmut等(1997)Nature 385:810-813和PCT公布No.WO 97/07668和WO97/07669中描述的方法产生本文所述非人转基因动物的克隆。
如本文指出，本发明包括与ALK抗性突变体多肽特异性结合的抗体。如本文所讨论，这些抗体称为“抗ALK抗性突变体抗体”。因此，“抗ALK抗性突变体抗体”意指对本文公开的抗至少一种ALK激酶抑制剂的ALK多肽有特异性的抗体。术语也涵盖对包含具有ALK抑制剂抗性突变的ALK多肽的ALK致癌融合蛋白有特异性的抗体。各抗体可单独或组合用于本发明的方法中。
可通过标准方法制备抗体，包括单克隆抗体(mAb)。见，例如，Harlow和Lane，UsingAntibodies:A Laboratory Manual,CSHL,NewYork,1999。简言之，可用免疫原形式的肽或肽复合物使哺乳动物例如小鼠、仓鼠或兔子免疫。赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包括与载体偶联或本领域中众所周知的其它技术。
“特异性结合的抗体”意指抗体大体上不与另一多肽交叉反应。“大体上不交叉反应”意指抗体或片段对不同多肽的结合亲和力是对特殊ALK抗性突变体多肽的结合亲和力的小于10%、小于5%或小于1%。
在特定实施方案中，抗ALK抗性突变体抗体与特殊ALK抗性突变体多肽特异性结合并且降低了激酶的激酶活性。因此，在特定实施方案中，抗ALK抗性突变体抗体为ALK抗性突变体抑制剂。
可使用本领域的技术人员已知的任何抗体生产方法生产本文公开的和用于本发明方法中的抗ALK抗性突变体抗体。因此，可通过常规方法制备多克隆血清。一般而言，首先用含有ALK抗性突变体多肽或其片段的溶液使适合动物免疫，优选为小鼠、大鼠、兔子或山羊。由于可获得的血清体积和标记的抗兔子和抗山羊抗体的可用性，兔子或山羊优选用于制备多克隆血清。
可在转基因动物体内，优选在具有人免疫球蛋白基因座的小鼠体内制备多克隆血清。在优选的实施方案中，表达ALK抗性突变体多肽或其片段的Sf9(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞用作免疫原。也可通过于盐水，优选于佐剂例如弗氏完全佐剂中混合或乳化含抗原的溶液，并经肠胃外(通常经皮下或肌肉内)注射混合物或乳液进行免疫。50-200μg/注射的剂量通常足够。通常在2-6周后一次或多次注射于盐水中的蛋白质增强免疫，优选使用弗氏不完全佐剂。人们可使用本领域中已知的方法通过体外免疫可选地生成抗体，体外免疫对于本发明的目的而言视为与体内免疫等效。可通过将免疫动物放血至玻璃或塑料容器中，在25℃下孵育1h，接着在4℃下孵育2-18h获得多克隆抗血清。通过离心(例如，1,000×g，持续10min)回收血清。每次放血可从兔子获得约20-50ml。
美国专利No.6,004,552中公开了Sf9细胞的生成。简言之，使用转运载体将编码ALK抗性突变体多肽的序列重组至杆状病毒中。用野生型杆状病毒DNA将质粒共转染至Sf9细胞中。鉴定重组杆状病毒感染的Sf9细胞并进行无性系纯化。
在一些实施方案中，抗体本质上为单克隆。“单克隆抗体”意指从一群大体上同源的抗体获得的抗体，即，除可能少量存在的可能自然存在的突变外，包含所述群的单独抗体相同。关于抗体的物种或来源，术语不受限制。术语涵盖全部免疫球蛋白以及片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv和保持抗体的抗原结合功能的其它片段。单克隆抗体为高度特异性，针对靶多肽上的单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰成分“单克隆”指出抗体从大体上同源的抗体群获得的特征，并且不得视为需要通过任何特殊方法生成抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可通过Kohler和Milstein(Nature 256:495-97,1975)首次描述的杂交瘤法制备，或可通过重组DNA法(见，例如，美国专利No.4,816,567)制备。也可使用(例如)Clackson等(Nature 352:624-28,1991)，Marks等(J.Mol Biol.222:581-97,1991)和美国专利No.5,514,548中描述的技术从噬菌体抗体库分离“单克隆抗体”。
“表位”意指抗体所生成的并且与抗体结合的抗原分子的一部分。表位可包含线性氨基酸残基(即，表位中的残基呈线性形式一个接一个地按顺序排列)、非线性氨基酸残基(本文也称为“非线性表位”-这些表位未按顺序排列)或线性和非线性氨基酸残基。对于目前公开的主题的目的，特异性抗ALK抗性突变体抗体识别的表位是在特殊ALK抗性突变体中找到的表位并且在天然ALK多肽中不存在。
如本文所讨论，可使用Kohler和Milstein的方法或其变型制备mAb。通常，用含有抗原的溶液使小鼠免疫。可通过于盐水，优选于佐剂例如弗氏完全佐剂中混合或乳化含抗原的溶液，并经肠胃外注射混合物或乳液进行免疫。本领域中已知的任何免疫方法均可用于获得本发明的单克隆抗体。动物免疫之后，取出脾(并且任选地，几个大的淋巴结)并分离成单个细胞。可通过将细胞悬浮液涂在涂覆有目标抗原的板或孔上筛选脾细胞。表达对抗原有特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞与板结合并未冲洗掉。然后诱导所得的B细胞或所有分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤，并且在选择培养基中培养。通过连续稀释接种所得的细胞并测定特异性结合目标抗原(并未与无关抗原结合)的抗体的生成。然后在体外(例如，在组织培养瓶或空心纤维反应器中)或在体内(如小鼠体内的腹水)培养所选的mAb分泌杂交瘤。
要使用重组DNA法制备本发明的抗ALK抗性突变体抗体时，使用常规方法(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)易于分离编码单克隆抗体的DNA并测序。本文所述的杂交瘤细胞可用作此DNA的来源。一经分离，就可将DNA置于表达载体中，然后转染至不以其它方式生成免疫球蛋白的宿主细胞中，例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。关于细菌中编码抗体的DNA的重组表达的评论文章包括Skerra(1993)Curr.OpinioninImmunol.5:256-62；和Phickthun(1992)Immunol Revs.130:151-88。可选地，如美国专利No.5,545,403、5,545,405和5,998,144中所公开，在诸如CHO细胞系的细胞系中可生成抗体。简言之，用分别能够表达轻链和重链的载体转染细胞系。通过转染单独载体上的两种蛋白质，可生成嵌合抗体。另一个优点是抗体的正确糖基化。
另外，如本文所使用的术语“抗ALK抗性突变体抗体”涵盖嵌合和人源化抗ALK抗性突变体抗体。“嵌合”抗体意指使用重组脱氧核糖核酸技术最优选衍生的包含人(包括免疫学“相关”物种，例如，黑猩猩)和非人组分的抗体。因此，嵌合抗体的恒定区最优选为与自然人抗体的恒定区大体上相同；嵌合抗体的可变区最优选为源自非人来源并且对ALK抗性突变体抗原具有所需抗原特异性。非人来源可为可用于生成针对人ALK抗性突变体抗原或包含人ALK抗性突变体抗原的物质的抗体的任何脊椎动物来源。此类非人来源包括但不限于啮齿动物(例如，兔子、大鼠、小鼠等；见，例如，美国专利No.4,816,567)和非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等；见，例如，美国专利No.5,750,105和5,756,096)。如本文所使用，词组“免疫学活性”当用于提及嵌合/人源化抗ALK抗性突变体抗体时指结合特殊ALK抗性突变体的嵌合/人源化抗体。
“人源化”意指含有源自非人免疫球蛋白序列的最小序列的抗ALK抗性突变体抗体的形式。对于大部分而言，人源化抗体是其中来自受体的超变区(也称为互补决定区或CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔子或具有所需特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物的超变区的残基置换的人免疫蛋白(受体抗体)。词组“互补决定区”指一起限定天然免疫蛋白结合位点的自然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。见，例如，Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196:901-17；和Kabat等(U.S.Dept.of Health andHumanServices,NIH Publication No.91-3242,1991)。词组“恒定区”指抗体分子赋予效应子功能的部分。
基本上可按照Jones等(1986)Nature 321:522-25；Riechmann等(1988)Nature332:323-27；和Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-36描述的方法，通过将啮齿动物或突变啮齿动物CDR或CDR序列取代为人抗体的相应序列进行人源化。同样见美国专利No.5,225,539、5,585,089、5,693,761、5,693,762和5,859,205。在一些情况下，可用相应非人残基置换人免疫球蛋白的一个或多个可变区的骨架区内的残基。(见，例如，美国专利No.5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗体可能包含在受体抗体或供体抗体中未找到的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能(例如，获得所需亲和力)。一般而言，人源化抗体将包含大体上所有，至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或大体上所有的超变区与非人免疫球蛋白的超变区相对应，并且所有或大体上所有的骨架区为人免疫球蛋白序列的骨架区。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少一部分。相应地，此类“人源化”抗体可能包括其中大体上少于完整人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代的抗体。
术语“抗ALK抗性突变体抗体”还涵盖非人哺乳动物宿主，更特别地转基因小鼠体内生成的特征在于失活的内源免疫球蛋白基因座的异源或经修饰抗ALK抗性突变体抗体。在此类转基因动物中，致使表达宿主免疫球蛋白的轻亚单位和重亚单位的主管内源基因为非功能性并且经类似人免疫球蛋白基因座取代。这些转基因动物在轻或重宿主免疫球蛋白亚单位大体上不存在时产生人抗体。见，例如，美国专利No.5,877,397和5,939,598。优选地，可通过使转基因小鼠免疫获得特殊ALK抗性突变体的全人抗体。美国专利No.6,075,181、6,091,001和6,114,598中公开了一种此类小鼠。
抗ALK抗性突变体抗体的片段适合用于本发明的方法中，只要它们保持全长抗体的所需亲和力。因此，抗ALK抗性突变体抗体的片段将保持与特殊ALK抗性突变体多肽特异性结合的能力。此类片段的特征在于性质与相应全长抗ALK抗性突变体抗体相似；即，片段将特异性结合特殊ALK抗性突变体多肽。本文将此类片段称为“抗原结合”片段。
抗体的适合抗原结合片段包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fv片段和单链抗体分子。“Fab”意指由轻链和重链的一部分构成的免疫球蛋白单价抗原结合片段。F(ab’)2意指含有两条轻链和两条重链的一部分的免疫球蛋白双价抗原结合片段。“单链Fv”或“sFv”抗体片段意指包含抗体的VH和VL结构域的片段，其中这些结构域存在于多肽单链上。见，例如，美国专利No.4,946,778、5,260,203、5,455,030和5,856,456。通常，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间使得sFv能够形成供抗原结合的所需结构的多肽连接子。sFv的评论，见Pluckthun(1994)，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies中，第113卷，Rosenburg和Moore编(Springer-Verlag,New York)，第269-315页。
可从使用例如McCafferty等(1990)Nature 348:552-54；和美国专利No.5,514,548中所述的技术生产的抗体噬菌体库中分离抗体或抗体片段。Clackson等(1991)Nature352:624-28和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222:581-97分别描述了使用噬菌体库分离鼠和人抗体。后续公布描述了通过链改组生成高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等(1992)Bio/Technology 10:779-83)，以及按构建极大噬菌体库的策略进行组合感染和体内重组(Waterhouse等(1993)Nucleic.Acids Res.21:2265-66)。因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆杂交瘤技术的可行替代方案。
已经研发了各种技术用于生产抗体片段。传统上，通过蛋白酶解完整抗体得到这些片段(见，例如Morimoto等(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-17；和Brennan等(1985)Science 229:81-3)。然而，现可通过重组宿主细胞直接生成这些片段。例如，可从以上讨论的抗体噬菌体库中分离抗体片段。可选地，可从大肠杆菌直接回收Fab片段并且化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等(1992)Bio/Technology 10:163-67)。根据另一方法，可直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。对于技术人员而言，生产抗体片段的其它技术显而易见。
本发明提供了鉴定目前公开的特殊ALK抗性突变体的特异性结合剂和/或抑制剂的方法(本文也称为“筛选测定”)。如本文所讨论，各种ALK抗性突变体多肽结合剂的鉴定令人感兴趣，包括ALK抗性突变体特异性结合剂和ALK抗性突变体抑制剂。
ALK抗性突变体结合剂或ALK抗性突变体抑制剂的筛选方法包括确定试验化合物是特异性还是非特异性结合ALK抗性突变体和/或确定试验化合物是否可降低特殊ALK抗性突变体的激酶活性。
各种筛选测定中采用的候选试剂可包括任何化合物，包括(例如)肽、拟肽、多核苷酸、小分子、抗体或其它药物。在某些实施方案中，候选试剂为小分子。在可使用本领域中已知的组合库方法中大量方法的任一种获得此类候选试剂，所述组合库方法包括需要去卷积的生物库、空间可寻址平行固相或液相库、合成库方法，“一珠一化合物”库方法和使用亲和色谱法选择的合成库方法。生物库方法限于肽库，而其它4种方法可适用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。
在本领域，例如在DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422；Zuckermann等(1994).J.Med.Chem.37:2678；Cho等(1993)Science 261:1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；和Gallop等(1994)J.Med.Chem.37:1233中可找到合成分子库的方法的实例。
已知的药理学试剂，甚至已知的ALK抑制剂可受定向或随机化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、扩增以生成可测试抑制至少一种ALK抗性突变体的激酶活性的能力的结构类似物。可选地，候选试剂可源自生物体，包括细菌、真菌、植物或动物。
化合物库可存在于溶液中(例如，Houghten(1992)Bio/Techniques13:412-421)或珠子(Lam(1991)Nature 354:82-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364:555-556)、细菌(美国专利No.5,223,409)、孢子(美国专利No.5,571,698、5,403,484和5,223,409)、质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869)或噬菌体上(Scott和Smith(1990)Science249:386-390；Devlin(1990)Science 249:404-406；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382；和Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310)。
例如，可通过偶联候选试剂和放射性同位元素或酶标记，以致可通过检测复合物中的标记试剂确定候选试剂与ALK抗性突变体多肽结合，实现确定候选试剂与特殊ALK抗性突变体结合的能力。例如，可用1251、35S、14C或3H直接或间接标记候选试剂，并且通过放射线发射直接计数或通过闪烁计数检测的放射性同位素。可选地，可用(例如)辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶对候选试剂进行酶标记，并且通过确定适当底物向产物的转化检测酶标记。
在一个实施方案中，鉴定ALK抗性突变体的特异性结合剂的测定法为无细胞测定法，包括使ALK抗性突变体多肽与候选试剂接触并确定候选试剂与ALK抗性突变体多肽结合的能力。可直接或间接确定候选试剂与ALK抗性突变体多肽的结合。间接测定法可包括测定ALK激酶活性的降低(例如，ALK底物的磷酸化)。
在一些测定法中，可能期望固定ALK抗性突变体或候选试剂以便测定的自动操作。在一个实施方案中，ALK抗性突变体可从细胞溶解产物中免疫沉淀，其中所述复合物与基质(例如，珠)结合。在另一实施方案中，可提供融合蛋白以向候选试剂或ALK抗性突变体多肽添加使得候选试剂或ALK抗性突变体与基质结合的结构域。例如，可将包含谷胱甘肽-S-转移酶/ALK抗性突变体融合蛋白的ALK抗性突变体多肽吸附至谷胱甘肽琼脂糖珠(SigmaChemical,St.Louis,MO)或谷胱甘肽源微量滴定板上，然后与候选试剂组合，并且在有益于在候选试剂和ALK抗性突变体之间形成复合物的条件下(例如，在生理盐和pH条件下)孵育混合物。孵育之后，洗涤珠或微量滴定板的孔以去除任何未结合组分并且例如以上所述，直接或间接测量候选试剂和ALK抗性突变体多肽的复合物形成。
将蛋白质固定在基质上的其它技术也可用于本发明的筛选测定中。例如，可利用生物素和链霉亲和素的偶联固定ALK抗性突变体多肽或候选试剂。可使用本领域中众所周知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals,Rockford,IL)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化ALK抗性突变体或候选试剂，并固定在涂覆链霉亲和素的板(Pierce Chemicals)的孔中。
在本发明的又一方面，在双杂交测定或三杂交测定中ALK抗性突变体多肽可用作“诱饵蛋白”(见，例如，美国专利No.5,283,317；Zervos等(1993)Cell 72:223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054；Bartel等(1993)Bio/Techniques 14:920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene 8:1693-1696；和PCT公布No.WO 94/10300)，以鉴定与ALK抗性突变体多肽结合或相互作用，并且在一些实施方案中，抑制ALK抗性突变体激酶活性的其它蛋白质。
在需要特异性结合ALK抑制剂抗性突变体的候选试剂的实施方案中，当与候选试剂接触时，ALK抑制剂抗性突变体可呈活性或非活性状态。活性状态是在活化结构域中的3个酪氨酸残基(全长ALK的酪氨酸1278、1282和1283)磷酸化的状态。相反，非活性状态是其中活化结构域酪氨酸残基未磷酸化并且活化结构域呈封闭构象的状态。
在需要ALK抗性突变体抑制剂的那些实施方案中，测定包括使ALK抗性突变体多肽与候选试剂接触并确定候选试剂降低或完全抑制ALK抗性突变体的激酶活性的能力。例如，可通过确定在试验化合物存在下ALK抗性突变体磷酸化ALK底物或自体磷酸化的能力实现确定候选试剂抑制ALK抗性突变体活性的能力。本文其它地方讨论了测定ALK抗性突变体的激酶活性的方法，并且包括体外激酶测定法，其中通过亲和纯化或免疫沉淀分离ALK多肽并且在ATP存在下测量ALK的自体磷酸化或底物蛋白或肽的磷酸化。
与特异性结合剂的筛选测定相似，在对抗性突变体的抑制剂的筛选中，当与候选试剂接触时ALK抗性突变体可呈活性或非活性状态。尤其需要与非活性状态的ALK结合的抑制剂，因为当无活性时受体酪氨酸激酶的激酶结构域的结构通常比活化激酶的构象更独特。在ALK抗性突变体与非活性状态的候选试剂接触的那些实施方案中，在测试候选试剂对激酶活性的影响之前活化激酶。在ALK突变体多肽包含配体结合结构域的那些情况下可通过添加配体(例如，多效营养因子、中期因子)活化ALK抑制剂抗性突变体。可选地，ALK抗性突变体多肽可包含激酶的细胞质结构域(例如，氨基酸1058-1620)，包括激酶结构域连同与下游效应子相互作用所必需的结构域，与可诱导二聚化或寡聚化结构域融合。可诱导二聚化结构域或可诱导寡聚化结构域是在二聚化或寡聚化配体存在下可经刺激二聚或寡聚化的多肽序列。可诱导的二聚化结构域的非限制性实例为包含至少一个可通过添加可透过细胞的合成二聚化配体FK1012二聚化的FKBP12多肽的二聚化结构域(Spencer等(1993)Science 262:989，通过引用整体并入本文)。一旦二聚化或寡聚化，ALK抗性突变体可诱导的二聚化/寡聚化结构域融合蛋白变得有活性。
基于细胞的测定也可用于测量ALK激酶活性，其中使用(例如)免疫印迹或酶联免疫测定确定ALK自体磷酸化或ALK底物的磷酸化。也可用基于细胞的测定间接评定对ALK激酶活性的抑制。在此类实施方案中，ALK抗性突变体在真核细胞中表达(内源性或外源性，其中例如通过例如转换引入序列)。如果全长ALK抗性突变体多肽用于此类实验，向培养物中添加活化配体(例如，多效生长因子、中期因子)。在其它实施方案中，ALK抗性突变体为组成型活性ALK抗性突变体-致癌融合蛋白。还有其它实施方案中，ALK抗性突变体多肽包含与可诱导的二聚化或寡聚化结构域融合的细胞质结构域(例如，氨基酸1058-1620)并且通过添加可透过细胞的二聚化或寡聚化配体活化融合蛋白(Spencer等(1992)Science 262:989)。ALK的活化导致刺激细胞增殖、细胞存活，促进锚定非依赖生长和细胞迁移和侵袭。因此，可基于候选试剂抑制表达活化ALK抗性突变体的细胞的细胞生长，刺激细胞死亡，抑制锚定非依赖生长和/或抑制细胞迁移或侵袭的能力选择抑制ALK抗性突变体的激酶活性的候选试剂。
如本文所使用，“细胞生长”指整个细胞周期的细胞增殖、细胞分裂或进展。“细胞死亡”包括细胞凋亡和坏死。此类基于细胞的测定在本领域中已知(von Bubnoff等(2005)Blood 105:1652-1659；vonBubnoff等(2006)Blood 108:1328-1333；Kancha等(2009)ClinCancerRes 15:460-467；von Bubnoff等(2009)Cancer Res 69:3032-3041；vonBubnoff等(2005)Cell Cycle 4:400-406；各自通过引用整体并入本文)并且在本文其它地方进行描述(见实施例1)。
本领域中任何已知方法均可用于测量细胞的生长速率或对细胞存活的影响，包括但不限于光密度(OD600)、CO2生成、O2消耗，测量线粒体功能的测定法，例如利用四唑盐(例如，MTT、XTT)或其它比色试剂(例如可从Roche获得的WST-1试剂)的测定法，测量或估计DNA含量的测定法，包括但不限于诸如利用荧光染料Hoechst 33258的荧光测定法，测量或估计蛋白质含量的测定法，包括但不限于磺酰罗丹明B(SRB)测定法，手动或自动细胞计数(用或不用锥虫蓝染剂以辨别活细胞)和用手动或自动菌落计数的克隆形成测定法。可用于测量细胞凋亡水平的测定法的非限制性实例包括但不限于测量DNA片段化、半胱天冬酶活化测定法、TUNEL染色、膜联蛋白V染色。
“锚定非依赖生长”指，与必须附着于胞外基质(锚定)存活和生长的附着正常细胞相反，甚至不需要此类锚定就能够生长的癌细胞的一般基本性质。测量细胞的锚定依赖性的方法在本领域中已知并且包括使细胞在软琼脂培养基中生长或在可形成球状体(细胞团块)的条件下培养细胞。美国专利申请公布No.2008/0090776和2009/0099193中描述了此类测定法。
“细胞迁移”指在一些实施方案中朝向靶(例如，生长因子)的细胞移动，也称为趋化性。“细胞侵袭”指通过基质，例如胞外基质的细胞移动。本领域中已知测量细胞迁移和侵袭的方法，包括跨孔测定，其中通过定量第二腔室中的细胞数量测量细胞从一个腔室至第二腔室的移动。在该测定法的变型中，在第二腔室中提供化学引诱剂和/或用包含胞外基质的各种组分(例如，胶原)的基质将腔室隔开。
可用于筛选ALK抗性突变体的抑制剂的其它测定法包括使用ALK活性异常相关癌症的体内动物模型(例如，异种移植物)，所述模型表达ALK抗性突变体。非人动物模型可为(例如)小鼠(例如，裸小鼠)、大鼠或仓鼠。内源性表达ALK抗性突变体多肽的癌细胞或通过表达ALK抗性突变体转化的细胞可经皮下、皮内或腹膜内植入或植入每个器官中。也可使用已经基因工程化为表达ALK抗性突变体-致癌融合蛋白的非人转基因动物，例如本文其它地方所述的非人转基因动物。可通过各种施用方法，例如口服、静脉内、皮下和腹膜内施用，施用候选试剂并测量动物模型肿瘤的体积或重量或疾病的进展确认候选试剂抑制ALK激酶活性的能力。此类方法在本领域中已知并且在美国专利申请公布No.2008/0090776和2009/0099193中有描述。
在一些实施方案中，抑制ALK抗性突变体激酶活性的试剂的筛选测定法包括筛选特异性减少目前公开的ALK抗性突变体或ALK抗性突变体-致癌融合蛋白的表达的试剂。“减少”多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平意指，ALK抗性突变体的多核苷酸或多肽水平在统计上低于未暴露于沉默元件的适当对照中相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在特殊实施方案中，根据目前公开的主题降低靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平导致适当对照中相同靶序列的多核苷酸水平或由其编码的多肽的水平小于95%、小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%或小于5%。本文其它地方讨论了测定RNA转录物的水平、编码多肽的水平或多核苷酸或多肽的活性的方法。
因此，本发明进一步提供了通过将沉默元件引入表达ALK抗性突变体的细胞中降低ALK抗性突变体的表达水平的方法和组合物，一旦引入或表达沉默元件，所述沉默元件就降低或消除ALK抗性突变体靶多核苷酸和由其编码的多肽的表达水平。进一步地，筛选特异性减少ALK抗性突变体表达的候选试剂的方法包括将候选试剂(例如，沉默元件)引入表达ALK抗性突变体的细胞中并确定ALK抗性突变体的表达水平。
可通过本领域中已知的任何方法抑制ALK抗性突变体的表达，包括引入抑制ALK抗性突变体表达的多肽，引入包含编码用于转座子插入ALK突变体基因的多核苷酸的沉默元件的核苷酸序列，同源重组/基因敲除ALK突变体基因，编码与ALK突变体基因结合的锌指蛋白并减少其表达的沉默元件，编码反义寡核苷酸或dsRNA分子(例如，shRNA、siRNA)的沉默元件或编码抑制Nrl表达或活性的抗体或其它多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，沉默元件编码与ALK抗性突变体基因结合，导致基因表达减少的锌指蛋白。在特殊实施方案中，锌指蛋白与ALK抗性突变体基因的调控区结合。在其它实施方案中，锌指蛋白与编码ALK抗性突变体的信使RNA(即，转录物)结合并防止其翻译。例如，在通过引用并入本文的美国专利No.6,453,242中描述了选择锌指蛋白靶向位点的方法。
在本发明的一些实施方案中，通过破坏ALK抗性突变体基因减少或消除ALK抗性突变体的表达。可通过本领域中已知的任何方法破坏ALK抗性突变体基因。例如，在一个实施方案中，通过转座子标签法破坏基因。在另一实施方案中，通过使用随机或定向诱变诱使细胞突变并选择ALK活性降低的细胞来破坏基因。
在本发明的一个实施方案中，转座子标签法用于减少或消除ALK抗性突变体的表达。转座子标签法包括在内源ALK抗性突变体基因内插入转座子以减少或消除ALK抗性突变体的表达。在该实施方案中，通过在ALK抗性突变体基因的调控区或编码区内插入转座子减少或消除ALK抗性突变体基因的表达。ALK抗性突变体基因的外显子、内含子、5’或3’非翻译序列、启动子或任何其它调控序列内的转座子可用于减少或消除编码的ALK抗性突变体的表达和/或活性。在这些实施方案中，沉默元件包含或编码可插入ALK抗性突变体基因内的靶转座子。
在其它实施方案中，沉默元件包含通过与ALK抗性突变体基因区的同源重组用于定点诱变的核苷酸序列。基因外显子中的插入突变通常产生无效突变体。本发明涵盖另外的降低或消除ALK抗性突变体的活性或表达的方法，例如包括基于启动子的沉默的方法。见，例如，Mette等(2000)EMBO J.19:5194-5201；Sijen等(2001)Curr.Biol.11:436-440；Jones等(2001)Curr.Biol.11:747-757。
如本文所使用，术语“沉默元件”指当表达或引入细胞中时能够降低或消除靶多核苷酸序列或由其编码的多肽的表达水平的多核苷酸。沉默元件可包含或编码反义寡核苷酸或干扰RNA(RNAi)。术语“干扰RNA”或“RNAi”指可进入RNAi途径并因此减少靶基因的表达的任何RNA分子。RNAi途径特征在于起作用以降低或阻碍靶mRNA翻译的Dicer核酸酶和RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RNAi与通过“反义”机制起作用的反义寡核苷酸截然不同，所述机制通常包括由单链寡核苷酸通过RNA酶H介导的途径抑制靶转录物。见，Crooke(编)(2001)“Antisense Drug Technology:Principles,Strategies,and Applications”(第1版),Marcel Dekker；ISBN:0824705661；第1版。
如本文所使用，术语“基因”具有如本领域中所理解的含义。一般而言，除编码序列(开放阅读框)外，使基因包括基因调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。将进一步了解，“基因”的定义包括对不编码蛋白质，而编码功能性RNA分子或其前体，例如微RNA或siRNA前体、tRNA等的核酸的引用。
如本文所使用，“靶基因”包含人们期望降低表达水平的任何基因。“降低”基因的表达水平意指，编码多核苷酸(即，靶转录物)或编码多肽的水平在统计上低于未暴露于沉默元件的适当对照中的编码多核苷酸水平或编码多肽水平。在特殊实施方案中，减少ALK抗性突变体基因的表达导致适当对照(例如，沉默元件引入/表达之前的相同细胞或在分化的相似阶段、相同表型、相同基因型的相似细胞)中ALK抗性突变体的水平或ALK抗性突变体多肽的水平小于95%、小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%或小于5%。测定RNA转录物的水平、编码多肽的水平或多核苷酸或多肽的活性的方法在本领域中已知，并且在本文其它地方有描述。
在本文中使用的术语“互补”根据其领域接受的含义，指两个核苷、核苷酸或核酸等之间通过氢键精确配对(例如，沃森-克里克碱基配对或胡斯坦碱基配对)的能力。例如，当从相反5’至3’方向(即，从反向平行方向)比对核酸时，如果第一个核酸某一位置上的核苷酸能够与第二个核酸中位于该核苷酸对面的核苷酸稳定氢键结合，则认为核酸在所述位置互补(其中位置可相对于任一核酸的任一末端定义，通常对于5’末端)。相互相对定位的核苷酸可称为“碱基对”。互补碱基对含有两个互补核苷酸，例如A和U、A和T、G和C等，而非互补碱基对含有两个非互补核苷酸(也称为错配)。当每个分子中相互氢键结合的核苷酸占用足够数量的相应位置，即，足够数量的碱基对互补时，将两个多核苷酸称为相互互补。
如本文所使用的术语“杂交”指两个互补核酸序列之间的相互作用，其中在适当条件下两个序列保持相互相联。
沉默元件可包含干扰RNA或反义寡核苷酸、干扰RNA或反义寡核苷酸的前体、用于转录干扰RNA或反义寡核苷酸的模板或用于转录前体干扰RNA或反义寡核苷酸的模板，其中在细胞内加工前体以生成干扰RNA或反义寡核苷酸。因此，例如，dsRNA沉默元件包括dsRNA分子、能够形成dsRNA的转录物或聚核糖核苷酸、一种以上能够形成dsRNA的转录物或聚核糖核苷酸、编码dsRNA分子的DNA或编码dsRNA分子的一条链的DNA。当沉默元件包含编码干扰RNA的DNA分子时，认识到DNA可在细胞中瞬时表达或稳定并入细胞的基因组中。在本文的其它地方更详细地描述了此类方法。
沉默元件可通过影响靶RNA转录物的水平，通过影响靶RNA转录物的翻译或通过影响转录前水平的表达(即，通过调节染色质结构、甲基化模式等改变基因表达)降低或消除靶基因的表达水平。见，例如，Verdel等(2004)Science 303:672-676；Pal-Bhadra等(2004)Science303:669-672；Allshire(2002)Science 297:1818-1819；Volpe等(2002)Science297:1833-1837；Jenuwein(2002)Science 297:2215-2218；和Hall等(2002)Science 297:2232-2237。测定能够减少或消除靶基因的表达的功能性干扰RNA的方法在本领域中已知并且在本文的其它地方进行描述。
来自靶基因的转录物(即，靶转录物)的任何区域可用于设计共有足够序列同一性的沉默元件的结构域，以允许沉默元件降低多核苷酸或靶基因编码的多肽的水平。例如，可将沉默元件设计为与靶转录物的5’非翻译区、靶转录物的3’非翻译区、靶转录物的外显子区、靶转录物的内含子区及其任何组合共有序列同一性。
可通过使用(例如)RNA印迹、核酸酶保护测定法、逆转录(RT)-PCR、实时RT-PCR、微阵列分析等测量靶转录物的量直接估计沉默元件降低靶转录物水平的能力。可选地，可使用各种基于亲和力的方法(例如，使用与靶多肽特异性结合的配体或抗体)，包括但不限于蛋白质印迹、免疫测定法、ELISA、流式细胞术、蛋白质微阵列等直接测量沉默元件降低靶基因和靶转录物编码的多肽水平的能力。还有其它方法中，例如，通过测量转录物编码的多肽的功能活性或通过测量转录物编码的多肽产生的信号间接估计沉默元件降低靶基因编码的靶多肽水平的能力。
本领域的普通技术人员将易于意识到，可根据任何可用技术制备沉默元件，包括但不限于化学合成、在体内或体外酶促或化学裂解、在体内或体外模板转录或前述的组合。
以下更详细地讨论各种类型的沉默元件。
在一个实施方案中，沉默元件包含或编码双链RNA分子。如本文所使用，“双链RNA”或“dsRNA”指由单个自补RNA分子形成的多核糖核苷酸结构或通过表达至少两条不同RNA链形成的多核糖核苷酸结构。相应地，如本文所使用，术语“dsRNA”指涵盖用于描述能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子的其它术语，包括(例如)小RNA(sRNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、发夹RNA、短发夹RNA(shRNA)等。见，例如，Meister和Tuschl(2004)Nature 431:343-349和Bonetta等(2004)NatureMethods 1:79-86。
在特定实施方案中，dsRNA的双链体或双链区的至少一条链与靶基因共有充分的序列同一性或序列互补性以允许dsRNA降低靶基因的表达水平。如本文所使用，与靶转录物互补的链为“反义链”，而与靶转录物同源的链为“有义链”。
在一个实施方案中，dsRNA包括发夹RNA。发夹RNA包括能够折回到自身以形成双链结构的RNA分子。可采用多个结构作为发夹元件。例如，自身杂交以形成发夹结构的发夹RNA分子可包含单链环区和碱基配对茎。碱基配对茎区可包含与整个或部分靶转录物相对应的有义序列并且进一步包含与有义序列完全或部分互补的反义序列。因此，沉默元件的碱基配对茎区可确定沉默的特异性。见，例如，通过引用并入本文的Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:4985-4990。通过引用并入本文的Panstruga等(2003)Mol.Biol.Rep.30:135-140描述了对hpRNA构建体使体内基因表达沉默的效率的瞬时测定。
“短干扰RNA”或“siRNA”包含RNA双链体(双链区)并且可进一步包含一个或多个单链突出，例如3’或5’突出。虽然可使用17至29个核苷酸之间，包括17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29个核苷酸的长度，但是双链体可为约19个碱基对(bp)长。siRNA可由一起杂交的两个RNA分子形成或可选地由包括自杂交部分的单个RNA分子生成。siRNA的双链体部分可在双链体的一条或两条链中包括含有一个或多个未配对和/或错配核苷酸的一个或多个凸出部分或可含有一个或多个非互补核苷酸对。siRNA的一条链(本文称为反义链)包括与靶转录物杂交的部分。在某些实施方案中，siRNA的一条链(反义链)与靶转录物区的至少约17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸精确互补，或更意味着siRNA反义链与靶转录物杂交，在该长度上无单个错配(即，无单个非互补碱基对)。在其它实施方案中，siRNA反义链与靶转录物的靶部分之间可存在一个或多个错配。在未达到完全互补的实施方案中，siRNA反义链和靶转录物之间的任何错配可位于或靠近siRNA反义链的3’末端。例如，在某些实施方案中，反义链的核苷酸1-9、2-9、2-10和/或1-10与靶完全互补。
McManus等(2002)Nature Reviews Genetics 3:737-747和Dykxhoorn等(2003)Nature Reviews Molecular Cell Biology 4:457-467中讨论了设计有效siRNA分子的考虑因素。此类考虑因素包括siRNA的碱基组成，相对于转录物的5’和3’末端与siRNA反义链互补的靶转录物部分的位置等。各种计算机程序也可用于辅助(例如)从URL为www.sinc.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html的网站的Ambion(URL www.ambion.com的网站)选择siRNA序列。Semizarov等Proc.Natl.Acad.Sci.100:6347-6352中描述了也可采用的另外的设计考虑因素。
术语“短发夹RNA”或“shRNA”指包含杂交或能够杂交形成足够长以介导RNAi(通常长度在约17至29个核苷酸之间，包括长度为17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29个核苷酸，在一些实施方案中，长度通常为至少19个碱基对)的双链(双链体)结构的至少两个互补部分，和长度通常在约1至20个或1至10个核苷酸之间，形成连接在双链体部分的一端形成碱基对的两个核苷酸的环的至少一个单链部分。双链体部分可以，但是不需要由一个或多个未配对核苷酸组成的一个或多个凸出部分。在特定实施方案中，shRNA包含3’突出。因此，shRNA为siRNA的前体并且，一般而言，同样能够抑制靶转录物的表达。
尤其，可用Dicer在细胞内加工具有发夹(茎环)结构的RNA分子以获得称为短发夹RNA(shRNA)的siRNA结构，短发夹RNA含有两个相互杂交(自杂交)形成称为茎的双链(双链体)区的互补区，连接在双链体的一端形成碱基对的核苷酸的单链环，并且任选含有突出，例如3’突出。虽然也可使用更短和更长(例如，长达约29个nt)的茎，但是茎可包含约19、20或21bp长。环可包含约1-20个nt，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个nt，约4-10个或约6-9个nt。如果存在，突出可包含约1-20个nt或约2-10个nt。环可位于与期望抑制的靶转录物互补的区域(即，shRNA的反义部分)的5’或3’末端。
虽然shRNA含有自杂交的单个RNA分子，将意识到相对于靶mRNA，可认为所得的双链体结构包含有义和反义链或部分并且可因此认为是双链。因此本文将便于指出shRNA的有义和反义链或有义和反义部分，其中反义链或部分是与靶多核苷酸的靶部分形成或能够形成双链体并与之互补的分子片段，而有义链或部分是与反义链或部分形成或能够形成双链体并且在序列上与靶转录物的靶部分大体上相同的分子片段。一般而言，对选择shRNA分子反义链序列的考虑因素与选择靶向相同转录物的siRNA分子反义链序列的考虑因素相似。
在一些实施方案中，沉默元件包含或编码反义寡核苷酸。“反义寡核苷酸”是与靶基因完全或部分互补的单链核酸序列，并且可为DNA或其RNA对应物(即，其中DNA的T残基是RNA对应物中的U残基)。
本发明的反义寡核苷酸设计为可与靶RNA(例如，mRNA)或DNA杂交。例如，与mRNA分子杂交的寡核苷酸(例如，DNA寡核苷酸)可用于靶向mRNA进行RNA酶H消化。可选地，与mRNA分子的翻译起始位点杂交的寡核苷酸可用于防止mRNA翻译。在另一种方法中，可施用与双链DNA结合的寡核苷酸。此类寡核苷酸可形成三链体构建体并抑制DNA的转录。三螺旋配对防止双螺旋充分开口以允许聚合酶、转录因子或调控分子结合。可使用三螺旋形成的碱基配对规则和靶基因的核苷酸序列构建本发明的此类寡核苷酸。
作为非限制性实例，可靶向反义寡核苷酸以与以下区域杂交：mRNA帽区、翻译起始位点、翻译终止位点、转录起始位点、转录终止位点、聚腺苷酸化信号、3’非翻译区、5’非翻译区、5’编码区、中间编码区和3’编码区。在一些实施方案中，互补寡核苷酸设计为与基因的大多数5’单一序列杂交，包括跨越5’编码序列的约15-35个核苷酸的任一个。
相应地，根据本发明所述的反义寡核苷酸可包含约10至约100个核苷酸，包括但不限于约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个核苷酸。
可用标准技术生成反义核酸(见，例如，Shewmaker等美国专利No.5,107,065)。可使用OLIGO软件(Molecular Biology Insights,Inc.,Cascade,Colo.;http://www.oligo.net)设计适当寡核苷酸。
根据本发明的方法，由沉默元件靶向ALK抗性突变体基因。如本文所使用，当引入或表达沉默元件导致靶基因和靶转录物的表达大体上特异性减少或抑制时由沉默元件“靶向”靶基因或靶转录物。靶基因或靶转录物与沉默元件具有大体序列同一性或相似性或与之互补的特定区域已经由沉默元件“靶向”。
沉默元件靶向的ALK抗性突变体区域包含赋予对至少一种ALK激酶抑制剂的抗性的突变。在特定实施方案中，引入或表达沉默元件特异性降低了ALK抗性突变体的水平，意味着天然或野生型ALK序列的表达水平不受或极少受沉默元件影响。
如以上所讨论，本发明方法和组合物中采用的沉默元件可包含dsRNA(例如，shRNA)或反义RNA的DNA模板或可编码锌指结合蛋白。在此类实施方案中，在表达盒中发现编码dsRNA、反义RNA或锌指结合蛋白的DNA分子。
本发明进一步涉及通过上述筛选测定法鉴定的新型试剂及其如本文所述的用途。简言之，ALK抗性突变体特异性结合剂可用于检测ALK抗性突变体和诊断抗至少一种ALK激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症的方法中。ALK抗性突变体抑制剂和沉默元件在治疗患有此类癌症的患者中有用。
提供了用于检测编码ALK抗性突变体的多核苷酸或用于检测样品(例如，生物样品)中的ALK抗性突变体多肽的各种方法和组合物。生物样品可包括人们期望在其中检测编码特殊ALK抗性突变体或突变体多肽的多核苷酸的任何样品。术语“生物样品”旨在包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及受试者体内存在的组织、细胞和流体或其溶解产物。样品可包含任何临床上相关的组织，例如但不限于骨髓样品、肿瘤活检、细针抽吸物，或体液样品，例如血液、血浆、血清、淋巴、腹水、囊液或尿。
测定生物样品的ALK抑制剂抗性突变的方法包括使生物样品与抗ALK抗性突变体抗体或与特殊ALK抗性突变体多肽特异性结合的其它试剂接触，接着检测抗体或结合剂与ALK抗性突变体的结合。可通过与抗体或结合剂偶联的可检测标记(例如，放射性同位素、荧光标签、酶标签、化学发光标签)的存在或通过使用特异性结合ALK特异性结合剂的标记二次抗体或二次结合剂检测抗体或结合剂与ALK抗性突变体的结合。可用于使用特异性结合剂检测ALK抗性突变体多肽的测定法的非限制性实例包括免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、免疫组织化学法、免疫细胞化学法和流式细胞术。
本发明进一步提供了测定生物样品的ALK抑制剂抗性突变的方法，包括使生物样品与包含至少一种可特异性检测或特异性扩增编码ALK抑制剂抗性突变体的多核苷酸(例如，mRNA或基因组DNA)的多核苷酸的试剂接触，并检测编码突变体的多核苷酸。试剂可特异性检测或扩增编码ALK抑制剂抗性突变体的基因组DNA或编码突变体的RNA转录物。
在一个实施方案中，检测样品中编码ALK抗性突变体多肽或其活性变异体和片段的多核苷酸的方法包括使样品与能够特异性扩增编码ALK抗性突变体多肽或其活性变异体和片段的多核苷酸的扩增子的引物对接触，扩增，然后检测扩增子。在某些实施方案中，扩增子具有足够长度以特异性检测编码ALK抗性突变体多肽或其活性变异体和片段的多核苷酸。
在其它实施方案中，检测样品中编码ALK抗性突变体多肽或其活性变异体和片段的多核苷酸的方法包括使样品与能够特异性检测编码ALK抗性突变体多肽或其活性变异体或片段的多核苷酸的多核苷酸接触，并检测编码ALK抗性突变体多肽或其活性变异体或片段的多核苷酸。
在特定实施方案中，使样品与在严格杂交条件下与待检测靶序列杂交的多核苷酸探针接触。然后使样品和探针经受严格杂交条件并检测探针与靶序列的杂交。
如本文所使用，“探针”是常规可检测标记或报告分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂、酶等与之连接的分离的多核苷酸。此类探针与靶多核苷酸链互补，在本发明的特定实施方案中，靶多核苷酸链包含编码ALK抗性突变体的多核苷酸。脱氧核糖核酸探针可能包括通过使用ALK抗性突变体特异性引物进行PCR生成的探针，体外合成的寡核苷酸探针或从细菌人工染色体、福斯质粒(fosmid)或粘粒(cosmid)库获得的DNA。探针不但包括脱氧核糖核酸或核糖核酸而且包括聚酰胺和可特异性检测靶DNA序列的存在的其它探针物质。对于核酸探针而言，检测试剂的实例包括但不限于放射性标记探针、酶标记探针(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、亲和标记探针(生物素、抗生物素蛋白或链霉亲和素)和荧光标记探针(6-FAM、VIC、TAMRA、MGB、荧光素、若丹明、德克萨斯红[对于BAC/福斯质粒而言])。本领域的技术人员将易于认识到，可容易地将本发明所述的核酸探针并入本领域中众所周知的其中一种确定试剂盒形式中。
如本文所使用，“引物”是通过核酸杂交与互补靶DNA链退火在引物和靶DNA链之间形成杂交，然后用聚合酶(例如DNA聚合酶)沿着靶DNA链延伸的分离多核苷酸。本发明的引物对指其(例如)通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规核酸扩增方法用于扩增靶多核苷酸的用途。“PCR”或“聚合酶链式反应”是用于扩增特定DNA片段的技术(见，美国专利No.4,683,195和4,800,159；通过引用并入本文)。
“特异性检测”意指多核苷酸可用作在严格条件下与编码ALK抗性突变体的多核苷酸杂交的探针或多核苷酸可用于核酸测序技术中以测定包含ALK抗性突变体的区域的序列。“特异性扩增”意指多核苷酸可用作引物以特异性扩增编码ALK抗性突变体的多核苷酸的扩增子。允许特异性检测编码ALK抗性突变体的多核苷酸的杂交水平或程度足以区别编码ALK抗性突变体的多核苷酸和不编码所述多肽(例如，天然AKT；SEQ ID NO:1)的多核苷酸。“共有足够序列同一性或互补性以允许扩增编码ALK抗性突变体的多核苷酸”意指序列与编码ALK抗性突变体的多核苷酸的片段或整个长度共有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性或互补性。
探针和引物具有足够核苷酸长度以与靶DNA结合并特异性检测和/或扩增编码ALK抗性突变体的多核苷酸。人们认识到，可由操作人员确定杂交条件或反应条件以实现该结果。该长度可能是足够长以用于所选检测方法中的任何长度。通常，使用长度为8、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700个核苷酸或更多个，或约11-20、20-30、30-40、40-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800个或更多个核苷酸。
如本文所使用，“扩增DNA”或“扩增子”指为核酸模板的一部分的靶多核苷酸的多核苷酸扩增产物。例如，为确定生物样品是否包含ALK抗性突变，可使用包括源自与ALK抗性突变相邻的5’侧翼序列的第一引物和源自与ALK抗性突变相邻的3’侧翼序列的第二引物的引物对使生物样品的核酸补体经多核苷酸扩增方法，以生成能够区别ALK抗性突变体和天然或野生型ALK的扩增子。扩增的多核苷酸(扩增子)可为允许检测编码ALK抗性突变体的多核苷酸的任何长度。例如，扩增子长度可为约10、50、100、200、300、500、700、100、2000、3000、4000个核苷酸或更长。进一步地，在一些实施方案中，允许特异性检测多核苷酸的编码ALK抗性突变体的多核苷酸的扩增区(扩增子)的长度或序列足以区别编码ALK抗性突变体的多核苷酸和不编码所述多肽的多核苷酸。源自侧翼序列的引物对的成员之一可位于离抗性突变一定距离处。该距离范围可为一个核苷酸碱基对至扩增反应的极限，或约20,000个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用将在DNA热扩增反应中可能形成的引物二聚体明确排除在外。
例如，在Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Sambrook等编，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.1989(在下文中，“Sambrook等1989”)；CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等编，GreenePublishing andWiley-Interscience,New York,1992(定期更新)(在下文中，“Ausubel等，1992”)；和Innis等，PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,AcademicPress:San Diego,1990中描述了制备和使用探针和引物的方法。可由已知序列得到PCR引物对，例如通过使用用于该目的的计算机程序，例如Vector NTI版本10(Informax Inc.,Bethesda Md.)；PrimerSelect(DNASTAR Inc.,Madison,Wis.)；和Primer3(版本0.4.0.COPYRGT.,1991,Whitehead Institute forBiomedical Research,Cambridge,Mass.)中的PCR引物分析工具。另外，可视觉扫描序列和使用本领域的技术人员已知的指南人工鉴定引物。
可使用本领域中普通技术人员已知的各种核酸技术检测ALK抑制剂抗性突变，所述核酸技术包括但不限于：核酸测序；核酸杂交和核酸扩增。
核酸测序技术的说明性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。链终止子测序使用用经修饰核苷酸底物进行DNA合成反应的序列特异性终止。通过使用与该区域的模板互补的短放射性或其它标记的寡核苷酸引物在模板DNA上的特定位点开始延伸。使用DNA聚合酶、4种标准脱氧核苷酸碱基和一种低浓度的链终止核苷酸(最常见的是双脱氧核苷酸)延伸寡核苷酸引物。在4根单独管中重复该反应，每种碱基轮流作为双脱氧核苷酸。通过DNA聚合酶有限并入链终止核苷酸产生一系列仅在使用特殊双脱氧核苷酸的位置终止的相关DNA片段。对于每根反应管而言，通过在平板聚丙烯酰胺凝胶中或在装满粘性聚合物的毛细管中电泳将片段按大小分开。当你从凝胶顶部扫描至底部时，通过读出哪条带产生来自标记引物的可视标志确定序列。染料终止子测序可选地标记终止子。在单一反应中可通过用发出不同波长荧光的单独荧光染料标记每个双脱氧核苷酸链终止子进行完整测序。
本发明进一步提供了使用核酸杂交技术测定生物样品的ALK抗性突变的方法。核酸杂交包括使用针对纯化DNA、扩增DNA和固定细胞制剂的标记探针的方法(荧光原位杂交)。核酸杂交技术的非限制性实例包括使用适当探针的染色体物质的DNA(DNA:DNA)印迹杂交、原位杂交和FISH的已知方法。可使用包含靠近ALK抗性突变的核苷酸序列的此类核酸探针。“靠近”意指在ALK抗性突变的约100,000个碱基(kb)之内。
原位杂交(ISH)是使用标记互补DNA或RNA链作为探针将特定DNA或RNA序列局部化于组织的一部分或切片中，或，如果组织足够小，局部化于整个组织(整体原位杂交)中的一类杂交。DNAISH可用于确定染色体的结构。通常处理样品细胞和组织以将靶转录物固定到位和增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后洗掉过量探针。局部化用放射性、荧光或抗原标记碱基标记的探针并分别使用放射自显影术、荧光显微法或免疫组织化学法在组织中定量。ISH也可使用两种或更多种标记有放射性或其它非放射性标记的探针，以同时检测两种或更多种转录物。在一些实施方案中，使用荧光原位杂交(FISH)检测ALK抗性突变体。
核酸杂交的特定方法在本领域中众所周知并且可容易适用于本发明。可从许多参考中获得关于方法论的指导，包括：In situHybridization:Medical Applications(G.R.Coulton和J.de Belleroche编),Kluwer Academic Publishers,Boston(1992)；Insitu Hybridization:hi Neurobiology；Advances in Methodology(J.H.Eberwine、K.L.Valentino和J.D.Barchas编),Oxford University Press Inc.,England(1994)；Insitu Hybridization:A Practical Approach(D.G.Wilkinson编),Oxford UniversityPress Inc.,England(1992))；Kuo等(199V)Am.J.Hum.Genet.42:112-119；Klinger等(1992)Am.J.Hum.Genet.51:55-65；和Ward等(1993)Am.J.Hum.Genet.52:854-865)。也有可商购获得并提供进行FISH测定的方法的试剂盒(可从例如Oncor,Inc.,Gaithersburg,MD获得)。提供关于方法论的指导的专利包括U.S.5,225,326、5,545,524、6,121,489和6,573,043。这些所有参考通过引用特此整体并入并且可连同本领域的相似参考使用。
DNA印迹法可用于检测特定DNA序列。在此类方法中，片段化从样品提取的DNA，在基质凝胶上电泳分离并转移至膜滤器。使滤器结合DNA和与目标序列互补的标记探针杂交。检测与滤器结合的杂交探针。进一步地，本领域中已知的蛋白质印迹技术可用于检测编码ALK抗性突变体的特定RNA序列。
微阵列也可用于特异性检测ALK抗性多核苷酸。每个阵列由可复制模式的附于固体支撑物上的捕获探针组成。标记RNA与阵列上的互补探针杂交并通过激光扫描检测。确定阵列上每个探针的杂交强度并转化为表示相对基因表达水平的定量值。见，例如，美国专利No.6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316，各自通过引用整体并入本文。
在杂交技术中，使用与编码ALK抗性突变体多肽的靶多核苷酸选择性杂交的整个或部分多核苷酸。当提到多核苷酸探针时，“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶序列杂交至比其它序列明显更高的程度(例如，比本底高至少2倍)的条件。严格条件依赖序列并且在不同情况下将有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100%互补的靶序列(同源探测)。可选地，可调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测较低程度的同一性(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸或长度小于500个核苷酸。
如本文所使用，大体上相同或互补的序列是在高度严格条件下将和与之比较的核酸分子的补体特异性杂交的多核苷酸。促进DNA杂交的适当严格条件，例如约45℃下的6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃下2×SSC洗涤，为本领域的技术人员已知或可在CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。通常，杂交和检测的严格条件将为盐浓度低于约1.5M Na离子，通常在pH 7.0-8.3为约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)和对于短探针(例如，10-50个核苷酸)而言温度为至少约30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的严格条件。也可通过添加去稳定剂，例如甲酰胺达到严格条件。示例性低严格条件包括在37℃下用30-35%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交和在50-55℃下于1×至2×SSC(20×SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性中等严格条件包括在37℃下于40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、1%SDS中杂交和在55-60℃下于0.5×至1×SSC中洗涤。示例性高度严格条件包括在37℃下于50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中杂交和在60-65℃下于0.1×SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1%至约1%SDS。杂交的持续时间通常小于约24h，通常为约4至约12h。洗涤的持续时间将至少为足以达到平衡的时长。
在杂交反应中，特异性通常为杂交后洗涤的函数，关键因素为离子强度和最终洗涤液的温度。对于DNA-DNA杂交物而言，可由Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的方程式近似计算Tm：Tm=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%甲酰胺)-500/L；其中M为一价阳离子的摩尔浓度，%GC为DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，%甲酰胺为杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L为碱基对形式的杂交物的长度。Tm为50%互补靶序列与完全匹配探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH下)。每1%错配，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90%同一性的序列，可使Tm降低10℃。通常，在定义的离子强度和pH下，对于特定序列及其补体而言选择严格条件为比热熔点(Tm)低约5℃。然而，高度严格条件可利用在低于热熔点(Tm)1、2、3或4℃的温度下杂交和/或洗涤；中度严格条件可利用在低于热熔点(Tm)6、7、8、9或10℃的温度下杂交和/或洗涤；低严格条件可利用在低于热熔点(Tm)11、12、13、14、15或20℃的温度下杂交和/或洗涤。使用方程式、杂交和洗涤组合物和所需Tm，普通技术人员将理解，本质上描述了杂交和/或洗涤溶液严格性的变化。如果所需程度的错配导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，最好提高SSC浓度，以便可使用较高温度。Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-HybridizationwithNucleic Acid Probes，第1部分，第2章(Elsevier,New York)；和Ausubel等编(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York)中找到大量对核酸杂交的指导。见，Sambrook等(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview，New York)和Haymes等(1985)Nucleic Acid Hybridization,a PracticalApproach,IRLPress,Washington,D.C中。
核酸扩增技术的说明性非限制性实例包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、连接酶链式反应(LCR)(Weiss(1991)Science 254:1292，通过引用整体并入本文)、链置换扩增(SDA)(Walker等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396；美国专利No.5,270,184和5,455,166，各自通过引用整体并入本文)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。聚合酶链式反应(美国专利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188，各自通过引用整体并入本文)，通常称为PCR，使用多循环的变性、引物对退火为相反链和引物延伸为指数增长拷贝数的靶核酸序列。其它各种排列的PCR，见，例如美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159；Mullis等(1987)Meth.Enzymol.155:335；和Murakawa等(1988)DNA 7:287，各自通过引用整体并入本文。
设计PCR引物和PCR克隆的方法通常在本领域中已知并且在Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Plainview，New York)中公开。同样见Innis等编(1990)PCR Protocols:A Guide toMethodsandApplications(Academic Press,New York)；Innis和Gelfand编(1995)PCRStrategies(Academic Press,New York)；和Innis和Gelfand编(1999)PCR MethodsManual(Academic Press,New York)。美国专利No.4,683,195、4,683,202和Chen等(1994)PNAS 91:5695-5699中进一步描述了扩增方法。这些方法以及本领域中已知的其它DNA扩增方法可用于本发明实施方案的实践中。应理解，特定PCR方法中许多参数可能需要调节至特定实验室条件并且可能稍微修改而仍允许收集类似结果。这些调节对于本领域的技术人员而言将显而易见。通常采用热循环仪进行多核苷酸的特异性扩增。可使用自动化装置，通常称为热循环仪进行PCR的变性、退火和聚合循环。美国专利No.5,612,473、5,602,756、5,538,871和5,475,610中描述了可采用的热循环仪，其内容通过引用并入本文。
一种说明性检测方法提供了实时扩增过程的定量评估。“实时”扩增过程的评估包括在扩增反应期间持续或定期确定反应混合物中扩增子的量，并使用确定值计算样品中最初存在的靶序列的量。本领域中众所周知基于实时扩增确定样品中存在的初始靶序列的量的各种方法。这些方法包括各自通过引用整体并入本文的美国专利No.6,303,305和6,541,205中公开的方法。通过引用整体并入本文的美国专利No.5,710,029中公开了另一种确定样品中最初存在的靶序列的量的方法。
可通过使用各种多数具有茎-环结构的自杂交探针实时检测扩增产物。标记此类自杂交探针，以致它们可发射出不同可检测信号，这取决于探针在与靶序列杂交过程中呈自杂交状态还是改变状态。通过非限制性实例，“分子火炬”是一类自杂交探针，其包括通过连接区(例如，非核苷酸连接子)连接并且在预定杂交测定条件下相互杂交的不同自补区域(称为“靶结合结构域”和“靶封闭结构域”)。通过引用整体并入本文的美国专利No.6,534,274中公开了分子火炬和各种类型的相互作用标记对。
具有自补性的检测探针的另一实例为“分子信标”。分子信标包括具有靶互补序列的核酸分子，在扩增反应中不存在靶序列时保持探针呈封闭构象的亲和对(或核酸臂)和当探针呈封闭构象时相互作用的标记对。靶序列和靶互补序列的杂交将亲和对成员分开，从而使探针转换为开放构象。由于标记对的相互作用减小，可检测向开放构象的转换，所述标记对可能为(例如)荧光团和猝灭剂(例如，DABCYL和EDANS)。通过引用整体并入本文的美国专利No.5,925,517和6,150,097中公开了分子信标。
其它自杂交探针对于本领域的普通技术人员而言众所周知。通过非限制性实例，诸如美国专利No.5,928,862(通过引用整体并入本文)公开的具有相互作用标记的探针结合对可适合用于本发明中。用于检测单核苷酸多态性(SNP)的探针系统也可用于本发明中。另外的检测系统包括如通过引用整体并入本文的美国公布No.20050042638中公开的“分子开关”。其它探针，例如包含插入染料和/或荧光染料的探针，也对本发明中扩增产物的检测有用。见，例如，美国专利No.5,814,447(通过引用整体并入本文)。
可在试剂盒中提供可用于特异性检测目前公开的ALK抗性突变体的试剂。如本文所使用，“试剂盒”指一套用于鉴定、检测和/或定量编码ALK抗性突变体多肽的多核苷酸或检测和/或定量生物样品中的ALK抗性突变体多肽的试剂。如本文所使用，术语“试剂盒”和“系统”意指在特定实施方案中，与一种或多种其它类型的元件或组件(例如，其它类型的生化试剂、容器、包装(例如用于商业销售的包装)、检测试剂附着的基质、电子硬件组件、使用说明等)组合的至少一种或多种检测试剂。相应地，本发明进一步提供了ALK抗性突变体检测试剂盒和系统，包括但不限于包装探针和引物组(例如，TaqMan探针/引物组)、核酸分子的阵列/微阵列和含有一种或多种探针、引物或用于检测一种或多种ALK抗性突变体的其它检测试剂的珠子。试剂盒/系统可任选包括各种电子硬件组件。例如，各生产商提供的阵列(例如，DNA芯片)和微流体系统(例如，芯片实验室系统)通常包括硬件组件。其它试剂盒/系统(例如，探针/引物组)可能不包括电子硬件组件，但是可包括(例如)一种或多种ALK抗性突变体检测试剂连同包装在一个或多个容器中的其它生化试剂。
在一些实施方案中，ALK抗性突变体检测试剂盒通常装有一种或多种检测试剂和进行测定或反应，例如包含ALK抗性突变的多核苷酸的扩增和/或检测所必需的其它组分(例如，缓冲液、酶(例如DNA聚合酶或连接酶)、链延伸核苷酸(例如脱氧核苷酸三磷酸)、阳性对照序列、阴性对照序列等)。试剂盒可进一步装有用于确定靶多核苷酸的量的工具和用于和适当标准相比较的工具，并且可包括使用试剂盒检测ALK抗性突变的说明。在一个实施方案中，提供装有进行一个或多个测定以检测如本文公开的一种或多种ALK抗性突变的必需试剂的试剂盒。ALK抗性突变检测试剂盒/系统可能装有(例如)与在ALK抗性突变处或附近的核酸分子杂交的一种或多种探针或探针对。
在特定实施方案中，试剂盒包含第一和第二引物，其中所述第一和第二引物扩增包含ALK抑制剂抗性突变的扩增子。在其它实施方案中，试剂盒包含至少一种探针，所述探针包含在严格条件下与编码具有抑制剂抗性突变的ALK的多核苷酸杂交的多核苷酸序列。
试剂盒也可用于检测ALK抑制剂抗性突变体多肽。在这些实施方案中，试剂盒包含与一种或多种其它类型的元件或组件(例如，其它类型的生化试剂、容器、包装(例如用于商业销售的包装)、电子硬件组件、洗涤剂、能够检测试剂盒的结合的特异性结合剂(例如抗体)的存在的试剂/化学药品)组合的特异性结合ALK抗性突变体多肽的试剂，例如抗体。
在特定实施方案中，试剂盒包含区室化试剂盒并且包括其中试剂装在单独容器中的任何试剂盒。此类容器包括小玻璃容器、塑料容器或塑料或纸条。此类容器允许人们有效地将试剂从一个区室转移到另一个区室，以致样品和试剂不交叉污染，并且可以定量形式将每个容器的试剂或溶液从一个区室添加到另一个区室。此类容器可包括将容纳试验样品的容器，装有用于测定的抗体或探针的容器，装有洗涤剂(例如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等)的容器和装有用于检测结合抗体或杂交探针的试剂的容器。本领域中已知的任何检测试剂均可使用，包括但不限于以上所述检测试剂。
检测ALK抗性突变体的方法可用于诊断受试者体内与ALK活性异常相关的疾病。进一步地，已经使用本文所述的筛选测定法鉴定的抑制ALK抗性突变体的试剂可用于治疗此类疾病。ALK活性介导的疾病包括但不限于部分特征在于迁移、侵袭、增殖和与侵袭性细胞生长相关的其它生物学活性的疾病。此类疾病包括癌症。因此，提供了诊断受试者抗至少一种ALK激酶活性或很可能发展对其的抗性的癌症的存在的方法。此类方法可包括使用任何前述方法测定来自受试者的生物样品中ALK抑制剂抗性突变的存在，例如用特异性结合剂(例如，抗体)检测ALK抗性突变体多肽或使用能够检测ALK抗性突变的多核苷酸检测ALK抗性突变。
术语“癌症”指受试者体内特征在于细胞生长不受调节的病状，其中癌细胞能够局部侵袭和/或转移至非连续部位。如本文所使用，“癌症细胞”、“癌细胞”或“肿瘤细胞”指特征在于这种细胞生长不受调节和具有侵袭性的细胞。
术语“癌症”涵盖所有类型的癌症，包括但不限于所有形式的癌、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病，包括但不限于心脏系统癌症：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺癌：支气管癌(鳞状细胞癌、未分化小细胞癌、未分化大细胞癌、腺癌)、肺泡(支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、中皮瘤；胃肠系统癌症：食道(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛瘤、高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠多肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；生殖泌尿道癌症：肾脏(腺癌、维尔姆斯氏瘤[成人肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚性癌、畸胎癌、绒膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝癌：肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝胚细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨癌：骨源性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性骨巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨性外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统癌症：颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、大脑(星细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室鼓膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、成视网膜细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科癌症：子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(宫颈癌、前肿瘤宫颈非典型增生)、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌]、颗粒膜细胞瘤、支持-间质细胞肿瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)；血液癌：血液(骨髓性白血病[急性和慢性]、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)；皮肤癌：恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波氏肉瘤、胎块发育异常痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣；和肾上腺癌：成神经细胞瘤。
在某些实施方案中，癌症为大B细胞淋巴瘤、恶性组织细胞增生症、炎性肌纤维母细胞瘤肉瘤、食管鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、成神经细胞瘤、膀胱癌、肾癌和成胶质细胞瘤。
“受试者”意指哺乳动物，例如，灵长类动物、人、农业和驯养动物例如但不限于狗、猫、牛、马、猪、绵羊等。在一些实施方案中，诊断或治疗的受试者为人。
所述方法可用于通过使用本文公开的检测方法检测具有ALK抑制剂抗性突变的ALK致癌融合蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸诊断先前不知道患有癌症的受试者的癌症。
所述方法可通过使用本文公开的检测方法检测ALK抑制剂抗性突变体多肽或编码所述多肽的多核苷酸诊断先前已知患有ALK活性异常相关癌症的受试者抗至少一种ALK激酶抑制剂或很可能发展对其的抗性的癌症。在这些实施方案中，ALK抑制剂抗性突变体并非必须是ALK致癌融合蛋白的一部分，因为基因组扩增或蛋白质过表达可导致ALK活性异常和癌症发展。因此，“ALK活性异常”指足以造成癌状态的发展和/或维持的ALK活性增强(这可归于基因组扩增、蛋白质过表达或过度活化或组成型活化ALK致癌融合蛋白的存在)。相应地，与ALK活性异常相关的癌症是其中ALK活性异常造成癌症发展和/或生长的癌症。
通过本文公开的方法鉴定的ALK抗性突变体抑制剂可用于治疗具有ALK抗性突变的癌症。相应地，减少ALK抗性突变体的表达的试剂(例如，沉默元件)可用于治疗具有ALK抗性突变的癌症。
如本文所使用，“治疗”是获得有益或预期临床结果的方法。为了本发明的目的，有益或预期临床结果包括但不限于症状减轻、视力(例如，中央视觉、视敏度)部分或完全恢复、病症程度缩小、病症状态稳定(即，不恶化)(例如，视锥细胞退化)、病症进展延迟或减缓、病症改善或减轻和预防、抑制或降低发展视网膜病症的风险。“治疗”指治疗性治疗和预防或防治措施。需要治疗的人包括已经患病的人(以防止进一步退化)以及待预防病症的人。“减轻”病症指与不治疗的情况相比，减轻病症的程度和/或不良临床表现和/或减缓或延长进展的时间进程。
在一些实施方案中，连同本文称为药物组合物的药学上可接受的载体一起施用ALK抗性突变体抑制剂。如本文所使用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂等。补充活性化合物也可并入组合物中。
本发明的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(局部)、透黏膜和直肠施用。另外，可能期望向需要治疗的区域(例如，向身体需要抑制TR细胞功能的区域)局部施用治疗有效量的药物组合物。这可通过(例如)在手术期间局部或区域性注入或灌注、局部施用、注射、导管、栓剂或植入物(例如，由多孔、无孔或凝胶状物质形成的植入物，包括膜，例如硅橡胶膜或纤维)等实现。在一个实施方案中，可在待治疗的癌症部位(或以前的部位)通过直接注射施用。在另一实施方案中，在囊泡(例如脂质体)中递送治疗有效量的药物组合物(见，例如，Langer(1990)Science 249:1527-33；和Treat等在Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer中，LopezBerestein和Fidler(编),Liss,N.Y.，第353-65页，1989)。
又一实施方案中，可用控释系统递送治疗有效量的药物组合物。在一个实例中，可使用泵(见，例如，Langer(1990)Science249:1527-33；Sefton(1987)Crit.Rev.Biomed.Eng.14:201-40；Buchwald等(1980)Surgery 88:507-16；Saudek等(1989)N.Engl.J.Med.321:574-79)。在另一实例中，可使用聚合材料(见，例如，Levy等(1985)Science 228:190-92；During等(1989)Ann.Neurol.25:351-56；Howard等(1989)J.Neurosurg.71:105-12)。也可使用其它控释系统，例如Langer(1990)Science 249:1527-33讨论的控释系统。
用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲液例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节紧张性的试剂例如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂装入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合注射用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，适合载体包括生理盐水、抑菌水、EL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须无菌并且应为以便于易于注射的形式存在的液体。在生产和储存条件下必须稳定并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用保存。载体可为含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质及其适合混合物。例如，可通过使用诸如卵磷脂的涂层，在分散体的情况下通过维持所需颗粒尺寸和通过使用表面活性剂维持适当流动性。可用各种抗菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂(例如，糖)、多元醇，例如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。可通过使组合物中包括延迟吸附的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶致使注射组合物的吸附延长。
可根据需要，通过在具有一种所列成分或其组合的适当溶剂中并入所需量的活性化合物，接着过滤灭菌制备无菌注射液。通常，通过向含有碱性分散介质和来自以上所列成分的其它所需成分的无菌媒介物中并入活性化合物制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，从其先前无菌过滤的溶液获得活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可将它们装入明胶胶囊中或压缩成片剂。为了口服治疗施用的目的，可使活性化合物与赋形剂合并并且用于片剂、锭剂或胶囊形式中。也可使用用作嗽口水的液体载体制备口服组合物，其中液体载体中的化合物经口服应用并漱口并吐出或咽下。可包括药学上相容的结合剂和/或辅料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有以下任何成分或相似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterote；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。对于通过吸入施用，以气溶胶喷雾的形式从装有适合推进物(例如，诸如二氧化碳的气体)的加压容器或分配器或喷雾器递送化合物。
也可通过透黏膜或经皮方式全身性施用。对于透黏膜或经皮施用，在制剂中使用对于待透入的屏障适当的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常已知，并且对于透黏膜施用，包括(例如)的洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。可通过使用鼻用喷雾或栓剂实现透黏膜施用。对于经皮施用，将活性化合物配制成本领域中通常已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。也可将化合物制备成供直肠递送的栓剂形式(例如，具有常规栓剂基体，例如可可油和其它甘油酯)或保留灌肠剂形式。
在一个实施方案中，用将防止化合物从身体迅速消除的载体制备活性化合物，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域的技术人员显而易见。材料也可从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮液(包括靶向具有特异性受体的单克隆抗体的感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域中技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利No.4,522,811中所述。
可通过使用缺陷型或减毒逆转录病毒或其它病毒载体感染，将多核苷酸作为裸DNA或RNA直接注射，或可涂覆脂质或细胞表面受体或转染剂，封装在脂质体、微粒或微胶囊中，或通过与已知进入细胞核中的肽连接施用，通过与配体对象连接施用以进行受体介导的胞吞作用(见，例如，Wu和Wu(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)(可用于特异性表达受体的靶细胞类型)等。在另一实施方案中，可形成多核苷酸-配体复合物，其中配体包含融合病毒性肽以破坏核内体，从而使多核苷酸避免溶酶体降解。在又一实施方案中，可通过靶向特异性受体在体内靶向多核苷酸以便细胞特异性摄取和表达。可选地，可在细胞内引入多核苷酸并且通过同源重组并入宿主细胞DNA中进行表达(Koller和Smithies(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935；Zijistra等(1989)Nature 342:435-438)。
尤其有利的是配制呈剂量单位形式的口服或肠胃外组合物以便于施用和剂量的均匀性。本文所使用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位，每个单位含有经计算产生预期治疗效果的预定量的活性化合物连同所需药物载体。本发明剂量单位形式的规格用活性化合物的独特特征和要达到的特殊治疗效果，和本领域中固有的化合限制，例如用于个体治疗的活性化合物的限制指示并直接依赖于所述因素。
容器、包或分配器中可包括药物组合物和施用说明书。
当为了治疗施用时，施用可能是为了预防(即，防治)或治疗目的。当预防性提供时，在任何症状之前提供物质。预防性施用物质用于防止或减弱任何后续症状。当治疗性提供时，在症状发作时(或不久之后)提供物质。治疗性施用物质用于减弱任何实际症状。
本领域的技术人员将理解，本文所述治疗方式可单独使用或连同其它治疗方式使用(即，作为辅助疗法)，包括但不限于手术疗法、放射疗法、化学疗法(例如，用本领域中众所周知的任何化学治疗剂)或免疫疗法。
技术人员将意识到，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前治疗、受试者的健康状况和/或年龄和存在的其它疾病。而且，用治疗有效量的ALK抗性突变体抑制剂治疗受试者可包括单一治疗，或优选，可包括一系列治疗。还将意识到，用于治疗的ALK抗性突变体抑制剂的有效剂量可能随特殊治疗的过程升高或降低。剂量变化可能导致如本文所述诊断测定的结果并且由所述结果显而易见。
应了解，此类活性化合物的适当剂量取决于普通熟练医师、兽医或研究员所知的许多因素。活性化合物的剂量将(例如)随治疗受试者或样品的身份、尺寸和状况变化，进一步随施用组合物的途径(若适用)和从业者期望活性化合物对ALK抗性突变体的影响变化。示例性剂量包括每千克受试者或样品重量毫克至微克量的小分子(例如，约1μg/kg至约500mg/kg，约100μg/kg至约5mg/kg或约1μg/kg至约50μg/kg。此外应了解，活性试剂的适当剂量取决于活性试剂关于调节表达或活性的效力。可使用本文所述的测定法确定此类适当剂量。当要向动物(例如，人)施用这些小分子的一种或多种，以便降低ALK抗性突变体的表达水平或活性时，医师、兽医或研究员可(例如)首先开相对低剂量的处方，随后提高剂量直至获得适当反应。另外，应了解，任何特殊动物受试者的特定剂量水平将取决于各种因素，包括采用的特定化合物的活性，受试者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄率、任何药物组合和待调节的表达或活性的程度。
可通过动物研究确定ALK抗性突变体抑制剂的治疗有效量。当使用动物测定法时，施用剂量以提供与在动物测定法中已经证实有效的靶组织浓度相似的靶组织浓度。应认识到，治疗方法可包括单次施用治疗有效量的ALK抗性突变体抑制剂或多次施用治疗有效量的ALK抗性突变体。
可使用有效实现抑制细胞生长的预期效果的任何递送系统或治疗方案。因此，例如，包含有效量的包含ALK抗性突变体抑制剂或ALK抗性突变体特异性结合剂的本发明药物组合物的制剂可用于治疗、预防和诊断与ALK抗性突变体活性有关的许多临床适应征。
应指出，术语“一个”或“一种”实体指一种或多种所述实体；例如，将“一个多肽”理解为表述一个或多个多肽。同样地，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”和“至少一个”在本文中可交换使用。
贯穿该说明书和实施方案，在非排他意义上使用词“包含”、“包括”和“含”，除非上下文另有要求。
如本文所使用，当提到值时术语“约”指涵盖从指定量，在一些实施方案中±50%，在一些实施方案中±20%，在一些实施方案中±10%，在一些实施方案中±5%，在一些实施方案中±1%，在一些实施方案中±0.5%和在一些实施方案中±0.1%的变化，适合进行公开方法或采用公开组合物的变化也一样。
进一步地，当给出量、浓度或其它值或参数作为优选上限值和优选下限值的范围、优选范围或列表时，这应理解为特别公开由任一对的任何上限或优选值和任何下限或优选值形成的所有范围，不管范围是否单独公开。本文叙述一系列数值时，除非另有规定，范围旨在包括其端点，范围内的所有整数和分数。并非旨在将目前公开的主题限于限定范围时叙述的特定值。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中技术人员通常所理解的相同含义。虽然本文的任何相似方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但是本文描述了优选方法和材料。
通过说明而非通过限制的方式提出以下实施例。
实施例
实施例1.赋予对小分子激酶抑制剂的抗性的ALK点突变的鉴定和表征
用pcDNA3neo-NPM-ALK表达构建体稳定转染鼠细胞系BaF3(NPM-ALK的核苷酸和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:3和4中)。通过用于抑制剂抗性筛选的有限稀释法分离NPM-ALK/BaF3细胞克隆。如先前所述做少许修改进行抗抑制剂克隆的筛选，包括间歇性或连续性暴露于抑制剂(von Bubnoff等(2005)Blood 105:1652-1659；von Bubnoff等(2006)Blood 108:1328-1333；Kancha等(2009)ClinCancer Res 15:460-467；von Bubnoff等(2009)Cancer Res69:3032-3041；von Bubnoff等(2005)Cell Cycle 4:400-406)。简言之，在各种浓度的双重ALK/MET抑制剂PF-02341066(Pfizer)或ALK抑制剂化合物NVP-TAE684(Novartis)的存在下按1×105个细胞/孔的密度在96孔板中培养NPM-ALK/BaF3细胞(Christensen等(2007)Mol CancerTher 6:3314-3322；McDermott等(2008)Cancer Res68:3389-3395；Galkin等(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104:270-275)。选择可见细胞克隆，扩增，并进行序列分析以鉴定ALK激酶结构域中的抑制剂抗性突变。
表2列出了鉴定的每个突变。鉴定了在ALK激酶结构域的13个不同氨基酸位置处总计十八(18)个突变交换。在BaF3细胞中，通过定点诱变野生型(WT)NPM-ALK(SEQ ID NO:4)改造每个突变并且经证实与表达WT NPM-ALK的BaF3细胞相比，赋予了对PF-02341066的抗性。需要注意的是，通过使用NVP-TAE684挑选鉴定的所有突变也赋予了对PF-02341066的抗性(数据未示出)。
表2.ALK激酶结构域中存在于NPM-ALK融合蛋白中时赋予对抑制剂化合物PF-02341066或NVP-TAE684的抗性的突变
*氨基酸残基的位置相对于全长ALK蛋白而言，其序列示于SEQID NO：2中。
如先前所述(Lagisetti等(2009)J.Med.Chem.2：6979-6990)通过72小时XTT测定法对含有鉴定的每个突变的NPM-ALK/BaF3细胞进行PF-02341066的细胞毒性IC50确定，以明确确认赋予抑制剂抗性的突变。图1中说明了示出由3个鉴定的ALK KD突变赋予对细胞死亡的抗性水平的代表性结果。PF-02341066的IC50值示于表3中。3个突变的每一个均与PF-02341066的IC50高于正常亲本BaF3的IC50相关，表明有效杀伤含有这些突变的肿瘤细胞所需的PF-02341066浓度很可能对正常组织有毒。
表3.亲本BaF3细胞(无)或表达具有一个鉴定的抑制剂抗性突变的天然(野生型)NPM-ALK或NPM-ALK的BaF3细胞中PF-02341066的IC50值
NPM-ALK IC 50 (nm)
无 1460
野生型 460
L1196M 1960
G1202R 2060
D1203N 1490
说明书中提到的所有公布和专利申请均表明本发明所属领域中技术人员的水平。所有公布和专利申请均以如同特别且单独地指出将每个单独的公布或专利申请通过引用并入的相同程度通过引用并入本文。
本文提出的本发明的许多修改和其它实施方案将被这些发明所属领域的技术人员想到，具有上述描述和相关附图中呈现的教导益处。因此，应理解本发明并不是要限于公开的特定实施方案并且修改和其它实施方案旨在包括在上述一系列的实施方案和所附权利要求的范围之内。虽然本文采用特定术语，但是它们仅在通用和描述性意义上使用并不是为了限制。

Claims (30)

1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO:25中所示的核苷酸序列；
b)编码SEQ ID NO:26中所示氨基酸序列的核苷酸序列；
c)编码SEQ ID NO:26的氨基酸序列变异体的核苷酸序列，所述变异体与SEQ ID NO:26相比的差异由1-15个保守性氨基酸取代组成，其中所述多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置具有精氨酸残基的多肽，并且其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO:53中所示的核苷酸序列；
b)编码SEQ ID NO:54中所示氨基酸序列的核苷酸序列；
c)编码由SEQ ID NO:54的氨基酸序列变异体组成的多肽的核苷酸序列，所述变异体与SEQ ID NO:54相比的差异由1-15个保守性氨基酸取代组成，
其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽。
3.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸还包含编码ALK致癌融合蛋白伴侣的多核苷酸，所述ALK致癌融合蛋白伴侣选自核磷酸蛋白(NPM)、非肌肉原肌球蛋白3(TPM3)、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、网格蛋白重链(CLTC)、TRK融合基因(TFG)、非肌肉原肌球蛋白4(TPM4)、膜突蛋白(MSN)、Ran结合蛋白2(RanBP2)、棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)、半胱氨酰-tRNA合成酶(CARS)、驱动蛋白家族成员5B(KIF5B)、非肌肉肌球蛋白重链9(MYH9)、SEC31同系物A(SEC31L1)和染色体17(ALO17)上的环指蛋白213(RNF213)/ALK淋巴瘤寡聚伴侣。
4.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中所述ALK致癌融合蛋白伴侣由SEQ IDNO:97中所示的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO:85中所示的核苷酸序列；
b)编码SEQ ID NO:86中所示氨基酸序列的核苷酸序列；
c)编码由SEQ ID NO:86的氨基酸序列变异体组成的多肽的核苷酸序列，其中所述变异体与SEQ ID NO:86相比的差异由1至15个保守性氨基酸取代组成，其中所述多核苷酸编码具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性的多肽。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述ALK小分子激酶抑制剂选自PF-02341066、NVP-TAE684、星孢菌素、7-羟基星孢菌素、CEP-14083、CEP-14513、CEP-28122、吡啶酮14、吡啶酮15、CRL151104A和WZ-5-126。
7.根据权利要求6所述的分离的多核苷酸，其中所述ALK小分子激酶抑制剂为PF-02341066。
8.一种表达盒，所述表达盒包含与启动子可操作地连接的根据权利要求1-7中任一项所述的分离的多核苷酸。
9.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求8所述的表达盒。
10.一种分离的多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO:26的氨基酸序列变异体，所述变异体与SEQ ID NO:26相比的差异由1-15个保守性氨基酸置换组成，其中所述多肽在与SEQ IDNO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置具有精氨酸残基，并且其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性。
11.一种分离的多肽，其中所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO:54的氨基酸序列变异体，所述变异体与SEQ ID NO:54相比的差异由1-15个保守性氨基酸置换组成；
其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性。
12.根据权利要求11所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽还包含选自以下的ALK致癌融合蛋白伴侣：核磷酸蛋白(NPM)、非肌肉原肌球蛋白3(TPM3)、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、网格蛋白重链(CLTC)、TRK融合基因(TFG)、非肌肉原肌球蛋白4(TPM4)、膜突蛋白(MSN)、Ran结合蛋白2(RanBP2)、棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)、半胱氨酰-tRNA合成酶(CARS)、驱动蛋白家族成员5B(KIF5B)、非肌肉肌球蛋白重链9(MYH9)、SEC31同系物A(SEC31L1)和染色体17(ALO17)上的环指蛋白213(RNF213)/ALK淋巴瘤寡聚伴侣。
13.根据权利要求12所述的分离的多肽，其中所述ALK致癌融合蛋白伴侣由SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列组成。
14.根据权利要求10所述的分离的多肽，其中所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:86中所示氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO:86的氨基酸序列变异体，所述变异体与SEQ ID NO:86相比的差异由1-15个保守性氨基酸置换组成，其中所述多肽具有抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的激酶活性。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的分离的多肽，其中所述ALK小分子激酶抑制剂选自PF-02341066、NVP-TAE684、星孢菌素、7-羟基星孢菌素、CEP-14083、CEP-14513、CEP-28122、吡啶酮14、吡啶酮15、CRL151104A和WZ-5-126。
16.根据权利要求15所述的分离的多肽，其中所述ALK小分子激酶抑制剂为PF-02341066。
17.一种特异性结合抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的ALK抗性突变体多肽的抗体，其中所述ALK抗性突变体多肽具有以下ALK激酶抑制剂抗性突变体残基：
在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置的精氨酸残基。
18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述ALK抗性突变体多肽包含根据权利要求10-16中任一项所述的分离的多肽。
19.一种用于检测生物样品中ALK抑制剂抗性突变的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求17或18所述的抗体。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含用于检测与ALK结合的抗体的化学药品。
21.一种用于检测生物样品中ALK抑制剂抗性突变的试剂盒，所述试剂盒包含含至少一种可特异性检测或特异性扩增具有ALK抑制剂抗性突变的ALK抗性突变体多核苷酸的多核苷酸的试剂，其中所述ALK抗性突变体多核苷酸编码抗至少一种ALK小分子激酶抑制剂的ALK抗性突变体多肽，其中所述ALK抗性突变体多肽具有以下ALK激酶抑制剂抗性突变体残基：
在与SEQ ID NO:2的氨基酸残基位置1202相对应的位置的精氨酸残基。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述至少一种可特异性检测或特异性扩增ALK抗性突变体多核苷酸的多核苷酸能够特异性检测或特异性扩增根据权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述试剂包含一对扩增包含所述ALK抑制剂抗性突变的扩增子的引物。
24.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述试剂包含至少一种探针，所述探针包含在严格条件下与所述ALK抗性突变体多核苷酸杂交并从而检测ALK抑制剂抗性突变的多核苷酸序列。
25.一种鉴定能够抑制ALK抗性突变体或ALK融合蛋白的激酶活性的试剂的方法，所述方法包括：
a)使候选试剂与根据权利要求10-16中任一项所述的多肽接触；以及
b)确定所述候选试剂是否抑制所述多肽的激酶活性。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述多肽在真核细胞中表达；其中所述多肽为根据权利要求12-13中任一项所述的多肽；并且其中确定所述试剂是否抑制所述多肽的激酶活性包括监测所述细胞在选自以下的细胞活性上的至少一种变化：
a)抑制细胞生长；
b)刺激细胞死亡；
c)抑制锚定非依赖生长；和，
d)抑制细胞迁移或侵袭；
其中鉴定诱导细胞活性的所述变化的至少一种的试剂为ALK抗性突变体的抑制剂。
27.根据权利要求25所述的方法，其中非人动物已被改变为表达所述多肽或其中已经将表达所述多肽的真核细胞引入非人动物体内；其中所述多肽为根据权利要求12-13中任一项所述的多肽；其中确定所述试剂是否抑制所述多肽的激酶活性包括监测所述非人动物的肿瘤生长；并且其中肿瘤生长的减缓表明试剂抑制所述多肽的激酶活性。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述多肽在真核细胞中表达；其中所述多肽为根据权利要求10或14所述的分离的多肽；其中所述多肽的激酶活性被激活；并且其中确定所述试剂是否抑制所述多肽的激酶活性包括监测所述细胞在选自以下的细胞活性上的至少一种变化：
a)抑制细胞生长；
b)刺激细胞死亡；
c)抑制锚定非依赖生长；和，
d)抑制细胞迁移或侵袭；
其中鉴定诱导细胞活性的所述变化的至少一种的试剂为ALK抗性突变体的抑制剂。
29.一种鉴定能够特异性结合根据权利要求10-16中任一项所述的多肽的试剂的方法，所述方法包括步骤：
a)使候选试剂与根据权利要求10-16中任一项所述的多肽接触；以及，
b)确定所述候选试剂是否特异性结合所述多肽。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述多肽呈活性或非活性状态。
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