JPH09509822A

JPH09509822A - Ｄｎａミスマッチ修復経路における変化の検出方法

Info

Publication number: JPH09509822A
Application number: JP7514644A
Authority: JP
Inventors: リチャードディ．コロドナー，; リチャードフィッシェル，; ロバートエイ．ジー．リーナン，
Original assignee: ダナ‐ファーバーキャンサーインスティチュート; ユニバーシティオブバーモントアンドステートアグリカルチュラルカレッジ
Priority date: 1993-11-17
Filing date: 1994-11-17
Publication date: 1997-10-07
Also published as: AU702022B2; WO1995014085A3; US7229755B1; JP2006296424A; WO1995014085A2; JP2007312783A; CA2176819A1; EP0725819A1; AU1183095A

Abstract

(57)【要約】本発明者らは、今回、哺乳動物を含む真核生物が、細菌に存在する経路に類似するDNAミスマッチ修復経路を有することを発見した。ヒトのような哺乳動物におけるこのミスマッチ修復経路の欠損または変化は、不安定な反復DNA配列の蓄積をもたらす。そのような表現型は、遺伝子性結腸ガンのような多くのガンにおける疾病状態に高い相関を有する。従って、本経路の欠損または変化を発見することは、ガンの素因に対する診察および特定のガンに対する予後となり得る。本発明者らはまた、ヒトを含む多くの哺乳動物においてこの経路の遺伝子の１つを発見し、そして配列を決定した。この遺伝子は本明細書中においてMSH2と呼ばれ、多くの適用例を有する。本遺伝子は、アッセイ、遺伝子産物の発現、薬物のスクリーニング、および臨床において使用され得る。本発明者らはまた、本明細書において、このミスマッチ修復経路の他の遺伝子をスクリーニングする方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 DNAミスマッチ修復経路における変化の検出方法本出願は、同時係属中の米国特許出願第08/259,310号(1994年６月13日に出願) の一部継続出願であり、同時係属中の米国特許出願第08/163,449号(1993年12月７日に出願)の一部継続出願であり、同時係属中の米国特許出願第08/154,792号( 1993年11月17日に出願)の一部継続出願である。本明細書に記載される研究の一部は、Dana-Farber Cancer Instituteに対する国立衛生研究所補助金HG00305(現在GM60005と番号される)、CA56542、および国立衛生ガンセンター研究所補助金CA06516の援助による。米国政府は本発明において所定の権利を有する。発明の分野本発明は真核生物DNAミスマッチ修復経路、関連遺伝子および、例えば、薬物のスクリーニング、ガンの予後および診断におけるその使用に関する。より詳細には、本発明は、大腸ガンなどのいくつかのヒトのガンに関するDNAミスマッチ修復経路における変化の検出に関する。発明の背景遺伝情報の正確な伝達は、細胞、生物、および種の生存において重要である。変異が細胞に対し有害であり得る新しい遺伝子型をもたらし得ることから、遺伝物質を１つの世代から次の世代へ、高い正確さでの伝達を確実にするのに役立つ多くの機構が発達してきた。頻繁に変異をもたらすDNA損傷とは、改変された、失われた、またはミスマッチのヌクレオチドである。多様な酵素経路が、これらの損傷を特異的に修復し得る原核生物システムにおいて記載されてきた。ミスマッチのヌクレオチドがDNAに生じるには少なくとも３つの方法がある。第１に、DNAまたはDNA前駆体への物理的損傷により、DNAにミスマッチの塩基が生じ得る。例えば、5-メチルシトシンの脱アミノ反応がチミンを作製し、従って G-Tのミスペアを作製する。第２に、DNA複製中のヌクレオチドの取り込み違い、挿入、または欠失がミスマッチの塩基対を生じさせ得る。最後に、２つの異なる親DNA配列が対合してそのようなヘテロ二本鎖が生じる場合、遺伝子組換えはミスマッチのヌクレオドを含み得るヘテロ二本鎖DNA領域を生成する。このような機構のそれぞれによって生成されるミスマッチのヌクレオチドは、特異的な酵素システムによって修復されることが知られている。十分に定義されているミスマッチ修復経路は、E.coliのMutHLS経路であり、mu tH、mutL、mutS、およびMutU(uvrD)遺伝子産物に依存する長い断片(long-patch) (約３Kb)除去修復反応を促進する。MutHLS経路は、E.coliにおいて最も活性なミスマッチ修復経路であるようであり、およびDNA複製の正確さを増し、ミスマッチの塩基対を含む組換え中間物質に作用する両方のことが知られている。このシステムはインビトロで再構成され、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素、DNAリガーゼ、一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)、および一本鎖DNAエキソヌクレアー群、ExoI 、ExoVII、またはRecJのうちの１つとともに、MutH、MutL、MutS、およびUvrD( ヘリカーゼII)タンパク質を必要とする。MutSタンパク質はDNAのミスマッチしたヌクレオチドに結合する。MutHタンパク質は、Aでヘミメチル化されたDNAのGATC 部位と相互作用し、そしてメチル化されていない鎖の切り出しの原因となる。切り出しは新しく複製されたメチル化されていないDNA鎖を標的にするので、メチル化されていない鎖の特異的な切り出しは、複製の正確さを増す。MutLは、ミスマッチに結合するMutSとヘミメチル化されたDam部位に結合するMutHとの間の相互作用を促進し、MutHを活性化する。UvrDは、一本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼの１つとともに作用して、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素、SSB、およびDNAリガーゼの作用によって修復されたギャップを残したまま、メチル化されていない鎖を切り出すヘリカーゼである。さらに、E.coliはいくつかの短い断片(short p atch)修復経路を包含し、特異的な単一の塩基ミスペアに作用するVSPシステムおよびMutY(MicA)システムを包含する。従って、細菌において、ミスマッチ修復経路は、DNAの遺伝的安定性を維持する役割を果たす。細菌のMutHLSシステムは、E.coliとS.typhimuriumとのような同類種に関する分岐(divergent)DNA配列間での遺伝子の組換え(用語：同種組換え(homeologous recombination)を妨げることが見出された。種々のタイプのヒト腫瘍が、DNA反復配列の不安定性を示すことから、遺伝子のDNA安定性を維持するために機能する原核生物ミスマッチ修復システムの存在は、特に重要である。例えば、遺伝性非ポリポーシス大腸ガン(HNPCC)は、ヒト大腸ガン(CRC)によく見られる形態であり、リンチ症候群としても知られるが、このような遺伝子不安定性をひきおこす遺伝子座に連鎖するようである。 CRCは、産業国における新生物の最も一般的な形態の１つであり、そしてCRCに対する遺伝性成分の可能性が十分に議論されてきた。家族内での高い発症率のCR Cが、数多く報告されている(CRC症例の約13%が、家族性として類別される)が、この影響が、食事のような環境上影響物に共通に曝されていること(食事がCRCの危険率に役割を果たすことが示されている)から生じるのか、または遺伝的要因の影響から生じるのかどうかについては、明らかではない。最近、遺伝的連鎖が、ヒト第２染色体上の無名のマイクロサテライトマーカーおよびHNPCC発症率との間で示されてきた。少なくとも連続した２世代において、CRCである少なくとも３名の家族が存在し、少なくとも１名の罹患者が50歳未満で診断された場合、HNPCCと定義される。独立した２つのHNPCCの家系の研究から、第２染色体のマーカーとの連鎖が示され、このことはHNPCCに対する遺伝子成分が存在するという見解を強く支持し、そして第２染色体上の未知の遺伝子が HNPCCに対する罹病性を与える役割を果たし得ることを示唆している(Peltomaki ら、Science 260:810、1993、この内容は本明細書中に参考として援用される)。 14のより小規模のHNPCC家系のさらなる研究からも、この第２の研究では、HNPCC と第２染色体上の遺伝子との間の連鎖が示唆されたものの、全ての家族で必ずしも疾病の発症率は第２染色体上のマーカー遺伝子と連鎖しなかった(Aalionenら、Science 260:812,1993)。 HNPCC腫瘍の分子分析は、HNPCCに対する罹病性を与える原因遺伝子の特徴と思われるいくつかの情報を提供している。特に、研究によって、HNPCC腫瘍組織における短いDNA反復配列のゲノム不安定性が明らかにされてきた(Aaltonenら、同上；Thibodeauら、Science 260:816、1993)。これらのデータはまた、ゲノム不安定性へのこの傾向が遺伝され得、そしてヒト第２染色体上に位置する遺伝子の変異に関係し得ることを示唆する。HNPCCに対する遺伝的素因である変異が短い反復配列のゲノム不安定さをもたらすという所見からも、HNPCC家系のメンバーか他のガンにも十分に罹病性を示し、そしてしばしば結腸直腸上皮以外(例えば、乳房、卵巣、膀胱、子宮内膜（子宮）、腎、皮膚または直腸において)でも腫瘍が発達するという観察に一致する。変異、ゲノム不安定性、および腫瘍発達と間の関係を十分に理解するためには、関連する遺伝子がクローン化され、そして配列が決定されることが必要である。問題は、ガンの発達に関連する遺伝子のクローニングが困難であるとされてきたことである。例えば、HNPCCにおいて、疾病と第２染色体上のマーカーとの間に遺伝的連鎖があるという知識があっても、同定されたマーカーは、目的の遺伝子から900万塩基対のオーダーで離れた染色体上に存在し得るので、遺伝子の同定は予測できない。(Peltomakiら、上述；Marx、Science 260:751、1993)。また、HNPCC腫瘍組織のゲノム不安定性が観察されるため、その遺伝子の同定をさらに困難にしている。原核生物のミスマッチ遺伝子の現在の情報およびDNAミスマッチ修復遺伝子産物がゲノム不安定性に関連するという観察によっても、原核生物のミスマッチ修復遺伝子の真核生物の相同物の同定方法は明らかではない。発明の要旨本発明者らは、今回、哺乳類を含む真核生物が、細菌に存在する経路に類似するDNAミスマッチ修復経路を有することを発見した。哺乳動物におけるこのミスマッチ修復経路の欠損または変化は、不安定なDNA反復配列の蓄積をもたらす。そのような表現型は、遺伝性結腸ガンのような多くのガンにおける、疾病状態に高い相関関係を有する。従って、本経路の欠損または変化を発見することは、ガンの素因に対する診察、および特定のガンに対する予後となり得る。本発明者らはまた、ヒトを含む多くの哺乳類においてこの経路の遺伝子の１つを発見し、そして配列を決定した。この遺伝子は、本明細書中においてMSH2と呼ばれ、下記で論ずるように、多くの適応例を有する。本遺伝子は、アッセイ、遺伝子産物の発現、薬物のスクリーニング、および臨床において使用され得る。本発明者らはまた、このミスマッチ修復経路の他の遺伝子をスクリーニングする方法を開示する。図表の簡単な説明図１は、伸長されたMuir-Torre HNPCC家系の家系図を示す。図で用いられる略語は以下の通りである：内部悪性腫皮膚腫瘍 Bl＝膀胱 BCC＝基底細胞ガン CLL＝慢性リンパ節白血病 KA＝角化棘細胞腫 Cx＝頚部 SA＝脂腺腫(Sabaceous Adenoma) CRC＝結腸直腸 SE＝脂腺上皮腫(Sabaceous Epithelioma) FAP＝腫瘍ポリープ症 SH＝脂腺過形成(Sabaceous Hyperplasia) L＝肺 Sa＝骨肉腫 Bo＝ボウエン病 SB＝小腸 St＝胃 Ur＝尿管 Ut＝子宮図２は、図１のHNPCCの家系で遺伝されているhMSH2変異を明らかにする配列のクロマトグラムを示す。図３は、ヒトおよび酵母Msh2タンパク質配列のアライメントを示す。図４は、ヒトおよび酵母Mlhlタンパク質配列のアライメントを示す。図５は、MSH2遺伝子座および遺伝子クローンを含むMSH2の構成図を示す。１〜 16の番号を含む枠は、個々のMSH2エキソンを示す。それぞれのエキソンの大きさを各エキソンの下に付し、そしてそれぞれのイントロンの大きさを個々のエキソン対の間の領域の上に付す。遺伝子の下にある線は、得られた個々のλおよびPl クローンのそれぞれを示す。各クローンは、認識番号およびクローン中に含まれる各エキソンの認識番号で標識される。示したエキソンの存在は、直接配列分析、または各クローンを鋳型として用いるエキソン特異的プライマーによるPCRのいずれかによって、決定された。配列リストの記載配列番号１は、酵母MSH2遺伝子のヌクレオチド配列である。配列番号２は、酵母MSH1遺伝子のヌクレオチド配列である。配列番号３は、酵母MSH2タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号４は、酵母MSH1タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号５は、ペプチドTGPNMのアミノ酸配列である。配列番号６は、ペプチドFATHFのアミノ酸配列である。配列番号７は、ペプチドFATHYのアミノ酸配列である。配列番号８は、E.coli mutSミスマッチ修復遺伝子の相同であるヒトcDNAクローンのヌクレオチド配列である。配列番号10は、E.coli mutSミスマッチ修復遺伝子に相同なマウスヌクレオチド配列のヌクレオチド配列である。配列番号11は、BamHI制限部位を含む、TGPNMをコードする配列を含む変性オリゴヌクレオチドのプールである。配列番号12は、BamHI制限部位を含む、F(A/V)THYをコードする配列を示す変性オリゴヌクレオチドのプールである。配列番号13は、FATH(F/Y)をコードし得る配列を示す変性オリゴヌクレオチドのプールである。配列番号14は、FTTH(F/Y)をコードし得る配列を示す変性オリゴヌクレオチドのプールである。配列番号15は、PCRクローン22.1のヌクレオチド配列である。配列番号16は、配列番号８によってコードされるヒトタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号17/18は、PCR反応のプライマーとして使用する際、E.coli mutSミスマッチ修復遺伝子の相同体である、真核生物ヌクレオチド配列の約85bpまでのフラグメントを増幅し得る、オリゴヌクレオチドのセットである。これらのプライマーは、BamHI制限部位を含む。配列番号19は、PCRクローンMS351-Iのヌクレオチド配列である。配列番号20は、PCRクローンMS351-IIのヌクレオチド配列である。配列番号21/22は、PCR反応のプライマーとして使用する際、mutSミスマッチ修復遺伝子のヒトゲノム相同体(MSH2_hu)由来の約158bpまでのイントロンフラグメントを増幅し得る、オリゴヌクレオチドのセットである。配列番号23は、配列番号17のプライマーとともにPCR反応において使用する際、配列番号8に見出される278bpのフラグメントを増幅する、オリゴヌクレオチドプライマーである。配列番号25/26、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、および39/40は：PCR反応のプライマーとして使用する際、MSH2_hu由来のエキソン配列を増幅し得る、オリゴヌクレオチドのセットである。配列番号27は、アミノ酸21と22との間の12CA5エピトープ標識を含む配列番号4 の酵母タンパク質である。配列番号28は、FVTH(F/Y)をコードし得る配列を示す変性したオリゴヌクレオチドプールである。配列番号41は、配列番号６のペプチドをコードする変性ヌクレオチド配列である。配列番号42は、配列番号７のペプチドをコードする変性ヌクレオチド配列である。配列番号43は、GenBank(寄託番号M64730)に見出されるE.coli mutS遺伝子のヌクレオチド配列である。配列番号44は、E.coli MutSタンパク質のアミノ酸配列であり、この配列は配列番号43から予想される。配列番号45は、ヒトMSH2遺伝子、hMSH2のcDNA配列である。配列番号46〜65は、hMSH2遺伝子の個々のエキソンを増幅するために使用され得る、プライマーである。配列番号66〜81は、hMSH2遺伝子の個々のエキソンである。配列番号82〜113は、確認された非エキソンhMSH2ゲノム配列である。配列番号157および114〜144は、それぞれ配列番号82〜113に追加の未確認の非エキソンhMSH2ゲノム配列を追加した配列である。配列番号145および146は、PlファージライブラリーのPCRスクリーニングに使用されるプライマーのセットであり、hMSH2ゲノムクローンを同定する。配列番号147/148〜153/154は、それぞれ配列番号62/63〜64/32のプライマーに対して「繰り込まれた(nested)」関係のプライマーのセットであり、実施例９に記載のに記載のような多様なPCRプロトコルにおいて、それぞれ配列番号62/63〜64 /32のプライマーとともに使用され得る。配列番号155は、ヒトMLH1遺伝子、hMLH1のcDNA配列である。配列番号156は、配列番号155によってコードされるhMlhlタンパク質のアミノ酸配列である。発明の詳細な説明本発明者らは、今回、哺乳類を含む真核生物が、細菌に存在する経路に類似するDNAミスマッチ修復経路を有することを発見した。ヒトのような哺乳動物におけるこのミスマッチ修復経路の欠損または変化は、不安定なDNA反復配列の蓄積をもたらす。そのような表現型は、遺伝性結腸ガンのような多くのガンにおける疾病状態に高い相関を有する。従って、本経路の欠損または変化を発見することは、ガンの素因に対する診断および特定のガンの予後となり得る。本発明の診断の方法および予後の方法は、真核生物ミスマッチ修復経路の要素の変化を検索をする工程を包含する。好ましくは、真核生物のミスマッチ修復経路は、哺乳類、最も好ましくはヒトの経路てある。変化は、この経路のメンバーである遺伝子の欠失、付加および／または変異(点突然変異のような)に起因し得る。これらのタイプの変異のいずれも、非機能なミスマッチ修復経路の遺伝子産物を導き得る。この変異反応はエキソンだけではなく、イントロンまたは非エキソン領域でも起き得る。非エキソン領域における変化を含むこの種の変化の結果、その影響が、経路のメンバーの転写および翻訳に見られ、従ってこれはミスマッチエラーを修復する能力に影響する。これらの変化に起因する変動は、遺伝子と同様に生じるタンパク質およびmRNAにも反映する。経路に存在し得る他の変化は、ミスマッチ修復経路における遺伝子の発現を増加または減少させる変動を包含する。従って、本発明の１つの局面は、ミスマッチ修復経路に少なくとも１つの要素変化が存在するかどうかを決定する工程を含む。この決定は、経路に関与する遺伝子、それらのmRNA、それらの遺伝子産物における変化をスクリーニングする工程、または経路における他の欠損の出現を検出することにより、スクリーニングする工程を包含し得る。変化は、例えば、組織、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、正常細胞溶解物の上清、新生物前駆体細胞溶解物の上清、新生物細胞溶解物の上清、組織培養で維持されるガン腫細胞株の上清のようなヒトの生物学的体液、真核細胞などから得られる適切なサンプルにおける特定のミスマッチ修復要素をスクリーニングすることによって検出され得る。組織からミスマッチ修復経路における変化を検出するために、周辺の正常組織を含まない組織を単離することは有用である。腫瘍細胞の組織調製物を富化する手段は、当該分野において公知である。例えば、組織は、パラフィン切片またはクリオスタット切片から単離され得る。ガン細胞も、フローサイトメトリーによって正常細胞から分離され得る。正常細胞から腫瘍を分離するための他の技術と同様に、これらの技術は当該分野において周知である。次いで、悪性腫瘍組織を含まない正常組織をスクリーニングすることは有用である。次いで、悪性腫がミスマッチ修復経路における自発的変動から起こるのか、あるいは遺伝的なものから起こるのかを決定するために、比較が行われ得る。変異の検出は、腫瘍組織に存在するそれらのミスマッチ修復経路遺伝子の分子クローニング、および当該分野において周知の技術を用いて遺伝子の配列を決定することによって達成され得る。例えば、mRNAは単離され得、逆転写され得、そしてcDNA配列が決定され得る。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応が、ミスマッチ修復経路遺伝子またはそのフラグメントを、腫瘍組織由来のゲノムDNA調製物から直接増幅するのに用いられ得る。増幅された配列のDNA配列は、次いで決定される。あるいは、DNAにおける変動を示すDNAのマーカーの位置をスクリーニングし得る。ポリメラーゼ連鎖反応自体は、当該分野において周知である。例えば、 Saikiら、Science、239:487(1988)；米国特許第4,683,203号；および米国特許第 4,683,195号を参照のこと。ミスマッチ修復遺伝子を増幅するために使用され得る特異的なプライマーについて以下により詳細に記載する。ミスマッチ修復経路の遺伝子の特異的な欠失もまた、検出され得る。例えば、 MSH2のようなミスマッチ修復遺伝子に対する制限断片長多型(RFLP)プローブが、野生型の対立遺伝子の欠落を評価するために使用され得る。欠失を検出するための他の技術は、当該分野において公知であるように、用いられ得る。野生型ミスマッチ修復経路遺伝子の欠落も、ミスマッチ修復経路遺伝子の野生型発現産物の欠落に基づいて検出される。このような発現産物は、mRNAおよびそれ自身のタンパク質産物の両方を含む。点突然変異も、mRNAを直接またはmRNAから作製されるcDNAの分子クローニングを介して配列を決定することにより検出され得る。クローン化されたcDNAの配列は、当該分野において周知のDNA配列決定技術を用いて決定され得る。あるいは、タンパク質における変動をスクリーニングし得る。例えば、抗体のパネル(例えば、一本鎖またはモノクローナル抗体)が、例えば、MSH2機能に関連する特異的エピトープが特定の抗体で堤示されるのに使用される。パネルにおけるモノクローナル抗体の結合の消失または摂動は、タンパク質の変異的な変化、すなわち遺伝子そのものの変異的な変化を示す。あるいは、切端タンパク質の発現を導く欠失変異は、サンドウィッチ型ELISAスクリーニング手順(この方法において、例えば、捕獲抗体が、経路のタンパク質のＮ末端部分に特異的である)を用いて迅速に検出され得る。標識抗体がタンパク質のＣ末端部分に結合できないことは、タンパク質が切端されていることを示す。Ｃ末端に結合する場合でも、タンパク質についてのさらなる試験が変化を示し得る。例えば、分子量の比較。変化したミスマッチ修復経路タンパク質を検出する任意の方法は、野生型ミスマッチ修復経路遺伝子を検出するために使用され得る。あるいは、ミスマッチの検出は、ミスマッチ修復経路遺伝子またはそれらのmR NA産物における点突然変異を検出するために用いられ得る。これらの技術は、配列決定よりも感度が低いが、これらの方法は、より簡便に多数の腫瘍において施行され得る。ミスマッチ切断技術の例としては、RNAアーゼ保護法があり、Winte rら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82:7575(1985)およびMeyersら、Science、230:1 242(1985)に詳細に記載されている。本発明の実施において、本方法は、ヒト野生型ミスマッチ修復経路遺伝子に相補的な標識リボプローブの使用を含む。このプローブと、腫瘍組織に由来するmRNAまたはDNA単離形態のいずれかとを、ともにアニールし(ハイブリダイズし)、続いてRNアーゼＡ酵素で切断することにより、二本鎖RNA構造中のいくつかのミスマッチを検出し得る。ミスマッチが、RNアーゼＡによって検出されるならば、RNアーゼＡはミスマッチ部位で切断する。従って、アニールされたRNA調整物を電気泳動ゲルマトリックス上で分離する場合、ミスマッチが検出され、そしてRNアーゼAによって切断されれば、リボプローブおよびミスマッチ修復経路のmRNAまたはDNAに対して完全長二本鎖RNAよりも短いRNA産物が認められる。リボプローブはミスマッチ修復経路のmRNAまたは遺伝子のセグメントのみを含む。ミスマッチに対するmRNAの全配列をスクリーニングするために、これらの多くのプローブを使用するのが望ましい。同様の様式で、酵素的または化学的切断により、DNAプローブはミスマッチを検出するために使用され得る。例えば、Cottonら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、85: 4397(1988)；およびShenkら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、72:989(1975)を参照のこと。あるいは、ミスマッチは、マッチした二本鎖に対してのミスマッチの二本鎖の電気泳動的移動度におけるシフトによって検出され得る。例えば、Cariello 、Human Genetics、42:726(1988)を参照のこと。リボプローブまたはDNAプローブのいずれかで、変異を含む細胞性mRNAまたはDNAを、ハイブリダイゼーションの前にPCRを用いて増幅し得る。ポリメラーゼ連鎖反応の使用によって増幅された腫瘍組織由来のミスマッチ修復経路遺伝子のDNA配列も、対立遺伝子特異的プローブを用いてスクリーニングされ得る。これらのプローブは核酸オリゴマーであり、それぞれ、既知の変異を有するミスマッチ修復経路遺伝子の領域を含む。一群の対立遺伝子特異的プローブの使用によって、PCR増幅産物は、スクリーニングされ得、ミスマッチ修復経路遺伝子における予め同定された遺伝子の存在を同定する。対立遺伝子特異的プローブと増幅されたミスマッチ修復経路配列のハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロンフィルター上で施行され得る。特定のプローブに対するハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブにおけるように、腫瘍組織においても同様の変異が存在することを示す。変化したミスマッチ修復経路遺伝子または遺伝子産物は、広範囲な生物学的サンプル、例えば血清、糞便、または他の体液、例えば尿および痰中において検出され得る。上記と同様の技術は、全ての生物学的サンプルに適応され得る。このような生物学的サンプルをスクリーニングすることによって、簡単な初期診断が多くのタイプのガンに対して達成され得る。ガンであると診断された場合でも、これらのスクリーニングは病態(例えば、自然変異対遺伝性)の予後となり得る。本発明の予後方法は、臨床医にとって有用であり、処置の適切な方針を決定し得る。例えば、DNAミスマッチ修復システムにおける遺伝性変異は、散発性の変異とは異なる治療上処方を示唆する。本発明のスクリーニング方法は、ミスマッチ修復経路における欠損が、腫瘍形成などにおいて役割を果たす任意のサンプルに利用可能である。 DNAミスマッチ修復を欠損する腫瘍の診断のための本発明の方法は、広範な腫瘍に対して利用可能である。これらは、結腸直腸、卵巣、子宮内膜(子宮)、腎、膀胱、皮膚、直腸、および小腸を含む。本発明はまた、DNA増幅方法(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)を用いたミスマッチ修復遺伝子のヌクレオチド配列の決定に有用なキットを提供する。このキットは、遺伝子自身のDNA合成の増幅を開始するための、ミスマッチ修復遺伝子内または周辺の配列にアニールし得る一本鎖オリゴヌクレオチドDNAプライマー対のセットを含む。増幅された配列の次のクローニングを促進するために、プライマーは5'末端に追加された制限酵素部位を有し得る。従って、プライマーの全てのヌクレオチドは、制限酵素部位の形成に必要な数個のヌクレオチド以外のミスマッチ修復遺伝子配列またはその隣の配列に由来する。このような酵素および部位は、当該分野において周知である。このプライマー自体は、当該分野において周知の方法を用いて合成され得る。一般的に、プライマーは市販の合成機を用いて作製され得る。好ましい実施態様において、hMSH2遺伝子における変化を検出するためのプライマーのセットは、配列番号46〜65および145〜154からなる群から選択されるプライマーの対を含む。本発明に従って、野生型ミスマッチ修復経路機能を変異したミスマッチ修復経路対立遺伝子を有する細胞に供給する方法も提供される。野生型のミスマッチ修復経路遺伝子または本遺伝子の一部分は、遺伝子が染色体外に残るようなベクターでの状態で細胞内へ導入され得る。このような状況において、遺伝子は細胞により、染色体外の位置から発現される。遺伝子の一部が導入され、そして変異したミスマッチ修復経路対立遺伝子を有する細胞において発現されれば、遺伝子の一部はその細胞においてミスマッチ修復に必要とされるミスマッチ修復経路のタンパク質の一部をコードするはすである。より好ましくは、野生型ミスマッチ修復経路遺伝子またはその一部が、細胞中に存在する内在性のミスマッチ修復経路遺伝子変異と組換えするような方法で、変異細胞中に導入されるような状況である。このような組換えには、ミスマッチ修復経路遺伝子の変異を修正する二重組換え反応を介するような、細胞内への安定な組み込みが必要である。組換えおよび染色体外維持の両方のための遺伝子導入ベクターは、当該分野において公知であり、そして任意の適切なプライマーが使用され得る。このような細胞は、広い範囲の活性において使用され得る。例えば、ミスマッチ修復経路における欠損を有する腫瘍細胞株を用いる薬物のスクリーニングを調製し得、そしてこの技術を用いてその腫瘍細胞由来のコントロール細胞を作製し得る。従って、試験された化合物が経路に影響を及ぼすかどうかを決定し得る。このような方法は、経路に特異的に影響する薬物を選択するために用いられ得、または薬剤のスクリーニングとして公知の抗ガン剤を含み、この薬剤はミスマッチ修復欠損腫瘍に対して有効である。これらの薬物は、併用または相乗効果を目的として、他の薬物と併用され得る。対照的に、正常細胞を新生物細胞と比較する場合、このような細胞に影響する種々の因子があり得、従って、このような比較では同様なデータを提供しない。これらの細胞はまた臨床的に、例えば、体細胞治療などにおいて使用され得る。本発明は、さらに経路の遺伝子における変化が変異であるのかまたは対立遺伝子の変種であるのかを決定するための方法を提供する。この方法は、試験される経路の遺伝子において変異を有する細胞内に変化される遺伝子を導入する工程を包含する。細胞は、インビトロまたはインビボであり得る。試験される変化した遺伝子が対立遺伝子の変種であれば、すなわち機能が維持されれば、変異は相補され、そして細胞は野生型の表現型を示す。対照的に、変化した遺伝子が変異であれば、変異は相補されず、そして細胞は非野生型を示し続ける。経路のメンバーを安定に発現する細胞株も調製され得る。このような細胞は、当該分野において周知の技術を用いて一連の抗体を調製するための優れた抗原源を含む種々の目的のために使用され得る。ミスマッチ修復経路活性を有するポリペプチドまたは他の分子が、変異したミスマッチ修復経路対立遺伝子を有する細胞に供給され得る。この活性な分子は、例えば、マイクロインジェクションによってまたはリポソームによって細胞内に導入され得る。あるいは、このようないくつかの活性な分子は、細胞によって能動的に、または拡散によって捕獲され得る。このような活性な分子の供給は、初期の新生物部位において有効である。ガンの素因は、ヒトの正常細胞を試験することによって確認され得る。例えば、生殖系列(germline)由来のミスマッチ修復経路の変化を遺伝しているヒトは、ガンが発達する傾向がある。このことは、ヒトの身体の任意の組織山来のDNAまたはmRNAを試験することによって決定され得る。最も簡単には、血液が採血され得、そして血液の細胞からDNAおよびmRNAが抽出され得る。点突然変異、付加、または欠失のいずれかによる野生型ミスマッチ修復経路の対立遺伝子の欠落は上記の任意の手段によって検出され得る。核酸はまた、この目的のために胎児組織から抽出され得、試験され得る。従って、本発明は広範囲(インビボとインビトロの両方)の分析を提供する。これらのアッセイは、ミスマッチ修復のメンバーの細胞活性を検出するために用いられ得、そのメンバーには細菌のミスマッチ修復経路遺伝子に相同性のある真核生物ヌクレオチド配列およびそれらがコードするポリペプチドの細胞活性が含まれる。これらのアッセイシステムにおいて、ミスマッチ修復遺伝子、ポリペプチド、特定のフラグメント、またはその機能的同等物は、このシステムに供給され得、またはこのシステム内で産生され得る。例えば、このようなアッセイは、ミスマッチ修復遺伝子が、過剰であるかまたは涸渇であるかを決定するために用いられ得る。例えば、インビボアッセイシステムは、全ての動物の細胞または組織培養物における、あるいは全ての動物または組織培養システム内の特定の細胞または組織における、あるいは特定の時間間隔(胚発生の期間を含む)における、本発明の転写またはポリペプチドの、増加されたまたは減少されたレベルの効果を研究するために使用され得る。本発明の別の局面は、ストリジェントな条件下で、配列番号８に記載の、またはその特定のフラグメントおよび真核生物DNAミスマッチ修復経路のメンバーをコードするフラグメントを有するDNA断片にハイブリダイズする単離されたDNA断片に関する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。例えば、実施例１に記載のハイブリダイゼーション条件が用いられ得る。腫瘍の同定および分類本明細書に記載の１つの好ましいアッセイは、ミスマッチ修復欠損腫瘍の診断および／または予後を可能にする。本発明の真核生物ヌクレオチド配列、ポリペプチド、および抗体は、以下のような腫瘍の疑いのある病理学上の条件を決定するのに特に有用である：(i)例えば、細菌のミスマッチ修復経路の類似体のメンバーに相同であるヌクレオチド配列の非野生型対立遺伝子を含み、および／または(ii)細菌のミスマッチ修復経路の類似体のメンバーに相同であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド上の、少なくとも１つの抗原決定基を欠き、および／または新しい抗原決定基を含む。例えば、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、PCRなど(例えば、 Grompe、Nature Genetics 5:111-117、1993、本明細書中に参考として援用される)を含有する当該分野で公知のいずれかの方法を用いて、腫瘍から単離された核酸における細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な非野生型対立遺伝子の配列の存在を同定するために、本発明のヌクレオチド配列が用いられ得る。例えば、１つの実施態様において、配列番号８を用いて、PCRプライマーを設計しE.coli mutsS遺伝子に相同である、ヒトHMS2の個々のエキソンまたはイントロンを増幅し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、配列番号８に記載のヒト遺伝子の配列の少なくとも１つの非野生型対立遺伝子を含むヒト腫瘍を同定し、そして分類し得る。配列番号25/26、29/30、31/32、35/36、37/38および39/ 40に例示したプライマーは、ヒトHMS2遺伝子の個々のエキソンを増幅するために使用され得る。これらのプライマーは、すべてイントロン配列にハイブリダイズし、従ってエキソンおよびそれらを挟むイントロン／エキソン接合部(スプライシングに重要な配列を含む)を、公知の腫瘍細胞または腫瘍の疑いのある細胞から増幅するために使用され得る。従って、増幅されたヌクレオチド配列は、次いで、公知に対応する配列と比較され得、野生型配列に関連する腫瘍配列における任意の相違の存在または非存在を決定する。ヒト遺伝子の少なくとも１つの配列の少なくとも１つの非野生型対立遺伝子を含む腫瘍は、「ミスマッチ修復欠損」として分類され得る。配列の比較は、直接配列比較または当該分野において他の公知の診断方法によって実施され得、このような診断方法には、一本鎖構造多形分析、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動などが含まれるが、これらに限定されない。（Grompe、上述を参照のこと。）例えば、配列番号33/34のプライマーのセットは、結腸直腸腫瘍のDNA由来の配列およびコントロール非腫瘍DNAの配列を標準的なPCR技術によって増幅するために使用された。例えば、使用するPCR反応は、10mM Tris緩衝液pH8.5、50mM KCl 、3mM MgCl₂、0.01ゼラチン、50μM各dNTP、1.5単位Taq DNAポリメラーゼ、5pmo le各プライマー、および25ng鋳型DNA(Glen Steele、New England Deaconess Hos pital、Boston、MAまたはJ.GarberおよびF.Lee Dana-Farber Cancer Institute 、Boston、MAから提供された)を含んだ。94℃で30秒、55℃で30秒、および72℃ で１分間での35サイクルを実施した。生成物のバンドはGrompeの上記の方法によって分析された。このような方法によって、腫瘍および非腫瘍DNA間の増幅配列の差が観測された。あるいは、生成物のバンドは、例えば配列番号33および配列番号34のようなオリゴヌクレオチドを用いて配列決定され得る。従って、腫瘍および非腫瘍DNA間では１塩基対の相違でも観察され得る。例えば、正常組織由来の生成物のバンドは、配列5'-C/CTACAAAAC-3'(「/」は、エキソン/イントロンの境界を示す)を有するが、同一個体の腫瘍組織由来の生成物のバンドは、配列5'-C/ CTACAGAAC-3'(下線は変化した塩基対を示す)。この変動はプレmRNAスプライシングシグナルに影響するイントロン配列内に位置決定される。他のプライマー対はイントロンの配列のみまたはエキソンの配列のみを増幅するのに使用され得る。生成物のバンドは上記のように分析され得る。あるいは、本発明の抗体は、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同であるヌクレオチド配列にコードされる少なくとも１つの真核生物ポリペプチド上の少なくとも１つの抗原決定基が、腫瘍組織において存在しないこと、および／または新規な抗原決定基が存在することを検出するために、ウエスタンブロッティングのような標準的な技術において、プローブとして使用され得る。このようなガンは、上記のようなミスマッチ修復欠損腫瘍を含むと予想される。本発明はまた、経路のメンバーの変化を有する細胞における他の因子を示し得る。例えば、本発明の単離された真核生物ヌクレオチド配列および単離されたポリペプチドによって提供される情報を用いて、宿主細胞内において、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である内在性ヌクレオチド配列、および／または細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である内在性ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド産物を不活性化し得る。その結果変化した宿主細胞の生理学的な特徴は、分析され得、そして未変化の宿主細胞の生理学的特徴と比較され得る。得られた変化した宿主細胞の任意の生理学的特徴が、非変化の宿主細胞のものとは異なることが認められ得る。次いで、同様の生理学的特徴が、腫瘍細胞において分析され得るが、これはその腫瘍細胞を同定するのに役立つ。ここで腫瘍細胞はミスマッチ修復遺伝子に相同であるヌクレオチド配列の非野生型対立遺伝子を含み、および／または細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同であるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド上で少なくとも１つの抗原決定基を欠く。そのような研究において分析され得る生理学的特徴として、自然突然変異の蓄積率の変化(例えば、薬剤耐性に対する自然突然変異率による)、変異の復帰率の変化、分岐配列間の組み換え頻度の変化、短い反復配列のゲノム安定性の変化、紫外線、ヌクレオチドアナログ、アルキル化剤などのDNA損傷誘発剤に対する感受性または耐性などをが挙げられるが、これらに限定されない。この種の分析に使用され得るプロトコルの例については、ReenanおよびKolodner、Genetics 132 :975-985(1992)；Katら、Proc.Nat.Acad.Sci、USA 90:6424-6428(1993)；Strand ら、Nature 365:274-276(1993)(それぞれ本明細書中に参考として援用される) を参照のこと。細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同であるヌクレオチド配列の分類本発明の真核生物ヌクレオチド配列の異なるバージョン（version）、すなわち「対立遺伝子」は、正常宿主細胞における細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である配列のような、内在性ヌクレオチド配列を機能的に置換する能力によって分類され得る。本明細書中で使用されるように、「野生型」対立遺伝子は、宿主細胞に検出可能な有害な効果をもたらさない、正常宿主細胞の内在性ヌクレオチド配列を置換し得る配列として定義される。「非野生型」対立遺伝子または「変化」は、宿主細胞に検出可能な有害な効果をもたらさない、正常宿主細胞の内在性ヌクレオチド配列を置換し得ない真核生物ヌクレオチド配列として定義される。本発明の真核生物ヌクレオチド配列の非野生型対立遺伝子は、いくつかの方法のうちのいずれかによって野生型対立遺伝子と区別され得、これらには、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列およびコードされるヌクレオチドの転写産物の発現レベルまたはポリペプチド産物のレベルを含むが、これらには限定されない。「野生型」または「非野生型」として細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列の分類においてモニターされ得る生理学的特性としては、増殖速度、薬剤耐性に対する自然突然変異率、遺伝子転換率、短いDNA反復配列のゲノム安定性、紫外線、ヌクレオチドアナログ、アルキル化剤などのDN A損傷誘発剤に対する感受性または耐性が挙げられるが、これらに限定されない。内在性ミスマッチ修復経路を阻害するタンパク質をコードする特定の「非野生型」対立遺伝子は、宿主細胞に導入された場合、「優性な負の」対立遺伝子と呼ばれる。宿主細胞における、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である内在性ヌクレオチド配列および／またはそれらがコードするポリペプチドの不活性化本発明の単離された真核生物ヌクレオチド配列および単離されたポリペプチドによって提供される情報を用いて、例えば、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な内在性ヌクレオチド配列および／または細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な内在性ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド産物を、宿主細胞において不活性化し得る(実施例２、実施例６を参照のこと)。例えば、本発明の真核生物ヌクレオチド配列の非野生型対立遺伝子を用いて、宿主細胞における内在性ヌクレオチド配列を、例えは、内在性ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせる、すなわち転写または翻訳を妨げることによって、または宿主細胞のゲノム内に組み込む、すなわち内在性ヌクレオチド配列を置換または破壊することによって、不活性化し得る。より詳細には、内在性ヌクレオチド配列に結合して、例えば３重ヘリックスを形成し得る非野生型の対立遺伝子を用いて、内在性DNA配列の転写を阻害し得た。転写において、非野生型の対立遺伝子は、内在性ヌクレオチド配列の転写物にハイブリダイズし得る「アンチセンス」核酸配列を産生し、内在性転写産物の翻訳を阻害し得た。非野生型対立遺伝子 (特にヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む対立遺伝子)は、宿主ゲノム細胞に組み込み得、従って、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な内在性ヌクレオチド配列を置換または破壊し得た。１つの実施態様において、内在性ミスマッチ修復遺伝子によって発現されるポリペルチドの量は、好ましくはトランスジェニック動物において、ミスマッチ修復遺伝子ポリペプチドの発現を減少させるのに効果的なミスマッチ修復遺伝子アンチセンスRNAまたはDNAの量で、ミスマッチ修復遺伝子ポリペプチド発現細胞を提供することによって、減少され得る。あるいは、トランスジェニック動物(好ましくは非ヒト哺乳動物)は、ミスマッチ修復遺伝子の特異的DNA配列に結合し得るリプレッサータンパク質で提供され得、これにより、ミスマッチ修復遺伝子の転写のレベルを減少(「抑制」)した。本発明のトランスジェニック動物は、そのミスマッチ修復遺伝子によって発現されるポリペプチドのレベルを減少させ、トランスジェニック動物の作製の分野に一般的に適用可能である。なぜなら、それらは遺伝子の発現レベルの制御を可能にするからである。細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列の変異誘発本発明の単離された真核生物ヌクレオチド配列および単離されたポリペプチドは、ヒドロキシルアミンによる処理、変異誘発性細菌株を介しての継代(passage )移行を包含するいくつかの標準的な手順のいずれかによって、変異が誘発され得る。次いで、変異が誘発された配列は上記のように、「野生型」または「非野生型」に分類され得る。変異誘発された配列は、点突然変異、欠失、置換、再配置などを含み得る。変異誘発された配列は、それらがコードするポリペプチドの異なる領域の細胞機能を明らかにするために使用され得る。例えば、配列番号４(アミノ酸１〜21)の推定ミトコンドリア標的配列をコードする配列番号２の領域は、変異誘発されてこれらのアミノ酸を欠失し得、これによりこれらのアミノ酸が、実際に、ミトコンドリアに対して、配列番号４のポリペプチドを標的とするように機能することが確認される。ミトコンドリア細胞局在は、例えば、免疫蛍光法によって検出され得る。ガン罹病性の診断本発明の別の好ましい実施態様は、ガン罹病性の診断にある。本発明の真核生物ヌクレオチド配列、ポリペプチド、および抗体は、上記のように、経路のメンバーの変化との相関を示すガンに対する罹病性の診断に特に有用である。このようなガンは、上記のように、ミスマッチ修復欠損腫瘍を含むと予想される。サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、PCRなど(例えば、Grompe、上記)当該分野において公知の任意の方法を用い、本発明のヌクレオチド配列を用いて、ガンに対する罹病性について試験される個体から単離された核酸の細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な配列である関連非野生型対立遺伝子の存在を同定し得る(上記の腫瘍の分類の説明を参照のこと)。あるいは、本発明の抗体をウェスタンブロッティングのような標準的な技術におけるプローブとして使用して、ガンに対する罹病性を試験される個体由来のサンプル組織の、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同であるヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１つの真核生物ポリペプチド上の、少なくとも１つの関連する抗原決定基の欠失を検出し得る。有効な治療剤の同定本発明で提供される分子および宿主細胞は、ガンに有効な治療剤を同定するために用いられ得る。特に、本発明の分子および宿主細胞を用いてガンに対して有効な治療剤を同定しうる。ここでガンの発症率は、ミスマッチ修復経路における任意の変化(例えば、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同であるヌクレオチド配列の非野生型対立遺伝子の存在)、および／または、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド上の少なくとも１つの抗原決定基の欠陥と相関する。例えば、上記のように、変化した宿主細胞が産生され、ここで細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である内在性ヌクレオチド配列が不活性化され、および／または細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である内在性ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド産物が不活性化される。このような変化された宿主細胞は、様々な可能性のある治療剤またはその組合わせと接触し得る。このような治療剤またはその組合わせの生理学的効果は、治療剤またはその組合わせに接触される変化した宿主細胞の生理学的特徴を、治療剤またはその組合わせに接触される非変化宿主細胞の生理学的特徴と比較することによってアッセイされ得る。好ましい実施態様において、変化した宿主細胞は、組織培養またはインサイチュ(非ヒトの場合)のいずれかにおける、哺乳動物細胞である。酵母のような他の真核生物細胞もまた、使用され得る。試験され得る可能性のある治療剤として、挿入剤（intercalating agent）、ヌクレオチドアナログ、アルキル化剤、およびＸ線が挙げられるが、これらに限定されない。アッセイされ得る可能な生理学的効果としては、自然突然変異の蓄積率の変化(例えば、薬剤耐性に対する自然突然変異率による)、変異復帰率の変化、分岐配列間の組換え頻度の変化、短い反復配列のゲノム安定性の変化、紫外線、ヌクレオチドアナログ、アルキル化剤のようなDNA損傷を誘発する薬剤に対する感受性または耐性が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい治療剤またはその組合わせは、選択され得る。好ましい治療剤としては、非変化細胞に比べて変化した細胞に比較的毒性である治療剤またはその組合わせが挙げられる。毒性は、細胞死の増加(細胞数でアッセイ)、DNA複製の減少(例えば、トリチウム化チミジン(³H))、および細胞成長速度の遅延(細胞数によってアッセイされる)のようなパラメーターで定義され得る。本発明の１つの特定の実施態様において、変化したおよび非変化の宿主細胞は、DNA損傷剤(例えば、ヌクレオチドアナログ(例えば、5-FU、2AP)、紫外線、またはアルキル化剤)の存在下において、治療剤またはその組合わせと接触され得る。本発明のいくらかの遺伝子は、DNAに対する損傷の修復に関与しているので、DNA損傷剤は単独で変化した宿主細胞に対して致死的であると予想される。ここで、この変化した宿主細胞は本発明の内在性であるか不活性化されたヌクレオチド配列またはポリペプチド産物を含んでいる。これは、ヌクレオチドアナログがDNA内に取り込まれ、機能的なミスマッチ修復システムの非存在下では修復されない変異を創り出すからである。しかし、このような効果は、類似のシステムである内在性mutS遺伝子が変異されたE.coli細胞で観察されなかった。それにもかかわらず、DNA損傷剤は、他の治療剤と併用すると、変化した細胞に比較的毒性であるようである。本明細書中に記載のアッセイにより、DNA損傷剤または他の薬剤の存在下で投与されたときに、非変化の細胞に比べて変化した宿主細胞に比較的毒性である治療剤またはその組合わせの同定が可能であり、ここで変化した宿主細胞は、本発明の不活性化された内在性ヌクレオチド配列、および／または本発明の不活性化されたポリペプチド産物を含む。別の好ましい治療剤は、投与の際に、治療試薬またはその組合わせで接触される変化した細胞の生理学的特徴を修復して、非変化、非処置の宿主細胞の生理学的特徴により厳密に類似させるものを包含する。これらの治療剤、またはその組合わせが、非変化宿主細胞の生理学的特徴に有意に影響しないことが、さらに好ましい。治療および薬学的組成物本明細書中に記載のヌクレオチド配列およびこれらの配列によって発現されるおよびポリペプチドは、例えば、遺伝子治療における薬学的組成物にもまた、使用され得る。１つの例示的な薬学的組成物は、本発明のミスマッチ修復ヌクレオチド配列の治療有効量であり、必要に応じて薬学的に受容可能かつ適合可能なキャリアに含まれる。用語「薬学的に受容可能かつ適合可能なキャリア」は、本明細書中で用いられるように、そしてさらに十分に以下に記載されるように、(i) ヒトまたは他の動物への投与に適した、１つ以上の適合可能な個体または液体の充填希釈剤またはカプセル化物質、および／または(ii)レトロウイルスベクターのようなミスマッチ修復ヌクレオチド配列を標的細胞に送達し得る、システムを意味する。本発明において用語「キャリア」は、従って、有機成分、または無機成分、天然成分または合成成分を示し、これを本発明のミスマッチ修復ヌクレオチド配列およびポリペプチドと組み合わせて適用を容易にする。用語「治療有効量」は、試験される特定の条件に対し、所望の結果を生成するか、または所望の影響を発揮する本発明の薬学的組成物の量である。様々な濃度が、同じ成分を取り込む組成物を調製するのに使用されて、処置される患者の年齢病状の重得度、処置期間、および投与様式における多様性を与え得る。用語「適合可能な」は、本明細書中で使用されるように、実質的に所望の薬学的効果を損なう相互作用が内容にて、薬学的組成物の構成成分が、本発明の核酸および／またはポリペプチドと混合され、そしてお互いに混合され得ることを意味する。本発明の薬学的組成物の用量は、被験体によっておよび使用される特定の投与経路によって変化する。実施例の方法のみでは、例えば約１マイクログラムから約300マイクログラムまでの用量範囲がヒトへの使用に意図される。この用量は、少なくとも２回に分けて、好ましくは約４週間の間隔をあけて投与される。本発明の薬学的組成物はまた、種々の他のよく特徴付けされたプロトルに従って、被験体に投与される。例えば、特定の現在受け入れられている免疫化処方は以下を含み得る：(i)推奨される投与回数は、選択された日付に１回目投与；１回目投与から１ヶ月後に２回目投与；２回目投与から５ヶ月後に３回目投与、Produc t Information，Physician's Desk Reference 、Merck SharpおよびDohme(1990) 、1442-43.(例えば、Ｂ型肝炎ワクチンのプロトコル)を参照のこと；(ii)小児への推奨される投与は、選択された日付に第１投与(生後６週目またはそれ以上で) ；１回目投与から４〜８週間後に第２投与；２回目投与から４〜８週間後に３回目投与；３回目投与から６〜12ヶ月後に４回目投与；４〜６歳時に５回目投与；最終投与から10年毎にさらなる追加免疫(additional booster)。Product Informat ion ，Physician's Desk Referrence、Merck SharpおよびDohme(1990),879(例えば、ジフテリア、破傷風および百日咳型ワクチンのプロトコルを参照のこと)。特定の組成物を多様な用量で送達するための所望の時間間隔は、ルーチンの実験にのみ従事する当業者によって決定され得る。本発明のポリペプチドはまた、それ自体で(ニート(neat))または薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。薬品に使用される場合、塩は薬学的に受容されるべきであるが、それの薬学的に受容可能な塩を調製するために、薬学的に受容可能でない塩が便宜上使用され得、そしてこれは本発明の範囲から除外されるものではない。このような薬学的に受容可能な塩は、以下の酸から調製されるものを含むが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン-2-スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩(例えば、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩)として調製される。従って、本発明はまた、薬品使用のために薬学的組成物を提供し、この組成物はそれの１つまたはそれ以上の薬学的に受容可能なそのキャリア、および必要に応じて任意の他の治療成分とともに、本発明の核酸および／またはポリペプチドを含有する。組成物は、経口投与、直腸投与、局所投与、鼻内投与、眼投与、または非経口投与に適切な組成物を包含し、これら全ては、本発明の物質を使用する投与経路として使用され得る。投与に適切な他の経路は、脊髄液への直接髄腔内投与(CSF )、動脈表面への直接注射、および器官の標的領域への直接柔組織内注射である。非経口の投与に適切な組成物が望ましい。「非経口」という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または灌注技術を包含する。組成物は、好都合には単位投与量剤形で与えられ得、そして薬学の分野で周知の任意の方法で調製され得る。全ての方法は、本発明の活性成分と１以上の副成分を構成する担体との結合をもたらす工程を包含する。経口投与に適した本発明の組成物は、カプセル、カシェ剤、錠剤、またはトローチ剤のような別々のユニットとして与えられ得、それぞれ既に決定された量の本発明の核酸および／またはポリペプチドを、リポソーム内にまたはシロップ、エリキシル、または乳剤のような水溶性溶剤あるいは非水溶性溶液に懸濁して含有している。非経口投与に適切な好ましい組成物は、都合の良いことには本発明の核酸および／またはポリペプチドの無菌水性調製物を含み、これは好ましくは受容者の血液と等張性である。この水性調製物は、それらの適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して既知の方法で処方され得る。無菌注射用調製物は、無菌注射用溶液、または非毒性の非経口受容可能希釈液または溶媒中の懸濁液、例えば1 、3-ブタンジオール中の溶液であり得る。受容可能な賦形剤および溶媒の中で、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液が用いられ得る。さらに、無菌不揮発油が、好都合に溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために、任意の無刺激性不揮発油が用いられ得、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを包含する。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射液の調製において有用であることが分かっている。本発明の核酸および／またはポリペプチドはまた、ワクチンに使用するために成分(moiety)に複合体化し得る。核酸および／またはポリペプチドに複合体化させる成分は、タンパク質、炭水化物、脂質等であり得る。この成分の化学構造は、いずれにしろ本発明の範囲を限定することを意図しない。核酸および／またはポリペプチドに結合させる成分はまた、アジュバントであり得る。「アジュバント」という用語は、本発明の核酸および／またはポリペプチドと同時に取り込まれ得るかまたは投与され得、そして被験体内の免疫反応を増強する任意の物質を包含することを意図する。アジュバントは、例えばゲル、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムゲルのようなアルミニウム化合物およびフロイントの完全または不完全なアジュバントを包含する。パラフィン油は、例えばスクアレンまたは落花生油のような異なるタイプの油と置き換え得る。アジュバント特性を有する他の物質は、BCG(弱毒Mycobacterium tuberculosis)、リン酸カルシウム、レバミソール、イソプリノシン、ポリアニオン（例えば、ポリＡ：Ｕ）、ロイチナン(leutinan)、百日咳毒素、リピドＡ、サポニン、および例えばムラミルペプチドのようなペプチドを包含する。希土類塩、例えばランタンおよびセリウムもまた、アジュバントとして使用し得る。必要とされるアジュバントの量は、被験体および用いられる特定の治療法に依存し、そして過度の実験を行うことなく当業者により容易に決定され得る。本発明の真核生物ヌクレオチド配列のポリペプチド産物と相互作用する因子の同定本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチドは、相互作用因子の同定に使用され得、それらの内いくつかはそれ自体が本発明に包含される。すなわち、本発明の種々の真核生物ヌクレオチド配列のポリペプチド産物は、互いによく相互作用し得る。特に、配列番号３のポリペプチドと相互作用するこれらのタンパク質を同定することにより、ミスマッチ修復に作用する他のタンパク質がさらに同定される。酵母は、相互作用因子を遺伝的に同定するための特に強力な系を提供する。遺伝学的方法に加えて、共免疫沈降法およびタンパク質アフィニティークロマトグラフィーのようないくつかの生物化学的方法が、相互作用タンパク質の同定に使用され得る。生物化学的方法本発明の１つの実施態様において、共免疫沈降法は、配列番号３、配列番号４、または配列番号16のポリペプチドのような本発明の単離されたポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定するために使用される。共免疫沈降法は、相互作用タンパク質を同定するために有用であると証明された(例えば、KolodziejおよびYoung,Methods Enzymol.194:508,1991,本明細書に参考として援用されている；Pallasら,J.Virol 62:3934,1988，本明細書に参考として援用されている、を参照のこと)。本発明の１つの好ましい実施態様では、配列番号３のポリペプチドは、標準的な方法を使用してＮ末端およびＣ末端の片方または両方にflu 12CA5エピトープタグ(KolodziejおよびYoung、上記)を含有させるように設計され得る。内部位置にエピトープを挿入することが必要であり得る。次に、タグ化タンパク質は、MS H2遺伝子（配列番号１）の内在性のコピーが不活性化された酵母細胞で、ミスマッチ修復機能を提供する能力について試験される。機能的なタグ化タンパク質が生産されない場合は、配列番号３のポリペプチドの抗原決定基に対して生じたポリクローナルまたはモノクローナルの抗血清が使用され得る。タグ化タンパク質は、有糸細胞または無糸細胞で対数期または定常期に発現される。発現（例えば、天然のプロモーター、cenベクター；GAL10プロモーター、 cenベクター；GAL10プロモーター、２μに基づくベクター）の種々のレベルを試験し得る。細胞を溶解し、タグ化タンパク質をflu 12CA5抗体（または配列番号３の抗原決定基に対して生じたポリクローナル抗血清）を使用して沈殿させ、そして共沈殿したタンパク質を検出するために１次元または二次元のゲル電気泳動により分析する(KoloddziejおよびYoung 1991,上記;Pallasら上記)。共沈殿の特異性は、タグ化タンパク質よりむしろ、非タグ化タンパク質が発現される実験、およびタグ化タンパク質が発現されていてそしてコントロールのマウス抗血清をflu 12CA5抗体の代わりに用いた実験によって評価される。塩、およびSDS、NP40およびジギトニンのような種々の界面活性剤に対する感受性は、観察された相互作用の安定性および特異性を評価するために用いられる。これらの相互作用にミスペアーの塩基が必要である可能性は、抗体を加える前に、ミスペアーの塩基を含有するオリゴヌクレオチド二本鎖およびコントロールのミスペアーの塩基を含有しないオリゴヌクレオチド二本鎖を細胞抽出物に加えることにより試験され得る。相互作用タンパク質が見つかった場合、標準的な方法によって、Ｎ末端および内部のタンパク質配列を得るのに十分な量を精製するために、ゲル電気泳動または免疫アフィニティークロマトグラフィーを使用し得る（例えば、本明細書に参考として援用のMatsudaira J.Biol.Chem.262:10035〜10038,1987を参照のこと）。次に、この配列情報を、DNAおよびタンパク質のデータベースとの比較、および、逆遺伝解析およびタンパク質過剰生産に使用するタンパク質をコードする遺伝子のクローニングのために使用し得る。同一のプロトコルは、配列番号４または配列番号16のポリペプチド、または本発明の真核生物ヌクレオチド配列にコードされる他の任意のポリペプチドについても行われ得る。本発明の別の実施態様では、本発明のポリペプチド、特に配列番号３、４および／または16のポリペプチドと相互作用するタンパク質が、これらのタンパク質が固定化されたタンパク質アフィニティーカラムを使用して同定され得る。(For mosaら,Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,80:2442,1983を参照のこと。例えば、１〜10mg のタンパク質をAffiGel-10(BioRad Laboratories,Richmond,CA製)または同等のマトリックスに共有結合させ得る。本発明のポリペプチド（例えば、配列番号３）を含有するカラムおよびコントロールのBSAカラムでの平行クロマトグラフィー実験を、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号３）に特異的に結合するタンパク質を同定するために行い得る。同定された相互作用タンパク質は、上記のようにＮ末端を配列決定し得る。また、同定された相互作用タンパク質と反応する抗体が生産され得る。次に、このような抗体を、例えば、同定された相互作用タンパク質をコードする遺伝子のクローニングを容易にする発現ライブラリーのスクリーニングのために使用し得る。いったん相互作用タンパク質が同定されてそして単離されたら、生物化学的実験を行い、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号３）にそれらが相互作用することの機能的重要性を評価し得る。このような実験は、以下の決定を包含する：1)相互作用タンパク質は、本発明のポリペプチドのミスペアー結合活性を増強するか；2)相互作用タンパク質は、インビトロ系で不活性化する機能を回復させるか；および3)相互作用タンパク質は、インビトロの再構成実験で必要な任意のタンパク質画分の代わりとなるか。代表的なインビトロ系の記載については、本明細書に参考として援用したMuster-Nassal およびKolodner,Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,83:7618(1986)を参照のこと。生物化学的方法はまた、本発明の単離されたポリペプチドと既知のタンパク質（例えば、DNA複製または組換えに関わるタンパク質）との間の特異的相互作用について試験するために用いられ得る。１つの取り組みとしては、これら既知のタンパク質をニトロセルロースフィルターまたは他の支持体に固定化し、この支持体をブロックして非特異的結合を防ぎ、本発明のエピトープタグ化ポリペプチド（配列番号３、４、および／または16のエピトープタグバージョン）と共にインキュベートし、そして次にエピトープタグと反応する抗体（例えば、12CA5 fl u抗体）でプローブして、固定化した既知タンパク質に相互作用してフィルターに結合した本発明のエピトープタグ化ポリペプチドを検出し得る。本発明の非エピトープタグ化ポリペプチドは、これらポリペプチドの抗原決定基に対して反応する抗血清と組み合わせて、代わりに使用され得る。相互作用タンパク質がクローン化されると、変異誘発および本出願に記載した他の方法を包含する標準的な方法が、これらタンパク質の細胞性機能（例えば、ミスマッチ修復、他のタイプのDNA修復、DNA複製、組換えなど）を決定するために使用され得る。いったん本発明の単離されたポリペプチドと相互作用するタンパク質が同定されたなら、新規に同定されたタンパク質と相互作用するタンパク質を同定するために同様のタイプの実験を行い得る。この取り組みを系統的に行うことにより、ミスマッチ修復において機能する数多くのタンパク質を同定し、そしてそれらの作用する機構についての洞察を同時に得ることが可能であり得る。遺伝学的方法あるいは、またはさらに、遺伝学的方法を、本発明のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定するために使用し得る。同定されたタンパク質の少なくともいくつかは、ミスマッチ修復に関与する遺伝子にコードされ、細菌ミスマッチ修復遺伝子に相同であり、そして従ってそれ自身本発明の範囲内にあることが予想される。例えば、１つの方法は、本明細書に参考として援用されているChienら,Proc.N at.Acad.Sci.USA.,88:9578(1991)に記載の２ハイブリット系である。この方法は、本発明のポリペプチドに相互作用するタンパク質を同定するために使用され得る。特に、配列番号３のＮ末端半分は、他のタンパク質と相互作用する少なくとも１つの領域を含有し得る(ReenanおよびKolodner,Genetics 132:963,上記)。この領域をGal4タンパク質のアミノ酸１〜147の末端に融合し、DNAのGal4部位に結合する融合タンパク質を作製し得る。配列番号３のアミノ酸１〜616が最初に使用され得るが、しかしこのポリペプチドの他のセグメント（全ポリペプチドを包含する）または配列番号４および16の類似の領域は、代わりに使用され得る。次に、融合タンパク質は、GAL1-LacZレポーターの活性化について、Gal4活性化ドメインと融合した酵母DNAフラグメントの利用可能なライブラリーを選択するために使用され得る。ポジティブなものは再スクリーニングされ、配列番号３のポリペプチドセグメントがなくて活性化するプラスミドをライブラリーから除去し得る。残ったポジティブクローンは、ライブラリープラスミドの配列が発する酵母遺伝子の破壊(disruption)を単離するために使用し得る。このような破壊を含有する細胞は、ミスマッチ修復に関わる遺伝子の破壊に予想されるように、この破壊が自然突然変異率、遺伝子転換、ミスペアー塩基を含有するプラスミドの修復、および／または短い繰り返しDNA配列のゲノム安定性に影響するかどうかを決定するために解析され得る。この方法は、必要とされるライブラリーがいくつかの供給源（例えば、Massachusetts General HospitalのRoger Brent教授）のいずれからも容易に得られるために迅速である。任意のクローン化された遺伝子がミスマッチ修復における役割と一致した性質を有するかどうかを決定することは簡単である。活性化ドメインのGal4と融合する、酵母以外の真核生物由来のDNAフラグメントのライブラリーもまた、スクリーニングされ得る。このようなライブラリーは、標準的な方法を使用して作製され得る。本発明のポリペプチドと相互作用するタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子を同定するために使用され得る代わりの遺伝的方法は、二次変異解析を使用することである。例えば、配列番号１に対応するE厄遺伝子、または哺乳動物のMSH2相同体に変異を持つ酵母細胞または哺乳動物細胞を、変異誘発し、そしてスクリーニングし、もともとのMSH2断細胞のミスマッチ修復欠損を訂正するか、または増大する二次的な変異を同定し得る。変異誘発された細胞は、例えば、自然突然変異率、遺伝子転換、ミスペアー塩基を含有するプラスミドの修復、および短い繰り返しDNA配列のゲノム安定性への影響について、本出願で既に記載したようにアッセイし得る。 MSH2破断細胞の欠損を訂正する二次変異は、「サプレッサー」と名付けられる。サプレッサー変異は、MSH2と相互作用する遺伝子において単離され得る。サプレッサー変異を単離する原理およびプロトコルの説明は、例えば、AdamsおよびB ot stein,Genetics 121:675〜683(1989);Novickら,Genetics 121:659〜674(1989);J arvikおよびBotstein,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 72:2738〜2742(1975)（これらは全て本明細書に参考として援用されている）を参照のこと。次に、これらの遺伝子は標準的なプロトコルでクローン化され、配列決定される。本来のMSH2破断細胞のミスマッチ修復欠損を増大する二次変異は時に、変異誘発された細胞がこれ以上生きられない程度までの極度の影響を有し得る。このような二次変異は、「合成致死」と称される。これらの変異を同定することに関わる原理およびプロトコルの説明は、本明細書に参考として援用されているKranz およびHolm,Proc.Nat.Acad.Sci.,USA 87:6629〜6633,(1990)を参照のこと。合成致死変異の影響は、UV光、ヌクレオチドアナログ、アルキル化剤などのようなDN A損傷剤の存在または不在下でアッセイされ得る。上記のように、ガンに対して有効な可能性のある治療剤の開発のために、DNA損傷剤が本発明の不活化真核生物ヌクレオチド配列を持つ宿主細胞に致死的である環境を同定することが望ましい。この場合、酵母の合成致死の研究は、変異した場合にMS厄破断細胞をDNA損傷剤に感受性にする遺伝子を同定するために用いられる。このような遺伝子は、化学療法の発展のための原理的な標的である。例えばこのような遺伝子を活化する、アンチセンス試薬、または他の可溶性酵素阻害剤のような薬剤は、E.coliのmutS遺伝子に相同である本発明の同定されたヒトゲノムヌクレオチド配列である、配列番号９の内在性のコピーの変化を有するHNPCC腫瘍を、ヌクレオチドアナログ、光、アルキル化剤、または他の治療剤のようなDN A損傷剤に感受性にし得る。経路メンバーの発現本発明のヌクレオチド配列を含有する組換えベクターは、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞に導入され得る。組換えベクターは、本発明の真核生物ヌクレオチド配列をベクター配列の調節因子（例えば、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナルなど）の制御下に置くように設計され得る。このような調節因子は、宿主細胞において、ヌクレオチド転写物および／または本発明の真核生物ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列の発現、および／またはプロセシングを導くように機能し得る。発現系は、原核細胞および／または真核細胞（すなわち、酵母、ヒト）を利用し得る。例えば、本明細書に参考として援用されている「Gene Expression Tech nology」,Volume 185,Methods in Enzymology,(D.V.Goeddel編),Academic Press Inc.,(1990)を参照のこと。ベクターに導入されたDNAのクローン化配列に相補的な大量のmRNAを生成する強力なプロモーターを含有する数多くのベクターが構築されてきた。例えば、これに限定されないが、E.coliにおける真核生物ヌクレオチド配列の発現は、lac、trp、lambda、およびrecAプロモーターを使用して達成され得る。例えば、本明細書に参考として援用されている「Expression in Es cherichia coli」,Section II,pp.11-195,V.185,Methods in Enzymology，上記; ならびにHawley,D.K.およびMcClure,W.R.，「Compilation and Analysis of Esc herichia coli promoter DNA sequences」,Nucl.Acids Res.,11:4891〜4906(198 3)を参照のこと。組換え細菌発現系での本発明の真核生物ヌクレオチド配列およびそれがコードするポリペプチドの発現は、容易に達成し得る。本発明の真核生物ヌクレオチド配列およびそれがコードするポリペプチドの発現に適切な酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae（上記参照）およびPichia p astorisの多くの系統を包含する。本明細書に参考として援用されている「Heter ologous Gene Expression in Yeast」,Section IV,pp.231〜482,V.185,Methods in Enzymology ,上記を参照のこと。さらに、当該分野で既知の数多くのベクター −哺乳動物宿主系が使用され得る。本明細書に参考として援用されているSambro okら,Volume III,上記および「Expression of Heterologous Genes in Mammalia n Cells」,Section V,pp.485〜596,V.185,Methods in Enzymology,上記を参照のこと。適切な発現系は、一時的にまたは安定的にDNAを発現する発現系、およびシミアンウイルス40(SV40)、レトロウイルス、およびバキュロウイルスに由来するウイルス発現ベクターを含む発現系を包含する。これらのベクターは、通常プロモーター、ならびにエンハンサー、スプライス受容および／または供給配列、およびポリアデニル化シグナルのような他の因子を供給する。可能なベクターは、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスを包含するが、これらに限定されない。しかしこのベクター系は、用いられる宿主細胞と適合しなければならない。ウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、またはラムダ誘導体を包含するが、それプラスミド誘導体を包含するが、それに限定されない。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞に導入され得る。一般に、宿主でのタンパク質発現は、宿主細胞で機能する調節領域の制御下にそのタンパク質をコードするDNAを含有するベクターを使用することにより達成される。特に、細菌のミスマッチ修復タンパク質の真核生物相同体の過剰生産を提供する発現系は、例えば、本明細書に参考文献として援用されている米国特許第4,82 0,642号(Edmanら、1989年４月11日)に記載の方法を使用することにより調製され得る。過剰発現が可能な発現ベクターの１形態を調製するために一般的に必要なことは、以下の通りである:(1)細菌のミスマッチ修復タンパク質の真核生物相同体をコードすることが可能なヌクレオチド配列が挿入され得る遺伝子（例えば原核生物遺伝子）の存在;(2)この原核生物遺伝子のプロモーター;および(3)原核生物遺伝子のプロモーターの上流に位置する第２のプロモーター、これは原核生物遺伝子のプロモーターを無効にし、その結果細胞外マトリックスタンパク質を過剰生産する。第２のプロモーターは、任意の適切な方法で得られる。本発明の真核生物ヌクレオチド配列を含有する組換えベクターが導入され得る可能な宿主細胞は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、組織培養中またはインサイチュの非ヒト哺乳動物細胞、および組織培養中だがインサイチュではないヒト細胞を包含する。宿主細胞に導入された本発明の真核生物ヌクレオチド配列は、染色体外配列として存在し得るか、または相同的組換え、ウイルス組込み、または他の手段によって宿主細胞のゲノムに組込まれ得る。ノーザンブロットおよびウェスタンブロットのような標準的な技術を、導入された配列が実際に宿主細胞で発現しているかを決定するために使用し得る。細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同なヒトのヌクレオチド配列またはそれがコードするポリペプチドを発現させる１つの方法では、ポリペプチド（例えば配列番号８）の完全なコード領域を含有するcDNAクローンを、真核生物発現ベクターにクローン化し、そしてサル腎臓由来細胞（例えばCOS-7細胞）にトランスフェクトする。発現は、トランスフェクション後に例えば、ノーザン、サザン、またはウェスタンブロッティングによってモニターする。このような導入配列を持つ宿主細胞は、配列導入が宿主細胞に及ぼした影響を決定するために解析され得る。特に、細胞は、自然突然変異の蓄積の割合（例えば、薬剤耐性の自然突然変異率によって）、変異復帰率、相同的組換えの頻度、分岐配列の間の組換え頻度、または短い繰り返し配列のゲノム安定性の変化についてアッセイされ得る。特に、本発明の導入配列を持つ哺乳動物細胞は、Schall ingらの方法（Schallingら、Nature．Genetics，4:135，1993、本明細書に参考として援用されている）によってジヌクレオチドおよびトリヌクレオチド繰り返しの安定性について、またはUV光、ヌクレオチドアナログ、アルキル化剤などのようなDNA損傷を誘導する薬剤に対する感受性について試験され得る。特定の実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、相同的組換えにより内在性遺伝子を不活化するために使用され得、そしてそれにより、ミスマッチ修復遺伝子欠損細胞、組織、または動物を作出し得る。例えば、限定するつもりはないが、本発明の組換えヒトヌクレオチド配列は、挿入変異（例えばneo遺伝子）を含有するように設計され得、この変異は、挿入された場合、細菌のミスマッチ修復遺伝子の相同体である内在性遺伝子の転写を不活化する。このような構築物は、本発明のヌクレオチド配列に作動可能に連結した適切なプロモーターの制御下で、形質転換、トランスフェクション、形質導入、注入などのような技術により細胞に導入され得る。特に、完全な内在性ミスマッチ修復遺伝子を欠損する幹細胞は、生殖系伝達を経由してミスマッチ修復遺伝子およびそれがコードするポリペプチドを欠損するトランスジェニック動物を生じ得る。本発明の特定の実施形態（実施例２または実施例６参照のこと）では、細胞の内在性ミスマッチ修復遺伝子は、変異ミスマッチ修復遺伝子との相同的組換えにより不活化され得、それにより、その細胞からトランスジェニック動物の発達が成され、この動物は、コードされたミスマッチ修復遺伝子ポリペプチドを発現する能力を欠く。別の実施態様では、転写に対しては「アンチセンスの」核酸配列を生じ、翻訳に対しては必要なミスマッチ修復遺伝子ポリペプチドを生じ得ないような構築物が提供され得る。「トランスジェニック動物」は、細胞に人工的に挿入されたDNAを含有する細胞を有する動物であり、このDNAは、その細胞から発達した動物のゲノムの一部となる。好ましいDNAは、以下のような酵母および／またはヒトのヌクレオチド配列を含有する。この配列は、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同であり、そしてトランスジェニック動物に完全に外来であり得るか、または動物の天然のミスマッチ修復遺伝子に同一であり得る。しかし、このDNAは、天然のコピーとは異なった位置の動物ゲノムに挿入される。トランスジェニック動物は、ガンの発達、潜在的な治療剤の効果、および動物に投与される化学薬剤の発ガン性を研究するために良好なモデル系を提供し得る。単離されたヌクレオチド配列およびポリペプチドの機能的同等物およびユニークフラグメント本発明は、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な単離された真核生物ヌクレオチド配列に関係し、従って、単離された真核生物ヌクレオチド配列、機能的同等物、またはこれらの配列のユニークフラグメントが本発明に従って使用され得る。ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列または「プローブ」もまた包含される。さらに、これらの配列にコードされる単離されたポリペプチドおよびこのポリペプチドのユニークフラグメントもまた、本発明に従って使用され得る。「ユニークフラグメント」という用語は、細菌のミスマッチ修復遺伝子またはそれらのコードするポリペプチドに相同である真核生物ヌクレオチド配列中にのみ見出される、本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチドの任意の部分をいう。例えば、E.coliのmutS遺伝子に相同な真核生物ヌクレオチド配列のユニークフラグメントは、E.coliのmutS遺伝子に相同な真核生物ヌクレオチド配列にのみ見出される。特に、E.coliのmutS遺伝子の２つの酵母相同体（配列番号１および２）およびヒト相同体（配列番号８）の正確なヌクレオチド配列が公知であるため、当業者は他のヌクレオチド配列に見出されない酵母およびヒトの相同体の部分を容易に決定し得る。「ユニークフラグメント」という用語は、特定の細菌ミスマッチ修復遺伝子またはタンパク質の全ての真核生物相同体に見出されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を言及し得るか、あるいはただ１つの真核生物相同体に見出されるが、同じ細菌のミスマッチ修復遺伝子またはタンパク質の他の真核生物相同体には存在しないヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を言及し得る。１つの特定の例では、アミノ酸配列FATHF（配列番号６）は、細菌のmutS/hexAミスマッチ修復遺伝子の酵母およびヒト相同体（配列番号３、４、16）のユニークフラグメントである。アミノ酸配列CMFATHFは、ヒト相同体（配列番号16のアミノ酸797〜803）のみのユニークフラグメントである。「ユニークフラグメント」は実施上、核酸配列および／またはアミノ酸配列を比較し得るコンピュータープログラムの使用により定義され得る。特に、HYPERB LASTプログラム(Altschulら,J.Mol.Biol．215:403〜410,1990、これは本明細書に参考として援用されている）のようなコンピュータープログラムを用いて、DN A配列を全ての可能なリーディングフレームで翻訳し、次に同様なまたは同一の配列を公知のデータベース(例えば、GenBank、PIR、SWIAS-PROT)で検索し得る。 PCRが、本発明の真核生物相同体のユニークフラグメントを生成するために使用され得る。例えば、配列番号20、19、および15のPCR生成プローブは、それぞれE.coliのmutS遺伝子の酵母相同体（配列番号１および２）およびヒト相同体（配列番号８）のユニークフラグメントである。同様に、配列番号10のPCR生成フラグメントは、E.coliのmutS遺伝子のマウス相同体のユニークフラグメントである。また、E.coliのmutS遺伝子のヒト相同体のユニークフラグメントを増幅するために使用し得るプライマーペアーは、配列番号17/18、17/23、25/26、29/30、 31/32、33/34、35/36、37/38、39/40により表される。いくつかの場合（例えば、配列番号17/18）、これらのプライマーセットはまた、E.coliのmutS遺伝子のヒト以外の真核生物相同体のユニークフラグメントを増幅することにおいても有用であり得る。ヌクレオチド配列の好ましいユニークフラグメントは、15〜6000ヌクレオチド (nt.)の間の長さであり、特に好ましいフラグメントは約3000nt長未満である。ヌクレオチド配列のユニークフラグメントは、一本鎖であり得る。ポリペプチドの好ましいユニークフラグメントは、約５〜100アミノ酸の間の長さである。「機能的同等物」という用語は、本発明のヌクレオチド配列に適用される場合、以下の条件のうち１つを満たす配列について述べる：(i)問題のヌクレオチド配列は、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るが、しかし細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である天然に存在する真核生物ヌクレオチド配列と同じ親和性を有する配列にハイブリダイズする必要はない(ii)問題のヌクレオチド配列は、酵母のミスマッチ修復遺伝子に相同な真核生物ヌクレオチド配列と他のヌクレオチド配列とを区別するためにプローブとして供し得る。特に、配列番号８のヒトcDNAクローンが単一のcDNAライブラリーから単離されたことに発明者らは注目する。ヒト集団内の通常の配列変化のために、種々のライブラリーに由来するクローンは、配列番号８のクローンと比較して配列可変性を示すようである。特に、いくつかの例では、コドン縮重（以下参照）の現象がコードされるタンパク質のアミノ酸配列の違いに寄与する。他の場合、タンパク質配列でさえ幾分変化し得る。大部分の例では、変化は無意味であり、そしてヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、機能的同等物である。以下に論じたように、このような同等性は、構造特性および／または機能的特性を比較することにより経験的に決定され得る。ヌクレオチドコード配列の縮重(Albertsら,Molecular Biology of the Cell,G arland Publishing,New York and London,1989,103ページ、本明細書に参考として援用されている）のために、他の核酸配列は本発明の実施において使用され得る。これらは、配列内に同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンで置換することにより改変されて、サイレントな変化を生じた、配列番号１、２、８、および10に記述した配列の全てまたは部分を包含する配列を包含するが、それに限定されない。トリプトファンとメチオニンとを除くほぼ全てのアミノ酸が、いくつかのコドンで表される。しばしばコドンの３番目の塩基は重要でない。なぜなら４つの異なるコドンを有するこれらのアミノ酸は、３番目の塩基でのみ異なるからである。この特徴は、類似のアミノ酸が関連のコドンにより表される傾向とともに、１塩基のランダムな塩基の変化により、アミノ酸置換がない、または類似の性質のアミノ酸を含む置換となる可能性を増加させる。例えば、いくつかの異なるヌクレオチド配列が、配列番号６および７[FATH(F/Y)]のアミノ酸配列をコードすることが可能である（このアミノ酸配列は、E.coliのMutSタンパク質の相同体にユニークおよび普遍的である）。FATHFをコードし得るヌクレオチド配列は、配列5'-TTYGCNACNCAYTTY-3'（配列番号41）と要約し得、FATHYをコードし得るヌクレオチド配列は、配列5'-TTYGCNACNCAYTAY-3'（配列番号42）と要約し得るが、ここでは、ＹはＣまたはT/Uを表し、そしてＮはＡ、Ｃ、Ｇ、またはT/Uを表す。このような縮重したヌクレオチド配列は、特に請求した配列の機能的同等物とみなし得る。本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１、２、８、10など）は、機能的に同等な核酸配列を提供する置換、付加、または欠失のような変異によって変更され得る。特に、与えられたヌクレオチド配列は、インビトロまたはインビボで、コード領域に変化を作るために、および／または新規の制限ヌクレアーゼ部位を形成するために、または既存の制限ヌクレアーゼ部位を破壊するために、その結果さらにインビトロの改変が容易になるように変異され得る。当該分野で公知の任意の変異誘発技術は、インビトロの部位特異的変異誘発(Hutchinsonら,J. 誘発などを包含するが、それに限定されない。このような変異誘発した配列の機能的同等物は、変異させない配列と比較して、構造および／または機能的性質の比較により経験的に決定され得る。本発明のポリペプチド産物、またはユニークフラグメント、またはその機能的同等物は、配列番号３、４、および16に実質的に記述したようなアミノ酸残基の全てまたはユニークな部分を１次アミノ酸配列として含有するものを包含するが、それに限定されない（機能的に同等なアミノ酸残基が、配列内の残基について置換され、機能的にサイレントな変化を生じる改変配列を包含する）。本発明のポリペプチドは、組換えヌクレオチド発現技術、または標準的なペプチド合成法を使用した化学合成技術により調製され得る。本発明により、アミノ酸配列が、配列内に機能的同等物として作用し得る類似の極性の別のアミノ酸により置換され得る１以上のアミノ酸残基を含有する場合、そのアミノ酸配列は、配列番号３、４、および16に記述の配列と比較した「機能的に同等」である。「機能的に同等」という用語はまた、本発明のアミノ酸配列に適用される場合、物理的特性または機能的特性が実質的に同じである種々のアミノ酸配列の間の関係を記述する。アミノ酸の置換、欠失、または挿入はしばしば、ポリペプチドの物理的特性および機能的特性に根本的な変化を生じない。これらの場合、置換、欠失、または挿入を含有するポリペプチドは、置換、欠失、または挿入のないポリペプチドと機能的に同等であると考えられる。配列内のアミノ酸についての機能的に同等な置換は、アミノ酸の属するクラスの他のメンバーから選択され得る。非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを包含する。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを包含する。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを包含する。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。機能的特性または例えば、免疫学的特性の実質的変化は、元のアミノ酸残基と異ならない置換を選択することにより回避され得る。さらに重要なことに、置換はそれらの及ぼす影響について選択し得る：(i)置換領域のペプチド骨格の構造（例えば、シート配座またはらせん配座）を維持する；(ii)標的側の分子の電荷または疎水性を維持する；または(iii)側鎖の大きさを維持する。以下のような置換は一般により大きな変化を誘導すると予想されるので、従って、避けるべきである：(a)グリシンおよび／またはプロリンが別のアミノ酸で置換される、または欠失される、または挿入される；(b)親水性残基（例えは、セリルまたはスレオニル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、またはアラニル）の代わりに（またはそれらの残基で）置換される；(c)システイン残基が任意の他の残基の代わりに（またはそれらの残基で）置換される； (d)正電荷の側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジル）が、負電荷の側鎖を有する残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）の代わりに（またはそれらの残基で）置換される、または(e)大きな側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニン）が、そのような側鎖を有しない残基（例えばグリシン）の代わりに（またはそれらの残基で）置換される。細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な真核生物ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドにおけるほとんどの欠失および挿入、および特に置換は、ポリペプチドの性質に根本的な変化を生じるとは予想されない。にもかかわらず、置換、欠失、または挿入を行う前に置換、欠失、または挿入による影響を正確に予測することが難しい場合、その影響は、本明細書に記載のおよび当該分野で公知のルーチンなスクリーニングアッセイを使用して評価され得ることが、当業者には認識される。例えば、ヒトのミスマッチ修復遺伝子産物の、与えられた抗体への結合のような免疫学的性質の変化は、競合型イムノアッセイのようなイムノアッセイによって測定し得る。２つのポリペプチド配列の機能的同等物は、物理的性質（例えば、参照配列に対する相同性、ユニークアミノ酸配列の存在など）および／またはインビトロまたはインビボで解析される機能的性質を調べることにより評価され得る。例えば、配列番号３、４、または16のタンパク質の機能的同等物は、アミノ酸配列FATH (F/Y)を含有すると予想される。これらの機能的同等物はまた、ヘリックスターンヘリックスのDNA結合モチーフ、Mg²⁺ATP結合ドメイン、および／またはアミノ酸配列TGPNMを含有し得る。これらの機能的同等物はまた、例えばフィルター結合アッセイでミスマッチな塩基対に結合可能である。機能的同等物はまた、本明細書に記載のアッセイにおいて検出されるように、 E.coliで発現させた場合に優性のミスマッチ修復欠損表現型を生じ得るか、またはさもなければ、本明細書に記載または当該分野で公知の他のアッセイにおいてミスマッチ修復タンパク質と同様に挙動し得る。本発明の範囲内にまた包含されるのは、翻訳の間または翻訳後に特異的に修飾される（例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解開裂、抗体分子、膜分子、または他のリガンドへの結合(Fergusonら、Ann.Rev.Bio chem．57:285-320、1988)による)ポリペプチド、またはユニークフラグメント、またはそれらの誘導体である。本発明のポリペプチドフラグメントは、例えば、部分的ポリペプチド配列をコードする本発明のクローン化したヌクレオチド配列を発現させることにより産生され得る。あるいは、本発明のポリペプチドフラグメントは完全なポリペプチドから直接生成され得る。ポリペプチドは、トリプシン、キモトリプシン、またはペプシンを包含するが、これに限定されないタンパク質分解酵素によって特異的に開裂され得る。これらの酵素はそれぞれ、その攻撃するペプチド結合のタイプが特異的である。トリプシンは、カルボニル基が塩基性アミノ酸（通常はアルギニンまたはリジン）に由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。ペプシンおよびキモトリプシンは、芳香族アミノ酸、特にトリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンに由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。開裂したポリペプチドフラグメントの交互のセットは、タンパク質分解酵素を受けやすい部位で開裂を防ぐことにより生成し得る。例えば、弱塩基性溶液中のリジンのε- アミノ基とエチルトリフルオロチオアセテートとの反応により、近接したペプチド結合が最早トリプシンの加水分解を受けないブロックされたアミノ酸残基を得る。Goldbergerら、Biochem.,1:401(1962)。従って、このようなポリペプチドをトリプシンで処理することによりアルギニル残基でのみ開裂する。ポリペプチドはまた、加水分解を触媒するタンパク質分解酵素を受けやすいペプチド結合を作るように改変され得る。例えば、β-ハロエチルアミンでシステイン残基をアルキル化することにより、トリプシンにより加水分解されるペプチド結合を得る。Lindley,Nature,178:647(1956)。さらに、特異的残基でポリペプチド鎖を開裂する化学試薬もまた使用され得る。Withcop,Adv.Protein Chem．16 :221(1961)。例えば、臭化シアンはメチオニン残基でポリペプチドを開裂する。 GrossおよびWitkip,J.Am Chem Soc.,83:1510(1961)。従って、ミスマッチ修復遺伝子ポリペプチドまたはそのフラグメントを様々な組み合わせの修飾剤、タンパク質分解酵素、および／または化学試薬で処理することにより、大きさの異なった数多くの別々の重複ペプチドが生成される。これらのペプチド鎖は、クロマトグラフィー法により、そのような分解物から単離および精製され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、適当な固体状態合成法を使用して合成され得る。StewardおよびYoung、Solid Phase Peptide Synthesis，Freemantle，S an Francisco，CA(1968)。好ましい方法は、Merrifield法である。Merrifield,R ecent Progress in Hormone Res. ,23:451(1967)。これらのペプチドフラグメントの活性は、例えば、本明細書に記載したようにフィルター結合アッセイ、または免疫学的アッセイを使用して簡便に試験され得る。前に定義したように、完全なミスマッチ修復遺伝子もコードする遺伝子からの転写物の代替スプライシングによって生じた、同じ遺伝子由来であるが、しかし１つ以上の構造的特性を欠く核酸配列にコードされる核酸配列またはタンパク質もまた、本発明の範囲内である。本発明のポリペプチドまたはその機能的に活性な部分をコードするDNAまたはR NA配列に相補的な核酸配列もまた提供される。動物、特にトランスジェニック動物では、所望の遺伝子または遺伝子群のRNA転写物が、宿主に表現型に作用を有するポリペプチド産物に翻訳され得る。本発明の１つの特定の局面では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが合成され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、翻訳をブロックするまたはRNAの機能を阻害するアンチセンス試薬のような活性を当然有し得る。従って、ヒトポリペプチドが本発明のヌクレオチド配列を利用して産生される場合、DNA配列は転写においてネガティブセンス（「アンチセンス」）RNAを生じさせる逆方向であり得る。このアンチセンスRNAは、間違った方向であり、翻訳された場合ナンセンス産物を生じるので、所望の産物に翻訳され得ない。ヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ本発明はまた、単離されたヌクレオチド「プローブ」を提供する。このプローブは、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同性のある真核生物標的配列にハイブリダイズし得る。プローブは、標的に選択的に結合し得る公知の品質のリガンドである。本発明によるヌクレオチドプローブは、標的鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸鎖である。特に本発明のプローブのヌクレオチド配列は、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列に見出される配列に相補的である。とりわけ、本発明のプローブは、E.coliのmutS貴伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列のセグメントにハイブリダイズし得ることが意図される。特に、配列番号１、２、８、９、10、および45のいずれか任意のユニークセグメントにハイブリダイズするプローブは、本発明に包含される。このようなプローブは、例えば、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析などに有用である。ハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さおよび組成によって異なり得る。特定のプローブ長および組成に適当な条件は、標準的な参照物質を参考にして容易に決定し得る(Sambrook ら、上記を参照のこと）。好ましいオリゴヌクレオチドプローブは代表的に、PCRプライマーに使用されるよりもいくぶん長い配列を有する。長い配列はプローブに好ましく、コドン縮重を最小にするために役立つ。cDNAライブラリーをスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドプローブを調製するための代表的なプロトコルは、Sambrook,J ら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Press,New York,1989に記載されている。一般に、プローブは例えば³²Pで標識され、そしてcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーのクローンをスクリーニングするために使用される。好ましいヌクレオチドプローブは、少なくとも20〜30ヌクレオチド長であり、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列において標的配列と相補的である少なくとも15〜20ヌクレオチドを含有する。好ましいヌクレオチドプローブは、放射性標識され得るか、またはNew England Biolabs(Beve rly,MA)またはAmersham(Arlington Heights,IL)から得られるような蛍光タグと複合体化され得、そして例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、プラークリフト、コロニーリフトなどのプローブに使用され得る。本発明のヌクレオチドプローブは、例えば、化学合成により作製されたプローブおよびPCRで生成されたプローブを包含する。本発明の好ましいヌクレオチドプローブは、それらがオリゴヌクレオチド、PC R生成フラグメント、または他の核酸配列（例えば、単離されたクローン）であれば、本明細書で概説した一般的プロトコルで、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列を単離するために使用され得る。本発明のヌクレオチドプローブは、ニックトランスレーション、５'末端標識、およびランダムプライミングのような標準的な方法においてもまた使用され得る(Sambrookら、上記)。抗体「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および本発明の真核生物ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドに選択的に反応する、組換え核酸技術によって調製された抗体を包含することを意味する。「選択的に反応する」という用語は、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドの１以上の抗原決定基に反応するが、他のポリペプチドには反応しない抗体を意図する。抗原決定基は、通常アミノ酸または糖側鎖のような化学的に活性な表面の分子配置(grouping)からなり、特異的な３次元構造特性および特異的電荷特性を有する。抗体は、診断応用または研究目的に使用され得る。特に、抗体は細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）ペプチドまたはカルボキシル末端（Ｃ末端）ペプチドに対して生じ得る。一般に、本発明の真核生物ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドに対する抗体を単離するためには、抗原決定基を含有するペプチド配列を免疫原として選択する。このペプチド免疫原は、免疫応答を増強するために担体に結合され得る。ペプチド免疫原は本発明の真核生物ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドの任意の部分と対応し得るが、特定のアミノ酸配列（例えば、本発明のヌクレオチド配列を含有する遺伝子にコードされるポリペプチドのＣ末端アミノ酸を包含するアミノ酸配列）は、他の配列よりも即時性の応答を惹起することが予想される。本発明のヒトヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドに反応する抗体を調製するための他の代用法は、以下の工程を包含する(i)原核細胞（例えば細菌）または真核細胞で発現されたタンパク質で動物を免疫する工程；細胞は、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドの全てまたは一部についてのコード配列を含有する；または(ii) 細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドの全てまたは一部を発現する細胞全体で動物を免疫する工程。例えば、本発明のポリペプチドをコードするcDNAクローンは、宿主から回収され得る全タンパク質の５〜20％が、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同である真核生物ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドであるように、標準的技術( 上記参照；Sambrookら,Molecul1ar Cloning; A Laboratory Manual，Cold Sprin g Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York: 1989参照)を使用して宿主で発現され得る。回収したタンパク質を、PAGEを使用して電気泳動し得、そして適当なタンパク質のバンドをゲルから切り出し得る。次に、所望のタンパク質サンプルを、ゲル薄片から溶出し、そし免疫化のために調製し得る。あるいは、問題のタンパク質を、例えばイオン交換疎水性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来法を使用して精製し得る。タンパク質免疫原が調製されると、マウスは個体あたり約50μgのタンパク質免疫原で腹腔内に２回免疫され得る。このような免疫したマウスの血清は、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な真核ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドを発現する任意の宿主のシステムにおける、免疫組織学あるいは免疫細胞学により、および、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な真核ヌクレオチド配列によりコードされた発現したポリペプチドを用いたELISAにより、抗体活性について試験され得る。免疫組織学について、本発明の活性抗体は、ビオチン結合抗マウス免疫グロブリンに続いてアビジンペルオキシダーゼおよび色素産生ペルオキシダーゼ基質を用いて同定され得る。このような試薬の調製物は商業的に入手可能である；例えばZymad Corp.(カルフォルニア州サンフランシスコ)。本発明の検出可能な活性抗体を含有する血清を有するマウスは３日後に屠殺され、その脾臓は融合物およびハイブリドーマ産生のために取り出され得る。このようなハイブリドーマのポジティブな上清は、前述の方法を用いておよび例えばウエスタンブロット分析により同定され得る。発明により提供される抗体産生の可能性をさらに改善するために、本発明の真核ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、免疫原性の増大に関連し得るアミノ酸配列部分を同定するために分析され得る。例えば、可能性のある免疫原性表面エピトープを同定するために、ポリペプチド配列をコンピューター分析にかけ得る。このようなコンピューター分析は、抗原性インデックス、親水性、両染性ヘリックスあるいは両染性シートのような構造的特徴などのプロットの生成を包含し得る。本発明の真核ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体の調製のために、連続的継代細胞株による抗体分子産生のために提供される任意の技術を使用し得る。例えば、KohlerおよびMilsteinにより最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら,Immunology Today,4:72)、およびヒトモノクローナル抗体産生のためのEBVハイブリドーマ技術などは本発明の範囲内である。一般には、Larrickらの米国特許第5,001,065号およびそこで引用された文献を参照されたい。さらに、一本鎖抗体(SCA)法がまた、本発明の真核ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対する抗体を産生するために利用可能である(Ladne rら，米国特許第4,704,694号および第4,976,778号)。モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト-マウス(または他種)モノクローナル抗体であり得る。本発明は抗体分子ならびにそのような抗体分子のフラグメントを提供する。当業者は、多様な可能性のある部分が、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な真核ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対する抗体、または本発明の他の分子にカップリングされ得ることを認識する。例えば、「Conjugate Vaccines」,Contributions to Microbiology and Immunology,J.M.CruseおよびR .E.Lewis,Jr(編),Carger Press,New York,(1989)(全ての内容を本明細書中で参考として援用する)を参照されたい。カップリングは、抗体および他の部分がそれぞれ活性を保持する限り、２つの分子を結合するどのような化学反応によっても達成され得る。この結合は多くの化学的メカニズム、例えば、共有結合、親和性結合、インタカレーション、配位結合、複合体化を含有し得る。しかし、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、実在側鎖の直接縮合、または外部の架橋分子の取り込みのいずれかにより達成され得る。多くの二価または多価の結合剤は、本発明の抗体のようなタンパク質分子を他の分子にカップリングするのに有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンのような有機化合物を包含し得る。このリストは当該分野で公知の様々なクラスのカップリング剤を余すことなく記載するようには意図されておらず、むしろより一般的なカップリング剤の例である(KillenおよびLindstrom 1984，「Spe cific killing of lymphocytes that cause experimental Autoimmune Myesthen ia Gravis by toxin-acetylcholine receptor conjugates.」Jour.Immun.133:13 35-2549;Jansen,F.K.,H.E.Blythman,D.Carriere,P.Casella,O.Gros,P.Gros,J.C. Laurent,F.Paolucci,B.Pau,P.Poncelet,G.Richer,H.Vidal,およびG.A.Voisin.19 82「Immunotoxins:Hybrid molecules combining high specificity and potent cytotoxicity」.Immunological Reviews 62:185-216;およびVitettaら,前出を参照されたい)。好ましいリンカーは文献に記載されている。例えば、MBS(M-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)の使用を記載しているRamakrishnan ,Sら、Cance rRes.44:201-208(1984)を参照されたい。また、オリゴペプチドリンカーにより抗体にカップリングされるハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載したUmemotoらの米国特許第5,030,719号を参照されたい。特に好ましいリンカーは以下のものを包含する：(i)EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミドヒドロクロリド；(ii)SMPT(4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)-トルエン(Pierce Chem.Co.,Cat.#2 1558G);(iii)SPDP(スクシンイミジル-6[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド ]ヘキサノエート(Pierce Chem.Co.,Cat#21651G)；(iv)スルホ-LC-SPDP(スルホスクシンイミジル6[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピアンアミド]ヘキサノエート(Pie rce Chem.Co.,Cat#2165-G);および(V)EDCに結合されたスルホ-NHS(N-ヒドロキシスルホ-スクシンイミド:Pierce Chem.Co.,Cat.#24510)。上記のリンカーは異なる属性を有する成分を含有し、このようにして異なる生理化学的特性を有する複合体を生じるようになる。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ-NHSエステルは芳香族カルボキシレートのスルホ-NHSエステルよりも安定である。リンカーを含有するNHS-エステルはスルホ-NHSエステルよりも溶解性でない。さらに、リンカーSMPTは立体障害のあるジスルフィド結合を含有し、そして安定性の増加した複合体を形成し得る。ジスフィルド結合はインビトロで開裂されるため、一般には他の結合よりも安定でなく、結果として複合体への利用に適していない。特にスルホ-NHSは、カルボジイミドカップリングの安定性を増大し得る。カルボジイミドカップリング(EDCなど)はスルホ-NHSとの結合に使用されるとき、カルボジイミドカップリング反応のみよりも加水分解に耐性であるるエステルを形成する。本発明の抗体は従来のどのようなタイプのイムノアッセイによっても検出され得る。例えば、本発明により提供される細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な真核ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを固相に付着するサンドイッチアッセイが行われ得る。このような本発明のポリペプチドに対する抗体を含有するまたは含有すると思われる腎臓あるいは腸液のような液体サンプルがこの固相とともにインキュベートされる。インキュベーションは、サンプル中の抗体を固相上に固定化しポリペプチドに結合させるのに十分な時間続けられる。この最初のインキュベーション後、固相をサンプルから分離する。固相を洗浄して、非結合物質およびサンプル中にまた存在し得る非特異的タンパク質のような妨害物質を除去する。本発明の固定されたポリペプチドに結合する目的の抗体を含有する固相は、続いて標識抗体あるいはビオチンまたはアビジンのようなカップリング剤とインキュベートされる。抗体の標識は当該分野で周知であり、放射性核種、酵素(例えば、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ)、蛍光分子(フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコシアニン、フルオレサミン)、ビオチンなどを含有する。標識抗体は固相とともにインキュベートされ、そして固相に結合した標識が測定され、標識の量はサンプル中に存在する抗尿素輸送抗体の量の測定として用いて検出される。これらのまたは他のイムノアッセイは当業者により容易に行われ得る。定義遺伝子--本明細書で使用されている「遺伝子」という用語は完全なコーディング配列を含有するヌクレオチド配列をいう。一般に、「遺伝子」はまた、コードされたポリペプチドの発現に影響を与える、上流(例えば、プロモーター配列、エンハンサーなど)または下流(転写終結シグナル、ポリアデニル化領域など)のコーディング配列にみられるヌクレオチド配列を含有する。野生型--「野生型」という用語が、本発明の核酸およびタンパク質に適用されるときには、天然に生じる正常型の核酸およびタンパク質と区別できないように機能する核酸またはタンパク質の型を意味する(すなわち野生型活性を有する核酸またはタンパク質)。例えば、ミスマッチ修復遺伝子の「野生型」対立遺伝子は、ミスマッチ修復を検出できるほど変化させることなく、宿主細胞中で同じ遺伝子の正常な内因性コピーと機能的に入れ換え得る。同じ核酸またはタンパク質の異なる野生型は互いに構造的に異なり得るかまたは異なり得ない。非野生型--「非野生型」という用語が、本発明の核酸およびタンパク質に適用されるときには、天然に生じる正常型の核酸またはタンパク質と区別できるように機能する核酸またはタンパク質の型を意味する。本発明の核酸の非野生型対立遺伝子は、同じ核酸の野生型遺伝子と構造的に異なり得、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列の差異および/またはコードされるヌクレオチドの転写物あるいはポリペプチド産物の発現レベルの差異を任意の様々な形で含有するが、これらに限定されない。例えば、本発明の核酸の非野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、および/または再配置により野生型の配列と異なり得る。同様に、非野生型ミスマッチ修復タンパク質のアミノ酸配列は、例えは、アミノ酸の付加、欠失、置換および/または再配置により野生型ミスマッチ修復タンパク質の配列と異なり得る。特に、正常宿主細胞に導入されたとき、内因性ミスマッチ修復経路を妨害する非野生型核酸あるいはタンパク質は「優勢ネガティブ」核酸またはタンパク質という用語で表される。相同/相同体--本明細書中で使用される「相同」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルで高度に関連している核酸またはポリペプチドをいう当該分野で公知の用語である。互いに相同な核酸またはポリペプチドは「相同体」という用語で表される。「相同」という用語は必然的に２つの配列間の比較をいう。本発明によると、２つのヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも１続きの少なくとも20アミノ酸に対して少なくとも約50〜60%が同一、好ましくは約70%が同一であるとき相同であると考えられる。好ましくは、相同なヌクレオチド配列はまた、１続きの少なくとも4〜5個の独特に特定されたアミノ酸をコードする能力により特徴づけられる。これらの互いに関連するアミノ酸の同一性およびおおよその間隔の両方は、相同であると考えられるヌクレオチド配列について考慮されなければならない。60より小さいヌクレオチド長について、１続きの少なくとも4〜5個の独特に特定されたアミノ酸をコードする能力により相同性が決定される。上流/下流--「上流」および「下流」という用語は、ヌクレオチド配列のエレメントの位置をいう当該分野で公知の用語である。「上流」は対照エレメントよりも５’側のエレメントを表す。「下流」は対照エレメントよりも３’側のエレメントをいう。イントロン、エキソン/イントロン--「エキソン」および「イントロン」という用語はゲノム遺伝子配列の様々な部分をいう当該分野で公知の用語である。「エキソン」はタンパク質をコードするゲノム遺伝子配列の部分である。「イントロン」はゲノム遺伝子配列のエキソン間に見い出される配列である。散発性--本明細書中で使用され、ならびに腫瘍または癌に適用される「散発性」という用語は、遺伝的または家族性の癌の素因が知られていない個体に発生する腫瘍または癌をいう。「散発性」としての腫瘍または癌の分類は当然入手できる情報に基づいており、そしてその情況から解釈されるべきである。例えば、低表現率変異(すなわち、統計的に劇的な表現型を有しそうにない変異)を遺伝した個体は、癌の家族歴がないが、その変異の結果、癌を発生する可能性がある(すなわち、遺伝的な癌の素因を有していた)。その個体が遺伝的な癌の素因を有すると知られていなかったので、その個体の腫瘍は本来は散発性と定義され得る。従って、「散発性」という用語は、受け継いだ遺伝的動機付けとは独立して発生したようであるこれらの腫瘍または癌を便利に記載するために使用される。しかし、遺伝的および散発性の腫瘍または癌の分子の違いを定義することを示すことを意図していない。影響された--本明細書中で使用される「影響された」という用語は、特徴的な癌(例えば、HNPCC系列の結腸癌)を発生している、および/または、例えは遺伝的研究に基づいて癌の罹病性を与える遺伝的変異を有していると予測されているいずれかの血縁のメンバーをいう。本発明はさらに以下の限定されない実施例において記載される。実施例１：E.coli mutSミスマッチ修復遺伝子の酵母菌相同体の単離および特徴付け材料および方法酵素および化学物質：制限酵素をNew England Biolabs(Beverly,Massachusetts) から得た。T4 DNAリガーゼをTaitら(1980)と類似の方法で調製した。DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントおよびランダムプライムDNA標識キットをBoehri nger Mannheim(Indianapolis,Indiana)から得た。TaqDNAポリメラーゼをPerkin Elmer-Cetus(Norwalk,Connecticut)から購入した。シークエナーゼDNA配列決定キットをU.S.Biochemical Corp.(Cleveland,Ohio)から得た。ランダムプライム標識に使用する[a-³²P]dATPおよびDNA配列決定に使用される[a-³⁵S]dATPをAmers ham(Arlington Heights,Illinois)から得た。オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドをホスホルアミダイトの化学を用いて、Applied Biosystems 380A DNA合成機で合成し、そして標準的な方法を用いて脱保護した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)用の縮重オリゴヌクレオチドを、さらに製造業者の指示に従い、15%変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により精製し、続いてWaters(Milford,Massachusetts)Sep/Pakカラムで精製した。菌株および培地:本研究でゲノムDNAの単離に使用されるS.cerevisiae NKY858 株(MATaura3 lys2 leu2::hisG ho::LYS2 his4x)はSKlに由来し、Nancy Kleckner (Harvard University,Cambridge,Massachusetts)より供与された。この菌株の構築および増殖の方法は他で記載されている(Tishkoff,JohnsonおよびKolodner,19 91;Cao,AlaniおよびKleckner 1990)。E.coli HB101株(BoyerおよびRoulland-Dus soix,1969)はYCP50ライブラリーのための宿主であった(Roseら1987)。E.coli RK 1400株(Symington,FogartyおよびKolodner,1983)は他の全てのプラスミドの宿主として用いた。E.coli JM101は組換えM13ファージ(Messing,1983)の宿主であった。全てのE.coli株を適当な抗生物質を含むＬブロス(LB)中で増殖した。M13感染に用いる菌株を2×YTで増殖した(Messing,同上1983)。M13ファージ、YCP50ライブラリーおよび全てのプラスミドは発明者らの研究室のコレクション由来であった。プラスミド：プラスミドを標準的な手順を用いて構築した(Sambrook,Fritsch およびManiatis,1989)。小規模プラスミド調製をHolmesおよびQuigley(1981)の煮沸法を用いて行った。大規模プラスミド調製を、Triton溶解法による修飾後、 CsCl-エチジウムブロミド濃度勾配での遠心分離による１型プラスミドDNAの精製により調製した(Sambrook,FritschおよびManiatis,1989)。二本鎖DNA配列決定用のDNAを２サイクルのCsCl-EtBr濃度勾配遠心分離を用いて精製した。配列決定用の一本鎖M13 DNAの調製は、本質的にポリエチレングリコール沈殿法(Messing,19 83)によった。用いたE.coliの形質転換手順は標準的なMg-Ca形質転換手順(Wensi nkら,1974)に基づいた。 MSH1(配列番号２)およびMSH2(配列番号１)遺伝子のPCR増幅産物を、M13mp19の BamHl部位に挿入し、それぞれM13mp19-39およびM13mp19-45を生成した。これらの挿入物は便宜上ms351-Iおよびms351-IIという。pIA5(MSH1を含有する)は、YCP 50のBamHI部位に挿入されたS.cerevisiaeの染色体VIII由来のSau3A部分消化フラグメントを含有する。これらの２つのプラスミドおよび完全ではないが特徴付けされ重複するクローンを、ROSEら(1987)により構築されたライブラリーから回収した。 PCR技術：タンパク質配列比較に基づき、以下のタンパク質配列の３つの領域を選択し、示した縮重オリゴヌクレオチドを設計するのに使用した：(1)F(A/V)T HY,5'-CTGGATCC(G/A)TG(G/A/T/C)GT(G/A/T/C)(G/A)C(G/A)AA-3'[配列番号11];および(2)TGPNM,5'-CTGGATCCAC(G/A/T/C)GG(G/A/T/C)CC(G/A/T/C)AA(T/C)ATG-3'[ 配列番号12]。各オリゴヌクレオチドの5'末端の配列CTGGATCCは、増幅産物のクローニングを促進するために加えたBamHI制限酵素切断部位である。PCRを、10mM Tris、pH8.3 、3mM MgCl₂、50mM KCl、0.01%ゼラチン、1.0ユニットのTaqDNAポリメラーゼ、2 5pmolの各縮重プライマー、および1μgの酵母染色体DNAを含有する50μlの溶液中で行った。これらの縮重オリゴヌクレオチドを使用した増幅のサイクルは以下のとおりであった：(1)変性 1分、94°；(2)アニーリング 2分、55°；(3)重合2 0秒、72°。反応を30サイクル継続した。クローニング用のPCR増幅産物をBamHI で消化し、そして10mM EDTA pH8.0中で流したSephadex G-50カラムを通過させ、リンカーおよびプライマーを除去した。コロニーハイブリダイゼーション：コロニーをLBプレート上で一晩増殖し、Ge nescreen(Du Pont)上に置き、そして２分間120°でオートクレーブした。フィルターを40mM NaHPO₄緩衝液pH7.2中、65°で全ての細胞砕片が除去されるまで洗浄した。ハイブリダイゼーションを当業者に周知の緊縮条件下で行った。例えば、ハイブリダイゼーション反応には以下を含有した：0.5 M NaHPO₄緩衝液(pH7.2), 0.5%w/vウシ血清アルブミン、１mM EDTA、５%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、およびFeinbergおよびVogelstein(1983)のランダムプライミング法による適当な35 1-bp PCR産物挿入物を含有するM13mp19から作成された0.5μg(10⁸cpm/μg)の³²P 標識プローブ。ハイブリダイゼーションを、60°で一晩継続し、その後40mM NaH PO₄緩衝液(pH7.2)、１mM EDTA、および１% SDSを用いる65°での30分洗浄を４回行った。フィルターをハイブリダイズしているコロニーを検出するためにX線フィルムに曝露した。サザンハイブリダイゼーション分析：DNAを、25mM NaHPO₄緩衝液(pH6.5)中でアガロースゲルからGenescreenメンブラン(Du Point)に移し、メンブランにUV架橋させた(ChurchおよびGilbert,1984)。ハイブリダイゼーションを、２×SSCおよび１% SDSを含む溶液で65°で30分間一定に撹拌しながら洗浄すること以外は、上記のように行った。次いで、ハイブリダイズしているDNAバンドをオートラジオグラフィーにより検出した。 DNA配列決定：一本鎖M13および二本鎖プラスミドDNAを、シークエナーゼおよび製造業者により提供されたプロトコルを用いたジデオキシ終止法により配列決定した。二本鎖配列決定テンプレートを以下のように調製した：共有結合により閉じたテンプレートDNAを0.2M NaOH、0.2mM EDTA中で37°で30分間変性させた。その混合物を0.1容量の３M酢酸ナトリウム(pH4.5)で中和し、DNAを４容量のエタノールで沈殿させ、５mM Tris(pH7.5)、0.5mM EDTA中で再懸濁した。製造業者により提供されたMn²⁺配列決定緩衝液を用いてプライマーに近接するDNA配列を決定した。本明細書で報告されているDNA配列は、配列番号１[MSH2]については受託番号M84169、配列番号２[MSH1]については受託番号M84170でGenebankに提出されている。配列分析：ホモロジー検索および並び合わせをSun Microsystems Sparkstatio n 1上で行ったEugeneプログラム(Lark Sequencing Technologies,Ltd.,Houston, Texas)を用いて行った。様々なmutS相同体の配列の並び合わせを、配列をホモロジーのさらに小さなブロックに再分割することにより行った。これらのより小さなドメインを、ペプチド配列間のホモロジードメインを定義するLawrenceホモロジー検索(LawrenceおよびGoldman,1988)に基づき選択した。3.0の偶然(chance) からの最小の許容可能な標準偏差を用いた10残基の最小のホモロジードメインを報告している、Lawrenceホモロジー検索のDayhoffコストマトリックス(cost mat rix)を使用した。配列の領域をホモロジードメインにより固定すると、SS2アルゴリズムを用いて全体的に最適の並び合わせを算定するために、Altschulプログラム(AltschulおよびErickson,1986)を使用した。Dayhoffoyおよび遺伝子距離コストマトリックスの両方をAltschulプログラム(AltschulおよびErickson,同上) とともに使用した。ギャップの開きのペナルティー(penalty)は1.5あるいは2.0 のいずれかであり、ギャップにおけるそれぞれの零(null)に対する増大したペナルティーは1.0であった。配列番号１のアミノ末端21アミノ酸を詳細に分析してミトコンドリア標的配列に関する特徴を同定した。両染性のヘリックスを形成する能力を有する配列の存在をVon Heijne(1986)の分析を用いて決定した。疎水性モーメント、最大疎水性および表面探索(seeking)能力％surfおよびsurf(E)の算定を、Eisenberg,Weiss およびTerwilliger(1984)およびEisenbergら(1984)の方法を用いて行った。正常化コンセンサススケール(Eisenberg,WeissおよびTerwilliger前出)を以下のように疎水性の計算に使用した：R=-2.53,K=-1.50,D=-0.90,Q=-0.85,n=-0.78,E=-0.7 4,H=-0.40,S=-0.78,T=-0.05,P=0.12,Y=0.26,C=0.29,G=0.48,A=0.62,M=0.64,W=0. 81,L=1.06,V=1.08,F=1.19,I=1.38。参考文献：Altshul,S.F.およびB.W.Erickson ,Bull.Math.Biol.48:603-616.1986.;Boyer,H.W.およびD.Roulland-Dussoix,coli .J.Mol.Biol.41:459-472.1969.;Cao,L.,Alani,E.およびN.Kleckner,Cell 61:108 9-1101.1990.;Church,G.M.,およびW.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1991- 1995.1984.;Eisenberg,D.,R.M.WeissおよびT.C.Terwilliger,Proc.Natl.Acad.Sc i.USA 81:140-144.1984;Eisenberg,D.,E.Schwarz,M.KomaromyおよびR.Wall,J.Mo l.Biol.179:125-142.1984.;Feinberg,A.P.,およびB.Vogelstein,Anal.Biochem.1 32:6-13.1983.;Holmes,D.S.,およびM.Quigley,Anal.Biochem.114:193-197.1981. ;Lawrence,C.B.およびD.A.Goldman,Comput.Appl.Biosci.4:25-31.1988.;Messing ,J.,Methods Enzymol.101:10-77.1983.;Rose,M.D.,P.Novick,J.H.Thomas,D.Bots teinおよびG.R.Fink,Gene 60:237-243.1987.;Sambrook,J.,E.F.FritschおよびT. Manitatis,Cold Spring Harbor,N.Y.1989.;Symington,L.S.,L.M.FogartyおよびR .Kolodner,Cell 35:805-813,1983.;Tait,R.C.,R.L.RodriguesおよびR.W.West,J. Biol.Chem.255:813-816.1980.;Tishkoff,D.,A.W.JohnsonおよびR.Kolodner,Mol. Cell.Biol.11:2593-2608.1991.;Von Heijne,G.,5:1335-1342.1986.;Wensink,P.C .,D.J.Finnegan,J.E.DonelsonおよびD.S.Hogness,Cell 3:315-325.1974. 実施例２：E.coli mutSミスマッチ修復遺伝子の酵母相同体の機能酵素および化学物質：化学物質、酵素およびオリゴヌクレオチドは実施例１に記載されている通りである。菌株および培地：本研究で使用されているS.cerevisiae株はSKIに由来し、そしてNancy Kleckner(Harvard University,Cambridge,Massachusetts)より譲渡された。これらの菌株の作製および操作の方法は他に記載されている(Tishkoff,Jo hnsonおよびKolodner 1991;Cao,AlaniおよびKleckner 1990)。２株の組み合わせ NK859:MATa ho::LYS2 lys2 ura3 leu2::hisG his4xおよびNK860:MATa ho::LYS2 lys2 ura3 leu2::hisG his4bまたはNK858:MATa ho::LYS2 lys2 ura3 leu2::hisG his4xおよびNK861:MATa ho::LYS2 lys2 ura3 leu2::G his4bを、すべてのMHS遺伝子破壊に使用する２倍体を作製するために交雑した。特定のHIS4対立遺伝子と組み合わせてMHS遺伝子挿入変異を有する半数体菌株を、破壊異型接合体から必要に応じて生成し、そして挿入変異の表現型の特徴付けまたは２倍体同型接合体の作製に使用した。この工程は、破壊変異がミューテーターであり得ると仮定し、用心のために行った。これらの研究で使用するhis4bおよびhis4x対立遺伝子は４塩基挿入変異体である(Cao,AlaniおよびKleckner 1990)。野生型HIS4対立遺伝子を、ヒスチジンの欠如した培地での選択により上記の菌株から生成した。本研究に記載される全ての菌株は、形質転換によりこれらの出発菌株に由来しており、それ故同質遺伝子型である。カナバニンプレートはアルギニンを欠き、30μg/ mlカナバニンを含有した。ここで使用する非発酵性炭素源プレートは、Sherman, FinkおよびHicks(1986)により記載されたように調製したYPアセテート(YPAc)およびYPグリセロール(YPgly)であった。他の酵母およびE.coli培地は上記実施例１に記載されたとおりであった。E.coli株RK1400(Symington,FogertyおよびKolo dner(1983))を全てのプラスミド構築に使用した。トランスポゾン変異誘発に使用される菌株を以下に記載する。プラスミド：プラスミドは上記実施例１で説明した材料および標準的な手順を用いて構築した。プラスミドpNk1206はNancy Kleckner(HuisumanおよびKleckner 1987)より得た。Tn10LLK構築物は以下のように作製した。Yep13 DNA(Broach,Str anthernおよびHicks 1979)をBglIIで消化し、そしてLEU2遺伝子を有する2.6-kb フラグメントを単離した。そしてこのフラグメントをpNK1206のTn10LKのlacZとK an^R配列との間に位置するBamHI部位に挿入し、pTN10LLK(Lac Leu Kan)を生成した。BamHl部位中のBglIIフラグメントの方向は決定していない。酵母を形質転換してTn10LUK挿入のURA3マーカーをLEU2マーカーを含むTN10LLKとの組換えにより置換するために、pTn 10LLKをBclIおよびNruIで消化して、DNAをLiCl形質転換に直接使用した(ITOら.1983)。BclおよびNruIは、pTN10LKKをlacZ中およびkan^R配列中のそれぞれの部位で切断する。トランスポゾン変異誘発：プラスミドpI-A5およびpII-2(ReenanおよびKolodne r 1992)をNK5830/pNK629(HuismanおよびKleckner 1987)に形質転換してアンピシリン(pI-A5およびpII-2)およびテトラサイクリン(pNK629)耐性を選択し、そして HuismanおよびKleckner(1987)に類似の方法に従い、λ1224ファージの感染によりTn10LUKで変異誘発した。変異誘発したプラスミドDNAの生じたプールを、NK80 17(HuissmanおよびKleckner 1987)を形質転換するために使用し、プラスミドDNA を独立した形質転換体から単離した(HolmesおよびQuigley 1981)。個々の変異体プラスミドDNAを、それぞれのプールから単離して挿入の独立性を確認した。次いで所望のフラグメントへの挿入は制限マッピングにより同定した。そして、これらの挿入変異をワンステップ置換法(one step transplacement method)(Roths tein 1991)を用いて酵母ゲノム中のそれらの相同性の位置に導入した。 MSH2/MSH2生存性実験の増殖プロトコル：最少栄養増殖制限２つの野生型またはmsh2::TN10LUK半数体を接合させ、そしてシングルコロニー(≧３mm)を富栄養培地(YPD)上で単離した。これらの２倍体コロニーを前胞子形成培地(YPAc)5mlに低細胞密度で接種するために用い、そして増殖を飽和に達するまで続けた。次にその培養物を胞子形成培地で洗浄し、そして胞子形成培地中で24時間インキュベートした。ゼロ増殖制限：半数体株を凍結ストックから直接富栄養培地(YPD)に入れ、一晩増殖させた。反対の接合型の半数体を液体YPDに懸濁し、混合してYPDプレートにプレーティングし直した。接合を４時間富栄養培地上で継続させ、そして接合混合物を直接胞子形成培地に移して栄養増殖をさせなかった。胞子形成を24時間継続させた。突然変異および組換え率の測定：突然変異率は揺動試験により測定し、２つまたは３つの実験を、検査したそれぞれの菌株について行った(LeaおよびCoulsen1 949)。試験する菌株をYPDプレート上で30℃でシングルコロニーになるようにプレーティングした。11のシングルコロニー(＞３mm)をプレートから削り取り、減菌水中で再懸濁した。次に適切な希釈物をプレーティングし、培養物当たりの生存細胞数およびカナバニン耐性細胞数を測定した。これらのデータをLeaおよびC oulsen(1949)の方法で分析した。この方法を用いると、r_o＝Ｍ(1.24+1ｎＭ)、ここでr_oは11のプレーティング物間の培養物当たりのカナバニン耐性細胞コロニー形成単位の中央値であり、Ｍは培養物当たりのカナバニン耐性突然変異の平均値である。Ｍは内挿法により解き、次いで突然変異率または組換え率を計算するために使用した。r＝Ｍ/Ｎ、ここでＮはプレーティング物当たりの生存細胞数の最終平均値である。減数組換えを、細胞の独立した培養物の胞子形成前および後に存在するHis⁺細胞の頻度を決定することで測定した。菌株をYPD中で0.5のOD₆₀₀まで増殖させ、次いで前胞子形成培地(YPAc)で２回洗浄した。これらの細胞をYPAc中に低密度(0 .0025のOD₆₀₀)で再懸濁し、1.0のOD₆₀₀に達するまで増殖させた。次に、細胞を胞子形成培地で２回洗浄し、胞子形成培地中に再懸濁した。これらの細胞はゼロ時点にあり、超音波で破壊してヒスチジンの欠如したプレートおよび最少完全プレートにプレーティングして、組換えの頻度を測定した。残りの細胞を20時間胞子形成させ、上記のように分析した。減数分裂誘導前および後のHis⁺細胞の頻度が与えられる。配列番号２[MSH1]の破壊：msh1::Tn10LUK4-2挿入のための２倍体異型接合体の胞子形成は、四分子が富栄養培地(YPD)上に分離されたときに小さいスカラップ( scalloped)型のコロニーの表現型の2:2の分離を示した。この表現型はプチット表現型に関連していることが見出された。なぜなら、すべてのこのようなコロニーは、非発酵性炭素源であるグリセロール(YPgly)、またはアセテート(YPAc)を含有するプレートにレプリカプレーティングしたときには増殖し得なかったからである。msh1::Tn10LUK4-2変異に関連するプチット表現型は劣性であった。最初の破壊異型接合体はプチットでなく、そして続くプチット半数体msh1::Tn10LUK4 -2変異体の野生型への接合は、YPglyプレート上で増殖し得、そしてストリークされてYPglyプレート上でシングルコロニーを生じ得る半数体を生成した。野生型株との交雑におけるmsh1プチットの非選択的条件下での挙動は以下で論じる。ミトコンドリアDNAを、異型接合体の胞子形成から直接的に得た５つの半数体m sn1プチット胞子コロニーから調製した。プチットmtDNAおよび野生型mtDNAコントロールをHindIIIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分析した。２つのmsh1 プチットmtDNAは野生型と同じ制限パターンを示した。これら２つの場合、プチット表現型は、点突然変異、またはおそらくこの分析では検出し得なかった小さな欠失またはmtDNA内での再配列により得る。他の３つのプチットは、いくつかの野生型フラグメントが消失し、追加の新規フラグメントが存在する制限パターンを示した。観察した３つの全ての再配列mtDNA制限パターンは同様であった。１つの場合において、再配列mtDNAを含有するプチット変異体および再配列していないmtDNAを含有する別のプチット変異体が、同じ四分子から得られた。これらの大規模なmtDNA再配列を含有する得られた胞子クローンの割合は超抑制型(hy persuppressive)プチットの胞子クローンの割合と類似していた。これは超抑制型プチットはしばしばmtDNAの大規模再配列を含有するという観察と一致する(Du jon 1981)。 msh1変異体中のmtDNAの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色：野生型およびmsh1::Tn10LUK3-3半数体株を富栄養培地(YPD)上で増殖させ、DAPI 染色に供して写真撮影した。野生型においては、mtDNAは細胞質中いたるところに散在する小さな斑点として現れた。msh1変異体において、核小体中の蛍光以外の唯一の蛍色が、ときには細胞当たり１つまたは２つ、ときおり核小体の20%の大きさに至るより大きな斑点として現れた。この変化したmtDNAの分布は、DNA代謝欠損の事実上の反映というよりはプチット変異体におけるミトコンドリアの異常形態および分布の結果であり得る。配列番号１[MSH2]の破壊：プラスミドpII-2中の配列番号１の破壊を上記のように単離した。必要な場合、msh2::Tn10LUK破壊を上記のようにTn10LLK破壊に変換した。msh2挿入変異について２倍体異型接合体の胞子形成およびそれに続く分離は、常に４つの等しい大きさの胞子クローンを生成し、msh2変異体は細胞増殖に明白な効果を有さないことを示した。 msh2変異体におけるカナバニン耐性への自然突然変異率：カナバニン耐性への自然突然変異率を、破壊変異体msh2::Tn10LUK7-7の揺動分析により測定し、これは野生型の率より70〜100倍以上に上昇した。この自然突然変異のレベルの増加は、胞子クローンをまくことおよびカナバニンプレートにレプリカプレーティングすることにより容易に視覚化した。ミューテーター表現型およびmsh2変異の両方の分離を分析するこの試験を用いることで、ミューテーター表現型は常にmsh2 破壊変異と共に分離されることを示した。参照文献：Broach,J.R.,J.N.StrathernおよびJ.B.Hicks,Gene 8:121-133.1979 .;Cao,L.,E.AlaniおよびN.Kleckner,Cell 61:1089-1101.1990.;Dujon,B.,Cold S pring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.1981.;Holmes,D.S.,およびM .Quigley,Anal.Biochem.114:193-197.1981.;Huisman,O.およびN.Kleckner,Genet ics 112:409-420.1987.;Ito,H.,Y.Fukuda,K.MurataおよびA.Kimura,J.Bacteriol .153:163-168.1983.;Lea,D.E.,およびC.A.Coulson,J.Genet.49:264-285.1949.;R eenan,R.A.G.およびR.D.Kolodner,Genetics 132:963-973.1992.;Rothstein,R.,M ethods Enzymol.194:281-302.1991.;Sherman,F.,G.R.FinkおよびJ.B.Hicks,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.1986.;Symington,L.S.,L. M.FogartyおよびR.Kolodner,Cell 35;805-813.1983.;Tishkoff,D.,A.W.Johnson およびR.Kolodner,Mol.Cell.Biol.11:2593-2608.1991 実施例３：E.coli mutSミスマッチ修復遺伝子のヒト相同体の単離および特徴付け材料および方法化学物質、酵素、オリゴヌクレオチド、DNA、ライブラリー、およびベクター超純度Tris(酸および塩基)、エチレンジアミ四酢酸(EDTA)、MgCl₂,MgSO₄,NaCl ,および分析用グレードのクエン酸ナトリウム、KCl、リン酸一カリウム(KH₂PO₄) 、リン酸二ナトリウム(Na₂HPO₄)はAmresco(Solon,OH)より得た。超純度グリセロールはMallinckrodt,Inc.(Paris,KY)から得た。デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートおよびATPはPharmacia LKB Biotechnology,Inc.(SWEDEN)より購入した。NIGMSマッピングパネル2DNAはCoriell Cell Respositories(Camden,NJ)から、そして予備実験に用いたこれらのDNAのBamHI消化物のサザントランスファーはOncor(Gaithersburg,MD)からであった。ゼラチンはSigma(St,Louis,MO)から購入した。制限エンドヌクレアーゼおよびT4 DNAリガーゼはNew England Biolabs, Inc.(Beverly,MA)から購入した。仔ウシ腸ホスファターゼはNew England Biolab s,Inc.(Beverly,MA)から購入した。TaqポリメラーゼはPerkin Elmer-Cetus(Norw alk,CT)から購入した。[α^-32P]-dCTPはAmershan(Arlington Heights,IL)から購入した。オリゴヌクレオチドはApplied Biosystems 394 DNA合成機で合成し、標準的な方法で脱保護し、精製した。PCR産物は、BamHI消化したBluescript SK+ベクターDNA(Stratagene,La Jolla,CA)に標準的な方法を用いて挿入した。MHS2_hu cDNAクローン(配列番号８)の単離はUniZapベクターシステム(Stratagene,La Jol la,CA)中で作製されたHela S3 cDNAライブラリーのスクリーニングにより行った。ライブラリーのプレーティングおよびスクリーニングは製造業者の推奨に従って行った。縮重PCRを用いたE.coli mutS遺伝子に相同性のヒトヌクレオチド配列のクローニング公知の細菌mutSおよびhexAおよびS.cerevisiae MSHタンパク質の高度に保存された領域をコードするDNAにハイブリダイズする縮重オリゴヌクレオチドを設計した。以下のアミノ酸領域を選択した：プライマー1a.)FATH(F/Y)(非コーディング鎖)5'-CGCGGATCC(G/A)(A/T)A(G/A)TG(G/A/T/C)GT(G/A/T/C)(GC(G/A)AA-3'(配列番号13);プライマー1b.)FTTH(F/Y)(非コーディング鎖)CGCCGATCC(G/A)(A/T)TG (G/A/T/C)GT(G/A/T/C)GT(G/A/T/C)GT(G/A)AA-3'(配列番号14);プライマー1c.)FV TH(FY)(非コーディング鎖)CGCGGATCC(G/A)(A/T)A(G/A)TG(G/A/T/C)GT(G/A/T/C)A C(A/G)AA-3'(配列番号28,およびプライマー2.)TPGNM(コーディング鎖)5'-CTGGAT CC AC(G/A/T/C)GG(G/A/T/C)CC(G/A/T/C)AA(T/C)ATG-3'(配列番号12)。それぞれのヌクレオチドの5'端のCGCGATCC配列は、Bluescript SK+ベクターへの増幅産物のクローニングを容易にするため付加されたBamHI制限酵素切断部位である。酵母ゲノムDNAからの公知のミスマッチ修復配列のPCR増幅を、プライマー1a、1bまたは1cとペアにしたプライマー２を用いたPCRの条件を至適化するために使用した。PCRは、10mM Tris(pH 8.3)、50mM KCl,0.1%ゼラチン、各200μMのdGTP/dATP /dTTP/dCTP、１単位のTaqDNAポリメラーゼおよびそれぞれ25pmolの縮重プライマーを含有する50μl容量中で行った。複数の濃度のMgSO₄(1mM,3mM,5mM,および10m M)および複数の濃度の酵母ゲノムDNAあるいはヒトcDNA(10ng,100ngおよび1μg) を、それぞれのプライマーペアに対して試験した。cDNAを、mRNA精製キット(Par macia,SWEDEN)を用いてHPB-ALL細胞(MooreおよびFishel,J.Biol.Chem.265:11108 -11117,1990)から調製した。cDNAに対するこれらのの縮重オリゴヌクレオチドを用いた増幅に至適な方法は、35サイクルのa)変性１分、94℃;b)アニーリング２分、45℃;c)ポリメラーゼ反応５分、72℃であることが見い出された。 45mM Tris(pH8.0)、5mM酢酸ナトリウム、2mM EDTA(TAE)中で行った2%アガロースゲルでの産物の電気泳動分析の後、予想した大きさの(∝360bp)産物を含有するとみなされる反応物を緩衝化フェノールで抽出し、エタノール中で沈殿させ、 0.5μg/mLエチジウムブロミド(Sigma,St.Louis,MO)を含有する調製用2%アガロースTAEゲル上で分画した。次に、問題のDNAバンドを、DNAをNA45ペーパーから300 μlの１mM NaCl,50mM アルギニン(遊離塩基)中での70℃、１時間のインキュベーションにより溶出したという改変をして、本質的には製造業者(Schleicher and Schuell,Keene,NH)により記載されるようにNA45ペーパーを用いてゲルから単離した。溶出溶液を取り出して緩衝化フェノール緩衝液で抽出しDNAをエタノールで沈殿させた。この単離したDNAフラグメントをBamHIで消化し上記のようにNA45 ペーパーを用いて2%アガロースTAEゲルから再単離してリンカーを取り除いた。B luescript SK+ベクターをBamHIで消化し、50μl反応中で20単位の仔ウシ腸ホスファターゼで処理し、そして上記のようにNA45ペーパーを用いて1%アガロースゲルから単離した。単離したDNAフラグメント(20ng)およびBluescriptベクター(200ng)を、50mM T ris(pH7.8)、8mM MgCl₂、5mM βメルカプトエタノール、67μM ATPおよび40単位のT4DNAリガーゼを含有するライゲーション反応物(100μl)に添加し、12.5℃で1 6時間インキュベートし、次いで標準的なMg-Ca形質転換の手順(Wensinkら,1974) によりDNAをE.coli XL1-blue(Stratagene,La Jolla,CA)に形質転換した。独立した形質転換体からのプラスミドDNAの小規模調製物(Sambrookら、上述)を適切な大きさの挿入物(∝360 bp)の存在について分析し、それぞれのプライマーペアにより生成された10のそのようなクローンを二本鎖DNA塩基配列決定法により分析した。本発明者らは、1a＋2プライマーペアで生成された10のクローンの中から１つのMHS2相同体を見出し、このプラスミドをpDHA 22と命名した。1b＋２および1c＋プライマーペアで生成された22のクローンの中からはMHS2相同体を見出さなかった。PCRフラグメントを22.1と命名した(配列番号15)。 pDHA22に含有されるMHS2相同体配列をプローブとして用いて、製造業者の推奨に従いヒトcDNAライブラリー(UniZap Hela S3 cDNA,Stratagene,La Jolla,CA)をスクリーニングした。オリゴヌクレオチドプライマー(#15998-5'GTGATAGTACTCAT GGCC; 配列番号23および#15607-5'AGCACCAATCTTTGTTGC;配列番号17、マイナスBa mHI部位)を、pDHA22に存在するMSH2配列の両端で縮重プライマーの内側のヌクレオチドにハイブリダイズするように設計した。278 bpフラグメントをこれらのプライマーを用いてPCRにより増幅し、上記のようにNA45を用いて精製した。放射性標識プローブを、1.5mM MgSO₄、10ngの単離した278bpフラグメント、各 200μMのdATP/dGTP/dTTP、25pmolの各々の２つのプライマー#15998および#15607 、ならびに100μCi α-(³²P)-dCTP(5000ci/mmol)を含有する50μl反応で、a)変性 1分、94℃;b)アニーリング 2分、50℃、c)ポリメラーゼ反応 2分、72℃のサイクルを用いたPCRを25サイクル行い作製した。取り込まれていないヌクレオチドをNick Column(Parmacia,SWEDEN)のクロマトグラフィーで取り除き、プローブを5分間煮沸して変性させ、そして10⁷-10⁸トータルdpmをλUniZap Hela S3 cDNA プレートリフト(百万メンバー)を含有するHybond Ｎ＋フィルター(Amershan,Arl ington Heights,IL)をプローブするため使用した。２回の追加のスクリーニングを実施して均質なλ UniZap Hela S3 cDNAファージ集団を単離し、挿入物を製造業者(Stratagene,La Jolla,CA)により記載されるように、R408ヘルパー線状ファージを使用してレスキューした。MHS2に相同性の2727 bpオープンリーディングフレームを用いる大きな3111 bp cDNA挿入物を含有する１つの陽性クローンを、 DNA配列決定により特徴付けし、pDHAllと命名した。cDNAクローンの配列を配列番号８として表す。このヒトcDNAを含有するプラスミドを、1994年１月26日、ブダペスト条約に従いアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)にATCC番号 75647として寄託した。このクローンの配列をまた、GenBankに寄託し、GenBank Accession No.U03911を有する。このヒトcDNAクローン(配列番号８)は、934アミノ酸をコードし得る完全なオープンリディングフレームを含有している。コードされるアミノ酸配列を配列番号16として表す。配列番号16のポリペプチドは、配列番号３のタンパク質(酵母M sh2タンパク質)と41％の全体での同一性を示す。最も保存された領域(配列番号1 6のアミノ酸657〜788)は、配列番号３の酵母タンパク質の対応する領域(アミノ酸67 6〜807)に対し約81%の同一性である。特に、配列番号16のヒトタンパク質は、アミノ酸668〜672の配列TGPNM(配列番号５)およびアミノ酸780〜784の配列FATHF( 配列番号６)を含む。このように、上記の基準により、同定されたヒトcDNAの配列は、配列番号１および２のE.coli mutS遺伝子および酵母遺伝子に相同である。さらに、配列番号８のヒトヌクレオチド配列はE.coli mufS遺伝子の相同体である。配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号16のタンパク質は、E.coli MutSミスマッチ修復タンパク質のタンパク質相同体である。配列番号16のヒトタンパク質はまた、配列番号３の酵母タンパク質(Msh2)の相同体であり、特に高い程度の相同性を示す。配列番号16のヒトタンパク質はそれ故、「ヒト Msh2」と命名される。同様に、このタンパク質(配列番号８に対応する)をコードするヒト遺伝子はMSH2_huと呼ばれる。 DNA記列分析：二本鎖プラスミドDNAのDNA配列決定は、Applied Biosysytems 3 73 ADNAシーケンサーで、標準的プロトコルおよびターミネーターとしての色素( dye)標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いて行った(Sangerら、P roc．Nat.Acad.Sci.,USA 74:5463-5467,1977,Smithら.Nature 321:674-679,1986 )。NCBI-GenBankリリース78、PIRリリース37およびSWIS-PROTリリース26のデータベースサーチを、BLASTネットワークサービスを使用しNational Center for B iotechnology Informationで行った。配列アラインメントはDNAStar MegAlignを使用し、Clustal法を用いて行った。多重アラインメントパラメーターは、Gap P enalty＝10およびGaplength Penalty＝10であった。対合(pairwise)アラインメントパラメーターはKtuple＝１、Gap Penalty＝３、Window＝５およびDiagnolss aved＝５であった。系統樹はまた、DNA Star MegAlignを使用して作成した。サザンハイブリダイゼーション：NIGMSマッピングパネル−２DNAをEcoRIで消化し、10μgの得られたゲノムFNAフラグメントを、TAE緩衝液中で１％アガロースゲルランを通じての電気泳動により分離した。Hybond N+ペーパー上へのサザントランスファーをSambrookら、（上記）に従い実施した。完全長のMSH2_huフラグメントを増幅するプライマーを用いたこと以外は、上記のPCR法を用いてプローブを調製した。本発明者らは、このプローブが最も大きいエキソンを含有するEc oRIフラグメントを同定するが、MSH2エキソンを含有する全てのゲノムEcoRIフラグメントを同定するわけではないことを見出した。これはおそらく、挿入物の中心部分由来のいくつかのMSH2配列がプローブ中に存在しているためである。 PCR マッピング： PCRを使用して、プライマー#16388-5'GTTTTTCCTTTCATCCGTTG （配列番号21）および#16389-5'AAACTAGCCAGGTATGG（配列番号22）を用いてDNA のNIGMSマッピングパネル中のMSH2配列を検出した。これらのプライマーは、cDN A配列のヌクレオチド位置2020位に位置するイントロンに含まれるMSH2の推定158 bpフラグメントを増幅する。25μlのPCR反応物は、10mM Tris緩衝液pH8.5、50mM KCl、３mM MgCl₂、0.01％ゼラチン、それぞれ50μMのdGTP/dATP/dTTP/dCTP、1. 5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ、それぞれ５pmoleのプライマーおよびそれぞれ0.5μgのDNAサンプルを含んでいた。PCRMを、a）変性30秒、94℃；b）アニーリング30秒、55℃，c）重合１分、72℃の30サイクルを実施し、そして３μlの各反応物を、TAE緩衝液中で1.4％アガロースゲルランを通じての電気泳動により分析した。ミューテーターアッセイ：プレートアッセイを用いて、野生型E.coli AB1157（F ，thr1，leu6，thi1，lacY1，galK4，aral14，xy15，mtl1，proA2，his4，argE3 str31，tsx33，supE44，λ^-）におけるrifへの自然変異率を測定した。Bluescr ipt（stratagene，La Jolla，CA）プラスミドの誘導体pDHA11を含有するMsh2_hu を、Fishelら(J．Mol．Biol．188:147-157，1986)に従い、AB1157に形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を選択し、100μg/mlアンピシリン（AMP）および0.5mM IPTGを含有するLB中で飽和するまで増殖させた。この培養物の希釈物を 100μg/ml AMPを含むLBプレートにプレートしてpDHA11プラスミドを含有する生存可能細胞の総数を測定した。この希釈物を、100μg/ml AMPに加えて100μg/ml リファンピシン（Sigma，St．Louis，MO）を含むLBプレート上にプレートし、培養物中の自然rif変異体の総数を測定した。変異率を、LeaおよびCoulson（J．Ge net.49:264-285，（1949）J.Genet．49:264-285）に従い、r₀=M（1.24+ln M）を用いて計算した。ここでr₀は、奇数個の独立した培養物（通常15）中のrif変異数の中央値であり、Mは、培養物あたりのrif変異の平均数である。Mを既知のr₀ 値から補間法により導き、次いで変異率rを計算するために用いた。ここでr=M/N 、N は、生存細胞の最終平均数である。ヒトゲノムDNAクローンの単離いくつかの異なるプローブ（上記のPCR生成クローン22.1およびヒトcDNAクローンを含む）を用いて、L．Kunkeにより提供されたλgt11ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。任意のヒトゲノムライブラリーがスクリーニングされた。配列番号１および２に相同であるヌクレオチド配列、ならびに細菌mutSおよび hexA遺伝子を含む９個のクローンを同定した。標準的な制限マッピングおよび配列決定プロトコルは、７つのエキソンおよびそれに連合したイントロン接合部を示した。ヒトcDNAクローン、およびゲノム配列に相当する部分の正確な配列が公知であるので、当業者は、PCRプライマーを容易に設計し、これらの配列の特定セクションを増幅し得る。例えば、配列番号25/26、29/30、31/32、33/34、35/36、37/ 38、および39/40は、ヒト遺伝子の個々のエキソンを増幅するために用いられ得るオリゴヌクレオチドプライマー対である。同定されたゲノムクローンが上記のヒトcDNAクローン（配列番号８）によりコードされるタンパク質のＣ末端部の48％のみをコードし得るヌクレオチド配列を含んでいるので、２つの新規のプローブを、配列番号８のＮ末端の配列に基づいて設計されたプライマーを用いたPCRを用いて作成し、そしてそれらを使用してゲノムライブラリーを再びスクリーニングした。一方のプローブは、６個のクローンを同定し、同時に、これらは、上記のヒトcDNAクローン（配列番号８）によりコードされるタンパク質のＮ末端の56％をコードし得るヌクレオチド配列を含んでいると同定された。他方のプローブは、２つのクローンを同定し、同時に、これらは、上記のヒトcDNAクローン（配列番号８）によりコードされるタンパク質のＮ末端の31％をコードし得るヌクレオチド配列を含んでいると同定された。ヒトクローンの遺伝子マッピング上記単離したヒトヌクレオチド配列をヒトゲノム中にマッピングした。 PCR生成クローン番号22.1（配列番号15）を用いて、ヒト染色体特異的ハムスターおよびマウス細胞ハイブリッドから単離したゲノムDNAのサザンブロットをプローブした。特に、本発明者らは、PCR生成配列番号15を用いてマッピングパネル２（米国国立衛生研究所、Institute of General Medical Science(Bethesd a，MD)により組み立てられた細胞ハイブリッドのセット）をスクリーニングした。マッピングパネル２は、27の異なるゲノムDNAサンプル：ヒトゲノムDNAのサンプル、チャイニーズハムスターゲノムDNAのサンプル、マウスゲノムDNAのサンプル、および単一ヒト染色体（第1〜22、Ｘ、またはＹ）を含む、24の異なるマウスまたはハムスターの細胞ハイブリッドの各々由来のゲノムDNAのサンプルから成る。マッピングパネル由来の、EcoRI消化またはBamHI消化DNAサンプルの両方のブロットをプローブした。この結果は、PCR生成プローブ番号22.1（配列番号1 5）が、ヒト第２染色体を含む細胞ハイブリッドから単離されたDNA中に存在するヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを示した。また、配列番号８に示されたヒトcDNAクローンを用いて、ヒトゲノムDNA、およびヒト第２染色体を含むチャイニーズハムスター細胞ハイブリッドから単離された両方のDNAのサザンブロットをプローブした。DNAサンプルは、Coriell Cell Repositories，Camden，NJにより提供された。ヒト第２染色体へのハイブリダイゼーションが再び観測された。このマッピングを、マッピングパネル２、およびCoriell Cell Repositories, Camden，NJにより提供されたDNAサンプルから単離されたDNA集団において実行されたPCR反応において、さらに確認した。用いたプライマー（その配列は配列番号21および22と表される）は、ヒトゲノム相同体Msh2_hu（cDNAクローン（配列番号８）のヌクレオチド位2020のイントロン部位に位置する）の予測される158b pフラグメントを特異的に増幅する。PCR産物は、ヒト第２染色体を含むこれらの反応物においてのみ観測された。ヒト第２染色体へのこの局在化は、配列番号８に相当するヒト遺伝子は、HNPC Cに関連する遺伝子である。特徴付け異なる細菌種由来のMutS相同体、例えば、S．pneumoniaeのhexAタンパク質のE .coliでの発現は、MutHLSミスマッチ修復経路を妨害し、優性ミスマッチ修復欠損表現型を生じた（Prudhommeら、J.Bacteriol．173:7196-7203，1991）。おそらく、S．pneumoniae MutS相同体は、E.coli中のミスマッチした塩基対に結合するが、E.coliミスマッチ修復機構の残りと相互作用し得ず、従って正常なミスマッチ修復を混乱させる。配列番号16のヒトタンパク質がミスマッチ修復における機能的役割を演じ得る可能性を試験するために、本発明者らは、E.coliにおけるこのヒトタンパク質の発現が優性ミスマッチ修復欠損表現型を生じるか否かを試験した。特に、本発明者らは、配列番号16のヒトタンパク質を発現するE.coli細胞がリファンピシン耐性への増加した率の自然変異の増加した割合を示すか否かを調査した（実施例３を参照のこと）。プレートアッセイおよび揺動分析（fluctuation assay）（Lea and Coulson J．Genet．49:264-285,1949、本明細書中で参考として援用）により配列番号16のヒトタンパク質を発現するE.coli株は、リファンピシン耐性への自然変異が、このヒトタンパク質を発現しない同質遺伝子のE.coli株で観測される率の約10倍の増加を示すことが明らかにされた。この結果は、配列番号16のヒトタンパク質がDNAミスマッチ修復において機能するという見解に一致する。特に、ヒトタンパク質は、他の公知のMutS相同体（配列番号３および４の酵母タンパク質を含む）のように、ミスマッチしたヌクレオチドに結合し得るが、E.coli ミスマッチ修復経路の他の構成成分とは相互作用し得ないようである。この表現型分析は、上記で考察したマッピング研究と併用した場合、配列番号８に相当するヒト遺伝子がHNPCC罹病性を与える原因遺伝子であることを強く示唆する。さらに、このタイプの分析は、配列番号16のヒトタンパク質のフラグメントおよび変異体、またはE.coli mutS遺伝子の他の真核生物の相同体（この相同体は、完全長の野生型タンパク質と機能的に等価である(下記参照のこと)）を同定するために用いられ得る。実施例４：類似した細菌性ミスマッチ修復経路のメンバーに相同な他の哺乳動物ヌクレオチド配列の単離および特徴付け A．同定上記の酵母およびヒト配列の単離により提供される情報は、任意の細菌性ミスマッチ修復遺伝子に相同な任意の他の真核生物のヌクレオチド配列を単離する一般的なプロトコルの開発を可能にする。特に、哺乳動物（例えば、マウス、雌ウシ、ブタ、およびサル）由来のE.coli mutS相同体は、容易に同定され得る。個々の場合において、DNAテンプレートとして、細菌性mutSおよびhexA遺伝子に相同な少なくとも１つの真核生物のヌクレオチド配列を含むことが知られるヌクレオチドライブラリーを用いる反応において、PCR反応条件を最適化することは大事なことであり得る。例えば、酵母ライブラリー（配列番号１または配列番号２を含む）が使用され得る。同様に、ヒト配列番号８または配列番号９を含むライブラリーが使用され得る。記載される手順はまた、細菌性ミスマッチ修復遺伝子ファミリー（例えば、mutH、mutL、heXB、およびmutU(uvrD)）の他のメンバーに相同な真核生物ヌクレオチド配列の単離および同定を可能にするように改変され得る。例として、本発明者らは、他の真核生物由来のE.coli mutS遺伝子に相同なヌクレオチド配列を単離するために用いられ得る、縮重したオリゴヌクレオチドプール（配列番号17および18）の配列を提供する。この配列は、BamHI制限遺伝子座を含む。当業者に明白なように、他の制限遺伝子座が等価的に使用され得る。別の制限遺伝子座を有するプライマーの作成は、当該分野の通常の技術に十分に含まれる。本発明者らは、配列番号17および18のプライマーを用いて、E.coli mutS遺伝子、配列番号１および配列番号２の酵母遺伝子、および配列番号８のヒト遺伝子に相同な、配列番号10で表されるマウスヌクレオチド配列を同定した。25-μl P CR反応物は、10mMのTris緩衝液pH 8.5，50mMのKCe、3mMのMgCl₂、0.01％のゼラチン、それぞれ50μMのdNTP、1.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ、それぞれ５p moleのプライマーおよびCorriel Cell，Camden，NJから入手の0.4μgのマウスDN Aを含有した。94℃で30秒、55℃で30秒、そして72℃で１分の30サイクルを実行した。本発明者らは、これらの反応条件（サイクル数はいくらかのバリエーションはある）が、いくつかの異なるプライマーセットを用いて、高等真核生物由来の細菌のmutS/hexA遺伝子に相同なヌクレオチド配列を増幅するために一般に有用であることを見出した。産物のバンドをクローン化し、標準的な方法により配列決定した。分析した10個のクローン全ては、同一の配列（配列番号10）を含んでいた。従って、E.coli mutS遺伝子に相同な、酵母およびヒトヌクレオチド配列の本発明者らによる単離からの情報を組み合わせることにより、本発明者らは、E.coli mutS遺伝子に相同な異なる配列からのヌクレオチド配列の単離において100％の成功を与えるプロトコルを開発させた。マウス配列は、ヒト染色体2p2 1-22とシンテニック（syntenic）であるマウス第17染色体の領域にマップされる。このことは、配列番号８に相当するヒト遺伝子が、ヒト第２染色体に位置すること、そしてこの遺伝子がHNPCCへの罹病性を与える原因の遺伝子であるように思われることを確認する。 E.coli mutSミスマッチ修復遺伝子に相同な真核生物ヌクレオチド配列の好ましいクローンは、FATH(F/Y)をコードし得る任意の真核生物ヌクレオチド配列のクローンを包含する。特に好ましいクローンはまた、TGPNM、ヘリックス-ターン -ヘリックスDNA結合モチーフおよび／またはMg²⁺-ATP結合遺伝子座をコードし得る配列を包含する。理想的なクローンは、完全なオープンリーディングフレーム（すなわち、メチオニンで開始し、そして終止コドンで終結するオープンリーディングフレーム）を含有する。内因性遺伝子の発現に関係する全ての5'および3' の非翻訳配列を含むcDNAおよびゲノムクローンを有することもまた望ましい。短いフラグメントから長いクローンを組み立てる必要がある場合、短いフラグメントは重なり合う配列に基づいて整列され得る。その後、長いクローンが、例えば、適切な制限酵素を用いてフラグメントを互いに結合させることにより、または PCRを用いてインタクトなクローンを増幅することにより調製され得る。ある場合には、本発明の好ましい真核生物ヌクレオチド配列の同定は、最初に、目的のヌクレオチド配列が発現される特定の真核生物組織または細胞株の同定を必要とし得る。いくつかの標準的な技術のいずれかが、ヌクレオチド配列の発現をアッセイするために使用され得る。例えば、PCRは、テンプレート核酸として単離されたRNAサンプルを用いて実行され得る。ウエスタンブロッティングは、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の発現をアッセイするために用いられ得る。あるいは、単離された全RNA、または細胞から単離されたオリゴ(dT )選択メッセンジャーRNA（mRNA）のノーザン分析は、細菌ミスマッチ修復遺伝子に相同な真核生物転写物を同定するために用いられ得る。細菌ミスマッチ修復遺伝子に相同な真核生物転写物とハイブリダイズし得る任意のプローブが、用いられ得る。例えば、上記の酵母およびヒトクローンに対するPCR生成プローブは、このノーザン分析に用いられ得る。ノーザン分析はまた、細菌ミスマッチ修復遺伝子に相同な真核生物転写物のサイズも示し得る。この情報により、同定されたクローンをまず配列決定する必要なく、所定の同定されたcDNAクローンが、全体の転写物を包含するに十分長いか、またはさらなるDNAクローンを取得する必要があるか（すなわち、cDNAクローンの長さが、ノーザン分析により見られるようなRNA転写物の長さより短い場合）を決定すること、およびそれらが完全なオープンリーディングフレームを含むか否かを決定することが可能になる。同定されたcDNAクローンが十分な長さでない場合、いくつかの可能な工程のいずれかが実行され得る。例えば：（i）最も長い利用可能なプローブを用いて、または、関連クローンの５'末端部に由来するプローブを用いて、同じライブラリーを再びスクリーニングしてより長いcDNAを同定する；（ii）最も長い利用可能なプローブを用いて、異なるcDNAライブラリーをスクリーニングする；および（iii）最も５'側の利用可能な領域に近接するが、その領域には位置しない領域に相当する特定のヌクレオチドプライマーを用いる逆転写によりプライマー伸長したcDNAライブラリーを調製する。次いで、このプライマー伸長したライブラリーは、このプライマーに対して５'側に位置する利用可能な配列に相当するプローブを用いて、スクリーニングされ得る。（例えば、Ruppら、Neuron，6: 811-8 23，1991を参照のこと）。本発明の真核生物ヌクレオチド配列はまた、単離されたゲノムクローンも含み得る。このゲノムクローンは、例えば、任意の利用可能なプローブを用いて、ハイブリダイゼーションによってゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、またはPCR増幅により同定され得る。上記のように、PCR生成プローブは、細菌ミスマッチ修復遺伝子に相同な酵母およびヒトヌクレオチド配列を単離するために用いられ得る。このようなプローブはまた、細菌ミスマッチ修復遺伝子に相同な真核生物ヌクレオチド配列を単離するために一般的なプロトコルにおいて用いられ得る。他の種類のプローブもまた、一般的なプロトコルで用いられ得る。これらのプローブは、配列番号１または２に示される酵母配列の一部、配列番号８で示されるヒト配列の一部、あるいは配列番号10で示されたマウス配列の一部をコードするオリゴヌクレオチドを含む。本発明の真核生物ヌクレオチド配列はまた、従来の免疫化技術（例えば、Harl owおよびLane，D，Antibodies，Cold Spring Harbor Press，New York（1988）に記載の技術）を用いたポリペプチド発現ライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。例えば、抗体は、本発明の単離された酵母またはヒトポリペプチドに対して調製され得、次いで発現ライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。これは、好ましくは、最初に細菌ミスマッチ修復遺伝子に相同な真核生物ヌクレオチド配列によりコードされる他種由来のポリペプチドとの交差反応性を、試験した後に用いられ得る。実施例５：E.coli mutSミスマッチ修復遺伝子に相同なマウスヌクレオチド配列は、ヒト染色体2p21-22とシンテニックである、マウス第17染色体の領域中にマップされる。手順ヒトMSH-2遺伝子（配列番号８に相当）のマップ位置を、マウス相同体（MSH-2_mouse : 配列番号10に相当）の位置をマッピングすることによって、より詳細に決定した。これは、配列番号８に相当するヒトMSH-2の高度に保存された領域が、マウス相同体に100％のアミノ酸同一性を有する大きなストレッチを含むこと、およびこの領域のコーディングDNA配列が、ヒトDNA配列と92％同一（配列番号８と配列番号10との比較）であるほぼ100bpの長さのセグメントを含むことに起因し得る。ヒト保存領域に対するプローブ（配列番号15）、およびマウス保存領域に対するプローブ（配列番号10）が、種間マウス交雑の産物から得られたDNA の制限消化のサザンブロット中の単一部位（locus）にハイブリダイズすることを見出された。このことは、制限遺伝子座多型マーカーと比較してヒトMSH-2遺伝子をマッピングすることを可能にした。ヒトMSH-2のマウス染色体上での位置を、[(C57BL/6J×Mus spretus)Fl×C57BL /6J]マウスの交配に由来する子孫を用いた種間戻し交雑分析により決定した。この種間戻し交雑マッピングパネルは、全ての常染色体およびＸ染色体の間に十分に分布する1300以上の遺伝子座について分類されている（CopelandおよびJenkin s，Trends Genet．7: 13-18，1991）。C57BL/6JおよびM.spretus DNAをいくつかの酵素を用いて消化し、そしてプローブとして配列番号15を用いて、有益な（in formative）制限フラグメント長多型(RFLP)のためのサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。サザン分析は、以前に、配列番号15がMSH-2_mouse およびハムスター（MSH-2_hamster）相同体の両方にクロスハイブリダイズ（hcro ss-hybridized）することを確証している。9.4kb M.spretus HindIII RFLPを用いて、戻し交雑マウスにおけるMSH-2_mouse遺伝子座の分離を追跡した。マッピングの結果は、MSH-2_mouseが、Lama、Tik、MsoslおよびLcgr/Gpcrに連結したマウス第17染色体の末端領域に位置することを示した。147匹のマウスを、全てのマーカーについて解析したが、176匹までのマウスが、いくつかのマーカーの組について分類された。それぞれの遺伝子座を、組換え頻度についてさらなるデータを用いて対組み合わせ（pairwise combination）で分析した。組換え染色体を示すマウスの総数の各対の遺伝子座について分析したマウスの総数に対する割合および最も可能性の高い遺伝子の順序は：セントロメア‐Lama‐9/176 ‐Tik‐1/162‐Msosl‐3/161‐MSH-2_{mouse_/_-}Lcgr/Gpcrである。組換え頻度（センチモルガン（cM）単位の遺伝距離＋標準誤差で表される）は、‐Lama -5.1 +/- 1.7‐Tik‐0.6 +/-0.6 Msosl‐1.9 +/- 1.1‐MSH-2_{mouse-_+/-_-}LCgr/GPSr である。第17染色体の種間地図と多くのクローン化されていないマウス変異の地図上の位置を報告する混成マウス連鎖地図（M.T．Davisson，T.H．Roderick，A.L．Hil lyardおよびD.P．Doolittleにコンパイルされ、The Jackson Laboratory，BarHa rbor，MEで維持されるコンピューターデータベースGBASEから提供される）との比較は、MSH-2_mouseが混成地図のマウス変異を欠いている領域にマップされることを示唆した。マウス第17染色体の遠位領域は、ヒト染色体2pとの相同性を有する領域を共有する。特に、Msoslは、ヒト2p21-22に配置されている。マウスにおけるMsoslとM SH-2_mouseとの間の密接な連鎖は、ヒトMSH-2が、同様にヒト染色体2p21-22上に存在するか、あるいは非常に近接して存在することを示唆する。この地図位置は、2p15-16のHNPCCの報告された位置とは幾分異なる。しかし、本発明者らは、HN PCC遺伝子およびこの領域の他の遺伝マーカーのマッピングの誤差の範囲内で、ヒトMSH-2遺伝子およびHNPCC遺伝子は、同一の位置にマッピングされるようであると考える。材料と方法種間戻し交雑マウスマッピング：種間戻し交雑子孫を、（CopelandおよびJenk ins、前出1991）に記載のように、（C57BL/6J×M.spretus）F1雌とC57BL/6J雄との交配により作成した。合計205匹のN2マウスを用いて、Hms2部位をマッピングした。DNA単離、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、サザンブロットトランスファーおよびハイブリダイゼーションを、本質的に（Jenkinsら、J.Virol 4 3: 26-36，1982）に記載のように実行した。全てのブロットをZetabindナイロンメンブレン（AMF-Cuno）を用いて調製した。プローブ（360bpヒトcDNAクローン）を、ランダムプライムラベリングキット（Stratagene）を用いて[α-³²P]-dCT Pで標識した；洗浄を、1.0×SSCP，0.1％ SDS，65℃の最終ストリンジェンシーまで実施した。 12.5kbのフラグメントをHind〜I消化C57BL/6J DNA中に検出し、9.4kbのフラグメントをHindIII消化M.spretus DNA中に検出した。9.4kb M.spretus特異的HindI IIフラグメントの存在または非存在を、戻し交雑マウスにおいて追跡した。ラミニンAサブユニット（Lama）およびSosのマウス相同体-1（Msosl）を含むMSH-2に連結された遺伝子座についてのプローブおよびRFLPの記載は、以前に報告されている（Webbら、投稿中）。以前に報告されていない１つの遺伝子座は、抗ホスホチロシン免疫反応性キナーゼ,(Tik)（Icelyら、J.Biol.Chem．266: 16073-77，1 991）である。プローブは、マウスcDNAの1733bp BamHIフラグメントであった。これは、ScaI消化C57BL/6J DNA中の、14.0、6.1、3.7、および1.5kbフラグメントならびにScaI消化M.spretus DNA中の、7.3、5.6、2.9、2.1、および1.5kbフラグメントを検出した。M．spretus特異的RFLPを同時分離し、そしてこの分析に置いて追跡した。組換え距離を、コンピュータープログラムSPRETUS MADNESSを用いて、（Green，Genetics and Probability in Animal Breeding Expreiments， Oxford University Press，New York，pp．77-113）に記載のように計算した。対立遺伝子分布パターンを説明するために必要とされる遺伝子を、組換え事象の数を最小化することにより決定した。実施例６：トランスフェクションおよびマイクロインジェクションのための構成物の調製マイクロインジェクションのためのDNAの精製方法は、当業者に周知である。例えば、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Sping Harbor Labora tory，Cold Spring Harbor，NY(1986); およびPalmerら、Nature，300: 611(198 2)を参照のこと。トランスジェニック動物の構築：様々な方法が、本発明に関係するトランスジェニック動物の産生に利用可能である。DNAは、雄性および雌性前核の融合の前に受精卵の前核中に注射され得、あるいは細胞分裂の開始後に胚性細胞の核（例えば、２細胞胚の核）中に注入され得る（Brinsterら、Proc.Nat.Acad.Sci; USA,8 2: 4438-4442(1985)）。胚は、ウイルス、特にレトロウイルスに感染し得、本発明の遺伝子を有するように改変され得る。胚の内部細胞塊に由来し、そして培養物中で安定化された多能性幹細胞は、本発明の尿素輸送体遺伝子を取り込むように、培養物中でマニピュレートされ得る。トランスジェニック動物は、代理母（foster mother）に移植（implant）されて出産をむかえることを許される胚盤胞中への移植を通じて、このような細胞から産生され得る。遺伝子導入実験に適切な動物は、標準的な商業的供給源（例えば、Charles Ri ver(Wilmington，MA)，Taconic(Germantown，NY)，Harlan Sprague Dawley(Indi anapolis，IN)など）から入手され得る。Swiss Webster雌マウスは、胚回復（em bryo retrieval）および胚移植（embryo transfer）のために好まれる。B6D2F₁ 雄は、交配のために用いられ得、精管切除されたSwiss Webster種マウス（stud ）は、偽妊娠を刺激するために用いられ得る。精管切除されたマウスおよびラットは、供給会社から入手され得る。マイクロインジェクション手順：齧歯類胚のマニピュレーションおよび接合体前核へのDNAのマイクロインジェクションの手順は、当業者に周知である（Hoganら、前出）。魚、両生類卵およびトリについてのマイクロインジェクション手順は、HoudebineおよびChourrout，Experientia，47: 897-905(1991)に詳細に記載される。動物組織へのDNA導入についての他の手順は、米国特許第4,945,050号（Sa nfordら、1990年７月30日）に記載される。トランスジェニックマウス：６週齢の雌マウスに、妊娠雌ウマ血清生殖線刺激ホルモン（PMSG; Sigma）の５IU注入（0.1cc，ip）、およびそれに続く48時間後のヒト胎盤性腺刺激ホルモン（hCG; Sigma）の５IU注入（0.1cc，ip）で排卵過度を誘導させる。雌を、hCG注入直後、雄とともに置く。hCG注入の21時間後、交配した雌をCO₂窒息または頚部脱臼により屠殺し、そして胚を摘出した卵管から取り出し、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA; Sigma）を含むDulbeccoリン酸緩衝生理食塩水（DPSS）中に置く。周囲の卵丘細胞を、ヒアルロニダーゼ（1mg/ml）を用いて除去する。次いで前核胚を洗浄し、インジェクションの時まで、５％ CO₂ ，95％空気の加湿大気とともに37.5℃のインキュベーター中で0.5％BSA含有Earl e平衡塩溶液（EBSS）に置いた。ランダムな周期の成雌を、精管切除された雄とペアリングさせる。Swiss Webs terまたは他のこれに匹敵する系統が、この目的に使用され得る。レシピエント雌を、ドナー雌と同時に交配する。胚移植時に、レシピエント雌を、体重１gあたり0.015mlの2.5％アベルチンの腹腔内注射で麻酔する。卵管を１箇所の背部正中切開により露出させる。次いで卵管のすぐ上の体壁を切開する。次いで卵嚢を、鉗子を用いて切り裂く。移植すべき胚をDPBS中で移植ピペットのチップ中に入れる（約10〜12個の胚）。ピペットチップを卵管漏斗に挿入し、そして胚を移植する。移植後、切開部を二つとも縫合により閉じる。トランスジェニックラット：トランスジェニックラットを作成するための手順は、マウスのトランスジェニック体作成の手順と同様である。Hammerら、Cell，63 :1099-1112(1990)を参照のこと。30日齢の雌ラットに20IUのPMSG（0.1cc）の皮下注射を与え、48時間後、それぞれの雌を生殖能力を確認された（proven）雄とともに置く。同時に、40〜80日齢の雌を精管切除された雄とともにケージ中に置く。これらは、胚移植のための代理母を提供する。翌朝、雌を膣栓について検査する。精管切除された雄と交配した雌を移植の時までわきに置いておく。交配したドナー雌を屠殺し（CO₂窒息）、そしてそれらの卵管を取り出し、0.5％ BSAを含むDPSS中に置き、そして胚を回収する。胚の周囲の卵丘細胞を、ヒアルロニダーゼ（１mg/ml）を用いて除去する。次いで胚を洗浄し、マイクロインジェクションの時まで、37.5℃のインキュベーター中の0.5％BSAを含有するEBSS（Earle 平衡塩溶液）中に置く。胚を注入する場合、代理母への移植のために、生存胚をDBPSに取り出す。代理母をケタミン（40mg/kg,ip）およびキシラジン(xylazine)（５mg/kg,ip）で麻酔する。背部正中切開を皮膚に行い、そして卵巣および卵管を、卵管のすぐ上の筋肉層の切開により露出させる。卵嚢を引き裂き、胚を移植ピペット中に吸い取り、そして移植ピペットのチップを卵管漏斗へ挿入する。約10〜12個の胚を、それぞれのラット卵管に卵管漏斗を通じて移植する。次いで切開部を縫合により閉鎖し、そして代理母を単独で飼育する。胚芽茎（ES）細胞方法DNAのES細胞への導入 ES細胞の培養方法、およびそれに続くエレクトロポレーション、リン酸カルシウム/DNA沈殿；および直接注入のような方法を用いるDNAのES細胞への導入による遺伝子導入動物の生産は、当業者に公知である。例えば、テトラカルシノーマおよび胚芽茎細胞、実用的アプローチ、E.J.Robertson編、IRLPress（1987）を参照。真核生物ミスマッチ修復遺伝子を含むES細胞の所望のクローンの選択は、いくつかの手段の一つにより行われる。胚芽茎細胞は現在マウスについてのみ手に入るが、本明細書に記載および引用されたような同様な方法および手順が、異なった種からの胚芽茎細胞について、それらが手に入るようになるとき、有効であり得ることが予期される。ランダムな遺伝子組み込みを含む場合には、本発明の遺伝子配列を含むクローンは、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子とともに同時トランスフェクトされる。あるいは、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子が、ミスマッチ修復遺伝子に物理的に連結される。トランスフェクションは、当業者に周知のいくつかの方法（E.J.Robertson、前出）の任意の一つによって行われる。リン酸カルシウム/ DNA沈殿、直接注入、およびエレクトロポレーションは好ましい方法である。DNA 導入に続いて、細胞に、G418（200と500μg/ml生物学的量との間）を補足したDM EM中に10％のウシ胎児血清を含む選択培地を供給する。G418に耐性の細胞のコロニーを、クローニングリング（cloning ring）を用いて単離し、そして増殖させる。DNAを薬物耐性クローンから抽出し、そして導入遺伝子に特異的なDNAプローブを用いるサザンブロッティング実験をミスマッチ修復遺伝子配列を有するクローンを同定するために用いる。いくつかの実験では、PCR法を目的のクローンを同定するために用いる。 ES細胞内に導入されたDNA分子はまた、相同組換えの過程を通じて染色体中へ組み込まれ得る。Copecchi、Science、244：1288-1292（1989）。直接注入は、高効率の組み込みを生じる。所望のクローンを、注入されたES細胞のプールから調製されたDNAのPCRにより同定する。プール内の陽性細胞を、細胞クローニングに続くPCRによって同定する。エレクトロポレーションによるDNA導入は、より有効ではなく、そして選択工程を必要とする。組換え事象（すなわち、neo耐性）の陽性選択および二重の陽性-陰性選択（すなわちneo耐性およびガンシクロビル耐性）法およびそれに続くPCRによる所望のクローンの同定が、Copecchi、前出およびJoynerら、Nature、338:153-156(1989)によって記載されており、その開示は本明細書中に援用される。胚回収およびES細胞注入オスのマウスと交配させた、自然の周期のまたは過排卵させたメスのマウスを、 ES細胞の移植のための胚を回収するために用いる。マウスを用いるとき、この目的のためにはC57BL165系統を用いることが望ましい。適切な年齢の胚は、うまく交配した後約3.5日で回収される。交配したメスを、CO₂による窒息または頸部の脱臼により屠殺し、そして胚を切除した子宮角から流し出し、そしてES細胞を用いる注入のために、ダルベッコの改変必須培地プラス10%子ウシ血清中に置かれる。約10〜20のES細胞を、約20μmの内径を有するガラス製微小針を用いて胚盤胞中へ注入する。胚の受容性メスへの移入ランダム周期の成体メスのマウスは、精管切除されたオスと対にされる。Swis s Webster、ICRまたはその他のようなマウス系統をこの目的のために用い得る。受容体のメスは、ES細胞を含む胚盤胞を用いる注入のために必要とされるとき、交配後それらが2.5〜3.5日にあるように交配される。胎児移入のときに、受容体のメスを、体重グラムあたり2.5%アバーティンの0.015mlを腹腔内注射して麻痺する。卵巣を、卵管のすぐ上にある体壁において切開を行うことによって曝し、卵巣および子宮を外面に出す。子宮角内に25ゲージ針を用いて穴が作成され、そこを通って胚盤胞が移入される。移入後、卵巣および子宮を身体内に押し戻し、そして切開を二つの縫合によって閉じる。この手順は、別の移入がなされ得る場合、対向する側で繰り返される。遺伝子導入マウスおよびラットの同定尾部サンプル（１-２cm）が三週令の動物から取り出される。DNAを調製し、そしてサザンブロットまたはPCRによって分析し、遺伝子導入始原（F₀）動物およびそれらの子孫（F₁およびF₂）を検出する。このようにして、バクテリアのミスマッチ修復遺伝子の相同体についてトランスジェニックとなった動物が同定される。すべての遺伝子導入動物がミスマッチ修復ポリペプチドを発現するわけではなく、そしてこれらのすべてが実験者によって予期される発現パターンを有するわけではないので、異なった組織におけるポリペプチドの発現に関して、遺伝子導入動物の各系統を特徴づけることが必要である。げっ歯以外の遺伝子導入動物の生成：げっ歯類でない哺乳動物および他の動物の生成の手順は他によって論議されている。HoudebineおよびChourrout、前出；Pu rselら、Science 244:1281-1288（1989）；およびSimmsら、Bio/Technology、6: 179-183（1988）参照。他の遺伝子導入生物の同定：生物は、DNA抽出のためにその生物のサンプルを採取し、そして目的の遺伝子に相補的なプローブを用いたハイブリダイゼイション分析により潜在的にトランスジェニックであると同定される。あるいは、生物から抽出されたDNAを、目的の遺伝子に相補的なPCRプライマーを用いるPCR分析に供し得る。実施例７：ミスマッチ修復遺伝子の哺乳類相同体を不活性化するためのプロトコル。マウスのゲノムクローンを、ヒトのミスマッチ修復遺伝子を有するマウスのD3 系統からゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離する。重複リフトが、確立されたプロトコル（Sambrook,J.ら、The Cloning Manual、Cold Spring Harbor Press、N.Y.）によって放射標識されたプローブを用いてハイブリダイズされる。両リフト上の陽性信号に対応するプラークを、プラーク密度を減少させた連続的スクリーニングのラウンドによって単離および精製する。単離されたクローンの有効性は、ヌクレオチド配列決定によって確認される。バクテリアのミスマッチ修復遺伝子の真核生物相同体を不活性化するための多くの可能なプロトコルの一つが、以下に提示される。ゲノムクローンを、相同的組換えによる胚芽茎におけるミスマッチ修復遺伝子の欠失のための遺伝子標的性ベクターを調製するために用いる。転写および翻訳信号を有するネオマイシン耐性遺伝子（neo）を、遺伝子の５’末端近くにある便利な部位中へクローン化される。これにより、ミスマッチ修復遺伝子配列のコード配列が破壊され、そしてベクターでトランスフェクトされた胚芽茎(ES)細胞によって薬物ゲネチシン（G418）による選択が可能となる。ヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ(HSV-tk)遺伝子を、第二の選択マーカーとしてゲノムDNA の他の末端に配置する。neo遺伝子を有する幹細胞のみがこの薬物の存在下で成長する。この構築物のESゲノム中へのランダムな組み込みは、構築物の末端での配列を経て起こる。これらの細胞株では、HSV-tk遺伝子が機能し、それゆえ、薬物ガンシクロビルは、改変されたミスマッチ修復コード配列の組み込み配列を有する細胞に対して毒性である。相同的組換えはまた、ESミスマッチ修復遺伝子の相同DNA配列と標的性ベクターとの間でも起こる。これは、通常、ミスマッチ修復遺伝子配列と相同でないので、HSV-tk遺伝子の切除を生じる。従って、G418およびガンシクロビル中でトランスフェクトされたES細胞を増殖させることによって、相同的組換えが起こった細胞株が高度に濃縮される。これらの細胞は、ミスマッチ修復遺伝子の破壊されたコード配列を含む。個々のクローンが単離され、そして成長させ、凍結ストックおよびDNA調製のために十分な細胞を生成するまで増殖させる。ミスマッチ修復遺伝子がうまく標的されたクローンが、サザンブロット分析によって同定される。この手順の最後のフェーズは、標的されたES細胞を胚盤胞の中へ注入し、そして胚盤胞を偽妊娠の雌へ移入することである。生じたキメラ動物は、飼育され、そしてその子孫はサザンブロッティングによって分析され、生殖系列において遺伝子の変異形態を有する個体を同定する。これらの動物は交配され、ネズミの発達と生理学に関するミスマッチ修復遺伝子欠損の効果を測定する。実施例８：P1ファージライブラリーからのhMSH2ゲノムクローンの増幅 PCR反応において用いられる25ngゲノムDNAは以下を含む： 0.05mM dNTPs 50mM KCl 3mM Mg 10mM Tris-HCl pH8.5 0.01%ゼラチンプライマー16061(配列番号114)および16062(配列番号115) 反応を、Perkin-Elmer Cetus model9600熱シリンダーで行った。反応は、95℃で５分間インキュベートし、続いて以下を35サイクル行った： 94℃で30秒 55℃で30秒 72℃で１分次いで最後の７分間伸長反応を72℃で行った。所望のP1クローンは、約146bpの生成物バンドが生産されるクローンであった。実施例９：ネストされたPCRプライマーを用いるゲノムDNAからのhMSH2配列の増幅本発明者らは、ゲノムDNAからhMSH2配列の２段階PCR増幅を以下のように行った。代表的には、最初の増幅は、以下を含む25マイクロリッター反応中で行った： 25ngの染色体DNA Perkin Elmer PCR緩衝液II（任意の適切な緩衝液が用いられ得る） 3mM MgCl₂ 50μM各dNTP Taq DNAポリメラーゼ 5μMプライマーそして95℃で５分間インキュベートし、次いで以下の20サイクルを行った。 94℃で30秒 55℃で30秒生成物バンドは、代表的には、十分小さく（約500bp未満）、別の伸長工程は各サイクルの後行わなかった。むしろ、20サイクルが終了した後、一回の伸長工程を、72℃で７分間行った。反応生成物を４℃で保存した。通常、25または50マイクロリッター容量で、第２の増幅反応は以下を含んでいた：１または２マイクロリッター（反応の容積に依存する）の第１の増幅反応生成物 Perkin Elmer PCR緩衝液II（任意の適切な緩衝液が用いられ得る） 3mM MgCl₂ 50μM各dNTP Taq DNAポリメラーゼ 5μMのネストされたプライマーそして95℃で５分間インキュベートし、続いて以下の20-25サイクルを行った。 94℃で30秒 55℃で30秒サイクルが完了した後、一回の伸長工程を72℃で７分間行った。反応生成物は４℃で保存した。標的hMSH2配列を増幅し得る任意のセットのプライマーが第１の増幅反応において用いられ得る。本発明者らは、第１の増幅反応における個々のhMSH2エキソンを増幅するために表２に提示された各プライマーセットを使用した。本発明者らはまた、これらのプライマーセットの組み合わせを使用し、それによって第１の増幅反応における複数の個々のhMSH2エキソンを増幅した。特に、本発明者らは、hMSH2エキソン９、10、11、および12を同時に増幅するために、一回の反応において配列番号25、26、29、30、32、63および64を一緒に使用した。第１増幅工程で用いられるネストされたプライマーは、第１増幅反応で用いられるプライマーに対して設計された。すなわち、単一セットのプライマーが第１の増幅反応で用いられる場合、第２の増幅反応において用いられるプライマーは、以下を除いて第１の反応で用いられたプライマーと同一であるべきである。すなわち、第２の反応で用いられるプライマーは、第１増幅反応プライマーの５’ の大部分のヌクレオチドを含むべきでないこと、および第２増幅反応プライマーのT_mが第１増幅反応プライマーのT_mとほぼ同じであるに十分、３’末端でより多く伸長すべきである。本発明者らの第２の反応プライマーは、代表的には、第１増幅反応プライマーの３、５’の大部分のヌクレオチドを欠き、そして３’末端上より遠くほぼ３-６ヌクレオチド伸長する。配列番号146/148-153/154は、配列番号62/63-64/32がそれぞれ第１の増幅反応で用いられたとき、第２の増幅反応で用いられ得るネストされたプライマーペアの例である。本発明者らはまた、用いられ得る標準配列（例えば5'-TGTAAAACGACGGCCAGT）を含むことが、例えば、第２の増幅反応プライマーの一つまたは両方の５’末端で配列決定反応をプライミングするために価値があり得ることを見出した。さらに、本発明者らは、第２の増幅反応プライマーの一つまたは両方の最後のプライマーをビオチン化することが有用であり、その結果、生成物バンドが磁気ビーズを用いて容易に精製され得ること（例えば、Tongら、Anal.Chem.64:2672-2677、 1992を参照）そして次いで配列決定反応がビーズに結合した生成物上で直接行われ得ること（例えば、Debuireら、Clin.Chem.39:1682-5、1993；Whalbergら、El ectrophonesis 13:547-551、1992；Kaneokaら、Biotechniques 10:30,32,34,199 1；Huhmanら、Biotechniques 10:84-93、1991；Hultmanら、Nuc.Acid.Res.17:49 37-46、1989を参照）を見い出した。ゲノムの配列決定 hMSH2のcDNA配列は、本明細書中では配列番号45で示され、そして受託番号U03 911または受託番号U04045でGenBankにおいて見い出され得る。本発明者らは、hM SH2 cDNA配列のこれらの異なる目録において幾分変動があり、それはヒト集団内の多型現象；遺伝子コードの縮重；および/または配列決定結果の編集および解釈の間のわずかな編集誤りから生じ得ることを注記する。ラムダライブラリーにないかもしれない領域を包含するために、本発明者らは、対応するゲノム配列がラムダスクリーンにおいて同定されなかった、hMSH2 cD NAの領域であるヌクレオチド655〜799を増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。このプライマーは、次いでGenome Sciences,Inc.(St.Louis,MO) へ送られ、そしてヒトゲノムP1ライブラリーから生成物バンドを増幅するために使用された。Genome Sciences,Inc.によって同定された陽性クローンは、さらに本発明者らによって分析された（すなわち配列決定など）これらの陽性のP1クローンのうち二つ、1315番および1316番を図５に示す。本発明者らは、SequiTherm^TMサイクル配列決定キット（Epicentre Technologi es,Madison,ＷIから手に入る）を用いるサイクル配列決定を含む当該分野で公知の方法を用いて本発明者らの同定されたゲノムクローンを配列決定した。配列決定プライマーは、既知のhMSH2 cDNA配列に基づいて設計された。新しい配列が推定されたとき、新しいプライマーを設計した。特に、可能なエキソン/イントロン境界がゲノムクローン内で同定されたとき、コードする（すなわちエキソンの）配列から、イントロンの配列に向かってプライムする新しいプライマーを設計した。当該分野において公知であるように、この過程は、必要なときイントロン配列が所望される程度に配列に対して繰り返され得、そして遺伝子のエキソンでない上流領域および下流領域を配列決定するために使用され得る。一般に、DNA配列決定研究で正確さが要求されるとき、分子の両方のストランドを配列決定すること、および/または一度より多く、好ましくは異なるヌクレオチドプライマーを用いて分子を配列決定することが望ましい。新しい配列決定プライマーは、たとえその配列が確認されていなかったとしても、既知配列に基づいて設計され得る。当該分野で既知であるように、配列決定プライマーは、その標的配列と完全にハイブリダイズする必要は必ずしもなく、それが、配列決定反応の条件下で十分に特異的にハイブリダイズすることのみが必要で、得られる配列が解釈できる、その３’末端での鋳型と塩基対を形成し得ることを含んでいる。これらのゲノム配列決定研究を通じて、本発明者らは、hMSH2遺伝子内のすべての16のエキソンを同定し、そしてイントロン/エキソン境界をマップした。表１は、hMSH2エキソンのヌクレオチド座標を示す。この示された座標は、hMSH2 c DNA配列に基づいており、位置１を開始「ATG」の「A」に割り当てている（Ａは配列番号45におけるヌクレオチド番号１である。）本発明者らのゲノム配列決定研究によって、hMSH2遺伝子の非エキソン領域のヌクレオチド配列を決定することができた。配列番号82-113は、上流、下流、およびイントロンのhMSH2配列を示す。本発明者らのプライマーがハイブリダイズした部位内、そしてまた配列番号91内のポリ-Ａ領域内でもいくらかの配列の曖昧さが存在し得るが、配列番号82-113に示された各ヌクレオチド配列は、相補DN Aストランドの配列決定によっておよび/または一つより多くのプライマーを用いる配列決定によって確認された。配列番号157および114-144に示された各ヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号82-113に示された配列と比較すると、付加的な非エキソン配列を含む。配列番号157および114-144に示された付加的な非エキソン配列は、相補的なストランドの配列決定によって確認されておらず、そしてそれゆえ、いくつかの誤りを含み得る；しかしながら、これらの配列は、とりわけ、さらなる配列決定研究について、およびプライマー設計について有用な情究について、およびプライマー設計について有用な情報を提供する。本発明の他の局面において、これらのゲノム配列決定研究によって提供された情報によって、個々のhMSH2エキソンを増幅し得るヌクレオチドプライマーの設計が可能となった。本発明者らがゲノムDNAから個々のhMSH2エキソンを増幅するために用いたオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列を表２に示す。本発明者らは、ガン罹病性と相関し、および/または特定の個体における腫瘍発達と相関するhMSH2変異の発明者ら研究においてこれらのプライマーセットを使用した（下記を参照）。表２に示された各プライマーペアは、個々のエキソンの側面にある非エキソン配列にハイブリダイズする。当該分野で公知であるように、多様な異なるプライマーペアの任意が、個々のhMSH2エキソンを増幅するために使用され得る。たとえば、すべてのエキソンヌクレオチドが増幅されることが必須でない場合、エキソン配列にハイブリダイズするプライマーが使用され得る。多様なイントロン結合性のプライマーがそうし得るように、イントロン/エキソン境界を横切ってハイブリダイズするプライマーもまた使用され得る。本明細書中に提供されるhMSH2配列情報は、ガン罹病性と相関しおよび/または個体における腫瘍発達と相関するhMSH2変異の同定において使用するいかなる多様なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用され得、これらのプライマーは単一の生成物バンドで一つより多くのエキソン（および/または側面にある非エキソン配列）を増幅するプライマーを含む。最近の研究は、PCRが非常に大きな断片を増幅するために使用され得、そしておそらく完全な遺伝子を増幅するためにさえ使用され得ることを示している（Barnes Proc.Natl.Acad.Sci US A 91:2216-2220、1994；Cohen Science 263:1564-1565、1994参照）。当業者は、所望の断片または遺伝子を増幅する使用のためにPCRプライマーの設計（例えば、PCR Protocols：a Guide to Methods and Applications：Innis ら編、Acadamic Press、1990、本明細書に参考として援用される）に重要な考察に精通している。これらの考察は、先に論議されたように、配列決定プライマーの設計に含まれる考察に必ずしも同一ではないが、類似であり得る。一般的に、プライマーが相対的に特異的に（すなわち、約55℃より高い、そして好ましくはほぼ60℃のT_mを有する）ハイブリダイズすることが重要である。多くの場合、長さが約17と25との間のヌクレオチドのプライマーが良好に作用する。より長いプライマーがより長い断片を増幅するために有用であり得る。すべての場合において、ヒトゲノムにおいて一つより多くの配列に相補的なプライマーを用いることは避けるのが望ましく、その結果、各PCRプライマーペアは単一の正確な断片のみを増幅する。にもかかわらず、正確な生成物バンドがPCR反応において他の生成物バンドから区別されることが、唯一全く必要なことである。正確なPCR条件（例えば塩濃度、増幅ラウンドの数、使用されるDNAポリメラーゼのタイプなど）は、当該分野で知られているように、例えば、反応の収率または特異性を改善するために変動し得る。特に、本発明者らは、増幅特異性を改善するために、PCR反応においてネストされたプライマーを使用することが価値あることを見出した（実施例２を参照）。このアプローチによって、本発明者らはより少ない基質DNAを使用し、そしてまた増幅特異性を改善することができた。もちろん、本明細書に記載された同じアプローチを、ヒトでない真核生物からミスマッチ修復遺伝子のゲノム配列を同定するのに使用され得る。先に議論されたように、本発明者らは、本明細書中でmMSH2と呼ばれ、酵母およびヒトMSH2遺伝子に相同である、マウス遺伝子の配列を同定した。実施例10：ガン罹病性の診断ガン罹病性（susceptibility）を被験体に与える（すなわち、変異を有しない被験体がガンになる可能性よりも高い、ガンになる可能性を与える）変異は、その被験体の組織のいたるところに存在すること（すなわち、腫瘍組織に制限されない）および/または被験体の両親の少なくとも一方の生殖細胞株に存在することが予想される。腫瘍組織はまた、さらに別のミスマッチ修復遺伝子の変異をも含み得、この変異は、被験体の他の組織には存在せず、そして遺伝しなかったが、その腫瘍の発生には関与した（および/または必要であった）。（以下および、例えば、Parsonsら、Cell 75:1227-1236、1993を参照）。そのような腫瘍特異的変異の同定もまた価値があり、そして以下でさらに記載される。本発明者らは以前、hMSH2遺伝子がヒト第２染色体に位置すること、およびhMS H2内の変異がHNPCCに対する罹病性を与えるようであることを示した（Fishelら、前出参照）。本発明者らはこの考えを確認し、そしてhMSH2遺伝子の変異をHNP CC家系（lineage）におけるガンの発症と関連づける研究を報告する。従って本発明のさらに他の局面は、ミスマッチ修復遺伝子（例えばhMSH2）内の変異の同定を含み、そして特に、ガン罹病性と相関するミスマッチ修復遺伝子の変異の同定を含む。本発明者らは、一つの大きなHNPCC家系（家系図２；染色体2pに正の連鎖を示す拡張されたMuir-Torre血族(Hallら、Eur.J.Cancer 30A:180-182、1994)）を、 hMSH2遺伝子内の変異の存在について分析した。この家族の家系図を図１に示す。本発明者らは、この家族のメンバーが多くの異なる種類のガンにかかった（図１を参照）ことに注目する。このことは、この家族がDNA修復に関与する遺伝子（例えば、hMSH2）内の変異を有するという考えと一致する。この家族の21人のメンバーからのDNAサンプルは、イギリス、リードのセントジェイムズ大学病院の帝国ガン研究基金、遺伝疫学研究室のTimothy Bishop博士によって提供された。本発明者らは、二つの異なる直接配列決定法を使用してこの家族におけるhMSH2変異を検出した。第１に、個々のエキソンをPCR（表２からのプライマーを使用）によって増幅および精製した。精製されたエキソンを、Ta q DNAポリメラーゼおよびダイターミネーター（dye terminator）化学を用いて配列決定した（Fishelら、Cell 75:1027-1038、1993に記載された技術を参照）。第２に、個々のエキソンを、２セットのネステッドプライマー（nested prime r）を用いる増幅を含む多重プロトコルを使用して増幅した。最終PCR産物を磁気ビーズ上に捕獲し、Sequenase^TMおよびダイターミネーター化学を用いて配列決定した。影響を受けた個体（例えば、特徴的なガンになった個体および/または例えば、連鎖分析によって変異キャリアであることが示された個体）において、その配列は、多くの個々のヌクレオチド位置に２つのシグナルが存在する（図２を参照）ため、エキソン12内のヌクレオチド位置1985位のＡの後で解釈不能になった。連鎖分析によって変異キャリアでないと決定された、影響を受けない個体は、解釈不能な配列の領域を示さなかった。これらの結果は、影響を受けた個体がヌクレオチド1985位および1986位の欠失により引き起こされたフレームシフト変異についてヘテロ接合であるという考えと一致する。 Applied Biosystems 373（ABI 373）自動シークエンサーにスタンダードベースコーリングソフトウェアー（例えば、Gene Codes,Inc.から入手可能なSequenc her2.0と共に用いるApplied Biosystems,Inc.のSequence Analysis 1.2）を用いる、影響を受けた個体からの配列データの分析は、フレームシフト変異の存在、すなわちヌクレオチド位置1985位でのAT塩基対およびヌクレオチド位置1986位でのGC塩基対の欠失を確認した。この２-塩基対（bp）欠失によって、コードされたタンパク質のリーディングフレーム内にフレームシフトが引き起こされ、11アミノ酸後にポリペプチド鎖の終結が生じる。従って、この変異体hMSH2対立遺伝子は、Msh2の最も保存された領域（配列番号16に示されるように、hMsh2のアミノ酸662位〜934位（末端）に対応、図３を参照）を欠くタンパク質を産生することが予期された。興味深いことに、本発明者らは、異なる配列決定法がヘテロ接合配列の分析を可能にする点で異なることを見出した。明確には、本発明者らは、Taq DNAポリメラーゼ/ダイターミネーター化学を用いて見出されるヌクレオチド組み込みに比べて、Sequenase^TM/ダイプライマー化学が、より一様なヌクレオチド組み込みを生じ、従ってヘテロ接合性のより容易な検出が可能となることを見出した。家族１の影響を受けるメンバーにおいて同定された2bpの欠失は、エキソン12 内の新しいAfllll部位（ヌクレオチド位置1983位）を生じる。本発明者らは、DN Aが入手され、Afllllでの消化によって産物バンドを分析した、21人全ての家族メンバーからのエキソン12を増幅した。この変異体Afllllの消化パターン（約15 4、114、および57 bpの産物バンド）は、影響を受けた全ての個体から単離および増幅されたエキソン12 DNAにおいて観察された。これらの個体はまた、正常な Afllll制限パターン（約213および114bpの産物バンド）を示し、このことはこれらの個体が変異についてヘテロ接合であることを示す。対照的に、連鎖分析によってキャリアでないと予期された影響を受けない全ての個体は、正常なAfllll制限パターンのみを示した。従って、本発明者らは、ガン罹病性と相関する、hMSH2遺伝子内の変異を同定した。ガン罹病性と相関する他のhMSH2変異も、ミスマッチ修復遺伝子の配列情報を用いて同様に容易に同定され得る。実際、他の研究者は、本発明者らが以前に提供した配列情報に基づいて、そのようなhMSH2変異の同定に成功したことをすでに報告した。例えば、Leachら（Ce ll 75:1215-1225、1993、本明細書中に参考として援用）は、HNPCC家系において次のhMSH2変異を同定した。（i）プロリンに代えてのロイシンの置換を生じる、コドン622位（ヌクレオチド1865位）でのＣからＴへのトランジション；（ii）コドン265位〜314位（エキソン５）をメッセンジャーRNA（mRNA）から除く、推定スプライシングの欠損；および（iii）アルギニン残基に代えてのストップコドンの置換を生じる、コドン406 位（ヌクレオチド1216位）でのＣからＴへのトランジション本発明者らが提供した情報に基づき、当業者は、ガン罹病性と相関する別のhM SH2変異を容易に同定し得る。この同定された、ガン罹病性と関連したhMSH2変異のすべてがコード配列において見出されるわけではない（上記を参照）。hMSH2発現または活性のいかなるレベル（例えば、転写、スプライシング、翻訳、翻訳後改変、他のファクターとの関連など）にも影響する変異は、ガン罹病性に潜在的に寄与し得る。特に、上記で議論された、同定されたいくつかのhMSH2変異は、hMSH2プレメッセンジャー RNA（プレmRNA）のスプライシングにおける欠損を明らかに引き起こす。また、本明細書中に提供された情報によって、hMSH2遺伝子については、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位などの同定が可能となり、従ってhMSH2遺伝子産物（例えば、プレmRNA、mRNA、および/またはコードタンパク質）の発現に影響するような部位の変化の同定が可能となる。当該分野において公知の任意方法を使用して、hMSH2 DNAまたはRNAのヌクレオチド配列における変化を同定し得る。公知の方法は、直接配列解析（上記で議論されたように、PCR増幅によってしばしば補助される）、一本鎖コンホメーション多形性分析、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを含むがそれらに限られない（例えば、Grompeら、Nature Genetics 5:111-117、1993を参照）。スプライシングの欠損を引き起こす変異を、イントロン配列決定によって、および/ またはRNAの分析によって同定し得る。RNAを、例えば逆転写PCR（reverse-trans cription coupled PCR）または当該分野で公知の他の方法によって分析し得る（例えば、Leachら、前出；Grompeら前出；IkonenらPCR Methods and Application s 1:234-40、1992を参照）。いくつかの場合、hMSH2ヌクレオチド配列における変化を、ウェスタンブロットのような公知の方法および/または活性アッセイを用いるコードポリペプチドの分析によって同定し得る（Sambrookら、前出および以下に引用された参考文献を参照）。本発明者らが本明細書中で議論したように、hMSH2遺伝子は細菌mutS遺伝子と相同であり、この細菌mutS遺伝子は相同体ミスマッチ修復経路の部分である。多分、この経路に関与する他の細菌遺伝子のヒト相同体（例えば、mutL、mutH、mu tU(uvrD)など）もまた存在するが、特に、ほとんどの真核細胞が、E.coliによって用いられる同じメチル化系を利用し得ない場合には、異なるファクターは等しく保存され得ない（例えば、Proffittら、Mol.Cell.Biol.4:985-988、1984；Har eら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82:7350-7354、1985;Thomasら、J.Biol.Chem.、 266:3744-3751、1991；Holmesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82;5837-5841、199 0を参照）。本発明者らは、このような相同体を同定する方法を教示し、他の相同体における変異がガンに対する罹病性を与え得ることを示唆した。実際、本明細書中に記載されたアプローチを、E.coli mutL遺伝子にうまく適用し、そして相同体ヒト遺伝子であるhMLH1を同定した（Bronnerら、Nature 368 :258-261、1994；Papadopoulosら、Science 263:1625-1629、1994を参照、いずれも本明細書中に参考として援用される）。hMLH1遺伝子のcDNA配列は配列番号1 24として示され、そして受託番号第007343号としてGenBankに見出され得る。HNP CC家系におけるガンの発症と相関するhMLH1における変異もまた同定した。特に、Bronnerら（前出）は、HNPCCに対する罹病性と相関する、hMLH1における以下の変異を見出した：（i）ヌクレオチド131位でのＣからＴへのトランジション；このタンパク質の高度に保存された領域であるエキソン２中（図４を参照）。 Paradopoulosら（前出）は、HNPCC罹病性と相関する以下の変異を見出した。（i）いくつかの高度に保存されたアミノ酸を含む、エキソン16（コドン578位〜632位）の欠失（図４を参照）；（ii）エキソン19における2179位〜2182位の４個のヌクレオチドの欠失、これは、フレームシフトを生じ続いて新たなストップコドンを生じる；（iii）エキソン19における2266位の後（コドン755位と756位との間）に４個のヌクレオチドの挿入、これは、オープンリーディングフレームのフレームシフトおよび伸張を生じる；および（iv）1038位の後から始まる371個のヌクレオチドの欠失、これは、フレームシフトを生じ続いて新たなストップコドンを生じると報告されている。この変異は、hMLH1エキソン12の欠失を反映するらしく、そしてエキソンスキッピングを生じるスプライシングの欠損を示し得る。本発明者らが提供する情報に基づき、当業者は、ガン罹病性と相関する別のミスマッチ修復遺伝子変異を同様に容易に同定し得る。上記のように、ミスマッチ修復遺伝子における変異は、HNPCC以外の遺伝性ガンに対する罹病性を与え得るようである。特に、ミスマッチ修復遺伝子における変異は、短い反復DNA配列のゲノム不安定性を示す遺伝性ガンに対する罹病性を与え得るようである（例えば、Aaltonenら、Science 260:812-816、1993;Thibod eauら、Science 260:816-819、1993；Strandら、Nature 365:274-276、1993、Ho nchelら、Cancer Res.、54:1159-1163、1994；Risingerら、Cancer Res.、53:51 00-5103、1993；Ionovら、Nature 260:558-561、1993；Hanら、Cancer Res．53: 5087-5089、1993;Merloら、Cancer Res．54:2098-2101、1994を参照）。このような遺伝性ガンを、公知の方法（例えば、Aaltonenら、前出；Thibodeauら、前出；Strandら、前出；Risingerら、前出；Ionovら、前出；Hanら、前出を参照）に従って腫瘍組織における反復不安定性の分析によって同定し得る。次いで、このようなガンに対する罹病性の診断は、ガン罹病性と相関するミスマッチ修復遺伝子における変異を同定すること、および同定されたミスマッチ修復遺伝子の変異の存在について、個体を（本明細書中に示された方法を含む利用可能な方法を用いて）スクリーニングすることによって行われ得る。実施例11：ミスマッチ修復欠損腫瘍の同定および特徴付け本明細書中に記載されたように、被験体においてガン罹病性を診断する際に有用であることに加えて、細菌ミスマッチ修復遺伝子に相同なヌクレオチド配列は、特に、ミスマッチ修復欠損腫瘍の同定および特徴付けにおける使用について価値があり得る。このような同定および特徴付けは、価値あるものである。なぜなら、ミスマッチ修復欠損腫瘍が、特定の治療養生法により良く応答しているからである。例えば、ミスマッチ修復欠損腫瘍は、特に、他の治療薬剤と併用して投与される場合、DNA損傷薬剤に対して敏感であり得る。ミスマッチ修復遺伝子における欠損は、個体の組織じゅうに存在してその個体における腫瘍形成に寄与する必要はない。特定の細胞または組織におけるミスマッチ修復遺伝子の自然変異は、その組織における腫瘍形成に寄与し得る。実際、少なくともいくつかの場合には、ミスマッチ修復遺伝子内の一つの変異は、腫瘍発生には十分ではない（例えば、Parsonら、前出、参照）。そのような場合、ミスマッチ腫瘍遺伝子内に１つの変異を有する個体はガンにかかり易いが、第２の変異が起こるまで腫瘍を発生し得ない。さらに、いくつかの場合には、個体において厳密に腫瘍と関連する同じミスマッチ修復遺伝子変異は、ガンの発生に対する遺伝的な素因（predisposition）を有する家族においてガン罹病性を与える原因である。本発明のさらに別の局面において、本発明者らが提供した配列情報を、当該分野で公知の方法および本明細書中で提供された方法と共に用いて、腫瘍（または腫瘍細胞株）を分析し、ミスマッチ修復遺伝子における腫瘍関連変異を同定し得る。好ましくは、これらの腫瘍関連変異が同じ個体由来の非腫瘍組織に存在しないことを示すことが可能である。本発明者らが本明細書中で提供した情報は、短い反復DNAエレメントのゲノム不安定性を示す、腫瘍（または腫瘍細胞株）内でのミスマッチ修復遺伝子変異の同定に特に有用である。実際、そのような研究は、hMSH2およびhMLH1遺伝子について、すでに首尾良く実行されている。Leachら（前出）は、２つのhMSH2変異を同定した。これらの変異は、短い反復ゲノム配列の不安定性を示す腫瘍（例えば、「RER+」腫瘍）と関連する。実際、Leachらによって分析された腫瘍は、HNPCC家族由来であった。この腫瘍から単離された両方のhMSH2対立遺伝子は変異を含んでいた。多分、一方の変異が遺伝し、そしてそのHNPCC家系においてガン罹病性の原因であり、他方が腫瘍発生に関与する二次的な腫瘍特異的変異であった。 Leachら（前出）によって同定された変異は以下の通りである：（i）コドン639位（ヌクレオチド1915位）におけるＣからＴへのトランジション、これはヒスチジンに代えてのチロシンの置換を生じる；および（ii）コドン663位（ヌクレオチド位置1987位）におけるＡ残基に代えてTGジヌクレオチドの置換、これは、フレームシフトを生じ、36ヌクレオチド下流で終結コドンを生じる。 Papadopoulosら（前出）は、マイクロサテライト不安定性を示す結腸腫瘍由来の細胞株において以下のhMLH1変異を同定した：（i）コドン252位（ヌクレオチド位置755位）でのＣからＡへのトランスバージョン、これはSer残基をストップコドンで置換する。この研究において、この腫瘍組織は野生型hMLH1対立遺伝子を含まなかった。変異対多形性ガン罹病性の研究のためならびに腫瘍の同定および特徴付けのためには、「変異」を「多形性」と区別することが重要である。「変異」は、遺伝子の「非野生型対立遺伝子」を生じる。遺伝子の非野生型対立遺伝子は、通常細胞内で機能しない転写物および/またはタンパク質産物を生じる（上記の定義を参照）。「変異」は、挿入、欠失、置換、および再配列を含む、ヌクレオチド配列におけるいかなる変化でもあり得る。一方、「多形性」は、正常に機能する（すなわち、「野生型」）遺伝子の集団内に見出される配列の差異である。いくつかの多形性は、核酸コードの縮重に起因する。すなわち、ほとんどのアミノ酸が１つより多くの三重コドンによってコードされるので、多くの異なるヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードし得る。他の多形性は、遺伝子またはコードポリペプチドの機能に対し重大な効果を有しない、単なる配列の差異である。例えば、ポリペプチドはしばしば、ポリペプチドの機能を顕著に改変することなく、アミノ酸配列における小さな挿入または欠失、あるいは「保存的」置換を許容し得る。「保存的」置換は、特定のアミノ酸を類似の化学的特性を有する別のアミノ酸によって置換する置換である。例えば、アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む「非極性（疎水性）」；グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む「極性中性」；アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む「正に荷電した（塩基性）」；およびアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む「負に荷電した（酸性）」としてしばしば分類される。あるアミノ酸を同じグループの別のアミノ酸に代えて置換することは、一般には、特に２つの関連するアミノ酸の側鎖（side group）が同様な大きさを有する場合には、「保存的」であると考えられる。ミスマッチ修復遺伝子配列における変異または多形性を同定する際の最初の工程は、本明細書中に記載された技術を含む利用可能な技術を用いる、ミスマッチ修復遺伝子（または遺伝子フラグメント）配列の同定を含む。この配列は、同じミスマッチ修復遺伝子（または遺伝子フラグメント）の既知の、正常な（例えば、野生型）配列とは異なる。例えば、配列番号45または65〜113のいずれかのような既知で正常な（例えば、野生型）hMSH2配列とは少なくとも１つのヌクレオチド位置で異なるhMSH2遺伝子（または遺伝子フラグメント）配列を同定し得る。変異は、様々な方法のいずれかを用いて多型性と区別され得、おそらく最もの直接的な方法はデータ収集および腫瘍の発達との相互関係である（上記を参照のこと）。すなわち、例えば、そのhMSH２遺伝子配列が配列番号45または65〜113 に報告されている配列と異なるが、癌を有しておらず、そして癌の家系（family history）を有しない被験体が同定され得る。特に、その被験体のファミリーの他のメンバー（好ましくは年長者）が同様に配列番号45または65〜113と異なるh MSH2遺伝子配列を有している場合、被験体のhMSH2遺伝子配列は「多型性」として分類され得るようである。他の関連しない個体が同一のhMSH2遺伝子配列を有すると同定され、そして癌の家系でない場合、この分類が確認され得る。癌に対する遺伝的罹病性を与える原因である変異が同定され得る。なぜなら、なかんずく、このような変異は影響を受けた個体のすべての組織中およびその個体の両親の少なくとも１人の生殖系列中に存在するようであり、さらに癌の経歴を有しない関連しないファミリー中に見出されないようである。変異を多型性と区別する場合、少なくとも１つの既知のミスマッチ修復遺伝子変異の存在下で特定の配列の違いを評価することはしばしば有益であり得る。いくつかの場合において、特定の配列変化は、単独でアッセイされたとき検出可能な効果を有しないが（すなわち、多型性であるように見える）、例えば、見かけの多型性の違いおよび既知の変異の両方を有する個体が、変異のみを有する個体よりも発達する癌の高い蓋然性を有するように既知変異の浸透度を増大させる。このような効果を有する配列の違いは、弱いとはいえ変異であると適切に考えられる。上記のように、ミスマッチ修復遺伝子あるいは遺伝子産物中の変異は、これらの遺伝子あるいは遺伝子産物の非野生型版を生産する。いくつかの変異はそれ故、インビボあるいはインビトロミスマッチ修復アッセイにおけるそれらの機能的特徴によって多型性と区別され得る。任意の利用可能なミスマッチ修復アッセイがこれらの特徴を分析するために使用され得る（例えば、実施例９〜12を参照のこと；Bishopら,Mol.Cell.Biol.6,3401-3409,1986;Folgerら,Mol.Cell.Biol.5,7 0-74,1985;T.C.Brownら,Cell 54,705-711,1988;T.C.Brownら,Genome 31,578-583 ,1989;C.Muster-Nassalら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,7618-7622,1986;I.Var letら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,7883-7887,1990;D.C.Thomasら,J.Biol.Che m.266,3744-3751,1991;J.J.Holmesら,Proc.Natl1.Acad.Sci.U.S.A.87,5837-5841 ,1990;P.Branchら,Nature 362,652-654,1993;A.Katら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S. A.90,6424-6428,1993;K.Wiebauerら,Nature 339,234-236,1989;K.Wiebauerら,Pr oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,5842-5845,1990;P.Neddermannら,J.Biol.Chem.268, 21218-24,1993;Kramerら,Mol.Cell.Biol.9:4432-40,1989;Kramerら,J.Bacteriol .171:5339-5346,1989およびそれらに引用される文献もまた参照のこと）。配列変化を多型性として分類する前に、一般に、１つよりも多いミスマッチ修復アッセイを利用することが望ましい。なぜなら、いくつかの変異はすべてのアッセイにおいて観察されない影響を有するから。例えば、本明細書に論議されるように、変異を含むミスマッチ修復遺伝子が、宿主細胞において、その細胞中におけるミスマッチ修復に検出可能に影響を与えることなく同一遺伝子の内因性のコピーを置換し得ることは予期されない；その一方、配列多型性を含むミスマッチ修復遺伝子が、宿主細胞において、その細胞におけるミスマッチ修復に、検出可能に影響することなく同一遺伝子の内因性のコピーを置換し得ることが予期され得る。本発明者らは、このような「置換」研究については、一般に、例えば、１つの種からの遺伝子産物が、別の種からの他のミスマッチ修復遺伝子産物と相互作用できないことに起因する複雑さを避けるために、試験されるべき遺伝子を、試験遺伝子が由来する細胞と同一（あるいは少なくとも密接に関連する）種の宿主細胞中へ導入することが望ましいことに注目する。同様に、変異体ミスマッチ修復タンパク質は、インビトロミスマッチ修復システム（好ましくは、関連生物由来）において正常に機能することは予期され得ない；その一方、多型性ミスマッチ修復タンパク質は正常に機能することが予期され得る。特に、いくつかのhMsh２変異体タンパク質は、おそらくミスマッチ塩基対に結合する能力を失っている。本発明者らは、本明細書に記載の方法が異なる種類のミスマッチ修復遺伝子変異の同定を可能にすることに注目する。特に、いずれかの特定の理論により拘束されることを望まずに、本発明者らはいくつかのミスマッチ修復遺伝子変異が細胞におけるミスマッチ修復の効率および／または正確さを実際に改良し得ることが可能であるということを指摘する。いくつかのこのような変異が、癌に対する罹病性を与えることおよび／または腫瘍発達に関係することはおそらく期待され得ない。多型性からミスマッチ修復遺伝子変異を区別するために使用され得る特に好ましいアッセイは以下の実施例１２〜１５に示される。いくつかの場合では、特定のミスマッチ修復遺伝子配列改変の影響について測定するとき、１つより多いこれらのアッセイを使用することが有益であり得る。コードされたhMsh２タンパク質がミスマッチ塩基対に結合する能力に影響するhMSH２遺伝子における変異を同定するために、例えば、以下の実施例１２に記載の「優性変異誘発アッセイ」が実施例１３に記載の「ミスマッチ結合アッセイ」と有利に組み合わされ得る。もちろん、これらのアッセイもまた、実験室で加工され、そしてHNPPC（あるいは、他の癌罹病性）系統および／または腫瘍と関連することが必ずしも知られていないミスマッチ修復遺伝子配列改変の影響を決定するために使用され得る。本発明者らは、ヒトミスマッチ修復遺伝子において同定される様々な変異をすでに論議した。同一の研究がまた、ヒトミスマッチ修復遺伝子多型性を同定した。特に、上記の本発明者らの配列決定研究は、hMSH2遺伝子における以下の多型性を同定した：（ｉ）配列番号45に示すhMSH２ cDNA配列の位置399でのＣまたはＴ。 Leachら、上述、もまた以下のhMSH２多型性を同定している：（ｉ）エキソン13の６bp上流のポリピリミジン領域におけるＣからＴへの転位（このエキソンは配列番号45に示すhMSH２ cDNA配列のヌクレオチド位置2006で始まる）。本発明者らは、同一のＣからＴへの転位がFishelら、上述、によって同定され、そしてこの変化が真に発現しない（silent）多型性でない可能性があることに注目する。すなわち、この変化は、実際、弱い変異であり得、例えば、細胞がさらなるミスマッチ修復欠陥を含まなければ、この影響は明らかではない（または有意ではない）。例えば、他のミスマッチ修復遺伝子変異（特にhMSH２遺伝子変異）は、細胞においてより劇的な表現型を有し得、またこのＣからＴへの遷移（例えば、この遷移は他の変異の浸透度を増加させ得る）を有する。本発明者らの研究は、位置2006 MSH２（配列番号45）（エキソン13、配列番号 78）の６塩基上流のイントロンスプライス受容体部位におけるＴに対するＣの置換が多型性であることを示す。本発明者らの研究はまた、MSH２遺伝子（配列番号45）のコドン596を除去する３つの塩基対の欠失が結腸癌の指標であることを示す。さらに、本発明者らの研究はまた、MSH２遺伝子（配列番号45）のヌクレオチド位置1801でのＣからＴへの変化が、GLNコドン601の代わりにナンセンスコドンを生成し、その一方、ヌクレオチド位置1985および1986での２bp、AGの欠失は、フレームシフトを生成することを示す。これらの変異は癌の指標である。ミュア−トール症候群（Muir-Torre syndrome）はリンチ症候群（Lynch syndr ome）（Lynchら、Br.J.Dermatol 118:295-801(1985)）の変種と考えられており、そしてこれはミュア−トール血族の最近の連鎖研究により支持されている（Ha llら、Eur.J.Cancer 30A:180-182）。本発明者らはmsh２変異の存在について２人のミュア−トール血族を分析し、そして上で議論したMSH２のエキソン12におけるナンセンス変異およびフレームシフト変異（それらは、これらの血族において癌罹病性の遺伝と連鎖している）を同定した。これらの変異の両方とも、MSH ２の大部分の保存領域を欠く短縮型MSH２タンパク質の合成に至ることが予期されている（Fishelら、Cell 75:1027-1038(1993)、Leachら、Cell,75:1215-1225( 1993)）。インビトロ変異研究は、この保存領域が機能性タンパク質の産生に必須であるATP結合部位を含むことを示した（HaberおよびWalker、EMBO J.10:2707 -2715(1991)）。従って、これらの血族において、影響されたメンバーは非機能性タンパク質を産生するMSH２遺伝子の１つのコピーを遺伝する；おそらく、MSH ２の第２番目のコピーの損失が進行して腫瘍細胞になる修復欠陥細胞に至る。本明細書で発明者らにより提供される情報を用いて、当業者はミスマッチ修復遺伝子および遺伝子産物における他の変異および多型性を容易に同定し得る。実施例１２：優性変異誘発アッセイ hMSH２遺伝子をバクテリア細胞（特に、E.coli細胞）に導入することは、優性変異誘発表現型（Fishelら、1993、上述）を生じる。類似の優性変異誘発表現型が、S.pneumonae MutS相同体であるHexAが、E.coli中で発現されるときに観察されている（Prudhommeら、J.Bacteriol.173:7196-203,1991を参照のこと）。この効果の適当な説明は、異種MutS相同体（例えば、HexAまたはhMsh２）がE.coli細胞中のミスマッチ塩基対に結合し得るが、E.coliミスマッチ修復システムの他の成分と（すなわち、MutL、MutH、などと）生産的に相互作用せず、それ故それらが結合するミスマッチ塩基対の修復を妨げることである。本発明者らは、MSH２配列改変（例えば、HNPCC血族において同定されているか、あるいは特定の腫瘍と関連していることが見い出されているような）が導入され得る発現構築物pTTQ18-MSH２を開発した。pTTQ18-MSH２は、改変されてそのＮ末端に有用なクローニング部位を有するpTTQ18（Stark Gene 51:255-267,1987）に hMSH２ cDNA配列（配列番号１）を挿入することにより得られる。 pTTQ18ベクターへの１つの利点は、それがIPTGにより十分に誘導され得、そしてIPTGがない場合完全に「オフ（off）」に見える（すなわち、低レベルでさえ発現していないように見える）ことである。これらの特徴は有益である。なぜなら、IPTGで誘導する前の低レベルの発現でさえ、誘起後に分析された結果の解釈を複雑にし得る変異の蓄積を誘導し得、および／または、例えば、ベクターからの発現レベルあるいはベクターのコピー数に影響し得るからである。簡単に述べれば、hMSH２配列改変は、当該分野で公知の、PCRプロトコル（例えば、PCR protocols：A guide to methods and applications、Innisら編、Aca demic Press,San Diego,CA,1990;PCR Technology:Principles and applications for DNA amplification、Erlichら編、Stockton Press,NY，NY，1989を参照のこと）を含む任意の技術（例えば、本明細書に参考として援用される、Sambrook ら、上述;Directed Mutagenesis、McPherson編、IRL Press at Oxford Universi ty Press,1991を参照のこと）を用いてpTTQ18-MSH２発現中に導入される。改変構築物は、例えば、Applied Biosystem 373Aシークエンサーの（利用可能な36のうち）15レーンを用いて、それらが所望の変化のみを含むことが確かであるように配列決定され得る。改変構築物は、次いで、バクテリア中に形質転換され、そしてRif^r変異の蓄積率が公知の技術（例えば、Prudhommeら、上述；Fishelら、上述）を用いて測定され、そして改変されていない構築物の存在下で観察された率と比較される。各改変構築物について少なくとも５つの独立した形質転換体を分析することが望ましい。Rif^r変異の蓄積率における約10倍の減少が、配列改変が変異として分類されるhMSH２機能における十分な減少であると考えられる。実施例１３：ミスマッチ結合アッセイ特定のhMSH２配列変化がhMSH２遺伝子または遺伝子産物の機能に対して有する影響をアッセイし、そしてそれによりこれらの配列変化を「変異」あるいは「多型性」として分類する他の方法は、コードされたhMSH２タンパク質がミスマッチ塩基対に結合する能力をアッセイすることである。 hMsh２タンパク質が過剰生産され、そしてhMSH２のＮ末端でhexa-HISおよび第 Xa因子リーダーペプチドを含むpETベクター誘導体構築物（Invitrogen、San Die go,CA）を用いてE.coliから実質的に精製される。清澄化されたバクテリア抽出物を調製し、次いでニッケルNTAカラム（Qiagen,Chatsworth,CA）上でカラムクロマトグラフィーにより、SDS-PAGEゲル電気泳動により判定された純度50％以上のhMsh２タンパク質の500倍の濃縮物を得た。ヒトミスマッチ修復タンパク質によるミスマッチ結合は、ゲルシフト結合アッセイを用いて研究された。簡単に述べれば、タンパク質画分を、分子内相互作用を最小にするように設計され、そしてまた位置20にGTミスマッチを含む³²Ｐ-標識39−塩基対オリゴヌクレオチド二本鎖（Oligo Designs）とインキュベートする。インキュベーションは23℃で10分間、20mM Tris（pH7.5）、50mM KCl、１mM DTT、および0.1mM EDTA中で行い、タンパク質-DNA複合体の形成を可能とした。いくつかの異なる競合核酸（例えば、ポリdI-dC、そうでなければミスマッチを欠いた同一の39マー、および／または未標識ミスマッチ基質）を非特異性結合を最小にするために添加した。反応物を、次いで、６％アクリルアミドゲル（TBE 中）に負荷し、そして電気泳動した。結果は、hMsh２はミスマッチを含むオリゴヌクレオチドDNAに特異的に結合することを示した。結果は、さらに、hMsh２に対するミスマッチ結合のオンオフ率がホモ二本鎖DNAについてよりもミスマッチを含むDNAについての方が１オーダー遅くあり得、しかも、上記の方法により生産されたhMsh２タンパク質が凍結に対して安定であり、37℃で４時間までのインキュベーション時間の間安定であり、hexa-HISリーダーペプチドが開裂せずに、検出可能なミスマッチ結合活性を示し、そして多重ヌクレオチドの、ループミスマッチを含むDNAに対して高い親和性を有することを示した。「ミスマッチ結合アッセイ」はまた、hMLH１遺伝子配列における変異を同定するために使用され得る。上記のhMSH２過剰生産体に類似のpETを基礎にした発現ベクターを、hMLH１を過剰生産するために構築した。このようなpET-hMLH１構築物を含むE.coli細胞から調製され清澄化バクテリア抽出物は、上記のhMsh２ミスマッチ複合体を「スーパーシフト」（すなわち、高分子量シフトを産生する）し得る。この観察は、hMsh２とhMlh１タンパク質とが互いに相互作用することを示し、そしてhMLH１および／またはhMSH２において、hMsh２およびhMlh１タンパク質の相互作用を破壊するかまたは促進する変異を同定するための基礎を提供する。例えば、hMsh２ミスマッチ複合体をスーパシフトしないか、あるいは減少したかあるいは増加した範囲に、あるいは異なる位置それをにスーパーシフトするhM lh１タンパク質の生産を生じるhMLH１遺伝子配列（例えば、配列番号155）における変化はhMLH１変異として分類され得る。同様に、ミスペアに結合し得るが、 hMlh１との相互作用によりスーパーシフトし得ない、または減少したかあるいは増加した範囲に、または異なる位置にスーパーシフトされるMsh２タンパク質の生産を生じるhMSH２遺伝子配列（例えば、配列番号45および82〜113）における配列変化はhMSH２変異として分類され得る。スーパーシフトの範囲およびスーパーシフトしたバンドの位置に影響しないhMLH１およびhMSH２配列変化は多型性であるようである。しかし、個々のミスマッチ修復活性アッセイ（例えば、このミスマッチ結合アッセイ）は、代表的には、ミスマッチ修復成分あるいは複数成分のただ１つの、あるいは多少の局面、あるいは活性を試験するとすれば、配列変化を、多型性として、対、変異として明確に分類する前に、複数の異なる活性アッセイを行うこと、好ましくはミスマッチ修復活性の異なる局面を検出することがしばしば望ましい。実施例１４：タンパク質−タンパク質相互作用アッセイ：hMsh２-hMlh１相互作用に対する遺伝学的アッセイタンパク質−タンパク質相互作用アッセイがまた、ミスマッチ修復遺伝子における配列改変を分析するため、およびそれらを変異または多型性として分類するために使用され得る。E.coliにおいて、MutLタンパク質は、MutSがミスマッチを含むDNAに結合しているときに観察されるフットプリントのサイズを増加する。M utLは、ミスマッチに結合したMutSタンパク質と、近くのDam部位に結合したMutH タンパク質との間の架橋として作用するようである。酵母ツーハイブリッドシステムが、バクテリアMutSおよびMutLタンパク質のように、hMsh２とhMlh１タンパク質とが互いに相互作用することを示すために使用される。特に、hMsh２タンパク質はGal４（pAS１-hMSH２）のDNA結合ドメインに融合され、そしてhMlh１タンパク質はGal４（pACTII-hMLH１）の活性化ドメインに融合された（Harperら、Cell 75:805-16,1993）。GAL４プロモーターはβ−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子の上流にあるように構築された。インタクトな Gal４タンパク質はこのβ−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子の転写を活性化し、青色コロニーを生成し、ここでは、β−ガラクトシダーゼ活性が顕著に増大（代表的には数1、000倍）する。Gal４DNA結合ドメインとGal４活性化ドメインとが互いに分離しているとき、β−ガラクトシダーゼ発現の活性化は起こらない。しかし、これらのドメインが互いに相互作用するタンパク質への融合により一緒にされる場合（この場合、hMsh２およびhMlh１への融合による）、β−ガラクトシダーゼ発現の活性化が観察される。（Gal４結合ドメイン）−hMsh２融合または（Gal４活性化ドメイン）−hMlh１融合のいずれも、単独ではβ−ガラクトシダーゼ活性を刺激しない。しかし、両方の構築物が同一の細胞に存在する場合、β−ガラクトシダーゼ活性は約100倍増加する。hMSH２あるいはMLH１における変異は、それ故、このツーハイブリッドアッセイシステムにおけるβ−ガラクトシダーゼ発現に対するそれらの定量的効果により同定され得る。このアッセイにおいて約２倍の減少より大きいかあるいは同等のβ−ガラクトシダーゼ活性を生じるhMSH２あるいはhMLH１配列改変は、多型性よりもむしろ変異として分類され得る。このアッセイにおいて約２倍の増加より大きいかあるいは同等のβ−ガラクトシダーゼ活性を生じるhMSH２あるいはhMLH１配列改変もまた変異を表すようである。このアッセイにおいて検出されるβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルに影響しないhMSH2あるいはhMLH１配列改変は多型性であるようである。しかし、個々のミスマッチ修復活性アッセイ（例えば、このツーハイブリッドアッセイ）は、代表的には、ミスマッチ修復成分または複数成分のただ１つのまたは多少の局面、または活性を試験するとすれば、複数の異なる活性アッセイを行うこと、好ましくはミスマッチ修復活性の異なる局面を検出することがしばしば望ましい。実施例１５：相同酵母遺伝子における類似の変化の影響を調査することによる、ヒトミスマッチ修復遺伝子における可能な変異の分析多型性を変異と区別する他の可能な方法は、検出可能な表現型がミスマッチ修復遺伝子の制御下にあるアッセイシステムを利用することである。すなわち、特定の挙動が機能的ミスマッチ修復遺伝子を必要とし、そしてその挙動における変化が検出可能である任意のシステムが、異なるミスマッチ修復遺伝子対立遺伝子を「変異体」あるいは「多型性」として分類するために使用され得る。特に、Saccharomyces cerevisiae系を、ミスマッチ修復経路に対する特定の変異の影響を定量的に分析するために使用し得る。酵母ミスマッチ修復遺伝子とそれらの既知ヒト相同体との間の比較的高い保存レベルが与えられれば（例えば、酵母とヒトMSH２との間、および酵母とヒトMLH１との間；図３および４を参照のこと）、多くの場合、HNPCC血族におけるヒトミスマッチ修復遺伝子において観察される配列変化と同等であるS.cerevisiaeミスマッチ修復遺伝子において変化させることが可能であるようである。これらの変化の影響は、次いで、酵母系において研究され得、それらについて配列変化が変異あるいは多型性を示すどうかを決定するために、ミスマッチ修復アッセイが十分に特徴づけられる（例えば、 D.K.Bishopら、Mol.Cell.Biol.6,3401-3409,1986;E.Alaniら、Genetics 137,19- 39,1994;R.A.G.Reenanら、Genetics 132,963-973,1992;R.A.G.Reenanら、Geneti cs 132,975-985,1992;L.Newら、Mol.Gen.Genet.239,97-108,1993;E.Alaniら、J. Biol.Chem.準備中、1994;N.-W.Chi,J.Biol.Chem.投稿中、1994;T.A.Prollaら、S cience 準備中、1994;M.Strandら、Nature 365,274-276,1993を参照のこと）。この種のアプローチは、すべての既知のミスマッチ修復遺伝子相同体間に保存されており、そして保存されたアミノ酸残基の一区画内に見い出される位置でのアミノ酸残基の置換を生じる配列変化について最もうまくいくようである。様々な癌に対する罹病性を与える原因であり、および／または腫瘍発達に関連する多くのこのような変異が存在するようである。例えば、コドン622での上記のHNPCC関連hMSH２のＣからＴへの転位は、11の既知MSH遺伝子のうち11で保存されているアミノ酸残基（Pro 622）の置換を生じる。同様に、ヌクレオチド位置番号1915での腫瘍に関連するhMSH２のＣからＴへの転位は（上記を参照せよ）、チロシン残基のヒスチジン639（His 639）との置換を生じる。His 639は11の既知MSH遺伝子のうち10で保存されている；そしてhMLH １のSer 44からPheへの変化は高度に保存された残基に影響する。これらの同一のアミノ酸変化が、単一のヌクレオチドを改変することにより対応するS.cerevisi ae遺伝子で作成され得る。ナンセンスおよびフレームシフト変異（そこでは、変異が短縮型タンパク質の合成に至る）の場合、変異がS.cerevisiae遺伝子中に作成され、変異体ヒト遺伝子により産生されるタンパク質と類似である短縮型タンパク質を産出し得、そこでは本質的に同一の領域が両方のタンパク質から除去されている。例えば、上記hMSH２ヌクレオチド1985および1986の２塩基対の欠失が、酵母系において再生され得る。この変異は、hMsh２アミノ酸番号663（配列番号２を参照のこと）で始まる11の新規なアミノ酸を導入するフレームシフトを生じ、そして、次いで、ポリペプチド鎖を未成熟で終結させ、hMsh２タンパク質の最も高度に保存された領域を除去する（図３を参照のこと）。類似のS.cerevisiaeヌクレオチドの２塩基対の欠失は、未成熟の翻訳停止によりタンパク質の保存された領域を除去し、そしてそのＣ末端で11の新規なアミノ酸を有する変異体タンパク質を産生する類似のフレームシフト変異を引き起す。S.cerevisiae変異体タンパク質に導入される11のアミノ酸のうちの５つは、hMsh２の変異形態に導入された対応するアミノ酸と同一である。 S.cerevisiae系において研究され得るこのような変異の第２の例は、上記のAr g406からオパール停止コドンへの変化である。アンバー停止コドンを導入する類似の変化が、S.cerevisiae遺伝子の類似のコドンにおいて容易に作成され得、類似の短縮型タンパク質の産生を生じる。小さな、インフレーム欠失変異がまた、変異体ヒト遺伝子により産生されるタンパク質と全く類似である変異体タンパク質を産生するために酵母遺伝子において作成され得る。この例は、エキソン５のスキッピングを生じ、その結果アミノ酸265〜314が欠失される変異体タンパク質を生じるhMSH２スプライス部位変異である。この場合、インフレーム欠失はS.cerevisiae遺伝子において作成され得、対応するアミノ酸が欠失したタンパク質の合成を生じる。ミスマッチ修復遺伝子配列を分析し、かつ変異対多型性を同定するための他の方法は、酵母株を利用すること（ここで、ミスマッチ修復は、機能的ヒトミスマッチ修復タンパク質および／または機能的酵母／ヒトキメラミスマッチ修復タンパク質に依存する）である。これらのタイプの研究は、標準プラスミド発現系を用いて行われ得る。例えば、S.cerevisiae MSH２およびMLH１遺伝子は、それらの天然プロモーターの制御下で、様々な選択マーカーを含む低コピー数CENベクター上にクローン化されている。選択された変異が、目的の変異を導入するために標準の部位特異的変異誘発技術を用いてこれらの遺伝子中に作成され得る。配列決定研究は変異の存在を確認し得、そしてさらなる変異が導入されていないこともまた証明し得る。変異したmsh２プラスミドは、次いで同質遺伝子野生型およびmsh２ヌル（null ）変異株に形質転換され得る；そして変異したmlh１変異体プラスミドは同質遺伝子野生型およびmlh１ヌル変異株に形質転換され得る。コントロール株はクローニングベクターで形質転換された同質遺伝子野生型、msh２ヌル変異株およびm lh１ヌル変異株；野生型MSH２プラスミドで形質転換された同質遺伝子野生型およびmsh２ヌル変異株；および野生型MLH１プラスミドで形質転換された同質遺伝子野生型およびmlh１ヌル変異株を含み得る。得られる株のすべては、導入されたヌクレオチド変化の影響を測定するために、例えば、彷徨変異分析、および例えば以下の確立された変異誘発アッセイを用いて試験され得る：１）カナバニン耐性に対する前進変異（R.A.G.Reenanら、Genetics 132,963-9 73,1992;R.A.G.Reenanら、Genetics 132,975-985,1992を参照のこと）；２）LYS２におけるフレームシフト変異の復帰（L.Newら、Mol.Gen.Genet.239, 97-108,1993を参照のこと）；および３）CA反復を含むプラスミドベクターを用いるCA反復不安定性（Strandら、Na ture 365:274-276,1993を参照のこと）。変異体表現型の存在あるいは非存在、および範囲は、これらの変異したプラスミドで形質転換されたヌル株に対するこれらのアッセイの結果を、適切なミスマッチ修復遺伝子の野生型対立遺伝子で形質転換されたヌル株に対するこれらのアッセイの結果および／または野生型（すなわち、ヌルでない）株に見い出される結果と比較することにより測定され得る。一般に、変異したプラスミドを含む株における増大した自発変異率は、プラスミド上のミスマッチ修復遺伝子における変化が変異である（そして多型性ではない）ことを示す。さらに、異なるミスマッチ修復遺伝子変異株で形質転換された菌株について観察された自然変異率の比較は、変異の相対的重症度（より強い変異はより高い変異率を生じる）の決定を可能にする。変異したプラスミドで形質転換された野生型株に対する、野生型プラスミドで形質転換された野生型株に対する、および非形質転換野生型株に対する変異誘発アッセイの結果の比較は、野生型ミスマッチ修復系を有する細胞においてミスマッチ修復を妨害する「優性な負の」変異の同定をさらに可能にする。変異体タンパク質の過剰発現が優性表現型、あるいはタンパク質が低コピー数ベクターから発現されるときに観測されるよりも強い優性表現型を引き起こすために必要であるかどうかを決定するために、高コピーの２ミクロンプラスミドに関する各変異株を発現することもまた有利であり得る。異なるMSH２およびMLH１変異により引き起こされる表現型がきわめて微妙であり得る可能性がある。例えば、原則的に変異の広いスペクトルを検出し得る前進変異アッセイに対する特異的変異の影響の大きさは、フレームシフト変異を検出する復帰あるいはCA反復不安定性アッセイにおいて観察される影響とは異なり得る。これらのタイプの影響は、ミスマッチ修復の特異性における改変を引き起こす変異の指標であり得る。このようなタイプのMSH２およびMLH１変異は、反復不安定性表現型を示さないか、あるいはトリおよびテトラヌクレオチド反復不安定性を示すがジヌクレオチド反復不安定性を示さない腫瘍中に見い出され得る。このような選択された場合において、ミスマッチ修復欠陥がミスペアの特異的タイプに限定されるかどうかを決定することが重要である。これは、例えば、msh２あるいはmlh１変異体プラスミドを含むS.cerevisiae株を規定されたミスペアを含むプラスミドで形質転換することにより、そしてこれらの個々のミスペアの修復の頻度を測定することにより分析され得る。８つの可能な単一塩基ミスペア、および異なる１つの、ならびに複数の塩基挿入変異を各々分析するために先に開発されたプラスミド系（文献D.K.Bishopら、Mol.Cell.Biol.6,3401-3409,1986;D .K.Bishopら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86,3713-3717,1989;B.Kramerら、Mol. C ell.Biol.9,4432-4440,1989を参照のこと）がこの分析のために用いられ得る。もちろん、S.cerevisiae系はその実験操作の容易さのために主として提案される。類似の研究が、他の細胞タイプ（例えば、ヒト、マウス、ショウジョウバエなどのような）において、利用可能な変異誘発、トランスフェクション、およびアッセイ系を用いて行われ得る。このタイプの分析はまた、本発明者らが、変異の任意の特定のタイプがHNPCC 血族の異なる表現型特性（例えば、開始年齢、複数腫瘍の発症、および異なるタイプの腫瘍の発症）と相関するかどうか、そして突発性腫瘍に見い出される変異がHNPCC血族に見い出される生殖系列変異である表現型と異なる表現型を引き起こすかどうかを決定することを可能にする。同等物前記は単に特定の好ましい実施態様の詳細な説明であることが理解されるべきである。従って、当業者にとって様々な改変物および同等物が本発明の精神あるいは範囲から逸脱することなく行われ得ることが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵＣ１２Ｐ 21/02 ＡＣＪＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣＶ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (31)優先権主張番号０８／２５９，３１０ (32)優先日 1994年６月13日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コロドナー，リチャードディ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02130，ジャマイカプレイン，アパートメント 602，パーキンズストリート 241 (72)発明者フィッシェル，リチャードアメリカ合衆国バーモント 05482，シェルバーン，バーストウロード 10エイ (72)発明者リーナン，ロバートエイ．ジー. アメリカ合衆国ウィスコンシン 53711, マディソン，ウェストブロークサークル９

Claims

【特許請求の範囲】１．真核細胞のDNAミスマッチ修復経路において変化があるかどうかを調べる方法であって、以下の工程：ａ）予め選択された真核生物から生物学的標本を単離する工程；ｂ）DNAミスマッチ修復経路のヌクレオチド配列またはその発現産物における変化について該標本を試験する工程；およびｃ）工程ｂ）で得られる結果と野生型コントロールとを比較する工程を包含する、方法。２．生物学的標本が、血液、組織、血清、糞便、尿、痰、脳脊髄液、細胞溶解物の上清、および真核生物細胞サンプルから選択される、請求項１に記載の方法。３．前記真核生物が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。４．前記哺乳動物がヒトである、請求項３に記載の方法。５．変化が哺乳動物における細胞の悪性的増殖に対する素因の徴候である、請求項１に記載の方法。６．前記生物学的標本が、血液に関連する個体の群より選択される、請求項４に記載の方法。７．前記ヌクレオチド配列が遺伝子である、請求項１に記載の方法。８．前記DNAミスマッチ修復経路遺伝子が、配列番号５および６を含むタンパク質をコードする第２染色体に存在する遺伝子であり、該遺伝子がhMSH2と呼ばれる、請求項７に記載の方法。９．前記発現産物がmRNAである、請求項１に記載の方法。１０．前記発現産物がタンパク質である、請求項１に記載の方法。１１．前記変化がDNAのヌクレオチド配列中にある、請求項１に記載の方法。１２．前記変化がDNAの増幅方法を用いて検出される、請求項１１に記載の方法。１３．前記DNAの増幅方法が少なくとも１つのイントロンまたはエキソンにおいて変化を検出する、請求項１２に記載の方法。１４．前記変化が、オリゴヌクレオチドプライマーの対を用いて、配列番号５および６を含むタンパク質をコードする第２染色体に存在する遺伝子である、hMSH 2遺伝子において検出される、請求項１３に記載の方法。１５．前記オリゴヌクレオチドプライマーの前記対が、配列番号４６〜６５および１４５〜１５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の方法。１６．前記変化が遺伝子発現のレベルを測定することによって検出される、請求項１に記載の方法。１７．前記変化が、（１）前記組織中のミスマッチ修復経路遺伝子またはそのmR NAと（２）哺乳動物の野生型ミスマッチ修復遺伝子に相補的な核酸プローブとの間にミスマッチを同定することにより検出され、このとき、（１）および（２）が互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する、請求項１に記載の方法。１８．前記核酸プローブがDNAプローブである、請求項１７に記載の方法。１９．前記ミスマッチが酵素的切断によって同定される、請求項１６に記載の方法。２０．前記DNAミスマッチ修復経路における変化が、ミスマッチ修復経路遺伝子の増幅および変異ミスマッチ修復経路対立遺伝子に相補的な核酸プローブへの前記増幅された配列のハイブリダイゼーションによって検出される、請求項１に記載の方法。２１．哺乳動物のDNAミスマッチ修復欠損腫瘍を診断する方法であって、以下の工程：腫瘍の疑いがある該哺乳動物由来の組織を単離する工程； DNAミスマッチ修復経路遺伝子またはその発現産物における変化を検出する工程であって、該変化がDNAミスマッチ修復欠損腫瘍の徴候である、工程；を包含する、方法。２２．前記哺乳動物がヒトである、請求項２１に記載の方法。２３．前記DNAミスマッチ修復欠損腫瘍が結腸直腸卵巣、子宮内膜（子宮）、腎、膀胱、皮膚、直腸、および小腸である、請求項２２に記載の方法。２４．ガンを有する固体における予後の方法であって、DNAミスマッチ修復経路における変化の存在について、該固体由来のガン細胞と該固体由来の非ガン細胞とを比較する工程を包含する、方法。２５．両細胞の変化が、前記ガンの遺伝的基礎を示す、請求項２４に記載の方法。２６．哺乳動物のDNAミスマッチ修復経路に影響する薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程：ａ）DNAミスマッチ修復経路における変化を有する第１の試験細胞を選択する工程；ｂ）第２の試験細胞を選択する工程であって、該第２の細胞が該第１の細胞由来であるが、DNAミスマッチ修復経路における変化を有さない、工程；ｃ）該試験細胞を選択された薬剤に接触させる工程；およびｄ）該第１および第２の試験細胞に対する該薬剤の効果を比較する工程；を包含する、方法。２７．配列番号１６に記載のアミノ酸配列またはその機能的同等物を有する、ヒトミスマッチ修復タンパク質。２８．配列番号８に記載の配列を有する、単離されたヌクレオチドセグメント。２９．配列番号８に記載の配列を有するヌクレオチドセグメントの特定のフラグメントを含む、単離されたヌクレオチドセグメント。３０．配列番号２５、２６、２９、３０、３２、３８、４０、４５−６５、８２ −１１３、１１４−１４４、および１５７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、単離された核酸セグメント。３１．真核生物DNAミスマッチ修復経路のメンバーをコードするDNAを単離する方法であって、以下の工程：ａ）予め選択された真核細胞から生物学的標本を単離する工程；ｂ）該標本を、DNAミスマッチ修復経路遺伝子について試験する工程；およびｃ）該DNAミスマッチ修復遺伝子を含むDNAを単離する工程；を包含する、方法。３２．配列番号８に記載のヌクレオチド配列またはその特定のフラグメントを有するDNAフラグメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そして真核生物のDNAミスマッチ修復経路のメンバーをコードする、単離されたDNAセグメント。３３．請求項３２に記載のDNAを含む、ベクター。３４．前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項３２に記載のベクター。３５．請求項３２または３３に記載の前記ベクターで形質転換された宿主。３６．配列番号８に記載のヌクレオチド配列またはその特定のフラグメントのアンチセンスDNAセグメントを含む、ベクター。３７．哺乳動物のDNAミスマッチ修復経路のメンバーにおける変化をDNA増幅によって決定するためのキットであって、DNAオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含み、該セットが、DNAミスマッチ修復遺伝子をコードするDNAの合成を可能にする、キット。３８．前記DNAミスマッチ修復遺伝子が、配列番号５および６を含むタンパク質をコードする第２染色体上に存在する遺伝子であり、該遺伝子がhMSH2と呼ばれる、請求項３７に記載のキット。３９．前記プライマーが配列番号４６−６５および１４５−１５４の群より選択される、請求項３６に記載のキット。４０．DNAミスマッチ修復経路のメンバーにおける変化を有する、非ヒト哺乳動物。４１．前記DNAミスマッチ修復経路のメンバーが、配列番号５および６を含むタンパク質をコードする第２染色体上に存在する遺伝子であり、該遺伝子がMSH2と呼ばれ、そして前記哺乳動物が齧歯類である、請求項４０に記載の非ヒト哺乳動物。