CN107384916A - 一种广谱性的癌症治疗基因靶点及其应用 - Google Patents

一种广谱性的癌症治疗基因靶点及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程及生命科学领域，公开了一种新的癌症治疗基因靶点——G‑T错配及其在癌症靶向治疗方面的应用。本发明主要针对错配修复系统缺失的癌细胞，其基因组DNA中G‑T错配的水平远远高于正常细胞。天然维生素B2即核黄素及其衍生物在光照条件下具有断裂含G‑T错配双链DNA的功能，当其作用于富含G‑T错配的癌细胞基因组DNA时，能够使基因组DNA发生断裂，最终导致癌细胞死亡。本发明提供的癌症治疗靶点适用于所有具有错配修复功能的癌细胞，且不会发生药物耐受，具有高度的广谱性、有效性和药效稳定性。

Description

一种广谱性的癌症治疗基因靶点及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程及生命科学领域，具体涉及一种新的癌症治疗靶点——G-T错配及其在癌症靶向治疗方面的应用。
背景技术
癌症是严重危害人类生命的高致死率疾病之一。手术、放疗和化疗是癌症治疗的三大传统方法，这些方法虽然在临床上取得了一定成就且目前仍然是主要的治疗手段，但很难实现癌症的彻底治愈，究其原因在于这些方法的靶点不明确、作用位点不单一，不具备高度特异性，从而在治疗过程中会对正常细胞产生严重损伤，发生的严重副作用，加重患者负担。
随着分子生物学及遗传学等研究的发展，人们发现肿瘤细胞表现出复杂的特异性的生物缺陷(癌基因、抑癌基因突变及染色质修饰等)以及一些关键因子的异常表达，从而提出了肿瘤分子靶向治疗的概念。目前，肿瘤分子靶向治疗已成为肿瘤治疗领域突破性和革命性的发展，代表了肿瘤治疗最新的发展方向。尽管如此，肿瘤分子靶向治疗仍然存在大量问题，目前研究最多的是靶向药物的耐药机制，如药物转运能力增强、靶基因改变、靶基因旁路激活、肿瘤微环境改变等会导致药物失效，民族、性别、环境、生活条件不同体现的显著个体化差异等会大大降低药物的广谱性，究其原因在于这些药物所针对的靶点易于变化或受细胞微环境影响，同时也缺乏广谱性。因此，具有肿瘤特异性且普遍存在的新的靶点的寻找及其应用研究将为分子靶向治疗目前面临的问题提供一个新的解决思路，从而推动肿瘤靶向治疗领域的发展。
发明内容
本发明目的在于提供一种普遍存在的癌症治疗靶点及其在癌症靶向治疗中的应用，为癌症靶向治疗提供更为有效的工具。
本发明的技术方案如下：
错配修复系统缺失的癌细胞基因组DNA中G-T错配的水平远远高于正常细胞。用靶向药物如核黄素及其衍生物在光照条件下同时作用于错配修复系统缺失的癌细胞及错配修复系统完善的正常细胞。前者因错配修复系统缺失，G-T错配无法被修复从而大量聚集，经核黄素及其衍生物处理时，能被其特异性识别并在光照条件下引起基因组DNA断裂，最终导致细胞死亡；后者具有错配修复功能，G-T错配能够得到修复以形成正常碱基配对，因而不会与核黄素及其衍生物发生作用，从而不会被杀死。由此，基因组DNA中的G-T错配可成为一种新的癌症治疗靶点，只要癌细胞属于错配修复系统缺失的细胞，即可用G-T错配的靶向药物将其杀死，具有非常高的广谱性。
本发明所述错配修复系统作用为细胞内识别并修复细胞内DNA复制、重组中产生的基因的错配，其最基本功能是消除DNA复制过程中形成的碱基-碱基错配与碱基插入/缺失突环。该系统包括hMSH2、hMSH6(GTBP)、hMSH3、hMLH1、hPMS1、hPMS2等至少6种与基因错配修复相关的MMR蛋白，几种蛋白协同工作，缺一不可，任一蛋白的异常表达都将导致DNA 错配修复功能的异常、缺失或丧失，从而导致突变频率增加、细胞周期停滞、细胞凋亡率降低，最终引发肿瘤的形成。
本发明所述错配修复系统缺失与包括胃癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌等密切相关。
本发明所述G-T错配以亚胺质子-羰基氢键的形式稳定结构，其发生概率远高于其他类型错配，并且难以与基因中其他正常的碱基配对相区别，不能够被迅速的识别修复。错配修复功能缺失的癌细胞中，G-T错配更是难以修复，大量累积，其含量远高于正常细胞，是该类癌细胞癌变的重要生物标志物。
本发明所述基因组DNA富含G-T错配的癌细胞的靶向治疗药物包括核黄素及其衍生物在内的所有能特异性识别G-T错配并导致癌细胞死亡的药物。
本发明所述核黄素为一种天然维生素，也是一种天然光敏剂，可购自市售产品。
本发明所述G-T错配与核黄素及其衍生物相互作用的基团均为异咯嗪环，两者相互作用方式均为核黄素及其衍生物的异咯嗪环与G-T碱基形成氢键，并于与G-T上下游碱基产生π- π相互作用。
本发明所述光照条件只需覆盖波长440-500nm即可。
如本文所用，除另外特殊说明，下列词语/术语具有下列含义。
“DNA”：脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子，由四种主要的脱氧核糖核苷酸通过3’，5’-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。
“错配”：DNA双链核酸分子中存在的非互补性碱基配对的现象，G-T错配是所有碱基错配中最常见的。DNA中正确的碱基配对为A-T配对，G-C配对。
“核黄素”：维生素B2，能够吸收光子后传递能量给反应物，发生氧化还原反应。
本发明的有益效果在于：
经济高效，适用范围广，所需条件简单，对于癌症的特异性治疗有很高的价值。本发明主要体现出以下几个突出的优点：
1.通用。G-T错配是一种普遍存在的癌症治疗靶点，适用于所有错配修复系统缺失的癌细胞。
2.稳定。G-T错配不同于特定的药物靶点突变后便会导致药物耐受，其大量分布在错配修复系统缺失的癌细胞的基因组DNA中，靶向药物只要对少量G-T错配发生作用，便可导致基因组DNA的断裂，从而导致癌细胞死亡。因此，用G-T错配作为癌症治疗靶点，不易产生耐药性，其疗效将是非常稳定的。
3.安全。G-T错配相应的靶向药物核黄素为天然维生素，低毒且易于被细胞吸收。
4.实用。G-T错配与核黄素及其衍生物的组合，在用于癌症治疗时，不依赖特殊、昂贵的治疗仪器。
附图说明
图1是本发明所设计的包含G-T错配的DNA双链示意图。
图2是具体实施例3的单链断裂结果图。1：单链D-t，2：完全互补双链D-t/D-a，3：反应体系不加入核黄素，4：反应体系不光照，5：D-t/D-g双链发生单链断裂，Clv为单链断裂产物。
图3是具体实施例4的转染操作示意图。
图4是具体实施例5的细胞活力结果图。
具体实施方式
下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于本发明，而不用于限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下属实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 参照附图1设计包含G-T的DNA序列为26个核苷酸长度的不完全互补序列
包含T的DNA序列(D-t)：
5’-3’：ATATATACTGATCTCTATATATATAT
包含G的DNA序列(D-g)：
5’-3’：ATATATATATAGGGATCAGTATATAT
与D-t完全互补的序列(D-a)：
5’-3’：ATATATATATAGAGATCAGTATATAT
实施例2 序列D-t的放射性同位素32P标记
10μl反应体系包括10uM D-t，50mM Tris-HCl(pH 7.8),40mM NaCl,10mM MgCl2,1mg/mL BSA,10μCiγ-32P ATP和10U T4多聚核苷酸激酶，在37℃反应1小时。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化得到32P标记后的D-t。
实施例3 光照后核黄素引起包含G-T错配双链DNA特异性单链断裂
15μl反应体系包括100mM磷酸缓冲液，0.4M标记后D-t，1μM D-g，200μM核黄素。将反应管放置于37℃恒温，并在距离反应管15cm处放置45W LED灯，光照1小时。回收样品，以聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应结果。附图2为反应结果，仅有包含G-T的双链在加入核黄素后光照后，才会发生单链断裂。
实施例4 错配修复功能缺失及错配修复功能恢复的细胞的制备
(1)选择本身就错配修复功能缺陷的结肠癌细胞HCT116作为模式细胞；
(2)以pcDNA 3.1质粒为载体，构建含错配修复蛋白hMLH1基因的重组质粒pcDNA3.1-hMLH1。具体操作如下：
pcDNA3.1载体和hMLH1 cDNA均有商品化产品，分别设计两组引物5-Bam-Pr和 3-Eco-Pr，以蒸馏水溶解引物至终浓度100μM。加入0.5μl引物至10×Taq缓冲液中，再加入5UPfu聚合酶，以及1μl hMLH1 cDNA(10μg/100μl)终体积为25μl。将样品管放入PCR仪中，PCR条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，50℃复性10s，72℃延伸2min，35个循环。得到的PCR产物加入10U BamH I限制性内切酶以及10U EcoR I限制性内切酶以及10×CutSmartTM缓冲液，终体积为50μl。经酶处理后，以胶回收试剂盒回收处理后的hMLH1 cDNA。
将10μl pcDNA 3.1载体加入2.5ul 10×CutSmartTM缓冲液以及10U BamH I限制性内切酶以及10U EcoR I限制性内切酶，终体积为25μl。经酶处理后，经酶处理后，以胶回收试剂盒回收处理后的pcDNA3.1载体。
将处理后的1μl pcDNA3.1和1μl hMLH1 cDNA，加入10U T4DNA连接酶及10×缓冲液，终体积为10μl，连接过夜。将连接产物转化进入Trans10化学感受态细胞中，将得到的克隆进行测序，筛选得到正确的重组载体pcDNA3.1-hMLH1。
(2)细胞转染
将结肠癌细胞HCT116接种至96孔板，培养液为DMEM高糖培养基，加入10％胎牛血清，青霉素以及链霉素，在37℃and 5％CO2培养箱中培养。转染前2小时，培养液换为不含胎牛血清培养液。随后将空质粒pcDNA3.1与含错配修复蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1-hMLH1分别与转染试剂trans-EZ以及opti-MEM培养液混合，加入细胞培养孔中。转染6小时后，培养液换为DMEM和10％胎牛血清。最后分别得到两组细胞：错配修复系统缺失HCT116以及错配修复系统完整HCT116。
实施例5 核黄素对癌细胞处理的效果研究
将不同浓度核黄素与实施例4制备的两组HCT116细胞共同孵育12小时，光照6小时后，加入细胞活力检测试剂AlamarBlue，酶标仪检测其细胞活力。检测结果如附图4所示：光照后核黄素能够明显降低转染pcDNA3.1空白载体HCT116的细胞活力，而对转染 pcDNA3.1-hMLH1载体的HCT116影响明显较小。证实了错配修复系统缺失的癌细胞中的G-T 不能被修复，大量累积，从而可以被靶向药物核黄素识别并最终导致癌细胞死亡；而导入错配修复蛋白的功能恢复的癌细胞则因能够修复G-T错配，从而降低了核黄素对其的杀灭作用。因此，G-T错配可以作为一种有效的癌症治疗靶点。

Claims (5)

1.一种癌症治疗基因靶点，其特征在于，该靶点为癌细胞基因组DNA中的G-T错配。
2.权利要求1所述癌细胞主要是错配修复系统缺失的癌细胞。
3.权利要求1所述G-T错配在错配修复功能缺失的癌细胞中的含量远高于正常细胞中的含量。
4.一种癌症治疗基因靶点在癌症靶向治疗中的应用，其特征在于，错配修复系统缺失的癌细胞基因组DNA含高水平G-T错配，靶向药物如核黄素及其衍生物能特异性识别G-T错配并在光照条件下引起基因组DNA断裂，最终导致癌细胞死亡；正常细胞具有错配修复功能，G-T错配能够得到修复，因而不会与核黄素及其衍生物发生作用，从而不会被杀死。
5.权利要求1或4所述癌症治疗基因靶点及其在癌症靶向治疗中的应用适用于与错配修复系统缺失密切相关的多种肿瘤，如胃癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌。
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