JPH11506940A - ミスマッチ修復タンパク質の抗体による検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトタンパク質であるミスマッチ修復タンパク質に対する抗体は、増殖性の細胞と非増殖性の細胞を区別するために、診断的に用いることができる。さらにそれらの抗体は、細胞が、hＭＳＨ2、hＭＬＨ1あるいはhＰＭＳ2の変異によるミスマッチ修復機構の異常を持っているか調べるために使用することができる。それらの抗体は、抗腫瘍療法の効用をモニターするために用いることもできる。

Description

【発明の詳細な説明】 ミスマッチ修復タンパク質の抗体による検出 発明の背景 ＨＮＰＣＣ（Ｌynch症候群）は、東洋においては、２００人に１人以上が患 っている最も一般的な癌の素因性症候群の一つである(Ｌynch et al．1993)。患 者は、しばしば、５０才以前に結腸、子宮内膜、卵巣、およびその他の器官で癌 を発生する。このシンドロームの家族性の性質は、ほぼ一世紀以上前に見つかっ たが(Ｗarthin et al．1913)、その因果関係における遺伝の役割を決定するのは 、難しかった(Ｌynch et al．1966)。しかし、最近、２つの大家族における連鎖 解析により、２番染色体上の多型マーカーとの関係が、明らかになった(Ｐeltom aki et al．1993a)。他の家族の研究からも多くのＨＮＰＣＣの親族における腫 瘍形成がこの同じ２番染色体の２Ｐ断片と連鎖することが示された(Ａaltonen e t al．1993)。 ＨＮＰＣＣは、臨床的には、少なくとも１親等の２世代に渡って結腸および その他の特定の癌が初期に起こることで定義される(Ｌynch et al．1993)。素因 は、常染色体優性様式に遺伝する。他の以前に特徴づけられたこの遺伝様式の癌 の素因性症候群が、腫瘍抑制遺伝子の変異によって引き起こされているので、Ｈ ＮＰＣＣの原因遺伝子は、癌抑制遺伝子であると当初は予想されていた(reviewe d inＫnudson，1993)。しかし、ＨＮＰＣＣの患者の腫瘍の解析は、他の機構に よることを示唆していた。腫瘍抑制遺伝子をコードするほとんどの遺伝子座は、 腫瘍化の間に体細胞から失われる(Ｓtanbridge，1990)。それに対して、２ｐ染 色体遺伝子座の両方の対立遺伝子は、ＨＮＰＣＣの腫瘍において残っていること が明らかになった(Ａaltonen et al．1993)。２番染色体の欠損についてのこの 探索の間に、ＨＮＰＣＣの腫瘍が多くのマイクロサテライト配列の体細胞変異を 示していることが明らかになった。 癌細胞のゲノムの広範な微妙な変化は、最初、任意プライマーによるポリメ ラーゼ連鎖反応（arbitrarily-primed ＰＣＲ）によって散発性結腸直腸腫瘍の サブセットで見つかった(Ｐeinado et al．1992)。ついでこれらの変化は、ゲノ ムのポリＡ領域で最大４ヌクレオチドまでの欠損を示していることが見つかった (Ｉonov et al． 1993)。他の研究から、散発性腫瘍のある特定のサブグルーブは、様々な単純な 繰り返し配列、特に、２ヌクレオチド、あるいは３ヌクレオチドの反復を含むマ イクロサテライト配列に挿入あるいは欠損を持っていることが示された(Ｉonov et al．1993; Ｔhibodeau et al．1993; Ａaltonen et al．1993)。興味深いこ とに、これらの散発性腫瘍は、ＨＮＰＣＣの家系において発生する散発性腫瘍と 共通のある特徴、例えば、結腸の右側に位置する傾向、ほぼ二倍体である傾向を 持っていた。これら及び他のデータは、ＨＮＰＣＣと散発性腫瘍のサブセットが 、マイクロサテライトの複製の誤り（ＲＥＲ）を引き起こす遺伝しうる欠損と関 連していることを示唆した(Ｉonov et al．1993;Ａaltonen et al．1993)。 仮定された欠損の基礎にある機構は、癌のＤＮＡの研究からは決定されない が、より下等な生物の研究は、興味深い可能性を示した(Ｌevinson and Ｇutman ，1987;Ｓtrand et al．1993)。この研究は、修復酵素の遺伝子を欠損したバク テリアと酵母が、２塩基の繰り返し配列の不安定性を引き起こすことを示した。 ＤＮＡの複製と組み換えに最も関わる遺伝子の破壊は、マイクロサテライトの正 確さに何の効果も示さなかった(reviewed in Ｋunkel，1993)。これらの重要な 研究は、ミスマッチ修復の欠損が、ＨＮＰＣＣの患者の癌におけるマイクロサテ ライトの変化の原因である可能性を示した(Ｓtrand et al．1993)。この仮説は 、hＭＳＨ2というＨＮＰＣＣの原因遺伝子が同定された時に証明された(Ｌeach et al．1993;Ｆishel et al．1993)。 遺伝性および体細胞性腫瘍に関わるミスマッチ修復の欠損を診断し予知する 方法が当該技術分野では必要である。このような癌は、他の癌より予知が望まれ る。また、当該技術分野では癌の予知のための因子として使用することができる 細胞の増殖性の指標を測定する改良法も必要である。 発明の概要 組織において増殖性の細胞と非増殖性の細胞を区別する方法を提供すること は本発明の目的である。 腫瘍細胞において、たとえばhＭＳＨ2、hＭＬＨ1あるいはhＰＭＳ2遺伝子に おけるミスマッチ修復の欠損を特定する方法を提供することは本発明の別の目的 である。 腫瘍性組織における抗腫瘍療法の効果をモニターする方法を提供することは 本発明さらに別の目的である。 増殖性の細胞と非増殖性の細胞を区別する方法を提供することは本発明のさ らに別の目的である。 腫瘍を持った人を特定する方法を提供することはこの発明の目的である。 以下に示す一つあるいはいくつかの態様において、本発明のこれらのおよび その他の目的を提供する。本発明の一つの態様において、組織内の増殖性の細胞 と非増殖性の細胞を区別する方法を提供する。その方法は、以下の工程：すなわ ち細胞を含む組織をミスマッチ修復タンパク質と特異的に免疫反応的である抗体 と接触させ、抗体−抗原複合体を形成し、前記細胞における増殖性の細胞である ことを示す前記抗体−抗原複合体の存在を検出することを含む。。 本発明の別の態様においては、腫瘍細胞におけるたとえばhＭＳＨ2、hＭＬ Ｈ1、hＰＭＳ2のような、ミスマッチ修復遺伝子におけるミスマッチ修復の欠損 を特定する方法を提供することであり、前記方法は、以下の工程：すなわち細胞 を含む組織をミスマッチ修復タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体と接触 させ、抗体−抗原複合体を形成し、前記抗体−抗原複合体が核に局在するか、核 以外に局在するかを検出し、核が染色されなければミスマッチ修復遺伝子の欠損 を示すことを含む。 本発明のさらに別の態様においては、腫瘍性組織における抗癌療法の効果を モニターする方法を提供することである。その方法は、以下の工程：すなわちミ スマッチ修復タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体と抗癌療法を施した腫 瘍性組織サンプルを接触させ、抗体−抗原複合体を作成し、前記サンプルで前記 抗体−抗原複合体の量を特定し、前記サンプル中の抗体−抗原複合体の量と初期 の前記抗体−抗原複合体の量とを比較することにより、抗体−抗原複合体の量が 減っていれば、治療の有効性を示すことを含む。 本発明のさらに別の態様において、増殖性の細胞と非増殖性の細胞を区別す る方法を提供する。その方法は、以下の工程：すなわち試験する細胞の融解物を 調製し、前記融解物をミスマッチ修復タンパク質と特異的に免疫反応性である抗 体と接触させ、抗体−抗原複合体を形成し、前記融解物中に形成された抗体−抗 原複合体の量を特定し、試験する細胞の融解物が腫瘍細胞でない対照の融解物よ りも多くの抗体−抗原複合体を提供すれば、その試験する細胞は増殖しているこ とを示すことを含む。 本発明のさらに別の態様において、増殖性の細胞と非増殖性の細胞を区別す る方法を提供する。その方法は、以下の工程：すなわち試験する細胞から核を分 離し、前記細胞の前記核の融解物を調製し、前記融解物をミスマッチ修復タンパ ク質と特異的に免疫反応性である抗体と接触させ、抗体−抗原複合体を形成し、 前記融解物中の抗体−抗原複合体の量を特定し、前記核の融解物中が腫瘍細胞で ない細胞核の対照の融解物よりも多くの抗体−抗原複合体を提供することが、そ の試験する細胞が増殖していることを示すことを含む。 本発明のさらに別の態様により、腫瘍を有している人を特定する方法を提供 する。その方法は、以下の工程：すなわちヒトでヒト体内に腫瘍が存在すること を示すミスマッチ修復タンパク質に対する自己抗体を検出することを含む。 このように本発明は、癌の診断と処置の選択性の評価を改善するための診断 と予知の情報を提供することができる免疫学的アッセイの技術を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、抗ＭＳＨ2モノクローナル抗体（mＡb）ＦＥ11およびＥＨ12を用い た結腸直腸腫瘍細胞からの免疫沈降のゲルである。図１は、両方の抗体が野生型 のＭＳＨ2を発現しているＨＣＴ116細胞から100kＤaのタンパク質を免疫沈降す ることを示す。そのタンパク質は、ＬoＶo細胞では検出されない。さらに、160k Ｄaのタンパク質もまた、共沈する複合体の一部として検出されるが、それは、 ＨＣＴ116細胞においてのみである。ＮＭＳは、ネガティブコントロールとして 使った正常マウスの血清である。 図２は、イムノブロットによる３つの細胞株の比較を示す。ＳＷ480細胞は 、野生型のＭＳＨ2のみを発現する。ＬoＶo細胞は、両対立遺伝子の欠損するホ モ結合体であるためＭＳＨ2を全く発現していない。ＫＫ細胞株は、全長の野生 型およびフレーム内の50アミノ酸残基の欠損による短い型の両方を発現している 。ＭＳＨ2の短い型が検出されることは、ＭＳＨ2遺伝子中にに変異があることを 示す。 図３は、正常の結腸のＦＥ11あるいはＥＨ12を用いた免疫組織化学染色であ る。図３Ａは、ＥＨ12によるパラフィン包埋した組織におけるＭＳＨ2の検出を 、一方図３Ｂは、ＦＥ11による凍結組織におけるＭＳＨ2の検出を示す。両方の 場合とも染色は核に局在し、結腸の上皮細胞の増殖している部分と密接している 陰窩の下部領域に優勢に局在している。 好ましい態様の詳細な記載 ＭＳＨ2遺伝子は、ＤＮＡ複製あるいは修復に引き続くミスマッチヌクレオ チドの修復に関わるタンパク質をコードする少なくとも４つの遺伝子のうちの１ つである。ＭＳＨ2遺伝子中の変異は、散発性結腸悪性腫瘍の進行に関与する。 一方、生殖細胞のＭＳＨ2の変異は、遺伝性の非ポリポーシス（polyposis）結腸 悪性腫瘍（ＨＮＰＣＣ）の約５０％に関連する。ＭＳＨ2は、散財性に発現して いるので、結腸直腸悪性腫瘍以外のその他の癌の進行にもＭＳＨ2の変化は、影 響する。ＨＮＰＣＣの家系の研究から、ＭＳＨ2の変異は、内部の、インフレー ムの欠失あるいは、鎖終結変異でありうることが明らかになった。 野生型および変異型のＭＳＨ2タンパク質を解析するため、ヒトのＭＳＨ2タ ンパク質（hＭＳＨ2）に対する特異的に免疫反応的な一連のモノクローナル抗体 を作成した。この抗体は、ヒトの他のタンパク質とは、免疫反応性ではない。モ ノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングから、正常細胞および数種 の結腸直腸腫瘍細胞（例えばＳＷ480）は、野生型の完全長100kＤaのＭＳＨ2タ ンパク質を発現しているが、一方でＭＳＨ2の片方の対立遺伝子にインフレーム の欠失を持つＨＮＰＣＣの患者由来の細胞株は、全長および短い型を低濃度発現 していることが示される。他の結腸直腸腫瘍細胞株（例えばＬoＶo細胞）は、対 立遺伝子の両方を失っていることにより変異を持った対立遺伝子から発現した異 常ＭＳＨ2タンパク質が不安定なためか、あるいは、結果として野生型ＭＳＨ2タ ンパク質が成熟する前に分解されてしまうその他のＨＮＰＣＣ遺伝子の変異のた めのどちらかにより、ＭＳＨ2タンパク質を発現していない。このように、これ らの抗体は、野生型ＭＳＨ2タンパク質の欠損を検出する目的で使用することが できる。 抗体の多数の驚くべき特徴が発見された。第１に、ＭＳＨ2タンパク質は、 増 殖性の細胞で強く発現しているが、非増殖性の細胞では発現していない。第２に 、ＭＳＨ2タンパク質の細胞内の局在は、細胞のミスマッチ修復の状態に依存す る。hＭＳＨ2、hＭＬＨ、hＰＭＳ2遺伝子を含むが、それらに限らず、いずれか のミスマッチ修復遺伝子の変異は、ＭＳＨ2タンパク質の異常な核外への局在を 引き起こす。細胞がミスマッチ修復遺伝子に関して野生型であればタンパク質は 、主に核に局在する。いずれか一つのミスマッチ修復タンパク質が変異を起こす と、他のミスマッチ修復タンパク質も同様に異常な局在を示す。 抗体との結合を基に細胞の増殖度を測る能力は、放射性標識されたデオキシ リボ核酸を用いるより、主要な実際上、経済上、そして安全上の利点を提供する 。放射性標識された核酸を用いずに処理された細胞の増殖度を基に抗癌療法をモ ニターすることも可能になる。効果のある治療は、癌細胞の増殖度を低下させる だろう。増殖能を低下させることができなかったり、十分低下させることが出来 なかったことを検出することにより、他の量や方法を試すことができるだろうし 、あるいは他の抗癌剤を使用することができるだろう。 増殖は、限定されないが、免疫組織化学、免疫蛍光法、および蛍光活性化細 胞分別法（ＦＡＣＳ）を含む、標準的な免疫学的な方法を用いて測ることができ る。さらに、細胞の融解物を調製し、直接ミスマッチ修復酵素の発現量について 調べることができる。同様に、細胞の核を分離し、融解することができ、そして 融解物を一般的には抗体を使ってミスマッチ修復タンパク質の発現量をアッセイ することができる。融解物を用いて簡便に、抗体結合イムノソーベントアッセイ (ＥＬＩＳＡ)を使用することによっても調べることができる。 ＭＳＨ2が、正常細胞よりも増殖の非常に早い癌細胞において大量に発現し ているという観察結果から、数種の癌で、病状の経過に伴って、ミスマッチ修復 タンパク質に対する自己抗体の発現することを説明することができる。ヒトの検 体において、ミスマッチ修復タンパク質に対する自己抗体を検出することを、体 内に腫瘍が存在することの指標として診断に用いることができる。 本明細書中で開示する抗体を用いて、組織中の増殖性の細胞を非増殖性の細 胞から区別することができる。抗体は、組織に接触させる。抗体と抗原の免疫複 合体は、例えば、免疫組織化学、免疫蛍光法、あるいは、ＦＡＣＳを用いて検出 す る。試験する細胞内に、抗体を含む免疫複合体が存在することは、これらの細胞 が増殖性の状態であることを示す。ＭＳＨ2を特異的に検出する抗体を用いて免 疫組織化学をすることにより、非増殖性の細胞は、検出されないのに対して、野 生型のＭＳＨ2タンパク質を発現している増殖性の細胞は、容易に検出されるこ とが示された。細胞増殖がミスマッチ修復タンパク質の発現と相関するという能 力により、免疫学的な方法により、ミスマッチ修復タンパク質の発現について細 胞を調べることのみにより組織の増殖状態を調べる方法を提供する。野生型のＭ ＳＨ2、ＭＬＨ1、およびＰＭＳ2遺伝子のみを発現し、増殖しているいずれかの 細胞は、抗ミスマッチ修復タンパク質モノクローナル、および／または、ポリク ローナル抗体を用いて免疫検出的な方法により検出される。ミスマッチ修復タン パク質が核に局在していないため、非増殖性の細胞は、検出されないだろう。組 織における細胞の増殖の程度は検出されるミスマッチ修復タンパク質の量と正の 相関をする。増殖のより遅い細胞では、ミスマッチ修復タンパク質の濃度が減少 していたのに対して、非常に増殖の早い細胞では、免疫組織化学、あるいは、フ ローサイトメトリー、あるいは免疫蛍光法により、ミスマッチ修復タンパク質が 核に高濃度で存在することを示す。 免疫組織化学の場合には、検査される個人の組織の中の適合した組織から、 あるいは、他の正常な個人から得た正常細胞を、対照として用いることができる 。ミスマッチ修復タンパク質の発現の正常値の幅を決定するために、健常な個人 の集団を調べることがしばしば望ましいだろう。通常、正常の平均値から、Ｓ. Ｄの２倍よりも離れた値を異常と診断する。正常と異常の幅を設定することは、 当業者にとって良く知っている日常的な実験である。 腫瘍細胞におけるhＭＳＨ2、hＭＬＨ1、hＰＭＳ2のような遺伝子の変異によ るミスマッチ修復の欠損は、本発明による抗体を用いて容易に検出することがで きる。免疫組織化学的方法によって特定されるように、ミスマッチ修復遺伝子の いずれかに変異のある癌細胞は、野生型のミスマッチ修復タンパク質の発現パタ ーンを示さないのに対して、ＭＳＨ2、ＭＬＨ1、あるいはＰＭＳ2遺伝子の変異 のない癌細胞では、ＭＳＨ2を検出することができる。ミスマッチ修復遺伝子の 変異は、核内の発現と染色性の欠損を引き起こすのに対し、野生型の発現パター ンは、核内であ る。さらに、ＭＳＨ2、ＭＬＨ1、あるいはＰＭＳ2遺伝子中の変化は、変化した ミスマッチ修復タンパク質の発現を引き起こすので、免疫組織化学によって異常 なミスマッチ修復タンパク質を検出することにより、その細胞株がＤＮＡ修復機 能を欠損しているかどうかについて調べることができる。ミスマッチ修復タンパ ク質の定量は、ミスマッチ修復タンパク質を一次抗体によって捕捉し、二次抗体 で検出し定量する、ＥＬＩＳＡによっても行うことができる。二次抗体は、ミス マッチ修復タンパク質に対する抗体でもミスマッチ修復タンパク質とin vivoで 安定な複合体を作るタンパク質に対する抗体でもよい。選択的には、捕捉したミ スマッチ修復タンパク質の検出は、適するミスマッチを持ったヌクレオチドを含 むＤＮＡがミスマッチ修復タンパク質により安定に結合されうる能力を測定する ことにより行うことができる。 抗ＭＳＨ2タンパク質抗体でＭＳＨ2タンパク質を免疫沈降すると、ＭＳＨ2 を含まない癌細胞では共沈しないが正常細胞の融解物からは、一つあるいはいく つかの別のタンパク質が共沈してくることが見いだされた。このようなタンパク 質は、ミスマッチ修復に関わる付属のタンパク質である可能性がある。そのよう なタンパク質の一つは、分子量約160kＤaである。 本発明の方法は、ヒトミスマッチ修復タンパク質に対して非常に特異的なポ リクローナル、あるいはモノクローナル抗体を決まったプロトコールに従って使 用することによるものである。我々は、まず最初に、大腸菌で発現させ、ＳＤＳ /ＰＡＧＥから、エレクトロエリューションすることにより単一に精製したＭＳ Ｈ2の組換え体をマウスに免疫することで特異性を得ることに成功した。マウス への数回にわたる免疫化の後、(1) ＧＳＴ-ＭＳＨ2抗原で陽性対照のためにコ ートしたマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡを行い、 (2)ＨＣＴ116 あるいは、ＳＷ480細胞を用いて、ウェスタンブロティングを行い、100kＤaのＭ ＳＨ2タンパク質を検出し、そして(3)p100のＭＳＨ2タンパク質を何も発現しな いＬoＶo細胞を用いて、ウェスタンブロティングを行うことにより、抗ＭＳＨ2 抗体の反応性についてマウスの血清を検査する。高免疫化したマウスの脾臓細胞 とＳＰ2/Ｏ細胞を細胞融合した後、得られたすべてのハイブリドーマをＧＳＴ- ＭＳＨ2融合タンパク質を用いたＥＬＩＳＡによって、スクリーニングした。Ｍ ＳＨ2反応性ハイブリドーマを限界希釈 法により２回サブクローン化し、そしてＥＬＩＳＡにより再スクリーニングした 。次に、得られた安定クローン株をウェスタンブロティングで調べ、既知の陽性 対照と陰性対照から作成したシグナルと比較して、得られたモノクローナル抗体 の特異性を決定する。望ましい遺伝子産物の発現を調節するために外来性に添加 する試薬を使用する、誘導した細胞ｖｓ誘導していない細胞を使用して行うこと ができる。興味のある抗原に特異的な抗体は、発現を誘導していない融解物から タンパク質は何も検出せず、いずれのタンパク質の検出もない、発現を誘導した 融解物からのみその抗原のみを検出しうる。選択的には、遺伝的背景が分かって いる場合、問題の遺伝子が欠損している細胞と野生型の対立遺伝子を持っている 細胞を比較する。ＭＳＨ2の場合、ＨＣＴ116は野生型のＭＳＨ2対立遺伝子を持 っており、ＭＳＨ2のmＲＮＡを発現していることが知られているが、一方ＬoＶo 細胞は、ＭＳＨ2をホモ接合体として欠損している。ウェスタンブロティングで も免疫沈降でも100kＤaのＭＳＨ2タンパク質はＨＣＴ116細胞でのみ検出され、 ＬoＶo細胞では100kＤaのタンパク質は何も検出されない。いくつかの場合、精 製されていない一次抗体、非特異的な二次抗体、化学発光を使った場合の長い露 光時間、試料調製や取扱いのまずさなどのさまざまな状況によって、複数の非特 異的なバンドが見られることもありうる(免疫学的な方法については、以下の参 考文献を参照；ＷＯ94/21814,Ｓmith,Ｋ.et al.Ｔhe ＡＰＣ Ｇene Ｐroduct in Ｎormal and Ｔumor Ｃells.Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ90:2846-2850,19 93あるいは、Ｈarow and Ｌaneによるマニュアル)。 実施例 野生型および変異型ＭＳＨ2タンパク質の両方の特徴を調べるために、私た ちは、ヒトＭＳＨ2タンパク質に対する一連のモノクローナル抗体を作成した。 （１）抗原と免疫化 マウスを免疫化するために使った抗原は、細菌で発現させ、精製したグルタ チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＭＳＨ2（ＧＳＴ-ＭＳＨ2）融合タンパク質 である。ＧＳＴ-ＭＳＨ2-ＮＨ融合タンパク質は、ＭＳＨ2のアミノ末端側300ア ミノ酸を含む。ＧＳＴ-ＭＳＨ2-ＣＯＯＨ融合タンパク質は、ＭＳＨ2のカルボキ シ末端側300アミノ酸を 含む。それぞれは、融合タンパク質の封入体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電 気泳動によって分離し精製した。ついで正確な分子量に相当するバンドをゲルか ら切り出し、ゲルスライスから、タンパク質をエレクトロエリューションした。 一群のマウスは、精製したＧＳＴ-ＭＳＨ2-ＮＨ融合タンパク質で免疫化し、も う一群のマウスは、精製したＧＳＴ-ＭＳＨ2-ＣＯＯＨ融合タンパク質で免疫化 した。それぞれの精製した融合タンパク質は、免疫化する前にＲＩＢＩアジュバ ンドと混ぜた。 （２）融合とスクリーニング カルボキシ末端融合タンパク質を投与した一匹のマウスを犠死させ、その脾 臓の細胞をＳＰ2/Ｏ細胞と融合した。得られたハイブリドーマを精製したＧＳＴ -ＭＳＨ2-ＣＯＯＨでコートしたマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡ によりスクリーニングした。陽性のウェルは、さらに、ＬoＶoの融解物では検出 されず、ＨＣＴ116の融解物でのみ存在する100kＤaのタンパク質に対する特異性 を調べるためにウェスタンブロティングでスクリーニングした。ウェスタンブロ ティングで陽性のハイブリドーマは、２度、単一細胞のサブクローニングをし、 腹水の産生のためにマウスに投与した。ＦＥ11とＥＨ12のハイブリドーマは、こ の融合によるものである。 アミノ末端のＧＳＴ-ＭＳＨ2融合タンパク質を免疫化したもう一匹のマウス を犠死させ、その脾臓の細胞をＳＰ2/Ｏ細胞と融合した。ＭＳＨ2タンパク質の アミノ末端部分と反応する抗体を発現するハイブリドーマを同定するため、ＧＳ Ｔ-ＭＳＨ2-ＮＨをコートしたマイクロタイタープレートを用いて最初のＥＬＩ ＳＡを行う以外は上記と同様に、ハイブリドーマをスクリーニングし、サブクロ ーニングした。ＧＢ12のハイブリドーマは、この融合によるものである。 （３）ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学による抗体の特 徴 ＦＥ11、ＥＨ12およびＧＢ12はすべて、ウェスタンブロティングおよび免疫 沈降によりＨＣＴ116融解物中で、100kＤaのＭＳＨ2タンパク質を認識する。Ｍ ＳＨ2を欠損しているＬoＶo細胞の融解物中では、ウェスタンブロティングある いは免疫沈降により100kＤaのタンパク質は検出されない。さらに、ＥＨ12は、 ホルマリン固定し、パラフィン包埋した正常な結腸において、Ｌiebertkuhnの陰 窩の基底にあ る増殖細胞中に局在する、核の染色増を示す。ＦＥ11は、凍結組織切片を染色す る。 ＭＳＨ2遺伝子は、934アミノ酸のタンパク質をコードする。ＭＳＨ2対立遺 伝子の片方にフレーム内の欠失を持っているＨＮＰＣＣの患者は(ＫＫ)由来の細 胞株は、完全長と880アミノ酸の型として発現された大きさに対応する短い種を 少量発現しているのに対し、正常な細胞とある種の結腸直腸腫瘍の細胞株(例え ば、ＳＷ480)は、野生型の完全長100kＤaのＭＳＨ2タンパク質を発現している。 ＬoＶo結腸直腸腫瘍細胞株は、ＭＳＨ2がホモ結合体として欠損しているため、 ＭＳＨ2タンパク質を発現していない。ＭＳＨ2遺伝子の変異の多くは、短縮型で ある。つまり、短い欠失や、塩基置換を導入し、100kＤaの正常型のＭＳＨ2タン パク質の短縮型を発現する。 抗ＭＳＨ2モノクローナル抗体のすべては、ＭＳＨ2タンパク質を免疫組織化 学的方法によって検出することができるかも評価した。ＭＳＨ2タンパク質は、 通常は核に局在する。ＦＥ11とＥＨ12は、凍結切片あるいはマイクロタイタープ レート中で固定化（immobilize）した後に固定（fix）した培養細胞で核に局在 するＭＳＨ2タンパク質を検出し、そしてＥＨ12は、ホルマリン固定しパラフィ ン包埋した組織でＭＳＨ2タンパク質を検出するために使用することができる。 ＤＮＡ修復機構は、少なくとも４つの異なった遺伝子産物が関わっているの で、私たちは、モノクローナル抗体ＦＥ11あるいはＥＨ12のどちらかを用いて、 細胞間相互作用を維持しうる条件下で、ＭＳＨ2細胞融解物からを免疫沈降する ことにより、ＭＳＨ2と他のタンパク質の安定な複合体について細胞融解物を調 べた。酵母におけるＤＮＡミスマッチ修復の生化学的な解析からＭＳＨ2の酵母 類似体は、通常はミスマッチＤＮＡ対合体の非存在下においては他の既知のＤＮ Ａ修復因子とは結合していないと示唆されていた。図１は、野生型のMSH2を発現 しているＨＣＴ116細胞において両方の抗体は100kＤaのＭＳＨ2タンパク質との 共沈複合体の一部として、160kＤaのタンパク質を共沈させる。ＦＥ11あるいは ＥＨ12のどちらかで免疫沈降した後ＥＨ12でイムノブロットすることでp100のＭ ＳＨ2タンパク質のみ検出されることから、これはＭＳＨ2の改変型でもダイマー でもない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バレル，マリリー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02370, ロックランド，ヴァーノン・ストリート 35 (72)発明者 ヒル，デヴィッド・イー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02174, アーリントン，リッジ・ストリート 85

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 組織中で増殖性の細胞を非増殖性の細胞と区別する方法であって 、以下の工程： 細胞を含む組織を、ミスマッチ修復タンパク質に対して特異的に免疫反応性 である抗体と接触させ、抗体−抗原複合体を形成し、 前記細胞中に、増殖性の細胞の指標である前記抗体−抗原複合体が存在する ことを特定すること を含む前記方法。 ２． 特定する工程が、免疫組織化学的な方法による、請求項１に記載 の方法。 ３． 特定する工程が蛍光免疫的な方法による、請求項１に記載の方法 。 ４． 特定する工程が蛍光活性化細胞分取法（ＦＡＣＳ）による、請求 項１に記載の方法。 ５． ミスマッチ修復タンパク質がｈＭＳＨ２である、請求項１に記載 の方法。 ６． ミスマッチ修復タンパク質がｈＭＬＨ１である、請求項１に記載 の方法。 ７． ミスマッチ修復タンパク質がｈＰＭＳ２である、請求項１に記載 の方法。 ８． 腫瘍細胞中のミスマッチ修復遺伝子中の欠損を特定する方法であ って、以下の工程： 腫瘍細胞を含む組織を、ミスマッチ修復タンパク質に対して特異的に免疫反 応性である抗体と接触させ、抗体−抗原複合体を形成し、 前記抗体−抗原複合体の核局在性を特定し、核の染色性がないことはミスマ ッチ修復遺伝子に欠損が存在することを示すこと を含む前記方法。 ９． 前記特定する工程が免疫組織化学的な方法による、請求項８に記 載の方法。 １０． 前記特定する工程が蛍光免疫的な方法による、請求項８に記載の 方法。 １１． ミスマッチ修復タンパク質がhＭＳＨ2である、請求項８に記載の 方法。 １２． ミスマッチ修復タンパク質がｈＭＬＨ１である、請求項８に記載 の方法。 １３． ミスマッチ修復タンパク質がｈＰＭＳ２である、請求項８に記載 の方法。 １４． 腫瘍性の組織において、抗癌療法の効果をモニターする方法であ って、以下の工程： 抗癌療法を受けた腫瘍性の組織のサンプルを、ミスマッチ修復タンパク質に 対して特異的に免疫反応性である抗体と接触させ、抗体−抗原複合体を形成し、 前記サンプル中の前記抗体−抗原複合体の量を特定し、 前記サンプル中の抗体−抗原複合体の量を、以前に特定した量と比較し、抗 体−抗原複合体の量が減少することが療法の有効性を示すこと を含む前記方法。 １５． 前記特定する工程が免疫組織化学的な方法による、請求項１４に 記載の方法。 １６． 前記特定する工程が蛍光免疫的な方法による、請求項１４に記載 の方法。 １７． 前記特定する工程がＦＡＣＳによる、請求項１４に記載の方法。 １８． 前記特定する工程が酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩ ＳＡ）による、請求項１４に記載の方法。 １９． ミスマッチ修復タンパク質がhＭＳＨ2である、請求項１４に記載 の方法。 ２０． ミスマッチ修復タンパク質がｈＭＬＨ１である、請求項１４に記 載の方法。 ２１． ミスマッチ修復タンパク質がｈＰＭＳ２である、請求項１４に記 載の方法。 ２２． 増殖性の細胞を非増殖性の細胞と区別する方法であって、以下の 工程： 試験する細胞の融解物（ｌｙｓａｔｅ）を調製し、 前記融解物をミスマッチ修復タンパク質に対して特異的に免疫反応性である 抗体と接触させ、抗体−抗原複合体を形成し、 前記融解物中に形成された抗体−抗原複合体の量を特定し、試験する細胞の 融解物が非腫瘍性の細胞の対照となる融解物よりも多くの抗体−抗原複合体を提 供することより試験する細胞が増殖性であることを示すこと を含む前記方法。 ２３． 前記特定する工程がＥＬＩＳＡによる、請求項２２に記載の方法 。 ２４． ミスマッチ修復タンパク質がｈＭＳＨ２である、請求項２２に記 載の方法。 ２５． ミスマッチ修復タンパク質がｈＭＬＨ１である、請求項２２に記 載の方法。 ２６． ミスマッチ修復タンパク質がｈＰＭＳ２である、請求項２２に記 載の方法。 ２７． 増殖性の細胞を非増殖性の細胞と区別する方法であって、以下の 工程： 試験する細胞の核を分離し、 試験する前記細胞の前記核の融解物を調製し、 前記融解物をミスマッチ修復タンパク質に対して特異的に免疫反応性である 抗体と接触させ、抗体−抗原複合体を形成し、 前記融解物中に形成された抗体−抗原複合体の量を特定し、核の融解物が非 腫瘍性細胞の核の対照となる融解物よりも多くの抗体−抗原複合体を提供するこ とより試験する細胞が増殖性であることを示すこと を含む前記方法。 ２８． 前記特定する工程がＥＬＩＳＡにより行われる、請求項２７に記 載の方法。 ２９． ミスマッチ修復タンパク質がｈＭＳＨ２である、請求項２７に記 載の方法。 ３０． ミスマッチ修復タンパク質がｈＭＬＨ１である、請求項２７に記 載の方法。 ３１． ミスマッチ修復タンパク質がｈＰＭＳ２である、請求項２７に記 載の方法。 ３２． 腫瘍を持つ患者を特定する方法であって、以下の工程： ヒトにおいて、自己抗体の存在がヒトにおいて腫瘍が存在することを示す、 ミスマッチ修復タンパク質に対する前記自己抗体を検出すること を含む前記方法。 ３３． ミスマッチ修復タンパク質がｈＭＳＨ２である、請求項３２に記 載の方法。 ３４． ミスマッチ修復タンパク質がｈＭＬＨ１である、請求項３２に記 載の方法。 ３５． ミスマッチ修復タンパク質がｈＰＭＳ２である、請求項３２に記 載の方法。