KR101415927B1 - 항―ｔｍａｐ／ｃｋａｐ２ 항체를 포함하는 암의 예후 진단용 조성물 - Google Patents

항―ｔｍａｐ／ｃｋａｐ２ 항체를 포함하는 암의 예후 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TMAP(Tumor associated microtubule associated protein)/CKAP2(cytoskeleton associated protein 2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이들의 단편 및 이들을 이용하여 유사분열 유무를 확인하는 방법 및 암의 예후를 진단하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 암의 예후 진단용 조성물, 상기 조성물을 이용하여 TMAP/CKAP2를 검출하는 방법, 암의 예후 진단용 항-TMAP/CKAP2 항체, 상기 조성물을 이용한 암의 예후 진단을 위한 정보제공 방법, 후보물질을 처리함으로써 TMAP/CKAP2의 항원-항체 반응 수준 변화를 측정하는 것을 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법 및 상기 조성물을 이용한 세포 분열 주기 측정용 조성물에 관한 것이다.

Description

항―ＴＭＡＰ／ＣＫＡＰ２ 항체를 포함하는 암의 예후 진단용 조성물{Composition for diagnosing susceptibility to cancer comprising anti-TMAP/CKAP2 antibody}
본 발명은 TMAP(Tumor associated microtubule associated protein)/CKAP2(cytoskeleton associated protein 2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이들의 단편 및 이들을 이용하여 유사분열 유무를 확인하는 방법 및 암의 예후를 진단하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 암의 예후 진단용 조성물, 상기 조성물을 이용하여 TMAP/CKAP2를 검출하는 방법, 암의 예후 진단용 항-TMAP/CKAP2 항체, 상기 조성물을 이용한 암의 예후 진단을 위한 정보제공 방법, 후보물질을 처리함으로써 TMAP/CKAP2의 항원-항체 반응 수준 변화를 측정하는 것을 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법 및 상기 조성물을 이용한 세포 분열 주기 측정용 조성물에 관한 것이다.
우리나라 암(악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명 (조사망률 인구 10만명 당 512명) 가운데 25.5% (남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만명 당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 간암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 간암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수(28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수(40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수(13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수(22,710명)의 60%를 차지하고 있다.
이러한 암의 종류는 현재까지 밝혀진 것만 해도 수십 종에 이르며, 주로 발병 조직의 위치에 따라 구분된다. 암은 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암등이 있다. 또한 이러한 암의 발병 기전 또는 형태에 따라 다른 분류 체계에 의해 구분되기도 한다.
그 중 유방암은 피부암과 함께 여성들에게서 흔히 발생하는 암으로서, 개선된 검출 방법, 집단 스크리닝(mass screening) 및 과거 십 여 년간에 걸친 치료 방법의 발달로 유방암으로 진단된 여성의 전망이 개선되고 있음에도 불구하고, 여전히 많은 수의 여성이 유방암으로 인하여 고통을 받고 있다. 초기 단계의 유방암으로 진단 받은 여성의 약 20%는 10년 후 예후가 나빠 재발, 전이 되거나 이 기간 내에 사망한다. 반면 초기 단계에서 진단받은 나머지 80%의 유방암 환자는 10년 후 예후가 우수하다고 보고되고 있다. 이처럼, 유방암은 같은 진행 단계에서 발견되었다 하더라도 초기 단계의 유방암 환자의 예후가 서로 상이하여, 이들을 구분할 수 있는 평가 방법이 절실히 필요한 실정이다.
예후 표지자(indicator)는 종양 크기, 림프절 상태 및 조직학적 등급뿐 만 아니라 예후에 대한 일부 정보를 제공하며, 특정 치료제에 대한 반응 가능성을 제시할 수 있다. 예컨대, 에스트로겐(ER) 및 프로게스테론(PR) 스테로이드 호르몬 리셉터 상태 측정법은 유방암 환자 평가에 흔히 사용하는 방법이 되었다. 그 밖에도 호르몬 리셉터 양성인 종양 여부에 대한 진단되는 경우, 호르몬 요법에 반응할 것이고, 상대적으로 느린 증식 양상을 보이므로, ER+/PR+ 종양이 있는 환자의 예후는 보다 양호한 편이다.
한편, 인간 상피 성장 인자 리셉터2 (HER-2), 트랜스 멤브레인 타이로신 키나제 리셉터 단백질의 과발현은 양호하지 않은 유방암 예후와 관련성이 있다(Ross et al. (2003) The Oncologist :307-325). 현재, 유방 종양에서의 Her2/neu 발현 수준을 이용하여, 항-Her-2/neu 항체 치료제 트라스투주맵(trastuzumab)(Herceptin; Genentech)에 대한 반응을 예측하고 있다. 또한, Ki-67은 세포 주기의 G1기에서 발현되어 M기까지 가는 비-히스톤성 핵 단백질로서, Ki-67 과발현 여부를 확인함으로써, 유방암의 양호하지 않은 예후와 상관성이 있음을 진단할 수 있는 방법이다.
이와 같이 예후 기준 및 분자 마커는 환자의 운명을 예측하고 적정 치료 경로를 선정하는데 일부 지침을 제공하고 있으나, 여전히 유방암의 예후를 정확하게 진단하는 데에는 한계가 있으며, 따라서 효과적인 예후 예측을 위한 진단 방법 또는 이를 진단할 수 있는 표지자에 대한 연구가 시급하다.
그 밖의 다른 암과 관련하여, 폐암은 19세기까지만 해도 드문 질환이었으나, 20세기 들어 흡연이 보편화되면서 급격히 증가하기 시작하여 우리나라에서도 폐암의 발생이 가파르게 상승하고 있는 추세이다. 또한 폐암은 다른 암에 비해 치료가 잘 되지 않아, 발병률은 1위가 아니나, 사망자는 암 환자 중 가장 많은 것으로 알려져 있다.
암세포가 어떠한 경로로 어떻게 생기는지에 관하여는 아직 확실히 밝혀지지 않고 있으나, 정상세포의 증식조절의 기능을 가진 유전자의 변형에 의해, 증식조절이 되지 않는 세포가 생겨 암이 발생하는 것으로 보는 것이 일반적인 견해이다. 이러한 암은 그 진행 정도에 따라, 암세포가 점막 내에 국한되어 있는 상태를 조기암으로 분류하고 있는데, 다양한 암에 있어, 조기암 상태에서 발견된 환자의 치료의 예후는 비교적 좋은 것으로 나타난다. 따라서 암의 조기 진단 및 치료는 암의 사망률을 낮추고, 암의 치료비용을 낮추는데 기여할 것으로 평가된다. 그러나 암은 많은 경우에 있어서 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 있다고 하더라고 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하여 암의 사망률을 높이는 원인이 되고 있다.
현재까지의 암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이다. 그 예로 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법 또는 점막촬영법 등이 있고, 내시경을 사용하여 내부 장기를 직접 육안으로 확인함으로써, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변까지 발견할 수 있을 뿐 아니라 암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단률을 높이고 있다. 하지만 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다.
또한, 현재까지 진행되고 있는 암의 치료는 대부분 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 특히 완치를 목표로 하는 경우 외과적인 절제방법이 유일하다. 이러한 외과적 절제에 있어, 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한 한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 다만 이러한 경우에도 암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이 때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는 일시적 효과만 있을 뿐, 근본적인 암의 치료에 있어서는 한계가 있고, 항암제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다.
따라서 암을 치료하기 위해서는, 치료 이전의 단계에서 높은 민감도와 특이도를 가진 암의 진단 방법의 개발이 무엇보다 중요하며, 이러한 진단은 암의 초기에 발견될 수 있는 것이어야 한다. 나아가 구체적 암에 대한 예후를 예측하여 맞춤형 진단 및 치료가 요구되고 있다. 그러나 현재까지 암 진단에 있어서 초기에 특이적으로 병소를 감지하여 발병 여부를 판단하는 분자적 진단 기술은 미미한 실정이고 특정 암에 대해서는 아직까지 그 방법이 전무한 상태라고 해도 과언이 아니다.
한편, 암의 진행은 세포의 증식 및 성장이 필수적인데, 대부분 비정상적인 유사세포 분열과정을 거치게 된다. 일반적으로 세포 주기라 하는 정상적인 유사세포 분열은 하나의 세포가 분열하여 두 개의 세포로 나누어지는 일련의 과정으로 세포가 증식하기 위한 준비단계인 G1기를 거쳐 DNA 복제가 일어나는 S(Interphase)기가 진행되고 DNA 합성 후기인 G2기를 거쳐 세포분열을 하는 M(Mitotic phase)기 단계를 거친다. 이러한 세포주기 과정 가운데 G1기와 S기 사이, G2기와 M기 사이에 세포의 성장을 점검하는 두 번의 확인지점 (check point)이 존재하여 정상적인 세포는 다음 단계로 진행시키고 비정상적인 세포는 자가사멸을 유도하게 된다. 또한 정상적인 세포에서는 G1기에 성장인자와 영양이 충분히 공급되지 못하면 세포주기를 멈추게 되고 성장 휴지기인 G0 상태로 접어들게 된다. 특히 세포의 실질적 분열이 일어나는 분열기인 M기는 시간적으로 가장 짧고 가장 드라마틱한 단계로 복제된 게놈이 세포의 양극으로 분리되어 두 개의 딸세포가 만들어지는 단계이다. 이러한 일련의 과정은 한 세포가 성장하여 두 세포로 분열되기 위해서 모든 세포가 거치는 과정이므로 세포의 생명유지에 매우 중요한 과정이다. 세포가 M 기에서 분열이 되면 G1기에서 성장을 통해 다음으로 넘어가야 하는데, 암세포의 경우 DNA의 손상에 의해 자가사멸 기능을 상실하여 확인지점에서 다음단계로 진행시키지 못하고 계속 M기에 머물러 과도한 세포분열이 일어나기 때문에 세포의 수가 빠르게 증가하고 성장하게 된다. 즉 암은 세포의 정상적인 분열 기작을 깨뜨리고, M기의 무한반복을 통하여 증식하는바, 이러한 비정상적 세포주기를 검출하는 표지자를 개발하는 경우 암의 진단뿐만 아니라 치료제 개발로도 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
이러한 배경 하에서 본 발명자는 암의 진단을 위하여 세포주기를 측정하기 위한 표지자를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, TMAP/CKAP2의 발현 여부 및 발현양을 검출하는 경우 구체적인 분열시기 뿐만 아니라 유사세포분열이 필수적인 암에 대한 진단용으로 사용할 수 있음을 확인하였을 뿐만 아니라, 유방암 환자의 생존율과 무병생존율을 예견할 수 있는 표지자로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항-TMAP/CKAP2(Tumor associated microtubule associated protein/cytoskeleton associated protein 2) 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 암의 예후 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TMAP/CKAP2 에 특이적으로 결합하는 암의 예후 진단용 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 암의 예후 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 결합부위를 포함하는 조성물을 이용하여 암을 가진 개체에서 TMAP/CKAP2를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 예후가 좋은 것으로 알려진 개체로부터 분리된 대조군 시료 및 암이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에 항-TMAP/CKAP2의 항체 또는 이의 항원결합부위를 처리하는 단계; (b) 상기의 단계 (a)의 항원-항체 반응 수준을 비교하는 단계;및 (c) 상기 단계 (b)에서 대조군 시료에 비해 암이 의심되는 개체로부터 분리된 시료의 항원-항체 반응 수준이 높은 경우, 해당 개체를 예후가 좋지 않은 암 환자로 판정하는 단계를 포함하는 암의 예후 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 조성물을 이용하여 암세포에서 TMAP/CKAP2의 항원-항체 반응 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 단계 (a)에 비해 상기 단계 (b)의 후보물질 처리 후 항원-항체 반응 수준이 감소됨을 확인하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 세포 분열주기 측정용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 항-TMAP/CKAP2(Tumor associated microtubule associated protein/cytoskeleton associated protein 2) 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 암의 예후 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로서, 본 발명의 목적상, 암의 발병 여부를 확인하는 것뿐만 아니라 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게 본 발명의 항-TMAP/CKAP2 항체를 이용하는 경우, 개체의 시료로부터 TMAP/CKAP2 발현 수준을 확인함으로써 해당 개체의 암의 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 예후가 좋을 것인지 여부에 대해서까지 예측이 가능하다. 또한 본 발명에서 용어 "예후"란 암과 같은 신생물 질환의 예를 들어 재발, 전이성 확산 및 약물 내성을 비롯한 암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 유방암, 위장관기저종양, 간암, 편평상피세포암, 비소세포암 또는 소세포암의 예후를 예측하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 유방암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 것이다.
본 발명에서 용어 "무병생존율"이란 암의 수술 후 암의 재발이 없이 생존하는 가능성을 의미하며, "생존율"이란 암의 재발여부에 관계 없이 생존하는 가능성을 의미한다.
본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커 (diagnosis marker)"란 암세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포 또는 예후가 좋은 암 세포에 비하여 예후가 좋지 않은 암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 암 진단마커는 TMAP/CKAP2이다.
본 발명에서 용어, "TMAP/CKAP2"란 Tumor associated microtubule associated protein/cytoskeleton associated protein 2의 약자로서, LB1 및 se 20-10으로도 알려져 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 상기 TMAP/CKAP2를 검출함으로써 해당 개체 내에서의 암 발병여부 및 암의 예후에 대해 확인할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 간암, 폐암, 유방암, 갑상선암, 고환암, 골수이형성증, 구강암, 균상식육종, 급성골수성 백혈병, 급성림프구성, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포 종양, 뇌종양, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 방광암, 부갑상샘암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 소아뇌종양, 소아림프종, 외음부암, 원발부위 불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관 간질종양, 위장관 기저종양, 월름종양, 유방암, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성뇌종양, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 편도암, 편평상피세포암, 선암, 대세포암, 피부암 및 후두암의 진단용 또는 예후 진단용으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 암세포 분열이 활발한 상기 암에 대한 전이성 암에 대한 진단 및 예후 진단용으로, 더욱 바람직하게는 간암 또는 폐암의 진단 또는 예후 진단용으로, 보다 더욱 바람직하게는 세포의 유사분열의 활성 여부에 따라 그 예후가 결정되는 유방암 또는 위장관기저암(GIST)과 같은 암의 예후 진단용으로 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 유방암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 예후 진단용으로 사용할 수 있다.
본 발명자들은 이러한 본 발명의 조성물이 갖는 진단 및 예후 예측 효과를 확인하기 위하여 본 발명자들이 제작한 TMAP/CKAP2에 대한 항체를 사용하여 인간 암 조직 및 각종 정상 조직에서 면역조직화학염색을 실시한 결과, 정상조직에 비해 암 조직에서 염색된 세포의 수가 현저하게 많음을 확인하였으며, 정상조직 대부분의 세포에서는 TMAP/CKAP2의 발현이 거의 없음을 확인하였다. 또한 TMAP/CKAP2의 발현이 유방암 환자의 생존율 및 무병생존율과 연관성이 크다는 것을 최초로 규명하였다. 이와 같은 확인은 4가지 서로 다른 분석방법인 염색체 천분율(chormosome permillage)분석, 전체 천분율(total permillage)분석, 필드 크로모솜 카운트(field chromosome count)분석, 필드 토탈 카운트(field total count)분석으로 분석해본 결과, 유사하게 TMAP/CKAP2 발현이 높은 군일 수록 무병생존율 및 생존율이 낮음을 확인하였다. 특히, 본 발명의 조성물은 유사분열 중인 세포의 염색체와 방추사와 결합함으로써 염색되는 바, 염색되는 위치를 검출함으로써 비정상적 세포분열에 의한 암세포 증식이 활발하게 일어나고 있는 구체적인 위치까지 확인이 가능하다. 즉, 본 발명의 조성은 암의 발생 및 진행에 의해 유사분열이 일어나고 있는 영역과 주위의 기질을 구분할 수 있어, 구체적인 부위와 분열시기까지 판단이 가능하다.
이러한 TMAP/CKAP2은 B세포 림프종, cutaneous T 세포 림프종 및 유방암 세포주와의 관계에 대해 일부 알려져 있으나, 이에 대한 항체를 이용하여 암을 진단할 수 있다거나 치료할 수 있다는 사실에 대해서는 알려진 바 없으며, 그 예후까지 진단 가능하다는 내용에 대해서는 전혀 개시된 바 없다. 또한 간암 및 폐암에 대한 진단 가능성에 대해서도 알려진 바 없으며, 소세포폐암에의 진단 가능 여부 및 비소세포폐암과의 구별을 위한 수단으로 사용될 수 있다는 점에 대해서도 보고된 바 없다. 특히 유방암 또는 위장관기저종양과 같은 암과 관련하여, 본 발명자들은 이들의 암세포 분열에 의한 증식으로 인해 상기 암을 가지는 암 환자의 예후를 진단할 수 있다는 점을 규명하였다. 이에 본 발명자들은 TMAP/CKAP2에 대한 항체를 직접 제조하는 한편, 이들을 이용하여 암의 진단 가능성, 나아가 구체적인 암의 진단 및 그 예후 예측이 가능함을 최초로 확인하였다. 아울러, 유방암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 진단 표지자로 사용할 수 있음을 최초로 규명하였다. 보다 바람직하게 본 발명의 조성물은 간암 및 폐암의 진단 및 예후 진단용으로 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 세포의 유사분열 여부를 확인함으로써 그 예후에 대한 예측이 가능한 유방암 또는 위장관기저종양(GIST, gastrointestinal stromal tumor)와 같은 암의 예후 진단용으로 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는 유방암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 암의 예후 진단용으로 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 조성물을 이용하여 유방암 조직에 대해 염색을 수행한 결과, 유방암 세포의 분열이 활발하게 일어나는 세포에 특이적으로 염색됨을 확인하였다. 한편, 세포분열의 표지자로서 유방암의 예후를 예측할 수 있다고 알려진 Ki-67 항체와 비교한 결과, 본 발명의 조성물이 Ki-67에 비해 세포 분열이 일어나고 있는 조직 특이적으로 염색될 수 있음을 확인하였다(도 8). 또한 본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 조성물을 이용하여 암절제술을 받은 유방암 환자의 생존율과 무병생존율을 분석한 결과, TMAP/CKAP2 발현이 높은 군에서 상대적으로 낮은 생존율과 무병생존율을 보이는 것을 확인하였다(도 11 내지 13).
유방암은 유방에 생긴 암 세포로 이루어진 종괴로서, 일반적으로 유방의 유관과 소엽에서 발생한 암을 의미한다. 그 원인 인자에 대해서는 명확하게 규명되지 않았으나, 에스트로겐의 영향, 나이, 출산경험, 음주 및 가족력과 같은 요인에 의한 것으로 추정하고 있다. 이러한 유방암의 생존율은 5년 생존율의 경우, 0기 암의 경우 100%에 가까우나 4기의 경우 20% 미만으로 보고되고 있으며, 수술적 절체, 화학 요법, 방사선 치료, 항호르몬 치료 등의 방법이 있다. 유방암의 예후는 암의 병기에 따라 달라지는 것으로 보고되고 있으나, 실질적으로 동일함 병기를 가지는 환자라 하더라도 전혀 다른 예후를 나타내는 경우도 많이 보고되고 있어, 유방암의 예후에 대한 구체적인 표지자의 설정이 필요하다.
한편, 위장관기저종양(GIST, gastrointestinal stromal tumor)은 위장관의 중배엽 종양 중 하나로서, Kit 유전자 또는 PDGFRA 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. GIST를 갖는 환자들은 음식물 섭식 장애, 위창자 출혈(gastrointestinal hemorrhage)를 나타내며, 주로 간으로 전이되는 것으로 알려져 있다. GIST 역시 암의 예후를 예측하는 것이 중요한데, 암 세포의 증식 정도가 예후 판정에 결정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있음에도 효과적인 예측이 가능한 구체적인 표지자에 대해서 알려지지 않아 예후 예측에 어려움을 겪고 있다.
실질적으로 초기 단계의 유방암으로 진단된 환자라 하더라도, 동일한 시술로 치료 받은 환자 중 20%에서는 예후가 좋지 않아 재발 또는 전이되거나, 10년 이내에 사망한다. 따라서 이러한 예후의 정확한 예측을 위하여 효과적인 진단 방법이 요구되는데, 이 암에 있어서 예후 진단은 세포 분열 활성 여부를 탐지함으로써 달성될 수 있다. 그러나 실질적으로 암의 진행과 별개로 암 세포의 증식이 활발하게 진행되고 있는지 또는 세포 분열이 활발하게 일어나고 있는지에 대한 정보를 제공하는 수단은 미미한 실정이다. 본 발명의 조성물은 상기와 같은 경우에 있어서, 유방암 또는 GIST 환자에 대한 정확도가 높은 예후 진단 수단을 제공하며, 구체적으로는 본 발명의 조성물을 진단하고자 하는 세포에 투여하여, 세포 분열 여부 및 활성 정도를 확인함으로써 이루어질 수 있다.
유방암 또는 GIST와 같은 암 환자의 가장 중요한 예후인자 중 하나는 세포분열 정도인데, 따라서 이를 측정하는 방법으로 유사분열 활성 표지자(mitotic activity index)를 사용할 수 있다. 그 중 상기 유사분열 활성 표지자로서, 종래에는 암조직을 H&E 염색한 후 현미경으로 분열기(mitotic phase)에 있는 세포의 수를 세는 방법을 사용하였는데 이러한 방법은 많은 시간이 소요되며, 병리학자의 주관적인 판단에 의해 판단하므로 개인마다 편차가 심한 단점이 존재한다. 이러한 배경 하에서 본 발명자들은 분열기에 있는 암세포를 동정하기 위한 방법을 개발하고자 노력한 결과, 인간에 대한 항-TMAP/CKAP2 항체를 이용하여 사람의 여러 조직과 여러 암 조직에서 조직면역화학염색을 하여 관찰하였으며, 항-TMAP/CKAP2 항체가 암 조직의 분열기에 있는 정상세포 뿐 아니라 분열기에 있는 암세포를 쉽게 구별해 낼 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.
항-TMAP/CKAP2 항체는 분열기에 있는 염색체 혹은 염색체주위의 구조를 염색함으로써 쉽게 유사 분열 중인 세포를 발견할 수 있는 장점이 있어, 이에 대한 정보가 중요한 유방암 또는 GIST와 같은 암의 예후 진단을 위한 객관적이고 신속한 방법을 제공할 수 있다. 분열기에 있는 세포를 쉽게 측정하기 위한 종래의 노력으로 항-Ki-67 항체를 사용하여 많은 연구 및 다양한 시도가 되어 왔는데, Ki-67의 발현은 분열기에 국한되지 않고 후기 G1, S, G2 및 M기에 걸쳐 많은 세포주기동안 발현되어 염색되는 세포의 수가 지나치게 많아 유사분열 활성 표지자로 사용되는 데에는 한계가 존재하였다. 그러나, 본 발명의 항-TMAP/CKAP2 항체는 분열기에 있는 염색체 혹은 염색체주위 구조물에 특이하게 발현하여 쉽게 유사분열 중인 세포를 확인할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 항-TMAP/CKAP2 항체를 포함하는 조성물은 세포질에 발현되는 경우도 많이 발견되는데, 이들 세포는 분열기 전 단계인 G2기 세포들일 것으로 추정하고 있다. G2기에 있는 세포들과 M기에 있는 세포들의 비율은 G2/M기 체크 포인트(checkpoint)가 어떤 상태인 지를 반영하므로 암환자의 예후 또는 항암제 내성 및 반응성에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 조성물은 G2기와 M기의 분포를 모두에 분석할 수 있는 최초의 조성물로서, 항암 및 암의 예후 진단과 관련한 분야의 연구에 중요한 자료로 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명의 TMAP/CKAP2은 유방암 환자의 무병생존율 및 생존율과 높은 연관성이 있으며, TMAP/CKAP2의 발현이 높을수록 무병생존율 및 생존율의 비율이 낮아진다는 것을 예측할 수 있으므로, 유방암 환자의 특정 치료제, 및/또는 암의 수술로 제거, 및/또는 암 재발 없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후 생존할 여부 및/또는 가능성을 예측할 수 있다. 본 발명의 조성물은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측용 조성물은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측할 수 있다. 또한 본 발명의 바람직한 실시예에서는 기존의 세포 분열 및 증식을 측정하는 표지자로 사용되던 Ki-67 발현과 생존율의 상관관계를 TMAP/CKAP2와 비교한 결과, TMAP/CKAP2의 경우가 생존율과의 관련성이 훨씬 컸으며 (도 11A 내지 11C), 이러한 결과는 TMAP/CKAP2가 유방암 환자의 무병생존율 및 생존율 예측 예후 표지자로 강력하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
한편 본 발명의 조성물은 유방암 또는 GIST외 특히 소세포폐암에 대한 민감도 및 특이도를 나타내는 바 소세포폐암의 진단용, 나아가 소세포폐암을 다른 암과 구분하기 위한 용도로 사용이 가능함을 확인하였다.
폐암은 크게 소세포폐암(small cell lung cancer)과 비소세포폐암(non-small cell lung cancer)으로 구분되며, 비소세포폐암은 다시 선암, 편평상피세포암 및 대세포암으로 구분된다. 상기와 같은 구분은 비록 소세포폐암이 발병 조직의 위치에 의해 폐암의 일부로 구분되기는 하나, 다른 폐암과는 임상 경과, 치료법 및 예후 면에서 확연히 구분되는 특징이 있어 별개의 암으로 구분하고 있다.
구체적으로 소세포폐암은 비소세포폐암과는 달리 대부분 진단 당시 수술적 절제가 어려울 정도로 진행되어 있는 경우가 많으며, 급속히 성장하여 전신 전이를 잘하나, 화학요법이나 방사선 치료에 잘 반응하는 것으로 알려져 있다. 소세포폐암은 악성도가 강하며, 발견 당시 림프관이나 혈액 순환을 통하여 다른 장기, 반대편 폐, 종격동으로 전이되어 있는 상태로 발견되는 경우가 많다. 주로 기도 (기관지나 세기관지)에서 처음으로 발병하는 것으로 알려져 있다. 대체적으로 종괴가 크며, 회백색을 띠고 기관지벽을 따라 증식하며, 주요 전이 장기로는 뇌, 간, 뼈, 폐, 부신, 신장 등의 순서로 전이되는 것으로 알려져 있다.
한편, 비소세포폐암은 상술한 바와 같이 선암, 편평상피세포암(squamous cell acrcinoma), 선암(adenocarcinoma) 및 대세포암(large-cell carcinoma)으로 나뉘고, 편평상피세포암은 주로 폐 중심부에서 발견되며, 남성에게 흔하고, 흡연과 관련이 많은 것으로 알려져 있다. 임상증상으로서 편평상피세포암은 주로 기관지 내강으로 자라 기관지를 막음으로써 나타나게 된다. 이에 반해 선암은 폐 말초부위에서 주로 발생하고, 여성 또는 비흡연자에게서도 잘 발생하며, 크기가 작아도 전이가 되어 있는 경우가 많다. 선암은 최근 그 발생빈도가 증가하는 추세에 있다. 마지막으로 대세포암은 폐암의 4 내지 10% 정도로 발생하는 암의 종류로서 폐표면 근처 (폐 말초)에서 주로 발생하고, 절반 가량은 큰 기관지에서 발생한다. 세포 크기가 대체적으로 크며, 그 중 일부는 빠르게 증식 및 전이되는 경향이 있어 다른 비소세포폐암에 비해 예후가 나쁜 것으로 알려져 있다.
본 발명의 TMAP/CKAP2에 대한 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 암 진단 마커는 상기 폐암 전반적으로 높은 발현을 나타내는 것으로 보아 대부분의 폐암에 있어서 진단이 가능함을 확인하였다. 또한 상기 폐암 중에서도, 특히 소세포폐암 특이적으로 검출이 가능함을 확인하였는데, 이러한 본 발명의 특징에 따라 폐암 및 간암을 포함한 암에 대한 진단 뿐만 아니라, 소세포폐암에 대한 진단이 가능하며, 암세포 증식에 의한 진행을 진단할 수 있어 예후를 예측하는 방법으로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라 본 발명자들은 본 발명의 조성물이 종래에 알려진 일반적인 방법으로 구분이 어려운 소세포폐암과 비소세포폐암을 구분하는데 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 구체적으로 본 발명자들은 이와 같은 본 발명의 진단 및 검출능을 확인하기 위하여, 폐암 조직을 이용하여 조직 면역화학을 실시한 결과, 1) 폐암의 종류에 따라 TMAP/CKAP2의 발현에 차이가 있음을 관찰하였는데, 2) 특히 선암보다는 편평세포암에서의 발현이 증가하였음을 확인하였다. 3) 특히 본 발명의 조성물은 소세포폐암 특이적으로 그 반응률이 높음을 확인하였으며, 실제로 소세포폐암 세포에서 TMAP/CKAP2 염색이 증가하게 됨을 확인하였다. 이는 상기에서 서술한 바와 같이 소세포폐암은 다른 비소세포폐암과 달리 임상경과, 예후 및 치료방식에 차이가 있다는 점에서 소세포폐암 진단용 조성물로 매우 유용할 수 있고, 나아가 다른 검사 또는 진단 방법으로 소세포폐암과 비소세포폐암의 구분이 어려운 경우, 본 발명의 조성물이 이들 방법을 대체하거나 추가적인 진단 방법으로 사용될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 조성물은 TMAP/CKAP2에 대한 항체를 포함하며, 또한 상기 항체의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 면역학적으로 특정 항원과 반응성인 면역글로불린 분자를 포함하며, 다클론항체 (polyclonal antibody) 및 단일클론항체 (monoclonal antibody)를 모두 포함한다. "단일클론항체" 역시 공지된 용어이며, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자로서 단일 항원성 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일에피토프에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 빛 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양 등의 방법에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
또한 당업자라면, 본 발명에 따른 단일클론항체가 인체에 적용하기 위해 면역원성을 감소시킨 카이메릭 항체, 인간화항체 및 인간 단일클론항체로 전환될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 카이메릭 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 재조합 시킨 것이고, 인간화 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역에서 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정 영역 (complementarity determining regions : CDRs) 또는 상보성 결정 영역 중에서도 항원 결합 특이성에 관여하는 아미노산 잔기들 (specificity determining residues : SDRs) 만을 인간항체에 이식시킨 것이다.
인간화항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역 중 중쇄 가변영역이나 경쇄가변영역을 인간 항체의 중쇄 가변영역이나, 경쇄 가변영역으로 치환하고, 그 결과 항원결합능을 나타내는 하이브리드 (hybrid:생쥐 중쇄/인간 경쇄 혹은 생쥐 경쇄/인간 중쇄) 항체로부터 생쥐 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역을 골라낸 후 이를 인간항체 불변영역과 연결시키는 등의 공지방법을 사용하여 본 발명의 단일클론항체로부터 용이하게 제조 가능하며, 이러한 변이체가 본 발명의 범위에 속함은 당연하다. 위와 같이 제조된 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 단일클론항체는 공지의 방법을 사용하여 동물세포에서 생산할 수 있다.
또한 본 발명의 단일클론항체는, 상기한 바와 같은 결합의 특성을 갖는 한 그의 단편이라도 무방하다. 즉 본 발명의 항체는, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편으로서 암 진단 및 여부 진단에 사용될 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 공지의 단일클론항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 융합 방법 (fusion method)에 의해 만들어 질 수 있다 (Kohler et al., European Journal of Immunology 6;511-519). 이 방법은 전통적 하이브리도마 제조 방법과 유사하나 마우스의 면역글로불린 유전자를 불활성화 시키고 대신 사람의 면역글로불린 유전자 좌위를 이식한 형질전환 마우스를 제조하여 얻을 수 있다.
또한 인간 항체 라이브러리를 제조항체절편(Fab, ScRv)의 형태로 박테리오파지의 표면에 발현시켜 특정 항원에 대한 항체클론들을 선별하는 기술인 파지디스플레이 기술을 통해 단일클론항체를 제조할 수도 있으나, 상기 방법에 의해 본 발명의 항체를 제조하는 방법이 제한되는 것은 아니다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역 (상기 부위는 "도메인"으로 또한 알려져 있음)를 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, "상보성 결정 영역" (complementaritydetermining resion, 이하, ‘CDR’이라 함)라고 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 "구조 영역" (framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명의 항체는 암의 예후를 진단할 수 있는 TMAP/CKAP2 에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 제한없이 포함되나, 바람직하게는 서열번호 38로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 39로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 40으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 42로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 43으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 44로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있으며, 더 바람직하게는 서열번호 45로 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 46으로 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명의 조성물은 TMAP/CKAP2에 특이적으로 결합하는 암의 예후 진단용 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 면역학적으로 특정 항원과 반응성인 면역글로불린 분자를 포함하며, 다클론항체 (polyclonal antibody) 및 단일클론항체 (monoclonal antibody)를 모두 포함한다.
항체에 대한 설명은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 항체는 암의 예후를 진단할 수 있는 TMAP/CKAP2 에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 제한없이 포함되나, 바람직하게는 서열번호 38로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 39로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 40으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 42로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 43으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 44로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있으며, 더 바람직하게는 서열번호 45로 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 46으로 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는, 사람 TMAP/CKAP2 단클론항체 하이브리도마를 생산하여, 상기 앙성클론의 서열을 분석한 결과 서열번호 37 및 41의 DNA 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄영역을 갖는 것을 확인하였다(도 2 및 3).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 암의 예후 진단용 키트에 관한 것이다. TMAP/CKAP2 및 사용가능한 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편은 상기 서술한 바와 같으며, 이러한 본 발명의 조성물을 구성 요소로 포함하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 키트의 형태로 제조될 수 있음은 자명하다. 본 발명의 목적상 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위에 의해서 암의 예후를 진단할 수 있는 암은 상기에서 설명한 암들을 제한 없이 포함하나, 바람직하게는 유방암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 것을 특징으로 하는 유방암 예후 진단용 키트이다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 조성물을 이용하여, 암을 가진 개체에서 TMAP/CKAP2를 검출하는 방법에 관한 것이다.
하기 서술되는 바와 같이 본 발명의 조성물을 이용할 경우, 세포의 유사분열기에 발현되는 TMAP/CKAP2를 검출할 수 있으며, 나아가 이러한 조성물은 암 환자, 바람직하게는 폐암 또는 간암을 가진 개체, 더욱 바람직하게는 소세포폐암을 가진 개체, 보다 더욱 바람직하게는 유방암 또는 GIST와 같이 암세포 분열 여부를 측정하여 예후를 진단하기 위한 개체로부터 TMAP/CKAP2를 검출하는데 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 유방암 환자의 무병생존율 또는 생존율 예후를 진단하기 위한 개체로부터 TMAP/CKAP2를 검출하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 예후가 좋은 것으로 알려진 개체로부터 분리된 대조군 시료 및 암이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 처리하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 항원-항체 반응 수준을 비교하는 단계, 및 (c) 상기 단계 (b)에서 대조군시료에 비해 암이 의심되는 개체로부터 분리된 시료의 항원-항체 반응 수준이 높은 경우, 해당 개체를 예후가 좋지 않은 암 환자로 판정하는 단계를 포함하는 암의 예후 진단을 위한 정보를 제공방법에 관한 것이다.
바람직하게 본 발명은 TMAP/CKAP2에 대한 항체를 시료에 처리하여, 그 반응정도를 비교 분석함으로써 대상 시료를 가진 개체가 암에 대해 어떤 예후를 가지는지를 확인할 수 있다. 또한 이러한 방법은 예후가 좋다고 알려진 대조군의 개체와 항원-항체의 반응 수준을 비교함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는 유방암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에서 예후가 좋다고 알려진 개체란 암이 발병 후 전이, 재발, 사망 등의 이력이 없는 개체를 의미한다. 암이 의심되는 개체의 시료란 암 또는 종양이 이미 발생하였거나 발생할 것으로 예상되는 개체 또는 조직의 시료로써, 그 예후를 진단하고자 하는 대상 시료를 의미한다.
본 발명에서 용어 "시료"란 개체의 암 조직에서 TMAP/CKAP2의 발현수준이 차이가 나는 전혈, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액과 같은 시료 등을 포함하며, 세포 분열 여부를 검출할 수 있는 세포를 포함하는 시료이면 제한되지 않는다.
본 발명의 암의 예후 진단을 위한 정보제공 방법은 상기와 같은 대조군 및 실험군에 항-TMAP/CKAP2 항체를 처리한 후 항원-항체의 반응 수준을 비교할 수 있는데 본 발명에서 항원-항체 반응 수준이란 시료 중의 TMAP/CKAP2 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부위와 결합된 양을 의미하며, 항원-항체 복합체의 양이다. 이러한 항원-항체의 반응수준은 당업계에서 통상적으로 사용되는 측정방법을 제한 없이 사용하여 비교할 수 있다. 항원-항체 반응수준 측정방법의 예로는 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 응집법 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
항원-항체의 반응수준을 확인하는 가장 대표적인 방법 중 하나인 ELISA 방법은 그 방법이 간단하고 비용면에서 경제적이며 다량 분석이 가능하여 현재 가장 널리 쓰이고 있는 항원-항체 분석법중 하나이다. 특히 이 방법은 방사능면역시험법 (RIA, Radio Immuno Assay)과 같이 매우 민감한 반응이면서도 RIA에서처럼 방사능을 사용하지 않는다는 잇점이 있어서 그 사용이 증가되고 있다.
응집법 (agglutination)은 항원과 항체가 만나서 입자들이 서로 덩어리를 형성하는 것을 의미한다. 일반적으로 세포와 같이 물에 녹지 않는 입자상태의 항원이 항체와 결합하여 침전되지 않고 서로 엉켜있는 상태를 형성하는 것을 응집이라 하는데 이러한 응집반응은 항체가 응집소 (agglutin)로 작용하여 다리처럼 응집원 (agglutinogen, 항원)을 서로 연결시켜 육안으로 확인이 가능한 반응이다.
항원-항체의 반응수준을 분석하기 위한 또 다른 방법으로 방사능 면역시험법 (radio-immuno assay, RIA)이 사용될 수 있다. 본 방법은 표준되는 항원을 방사능으로 표지하여, 항체와 면역 침전시키는데, 이때, 방사능으로 표지되지 않은 항원 (시료)를 넣어주면, 방사능 표지된 표준항원의 침전이 줄어들게 되어, 침전속의 방사능이 줄어든다. 이러한 원리를 이용하여 시료 중의 항원의 양을 측정하는 방법이다.
한편, 면역조직화학염색(Immunohistochemistry) 또는 면역조직화학염색법에는 면역형광법과 면역효소법이 있으며 면역형광법은 직접법, 간접법이 있고, 면역효소법에는 직접법, 간접법, PAP법, ABC법 및 LSAB법 등이 있다. 면역조직화학염색은 조직절편에서 특이한 항원의 존재를 증명하기 위한 염색법으로서 항원에 대한 항체의 친화성을 이용한 방법이다. 이러한 면역조직화학적 염색은 미분화 세포의 기원을 확인해 주거나, 효소, 호르몬, 종양표지자 및 예후 인자의 존재 유무, 암종과 육종의 구별 및 양성 종양과 악성 종양의 감별, 그리고 전이암의 원발소를 추정하는데 이용되고 있다. 본 발명의 암진단을 위한 정보제공 방법은 항원-항체 반응 수준을 측정하기 위하여 상기와 같은 방법을 적용할 수 있으며, 바람직하게 본 발명자들은 조직면역 염색을 통해 세포 내 TMAP/CKAP2의 발현 수준 및 발현 위치를 확인하였다.
또한 본 발명의 항원-항체 반응수준을 측정하기 위해 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 국한되지는 않는다.
검출 표지체로 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-락타아제 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물질로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드, 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 37Co, 3H, 125I, 125I-볼톤-헌터(Bolton-Hunter) 시약 등을 포함한다.
본 발명은 상기와 같은 방법을 이용하여 항원-항체의 반응수준을 측정함으로써 암 의심개체를 암 발병개체로 판정할 수 있고, 나아가 암 환자의 예후를 예측 및 진단할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 TMAP/CKAP2는 암세포, 특히 유사분열중인 세포로서 유사분열 중에서도 분열 중기(metaphase) 및 후기(anaphase)에서 그 발현이 증가되는 특징을 나타내는 것으로, 암 의심 개체의 시료에서 활발한 분열이 일어나면 대조군 시료에 비해 항원-항체의 반응 수준이 증가하는바, 이를 확인함으로써 해당 개체를 암 환자로 판정할 수 있고, 암질환 이력이 있는 환자인 경우 활발한 증식에 의해 예후가 좋지 않은 개체로 예측할 수 있게 된다. 바람직하게 이러한 판정은 간암 또는 폐암 의심환자의 경우 발현 양상이 더욱 뚜렷하며, 소세포폐암의 경우 그 대비가 더욱 강한 바 이들 암에 대한 진단이 용이함을 확인하였다. 또한 유방암 및 GIST와 같이 암세포 증식에 대한 검증이 그 예후와 밀접하게 관련이 되어 있는 암의 경우 진단에서 나아가 예후에 대한 정확한 예측이 가능함을 확인하였다. 가장 바람직하게는 유방암 환자의 무병생존율 및 생존율을 정확하게 예측할 수 있음을 확인하였으며, 이는 기존의 증식 표지자로 사용된 Ki-67과 비교한 결과, 본 발명의 TMAP/CKAP2가 무병생존율 및 생존율을 더욱 뚜렷하게 구분할 수 있어서, 유방암 환자의 향후 치료 요법 등을 결정하는 임상학적인 정보를 제공할 수 있을 것으로 확인하였다.
또 다른 양태로서 본 발명은 (a) 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편을 이용하여 암세포에서 TMAP/CKAP2의 항원-항체 반응수준을 측정하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 세포에 후보물질을 처리하는 단계, 및 (c) 상기 단계 (a)에 비해 상기 (b) 단계의 후보 물질 처리 후 항원-항체 반응 수준이 감소됨을 확인하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
항-TMAP/CKAP2 항체의 발현수준을 측정하는 단계는, 상기 기술한 바와 같이 당업계에서 이용되는 통상의 발현수준 측정 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블럿(western blot), ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 등이 있다.
또한 본 발명의 용어 "후보물질"이란 암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질 또는 그 예후를 개선시킬 수 있을것으로 기대되는 물질로서, 직접 또는 간접적으로 암을 호전 또는 개선시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한되지 않는다. 이러한 후보물질의 예로는 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 모든 치료 가능 예상물질을 포함한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 후보 물질의 투여 전후의 항-TMAP/CKAP2 항체의 발현 수준을 확인하는 한편, 상기 발현수준이 후보물질 투여 전에 비해 감소된 경우, 해당 후보물질을 암에 대한 예상 치료제로서 결정 할 수 있다.
또 다른 양태로서 본 발명은 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 세포 분열 주기 측정용 조성물에 관한 것이다.
실질적으로 세포 분열기에는 다른 주기에서 나타나지 않는 많은 단백질, 효소 및 키나아제와 같은 물질이 발현되나 이들 모두가 세포 분열 여부 확인을 위한 구체적인 표지자로 사용될 수 있는 것은 아니다. 따라서 효과적인 표지자의 발굴을 위해 많은 연구자들이 현재까지도 끊임없는 노력을 경주하고 있는 실정이다.
본 발명의 항체는 세포 분열이 활발한 분열기(mitotic phase)에 발현되며, 세포주기 중 G2/M기에서 발현양이 최대로 나타나는 TMAP/CKAP2를 특이적으로 인지하여 결합할 수 있다. 비록 TMAP/CKAP2는 분열기에 발현된다는 사실이 일부 알려져 있었으나, 조직면역화학염색을 통해 분열기를 쉽게 표식할 수 있어 유사세포분열에 대한 표지자로 사용할 수 있는지 여부에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다. 본 발명자들은 TMAP/CKAP2의 발현률이 높은 세포의 경우, 세포의 분열 및 성장 속도가 빠르고, TMAP/CKAP2 의 발현률이 낮은 세포의 경우, 세포의 분열과 성장속도도 낮은 상관관계에 있다는 것을 확인할 수 있었다.
현재 세포의 분열(mitosis)과 증식(proliferation)을 측정하는 표지자로 Ki-67을 사용하고 있으나, 이 표지자는 주로 핵에 염색되기 때문에 유사분열(mitosis) 중인 세포는 핵이 소멸하므로 분열기에 진입한 세포에 대해서는 관찰이 불가능하다는 단점 및, 일반적으로 Ki-67에 의해 염색되는 세포의 비율(%)이 너무 높은바 표지자(index)로 사용하기 어려운 단점이 존재하여, 효과적인 검출 표지자로 사용되기에는 한계가 있었다. 그러나 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 핵의 유무와 무관하게 방추사 특이적으로 반응하는바 분열 중인 세포의 구체적 관찰이 가능하고, 분열기에 진입하기 직전인 세포 및 분열 중인 세포에 대한 특이도를 가지므로 세포증식 예정인 세포 및 증식중인 세포를 한번에 검출할 수 있다. 보다 상세하게 본 발명자들은 본 발명의 조성물을 이용하여 구체적인 세포분열시기를 탐지할 수 있음을 최초로 규명하고, 이를 확인하기 위하여 본 발명의 항체를 세포에 처리한 결과, 분열 중인 세포의 염색체와 방추사에 특이적으로 염색됨을 관찰하였다.
더욱 바람직하게, 본 발명의 조성물은 TMAP/CKAP2의 인산화와 무관하게 발현되어 있는 TMAP/CKAP2에 결합할 수 있는바, 분열기 중 순간적으로만 검출되는 것이 아니라, 분열 중기 및 후기에 걸쳐 지속적으로 확인이 가능하다. 즉 TMAP/CKAP2의 활성에 관여하는 인산화 여부에 따라 상기 단백질의 검출 가능성이 변화하는 경우, 분열기 중에서도 매우 짧은 시기에만 확인이 가능하고, 인산화 여부를 불문한 전체 TMAP/CKAP2의 발현 수준을 확인할 수 없는 단점이 존재한다. 그러나 본원의 조성물은 이러한 단백질의 인산화 여부와 무관하게 그 발현 수준을 확인할 수 있는바, 보다 정확한 세포 분열 여부에 대한 확인이 가능하다.
본 발명에 따른 항체 또는 이들이 항원결정성 부위를 포함하는 단편은 세포 분열기(mitotic phase)의 중기(metaphase)와 후기(anaphase)에 발현되는 인산화 또는 비인산화 형태의 TMAP/CKAP2에 특이적으로 결합함으로써 세포주기의 변화에 따른 연구 및 TMAP/CKAP2의 역할에 관한 연구뿐만 아니라 유방암, GIST와 같이 세포분열주기를 검출함으로써 그 예후를 예측할 수 있는 암의 진단 및 치료제 발굴에 중요한 수단을 제공할 수 있다. 또한 유방암 환자의 무병생존율 및 생존율을 정확하게 예측할 수 있어, 유방암의 진단, 치료제 발굴뿐만 아니라 추후 치료법 선택에 있어 중요한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 면역글로불린 특이적인 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행 후, PCR이 끝난 반응액을 2% 아가로스 젤 전기영동을 이용하여 분리한 것을 나타낸 도이다.
도 2는 사람 TMAP/CKAP2 항체의 중쇄영역의 DNA 서열분석결과 및 아미노산서열을 나타낸 도이다.
도 3은 사람 TMAP/CKAP2 항체의 경쇄영역의 DNA 서열분석결과 및 아미노산서열을 나타낸 도이다.
도 4는 간암조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체를 이용한 조직면역화학염색(x100) 결과를 나타낸 것이다. 갈색 또는 검정색으로 염색된 세포들이 항체에 의해 염색체부위가 염색되었음을 보여주고 있으며, 분열 중인 세포의 대부분이 염색되었음을 확인할 수 있다.
도 5는 간암조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체를 이용한 조직면역화학염색(x200) 결과를 나타낸 것이다. 도 4에 비해 좀 더 높은 배율로 관찰한 조직면역화학염색의 결과로 세포질에 염색된 세포들은 핵에는 염색되지 않았으며, 곧 분열단계로 들어갈 세포들을 관찰할 수 있다.
도 6은 여러 종류의 폐암 조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체를 이용한 조직면역화학염색의 결과이다. 선암에 비해 평편세포암에서 발현이 높았고, 이들 두 가지 비소세포암에 비해 소세포폐암은 발현이 훨씬 높게 관찰되었다.
도 7은 원발성 폐암과 전이된 폐암조직에서의 TMAP/CKAP2 항체를 이용한 조직면역화학염색의 결과이다. 원발성 폐암에 비해 전이성 폐암 조직에서 TMAP/CKAP2의 발현이 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있다. 이렇게 발현이 증가되는 것은 비소세포폐암에서도 평편세포암들에서 나타났는데, 선암에서는 이렇게 전이성 폐암 조직에서의 발현 증가를 관찰할 수 없었다.
도 8은 정상조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체와 항-Ki67 항체를 이용한 면역조직화학염색 결과를 나타낸 것으로, 자궁경부조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체 (A)와 항-Ki67 항체를 (B) 이용하여 조직면역화학염색을 시행한 결과이다. 두 가지 항체 모두 분열을 하고 있다고 알려져 있는 자궁경부표피조직 중 기저부에 있는 세포에만 염색이 되는 것을 관찰하였고, 항-Ki67 항체에 비하여 항-TMAP/CKAP2 항체에 의해 염색되는 세포의 수가 적은 것으로 관찰되었는데, 이는 TMAP/CKAP2가 더 좁은 세포분열기 단계동안 발현되는 것과 관련이 있을 것으로 여겨진다. 또한 세포분열이 활발하게 일어나는 LF(lymphoid follicle) 조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체(C)와 항-Ki67 항체(D)를 이용하여 조직면역화학염색을 시행한 결과, 역시 항-Ki67 항체에 비해 항-TMAP/CKAP2 항체에 의해 염색되는 세포의 수가 적은 것을 관찰할 수 있었다.
도 9는 위조직과 대장조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체를 이용한 면역조직화학염색 결과이다. 위조직과 대장조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체에 의해 염색되는 세포는 분열이 일어나고 있다고 알려져 있는 crypt 부위의 세포에서 염색되는 것을 확인할 수 있다. 도 9A (x100)와 도 9B (x200)는 위 조직이고 도 9C (x100)와 도 9D (x200)는 대장조직이다.
도 10은 유방암조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체를 이용한 면역조직화학염색 결과를 나타낸 도이다. 유방암 조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체에 의해 염색되는 세포가 많은 조직 (A)과 염색되는 세포가 거의 없는 암 조직이 있으며 (B), 이는 암세포의 분열정도와 밀접한 관계가 있다. 항-TMAP/CKAP2 항체에 의해 염색되는 세포 중 염색체 혹은 염색체 주위 구조물에 염색되는 세포는 쉽게 유사분열기(mitotic phase)에 있는 세포라는 것을 확인할 수 있다. 그리고 세포질에 비교적 염색이 약하게 염색되는 세포들은 G2 phase의 세포들로 M phase로 들어가고 있거나 들어가려고 준비 중인 세포들로 여겨진다. 염색체 또는 염색체 주위 구조물에 염색되는 세포들은 유사분열 활성 표지자(mitotic activity index)로서 중요한 마커로 사용할 수 있을 것으로 여겨지고, G2 기에 있는 세포들과 M 기에 있는 세포들의 비율은 G2기-M기 체크포인트(checkpoint)가 어떤 상태인 지를 반영하므로 항암제 반응성과 관련이 있을 것이다.
도 11은 유방암 환자에서 TMAP/CKAP2 의 발현 또는 Ki-67 발현정도에 따라 생존기간 (overall survival)과 무병생존기간(Disease free survival) 을 Kaplan-Meier plot으로 나타낸 도이다. Kaplan-Meier plot에서 2, 3 및 4군에서는 높은 TMAP/CKAP2 양성세포 염색체 천분율을 보였고, 생존율(A)과 무병생존율(B)은 TMAP/CKAP2 발현이 낮은 1군에 비해 좋지 않았다. (C)에서는 상대적으로 높은 핵 Ki-67 양성세포의 퍼센트를 가지는 2, 3 및 4군에서 양성세포 퍼센트가 낮은 1군에 비해 생존율이 낮은 것을 알 수 있다. (D)에서는 N 단계에 따른 생존율을 Kaplan-Meier plot으로 나타낸 도이다. 현재 유방암의 예후를 예측하는데 가장 예측 수준(predictive value)이 높은 것으로 알려진 N 단계를 이용한 환자의 생존율 예측보다도 TMAP/CKAP2의 발현정도를 이용한 생존율의 예측이 더 나은 것을 알 수 있다. X축; 수술 후 생존일, Y축;생존가능성
도 12는 TMAP/CKAP2 발현에 따라 유방암환자들의 생존율 (OS)과 무병생존율 (DFS)을 Kaplan-Meier plot 으로 나타낸 도이다. 필드 크로모솜 카운트(A 와 D), 필드 토탈 카운트 (B 와 E) 또는 전체 천분율 (C와 F)에 의거하여 각각의 평가방법으로 가장 발현이 낮은 1군에 비하여 2, 3 및 4군의 생존율 (A-C)과 무병생존율 (D-F)을 Kaplan-Meier plot을 하였다. 이 그림에서 TMAP/CKAP2 발현이 높을수록 유방암 환자는 낮은 생존율과 무병생존율을 갖는다는 것을 보여준다.
도 13은 유방암으로 인해 사망한 환자의 생존기간을 Kaplan-Meier plot으로 나타낸 도이다. 4군의 환자에서 확연히 3군 환자에 비해 생존기간이 짧은 것을 알 수 있다.(A)염색체천분율에 의거한 분석법 (p=0.026) (B)전체천분율에 의거한 분석법 (p=0.013)
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예1: 단클론항체 하이브리도마의 생산
사람 TMAP/CKAP2 단클론항체를 제작하기 위해 우선 생쥐(m) TMAP/CKAP2를 증폭하여 His tag가 N-말단에 발현하도록 고안된 발현벡터 pET-28a(+) vector에 클론 하였다. 박테리아에서 과발현 시킨 후, His-결합 친화성 크로마토그래피(His-bind affinity chromatography), 젤 여과 크로마토그라피(gel filtration chromatography)와 SDS-PAGE 후 겔 용출(gel elution)을 거쳐 SDS-PAGE상 단일 밴드가 나오도록 정제하였다. 상기와 같은 방법으로 수득한 재조합 His-TMAP/CKAP2 융합단백질을 Balb/c 생쥐에 3차례 면역하여 얻은 지라(spleen)와 SP2 골수종(myeloma) 세포를 융합하여 His-hTMAP/CKAP2가 코팅된 ELISA 플레이트를 이용하여 스크리닝을 시행하였고 양성인 클론들을 얻었다.
실시예2. PCR을 이용한 생산된 항-사람 TMAP/CKAP2 항체의 아미노산 서열 및 DNA 서열 분석
실시예 1에서 생산된 단클론 항체 생산 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA 를 분리하여, 이를 통한 cDNA 를 합성하고, 이후 면역글로불린 특이적인 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여, 이의 서열을 분석하였다.
보다 상세하게는 면역글로불린(Immunoglobulin) PCR 분석을 위해, TRIzol 시약(Invitrogen, catalog number : 15596)을 이용하여 사람 TMAP/CKAP2 단클론항체 생산 하이브리도마 세포로부터 전체RNA를 분리하였다. 이를 통한 cDNA 합성은 SuperScript Ⅲ First-strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen, catalog number : 18080-051)을 이용하여 실시하였는데, 방법은 제조사에서 추천하는 방법으로 실시하였다. 분리된 전체 RNA중 각 시료당 5㎍ 씩 cDNA 합성에 이용하였다. cDNA 합성시 사용되는 프라이머는, oligo-d(T) 프라이머 대신, 면역 글로불린 3'-보존부위 서열 프라이머를 이용하여 진행하였다. 면역 글로불린 3'-보존부위 서열 프라이머는 각 하이브리도마 세포가 생산하는 항체의 아형(sub-type) 에 따라, 구분하여 사용하였다. 즉, 생산하는 항체의 중쇄 (Heavy-chain)의 아형이 면역 글로불린-M 인 경우에는 MuIgMVH3'-1 을 사용하였고, 아형이 면역글로불린-G 인 경우에는 MuIgGVH3'-2 를 사용하였다. 또한, 경쇄(Light-chain)의 아형이 카파(k)-체인인 경우에는 MuIgkVL3'-1 을 사용하였고, 아형이 람다(λ)-체인인 경우에는 MuIgλVL3'-1 을 사용하였다. 그리고, 이때 사용한, MuIgMVH3'-1, MuIgGVH3'-2, MuIgkVL3'-1, MuIgλVL3'-1 프라이머는 마우스 Ig-Primer Set (Novagen, catalog number 69831-3) 의 구성품을 각각 이용하였으며, 각 프라이머의 서열정보는 표 1에 나타내었다.
Figure 112011008156815-pat00001
면역글로불린-PCR 반응은 항-사람 TMAP/CKAP2 단클론항체 생산 하이브리도마 세포로부터 순차적으로 합성한 상기 cDNA로부터, 마우스 Ig-Primer Set (Novagen, catalog number 69831-3)와 2X PCR pre-Mix (SolGent, catalog number : STD01-M50h)를 사용하여 수행하였다. PCR 과정은 마우스 Ig-Primer Set (Novagen, catalog number 69831-3) 의 제조사에서 추천하는 방법으로 수행하였는데, 중쇄(Heavy-chain)와 경쇄 (Light chain) PCR을 수행할 때 사용하는 5'-프라이머 구성을 달리하였다.
즉, 중쇄의 경우 면역글로불린-G 또는 M 모두 다, 5'-프라이머는 MuIgVH5'-A, MuIgVH5'-B, MuIgVH5'-C, MuIgVH5'-D, MuIgVH5'-E, MuIgVH5'-F 를 각각 사용하였고, 경쇄의 경우 카파(k)-체인일때, 5'-프라이머는, MuIgkVL5'-A, MuIgkVL5'-B, MuIgkVL5'-C, MuIgkVL5'-D, MuIgkVL5'-E, MuIgkVL5'-F, MuIgkVL5'-G 를, 그리고 람다(λ)-체인일때는, MuIgλVL5'-A 를 5'-프라이머로 각각 사용하였다. 각각의 모든 프라이머 서열정보는 상기 표 1에 나타내었다.
또한, 각 PCR을 수행하는 조건은 5'-프라이머를 A, B 프라이머로 사용하는 경우는 94℃, 3-min -> 94℃, 1-min/ 50℃, 1-min/ 72℃, 2-min (35-cycles) -> 72℃, 6-min -> 4℃ 조건으로 수행하였고, 5'-프라이머를 C, D, E, F, G 프라이머로 사용하는 경우는 94℃, 3-min -> 94℃, 1-min/ 60℃, 1-min/ 72℃, 2-min (35-cycles) -> 72℃, 6-min -> 4℃ 조건으로 PCR 반응을 수행 하였다. PCR이 끝난 반응액은 2% 아가로스 젤 전기영동을 이용하여 분리하였다(도 1).
생성된 PCR-밴드는 UV상에서 잘라내어, 젤 일루션 방법에 따라 DNA를 추출하여, 서열분석 실험에 사용하였다.
그 결과를, 도 2 와 도 3에 나타내었다.
실시예3: 간암, 폐암, 자궁경부, 위, 대장 및 유방암 조직과 폐암조직에서 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 항-Ki-67 항체를 이용한 조직면역화학염색분석
Ultravision LP Detection kit와 DAB (Lab Vision Corporational Fremont, CA, USA)를 사용하여 조직면역화학염색을 시행하였다. 여러 사람의 정상조직과 암조직 array를 Superbiochip company (www.Tissue-array.com)에서 구입하여 시행하였다. 조직 절편은 자일렌(xylene)으로 파라핀을 제거(deparafinize)하였고 1 mM EDTA가 포함된 10 mM 트리스완충액(Tris buffer) pH 9.0에서 121℃로 15분간 가열하여 항원을 회수(retrieval)하였다. 95% 에탄올로 고정한 후 절편을 일차항원 (항-TMAP/CKAP2 단일클론항체또는 항-Ki-67 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마의 희석배양액)과 20% FBS가 들어있는 TBST (Tris buffered saline with 0.05% Tween) 용액에서 실온에서 한 시간 반응시켰다. TBST로 다시 씻은 후 DAB를 이용하여 발색반응시키고 Mayer's 헤마토자일린(Mayer's Hematoxylin;(DacoCytomation Denmark))으로 대조염색을 실시하였다.
그 결과를 도 4 내지 도 10 에 나타냈다.
실시예 4: 유방암 환자 준비 및 임상병리학적인 특성 분석
1999년에서 2003년에 침습성 유방암을 진단받아서, 치료적 외과수술을 시술 받은 침습성 유방암을 가진 환자 112명을 대상으로 실험을 수행하였다. 상기 환자들은 최소한 7년 이상의 생존율을 나타냈다. 이들 환자의 자세한 병리학적인 특성을 하기 표 2에 나타냈다. 대부분의 환자들은 침습성 도관암환자(84.8%), 루미날 A 형(45.5%)을 가진 환자였다.
Figure 112011008156815-pat00002
실시예 5: 유방암조직에서 TMAP/CKAP2-양성세포의 측정 및 TMAP/CKAP2 의 발현정도 평가분석 방법
평균 염색체 TMAP/CKAP2 양성세포를 200 배율하에서 계수하였다. 200 배율에서의 전체 암세포 수를 400 배율에서의 세포수의 4배에 기초하여 계산하였다. 400 배율에서 세포수의 측정은 150, 200, 300, 350, 450, 500, 550, 900, 1000 암세포수의 400 배율의 사진과 비교하여 수행하였다. 상기 방법은 측정효율을 더욱 더 높인다. 암세포의 수를 계산하는 것은 단순한 비교로 측정하기에는 어렵고 불규칙적일 때에는 TMAP/CKAP2 양성세포의 수를 셀 때 사용한 현미경 필드에 있는 모든 암세포 수를 계수하였다. 암 조직에서 특정한 두 개의 영역 즉, 다른 수준의 염색체 TMAP/CKAP2 염색이 보일 때, 높은 양성 영역은 20% 이상이 암세포로 덮여 있을 경우 이를 암 세포수를 계수하는 데에 사용하였다. TMAP/CKAP2 발현정도는 다음과 같은 4가지 분석법을 사용하여 측정하였다.
1) 염색체 천분율(chromosome permillage) 분석
염색체 TMAP/CKAP2 양성세포 천분율은 염색체 TMAP/CKAP2 양성세포 수 (A)를 TMAP/CKAP2 양성 세포를 계수할 때 사용되는 영역의 전체 암세포수 (B)로 나눈 값 (A/B)이다. 이 분석방법은 TMAP/CKAP2 발현정도를 알아볼 때에도 사용하였으며, 다른 3가지 측정방법 또한 TMAP/CKAP2 발현과 환자생존율간의 연관관계에 대해 평가할 때 사용하였다.
2) 전체 천분율(total permillage) 분석
염색체 이외에 세포질도 TMAP/CKAP2로 염색되는데, 세포질에만 염색되는 세포의 경우 분열하는 세포의 G2혹은 초기 M기의 세포인 것으로 판단하였다. 따라서 이들을 양성세포를 증식하고 있는 세포로 포함시키기 위하여, 세포질 양성세포 수 (A)에 0.1을 곱하고, 이 수와 염색체 양성세포 (B)를 더한 후, 총 암세포수 (C)로 나눈 수를 전체 천분율 [(A*0.1 + B)/C]로 정의하였다.
3) 필드 크로모솜 카운트(field chromosome count) 분석
현미경 200배율 내에 있는 TMAP/CKAP2 염색체 양성세포의 평균수를 필드 크로모솜 카운트로 정의하였다.
4) 필드 토탈 카운트(field total count) 분석
세포질 염색세포를 고려하기 위하여, 현미경 200 배율 내에 있는 세포질 염색세포 수 (A)에 0.1을 곱하고 이 수를 염색체 양성세포의 수 (B)와 더한 수를 전체 TMAP/CKAP2 양성세포 수 (A*0.1 + B)로 정의하였다.
이상의 4가지 다른 분석방법으로 TMAP/CKAP2 발현을 측정하였다.
실시예 6: TMAP/CKAP2발현 또는 Ki-67 발현과 임상병리학적 변이의 연관성 분석
TMAP/CKAP2발현 또는 Ki-67 발현과 임상병리학적 변이의 연관성을 Spear man's rank correlation test 또는 Wilcoxon rank sum test로 분석하였다.
그 결과, 하기 표 3에서 알 수 있듯이, TMAP/CKAP2 발현은 임상병리학적 변수인 조직학적 등급, 핵 등급, T 단계, N단계, ER과 PR의 상태와 연관이 되어있으며, Ki-67 발현 또한 조직학적 등급, 핵 등급, ER 과 PR의 상태와 통계적으로 유의하게 연관되어 있는 것을 확인하였다.
Figure 112011008156815-pat00003
하기 표 4은 염색체 천분율(chromosome permillage)이 Ki-67 발현과 매우 밀접하게 연관되어 있음을 보여주며, TMAP/CKAP2발현을 분석하는 다른 방법들에서도 TMAP/CKAP2발현이 임상병리학적 변수들과 매우 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다.
Figure 112011008156815-pat00004
실시예 7: 유방암환자에서 TMAP/CKAP2 발현 또는 Ki-67 발현과 생존율(Overall survival; OS)또는 무병생존율 (Disease free survival; DFS) 과의 연관성 분석
TMAP/CKAP2 양성세포의 염색체 천분율 (chromosomal permillage) 분석방법에 의거하여 TMAP/CKAP2 의 발현 또는 Ki-67 발현정도가 다른 환자들을 4개의 다른 군으로 나누어 분석을 하였다: 1군(낮은 발현)에서 4군 (높은 발현).
Kaplan-Meier plot으로 상대적인 생존율 (overall survival)과 무병생존율(Disease free survival)의 차이를 분석한 결과, 3 및 4군에서는 TMAP/CKAP2 발현에 높은 염색체 천분율을 보이며, 이들은 1군에 비해 낮은 생존율(OS ; 도 11A)과 무명생존율(DFS; 도 11B)과 관련되어 있는 것을 알 수 있다.
나이와 핵등급(nuclear grade), T 단계 및 N 단계와 같은 여러가지 변수가 모두 환자의 생존율과 유의하게 연관되어 있음을 확인하였다(표 5). 유방암의 재발 정보는 완벽하지 않고, 재발 시기 또한 20건 정도만 연구가능하며, 상기의 대부분은 사망건(16건)과 관련되어져 있다. 17건에서(85%) 암이 멀리까지 전이가 된 것을 확인하였으며, 국소 재발은 1건(5%) 에서 발견되었다. 또한 멀리까지 전이된 경우와 국소재발 모두 일어난 경우는 2건 (10%)으로 발견되었다. 주로 폐, 뼈, 간 그리고 뇌로 전이가 빈번이 일어났다. 모든 23명의 환자가 유방암과 관련이 있었다.
Figure 112011008156815-pat00005
상기 표 5는 염색체 천분율(chromosomal permillage) 분석방법에 의거하여 TMAP/CKAP2의 발현 정도가 다른 환자들을 같은 비율로 4개의 다른 군으로 나누어 분석한것으로, 통계학적 처리를 위하여 1군과 2군을 하나의 군으로 묶은 1 및 2군과 나머지 3과 4 군을 비교하였는데, 이를 단일변수분석법 (univariate analysis)과 다변수분석법(multivariate analysis)을 사용하여 분석하였다.
그 결과, 단일변수분석법에 의거하면, 3군과 4군은 1 및 2군에 비해 낮은 생존율을 보였다. 또한 진단 당시의 환자의 나이, 핵등급, HER, T, N 단계를 고려한 다변수분석법으로 분석한 결과에서도 염색체천분율이 생존율과 통계적으로 유의하게 (p=0.016) 관련되어 있다는 것을 확인하였다. 또한 위험률(harzard ratio) 이 3군과 4군에서 각각 12.9 와 24.7을 보이는데 이는 현재까지 생존율과 가장 관련성이 크다고 알려진 N 단계와 위험률 (군 2의 경우 4.8 과 군 3의 경우 11.2)과 같거나 좋은 정도를 보이므로, 위험률(harzard ratio) 또한 N 단계에 버금 갈 정도로 본 발명의 TMAP/CKAP2가 좋은 예후 진단 마커임을 시사하였다.
Kaplan-Meier plot에 의거하여, 각각 다른 Ki-67 발현정도를 나타낸 결과, 2, 3 및 4군에서 Ki-67의 발현이 1군에 비해 높게 나타난 것을 알 수 있으며, Ki-67의 발현이 높을수록 낮은 생존율을 보였다(도 11C).
현재 유방암의 예후를 예측하는 데 예측가치가 높은것으로 알려진 N단계에 따른 생존율을 Kaplan-Meier plot으로 나타낸 결과, 이 N 단계를 이용한 환자의 생존율 예측보다도 본 발명의 TMAP/CKAP2의 발현정도를 이용한 생존율의 예측이 더 좋을 수 있다는 것을 시사하였다(도 11D).
하기 표 5에서는 염색체 천분율(chromosomal permillage) 분석 방법 이외의 TMAP/CKAP2 발현 정도를 평가하는 방법인 필드 크로모솜 카운트, 필드 토탈 카운트, 전체 천분율과 같은 분석방법에 의거하여 분석해 본 결과, 높은 TMAP/CKAP2 발현이 낮은 생존율과 통계적으로 유의하게 연관되어 있다는 것을 확인하였다. 또한 이러한 관계를 Kaplan Meier plot하여 보아도 역시 염색체 천분율 분석방법에서와 마찬가지로 TMAP/CKAP2의 발현이 낮은 생존율과 연관되어 있다는 것을 확인할 수 있다 (도 12).
Figure 112011008156815-pat00006
TMAP/CKAP2의 발현이 무병생존율(DFS)과도 관련이 큰 결과를 얻었다(하기 표 7 및 8). 염색체 천분율(chromosomal permillage) 분석방법에 의거하여 TMAP/CKAP2 의 발현정도가 다른 환자들을 4개의 다른 군으로 나누어 분석하고, 통계학적 처리를 위하여 1군과 2군을 하나의 군으로 묶어서 1 및 2군으로 만든 군과 나머지 3과 4군을 비교하였는데, 이를 위하여 단일변수분석법(univariate analysis)과 다변수 분석법 (multivariate analysis)을 사용하여 분석하였다.
그 결과, 1 및 2군에 비해 높은 TMAP/CKAP2 양성세포 염색체 천분율을 가지고 있는 3군 또는 4군에서 무병생존율이 모두 유의하게 낮다는 것을 (3군에서 p=0.014, 4군에서 p=0.024) 확인하였다.
그런데, 이 무병생존율(DFS)과의 관련성에는 환자정보를 얻는데 한계가 있어서 환자의 최종 검사까지 재발이 없으면 그 시점까지만 재발이 없는 것으로 가정하였고, 사망한 환자들은 모두 유방암으로 인해 사망하였는데, 어느 시점에서 재발했는지 알 수 없으므로, 재발한 시점을 사망한 시점으로 추정하여 무병생존율(DFS)을 추정하였다. 따라서 신뢰도는 생존율(OS)에 비해 떨어진다고 할 수 있다.
또한, 염색체 천분율 이외의 분석방법에 의해서도 TMAP/CKAP2의 발현정도와 무병생존율을 분석해 본 결과 (표 8), 모두 TMAP/CKAP2의 발현과 무병생존율이 유의하게 관련이 있다는 것을 보여주었고, 위험률(harzard ratio) 또한 염색체 천분율의 결과와 유사하다는 것을 알 수 있다.
Figure 112011008156815-pat00007
Figure 112011008156815-pat00008
실시예8: 유방암으로 인해 사망한 환자 23명을 대상으로 TMAP/CKAP2 발현과 생존율(OS)과의 관련성에 대한 분석
TMAP/CKAP2발현이 N단계와 T 단계와 같은 예후변이 인자들과 밀접한 연관을 가지고 있다고 하면, TMAP/CKAP2발현은 또한 조기 사망과 관련이 있다고 할 수 있다.
그 결과, 도 13에 염색체 천분율(chromosome permillage; 도 13A)과 전체 천분율 분석방법(도 13B)에 의거하여, TMAP/CKAP2 발현과 생존율(OS)과의 관련성에 대해 분석하고, 이를 Kaplan-Meier plot으로 결과를 나타낸 것이다.
그 결과, 높은 TMAP/CKAP2 발현이 낮은 생존율(OS)을 보이는 것으로, 고위험군환자들이 빨리 사망할 가능성을 미리 알 수 있다는 것을 의미하며, 이러한 고위험군 환자들은 좀 더 적극적인 치료방법을 사용할 수 있다는 것을 의미하는 것으로 임상적인 의의가 있을 것으로 판단하였다.
실시예9: Ki-67 및 TMAP/CKAP2의 예후진단 마커로서의 비교
현재 세포의 분열(mitosis)과 증식(proliferation)을 측정하는 표지자로 Ki-67을 사용하고 있으나, 이 표지자는 주로 핵에 염색되기 때문에 유사분열(mitosis) 중인 세포는 핵이 소멸하므로 분열기에 진입한 세포에 대해서는 관찰이 불가능하다는 단점이 있으며 실제 Ki-67 발현의 정도와 암환자의 생존율과 관련성이 아직까지 확실히 증명되지 못했다.
도 11C에서와 같이 Ki-67발현과 생존율의 상관관계에 대해 분석한 결과를 비교해보면, Ki-67발현이 TMAP/CKAP2 발현(도 11A 및 11B)에 비하여 생존율과의 관련성이 떨어지는 것으로 나타났다. 또한 도 11C에서와 나타낸 바와 같이, Ki-67 발현이 가장 낮은 1군의 경우는 다른 군들에 비해 생존율이 좋았으나 2,3 및 4군 사이에는 유의한 변화를 보이지 않았다. 이에 반하여, TMAP/CKAP2 발현은 도 11A의 분석결과에서는 2, 3 및 4군 간에 생존율이 많은 차이가 있음을 알 수 있다. 이러한 결과로 지금까지 Ki-67이 생존율을 예견하는 좋은 마커로 널리 사용되지 않았을 것으로 추정할 수 있다.
이러한 원인을 생물학적으로 보면, TMAP/CKAP2의 염색체 발현은 유사분열의 중기이후부터 세포질분열이 일어난 직후까지 관찰할 수 있는데 비해, Ki-67은 후기 G1 기에서 시작하여 유사분열시기까지 전 기간 동안 핵 염색을 관찰할 수 있다. 따라서 생존율이 증식시기 중 유사분열기와 더 밀접하게 관련이 되어 있다는 것을 의미한다고 할 수 있다. 이러한 결과는 기존에 보고된 바와 같이, H&E염색 후 유사분열을 현미경으로 직접세는 것이 Ki-67을 사용하는 것보다 좋다고 알려진 것과 일맥상통한다고 할 수 있다.
상기와 같은 결과들은, 본 발명의 TMAP/CKAP2의 발현이 유방암 환자의 생존율과 무병생존율을 예측할 수 있는 강력한 예후 표지자로서 사용될 수 있는 것을 뒷받침해준다.
<110> NATIONAL CANCER CENTER SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration SHIN, chang-ho <120> Composition for diagnosing susceptibility to cancer comprising anti-TMAP/CKAP2 antibody <130> PA100560KR <150> KR10-2010-0011126 <151> 2010-02-05 <150> KR10-2010-0081081 <151> 2010-08-20 <160> 46 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuIgVH5'-A primer <400> 1 gggaattcat grasttskgg ytmarctkgr ttt 33 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuIgVH5'-B primer <400> 2 gggaattcat graatgsasc tgggtywtyc tctt 34 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuIgVH5'-C primer <400> 3 actagtcgac atggactcca ggctcaattt agttttcct 39 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuIgVH5'-C primer <400> 4 actagtcgac atggctgtcy trgbgctgyt cytctg 36 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuIgVH5'-C primer <400> 5 actagtcgac atggvttggs tgtggamctt gcyattcct 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atcagtttcc atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata 180 cttgaattgg tatctgcaga gaccaggaca atctcctcag ctcctgatct atttgatgtc 240 cacccgtgca tcaggagtct cagaccggtt tagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac 300 cctggaaatc agtagagtga aggctgagga tgtgggtgtg tattactgcc aacaagttgt 360 agagtatcca ttcacgttcg gctcggggac aaaatggaaa 400 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of light chain <400> 42 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of light chain <400> 43 Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of light chain <400> 44 Gln Gln Val Val Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 45 <211> 139 <212> PRT <213> Human TMAP/CKAP2 heavy chain <400> 45 Leu Val Asp Met Gly Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Leu Ser Gly 1 5 10 15 Thr Ala Gly Val His Cys Gln Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu 20 25 30 Leu Val Lys Pro Gly Ala Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly 50 55 60 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Ile 65 70 75 80 Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys 85 90 95 Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Gln Thr Ser Glu Asn 100 105 110 Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Leu Gly Pro Arg His His Ser His Ser Ser Arg 130 135 <210> 46 <211> 133 <212> PRT <213> Human TMAP/CKAP2 light chain <400> 46 Leu Val Asp Met Ser Val Xaa Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Met Phe 1 5 10 15 Trp Ile Ser Gly Val Ser Gly Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Leu 20 25 30 Ser Asn Pro Val Ile Phe Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser 35 40 45 Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr 50 55 60 Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser 65 70 75 80 Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 85 90 95 Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser 115 120 125 Gly Thr Lys Trp Lys 130

Claims (21)

  1. 항-TMAP/CKAP2 (Tumor associated microtubule associated protein/cytoskeleton associated protein2) 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 유방암 또는 위장관 기저종양(GIST)의 예후 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포의 유사분열기(mitosis)를 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 유방암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 38로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 39로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 40으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 42로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 43으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 44로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 45로 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 46으로 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체인 조성물.
  8. TMAP/CKAP2 (Tumor associated microtubule associated protein/cytoskeleton associated protein2)에 특이적으로 결합하는 유방암 또는 GIST의 예후 진단용 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 38로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 39로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 40으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 42로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 43으로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 44로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 45로 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 46으로 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  11. 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 유방암 또는 GIST의 예후 진단용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 키트는 유방암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 삭제
  14. (a) 예후가 좋은 것으로 알려진 개체로부터 분리된 대조군 시료 및 암이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에 항-TMAP/CKAP2 항체 또는 이의 항원결합부위를 처리하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 항원-항체 반응 수준을 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 대조군 시료에 비해 암이 의심되는 개체로부터 분리된 시료의 항원-항체 반응 수준이 높은 경우, 해당 개체를 예후가 좋지 않은 암 환자로 판정하는 단계를 포함하는 유방암 또는 GIST의 예후 진단을 위한 정보제공 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암의 예후는 유방암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 확인하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 시료인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 항원-항체 반응 수준을 비교하는 방법은 웨스턴블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질칩 중 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
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박주배(성균관대학교). 신약 타겟 발굴 연구: TMAP/CKAP2의 세포 성장 조절 기전 연구 및 암치료제 타겟 유전자 가능성 탐색. 2007.05, 과학기술부 연구보고서.*

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