KR20050102627A - Ｉｇｓｆ9 및 ｌｉｖ-1을 사용한 암 치료용 조성물 및치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 IGSF9 및 LIV-1 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 DNA(RNA)를 개시한다. 개시된 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드는 항체 생산하는데 특히 유용하게 사용되는데, 이 둘은 변형된 것이거나 천연의 것으로서 IGSF9 또는 LIV-1에 결합한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 함유하는 약학적 조성물과 백신에 대해서도 개시하고 있다. 본 발명은 이러한 폴리펩티드를 사용하여 이 폴리펩티드에 대한 리간드, 길항제 및 작동제을 동정하는 방법에 관하여 기재하고 있다. 마지막으로, 전술한 조성물을 함유하는 방법은 신생물(종양) 질환을 치료, 진단 및/또는 예후를 예측하기 위해서 개시된 것이다.

Description

ＩＧＳＦ9 및 ＬＩＶ-1을 사용한 암 치료용 조성물 및 치료방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CANCER USING IGSF9 AND LIV-1}

본 발명은 조성물, 구체적으로는 IGSF9 및 LIV-1의 항체 및 항원 결합 단편 조성물과, 신생물 질환을 검출 및 치료하는 데에 이 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

암은 미국에서 두 번째 가는 사망 원인으로서 전체 사망률의 1/5 이상을 차지하고 있다. 암세포는 두 가지 중요한 특성을 가지는 것으로 정의되는데, 그 특성이란 이 암세포 및 이들 자손 세포가 (1) 정상적인 억제작용에 반하여 재생된다는 특성과, (2) 다른 세포들을 위해 정상적으로 보유하고 있는 도메인들을 침입하여 콜로니화하는 특성을 말한다. 통제 불가능한 암세포의 증식은 종양(tumor), 또는 신생물(neoplasm)을 생성한다.

정상적인 세포성 생성물의 독특한 성분이 암세포로 발현된다는 것은 종양 면역학계에서는 기본적인 가설이다. 현재 설득력이 강한 많은 증거가 신생물 형질전환이 포유 동물의 세포 표면상에서 항원 변화와 관련이 있다는 개념을 명백하게 지지하고 있다(Reisfeld, R. A. and Cheresh, D. A., Ad Immunol 40: 323-377 (1987)). 인간 종양 세포 상에서 발현이 적어도 증가하는 것으로 보이는 세포 표면 항원의 커다란 그룹을 정의하기 위해서 다양한 혈청학적 전략이 사용되어 왔다(Old, L. J., Cancer Res 41:361-375 (1981); Rosenberg S A, (ed.) Serologic Analysis of Human Cancer Antigens. Academic Press, New York. 1980)). 이러한 두 가지 항원으로는 IGSF9 및 LIV-1가 있다.

면역 글로불린 유사 도메인이 존재하는 특징을 갖는 면역 글로불린 단백질의 상과(superfamily) 멤버들은 동종 항원에 친화성을 가지는 결합 및 이종 항원에 친화성을 가지는 결합 모두를 중재한다(Doudney, et al., Genomics 79:663-670 (2002)). 면역 글로불린 단백질은 종종 세포 내에서 세포 외 리간드와 2차 메신저 캐스케이드 간의 시그널 전도를 중재 조정한다. 그러한 것으로는, 세포내 환경과 상호반응하는 세포질 카르복시 말단 서열과 트랜스멤브레인 도메인을 지닌 다수의 면역글로불린이 있다. 예를 들면, 세포질 수용체 티로신 키나제 또는 포스파타제 도메인을 지닌 면역글로불린 단백질은 이들의 효소 작용을 통해서 직접적으로 세포내 시그날링 영향력을 발휘하는 반면, 다른 단백질은 세포내 키나제와 관련되어 이를 활성화하는 방식으로 작용한다. 면역글로불린 리간드 결합에 의한 src 과의 티로신 키나제의 활성화는 세포 뼈대의 역할에 영향을 주어서, 배아 단계의 형태 유전적 이동과 연관된 세포 형태의 변화 및 세포 유착간에 중요한 관련성을 제공한다.

IGSF9 (면역 글로불린 상과 멤버 9)는 면역글로불린 상과의 NCAM 서브 클래스에 속하는 신규 멤버이며, 이는 마우스의 Lp 유전자를 단리하기 위해서 위치성 클로닝을 수행하던 중에 확인되었다(Doudney, et al., Genomics 79 : 663-670 (2002)). IGSF9 동족체는 Drosophila melanogaster에서 거북이(Turtle) 단백질인데, 이 단백질은 신경계 발달과 관련이 있다. 또한, IGSF9는 인간 종양을 형성하고 침입하는 것과 관련하여 중요한 후보 대상이 될 수 있다. 염색체 1q22-q23 영역이 복제되는 종양이 흔히 관찰되고, 또한 면역글로불린 단백질의 발현을 상향 조절하는 것이 인간의 종양에서 공통으로 관찰되며, 그리고 이러한 상향 조절은 세포 기능의 불-조절과 신생물의 침입에 기여하는 것일 수 있다.

LIV-1은 전이성 유방암과 관련된 에스트로젠 조절 유전자이다. LIV-1 구조물을 연구해보면 Zn^{2 +} 이온과 결합 및/또는 이를 운반할 가능성이 큰 히스티딘이 풍부한 단백질이라는 것을 알 수 있다. Zn^{2 +}는 생물학적 멤브레인 전체에 걸쳐서 활성적으로 운반되므로, 이의 유입 및 유출이 빈틈없이 조절되는 것은 이 이온이 세포에 필수적이면서도 유독한 이온이기 때문이다(Taylor, K. M., IUBMB Life 49 : 249-253 (2000)).

LIV-1은 유일하게 알려진 호르몬 조절된 Zn^{2 +} -결합 단백질이다. 기타 다른 Zn²⁺ -결합 단백질이 전이성 암종에 역할을 감당하는 여부가 측정해야될 여지가 남아있다. 하지만, 조직 배열에서의 일종의 Zn²⁺ -결합 단백질은 세포의 사멸과 뉴론성 질환과 관련이 있어왔다.

발명의 간단한 설명

본 발명은 일반적으로 특히, 암의 검출 및 치료에 사용될 수 있는 조성물 및 암 검출 방법 및 치료방법에 관한 것이다.

하기에 제시된 실험 결과는 IGSF9 및 LIV-1가 다양한 신생물 세포 중에서 다양하게 발현됨을 입증한 것이다. 이러한 상이한 발현은 IGSF9 및 LIV-1가 유방암, 결장암, 난소암, 폐암 및 전립선암을 비롯한 다양한 신생물의 검출 방법 및 치료에 대한 표적으로서 작용하게끔 한다.

본 발명은 IGSF9 또는 LIV-1 또는 이 단백질의 단편과 결합한 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 도 1B(서열 번호: 2)에 도시된 21-718의 아미노산, 서열 번호: 8의 21-734의 아미노산, 서열 번호: 22-27에 도시된 아미노산의 IGSF9과 관련된 것이거나, 또는 도 22 B(서열 번호: 29)에 개시된 28-317의 아미노산, 373-417의 아미노산, 674-678의 아미노산, 또는 742-749의 아미노산의 LIV-1과 IGSF9과 관련될 수 있다.

본 발명은 또한 단리된 항-IGSF9 또는 항-LIV-1 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것으로서, 이 항체 또는 항원 결합 단편은 도메인이 결손된 항체를 포함하고 있다. 도메인 결손된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 세포독성제를 포함하고 있다. 바람직한 구체예에서, 세포독성제는 방사성 핵종이다.

본 발명의 항-IGSF9 또는 항-LIV-1 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 인간화되거나 또는 영장류화된 것 일수 있다.

본 발명은 IGSF9 또는 LIV-1과 결합하는 항체 또는 이의 항원 단편에 관한 것으로서, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IGSF9 또는 LIV-1이 지니고 있는 기능 중 하나 이상을 억제한다.

본 발명은 추가로 IGSF9 또는 LIV-1과 관련된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

바람직한 구체예에서, 신생물 질환을 치료하는 방법은 하나 이상의 2 기능성 킬레이트제에 공유 결합한 도메인 삭제의 항-IGSF9 또는 항-LIV-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 2 기능성 킬레이트제는 MX-DTPA 및 CHX-DTPA로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명은 IGSF9 또는 LIV-1와 관련된 치료 유효량의 항체 또는 이의 항원 단편을 투여하는 단계를 포함하여 신생물 질환을 앓고 있는 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 추가로 1종 이상의 화학 치료제를 치료적 유효량으로 상기 포유 동물에게 투여하는 단계를 더 포함하는데, 이때 상기 화학 치료제와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항-IGSF9 또는 항-LIV-1 항체 또는 항원 결합 단편을 치료가 필요한 포유동물에게 투여한다. 항-IGSF9 및 항-LIV-1 항체 또는 항원 결합 단편은 C_H2 도메인이 소실되도록 변형시키고/또는 인간화된 것일 수 있으며, 또한 세포독성제를 함유한다.

본 발명은 추가로 IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드 또는 이의 단편 및 약리학적 허용 담체를 포함하는 암 치료용 백신에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 항암 백신은 도 1B(서열 번호: 2)에 도시된 IGSF9의 아미노산 1-1163 또는 아미노산 21-718을 포함하며, 또는 도 22B(서열 번호: 29)에 도시된 LIV-1의 아미노산 1-749, 아미노산 28-317, 또는 아미노산 373-417를 포함한다. 이 백신은 추가로 T 헬퍼 펩티드에 융합된 IGSF9 또는 LIV-1 펩티드를 함유할 수도 있다. 또한, 백신은 어쥬반트 또는 면역자극제와 같은 약리학적 허용 담체를 더 포함할 수도 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 백신은 어쥬반트 PROVAX^TM을 더 포함한다. 본 발명은 추가로 암 치료나 예방이 필요한 환자에게서 면역 반응을 유도하도록 상기 백신을 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 IGSF-9 또는 LIV-1, 또는 이의 단편의 과잉 발현을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 (a) 암 진단이 필요한 개체로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료 중에서 IGSF-9 또는 LIV-1, 또는 이의 단편의 발현을 검출하는 단계; (c) 진단받은 개체로부터 얻은 정상 조직중이나 또는 정상의 개체로부터 얻은 대조 시료 중에서 IGSF-9 또는 LIV-1 또는, 이의 단편의 발현을 검출하는 단계; (d) IGSF-9 또는 LIV-1의 발현 농도를 대조 시료에서 얻은 발현 농도와 비교하는 단계를 포함하며, 이 비교단계가 암을 진단하는 결과를 나타낸다.

본 발명의 한가지 구체예에서, 과잉 발현은 IGSF9 또는 LIV-1, 또는 이의 단편에 대한 항체를 사용하거나, 하이브리드화 과정에 의하거나, 또는 핵산 증폭과정에 의해 검출된다. 다른 구체예에서, IGSF9 단편은 엑손 5-10을 포함한다.

본 발명은 또한 암 치료를 받는 개체의 예후를 측정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 암 치료의 예후가 필요한 상기 개체로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료 중에서 IGSF9 또는 LIV-1, 또는 이의 단편의 발현을 검출하는 단계; (c) 정상 개체로부터 얻은 대조 시료 중에서, 또는 진단받은 개체로부터 얻은 정상 조직 중에서 IGSF9 또는 LIV-1, 또는 이의 단편의 발현을 검출하는 단계; (d) IGSF9 또는 LIV-1의 발현 농도를 대조 시료 중에서 얻은 발현 농도와 비교하는 단계를 포함하되, 이 비교가 암의 예후를 나타낸다.

한 구체예에서, IGSF9 단편은 엑손 5-10이다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서 IGSF9 또는 LIV-1 또는 이의 단편을 면역학적으로 모방하는 항 유전자형 항체를 함유한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 다양한 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체 및 항원 결합 단편과 함께 암 치료 또는 암 검출에 사용하는 지시 사항을 포함한 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한 포유동물에게서 신생물 세포가 IGSF9 또는 LIV-1 항원을 발현하는 종양 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 IGSF9 또는 LIV-1에 대한 약학적 유효량의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 조성물을 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 항-종양 면역반응 유도 유효량의 IGSF9 또는 LIV-1을 함유하는 항-종양 면역반응 유도 유효량과 약학적 허용 담체를 포함한 백신을 사용하여 항-종양 면역반응을 유발한다.

본 발명은 또한 IGSF9 또는 LIV-1의 발현을 억제하며, IGSF9 또는 LIV-1의 8개 이상의 뉴클레오티드 부분을 포함하는 길이 50개까지의 뉴클레오티드로 이루어진 안티센스 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 안티센스 핵산은 1종 이상이 변형된 내부 뉴클레오티드 결합을 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명은 세포 또는 조직 내에서 IGSF9 또는 LIV-1의 발현을 억제하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 안티센스 핵산을 상기 세포 또는 조직과 접촉하여 IGSF9 또는 LIV-1의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.

본 발명은 추가로 다양한 형태의 IGSF9(서열 번호: 1, 7, 및 12-21)을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열 번호: 1, 7, 및 12-25를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 더 나아가 본 발명은 서열 번호: 2, 8, 및 22-27을 포함하는 단리된 폴리펩티드 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전술한 바와 같이, 서열 번호: 2, 8 및 22-27의 폴리펩티드 및 약리학적 허용 담체를 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명은 짧은 형의 IGSF9-Ig(서열번호: 3)를 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열 번호: 3을 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열 번호: 4의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은, 전술한 바와 같이, 서열 번호: 4의 폴리펩티드 및 이의 약리학적 허용 담체를 포함하여 암을 치료하는 백신에 관한 것이다.

본 발명은 또한 기다란 형의 IGSF9-Ig(서열 번호: 5)를 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 서열 번호: 5를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 서열 번호: 6의 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명은 서열 번호 6의 폴리펩티드 및 약리학적 허용 담체를 포함하는 암 치료용 백신에 관한 것이다.

도 1A 및 도 1B는 인간의 IGSF9의 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 1) 및 단백질 서열(서열 번호: 2)을 각각 도시한 것이다. 도 1B에서 추정된 시그날 서열을 굵은 글씨체로 나타낸 것이며, 추정된 세포 외 도메인은 밑줄을 그어서 표시하였고, 추정된 트랜스맴브레인 도메인은 굵은 이탤릭체 글씨로 나타내었다.

도 2는 Gene Logic datasuite를 사용하여 측정한 IGSF9의 유전자 발현 프로필을 보여주는 일렉트로닉 노던 프로필(electronic Northern profile)을 나타낸다.

도 3은 정상 조직에서의 IGSF9 발현을 나타낸다. 상부 패널은 IGSF9 발현을, 하부 패널은 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디히드로게나제(GAPDH)의 발현을 나타낸다. 각 레인 내에 존재하는 cDNA 시료는 다음과 같다: (1) 뇌, (2) 태반, (3) 폐, (4) 간, (5) 골격 근육, (6) 신장, (7) 췌장, (8) 비장, (9) 흉선, (10) 전립선, (11) 고환, (12) 난소, (13) 소장, (14) 결장, (15) 말초 혈액 백혈구, (16) 양성 대조군, 및 (17) 음성 대조군.

도 4는 인간의 난소 종양 시료 및 세포주 패널에서의 IGSF9 발현을 도시한 것이다. 상부 패널은 IGSF9 발현을, 하부 패널은 GAPDH 발현을 나타낸다. 각 레인 위의 숫자는 다음과 같은 난소 종양 시료에 해당된다: (1) 적절히 분화된 낭샘암종, (2) 불량하게 분화된 유두 장액성 선암종, (3) 불량하게 분화된 유두 장액성 선암종, (4) 불량하게 분화된 선암종, (5) 유두 장액성 선암종, (6) 자궁내막 유사 선암종, (7) 불량하게 분화된 선암종, (8) 불량하게 분화된 유두 장액성 선암종, (9) Ovcar-3 세포주, (10) PA-1 세포주, (11) 양성 대조군, 및 (12) 음성 대조군.

도 5는 유방 종양 시료에서의 IGSF9 발현 및 이와 매치된 정상의 유방 시료에서의 IGSF9의 발현을 도시한 것이다. 상부 겔은 IGSF9 발현을 나타내고, 하부 겔은 GAPDH 발현을 나타낸다. (N) 정상 시료, (T) 종양 시료. 종양 시료는 다음과 같다: (환자 A) 침윤성 관형 암종, (환자 B) 침윤성 관형 암종, (환자 C) 관형 선암종, (환자 D) 침윤성 관형 암종, (환자 E) 침윤성 관형 암종, (환자 T) 동일계의 높은 등급 및 침습성 관형 암종, (환자 X) 관형 선암종, (환자 W) 혼합된 관형 및 소엽성 선암종, (환자 GH19) 높은 등급의 침습성 관형 암종, (환자 GH17) 낮은 등급의 관내형 암종.

도 6은 폐 종양에서의 IGSF9 발현을 나타낸 것이다. 상부 패널은 IGSF9 발현을, 하부 패널은 GAPDH 발현을 나타낸다. (N) 정상 시료, (T) 종양 시료. 분석된 종양 시료는 다음과 같다: (환자 A) 침습성 관형 암종, (환자 B) 비늘 모양의 세포 각질 암종, (환자 C) 비늘모양샘 암종, (환자 D) 각질화 비늘 모양 세포 암종, (환자 E) 비늘 모양의 세포 암종.

도 7은 결장 종양에서의 IGSF9 발현을 나타낸 것이다. 상부 레인은 IGSF9 발현을 나타내고, 하부 패널은 GAPDH 발현을 나타낸다. 시료는 다음과 같다: (1) 3 등급의 선암종, (2) 2 등급의 선암종, (3) 1 등급의 선암종, (4) 2 등급의 선암종, (5) 직장 결장 세포주 HCT116.

도 8은 RT-PCR 분석에 의한 인간 종양 세포주의 IGSF9 발현을 나타낸 것이다. 상대적인 IGSF9 발현은 췌장 세포주(반점), 난소 세포주(수직선), 유방 세포주(하부방향을 향해 그어진 대각선의 선), 폐 세포주(반점이 채워진 것), 및 결장 세포주(상부방향을 향해 그어진 대각선의 선)에서 측정되었다.

도 9는 다양한 IGSF9 구조물의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다. 도 9A 및 9B는 각기 짧은 형의 IGSF9-Ig의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 3) 및 아미노산 서열(서열 번호: 4)을 각각 나타낸 것이다. 도 9C 및 9D는 기다란 형의 가용성 IGSF9-Ig의 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 5) 및 아미노산 서열(서열 번호: 6)을 각각 나타낸 것이다. 도 9E 및 9F는 기다란 형의 전장 IGSF9의 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 7) 및 아미노산 서열(서열 번호: 8)을 나타낸 것이다. 도 9G는 기다란 형 및 짧은 형의 IGSF9 (서열 번호: 9-11)의 단백질 서열을 비교한 것이다. 도 9H는 종양의 이종 이식 시료(서열 번호: 12-15)의 엑손 5-11 영역에서 IGSF9의 교호적인 스플라이스 형으로 나타낸 뉴클레오티드 서열이다.

도 10은 재조합에 의해 발현 정제된 IGSF9 폴리펩티드의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 레인 1과 2는 가용성 IGSF9-Ig의 짧은 형 및 기다란 형을 각기 나타낸 것이다. 도 11은 안정하게 형질 감염된 CHO 세포주에서의 IGSF9의 노던 블럿트 분석을 나타낸 것이다. 각 레인 내의 시료는 다음과 같다: (1) 형질감염되지 않은 야생형 CHO DG44 세포; (2) 짧은 형의 전장 IGSF9을 발현하는 안정한 CHO 5 nM 메토트렉세이트 (MTX) 증폭제; (3) 짧은 형의 가용성 IGSF9-Ig를 발현하는 안정한 CHO 5 nM MTX 증폭제; (4) 짧은 형의 가용성 IGSF9-Ig를 발현하는 안정한 CHO 50 nM MTX 증폭제 발현 짧은 형 가용성 IGSF9-Ig; (5) 기다란 형의 가용성 IGSF9-Ig를 발현하는 안정한 CHO G418 클론.

도 12는 짧은 형의 정제된 IGSF9-Ig에 대하여 ELISA 에 의해 측정한 마우스 혈청으로 부터 얻은 항-IGSF9 항체 역가를 나타낸 것이다.

도 13은 형질 감염된 G418-내성체 및 짧은 형의 IGSF9을 안정하게 발현하는 MTX- 증폭 CHO DG44 세포주에서의 짧은 형 IGSF9 표면 발현을 형을 FACS 분석한 것이다. IGSF9 표면 발현은 형질감염되지 않은 CHO DG44 세포 (DG44); G418 내성 세포(G418); 5nM MTX 증폭제(5nM); 및 50nM MTX 증폭제(50nM)에서 나타났다.

도 14는 형질 감염된 G418-내성체 및 기다란 형의 IGSF9을 안정하게 발현하는 MTX- 증폭 CHO DG44 세포주에서의 길다란 형의 IGSF9 표면 발현을 형을 FACS 분석한 것이다. IGSF9 표면 발현은 형질감염되지 않은 CHO DG44 세포 (DG44); 및 G418- 내성체 세포(G418)에서 나타났다.

도 15는 NCI-H69 종양 세포에서 내생성 IGSF9 표면 발현을 FACS로 분석한 것이다. 2o 대조 세포, 이소형이 매치된 대조군 항체(2B8), 및 주 검출 항체 8F3의 다양한 농도가 테스트 되었다.

도 16은 인간의 종양 세포주에서 IGSF9 발현의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. 2 개의 다른 노출 시간이 제시되었다: 30 분 (좌측 패널) 및 5 초(우측 패널, 레인 1과 2만 보임). 각 레인에 사용된 세포주는 다음과 같다: (1) 가짜로 형질 감염된 COS-7 세포(5 g); (2) 전장의 IGSF9(5㎍)로 일시적으로 형질감염된 COS-7 세포; (3); 전장의 IGSF9(5㎍)을 발현하는 안정한 CHO G418 클론; (4) MDA-MB-468 유방암 세포주(50㎍); (5) ZR-75-1 유방암 세포주(50㎍); (6) NCI-H69 작은 세포 폐암 세포주 (50㎍); (7) Ovcar-3 난소암 세포주(50㎍); (8) PA-1 난소암 세포주(505㎍).

도 17은 면역 형광 현미경으로 관찰한 유방암 세포주 ZR-75에서의 세포 표면 IGSF9 발현을 나타낸 것이다.

도 18은 Ovcar-3 및 NCI-H69 쥐의 종양 이종이식물과 배양된 세포 중에서의 세포 표면 IGSF9 발현에 대해 FACS를 분석한 것이다.

도 19는 쥐의 이종 이식물로부터 유래한 LS174T 및 NCI-H69 종양 세포주, 및 Ovcar-3 세포의 생체 내 통과를 2회 한 경우(PO 및 P1)의 IGSF9의 RT-PCR 분석을 나타낸 것이다.

도 20은 쥐의 이종 이식물 종양에 의해 IGSF9의 교호적인 스플라이스 형태가 발현된 것을 나타낸 것이다. 도 20A는 (1) NCI-H69 종양 세포주; (2) Ovcar-3 종양 세포주; (3) NCI-H69 마우스 이종 이식물; (4) Ovcar-3 마우스 이종 이식물; 및 (5) 음성 대조군. 도 20B는 Ovcar-3 및 NCI-H69 종양 이종이식물에서 발견된 새로운 스플라이스 변형체의 배열을 보여주는 계통적인 대표도이다. 상부 다이아그램은 공지된 IGSF9 변형 체(짧은 형 및 길다란 형)의 엑손 5-10을 도시한 것이다. 하부 다이어그램은 새로운 IGSF9 이소형의 엑손 5-11을 도시한 것이다.

도 21은 쥐의 이종 이식 조직으로부터 유래한 신규의 IGSF9 이소형의 IGSF9 서열 배열을 도시한 것이다. 도 21A는 Ovcar-3 및 NCI-H69 이종 이식 종양에서 발현된 독특한 스플라이스 변형체로부터 얻은 상응하는 부분적인 서열로 정렬된 엑손 8-10개를 함유한 오픈 리딩 프레임 뉴클레오티드 1138-1155의 부분적으로 길다란 형의 뉴클레오티드 서열의 배열을 나타낸 것이다. 도 21B는 Ovcar-3 및 NCI-H69 이종 이식 종양에서 발현된 독특한 스플라이스 변형체로부터 얻은 상응하는 부분적인 서열로 정렬된 엑손 8-10를 함유한 오픈 리딩 프레임 뉴클레오티드 285-426의 부분적으로 길다란 형의 뉴클레오티드 서열의 배열을 나타낸 것이다. 이러한 배열에 나타난 서열은 다음과 같다: (1) 길다란 형의 IGSF9 (서열 번호: 16 및 22); (2) Ovcar-3 이종이식물로부터 얻은 서열, 클론 2 (서열 번호: 17 및 23); (3) Ovcar-3 이종 이식물로부터 얻은 서열, 클론 1 (서열 번호: 18 및 24); (4) NCI-H69 이종 이식물로부터 얻은 서열, 클론 1 (서열 번호: 19 및 25); (5) NCI-H69 이종 이식물로부터 얻은 서열, 클론 2 (서열번호: 20 및 26); 및 (6) 콘센서스 서열 (서열 번호: 21 및 27).

도 22A 및 22B는 인간 LIV-1의 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 28) 및 단백질 서열(서열 번호: 29)을 각기 나타낸 것이다. 도 22B에서 추정된 시그날 서열은 굵은 글씨체로 표시하였고, 추정된 세포 외 도메인은 밑줄을 그어서 표시하였고, 그리고 추정된 트랜스멤브레인 도메인은 굵은 이탤릭체로 표시하였다.

도 23은 Gene Logic datasuite를 사용한 LIV-1의 유전자 발현 프로필을 도시한 일렉트로닉 노던 프로필을 나타낸 것이다.

도 24는 정상 조직에서의 LIV-1 발현을 나타낸 것이다. 상부 패널은 LIV-1 발현을, 하부 패널은 GAPDH 발현을 나타낸다. 각 레인에 존재하는 cDNA 시료는 다음과 같다: (1) 심장, (2) 뇌, (3) 태반, (4) 폐, (5) 간, (6) 골격 근육, (7) 신장, (8) 췌장, (9) 음성 대조군, 및 (10) 양성 대조군.

도 25는 유방 종양 시료에서 LIV-1 발현 및 이와 매치된 정상의 유방 시료에서의 LIV-1 발현을 나타낸 것이다. 상부 겔은 LIV-1 발현을, 하부 겔은 GAPDH 발현을 나타낸다. 본 도면의 우측 화살표는 LIV-1 PCR 생성물의 예상된 크기를 나타낸다. 종양 시료는 다음과 같다:(1-환자 A) 침윤성 관형 암종, (2-환자 B) 침윤성 관형 암종, (3-환자 C) 관형 선암종, (4- 환자 D) 침윤성 관형 암종, (5-환자 E) 침윤성 관형 암종, (6-환자 A) 정상, (7-환자 B) 정상, (8-환자 C) 정상, (9-환자 D) 정상, (10-환자 E) 정상, (11) 음성 대조군, (12) 양성 대조군, (13-환자 G19) 높은 등급의 침습성 관형 암종, (14- 환자 G17) 낮은 등급의 관내형 암종, (15-환자 X) 관형 선암종, (16-환자 W) 혼합된 관형 및 소엽성 선암종, (17-환자 T) 동일계의 높은 등급 및 침습성 관형 암종, (18-환자 G19) 정상, (19-환자 G17) 정상, (20-환자 X) 정상, (21-환자 W) 정상, (22-환자 T) 정상, (23) 음성 대조군, 및 (24) 양성 대조군.

도 26은 결장 종양에서의 LIV-1 발현을 나타낸 것이다. 상부 패널은 LIV-1 발현을, 하부 패널은 GAPDH 발현을 도시한 것이다. 시료는 다음과 같다: (1) 3 등급의 선암종, (2) 2 등급의 선암종, (3) 1 등급의 선암종, (4) 2 등급의 선암종, (5) 직장결장 암 세포주 HCT 116, (6) 양성 대조군, 및 (7) 음성 대조군.

본 발명은 IGSF9 및 LIV-1 유전자가 신생물 세포, 특히 유방, 난소, 결장, 폐 및 전립선의 신생물 세포와 정상 세포 간에 다르게 발현된다는 발견하였다. 이들 유전자의 과잉 발현은 암의 마커로 사용될 수 있다. 이 정보를 사용하여 유전자 및 이들의 발현 생성물, 특히 항체 및 이의 항원 결합 단편 모두에 특이한 진단 및 치료 시약을 제조할 수 있다. 또한, 이 정보는 암환자, 특히 유방암, 난소암, 결장암, 또는 전립선암을 가진 환자들에 대한 적절한 치료 투약법(regimen)을 제공하는 것을 도와주는 진단 방법 및 치료 방법에 사용될 수 있다.

본 발명의 항체

IGSF9 또는 LIV-1에서 얻은 펩티드를 사용하여 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 본 발명은 암 환자에게 치료 프로토콜에 따라 사용되었을 때 향상된 생화학 특성을 제공하기 위해서 신생물 세포와 관련 있는 항원과 면역 반응성인 항체 또는 항원 결합 단편을 변형 및 변경할 수도 있다는 사실에 기인하여 적어도 부분적으로 추정한 것이다. 변형된 항체는 방사성 핵종 또는 항신생물제와 같은 세포독성제와 관련되는 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용된 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역 활성 부위를 의미한다. 이러한 항체로는 폴리크로날 항체, 모노클로날 항체, 키메릭 항체, 일본쇄, Fab, Fab' 및 Fab'₂ 단편, Fv, 및 Fab 발현 라이브러리를 들 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, 인간으로부터 얻은 항체 분자는 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 클래스의 임의의 것에 관한 것으로서, 이는 분자 중에 존재하는 중쇄 특성이 서로 다르다. 어떤 클래스는 서브 클래스, 예를 들면 IgG1, IgG2, 및 기타 클래스를 포함한다. 또한, 인간에게서, 경쇄는 카파쇄 또는 람다쇄 일수도 있다. 본 명세서에서 항체에 대한 참고물은 모든 이러한 클래스, 서브클래스 및 항체 종의 유형에 대한 참고물을 포함한다.

항체 단편이 항원에 결합할 수 있는 기능을 수행할 수 있다는 것은 밝혀졌다. 본 명세서에서 "항원 결합 단편"이란 제한하는 것은 아니지만 (i) V_L, V_H, C_L 및 C_Hl 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) V_H 및 C_H1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) V_H 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward, E. S. et al .,Nature 341: 544-546 (1989)); (v) 단리된 CDR 도메인; (vi) F (ab')₂ 단편, (vii) 일본쇄 Fv 분자 (scFv), 여기서 두 개의 도메인이 결합하여 항원 결합 부위를 형성하도록 V_H 도메인 및 V_L 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결되어 있다(Bird, et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85 : 5879-5883 (1988)); (viii) 2 특이성 일본쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축된 다이아바디즈(diabodies), 다가 또는 다특이성 단편 (W094/13804 ; P. Holliger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . UNA 90: 6444-6448 (1993).

본 발명의 단리된 폴리펩티드는 항원, 이의 일부분 또는 이의 단편으로서 사용될 수도 있으며, 또한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 제제에 대한 표준 기술을 사용하여 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는데도 사용될 수 있다. 전장 단백질도 사용될 수 있으며 또는, 대안적으로, 본 발명은 면역원으로서 사용되는 IGSF9 및 LIV-1의 항원 펩티드 단편을 제공한다. 항원 펩티드 단편은 전장 IGSF9 및 LIV-1 단백질의 아미노산 서열의 6개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들면 도 1B, 9B, 9D, 9F, 21B, 또는 22B(서열 번호: 2, 4, 6, 8, 22-27, 또는 29)에 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이의 에피토프를 둘러싸서, 펩티드에 대해 생성된 항체는 에피토프를 함유하는 임의의 단편 또는 전장 단백질과 특이적인 복합체를 형성한다. 항원 펩티드는 10 개 이상의 아미노산 잔기, 또는 15개 이상의 잔기, 또는 20개 이상의 아미노산 잔기, 또는 30개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 특정 구체예에서, 항원 펩티드에 의해 둘러싸인 1개 이상의 에피토프는 단백질의 표면에 위치한 IGSF9 또는 LIV-1 영역, 예를 들면 친수성 영역이다. 인간의 IGSF9 및 LIV-1 단백질 서열 (도 1B 및 22B)의 소수성 영역을 분석하면 이들 단백질의 어떤 영역은 높은 친수성을 띠므로 항체 생산을 표적으로 하는 표면 잔기를 암호화할 확률이 높다는 것을 나타낸다(Kyte and Doolittle, J. Mol . Biol . 157:105-142 (1982)). 그러므로, 항원 펩티드로 둘러싸인 바람직한 에피토프는 이의 표면에 위치한 IGSF9 및 LIV-1 영역으로서, 예를 들면 IGSF9의 아미노산 약 21 내지 아미노산 약 718(도 1B); IGSF9의 아미노산 약 21 내지 아미노산 약 734(도 9F); 도 21 B에 도시된 아미노산 서열; 또는 LIV-1의 아미노산 약 28 내지 아미노산 약 317, LIV-1의 아미노산 약 373 내지 아미노산 약 417, LIV-1의 아미노산 약 674 내지 아미노산 약 678 또는 LIV-1의 아미노산 약 742 내지 약 749(도 22B)(서열번호: 2, 4, 6, 8, 22-27 또는 29)을 들 수 있다.

폴리클로날 항체를 생산하기 위해서, 여러 가지의 적절한 숙주 동물(예, 토끼, 염소, 마우스 또는 기타 다른 동물)에 IGSF9 또는 LIV-1 펩티드, 이의 합성 변형체, 이의 유도체, 또는 이의 단편으로 1회 이상 주사하여 이들 동물을 면역화시킬 수도 있다. 적절한 면역원 제제물로는, 예를 들면, 자연에서 생산되는 면역원 단백질, 그 면역원 단백질을 나타내는 화학적으로 합성된 폴리펩티드, 또는 그 면역원 단백질의 재조합 발현 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 그 단백질은 면역화된 포유동물에게서 면역원성을 나타내는 것으로 알려진 2차 단백질에 콘쥬게이트 될 수도 있다. 이러한 면역원 단백질의 예로는, 다음의 예에 제한하는 것은 아니지만, 키홀 림페트 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소의 티로글로불린, 및 대두 트립신 억제제를 포함한다. 이 제제는 추가로 어쥬반트를 함유한다. 면역학적 반응을 증진시키는데 사용되는 다양한 어쥬반트로는, 다음의 예에 국한하는 것은 아니지만, Freund's (완전 및 불완전), 미네랄 겔 (예, 알부민 히드록사이드), MPL-TDM (모노포스포릴 지질 A-합성 트레할로즈 디코리노마이콜레이트), PROVAX^TM을 포함한다.

IGSF9 또는 LIV-1에 대한 폴리클로날 항체는 면역화된 포유동물로부터 단리한 후 또한 단백질 A 또는 단백질 G를 사용한 친화도 크로마토그래피와 같이 종래 기술에 잘 알려진 기술을 사용하여 정제할 수 있다.

포유 동물의 혈청으로 부터 생성된 항체를 수거하여 폴리클로날 제제물을 제공할 수도 있지만. 비장, 림프 결절 또는 말초 혈액으로부터 개체의 림프구를 단리 하여 균질한 모노클로날 항체 제제물을 제공하는 것도 종종 바람직하다. 림프구는 비장으로부터 얻는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 "모노클로날 항체들"(MAbs)는 독특한 경쇄 유전자 생성물 및 독특한 중쇄 유전자 생성물로 구성된 항체 분자의 분자종 하나만을 포함하는 항체 분자들의 개체군을 말한다. 특히, MAb의 상보성을 결정하는 영역은 개체군의 모든 분자에서 동일하게 나타난다. 따라서, MAb는 이것에 독특하게 결합하는 친화성의 특징을 갖는 항원의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다.

위와 같이 잘 알려진 공정 (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975))에 있어서, 항원 주사를 받은 포유 동물에서 얻은 비교적 짧은 수명의 또는 무한 증식하지 않는 림프구를 무한 증식(immortal) 종양 세포주(예를 들면, 골수종 세포주)로 융합시키면, B 세포의 무한증식이면서 유전적으로 암호된 항체인 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"가 생성된다. 생성된 하이브리드를 선택, 희석, 재성장에 의해 단일의 유전 균주로 분할하면 각 개체의 균주마다 단일 항체의 형성에 사용되는 특정 유전자가 함유된다.

그러므로, 제조된 하이브리도마 세포를 심고, 이를 융합되지 않은, 모(母) 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 성분을 바람직하게 함유하는 적당한 배지 중에서 심은 후 성장시킨다. 당업자라면 하이브리도마의 형성, 선택, 및 성장에 적합한 시약, 세포주 및 배지가 다수의 공급원으로부터 상업적으로 시판된다는 것을 숙지할 수 있을 것이며 또한, 표준화된 프로토콜도 잘 정립되어 있다는 것도 알고 있을 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 자라는 배양 배지에서 소정의 항원에 대한 MAbs의 생산을 분석한다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역 침전 분석 또는 시험관 분석, 예를 들면 방사 면역 분석(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정하는 것이 바람직하다. 소정의 특이성, 친화성 및/또는 활성을 지닌 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 식별한 후, 이들 클론 물을 표준 방법(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp 59-103 (Academic Press, 1986))에 따라 희석을 제한하는 절차로 서브클로닝을 수행하고 표준 방법에 의해 성장하게 할 수도 있다. 통상적인 정제 기술, 예를 들면, 단백질-A, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기 영동, 투석 또는 친화도 크로마토 그래피에 의해 서브 클론물에 의해 분비된 모노클로날 항체를 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 분리된다는 것도 인식할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 "변형된 항체"란 용어는 고정 영역 도메인 1개 이상의 적어도 일부가 삭제되어 있거나 또는 그렇지 않으면 변형되어 있어, 거의 동일한 결합 특이성을 지니면서 전체적으로 변형되지 않은 항체와 비교했을 때 증가한 종양 편재화 또는 감소한 혈청 반감기와 같은 소정의 생화학적 특성을 제공하는 IGSF9 또는 LIV-1와 면역 반응성인 임의의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 이의 재조합체를 말한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 변형된 항체는 고정 도메인 하나 중 적어도 일부가 삭제되어 있다. 이러한 개시 목적을 위해서, 이 구조물은 "도메인 결손된"이라는 용어로 사용될 수 있다. 변형된 항체의 고정 도메인 하나 전체 도메인을 삭제하고는 것이 바람직하며, 전체 C_H2 도메인을 삭제하는 것이 더욱 바람직하다. 더욱 자세히 후술하는 바와 같이, 소정의 변형체 각각은 잘 알려진 기법을 사용하여 전체 전구체 또는 모 항체로부터 용이하게 제작할 수 있거나 또는 구축될 수도 있다.

당업자라면 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법이 본 발명의 폴리펩티드를 나타내는 임의의 신생물 질환, 종양, 또는 악성 종양을 치료하는데 유용하다는 것을 숙지할 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 변형된 항체는 IGSF9 또는 LIV-1와 면역 반응성이다. 즉, 개시된 변형된 항체의 항원 결합 부위(즉, 가변성 영역, 이의 면역반응성 단편 또는 이의 재조합체)는 악성 종양부위에서 IGSF9 or LIV-1와 결합한다. 더욱 일반적으로는, 본 발명에 유용하게 사용되는 변형된 항체는 IGSF9 또는 LIV-1와 반응하는 임의의 항체(문헌에 이미 보고된 것들)로부터 유래한 것이거나 또는 이로부터 얻은 것일 수도 있다. 또한, 개시된 변형된 항체를 생성하는 데 사용되는 모 항체 또는 전구체 항체 또는 이의 단편은 쥐, 인간, 키메릭, 비인간 영장류 또는 영장류화된 것일 수도 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 변형된 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 변경된 고정 도메인을 가진 일본쇄 항체 구조물(예를 들면 미국 특허 제5,892,019호에 개시된 것, 참고 인용)을 포함할 수도 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 교시에 따라 변형된 이들 유형의 어떠한 항체도 본 발명에 사용가능하다.

본 발명의 변형된 항체는 IGSF9 or LIV-1와 관련되거나 또는 이에 결합하는 것이 바람직하다. 따라서, 어느 정도 후술하는 바와 같이, 본 발명의 변형된 항체는 IGSF9 or LIV-1와 반응하는 다수의 항체 중 하나로부터 유래한 것이거나, 생성된 것이거나, 또는 제작된 것일 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 변형된 항체는 통상의 유전 공학 기술을 사용하여 유래할 수 있기 때문에 하나 이상의 고정 영역 도메인의 적어도 일부가 삭제되거나 변경되어 혈청 반감기의 감소와 같은 바람직한 생화학 특성을 제공할 것이다. 더욱 구체적으로, 후술 되는 곳에서 예시되는 바와 같이, 당업자는 대상 항체의 가변성 및/또는 고정 영역에 상응하는 유전 서열을 쉽게 단리한 후 적당한 뉴클레오티드를 결손 또는 변경하여 본 발명의 변형된 항체를 제공할 수도 있다는 것을 숙지할 수 있을 것이다. 또한, 변형된 항체는 잘 확립된 프로토콜을 사용하여 발현되고 임상 규모 또는 상업적 규모로 생성될 수 있다는 것도 알 수 있을 것이다.

선택된 구체예에서, 본 발명에 유용하게 사용되는 변형된 항체는 IGSF9 또는 LIV-1에 대해 알려진 항체로부터 유래할 것이다. 이는 전술한 바와 같이 모 항체의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 얻고, 변형물을 가공처리함으로써 쉽게 얻을 수도 있다. 다른 구체예에서, 공지된 항체의 항원 결합 영역(예, 가변성 영역 또는 상보성 결정 영역)만을 사용하고 이들을 변형된 고정 영역에 결합시켜 소정의 변형된 항체를 제작하는 것이 바람직할 수도 있다. 상용가능한 일본쇄 구조물을 이와 유사한 방식으로 생성할 수도 있다. 어떠한 경우에도, 본 발명의 항체를 가공처리하여 당 분야에 흔하게 알려진 것처럼 친화도를 개선하거나 또는 면역원성을 감소시킬 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 변형된 항체는 인간의 항체 또는 키메릭화된 항체로부터 유래하거나 또는 제작된 것일 수도 있다. 그러므로 본 발명에 부합하는 변형된 항체는 자연산 쥐, 영장류(인간을 비롯한) 또는 다른 포유동물의 모노클로날 항체, 키메릭 항체, 인간화된 항체, 영장류화 항체, 2 특이성 항체, 또는 일본쇄 항체 구조물뿐 아니라 각 유형의 면역반응성 단편을 포함하고/또는 이로부터 유래한 것일 수도 있다.

전술한 항체 이외에도, 전술한 통상의 면역원 기술과 결합한 면역화 기술을 사용하여 생성된 새로운 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 또는 이로부터 유래하는 변형된 항체를 제공하는 것이 바람직할 수도 있다.

다른 상용가능한 구체예에서, 소정의 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상의 방법(예, 쥐 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써)에 의해 용이하게 단리한 후 서열을 결정할 수도 있다. 단리되어 서브클론된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 기능을 한다. 일단 단리된 후에는, DNA는 발현 벡터내로 유입될 수 있으며, 이후에 면역 글로불린을 생성하지 않는 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포, 예를 들면 이. 콜리 세포, 시미안 COS 세포, 챠이니즈 햄스터 오바리(CHO) 세포 또는 골수종 세포 내에서 형질감염된다. 더욱 구체적으로는, 단리된 DNA (이것은 본 명세서에 기술된 바와 같이 변형될 수도 있다)를 사용하여 본 발명에 참고로 인용된 Newman등의 미국 특허 5,658,570에 기술된 바와 같이 항체를 제조하기 위해 고정 영역 및 가변성 영역을 클론할 수도 있다. 본질적으로, 이는 선택된 세포로부터 RNA를 추출하고, cDNA로 전환하며, 면역글로불린 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의해 이를 증폭하는 과정을 수반한다. 후술 되는 곳에서 자세히 기술하는 바와 같이, 소정의 항체를 발현하는 형질감염된 세포는 비교적 다량으로 성장해서 면역글로불린을 임상적 및 상업적으로 공급할 수도 있다.

당업자는 본원에 각기 참고로 인용된 미국 특허 5,969,108 및 EP 368,684B1에서 개시된 바와 같이, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA가 항체 파지 라이브러리로부터 유래한 것일 수 있다는 것을 숙지할 수 있을 것이다. 몇몇 공개 문헌들 (예, Marks 등 BioTechnology 10: 779-783(1992))은 커다란 파지 라이브러러를 구축하기 위한 전략으로서 생체 내 재조합과 조합 감염(combinatorial infection)뿐 아니라, 사슬 셔플링에 의해 고 친화도 인간 항체를 생성하는 것도 개시하고 있다. 이러한 과정은 모노클로날 항체의 단리 및 이후의 클로닝에 적합한 통상의 하이브리도마 기법에 대한 가능한 대체 방법을 제공하는 것으로서, 이는 명백하게 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명의 다른 구체예들은 내인성 면역글로불린을 생성할 수 없는 트랜스게닉 동물(예, 마우스) 중에서 실질적으로 인간 항체를 생성하는 것을 포함한다(예, 미국 특허 6,075,181, 5,939,598, 5,591,669 및 5,589,369, 이들 각 문헌은 본원에 참고로 인용). 예를 들면, 키메릭이면서 점-라인(germ-line) 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역의 동형접합 결손은 내인성 항체 생산을 완전히 억제한다고 기술되어 있다. 이러한 점-라인 돌연변이 마우스 중의 인간 면역글로불린 유전자 배열을 이동하는 것은 항원 투여시에 인간 항체의 생산을 가져온다. SCIP 마우스를 사용하는 인간 항체를 생산하는 다른 바람직한 수단은 공동 소유된 미국 특허 5,811,524(본원에 참고로 인용)에 개시되어 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이 이들 인간 항체와 관련한 유전적 재료를 단리한 후 조작할 수 있다는 것도 숙지할 수 있을 것이다.

재조합 항체를 생성하는 다른 고 효율적인 수단은 Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992)에 개시되어 있다. 구체적으로, 이 기법은 원숭이의 가변성 도메인 및 인간의 고정 서열을 함유하는 영장류화된 항체를 생산한다. 이에 대한 문헌은 그 전체로서 본원에 참고로 인용된다. 또한, 이 기법은 공동 양수인의 미국 특허 5,658,570, 5,693,780 및 5,756,096에 개시되어 있으며, 이 문헌들은 본원에 참고로 인용된 것이다.

본 발명의 범주에는 본 명세서에 기술된 DNA 서열의 돌연변이, 변형체, 및 모든 대립 형질(alleles)이 포함된다.

공지된 바와 같이, RNA는 구아니디늄 이소치오시아네이트 추출 및 침전 후에 원심분리 또는 크로마토그래피를 수행하는 것과 같은 표준 기법에 의해 다른 형질전환된 세포로부터 또는 원래의 하이브리도마 세포로부터 단리될 수도 있다. 바람직하게는, mRNA는 올리고dT 셀룰로오스 크로마토그래피와 같은 표준 기법에 의해 전체 RNA로부터 단리될 수도 있다. 이들 목적에 적합한 기법은 당기술 분야에 잘 알려진 것이며, 또한 전술한 참고 문헌들에 개시되어 있다.

항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNAs는 잘 알려진 방법에 따른 DNA 폴리머라제 및 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 동시에 또는 분리하여 제조될 수도 있다. 이는 공개된 중쇄 DNA 및 경쇄 DNA 그리고 아미노산 서열에 기초하여 더욱 특이적인 프라이머에 의해 또는 콘센서스 고정 영역 프라이머에 의해 개시될 수도 있다. 전술한 바와 같이, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 클론물을 단리하는 데 사용될 수도 있다. 이러한 경우에 있어서, 라이브러리는 마우스 고정 영역 프로브와 같은 콘센서스 프라이머 또는 이보다 큰 상동성 프로브에 의해 스크린 될 수도 있다.

DNA, 일반적으로 플라스미드 DNA는 본 명세서에 기술된 바와 같이 세포로부터 단리된 후, 재조합 DNA 기법과 관련한 전술한 참고 문헌에 자세히 기술된 잘 알려진 표준 기법에 따라 제한지도가 그려질 수 있고 또한 서열이 결정될 수도 있다. 물론, DNA는 단리 과정 또는 이후의 분석 과정 중 임의의 시점에서 본 발명에 따라 변형될 수도 있다.

본 발명에 따라, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 일본쇄 항체 생산에 적합한 기법이 적용될 수 있다(예, 미국 특허 4,946,778). 또한, Fab 발현 라이브러리를 구축하는데 적합한 방법을 사용하여(Huse, 등., Science 246: 1275-1281 (1989)) IGSF9 또는 LIV1 또는 이의 유도체, 이의 단편, 이의 유사체 또는 이의 동족체에 대해 소정의 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 효과적으로 동정하는 것을 가능케 할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 유전자형을 함유하는 항체 단편은 당 분야에서의 기법에 따라 제조될 수 있는데, 그러한 단편으로는, 다음의 예에 제한하는 것은 아니지만 (a) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생산된 F(ab')₂ 단편; (b) F (ab')₂ 단편의 이황화 결합(disulfide bridge)을 환원시켜 생성된 Fab, (c) 파파인과 환원제로 항체 분자를 처리하여 생성된 Fab 단편 및 (d) Fv 단편을 들 수있다.

2 특이성 항체 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 2 특이성 항체는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체로서 적어도 2개의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이 경우에 있어서, 결합 특이성 중의 하나는 본 발명의 항원 폴리펩티드(IGSF9 또는 LIV-1, 또는 이의 단편)에 대한 것인 반면, 2차 결합 표적은 임의의 다른 항원으로서 유리하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브 유닛이다.

2 특이성 항체를 제조하는 방법은 종래 기술에 공지되어 있다. 통상적으로 2 특이적 항체를 재조합 생산하는 것은 두 개의 면역 글로불린 중쇄/경쇄 쌍을 공동 발현하는 것인데, 여기서 두 개의 중쇄는 상이한 특이성을 지닌다(Milstein and Cuello, Nature 305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 임의적인 분류(assortment) 때문에, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산하는데, 이것중 오직 하나만이 정확한 2 특이성 구조를 가진다. 정확한 분자의 정제는 친화도 크로마토그래피로 달성할 수 있다.

소정의 결합 특이성을 가진 항체 가변성 도메인을 면역 글로불린 고정 도메인 서열과 융합할 수 있다. 이 융합체는 바람직하게는 힌지 영역, C_H2 및 C_H3 영역 중 적어도 일부를 포함하여, 면역글로불린 중쇄 고정 영역을 지닌 것이 바람직하다. 융합체중 적어도 한 가지 융합체 중에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1의 중쇄 고정 영역(C_H1)을 가지는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 필요하다면, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA를 분리된 발현 벡터 중에 삽입한 후 적당한 숙주 유기체내로 공-형질감염시킨다. 2 특이성 항체를 생성하는 것에 관한 자세한 설명은 Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986)등에 개시되어 있다.

2 특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조할 수 있다. 항체 단편으로부터 2 특이성 항체를 생성하는 기법은 문헌에 개시되어 있다. 예를 들면, 2 특이성 항체는 화학 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 또한, Brennan 등의 Science 22F: 81 (1985)는 완전한 항체가 F(ab')₂ 단편을 생성하기 위해 단백질분해로 절단되는 절차에 대해서 개시한다.

또한, Fab' 단편은 이. 콜리로부터 직접 회수될 수 있으며 화학적으로 커플링 되어 2 특이성 항체를 형성할 수 있다(Shalaby et al ., J. Exp. Med . 175: 217-225 (1992)). 이들 방법을 사용하여 완전히 인간화된 2 특이성 항체 F(ab')₂ 분자를 생성할 수 있다.

원자가가 2 이상인 항체를 또한 사용할 수 있다. 예컨대, 3 특이성 항체를 제조할 수도 있다(Tutt et al., J. Immunology 147 : 60 (1991)).

예를 들어 2 특이성 항체를 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는데, 이 에피토프중 적어도 하나는 본 발명의 폴리펩티드에서 비롯된 것이다. 대안적으로, 면역글로불린 분자의 항-항원성 아암(anti-antigenic arm)은 IgG의 Fc 수용체, 또는 T 세포 수용체 분자(예. CD2, CD3, CD28, 또는 B7)와 같은 백혈구 상의 유인성 분자에 결합하는 암에 결합하여 세포성 방어 기작이 특정 항원을 발현하는 세포에 초점을 맞추도록 할 수 있다. 2 특이성 항체는 또한 세포독성제가 특정 항원을 발현하는 세포를 대상으로 하도록 사용할 수 있다. 이들 항체는 세포독성제 또는 방사성 핵종 킬레이트제, 예를 들면 EOTUBE, DPTA, DOTA, 또는 TETA와 결합하는 아암 및 항원 결합 아암을 지닌다.

헤테로콘쥬게이트 항체 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 헤테로콘쥬게이트 항체는 두 개가 공유 결합한 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들면, 면역 세포가 원치 않는 세포를 표적으로 하는 것으로 제안되어 왔다(미국 특허 4,676,980). 가교제와 관련된 방법들을 포함하여, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하면 항체를 제조하는 것이 또한 가능하다. 예를 들면, 면역독소는 이황화 교환 반응을 사용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부틸이미데이트를 포함한다.

본 발명의 목적에 부합하도록, 변형된 항체는 IGSF9 또는 LIV-1의 폴리펩티드와 항체가 관련성을 가지도록 하기 위해서는 제공되는 임의 유형의 가변성 영역을 포함할 수도 있다는 것을 인식해야 할 것이다. 이러한 점에서, 가변성 영역은 체액성 반응을 일으키도록 유도하여 소정의 종양 관련 항원에 대한 면역글로불린을 생성할 수 있도록 임의 유형의 포유동물로부터 유래하거나 이러한 유형을 포함할 수도 있다. 그러한 것으로서, 변형된 항체의 가변성 영역은, 예를 들면 인간, 쥐, 비인간 영장류(사이노몰고스(cynomolgus) 원숭이, 짧은 꼬리 원숭이(macaques) 등) 또는 루핀(lupine) 기원의 것일 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 변형된 면역글로불린의 가변성 영역 및 고정 영역 둘 다는 인간의 것이다. 다른 바람직한 구체예에서, 상용성 항체의 가변성 영역(일반적으로 비인간 공급원에서 유래한 것)은 결합 특성을 개선하거나 또는 분자의 면역원성을 감소시키기 위해서 조작되거나 또는 특별히 가공된 것이다. 이러한 점에서, 본 발명에 유용하게 사용되는 가변성 영역은 인간화되거나 또는 그렇지 않으면 삽입된 아미노산 서열의 혼입을 통하여 변경된 것일 수도 있다.

"인간화된 항체"는 모 항체의 항원 결합 특성을 보유하거나 또는 실질적으로 보유하지만 인간에서보다는 면역원성이 낮은 비-인간 공급원, 일반적으로 쥐의 항체로부터 유래한 항체를 의미한다. 이 항체는 다음과 같은 다양한 방법에 의해 얻을 수 있다: (a) 인간 고정 영역 상에 전체의 비-인간 가변성 도메인을 그래프팅하는 하여 키메릭 항체를 생성하는 방법; (b) 중요한 기본 구조의 잔기를 보유 또는 보유하지 않고서 인간 기본 구조 및 고정 도메인 내로 1개 이상의 비-인간 상보성 결정 영역(CDRs) 중 적어도 일부를 그래프팅하는 방법; 또는 (c) 전체 비-인간 가변성 도메인을 이식하지만, 이들을 표면 잔기 치환에 의해 인간 유사한 부분으로 가리는("cloaking") 방법. 이러한 방법들은 Morrison 등의 Proc . Natl . Acad . Sci . 81: 6851-6855(1984) ; Morrison et al., Adv . Immunol . 44: 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536(1988) ; Padlan, Molec. Immun . 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec . Immun . 31: 169-217 (1994), 및 미국 특허 5,585,089, 5,693,761 및 5,693,762에 개시되어 있으며, 이들은 전체가 본원에 참고로 인용된다.

인간화된 항체는 인간 면역글로불린 (수용체(recipient) 항체)을 포함하는데, 여기서 수용체의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 유래한 잔기는 소정의 특이성, 친화성 및 역량을 갖는 마우스, 래트, 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 잔기로 치환되어 있다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 기본 구조 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환되어 있다. 인간화된 항체는 또한 삽입된 CDR이나 기본 구조 서열 내에서도 아니고 또한 수용체 항체에서도 아닌 곳에서 발견되는 잔기를 포함한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 한 개, 및 일반적으로는 두 개의 가변성 도메인의 실질적인 모든 것을 포함하는데, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 것에 상응하는 것이며, FR 영역 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 콘센서스 서열이다. 인간화된 항체는 최적으로는 면역글로불린 고정 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다(Jones et al ., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); and Presta, C urr . Op. Struct . Biol . 2: 593-596 (1992)).

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간 공급원으로부터 그것에 도입된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "삽입(import)" 잔기로 지칭되며, 이것은 일반적으로 "삽입" 가변성 도메인에서 얻은 것이다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열 대신에 설치류의 CDRs 또는 CDR 서열로 치환함으로써 Winter 및 공동 연구가들의 방법에 따라서 본질적으로 수행할 수 있다[Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)]. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 키메릭 항체(미국 특허 4,816,567)로서, 여기서 완전한 인간 가변성 도메인보다는 실질적으로 완전하지 않은 도메인이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환되어 있다. 실제 실시에 있어서, 인간화된 항체는 일반적으로 인간 항체로서 일부 CDR 잔기 및 가능한 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서의 유사한 부위에서 얻은 잔기에 의해 치환되어 있다.

인간화된 항체를 제조하는 데 사용가능한 인간 가변성 도메인으로, 경쇄 및 중쇄를 선택하는 것이 중요한 것은 이 항체가 인간 치료 목적으로 사용될 때 항원도 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 감소시키기 때문이다. 소위 "최적(best-fit)" 방법에서, 설치류 항체의 가변성 도메인 서열은 공지된 인간 가변성 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크린된다. 설치류의 그것과 가장 유사한 인간 V 도메인 서열을 동정하고, 이 서열 내에서 인간 기본구조 영역(FR)을 인간화된 항체로 받아들인다(Sims et al ., J.Immunol/.151: 2296 (1993); Chothia et al .,J ; Mol . Biol . 196: 901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹에 속하는 모든 인간 항체의 콘센서스 서열로부터 유래한 특정 기본 구조 영역을 사용하는 방법이다. 이러한 동일한 기본 구조가 몇몇 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수도 있다(Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89: 4285 (1992); Presta et al .,J Immunol. 151: 2623 (1993)).

항체는 항원에 대해서 높은 결합 친화도를 보유하면서 다른 바람직한 생물학적 특성이 있도록 인간화되는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 방법에 따라, 모체 서열 및 인간화된 서열의 3-차원적 모델을 사용하여 모체 서열 및 다양하게 개념적인 인간화된 생성물을 분석함으로써 인간화된 항체를 제조한다. 3-차원 면역글로불린 모델은 상업적으로 시판되는 것으로서 당업자에게 친숙한 것들이다. 컴퓨터 프로그램은 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원적 순응성 구조물을 설명해서 이를 디스플레이한다는 점에서 유용하게 사용된다. 이 디스플레이를 검사하면 후보 대상 면역글로불린 서열의 기능을 규명하는 데 있어서 잔기의 그럴 듯한 역할을 분석할 수 있다. 즉, 이 항원에 결합하는 후보 대상의 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 수용체로부터 FR 잔기를 선택하고 결합한 후 서열을 삽입하면 소정의 항체 특성, 예를 들면, 표적 항원에 대한 증가된 친화도가 얻어진다. 일반적으로, 초가변성 영역 잔기는 항원 결합에 직접적이면서 대부분 실질적으로 영향을 주는 것과 관련이 있다.

인간화된 항체의 다양한 형태를 설명한다. 예를 들면, 인간화된 항체는 항체 단편이거나, 가령 Fab로서, 이는 하나 이상의 세포독성제와 임의적으로 콘쥬게이트되어 면역콘쥬게이트를 생성하는 것일 수도 있다. 대안적으로, 인간화된 항체는 완전한 항체, 예를 들면 완전한 IgG₁ 항체일 수도 있다.

인간화 과정에 대한 대체 방법으로서, 인간의 항체를 생산할 수 있다. 예를 들면, 내인성 면역글로불린이 생산되지 않는 상황에서, 면역화 과정 수행시에 인간 항체의 전체적인 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스게닉 동물(예, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들면, 키메릭 및 점-라인 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(J_H)의 동형접합 결손은 내인성 항체 생산을 완전하게 억제한다는 것은 개시되어 있다. 인간 점-라인 면역글로불린 유전자 배열을 이러한 점-라인 돌연변이 마우스내로 이동하면 항원 투여시에 인간 항체가 생산되는 결과를 가져온다. 예, 참조: Jakobovits et al ., Proc . Natl . Acad . Sci .USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year inInzmrzuno. 7: 33 (1993); 미국 특허 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545, 807; 및 WO 97/17852.

대안으로서, 파지 디스플레이 기법(McCafferty et al ., Nature 348: 552-553 (1990))을 사용하여 면역화되지 않은 공여자의 면역글로불린 가변성(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관 내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다. 이 기법에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 인-프레임 상태로 필라멘트성 박테리오파지, 예를 들면 M13 또는 fd와 같은 주된 또는 부수적인 코트 단백질 유전자에 클론된 뒤 파지 입자의 표면상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 일본쇄 DNA 복사물을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기준으로 선택을 수행하면 이러한 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선택이 이루어진다. 그러므로 파지는 B-세포가 지닌 특성 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는, 예를 들면 Johnson, K. S. 및 Chiswell, D. J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)에서 다양한 포맷으로 수행되어 검토될 수 있다. V-유전자 분체의 몇몇 공급원을 사용하며 파지 디스플레이를 수행할 수 있다. Clackson 등., Nature 352: 624-628 (1991)에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래한 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 다양한 배열을 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자의 V 유전자 레퍼토리를 구축하여 항원의 다양한 배열에 대한 항체(자가 항원을 비롯하여)를 단리하는데, 이러한 과정은 Marks et al ., J: Mol . Biol . 222: 581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBOJ . 12: 725-734 (1993)에 기재된 기법에 따라 수행할 수 있다. 참조, 미국 특허 5,565,332 및 5,573,905.

전술한 바와 같이, 인간 항체는 시험관 내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다(미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).

본 기술에 숙련된 당업자라면 전체적인 비-인간 가변성 도메인을 인간 고정 영역 상에 그래프팅하면 "클래식한" 키메릭 항체가 생성된다는 것을 숙지할 것이다. 본 발명의 문맥상, "키메릭 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 얻거나 또는 이로부터 유래한 것이고, 고정 영역(이는 본 발명에 따라 완전한 것이거나, 부분적인 것이거나 또는 변형된 것일 수도 있다)은 제2 종으로부터 얻은 것일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항원 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원(예, 마우스)이고, 고정 영역은 인간이다. 가변성 영역의 면역원성 특이성이 일반적으로는 이의 공급원에 따라 영향을 받지는 않지만, 인간 고정 영역은 비-인간 공급원으로부터 얻은 고정 영역의 경우보다 인간 검체로부터 얻은 면역 반응을 덜 이끌어낼 것 같다.

중쇄 및 경쇄 모두에서의 가변성 도메인은 하나 이상의 CDRs 중의 적어도 일부 치환에 의해 변경되거나, 필요하다면 기본 구조 영역의 부분 치환과 서열 변화에 의해서 변경될 수 있다. CDRs은 기본 구조의 영역이 유래 되는 항체와 같은 부류 또는 심지어는 서브 클래스로부터 유래할 수 있기도 하지만, CDRs는 상이한 부류의 항체로부터 유래하고, 바람직하게는 상이한 종에서 얻은 항체로부터 유래할 것이다. 한 개의 가변성 도메인의 항원 결합 역량을 다른 도메인으로 이동하기 위해서 모든 CDRs를 공여자의 가변성 영역으로부터 얻은 완전한 CDRs로 치환할 필요가 없을 수도 있다. 그보다는, 항원 결합 부위의 활성을 유지하기 위해 필요한 이러한 잔기를 이동시키는 것만이 필요할 수도 있다. 미국 특허 5,585,089, 5,693,761 및 5,693,762에 개시된 것을 근거로 할 때, 면역원성이 감소한 기능성 항체를 얻기 위해서, 보편적인 실험을 수행하던지, 아니면 시행 착오 테스트를 수행하는 것도 당업자의 역량 내에 있을 것이다.

가변성 영역에 대한 변경에도 불구하고, 당업자라면 본 발명의 변형된 항체가 항체, 또는 이의 면역반응 단편을 포함한다는 것을 숙지할 것인데, 여기서 이들은 하나 이상의 고정 영역 도메인의 적어도 일부가 삭제되거나 또는 그렇지 않으면 변경되어, 원래의 고정 영역 또는 변경되지 않은 고정 영역을 포함하는 거의 동일한 면역원성의 항체와 비교했을 때 증가한 종양 편재화 또는 감소한 혈청 반감기와 같은 소정의 생화학 특성을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 변형된 항체의 고정 영역은 인간의 고정 영역을 포함할 것이다. 본 발명에 적합한 고정 영역에 대한 변형은 하나 또는 그 이상의 도메인에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 첨가, 결손 또는 치환하는 것을 포함한다. 즉, 본 명세서에 개시된 변형된 항체는 3개의 중쇄 고정 도메인(C_H1, C_H2 또는C_H3) 및/또는 경쇄 고정 도메인(C_L) 중 하나 또는 그 이상에 대해 변경 또는 변형한 것을 포함할 수도 있다. 후술하는 바 및 실시예에서 설명하는 바와 같이, 본 발명의 바람직한 구체예는 변형된 고정 영역을 포함하는데, 여기서 하나 또는 그 이상의 도메인은 부분적으로 또는 전체적으로 삭제되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 변형된 항체는 전체 C_H2 도메인이 제거된 도메인 삭제의 구축물 또는 변형체이다(△C_H2 구축물). 또 다른 바람직한 구체예에서, 생략된 고정 영역 도메인은 고정 영역이 없으므로 인해서 일부의 분자 유연성을 제공하는 짧은 아미노산 스페이서(예, 10개의 잔기)에 의해 대체될 것이다.

이러한 형상 이외에, 당 분야에는 고정 영역이 다수의 이펙터 기능을 중재한다는 것은 잘 알려져 있다. 예를 들면, 항체에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화작용 및 용균 과정에 있어서 중요하다. 또한, 보체의 활성화는 염증 반응을 자극하므로 자가면역 과민성과 관련될 수도 있다. 또한, 항체는 Fc 영역을 통하여 세포에 결합하며, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위는 세포 상에서 Fc 수용체(FcR)에 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (에타 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)를 비롯한, 항체의 상이한 부류에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면에서의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은, 항체 피복 입자의 흡수 및 파괴, 면역 복합체의 청소, 킬러 세포에 의한 항체 피복 표적 세포의 용균 과정(항체 의존 세포 매개 세포독성 또는 ADCC라 지칭), 염증성 중재자의 방출, 면역글로불린 생산의 태반성 이동 및 통제를 비롯한 중요하면서도 다양한 생물학적 반응을 목표로 한다. 다양한 Fc 수용체 및 수용체 부위가 어느 정도 연구되긴 하였지만, 이들의 위치, 구조 및 기능 규명에 관해서는 여전히 알려지지 않은 것이 많다.

본 발명의 영역을 제한하는 것은 아니지만, 본 명세서에 기술된 바와 같이 변형된 고정 영역을 함유하는 항체는 변경된 이펙터 기능을 제공함으로써 투여된 항체의 생물학적 프로필에 영향을 끼친다. 예를 들면, 고정 영역 도메인의 결손 또는 불활성화(점 돌연변이 또는 기타 다른 수단)는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜 종양의 편재화를 증가시킨다. 다른 경우에 있어서, 본 발명에 부합하는 고정 영역 변형은 보체 결합을 적절하게 함으로써 혈청 반감기를 감소시키고 콘쥬게이트된 세포독소의 비특이적 관련성을 또한 감소시킨다. 고정 영역의 다른 변형체를 사용하여 이황화 결합 또는 올리고사카라이드 부분을 제거하면 증가한 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인해 향상된 편재화 현상이 나타난다. 더욱 일반적으로, 당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같이, 변형된 항체가 인식되거나 또는 되지 않을 수도 있는 다수의 민감한 효과를 보일 수도 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 이와 유사하게, 본 발명에 따른 고정 영역의 변형체는 당업자의 관점 내에서 잘 알려진 생화학 기법 또는 분자 공학 기법을 사용하여 쉽게 만들 수 있다.

변형된 항체를 조작하여 각기 변형된 항체의 힌지 영역에 직접 C_H3 도메인을 융합시키도록 할 수도 있다. 다른 구조물에서, 힌지 영역과 변형된 C_H2 및/또는 C_H3 도메인 사이에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수도 있다. 예를 들면, 상용성 구조물은, C_H2 도메인이 삭제되고 남은 C_H3 도메인(변형된 또는 변형되지 않은)이 5-20 개의 아미노산 스페이서에 의해 힌지 도메인에 결합하는 방식으로 발현될 수도 있을 것이다. 이러한 관점에서, 하나의 바람직한 스페이서는 아미노산 서열 IGKTISKKAK (서열 번호: 44)이다. 이러한 스페이서는 첨가되면, 예를 들면, 고정 도메인의 조절 요소들을 확실하게 자유롭게 접근 가능하도록 유지하거나 또는 힌지 영역이 확실하게 유연성을 갖도록 할 수도 있다. 하지만, 아미노산 스페이서는, 어떤 경우에, 면역원성을 가지는 것으로 입증되어 구조물에 대해서 원치 않은 면역 반응을 유발한다는 것도 주목하여야 한다. 따라서, 구조물에 첨가된 임의의 스페이서는 비교적 면역원성이 없는 것이 바람직하고, 심지어 보다 바람직하게는, 변형된 항체의 바람직한 생화학적 품질이 유지될 수도 있는 경우라면, 함께 생략된다.

전체 고정 영역 도메인을 삭제하는 것 외에도, 본 발명의 항체는 몇 개 또는 단 한 개의 아미노산이 부분적으로 결손 또는 치환되어 제공될 수 있음을 숙지해야 할 것이다. 예를 들면, C_H2 도메인의 선택된 영역에서 단 한 개의 아미노산의 돌연변이가 Fc 결합을 실질적으로 감소시켜 종양 편재화의 증가를 일으키기에 충분한 것일 수도 있다. 이와 유사하게, 조절될 이펙터 기능(예, 보체 CLQ 결합)을 통제하는 1종 이상의 고정 영역 도메인을 간단히 삭제하는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 고정 영역의 부분적 결손은 항체의 선택된 특성(혈청 반감기)을 개선하면서 대상고정 영역 도메인과 관련된 다른 바람직한 기능들은 그대로 유지할 수도 있다. 또한, 상기 설명한 바와 같이, 개시된 항체의 고정 영역은 생성된 구조물의 프로필을 증진시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통하여 변형될 수도 있다. 이러한 관점에서, 보전된 결합 부위(Fc 결합)에 의해 제공된 활성을 붕괴시키면서 변형된 항체의 면역원 프로필과 구성 배열은 실질적으로 보유하는 것이 가능할 수도 있다. 또 다른 구체예에서는, 이펙터 기능과 같은 바람직한 특성을 향상시키기 위해서 고정 영역에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 첨가시키는 것을 포함하거나 또는 더 많은 세포독소 또는 탄수화물을 부착하게 할 수도 있다. 이러한 구체예에서, 선택된 영역 도메인으로부터 유래한 특이적 서열을 삽입 또는 복제하는 것이 바람직할 수도 있다.

특히 바람직한 구체예에서, 클론된 가변성 영역 유전자를 상술한 바와 같이 중쇄 및 경쇄 고정 영역 유전자(바람직하게는 인간)와 함께 발현 벡터에 삽입한다. 이는 NEOSPLA로 지칭된 IDEC, Inc의 고유 발현 벡터를 사용함으로써 일어난다. 이 벡터는 시토메갈로바이러스 프로모터/인헨서, 마우스 베타 글로빈 주 프로모터, SV 40 복제 원점, 소의 혈청 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 리더 서열을 함유한다. 후술되는 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 이 벡터는 가변성 및 고정 영역 유전자의 혼입, CHO 세포에서의 형질감염 후 배지 및 메토트렉세이트 증폭제를 함유한 G418 에서의 선택에 의해 매우 높은 발현율을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이 벡터는 공동 양수인의 미국 특허 5,736,137 및 5,658,570에 개시되어 있는데, 이 각각은 본원에 전체가 참고로 인용되었다. 이 시스템은 즉, 30 pg/세포/일 이상의 높은 발현 수준을 제공한다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 변형된 항체는 2001년 11월 16일에 미국 가명세서 출원에 개시된 폴리시스트로닉 구조물을 사용하여 발현될 수도 있다. 이 문헌은 전체가 참고 인용되었다. 이러한 새로운 발현 시스템에서, 항체의 중쇄 및 경쇄와 같이 목적하는 다수 유전자 생성물은 단일 폴리시스트로닉 구조물로부터 제조될 수도 있다. 이들 시스템은 유리하게 내부 리보좀 입장 부위(IRES)를 사용하여 진핵 숙주 세포 중에서 비교적 높은 수준의 변형된 항체를 제공한다. 상용성 IRES 서열은 미국 특허 6,193,980에 개시되어 있다. 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용된 것이다. 당업자는 이러한 발현시스템을 사용하여 효과적으로 본 출원에 개시된 모든 범위의 항체를 효과적으로 생산할 수도 있음을 숙지할 수 있을 것이다.

더욱 구체적으로는, 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 벡터 또는 DNA 서열, 예를 들면 변형된 항체가 일단 제조되면, 발현 벡터는 적당한 숙주 세포 내로 도입될 수도 있다. 즉, 숙주 세포는 형질전환될 수도 있다. 플라스미드를 숙주세포 내로 유입하는 것은 당 분야에 알려진 다양한 기법에 의해 달성될 수 있는데, 형질감염(전기영동 및 일렉트로포레이션을 포함), 원형질 융합, 칼슘 포스페이트 침전, 봉입된(enveloped) DNA와의 세포 융합, 마이크로인젝션 및 완전한 바이러스에 의한 감염을 포함할 수 있지만 이에 국한되는 것은 아니다. 참조, Ridgway, A. A. G."Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez 및 Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). 더욱 바람직하게는, 플라스미드를 숙주 내로 도입하는 것은 일렉트로포레이션을 통하여 수행한다. 형질전환된 세포는 경쇄 및 중쇄의 생성에 적합한 조건하에서 성장된 후 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성이 분석된다. 분석 기법의 예로는 효소-결합 면역흡수 분석(ELISA), 방사 면역분석(RIA), 또는 형광-활성화 세포 분류 분석(FACS), 면역조직화학 및 기타 등을 포함한다.

본 명세서에서, 용어 "형질전환"은 넓은 의미에서 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 유전형을 변화시켜 결과적으로 수용체 내에서 세포의 변화를 가져오는 것을 말한다.

동일한 맥락에서, "숙주 세포"란 재조합 DNA 기술을 사용하여 구축된 적어도 1개의 이형 유전자를 함유한 벡터로 형질전환된 세포를 말한다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 숙주 세포에 의해 생산된 항체 또는 변형체는 이러한 형질 전환에 의한다. 재조합 숙주로부터 항체를 단리하는 과정을 기재하는 데 있어서, "세포" 및 "세포 배양물"이란 용어는 특별히 언급하지 않는 한, 항체의 공급원을 나타내는 것으로 서로 상호적으로 사용된다. 다른 말로 하면, "세포"로부터 항체를 회수하는 것은 스펀 다운된(spun down) 전체 세포로부터이거나 또는 배지 및 현탁된 세포를 함유하는 세포 배양물로부터의 것을 의미할 수도 있다.

단백질 발현에 사용되는 숙주 세포주는 포유 동물의 기원의 것이 가장 바람직하며; 당업자들은 발현될 소정의 유전자 생성물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 우세하게 결정할 수 있는 능력을 지녔다. 세포주의 예로는 제한하는 것은 아니지만 DG44 및 DUXB 11 (차이니즈 햄스터 난소 라인, DHFR 마이너스), HELA (인간의 자궁 경부암), CVI (원숭이의 신장 라인), COS (SV40 T 항원에 의한 CVI의 유도체), R1610 (차이니즈 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3 (마우스 섬유아세포), HAK (햄스터 신장 라인), SP2/0 (마우스 골수종), P3.times.63-Ag3.653 (마우스 골수종), BFA-lclBPT (소의 상피세포), RAJI (인간의 림프구) 및 293 (인간의 신장)을 포함한다. CHO 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포주는 일반적으로 상업적인 서비스 제공처, 미국 배양물 수집소(American Tissue Culture Collection)나 공개 문헌으로부터 입수 가능하다.

바람직한 항체를 다량 생산하기 위해서 실험실 생산을 대규모로 하는 것이 가능하다. 조직 배양 조건하에 포유 동물의 세포를 배양하는 것에 관한 기법은 종래 기술에 잘 알려져 있는데, 이에는 예를 들면 에어리프트(airlift) 반응기 또는 연속 교반 반응기에서의 균질한 현탁 배양, 또는 예컨대, 중공 섬유, 미소캡슐 내에서, 아가로즈 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서의 고정화 또는 포획된 세포 배양을 포함한다. 변형된 항체를 단리하기 위해서, 배양 상청액중의 면역글로불린을 우선 예컨대, 암모늄 설페이트로 침전시켜서 농축하고, 예컨대, 흡습성 재료(예, PEG)에 대한 투석을 수행하고, 선택성 막을 통한 여과를 하며, 또는 기타 등을 수행한다. 필요하고/또는 소망스럽게는, 농축 항체를 예를 들면 겔 투과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스 상에서의 크로마토그래피, 또는 (면역-) 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 크로마토그래피 방법에 의해 정제한다.

본 발명의 변형된 면역글로불린 유전자 및/또는 폴리펩티드는 박테리아 또는 효모와 같은 비-포유동물 세포 중에서도 또한 발현될 수 있다. 이러한 관점에서, 박테리아와 같은 다양한 단세포 비-포유동물의 미생물도 형질전환될 수 있음을 숙지할 것이다; 여기서 미생물은 배양물 또는 발효를 통해 증식할 수 있는 미생물을 말한다. 형질전환에 민감한 박테리아는 엔테로박테리아세에(enterobacteriaceae),예를 들면 이. 콜리 (Escherichia coli); 살모넬라(Salmonella); 바실라세에(Bacillaceae), 예컨대 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) ; 뉴모코코스 (Pneumococcus) ; 스트렙토코구스(Streptococcus), 및 헤모필러스 인플루엔재(Haemophilus influenzae) 균주를 포함한다. 박테리아 중에서 발현되었을 때, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는 일반적으로 삽입체(inclusion bodies)의 일부가 된다는 것도 알 수 있을 것이다. 이후 사슬은 단리, 정제 및 기능성 면역글로불린 분자로 어셈블링되어야 한다.

원핵 세포 이외에, 진핵세포의 마이크로브가 또한 사용될 수도 있다. 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 제빵자의 효모는 진핵 세포 미생물 가운데 통상적으로 가장 많이 사용되는 것이지만 다른 다수의 균주도 사용가능하다.

사카로마이세스에서 발현하는 경우, 플라스미드 YRp7, 예컨대, (Stinchcomb et al., Nature 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10: 157 (1980))가 통상적으로 사용된다. 이러한 플라스미드는 또한 트립토판중에서 성장 능력이 부족한 효모의 돌연 변이주에 대한 선택 마커를 제공하는 trpl 유전자를 함유하는데, 이의 예로는 ATCC 수탁번호 44076 또는 PEP4-1가 있다. (Jones, Genetics 85: 12 (1977) ). 효모 숙주 세포 게놈의 특징인 trpl 병변의 존재는 트립토판 부재하에 성장한 것에 의해 형질전환을 검출하는 효과적인 환경을 제공한다.

임상적으로 얼마나 유용한 양이 얻어지는가와는 무관하게, 본 발명의 변형된 항체는 수많은 콘쥬게이트(즉, 면역콘쥬게이트) 또는 비콘쥬게이트 형중 임의의 하나로 사용될 수도 있다. 특히, 본 발명의 항체는 방사성 동위원소, 치료제, 세포활동 억제제, 생물학적 독소 또는 프로드럭과 같은 세포독소에 콘쥬게이트될 수도 있다. 대안적으로, 본 발명의 변형된 항체는 비콘쥬게이트된 형으로 사용될 수 있거나 또는 "네이키드(naked)" 형으로 사용되어 보체 의존 세포독성(CDC) 및 항체 의존 세포 독성(ADCC)을 비롯한 개체의 자연적 방어 기작을 이용함으로써 악성 종양 세포를 제거한다. 특히 바람직한 구체예에서, 변형된 항체는 잘 알려진 킬레이트제 또는 직접 표지화 중 어느 하나를 사용하여 방사성 동위원소에 콘쥬케이트될 수 있으며, 이러한 방사성 동위원소의 예로는 ⁹⁰Y,^l25I,¹³¹I, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹⁰⁵Rh, ¹⁵³Sm, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re 및 ¹⁸⁸Re 을 들 수 있다. 다른 구체예에서, 개시된 조성물은 약물, 프로드럭 또는 생물학적 반응 조절제(예, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 림포카인(예, 인터페론))에 커플링 된 변형된 항체를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 라이신(ricin) 또는 디프테리아 독소와 같은 특이적 바이오톡신에 콘쥬게이트된 변형된 항체를 사용하는 것을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, 변형된 항체는 다른 면역적으로 활성인 리간드(예, 항체 또는 이의 단편)과 복합체화될 수도 있는데, 여기서 생성된 분자는 신생물 세포 및 이펙터 세포(예, T 세포) 둘 다에 결합한다. 콘쥬게이트된 또는 콘쥬게이트 되지 않은 변형된 항체 어느것을 사용할지를 선택하는 것은 암의 유형 및 암의 진행 단계, 보조 치료법의 사용(예, 화학 치료 요법 또는 외부 방사선 치료 요법) 및 환자의 상태에 따른다. 당업자는 본 발명의 교시 관점에서 이러한 선택을 용이하게 할 수 있을 것이다.

본 명세서에 사용된 "세포독소 또는 세포독성제"란 노출되었을 때 세포의 성장 및 증식에 해로우며 악성 종양을 감소, 억제 또는 사멸시키도록 작용하는 제제를 의미한다. 세포독소의 예로는 다음의 것에 제한하는 것은 아니지만, 방사선 핵종, 생물학적 독소, 세포활동 억제성 치료제 또는 세포독성 치료제, 프로드럭, 면역학적으로 활성화된 리간드 및 시토킨과 같은 생물학적 반응 조절제를 포함한다. 후술 되는 곳에서 기술하는 바와 같이, 방사성 핵종 세포독소는 본 발명의 사용에 특히 바람직하다. 그러나 악성 종양 세포의 성장을 지연 또는 늦추거나 또는 악성 종양 세포를 제거하도록 작용하며, 또한 본원 명세서에 개시된 변형된 항체와 관련될 수도 있는 임의의 세포독소도 본 발명의 범주 내에 속한다.

이전의 연구에서, 동위원소로 표지 된 항종양 항체는 고형 종양에서 세포들을 성공적으로 파괴했을 뿐 아니라 동물 모델 및 인간에게서 림프종/백혈병을 성공적으로 사멸시켰다. 방사성 핵종은 핵 DNA에서 다수의 가닥 파괴를 일으켜 세포의 사멸을 가져오는 이온화 조사가 일어나도록 작용한다. 일반적으로, 치료성 콘쥬게이트를 생산하는 데 사용되는 동위원소는 치료적으로 효과가 있는 경로 길이를 지닌 고에너지의 알파-, 감마- 또는 베타- 입자들을 생성한다. 이러한 방사성 핵종은 근접해 있는 세포들, 예를 들면 콘쥬게이트가 부착되거나 유입되어 있는 신생물 세포들을 죽인다. 일반적으로 이들은 비 편재화 세포 상에 거의 영향을 미치지 못하거나 영향을 전혀 끼치지 않는다. 방사성 핵종은 필연적으로 비면역원성이다.

본 발명과 관련하여 방사표지 된 콘쥬게이트를 사용하는 것과 관련하여, 변형된 항체를 직접 표지하거나(예를 들면, 이온화 방법을 사용하여) 또는 킬레이트제를 사용하여 간접적으로 표지할 수도 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "간접 표지화" 및 "간접 표지화 접근법" 용어 둘 다는 킬레이트제가 항체에 공유적으로 결합하여 하나 이상의 방사성 핵종이 킬레이트제와 결합하는 것을 의미한다. 이러한 킬레이트제는 일반적으로 2 기능성 킬레이트제로 간주하는데, 이는 이들이 폴리펩티드와 방사성 동위원소에 모두 결합하기 때문이다. 특히 바람직한 킬레이트제는 l-이소티오시마토벤질-3-메틸디오트텔렌 트리아민펜타아세트산("MX-DTPA") 및 시클로헥실 디에틸렌트리아민펜타아세트산("CHX-DTPA") 유도체를 포함한다. 다른 킬레이트제는 P-DOTA 및 EDTA 유도체를 포함한다. 특히 바람직한 간접 라벨링에 대한 방사성 핵종은 ¹¹¹In 및 ⁹⁰Y를 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "직접 표지화" 및 "직접 표지화 접근법"은 모두 방사성 핵종이 항체에 직접 공유적으로 결합한 것을 말한다(일반적으로 아미노산 잔기를 통하여). 더욱 구체적으로는, 이들 결합 기법은 랜덤 표지화 및 부위-지시의 표지화를 포함한다. 후자의 경우, 표지화는 콘쥬게이트의 Fc 부위 상만 존재하는 N-결합 당 잔기와 같은 이량체, 또는 사량체상의 특정 부위와 관련 있다. 또한, 다양한 직접 표지화 기법 및 프로토콜은 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들면, 테크네튬-99m 표지된 항체는 리간드 교환 과정을 수행하거나, 퍼테크네이트(Tc0₄ ^-)를 제1주석 이온 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 칼럼 상에 킬레이트화 처리하여 항체를 이 칼럼에 적용하거나, 또는 배치 표지화 기법, 예를 들면 퍼테크네이트, 환원제(SnCl₂와 같은), 완충 용액(예, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액), 및 항체를 인큐베이터로 배양시키는 방식으로 제조할 수도 있다. 어떤 경우에도, 항체를 직접 표지화하는데 바람직한 방사성 핵종은 당분야에 잘 알려져 있으며, 특히 바람직한 직접 표지화 용의 방사성 핵종은 티로신 잔기를 통하여 공유 결합한 ¹³¹I이다. 본 발명에 따른 변형된 항체는, 예를 들면 방사 활성의 나트륨 또는 요오드화 칼륨 및 화학 산화제, 예를 들면 나트륨 차아염소산염, 클로라민 T 또는 기타, 또는 효소 산화제(예, 락토페록시다제, 글루코오스 옥시다아제 및 글루코오스)에 의해 유래한 것일 수도 있다. 하지만, 본 발명의 목정상, 간접 표지화 접근법이 특히 바람직하다.

킬레이트제 및 킬레이트제 콘쥬게이트에 관한 특허는 기술에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 4,831,175(Gansow)는 다치환된 디에틸렌트리아민펜타아세트산 킬레이트 및 동일한 것을 함유하는 단백질 콘쥬게이트 그리고 이들의 제조방법에 관한 것이다. 미국 특허 5,099,069, 5,246,692, 5,286,850, 5,434,287 및 5,124 471(Gansow)는 또한 다치환된 DTPA 킬레이트에 관한 것이다. 이들 특허는 본 명세서에 전체가 참고로 인용되었다. 상용성의 금속 킬레이트제의 다른 예로는 에틸렌아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜탄아세트산(DPTA), 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸, 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산, 1-옥사-4,7,12,15-테트라아자헵타데칸-4,7,12,15-테트라아세트산 또는 기타 등을 들 수 있다. 시클로헥실-DTPA 또는 CHX-DTPA가 특히 바람직하며, 이는 후술 되는 곳에서 광범위하게 예시된다. 아직 발견중에 있는 것, 당업자가 쉽게 인식할 수 있는 것 등의 기타 상용성의 킬레이트제도 본 발명의 범주 내에 확실히 속한다.

함께 계류중인 출원 08/475,813, 08/475, 815 및 08/478,967에서 킬레이트화 과정을 용이하게 하기 위하여 사용된, 특이적 2 기능성 킬레이트제를 비롯한 상용성의 킬레이트제가 3가 금속에 대하여 높은 친화도를 제공하기 위하여 선택되고, 증가한 종양 대 비-종양 비 및 감소한 뼈 흡수율 뿐만 아니라, 생체 내에서 방사성 핵종을 표적 부위, 즉 B-세포 림프종 종양 부위로 더욱 많이 보유하는 것을 나타낸다. 하지만, 이러한 모든 특성을 모두 가지거나 모두 가지지 않는 다른 2 기능성 킬레이트제도 당 분야에 잘 알려져 있으므로 종양 치료 요법에 또한 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 교시에 따라, 변형된 항체를 상이한 방사 표지체에 콘쥬게이트하여 진단 목적 및 치료 목적으로 사용될 수 있음도 알 수 있을 것이다. 이를 위해서, 전술한 함께 계류중인 출원(본원에 전체가 참고 인용됨)은 치료 항체를 투여하기 전에 종양을 진단가능하도록 영상화하기 위한, 방사표지된 치료 콘쥬게이트를 개시하고 있다. "In2B8" 콘쥬게이트는 인간 CD20 항원에 특이적인 쥐의 모노클로날 항체, 2B8을 포함하는데, 이는 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸-DTPA 및 1-메틸-3-이소티오시아네이토벤질-DTPA의 1:1 혼합물을 포함하는, 2 기능성 킬레이트제, 즉 MX-DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산)를 통하여 ¹¹¹In에 부착되어 있다. ¹¹¹In이 진단용의 방사성 핵종으로 특히 바람직한 것은 약 1 내지 약 10 mCi가 검출가능한 독성을 나타내지 않으면서도 안전하게 투여될 수 있으며 또한 영상 데이터가 일반적으로 이후의 ⁹⁰ Y-표지된 항체 분포를 미리 보여주기 때문이다. 대부분의 영상화 연구는 5mCi의 ¹¹¹In 표지의 항체를 이용하는데, 이는 이 용량이 안전하며, 또한 낮은 용량과 비교하여 증가한 영상 효율을 나타내고, 항체 투여한 지 3 내지 6일에 최적의 영상을 나타내기 때문이다. 예컨대, Murray, J. Nuc . Med. 26:3328(1985) and Carraguillo et al., J. Nuc. Med. 26: 67(1985) 참조.

전술한 바와 같이, 다양한 방사선 핵종이 본원 발명에 사용되며, 당업자들은 어느 방사선 핵종이 다양한 환경에서 가장 적합한지를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면 ¹³¹I는 표적 면역 치료 요법에 사용되는 가장 잘 알려진 방사선 핵종이다. 하지만, ¹³¹I의 임상적 유용성은 8일간의 물리적 반감기; 혈액 및 종양 부위에서의 요오드화된 항체의 탈할로겐화반응; 및 종양에서 편재화된 용량 침적에 최적 이하일 수 있는 유출 특성(예, 커다란 감마 성분)과 같은 제한 요인에 의해 제한될 수 있다. 강력한 킬레이트제의 출현에 따라, 금속 킬레이트 그룹을 단백질에 부착시키는 기회는 ¹¹¹In 및 ⁹⁰Y과 같은 기타 다른 방사성 핵종을 사용하는 기회를 증가시켰다. ⁹⁰Y는 방사 면역치료 투여에 이용할 경우 유리한 몇몇 이점을 제공한다:⁹⁰Y의 64시간의 반감기는 종양에 의한 항체의 축적을 허용하기에 충분하도록 긴 시간이며, ¹³¹I와는 달리, ⁹⁰Y는 붕괴시에 감마 조사를 동반하지 않는 높은 에너지의 순수한 베타 방사체로서 조직 내에서 세포 직경이 100 내지 1,000인 범위에 있다. 또한, 침투되는 최소의 조사량은 외래 환자에게로 하여금 ⁹⁰Y-표지 항체를 투여하게 한다. 또한, 표지된 항체의 내재화 과정은 세포 사멸에는 요구되지 않으며, 이온 조사의 국소적 유출은 표적 항원이 부족한 인접 종양 세포에 대해서 치명적이어야 한다.

⁹⁰Y-표지 항체의 효과적인 1회의 치료량(즉, 치료 유효량)은 약 5 내지 약 75 mCi, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 40 mCi의 범위 내에 있다. ^l3lI-표지 항체의 효과적인 1회 치료 비-골수 제거가능한 용량은 약 5 내지 약 70 mCi, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 40 mCi에 있다. ^l3lI-표지화 항체의 효과적인 1회 치료 비-골수 제거가능한 용량은(즉, 자가 조직의 골수 이식을 요구할 수도 있다) 약 30 내지 약 600 mCi, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 500 mCi 미만의 범위에 있다. 키메릭 항체와 관련하여, 쥐의 항체에 대해 더 길어진 순환 반감기 때문에, 요오드-131로 표지된 키메릭 항체의 효과적인 단일 치료 비-골수 제거가능한 용량은 약 5 내지 40 mCi에 있으며, 더욱 바람직하게는 약 30 mCi 미만에 있다. 예컨대, ¹¹¹In 표지에 대한 영상화 기준은 일반적으로 약 5 mCi 미만이다.

¹³¹I 및 ⁹⁰ Y로 많은 임상 경험을 얻을 수 있긴 하지만, 다른 방사성 표지도 종래기술에 알려져 있으며 유사한 목적으로 사용되어 왔다. 기타 다른 방사성 동위원소를 영상화에 사용한다. 예를 들면, 본 발명의 범주 내에 속하는 부가의 방사성 동위원소는, 다음의 예로 제한하는 것은 아니지만, ¹²³I, ¹²⁵I, ³²P, ⁵⁷Co, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁷⁷Br, ^{8 l}Rb, ^{8 l}Kr, ⁸⁷Sr, ¹¹³In, ¹²⁷Cs, ¹²⁹Cs, ¹³²I, ¹⁹⁷Hg,²⁰³Pb, ²⁰⁶Bi, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹⁵³Sm, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ²²⁵Ac, ²¹¹At, 및 ²¹³Bi를 들 수 있다. 이러한 관점에서, 알파, 감마 및 베타 에미터는 모두 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 본 발명의 관점에서, 당업자는 어떤 방사성 핵종이 부당한 실험 없이 선택된 치료 코스에 부합하는 지를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 이러한 목적을 위해서, 임상 진단에 이미 사용된 부가의 방사성 핵종은 ^l25I, ¹²³I, ⁹⁹Tc, ⁴³K, ⁵²Fe, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga 뿐 아니라 ¹¹¹In를 포함한다. 또한, 항체는 표적 면역 치료요법에 사용가능한 다양한 방사성 핵종으로 표지된바 있다(Peirersz et al. Immunol . Cell Biol . 65: 111-125(1987). 이들 방사성 핵종은 ¹⁸⁸Re 및 ¹⁸⁶Re 뿐 아니라 작게는 ¹⁹⁹Au 및 ⁶⁷Cu을 포함한다. 미국 특허 5,460,785은 이러한 방사성 동위원소 같은 부가의 데이터를 제공하며, 이 문헌은 본원에 참고로 인용되었다.

방사성 핵종 이외에, 본 발명의 변형된 항체는 다수의 생물학적 반응 조절제, 약학적 제제, 독소 또는 면역학적으로 활성인 리간드 중 어느 하나에 콘쥬게이트 되거나 또는 결합된것일 수 있다. 당업자는 이들 비-방사활성의 콘쥬게이트는 선택된 세포 독소에 따라 다양한 기법을 사용하여 어셈블리 될 수도 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 비오틴과의 콘쥬게이트는, 예를 들면, 변형된 항체를 비오틴 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 같은 비오틴의 활성화된 에스테르와 반응시킴으로써 제조된다. 이와 유사하게, 형광 마커와의 콘쥬게이트는 커플링제, 예를 들면 상술한 목록의 것들 존재하에 제조될 수 있거나, 또는 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레신-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수도 있다. 세포 활동 억제/세포독성 성분 및 금속 킬레이트와 본 발명의 키메릭 항체와의 콘쥬게이트는 유사한 방식으로 제조가능하다.

본 발명의 바람직한 제제로는 세포독성 약물, 특히 암 치료에 사용되는 세포독성 약물이다. 이러한 약물로는 일반적으로 세포 활동 억제제, 알킬화제, 대사 길항제, 증식 저해제, 튜블린 결합제, 호르몬 및 호르몬 길항제 및 유사한 것 등을 들 수 있다. 본 발명에 속하는 세포 활동 억제제제의 예로는 알킬화 성분, 예를 들면 메클로르에타민, 트리에틸렌포스포라미드, 시클로포스포라미드, 이포스파미드, 클로로암부실, 부술판, 멜파렌 또는 트리아지퀴논, 또한 니트로소우레아 화합물, 예를 들면 카르뮤스틴, 로무스틴, 또는 세무스틴과 같은 것을 들 수 있다. 다른 바람직한 세포 활동 저해제로는 예를 들면 안트라사이클린 약물 군, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독성 뉴클레오시드, 프테리딘 약물 군, 디이네니즈(diynenes), 및 포도필로톡신을 포함한다. 특히, 이러한 부류로서 유용한 것들로는, 예를 들면, 아드리아마이신, 카르미노마이신, 다우노루비신(다우노마이신), 독소루비신, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 메토프테린, 미트라마이신, 스트렙토니그린, 디클로로메토트렉세이트, 미토마이신 C, 악티노마이신-D, 포르피로마이신, 5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 프토라푸르, 6-메르캅토퓨린, 시타라빈, 시토신 아라비노시드, 포도필로톡신, 또는 포도필로톡신 유도체, 예를 들면 에토포시드 또는 에토포시드 포스페이트, 멜파란, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 류로시딘, 빈데신,류로신등과 같은 것을 포함한다. 본 발명의 범주에 들어오는 다른 세포독성제는 탁솔, 탁산, 시토챠라신 B, 그라미시딘 D, 에티디늄 브로마이드, 에메틴, 테노포시드, 콜치신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로파놀올, 푸로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 호르몬 및 호르몬 길항제, 예를 들면 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 프로제스틴, 예를 들면 히드록시프로제스테론, 또는 메도프로제스테론, 에스트로젠, 예컨대 디에틸베스트롤, 항에스트로젠, 예를 들면, 타목시펜, 안드로겐, 예컨대, 테스토스테론 및 아로마타제 억제제, 예컨대 아미노글루쎄티미드는 본 발명의 범주에 속한다. 전술한 바와 같이, 당업자는 본 발명의 콘쥬게이트 제조 목적에 더욱 부합하는 화합물의 반응을 일으키기 위해서 소정의 화합물에 대한 화학적 변형을 만드는 것도 본 발명의 범주에 속한다.

특히 바람직한 세포 독소의 한 예는 칼리키아마이신(alchemic), 에스페라마이신(esperamicin), 또는 디네마이신(dynemicin)을 비롯한 항종양 항생제의 에네디엔(enediyne) 군에 속하는 멤버나 또는 유도체를 포함한다. 이들 독소들은 매우 강력한 것으로서 핵 DNA를 분해하는 방식으로 작용하여 세포의 사멸을 가져온다. 많이 불활성이 되지만 면역원성인 폴리펩티드 단편을 생산하도록 생체 내에서 분해될 수 있는 단백질 독소와는 달리, 칼리키아마이신, 에스페라마이신, 및 기타 에네디엔류와 같은 독소는 본질적으로 비-면역원성인 소 분자들이다. 이들 비-펩티드 독소는 모노클로날 항체 및 기타 항체들을 표지하는 것으로 기존에 사용되었던 기법에 의해 이량체 또는 사량체에 화학적으로 결합한다. 이들 결합 기법은 콘쥬게이트의 Fc 부위 상에만 존재하는 N-결합 당 잔기를 통한 부위-특이적 결합을 포함한다. 이러한 부위-지시 결합 방법은 콘쥬게이트의 결합 특성에 대해 결합의 가능한 효과를 감소시키는 이점이 있다.

전술한 바와 같이, 상용성의 세포독소는 프로드럭을 함유할 수도 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 용어 "프로드럭"은 모체 약물과 비교하여 종양 세포에 대해 세포독성이 적으면서 효소적으로 활성화되거나 또는 더욱 활성화된 모(母)형으로 전환될 수 있는 약학적 활성 성분의 전구체 또는 유도체를 말한다. 본 발명과 혼화성인 프로드럭은, 다음의 예로 제한하는 것은 아니지만, 포스페이트-함유 프로드럭, 티오포스페이트-함유 프로드럭, 설페이트 함유 프로드럭, 펩티드 함유 프로드럭, 베타-락탐 함유 프로드럭, 임의 치환된 페녹시아세트아미드 함유의 프로드럭 또는 임의 치환 페닐아세트아미드 함유의 프로드럭, 5-플루오로시토신 및 더욱 활성이 강한 세포 독성 유리 약물로 전환될 수 있는 기타 5-플루오로우리딘 프로드럭을 포함한다. 본 발명의 사용에 적합한 프로드럭 형태로 유도체화할 수 있는 세포독성 약물의 다른 예로는 전술한 화학치료제가 포함된다.

다른 세포독소 가운데, 항체가 또한 생물학적 독소와 결합하여 있다는 것을 인식할 수 있을 것인데, 그러한 생물학적 독소의 예로는 라이신(ricin) 서브유닛 A, 아브린(abrin), 디프테리아 독소(diptheria toxin), 보툴리늄(botulinum), 시앙기노신즈(cyanginosins), 사키톡신(saxitoxin), 쉬가톡신(shigatoxin), 파상풍(tetanus), 테드로도톡신(tetrodotoxin), 트리코테센(trichothecene), 베루코겐(verrucologen) 또는 독소 효소를 들 수있다. 이러한 구조물은 항체-독소 구조물의 직접 발현을 허용하는 유전 공학 기법을 사용하여 제조되는 것이 바람직할 것이다. 본 발명의 변형된 항체와 결합할 수도 있는 다른 생물학적 반응 조절제로는 시토킨(예를 들면, 림포카인 및 인터페론)이 있다. 또한, 상술한 바와 같이, 면역학적으로 활성인 리간드(예, 항체 또는 이의 단편)를 본 발명의 변형된 항체와 결합시키기 위해서 유사한 구조물을 사용할 수도 있다. 바람직하게는, 이들 면역학적 활성 리간드는 면역활성 이펙터 세포의 표면상에 존재하는 항원을 대상으로 할 것이다. 이러한 경우에 있어서, 구조물을 사용하여 이펙터 세포, 예를 들면 T 세포 또는 NK 세포가 종양 관련 항원을 지닌 신생물 세포에 근접하게 하므로써 소정의 면역반응을 유발할 수 있다. 이러한 개시관점에 비추어서, 당업자라면 통상의 기법을 사용하여 이러한 구조물을 용이하게 형성할 수 있을 것이다.

개시된 변형된 항체와 결합하여 사용될 수도 있는 상용성의 세포독소의 다른 부류는 방사 감수성 약물로서 이는 종양 세포에 효과적으로 접근할 수도 있다. 이러한 약물은 이온 방사에 대한 감수성을 증진시켜 결과적으로는 방사 치료 요법의 효능을 증가시킨다. 종양 세포에 의해 내재화된 항체 콘쥬게이트는 방사 감수성이 최대인 핵 가까이로 방사성 감수제를 전달할 것이다. 그러므로 변형된 항체와 결합한 비결합의 방사성 감수제는 혈액으로부터 재빨리 청소되어, 남은 방사선 감수제를 표적 종양에 편재화시켜 정상 조직에서 최소의 흡수를 제공한다. 혈액으로부터 신속하게 청소된 후에, 어쥬반트 방사 치료법을 다음 세 가지 방식 중 하나로 진행한다: 1) 종양에 특이적으로 설정된 외부적 빔(beam) 방사, 2) 종양에 직접 이식된 방사활성도, 또는 3) 동일한 표적 항체로 전신 방사면역치료요법. 이러한 접근 방식이 가진 잠재적으로 흥미를 끄는 변화로는 치료 방사 동위원소가 방사선 감수 면역콘쥬게이트에 부착하여, 환자에게 단일 횟수의 약물을 편리하게 투여할 수 있다는 것일 것이다.

개시된 항체가 콘쥬게이트되었는지 또는 안되었는지와 무관하게, 본 발명의 장점은 이들 항체가 골수억제 환자, 특히 방사선 치료 요법 또는 화학 치료요법과 같은 부가 요법으로 치료중이거나 이 치료를 받아온 환자를 대상으로 이들 항체를 사용하는 능력에 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 즉, 변형된 항체의 유리한 전달 프로파일(예, 비교적 짧은 혈청 체류 시간 및 증진된 편재화)은 이들을 붉은 골수의 보존을 감소되고 골수 독성에 민감한 암환자를 치료하는데 특히 적합하도록 만든다. 이러한 점에서, 변형된 항체의 독특한 전달 프로파일은 이들을 골수억제 암 환자에게 방사 표지된 콘쥬게이트를 매우 효과적으로 투여가능하게 한다. 예로서, 외부 빔 방사선 또는 화학치료요법과 같은 부가의 치료 요법을 받은 환자에게는 변형된 항체가 콘쥬게이트 또는 비콘쥬게이트 형인 것이 유용하다. 다른 바람직한 구체예에서, 변형된 항체(다시 콘쥬게이트된 또는 비콘쥬게이트된 형태로)는 화학 치료제와 결합한 치료 투약 스케줄로 사용될 수 있다. 당 분야의 당업자들은 이러한 치료 스케줄이 개시된 항체 및 1종 이상의 치료제를 순차적으로(sequential), 동시에(simultaneous), 또는 수반하여(concurrent), 또는 동일한 시간에 걸쳐(coextensive) 투여할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 특히 바람직한 본 발명의 이러한 관점은 방사표지 된 항체의 투여를 포함할 것이다.

변형된 항체를 바로 앞서 전술한 바에 따라 투여할 수 있긴 하지만, 다른 구체예에서, 콘쥬게이트되고 그리고 콘쥬게이트되지 않은 변형된 항체를 처음 치료제로서 건강한 암환자에게 투여할수 있음도 주목해야한다. 이러한 구체예에서, 변형된 항체는 외부 빔 조사 요법 또는 화학 요법과 같은 부가의 요법을 받고 있지 않거나 또는 받아오지 않은 환자 및/또는 신생물 질환을 앓는 환자에게 투여될 수 있을 것이다.

본 발명의 폴리펩티드

추가로 본 발명은 도 1B, 9F, 21B, 또는 22B(서열번호: 2,4,6,8, 22-27, 또는 29)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단리된 IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드, 또는, 이 폴리펩티드 일부를 함유하는 폴리펩티드 또는 펩티드에 관한 것이다. 용어 "펩티드" 및 "올리고펩티드"는 동의어로 간주하며(같은 것으로 인식됨), 이 각각의 용어는 문맥에서 펩티딜 결합에 의해 커플링된 아미노산에 최소한 부분적인 사슬을 나타내는 의미로 상호적으로 사용될 수 있다. "폴리펩티드"란 용어는 본 명세서에서 10개 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 사슬을 뜻하는 것으로 사용된다. 본 명세서의 올리고펩티드 및 폴리펩티드 포뮬라, 또는 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰며 아미노산 말단에서 카르복시 말단의 방향으로 쓴다.

IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드의 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조나 기능에 상당한 효과를 끼치지 않고서도 변화될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 서열에서의 이러한 차이를 나타내려면, 거기에는 활성을 결정하는 단백질 상에 중요한 영역이 있음을 유념해야 할 것이다. 일반적으로, 유사한 기능을 수행하는 잔기를 사용할 것을 조건으로, 삼차 구조물을 형성하는 잔기를 치환하는 것이 가능하다. 다른 경우에 있어서, 변경이 단백질의 중요하지 않은 영역에서 일어나는 경우 잔기 유형은 전혀 중요하지 않을 수 있다.

그러므로 추가로 본 발명은 후술 되는 단백질 일부와 같은 IGSF9 또는 LIV-1 단백질의 영역을 포함한 IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변이체는 결손, 삽입, 전위, 반복 및 유형 치환(예, 다른 잔기를 친수성 잔기로 치환하지만, 일반적으로 강한 소수성인 것을 강하지 않은 친수성으로 치환한다)을 포함한다. 이러한 작은 변화 또는 이러한 "중성의" 아미노산 치환체는 일반적으로 활성에 대해 거의 영향력을 끼치지 못한다.

일반적 보존적 치환은 지방족 아미노산, Ala, Val, Leu 및 Ile 가운데서 서로 치환된 것이다; 히드록시 잔기 Ser 및 Thr의 상호변환, 산성 잔기의 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln의 치환, 염기성 잔기인 Lys 및 Arg의 교환, 방향족 잔기 Phe, Tyr중에서의 치환이 있다.

전술한 곳에서 상세히 지시한 바와 같이, 아미노산 변화가 표현형으로 나타나지 않을 것 같다는 것(즉, 기능에 상당한 유해 효과를 지닐 것 같지 않다는)에 대한 추가의 안내는 Bowie, J. U., et al ., " Deciphering the Message in Protein Sequences : Tolerance to Amino Acid Substitutions,"Science 247 : 1306-1310 (1990)에 기재되어 있다.

그러므로, 도 1B, 9B, 9D, 9F, 21B, 또는 22B (서열 번호: 2,4, 6,8, 22-27, 또는 29)의 폴리펩티드 단편, 유도체, 또는 유사체는 (i) 보존되거나 또는 보존되지 않은 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환되고, 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전 암호에 의해 암호화하거나 암호화하지 않는 것, 또는 (ii) 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것, 또는 (iii) 성숙한 폴리펩티드가 예를 들면 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 또 다른 화합물과 융합된 것, 또는 (iv) 부가의 아미노산이 예를 들면 성숙한 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열의 정제에 사용되는 서열 또는 리더 서열 또는 분비성 서열 또는 IgG Fc 융합 영역 펩티드와 같은, 성숙한 폴리펩티드에 융합된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체, 및 유사체는 본 명세서의 교시내용으로부터 당업자의 범주 내에 있다.

기능에 필수적인 본 발명의 IGSF9 또는 LIV-1 단백질은 당 분야에 공지된 방법, 예를 들면 부위 지시 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(alanin-scanning mutagenesis)과 같은 방법을 사용하여 동정될 수 있다(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). 이 후자의 방법은 분자 중의 매 잔기에 하나의 알라닌 돌연변이를 도입하는 방법이다. 이후에 생성된 돌연변이 분자에 대해 생물학적 활성을 테스트한다. 리간드 수용체 결합에 중요한 부위는 구조 분석, 예를 들면 결정화, 핵 자기 공명, 광친화 표지화 기법으로 측정할 수 있다(Smith et al, J MoL Biol 224 : 899-904 (1992) 및 de Vos et al. Science 255: 306-312 (1992)).

본 발명의 폴리펩티드는 단리된 형으로 제공되는 것이 바람직하다. "단리된 폴리펩티드"는 이의 천연 환경으로부터 제거된 폴리펩티드를 말한다. 그러므로 재조합 숙주에서 생성되고/또는 함유된 폴리펩티드는 본 발명의 목적상 단리된 것으로 간주한다. 또한, "단리된 폴리펩티드"는 재조합 숙주 세포로부터 상당하게 또는 부분적으로 정제된 폴리펩티드를 말한다.

당 분야에 공지된 다양한 방법들을 사용하여 본 발명의 단리된 폴리펩티드 중 임의의 하나를 얻을 수 있다. 가장 간단한 레벨에서, 아미노산 서열은 상업적으로 시판되는 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 일차, 이차, 또는 삼차 구조적 특성 및/또는 순응성 특성을 단백질과 공유함으로써 합성에 의해 구축된 단백질 서열은 단백질 활성을 비롯한 단백질에 공통되는 생물학적 특성을 보유할 수도 있다. 이러한 기법은 작은 펩티드 및 커다란 폴리펩티드의 단편을 생산하는 데 특히 유용하게 사용된다. 예를 들면, 단편들은 천연 폴리펩티드에 대해 항체를 생산하는 데 유용하게 사용된다. 그러므로 이들 단편을 생물학적 활성 또는 면역학적 치환체를 치료 화합물을 스크리닝하고 항체를 개발하기 위한 면역학적 공정에서 천연의 정제된 단백질 대신 사용할 수도 있다.

대안으로, 본 발명의 폴리펩티드는 소정의 폴리펩티드를 발현하도록 변경어진 세포로부터 정제될 수 있다. 본 명세서에서, 유전 조작을 통하여 세포가 정상적으로는 생산하지 않는 폴리펩티드 또는 세포가 정상적으로는 낮은 레벨로 생성하는 폴리펩티드를 제조하도록 만들어지는 경우에, 세포는 소정의 폴리펩티드의 발현을 위해 변경될 것이라고 말한다. 당업자는 본 발명의 폴리펩티드 중 하나를 생산하는 세포를 생성하기 위해서 진핵세포 또는 원핵 세포 내로 재조합 서열 또는 합성 서열을 도입한 후 발현하기 위한 방법을 용이하게 적용할 수 있을 것이다. 이러한 것들은, 특히 전술한 플라스미드와 숙주세포를 포함한다. 예를 들면, IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드의 재조합 생성 버젼은 Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988)에 개시된 1단계 방법에 의해 실질적으로 정제될 수 있다.

본 발명의 IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드는 리더를 포함하는 폴리펩티드; 성숙한 폴리펩티드 마이너스 리더(즉, 성숙한 단백질); 도 1B(서열번호: 2)의 약 21 내지 약 718의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드; 도 9F(서열번호: 8)에서의 약 1 내지 약 1179의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드; 도 9F(서열번호: 8)에서의 약 21 내지 약 1179의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드; 서열 번호 4, 6, 22-27에 도시된 서열을 함유하는 폴리펩티드; 도 22B(서열 번호: 29)의 약 28 내지 약 317의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드; 도 22B(서열 번호: 29)의 약 373 내지 약 417의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드; 도 22B(서열 번호: 29)의 약 674 내지 약 678의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드; 도 22B(서열 번호: 29)의 약 742 내지 약 749의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드뿐 아니라 전술한 폴리펩티드와 적어도 80%의 상동성을 갖거나, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 또는 95%의 상동성을 갖거나, 더더욱 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 또한 적어도 30 개의 아미노산 및 더욱 바람직하게는 적어도 50개의 아미노산을 지닌 폴리펩티드의 일부분도 포함한다.

2개의 폴리펩티드에 대한 "유사율(%)"은 Bestfit 프로그램을 사용하여(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) 및 유사도를 측정하기 위한 디폴트값 설정을 이용하여 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교하여 유사한 스코어를 얻는 것을 말한다. Bestfit는 두 서열 간의 유사성을 가진 최적 분체를 발견하기 위해서 Smith 및 Waterman의 로칼 동족체 알고리즘(Advances in Applied Mathematics 2: 482-489,1981)을 사용한다.

IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드의 참고 아미노산 서열에 대해서 적어도, 예를 들면, 95% 상동성의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 이 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열이 참고 서열과 동일하되, 폴리펩티드 서열이 IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티의 참고 아미노산의 100개 아미노산 각각에 대해서 5개까지의 아미노산이 변경된 것을 말한다. 다른 말로 하면, 참고 아미노산 서열에 대해서 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻기 위해서는, 참고 서열의 아미노산 잔기 5%까지가 삭제되거나 또는 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 참고 서열 중의 전체 아미노산 잔기 5%까지의 아미노산 수가 참고 서열 내로 삽입될 수도 있다는 것을 말한다. 참고 서열의 이러한 변경은 참고 아미노산 서열의 카르복시 말단에서 일어나거나 또는 참고 서열 중의 잔기 가운데 개별적으로 산재한 말단 위치 사이의 아무 지점에서 또는 참고 서열 내에서 하나 또는 그 이상의 인접 기중에서 일어날 수 있다.

실제 문제로서, 임의의 특정 폴리펩티드가 예를 들면, 도 1B 및 22B (서열 번호: 2 및 29)에 나타난 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 갖는 특정 폴리펩티드가 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면Bestfit 프로프램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)을 사용하는 통상적인 방식으로 측정될 수 있다. Bestfit 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이, 예를 들어 본 발명에 따른 참고 서열과 95%의 상동성을 갖는지를 측정하려고 할 때, 물론 상동율(%)은 참고 아미노산 서열의 전 길이에 대해서 계산하고 참고 서열 중의 아미노산 잔기의 전체 수의 5%까지의 상동성의 차이가 허용되도록 파라미터를 설정해놓는다.

본 발명의 폴리펩티드는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 SDS-PAGE 겔 상의 분자량 마커 또는 분자체(molecular sieve) 겔 투과 칼럼 상의 분자량 마커로서 유용하게 사용된다.

폴리펩티드에 결합하는 분자를 동정하기 위해 정제된 폴리펩티드를 사용하여 당 분야에 공지된 실험관 내 결합 분석을 수행할 수 있다. 이들 분자들은, 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면 소 분자, 조합성 라이브러리로부터 얻은 분자, 항체 또는 다른 단백질을 포함한다.

또한, 본 발명의 펩티드 또는 펩티드에 결합할 수 있는 분자는 독소, 예를 들면 라이신 또는 콜레라 또는 세포에 독성인 기타 화합물과 같은 것과 복합체화 할 수 있다. 도 1B, 9B, 9D, 9F, 21B, 또는 22B (서열 번호: 2, 4, 6, 8, 22-27, 또는 29)의 폴리펩티드에 대한 결합 분자의 특이성에 따라 독소-결합 분자 복합체를 종양 또는 기타 세포로 표적 한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 생성하는데 사용할 수 있으며, 이는 후술하는 바와 같이 IGSF9 또는 LIV-1 단백질 발현을 검출하기 위한 진단 분석에 유용하게 사용되거나 또는 IGSF9 또는 LIV-1 단백질 기능을 증진 또는 억제하는 작동제 및 길항제로서 유용하게 사용된다. 또한, 이러한 폴리펩티드를 효모 2-하이브리드 시스템에 사용하여 본 발명에 따른 작동제 후보 대상과 길항제 후보대상인 IGSF9 또는 LIV-1 단백질 결합 단백질을 "포획(capture)" 한다. 효모 2 하이브리드 시스템은 Fields and Song, Nature 340: 245-246 (1989)에 기재되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드.

본 발명은 전술한 IGSF9 또는 LIV-1의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 함유의 단리된 핵산 분자를 제공한다.

특별히 지시하지 않는 한, 본 명세서에 기재한 각 "뉴클레오티드 서열"은 디옥시리보뉴클레오티드의 서열로서 제시된다(약어 A, G, C 및 T). 하지만, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 "뉴클레오티드 서열"이란 폴리뉴클레오티드의 DNA 경우에는 디옥시리보뉴클레오티드 서열이고, RNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 경우에는 특정된 디옥시뉴클레오티드 서열(T)이 리보뉴클레오티드 우리딘(U)으로 치환된 경우에 대응되는 리보뉴클레오티드 서열(A, G, C 및 U)을 뜻한다. 예를 들면, 디옥시뉴클레오티드 약어를 사용하는 서열 번호: 1의 서열을 가진 RNA 분자에 대한 참고란 서열번호: 1의 각 디옥시뉴클레오티드 A, G 또는 C 가 상응하는 리보뉴클레오티드 A, G, 또는 C로 치환되고, 각 디옥시뉴클레오티드 T가 리보뉴클레오티드 U로 치환된 서열을 갖는 RNA 분자를 말한다.

본 명세서에 제공된 정보를 사용하여, 예를 들면, 도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, 및 22A에 제시된 뉴클레오티드 서열을 사용하면, 표준 클로닝 및 스크리닝 절차, 예를 들면 출발물질로서 mRNA를 사용하여 cDNA를 클로닝시키는 절차 등에 의해 IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자가 얻어질 수도 있다. 전술한 바와 같이, 그리고 당 업계에 잘 알려진 바와 같이, 단리된 핵산은 또한 벡터 중에서 클론화하여 증식할 수도 있다.

도 1A에서 IGSF9의 측정된 뉴클레오티드 서열은 도 1A-1B (서열 번호: 1-2)에 제시된 뉴클레오티드 서열 위치 1의 개시 코돈을 지닌 약 1163개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질 및 약 20개의 아미노산 잔기의 추정 리더 서열을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 추정된 IGSF9 단백질의 아미노산 서열은, 도 1B에 제시된 바와 같이, 약 아미노산 21 내지 약 아미노산 718로 이루어진 세포 외 도메인을 함유한다.

도 8A에서 LIV-1의 추정된 뉴클레오티드 서열은 도 22A 내지 22B(서열 번호: 28-29)에 제시된 뉴클레오티드 서열 위치 1의 개시 코돈을 지닌 약 749개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질 및 약 27개의 아미노산 잔기의 추정 리더 서열을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 추정된 LIV-1 단백질의 아미노산 서열은, 도 22B에 제시된 바와 같이, 추가로 약 아미노산 28 내지 약 아미노산 317, 약 아미노산 373 내지 약 아미노산 417, 약 아미노산 674 내지 약 아미노산 678, 약 아미노산 742 내지 약 아미노산 749로 이루어진 세포 외 도메인을 함유한다.

지적한 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는, 예를 들면 클로닝에 의해 얻거나 또는 합성적으로 생성된 cDNA 및 게놈 DNA를 비롯한 DNA의 형태, 또는 mRNA과 같은 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있다. 일본쇄 DNA 또는 RNA는 센스 쇄(sense strand)의 의미로 알려진 암호 쇄일 수도 있거나 또는 안티센스 쇄로 간주되는 비-암호 쇄일 수도 있다.

"단리된" 핵산 분자(들)는 핵산 분자, DNA, 또는 RNA 분자로서 자연 환경으로부터 분리된 것이다. 예를 들면, 벡터 중에 함유된 재조합 DNA 분자는 본 발명이 목적을 위해서 단리된 것으로 간주한다. 또한, 단리된 DNA 분자의 예로는 이종 숙주세포 중에서 유지되거나 또는 용액 중에서 정제된(부분적으로 또는 상당하게) DNA 분자를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 DNA 분자의 생체 내 또는 시험관 내 RNA 전사물을 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 합성에 의해 생성된 이러한 분자를 더 포함한다.

본 발명의 단리된 핵산분자는 도 1A 및 22A (서열 번호: 1 및 28)에 도시된 뉴클레오티드 서열의 위치 1에 있는 개시 코돈을 지닌 오픈 리딩 프레임(OR)을 포함하는 DNA 분자; 도 1A 및 22A (서열 번호: 1 및 28)에 도시된 성숙한 IGSF9 및 LIV-1 단백질의 암호 서열을 함유한 DNA 분자; 도 9A, 9C, 9E, 9H 및 21A (서열번호: 3, 5, 7 및 12-21)에 도시된 암호 서열을 함유한 DNA 분자; 상술한 것과는 실질적으로 다른 서열이지만 유전 암호의 축퇴성(degeneracy) 때문에 여전히 IGSF9 또는 LIV-1 단백질을 암호하는 DNA 분자를 포함한다. 물론, 유전 암호는 당 분야에 잘 알려져 있다. 그러므로 당업자에게는 전술한 축퇴성의 변형체를 생산한다는 것은 통상적인 일일 것이다.

본 발명은 나아가 본 명세서에 기술된 단리된 핵산의 단편에 관한 것이다. 도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, 또는 22A (서열 번호: 1, 3, 5, 7, 12-21, 또는 28)에 도시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열을 지닌 단리된 핵산 분자의 단편이란 적어도 길이가 약 15개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 길이가 약 20개의 뉴클레오티드, 더더욱 바람직하게는 적어도 길이가 약 30개의 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게는 길이가 적어도 약 40개인 뉴클레오티드를 가리키는데, 이들은 본 명세서에서 진단 프로브 및 프라이머로서 유용하다. 물론, 이보다 길이가 더 긴 단편 50-500개의 뉴클레오티드도 유용하며, 도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, 또는 22A (서열 번호: 1, 3, 5, 7, 12-21, 또는 28)에 도시된 뉴클레오티드 서열 대부분(전부가 아니라면)에 상응하는 단편도 그러하다. 예를 들면, 길이가 적어도 20개의 뉴클레오티드인 단편은 도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H,21A, 또는 22A (서열 번호: 1, 3, 5, 7, 12-21,또는 28)에 도시된 뉴클레오티드 서열로부터 20개 또는 그 이상의 인접한 염기를 포함하는 단편을 뜻한다. 본 발명의 바람직한 핵산 단편은 IGSF9 또는 LIV-1 단백질의 에피토프를 지닌 부위를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 단리된 분자, 특히 DNA 분자는 염색체와의 동일계 하이브리드화에 의한 유전자 지도 작성의 프로브 및 예를 들면, 노던 블럿 분석에 의해 인간 조직 중에서 IGSF9 또는 LIV-1 유전자의 발현을 검출하기 위한 프로브로서 유용하게 사용된다. 후술 되는 바와 같이, 어떤 조직 또는 체액 중에서 변경된 IGSF9 또는 LIV-1 유전자 발현을 검출하는 것은 어떤 신생물 질환이 있다는 것을 의미한다.

또 다른 측면에서, 전술한 본 발명의 핵산 분자 중에서 엄중한(stringent) 하이브리드화 조건하에서 폴리뉴클레오티드 일부와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 여기서 "엄중한 하이브리드화 조건"이란 용액 중에서 42℃에 밤새도록 배양하고, 이후에 약 65℃에서 0.1 X SSC 에서 여과기를 세척하는 것을 말하는 것으로, 여기서 용액은 50% 포름아미드, 5X SSC (750 mMNaCl, 75 mM 트리나트륨 시트레이트), 50mM 나트륨 포스페이트(pH 7.6), 5X 덴하르트(Denhardt's) 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20㎕/ml의 변성되고 절단된 연어 정자 DNA를 함유한다. 폴리뉴클레오티드의 "일부"에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 참고 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 15개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 20 개의 뉴클레오티드, 더더욱 바람직하게는 적어도 30개의 뉴클레오티드, 매우 더 바람직하게는 약 30-70 개의 뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 말한다. 이들은 전술한바 및 자세히 후술 되는 바와 같이 진단 프로브와 프라이머로서 유용하게 사용된다.

물론, 참고 폴리뉴클레오티드의 보다 큰 부위, 예를 들면 길이 50-750 개의 뉴클레오티드 또는 심지어 참고 폴리뉴클레오티드의 전체 길이(=전장)에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 프로브로서 유용하게 사용되며, 이는 도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, 또는 22A (서열번호: 1, 3, 5, 7, 12-21, 또는 28)에 도시된 뉴클레오티드 대부분(전부가 아니라면)에 상응하는 폴리뉴클레오티드의 경우에도 그러하다. "길이가 적어도 20개의 뉴클레오티드인" 폴리뉴클레오티드의 일부란, 예를 들면 참고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열로부터 20개 또는 그 이상 인접한 뉴클레오티드를 의미한다. 지적한 바와 같이, 이러한 부분들은 진단적으로 통상의 DNA 하이브리드화 기술에 따른 프로브 또는 예를 들면 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, edited by Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, T. , (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기재한 바와 같이 중합효소 사슬 반응(PCR)에 의해 표적 서열의 증폭과정을 위한 프라이머로서 유용하게 사용된다. 상기 문헌들은 전체가 본 발명에 참고로 인용된 것이다.

도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, 또는 22A (서열번호: 1, 3, 5, 7, 12-21, 또는 28)에 IGSF9 및 LIV-1 뉴클레오티드 서열이 제공되어 있기 때문에, IGSF9 또는 LIV-1일부에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 생성하는 것은 당업자에게는 통상적인 일일 것이다. 예를 들면, IGSF9 또는 LIV-1 분자의 초음파 처리에 의한 제한 엔도뉴클레아제의 분해 또는 제한 전단을 용이하게 수행하여 전장 길이의 IGSF9 또는 LIV-1 분자 일부에 하이브리드화 하는 폴리뉴클레오티드의 다양한 크기를 가진 DNA 부분들을 생성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 하이브리드화 폴리뉴클레오티드는 공지된 기술에 따라 합성으로 생성할 수 있을 것이다. 물론, 폴리 A 서열(예를 들면, IGSF9 또는 LIV-1 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 폴리 (A) 트랙)에만 , 또는 T (또는 U) 잔기의 상보성 스트레치에만 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산 일부에 하이브리드화하는데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 포함되지 않을 것인데, 이는 이러한 폴리뉴클레오티드가 폴리 (A) 스트레치 또는 이의 보체를 함유하는 임의의 핵산 분자에 하이브리드화할 것이기 때문이다.

지적한 바와 같이, IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는, 성숙한 폴리펩티드 그 자체의 아미노산을 암호화하는 것; 성숙한 폴리펩티드의 암호 서열과 부가의 서열, 예를 들면 pre- 또는 pro- 또는 prepro-단백질 서열과 같은 약 20 개의 아미노산 리더 또는 분비성 서열을 암호화하는 것들; 전술한 부가의 암호 서열을 가질 수도 안 가질 수도 있는, 전사, mRNA 가공(스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그날), 예를 들면 리보솜 결합 및 mRNA의 안정성에 역할을 담당하는 전사된 비-번역 서열과 같은 비-암호 5' 및 3' 서열과 인트론을 비롯한 부가의 비암호서열을 함께 가지는 성숙한 폴리펩티드의 암호 서열; 부가의 작용기를 제공하는 것과 같은, 부가의 아미노산을 암호하는 부가의 암호 서열을 포함할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러므로 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 마커 서열, 예를 들면 융합된 폴리펩티드의 정제를 수월하게 돕는 펩티드 암호화 서열에 융합할 수도 있다. 본 발명의 어떤 바람직한 구체예에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예를 들면 무엇보다도 pGE 벡터(Qiagen, Inc. ) 중에 제공된 태그(tag)와 같은데, 이들 중 많은 것들이 상업적으로 시판되고 있다. Gentz 등. Proc . Natl . Acad . Sci ., USA 86: 821-824 (1989)에 개시된 바와 같이, 예를 들면 헥사-히스티딘은 융합 단백질 정제가 편리하게 수행하게 한다. "HA" 태그는 인플루엔자 수행하게 단백질로부터 유래한 에피토프에 상응하는 정제에 유용하게 사용되는 다른 펩티드인데, 이는 Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)에 개시되어 있다. 기타 이러한 융합 단백질은 아미노-또는 카르복시 말단에서 IgG Fc에 융합된 IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 추가로 IGSF9 또는 LIV-1 단백질의 일부, 유사체 또는 유도체를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자 변형체에 관한 것이다. 변형체는 천연 대립 형질을 갖는 변형체와 같이 자연적으로 일어날 수 있다. "대립 형질을 갖는 변형체"란 유기체의 염색체상의 주어진 궤적(locus)을 차지하는 유전자의 여러 교호적인 형태중 하나를 의미한다. Gene II, Lewin, ed. 비-자연산 변형체는 당분야에 공지된 돌연변이 기법을 사용하여 생성될 수있다.

이러한 변형체는 뉴클레오티드 치환, 결손, 또는 부가에 의해 생성된 것들들 포함한다. 치환체, 삭제물, 또는 부가물은 1종 이상의 뉴크레오티드를 포함할 수도 있다. 변형체는 암호 영역 또는 비 암호 영역 또는 이 둘에서 변경될 수도 있다. 암호 영역에서의 변경은 보전 또는 비-보전 아미노산 치환, 결손 또는 부가물을 나타낼 수도 있다. 이들 가운데 특히 바람직한 것은 IGSF9 또는 LIV-1 단백질 또는 이의 일부의 특성과 활성을 변화시키지 않는 침묵성(silent) 치환, 부가 또는 결손물이다. 이러한 관점에서 보전 치환체가 특히 바람직하다. 가장 바람직한 것은 도 1A, 9A, 9C, 9E, 및 22A (서열 번호: 1, 3, 5, 7, 및 28)에 도시된 아미노산 서열을 가진 성숙한 IGSF9 또는 LIV-1을 암호화하는 핵산 분자이다.

본 발명의 추가 구체예는 (a) 도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, 또는 22A (서열번호: 1, 3, 5, 7, 12-21, 또는 28)에 도시된 서열을 지닌 IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (b) 도 1B(서열번호: 2)에 도시된 약 1 내지 약 718 위치, 도 22B(서열번호: 29)에서의 약 28 내지 약 317의 위치, 도 22B(서열번호: 29) 에서의 약 373 내지 약 417 위치, 도 22B(서열번호: 29) 에서의 약 674 내지 약 678 위치, 또는 도 22B(서열번호: 29) 에서의 약 742 내지 약 749 위치에 있는 아미노산을 가진 성숙한 IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 중 임의의 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 지닌 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.

IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드를 암호화하는 참고 뉴클레오티드 서열에 적어도, 예를 들면 95%가 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란 IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드를 암호화하는 참고 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드 당 5개까지의 점 돌연변이가 포함될 수도 있는 것을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 참고 서열이 동일한 것을 말한다. 다른 말로 하면, 참고 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서, 참고 서열에서 뉴클레오티드가 5%까지가 삭제되거나 또는 다른 뉴클레오티드로 치환되거나, 또는 참고 서열에서 전체 뉴클레오티드 중 5%까지에 해당하는 뉴클레오티드 수를 참고 서열에 삽입할 수도 있다. 참고 서열의 이러한 돌연변이체는 참고 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 또는 참고 서열 내의 1 이상의 인접 기 내에서 산재한 또는 참고 서열의 뉴클레오티드 가운데서 개별적으로 산재한 말단 위치 사이의 어떤 지점에서도 일어날 수 있다.

실제 문제로서, 임의의 특정 핵산 분자가 예를 들면, 도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, 또는 22A (서열 번호: 1, 3, 5, 7, 12-21, 또는 28)에 나타난 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 갖는지 여부는 일반적으로 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 Bestfit 프로프램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)을 사용하여 통상적인 방식으로 측정될 수 있다. Bestfit는 Smith 및 Waterman의 로칼 상동성 알고리즘(Advances in Applied Mathematics 2: 482-489, 1981)을 사용하여 두 서열 간의 상동성을 가장 많이 지닌 분체를 발견한다. Bestfit 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 예를 들어 본 발명에 따른 참고 서열과 95% 상동한지를 측정하려고 하는 경우에, 물론, 상동률(%)은 참고 뉴클레오티드 서열의 전장에 대해서 계산되고 참고 뉴클레오티드 서열 중의 뉴클레오티드 잔기가 전체 수의 5%까지 상동성의 차이를 허용하도록 파라미터를 설정한다.

물론, 유전 암호의 축퇴성때문에, 당업자라면 도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, 또는 22A (서열 번호: 1, 3, 5, 7, 12-21, 또는 28)에 도시된 핵산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 다수의 핵산 분자가 IGSF9 또는 LIV-1 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호할 것임을 즉시 알 수 있을 것이다. 사실상, 이들 뉴클레오티드 서열의 축퇴성 변형체 모두가 동일한 폴리펩티드를 암호화하기 때문에, 이는 전술된 비교 분석을 수행하지 않고서도 당업자는 명백히 알 수 있을 것이다. 또한, 축퇴성의 변형체가 아닌 이러한 핵산 분자의 경우, 합리적인 수가 IGSF9 또는 LIV-1 단백질 활성을 지닌 폴리펩티드를 암호화할 것이라는 것을 당 업계는 인식할 것이다. 이는 당업자가 단백질 기능에 상당히 효과를 작게 미치거나 미치지 못할 것 같은 아미노산 치환체를 완벽하게 알고 있기 때문이다(예, 제2 지방족 아미노산으로 제1 지방족 아미노산을 대체).

예를 들면, 표현형이 드러나지 않는 아미노산 치환체를 어떻게 제조하는 지에 관한 안내는 Bowie, J. U. , et al, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990)에 제공되어 있는데, 여기서, 저자들은 아미노산 서열이 변화되는 것에 대한 내성을 연구하는데 있어서 두 가지 주된 접근법이 있다고 언급한다. 그 첫 번째 방법은 진화의 과정에 따른 것으로서, 변이가 자연적인 선택에 의해 선택 또는 거절되는 것을 말한다. 그 두 번째 접근 방법은 유전 공학을 사용하여 클론된 유전자 및 선택 유전자의 특이 위치에서 아미노산 변화 및 선택을 도입하거나 또는 스크린 하여 작용성을 유지하는 서열을 동정하는 방법이다. 저자들이 언급한 바와 같이, 이러한 연구는 단백질이 아미노산 치환체의 놀라운 내성체임을 밝혔다. 저자들은 또한 아미노산의 변화는 단백질의 특정위치에서 허용될 확률이 높다고 지적한다. 예를 들면, 대부분의 매장된 아미노산 서열 잔기는 비극성 측쇄를 필요로 하는 반면, 표면 사슬의 몇몇 특징은 일반적으로 보전된다. 다른 이러한 표현형이 없는 치환체에 대해서는 상술한 Bowie, J. U. , et al. 에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본원에 참고로 인용되었다.

본 발명의 암 진단 및 치료법

본 발명의 폴리펩티드는 암 세포 생성, 증식 또는 전이와 연관이 있을 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 존재 또는 이들 양의 검출은 한가지 이상의 유형의 암을 진단 및/또는 예측하는데 유용할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드의 존재 또는 증가한 발현은 암의 유전 특성, 전암 상태, 또는 진행중인 악성 종양상태를 나타낼 수 있다. 이와는 반대로, 유전자의 결함 또는 폴리펩티드의 부재가 암 상태와 관련되어 있을 수 있다. 암과 관련 있는 단일 뉴클레오티드 다형성 확인 또는 암에 걸리기 쉬운 경향 등도 진단 또는 예후 예측에 유용한 것일 수도 있다.

암치료는 종양 세포의 증식을 억제하고, 혈관 생성(종양 성장을 지지하는 데 필요한 새로운 혈관의 생성)을 억제 및/또는 종양 세포 이동 또는 침입을 감소시켜 전이를 억제함으로써 종양의 퇴화를 촉진한다. 본 발명의 치료 조성물은 고형 상 종양/악성 종양, 소세포암 및 비-소세포암을 비롯한 폐암, 소세포 암종 및 관형 암을 비롯한 유방암, 식도암, 위암, 직장암, 위장암, 및 직장 결장 종양과 관련된 폴립, 방광암과 전립선암을 비롯한 비뇨기과 암들 및 난소암종, 뇨암(자궁내막을 포함), 및 난소 소낭에서의 고형암을 비롯한 여성의 생식기 관의 악성 종양을 포함하는 성인 및 소아 암에 효과적일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체(또는 이의 항체 결합 단편) 또는 폴리펩티드 조절제(본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성의 자극제 및 억제제를 포함함)는 암을 치료하는데 투여될 수도 있다. 치료 조성물은 치료적 유효량을 단독으로 투여하거나 또는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 온열치료 요법 및 레이저 요법과 같은 어쥬반트 암 요법과 병행하여 투여될 수 있으며, 반드시 암을 박멸하지는 못하지만, 종양의 크기를 줄이고, 종양 증식의 속도를 늦추며, 전이를 억제하고 또는 전체적인 임상 상태를 개선하는 것과 같은 유익한 효과를 제공할 수 있다.

조성물은 또한 항암 칵테일의 일부로서 치료적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 항암 칵테일은 전달을 위한 약학적 담체 이외에도 본 발명의 조절제 또는 폴리펩티드와 1종 이상의 항암 약물과의 혼합물이다. 암 치료제로서 항암 칵테일을 사용하는 것은 보편적인 일이다. 당 분야에 잘 알려져 있고 본 발명의 폴리펩티드 또는 조절제와 조합하여 치료제로서 사용될 수 있는 항암 약물은 다음을 포함한다: 악티노마이신 D(Actinomycin D), 아미노글루테티미드(Aminoglutethimide), 아스파라기나제(Asparaginase), 블레오마이신(Bleomycin), 부설판(Busulfan), 카르보플라틴(Carboplatin), 카르무스틴(Carmustine), 클로르암부실(Chlorambucil), 시스플라틴(Cisplatin, cis-DDP), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 시스타라빈HCl(Cytarabine HC1, 시토신 아라비노시드), 다카바진(Dacarbazine), 닥티노마이신(Dactinomycin), 다우노루비신(Daunorubicin) HC1, 독소루비신(Doxorubicin) HC1, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨(Estramustine phosphate sodium), 에톱시드(V16-213), 플록수리딘(Floxuridine), 5-플루오우라실(5-Fluorouracil (5-Fu), 플루타미드(Flutamide), 히드록시우레아(Hydroxyurea, hydroxycarbamide), 이포스파미드(Ifosfamide), 인터페론 알파 2-a(Interferon alpha-2a), 인터페론 알파 2b(Interferon Alpha-2b), 루프로라이드 아세테이트(Leuprolide acetate, LHRH-방출 인자 유사체), 로무스틴(L omustine), 메클로로에타민 HCL(Mechlorethamine HC1, 질소 머스타드), 메타팔란(Melphalan), 머캅토푸린(Mercaptopurine), 메스나(Mesna), 메토트렉세이트(Methotrexate, MTX), 미토마이신(Mitomycin), 미코크산트론 HCL(Mitoxantrone HC1), 옥트레오티드(Octreotide), 플리카마이신(Plicamycin), 프로카르바진 HCL(Procarbazine HC1) 스트렙토조신(streptozocin), 타목시펜 시트레이트(Tamoxifen citrate), 티오구아닌(Thioguanine), 티오테파(Thiotepa), 빈블라스틴 설페이트(Vinblastine sulfate), 빈크리스틴 설페니이트(Vincristine sulfate), 암사크린(Amsacrine), 아자시티딘(Azacitidine), 헥사메틸멜라민(Hexamethylmelamine), 인터루킨-2 (Interleukin-2), 미토구아존(Mitoguazone), 펜토스타틴(Pentostatin), 세무스틴(Semustine), 테니포시드(Teniposide), 및 빈데신 설페이트(Vindesine sulfate).

또한, 본 발명의 치료 조성물은 암을 예방치료하는 데 사용될 수도 있다. 개체에서 암의 진행이 쉽게 일어나는 지를 예측하는 당 분야에 알려진 것으로는 유전 조건 및/또는 환경 상황(예, 발암원에 노출되는 경우)이 있다. 이러한 환경하에서는, 이들 개체를 본 발명의 치료적 유효량의 폴리펩티드로 치료하여 암의 진행 위험을 줄이는 것이 유리할 수도 있다

시험관 모델을 사용하여 가능한 암 치료제로서 사용되는 본 발명의 폴리펩티드의 유효량을 측정할 수 있다. 이들 시험관 모델은 배양된 종양 세포의 증식분석, 연성 아가에게서 배양된 종양 세포의 성장(참조 Freshney, (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wily-Liss, New York, NY Chl8 and Ch21), 누드 마우스에서의 종양 시스템(Giovanella et al., J. Natl. Can inst. 52 : 921-30 (1974)에 기술됨), Pilkington et al., Anticancer Res. 17 : 4107-9 (1997)에 기재된 바와 같은 보이덴 챔버(Boyden Chamber) 분석을 통한 종양 세포의 이동 및 침입 가능성, 그리고 Ribatta et al., Intl . J : Dev. Biol . 40: 1189-97 (1999) 및 Li et al., Clin . Exp . Metastasis 17:423-9 (1999)에 각기 기재된 바와 같은 혈관 내피세포 이동의 유도 또는 치크 코리오알란토익 멤브레인(chick chorioallantoic membrane)의 혈관화 유도와 같은 혈관신생 분석을 포함한다. 적합한 종양 세포주는 미국 조직 배양 수집소 카탈로그로부터 입수가능하다.

하지만, 전술한 바와 같이, 본 발명의 선택 구체예는 변형된 항체를 암환자에게 투여하거나 또는 방사선 치료 요법 또는 화학 치료 요법과 같은 하나 이상의 부수적인 치료 요법을 조합 또는 병행하여 이 변형된 항체를 투여하는 것(즉, 조합 치료 투약법)을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 보조 치료 요법 수단과 조합하여 또는 이와 병행하여 변형된 항체를 투여하는 것은 치료 요법과 개시된 항체를 순차적으로(sequential), 동시에(simultaneous), 동일한 시간에 걸쳐(coextensive), 수반하여(concurrent), 부수하여(concomitant), 또는 동시적으로(contemporaneous) 투여 또는 적용하는 것을 포함한다. 당업자라면 조합 치료 투약법의 여러 성분을 투여 또는 적용하는 것을 시간을 정해서 하면 치료의 전체적인 효율도를 증진시킬 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들면, 화학치료제를 잘 알려진 표준 치료 코스를 통해서 투여한 후 수주 내에 본 발명의 방사 면역 콘쥬게이트를 투여하는 것이다. 이와는 반대로, 변형된 항체와 병행되는 세포독소는 정맥 내로 투여한 후 종양 편재화 외부 비임 방사선 요법을 적용할 수 있다. 다른 구체예에서, 변형된 항체를 1회의 공식적인 방문을 통해 1종 이상의 선택된 화학 치료제와 수반하여 투여될 수도 있다. 당업자(예, 숙련된 종양학자)는 선택된 부가의 치료 요법 및 본 발명의 교시 내용을 통해서 부당한 실험 없이 효과적인 조합 치료 투약법을 쉽게 알 수 있을 것이다.

이러한 점에서, 변형된 항체(세포독소 유무 하에)와 화학 치료제의 조합 치료요법은 환자에게 치료적인 유익을 제공하는 임의의 시간표의 범주 내에서 임의 순서대로 투여될 수도 있다. 즉, 화학치료제 및 변형된 항체는 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수도 있다. 선택된 구체예에서, 본 발명의 변형된 항체는 이전에 화학치료 요법을 받은 환자에게 투여될 것이다. 다른 구체예에서, 변형된 항체 및 화학 치료제는 실질적으로 동시에 또는 부수하여 투여될 수 있을 것이다. 예들 들면, 환자는 화학 치료를 받으면서도 변형된 항체를 투여받을 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 변형된 항체는 임의의 화학치료제 또는 치료법을 수행한 지 1년 이내에 사용할 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 변형된 항체는 임의의 화학 치료제 또는 치료법을 수행한 지 10, 8, 6, 4, 또는 2개월 이내에 투여한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 변형된 항체는 임의의 화학치료제 또는 치료법을 수행한 지 4, 3, 2 또는 1주 내에 투여될 것이다. 다른 구체예에서, 변형된 항체는 임의의 화학치료제 또는 치료법을 수행한 지 5, 4, 3, 2 또는 1일 내에 투여될 것이다. 환자에게 두 가지 치료제 또는 치료법을 시간 또는 분의 기준으로 투여할 수도 있다(실질적으로 동시에)는 것도 알 수 있을 것이다.

이러한 점에서, 본 발명의 변형된 항체는 생체 내에서 신생물 세포의 성장을 제거, 감소, 억제 또는 통제하는 임의의 화학 치료제 또는 제제 또는 투약법(예, 치료 투약법을 조합)와 함께 또는 조합하여 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이러한 제제는 종종 붉은 골수가 보존되는 것을 감소시킨다. 이러한 감소는 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 화합물의 감소한 골수독성(myelocytoxicity)에 의하여 상쇄되어 이러한 환자에게서 신생물 질환 치료를 적극적으로 하게 하는 잇점이 있을 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 본원에 개시된 방사표지 된 면역 콘쥬게이트는 방사성 핵종에 대한 신생물 세포의 감수성을 향상시키는 방사선 감수제와 함께 효과적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 방사선 감수성 화합물은 방사 표지된 변형된 항체가 혈류로부터 대부분 청소된 후에도 투여되어 종양(들) 부위에서 치료효과가 그대로 유지될 수도 있다.

본 발명의 측면들과 관련하여, 본 발명과 상용성인 치료제의 예로는 다음과 같다: 알킬화제, 빈카 알카로이드류(예, 빈크리스틴 및 빈블라스틴), 프로카르바진, 메톡트렉세이트 및 프레드니손. 4가지의 약물 조합물인 MOPP (메클레타민 (mechlethamine)(질소 머스터드), 빈크리스틴(온코빈, Oncovin), 프로카르바진(procarbazine) 및 프레드니손(prednisone)은 림프종의 다양한 유형을 치료하는 데 매우 효과적이며, 본 발명의 바람직한 구체예를 포함한다. MOPP-내성 환자의 경우, ABVD (예, 아드리아마이신(adriamycin), 블레오마이신(bleomycin), 빈블라스틴(vinblastine) 및 다카르바진(dacarbazine), ChlVPP (클로로암부실(chlorambucil), 빈블라스틴(vinblastine), 프로카르바진(procarbazine) 및 프레드니손(prednisone)), CABS (로무스틴(lomustine), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin) 및 스트렙토조토신(streptozotocin)), MOPP 플러스 ABVD, MOPP 플러스 ABV(독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin) 및 빈블라스틴( vinblastine)) 또는 BCVPP(카르무스틴(carmustine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 빈블라스틴(vinblastine), 프로카르바진(procarbazine) 및 프레드니손(prednisone)) 조합물을 사용할 수있다. Arnold S. Freedman and Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et al., eds. ,13th ed. 1994) 및 V. T. DeVita et al., (1997) 및 이들에 인용된 참고 문헌들은 표준 투여량 및 투약 스케쥴에 대해서 설명한다. 이들 치료 요법은 특정 환자에 따라 변화시키지 않고 또는 필요에 따라 변경하되 본명세서에 개시된 1종 이상의 변형된 항체를 조합하여 사용된다.

본 발명의 문맥상 유용하게 사용되는 부가적인 투약법은 단일의 알킬화제를 사용하는 것을 포함하는데, 이러한 알킬화제로는 예를 들면 시클로포스파미드 또는 클로람부실(chlorambucil) 또는 이의 조합물, 예를 들면 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손(cyclophosphamide, vincristine and prednisone), CHOP (CVP 및 독소루비신), C-MOPP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진), CAP-BOP (CHOP 플러스 프로카바진 및 블레오마이신), m-BACOD (CHOP 플러스 메토트렉세이트, 블레오마이신 및 루코보린), ProMACE-MOPP (프레드니손, 메토트렉세이트, 독소부비신, 시클로포스파미드, 에톱시드 및 류코보린 플러스 표준 MOPP), ProMACE-CytaBOM (프레드니손, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에톱시드, 시타라빈, 블레오마이신, 빈크리스틴, 메토트렉세이트 및 류코보린) 및 MACOP-B (메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 고용량의 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린)을 들 수있다. 당업자는 이들 각 투약법에 따른 표준 복용량 및 복용 시간을 용이하게 결정할 수있을 것이다. CHOP는 블레오마이신, 메토트렉세이트, 프로카바진, 질소 머스타드, 시토신 아라비노시드 및 에톱시드와 조합하여 사용할 수있다. 다른 혼화성의 화학치료제는, 제한하는 것은 아니지만, 2-클로로데옥시아데노신 (2-CDA), 2'-데옥시코포르마이신 및 플루다라빈(fludarabine)을 들 수있다.

본 발명의 변형된 항체와 조합되어 사용되는 화학 치료제의 양은 검체에 따라 변화되거나 또는 종래 기술에 공지된 바에 따라 투여될 수 있다. 참조, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al eds., 9th ed 1996).

전술한 바와 같이, 본 발명의 변형된 항체, 이의 면역반응성 단편 또는 이의 재조합체는 포유 동물의 악성 종양을 생체 내에서 치료하기에 적합한 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이러한 점에서, 개시된 항체를 조성하여 활성제의 투여를 용이하게 하고 또 이의 안정성을 촉진한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적 허용의 비독성 멸균 담체, 예를 들면 약리학적 식염수, 비-독성 버퍼, 방부제 및 기타 등과 같은 것을 함유하는 것이 바람직하다. 이 방법의 목적상, 치료제와 콘쥬게이트 되거나 되지 않은 변형된 항체, 이의 면역반응성 단편, 또는 이의 재조합체의 약학적 유효량은 신생물 세포 상에 선택된 면역 반응성 항원과 효과적으로 결합하여 이러한 세포의 사멸을 증가시키기에 충분한 양을 말한다. 물론, 본 발명의 약학적 조성물은 변형된 항체의 약학적 유효량을 제공하도록 1회 또는 다수 회 용량으로 투여될 수 있다.

더욱 구체적으로, 개시된 항체와 방법은 종양의 크기를 감소시키며, 종양 성장을 억제하고/하거나 종양을 지닌 동물의 생존 시간을 지연하는데 유용한 것이어야 한다. 따라서, 본 발명은 인간 또는 다른 동물에게 유효한 비-독성량의 변형된 항체를 투여함으로써 이러한 인간 또는 다른 동물에서의 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당업자는 일상적인 실험에 의해 변형된 항체의 어떤 비독성의 유효량이 악성 종양을 치료할 목적에 부합되는 지를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 변형된 항체의 치료적 활성량은 질환의 상태(예, 단계 I 대 단계 IV), 년령, 성, 의료 조성물(예, 면역억제 조건 또는 질환) 및 검체의 체중, 그리고 검체에서 소정의 반응을 끌어낼 수 있는 항체의 역량 등의 요인에 따라 변화할 수도 있다. 용량 투약법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수도 있다. 예를 들면, 몇몇 분할 용량으로 매일 투여하거나 또는 치료 상황의 급박성에 따라 지시된 바와 같이 용량의 비율을 감소시킬 수 있다. 하지만, 일반적으로는, 유효량은 약 0.05 내지 100 mg/kg(체중)/일이며, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 10 mg/kg(체중)/일이다.

본 명세서 개시사항의 범주에 부합하고자, 본 발명의 변형된 항체를 치료 또는 예방 효과가 나타나기에 충분한 양으로 전술한 치료법에 따라 인간 또는 기타 동물에게 투여할 있다. 본 발명의 항체는 공지된 기술에 따라 통상의 약학적 허용 담체 또는 희석제를 본 발명의 항체와 조합하여 제조한 통상의 투여 제형으로 상기 인간 또는 다른 동물에게 투여할 수도 있다. 당업자라면 약학적 허용 담체 또는 희석제의 형태와 특성이, 조합할 활성 성분의 양, 투여 경로 및 기타 잘 알려진 가변 인자에 따른다는 것을 잘 숙지하고 있을 것이다. 또한, 당업자라면 본 발명에 따른 모노클로날 항체 1종 이상을 함유한 칵테일이 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있음도 숙지할 것이다.

항체, 이의 면역반응성 단편 또는 이의 제조합체 및 치료제의 콘쥬게이트를 제조 및 투여하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있거나 당업자가 잘 결정할 수있을 것이다. 본 발명의 항체(또는 이의 단편)의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입 또는 국소경로일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "비경구"란 용어는 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 직장 내 또는 질 내 투여를 의미한다. 일반적으로, 비경구 투여로는 동맥 내, 피하 및 근육 내 경로가 바람직하다. 이러한 모든 투여 형태가 명백히 본 발명의 범주에 속하지만, 바람직한 투여 형태는 주사 용제, 특히 정맥 주사, 동맥 주사 또는 점적제(drip) 일 수도 있다. 일반적으로, 주사용으로 적절한 약학적 조성물은 버퍼(예, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 버퍼), 계면활성제(예, 폴리솔베이트), 임의적으로 안정화 제(예, 인간 알부민)등을 함유한다. 하지만, 본원 명세서의 교시에 부합하는 다른 방법으로, 변형된 항체를 악성 종양 부위로 직접 전달하여 신생물 조직이 치료제에 노출되는 것을 증가시킬 수 있다.

비경구 투여의 제제물로는 멸균성 수성 용제 또는 비수성 용제, 서스펜션제 및 유제를 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들면 올리브 오일, 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들면 에틸 올레이트이다. 물, 알코올성 용제/수성 용제, 식염수와 버퍼 매질을 비롯한 유제 또는 서스팬션제를 포함한다. 본 발명의 경우, 약학적 허용 담체는 제한하는 것은 아니지만, 0.01-0.1M 및 바람직하게는 0.05M 인산염 버퍼 또는 0.8% 식염수를 포함한다. 다른 보편적인 비경구 비이클은 나트륨 포스페이트 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화 나트륨, 락테이트 링거 오일 또는 정착유를 포함한다. 정맥용 비이클로는 유체, 영양 보충제, 전해질 공급제, 예를 들면 링거 덱스트로즈를 주성분으로 한 것 및 유사한 것 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제가 존재할 수 있는 데 그러한 것들의 예로는 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 기체 및 유사한 것 등이 있다.

더욱 구체적으로는, 주사 용도에 적합한 약학적 조성물은 멸균 주사성 용제나 분산제의 임시 제조물 용의 멸균성 분제 또는 멸균 수성 용제(수용성인 경우) 또는 분산제를 포함한다. 이러한 경우에 있어서, 조성물은 멸균되어야 하며 주사가 용이할 정도로 유체로 존재하여야 한다. 제조 조건 및 보관 조건하에서 안정하여야 하며, 바람직하게는 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해서 보존되는 것이 바람직할 것이다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 등)을 함유한 분산 매질이거나 용매 및 이들의 적절한 혼합물일 수 있다. 레시틴 같은 피복제를 사용하고, 분산물의 경우 필요한 입도를 유지하며, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다.

미생물의 작용을 방지하는 것은 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤(paraben), 클로로부탄올, 페놀, 아스코르빈산, 티메로살 및 기타 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 조성물 중에 등장 화제, 예를 들면 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화 나트륨을 함유하는 것이 바람직할 것이다. 주사성 조성물의 흡수능력이 연장되는 것은 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 혼입함으로써 가능하다.

임의의 경우에 있어서, 멸균 주사성 용제는 필요한 양의 활성 화합물(예, 변형된 항체 그 자체, 또는 다른 활성 성분과 조합한 것)을 본 명세서에 예시된 성분 하나 또는 이들 성분의 조합물과 함께 적당한 용매 중에 혼입한 후 여과 멸균하는 것이다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을 멸균 비이클에 혼입하는 것으로서, 이 분산물은 앞서 예시한 기타의 필수성분들과 기본적인 분산 매질을 함유한다. 멸균 주사성 용제를 제조하는 멸규 분제의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조인데, 이는 사전에 멸균 여과된 용제로부터 얻은 임의의 부가성 소정 성분에 활성성분이 첨가된 분제를 생성한다. 이 주사 제제물을 가공하고, 앰플, 백, 병, 주사기 또는 바이알과 같은 용기내로 충전하고 기술에 공지된 방법에 따른 무균 조건하에서 밀봉한다. 또한, 함께 계류중인 미국 특허 09/259,337 및 09/259,338(참고 인용)에 기술된 바와 같이, 제제물을 포장하여 키트의 형태로 시판한다. 이러한 제조 제품은 암, 악성 종양 또는 신생물 질환에 걸리기 쉽거나 이로부터 고통받는 환자를 치료하는 데 유용하게 사용된다.

상세하게 전술한 바와 같이, 본 발명은 치료가 필요한 포유 동물 검체에서 신생물 질환을 치료하기 위한 화합물, 조성물 및 키트 그리고 치료 방법을 제공한다. 검체는 인간인 것이 바람직하다. 신생물 질환(예, 암 및 악성 종양)이란 고형의 종양, 예를 들면 흑색종, 글리오마(glioma), 육종 및 암종뿐 아니라 골수 또는 혈액 악성 종양, 예를 들면 림프종 및 백혈병 등을 포함한다. 일반적으로, 개시된 발명을 사용하면 변형된 항체에 의해 암종 세포를 표적가능 하게 하는 항원 표지로서 IGSF9 또는 LIV-1을 함유한 임의의 신생물 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 치료될 수 있는 암의 예로는, 제한하는 것은 아니지만, 전립선, 결장, 유방, 난소 및 폐를 포함한다. 또한, 전술한 신생물 질환 외에, 개시된 발명은 IGSF9 또는 LIV-1을 보유한 부가의 악성 종양을 치료하는 데 이롭게 사용될 수 있다.

본 발명의 수용체/리간드 활성

본 발명의 폴리펩티드는 또한 수용체/리간드 상호반응의 작동제, 수용체, 수용체 리간드 또는 억제제로서의 활성을 입증할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이러한 특성을 지닌 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 이러한 수용체 및 리간드의 비제한 예로는 항원 제시, 항원 인식 및 세포성 및 체액성 면역 반응의 개발과 관련된 시토킨 수용체 및 이들의 리간드, 수용체 키나제 및 이들의 리간드(제한 없이, 세포 유착 분자(예를 들면 셀렉틴, 인테그린 및 이들의 리간드를 포함) 및 수용체/리간드 쌍을 포함한다. 수용체 및 리간드는 또한 관련 수용체/리간드 상호반응의 가능한 펩티드 또는 소분자 억제제를 스크리닝하는데 유용하게 사용된다. 본 발명의 폴리펩티드는(제한 없이 수용체 단편 및 리간드를 포함하여) 그 자체가 수용체/리간드 상호작용의 억제제로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 수용체-리간드 활성을 측정하는 적합한 분석은 제한 없이 다음의 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, et al., Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.28. 1-7.28. 22), Takai et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84 : 6864-6868,1987 ; Bierer et al., J. Exp . Ated . 168 :1145-1156, 1988; Rosenstein et al, J. Exp . Med . 169: 149-160 1989; Stoltenborg et al., J. Imnaunol . Methods 175: 56-98,1994 ; Stitt et al., Cell 80: 661-670, 1995.

일례에서, 본 발명의 폴리펩티드는 리간드의 수용체로서 사용되어 리간드의 생물학적 활성을 전달할 수도 있다. 결합 분석, 친화도 크로마토그래피, 디하이브리드 스크리닝 분석, BIA코어 분석, 겔 오버레이 분석, 또는 기술에 공지된 다른 방법 등을 통하여 이 리간드를 확인할 수 있다.

작동제, 또는 길항제 또는 부분적인 작동제 또는 부분적인 길항제로서 약물 또는 단백질을 규명하는 연구는 경쟁 리간드로서 다른 단백질을 사용할 것을 필요로 한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 리간드는 통상의 방법에 따라 방사성 동위원소, 열량측정 분자 또는 독소 분자에 결합한 상태로 표지화될 수 있다 (Guide to Protein Purification "Murray P. Deutscher (ed) Methods in Enzymology Vol. 182 (1990) Academic Press, Inc. SanDiego). 방사성 동위원소의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 트리튬 및 탄소-14를 포함한다. 열량 측정 분자는, 제한하는 것은 아니지만, 플루오레스카민, 또는 로다민, 또는 기타 열량 측정 분자와 같은 형광 분자를 포함한다. 독소의 비제한적인 예로는 라이신(ricin)이 포함된다.

수용체 활성 분석

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들면 리간드 또는 수용체의 특이적 결합을 검출하는 방법을 제공한다. 당 분야 기술은 본 발명의 수용체 폴리펩티드에 적합한 예전에 알려지지 않은 결합 파트너를 동정하는 데 특히 유용한 여러 가지 분석법을 제공하고 있다. 예를 들면, 포유동물 또는 박테리아 세포를 사용한 발현 클로닝, 또는 디하이브리드 스크리닝 분석을 사용하여 결합 파트너를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 동정할 수 있다. 다른 예로서, 본 발명의 적합한 고정화 폴리펩티드에 대한 친화도 크로마토그래피를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 인식하고 결합하는 폴리펩티드를 단리할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절(즉, 증가 또는 감소)하는 화합물, 특히 소 분자에서 이를 동정하는데 사용되는 다수의 다양한 라이브러리가 있다. 본 발명의 수용체 폴리펩티드의 리간드는 외인성 리간드 또는 리간드 칵테일을 본 발명의 수용체 발현을 제외하고는 유전적으로 동일한 두 개의 세포 개체군에 첨가함으로써 확인되는데, 여기서 한 개의 세포 개체군은 본 발명의 수용체를 발현하지만 다른 하나의 개체군은 수용체를 발현하지 않는다. 이후에 리간드에 첨가에 대한 두 개의 세포 개체군에서의 반응을 비교한다. 대안적으로, 발현 라이브러리를 본 발명의 폴리펩티드와 세포 중에서 공 발현한 후 오토크린 반응 분석을 통해서 가능한 리간드를 확인할 수 있다. 다른 예로서, BLA코어 분석, 겔 오버레이 분석 또는 기술에 공지된 다른 방법들을 사용하여 (1) 유기 및 무기 화학적 라이브러리, (2) 천연 생성물 라이브러리 및 (3) 랜덤 펩티드, 올리고 뉴클레오티드 또는 유기 분자를 포함하는 조합성 라이브러리를 비롯한 결합 파트너 폴리펩티드를 확인할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 시그날 캐스케이드에서 하부류 세포네 시그날 분자의 역할을 측정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드의 세포질 도메인을 리간드가 동정된 단백질의 세포 외 부분과 융합시킨 키메릭 단백질을 숙주세포에서 생산한다. 이후 세포를 키메릭 단백질의 세포 외 부분에 특이적인 리간드로 인큐베이터로 배양한 후 키메릭 수용체를 활성화한다. 세포내 시그널링에 관여하는 공지된 하부류 단백질에 대해서 예기된 변형 반응, 예를 들면 인산화 반응을 분석할 수 있다. 기술에 공지된 기타 방법을 또한 사용하여 수용체 활성에 관여하는 시그날 분자를 동정할 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드

본 발명의 다른 측면은 도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, 또는 22A (서열 번호: 1, 3,5,7,12-21,또는 28)의 뉴클레오티드 서열을 함유한 핵산 분자에 상보적이거나 이에 하이브리드화하는 단리된 안티센스 핵산 분자 또는 이의 단편, 이의 유사체, 또는 이의 유도체에 관한 것이다. 안티센스 핵산은 단백질을 암호화하는 센스 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 관점에서, 안티센스 핵산 분자는 적어도 약 10, 25, 50, 100, 250 또는 500 개의 뉴클레오티드 또는 전체 암호 쇄에 상보적이거나 또는 이의 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 도 1B, 9B, 9D, 9F, 21B, 또는 22B (서열 번호: 2, 4, 6, 8, 22-27, 또는 29)의 단편, 동족체, 유도체, 및 유사체를 암호화하는 핵산 분자, 또는 도 1A, 9A, 9C, 9E, 9H,21A, 또는 22A (서열번호: 1, 3, 5, 7, 12-21, 또는 28)의 핵산 서열에 상보적인 안티센스 핵산이 부가적으로 제공된다.

한 구체예에서, 안티센스 핵산 분자는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 암호 쇄의 암호 영역에 대한 안티센스이다. 암호 영역이란 아미노산 잔기로 번역될 코돈을 함유하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 말한다. 다른 구체예에서, 안티센스 핵산 분자는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 암호쇄의 비암호영역에 대한 안티센스이다. 비암호 영역이란 용어는 아미노산으로 번역되지 않은 암호 도메인과 인접한 5' 서열 및 3' 서열을 말한다(즉, 5' 및 3' 비-번역된 영역이라고도 함).

본 명세서의 개시내용에 사용된 안티센스란 용어는 자연에서 발견되는 유형의 올리고머 핵산 부분(예를 들면, DNA 및 RNA의 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 구조물)과 자연에서 발견되는 핵산에 결합할 수 있는 인간이 만든 유사체를 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합에 의해 결합한 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보튜클레오티드 단량체, 또는 메틸 포스포네이트 포스포로티오에이트, 또는 기타 결합에 의해 결합한 유사물을 의미할 수 있다. 또한, 이는 자연적으로 생성되는 DNA 및 RNA 구조물에 결합할 수 있는 능력은 여전히 보유하면서 기본 구조나 다른 변형물을 변경하는 단량체 부분을 포함할 것이다.

핵산을 암호화하는 암호쇄 서열이 본 명세서에 개시되어 있다는 것을 고려할 때(예, 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 12-21, 또는 28), 본 발명의 안티센스 핵산을 Watson 및 Crick 또는 Hoogsteen 염기 쌍의 법칙에 따라 디자인할 수 있다. 안티센스 분자는 mRNA의 전체 암호 영역에 상보적일 수 있지만, 더욱 바람직한 것은 mRNA의 번역 출발 부위를 둘러쌓은 암호 또는 비암호 영역의 일부분에서만 안티센스인 올리고뉴클레오티드이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개인 뉴클레오티드이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드에 바람직한 길이를 선택하기 위해서, 최고로 바람직한 특성을 제공하는 발란스가 제공되어야만 한다. 짧은 길이의 10-15 염기의 올리고뉴클레오티드는 쉽게 세포내로 진입하지만 유전자 특이성이 낮다. 이와는 대조적으로, 길다란 20-30 염기의 올리고뉴클레오티드는 놀라운 유전자 특이성을 제공하지만 세포내로의 흡수가 감소한 키네틱을 보인다. 참조: Stein et al. , PHOSPHOROTHIOATE OLIGODEOXYNUCLEOTIDE ANALOGUES in "Oligodeoxynucleotides--Antisense Inhibitors of Gene Expression" Cohen, Ed. McMillan Press, London (1988).

본 발명의 안티센스 핵산은 기술에 알려진 방법을 사용하여 화학 합성 또는 효소 결찰 반응에 의해 제작될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산은 안티센스 및 센스 핵산 간에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키거나 또는 본 자의 생물학적 안정성을 향상시키도록 디자인된(예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환 뉴클레오티드) 다양하게 변형된 뉴클레오티드 또는 자연 발생의 뉴클레오티드를 사용하여 합성될 수있다.

안티센스 핵산을 생성하는 데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예로는 다음을 포함한다: 5-플루오우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실엘퀘오신(beta-D-galactosylqueosine), 이노신, N6-이소펜타닐아데닐, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실(pseudouracil), 퀘오신(queosine), 2-티오시토신(thiocytosine), 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린. 대안적으로, 안티센스 핵산은 핵산이 안티센스 배향으로 서브 클론되는 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 하기에서 자세히 후술하는 바와 같이 대상 핵산을목표로 하는 안티센스 배향을 가질 것이다).

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 일반적으로 검체에 투여되거나 또는 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 세포성 mRNA 및/또는 게놈 DNA에 결합하거나 하이브리드화하여 단백질의 발현을 억제하는 방식, 예를 들면 전사 및/또는 번역을 억제하여 동일계로 안티센스 핵산 분자를 생성한다. 하이브리드화는 안정한 듀플렉스를 형성하기 위해서 통상적인 뉴클레오티드 상보적으로 일어날 수 있거나, 또는 예를 들면 DNA 듀플렉스에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에는 이중 나선의 주된 홈에서 특이적 상호 반응을 통하여 일어날 수 있다. 안티센스 핵산 분자의 투여 경로 예로는 선택된 세포를 표적으로 하여 변형한 후에 이를 전신적으로 투여하는 것이다. 예를 들면, 전신성 투여 경우, 안티센스 분자는 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩티드 또는 항체에 안티센스 핵산 분자를 결합시킴으로써, 안티센스 핵산 분자가 선택된 세포 표면상에서 발현된 수용체나 항원에 특이적으로 결합하는 방식으로 변형된다. 안티센스 핵산 분자는 또한 본원에 기술된 벡터를 사용하여 세포에 전달할 수도 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 얻기 위해서는, 안티센스 핵산 분자가 강력한 pol II 또는 pol III 프로모터의 조절하에 놓인 벡터 구조물이 바람직하다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 알파-아노머 핵산 분자이다. 알파-아노머 핵산 분자는 상보적인 RNA에 하이브리드화 하는 특이적 이본쇄 하이브리드를 형성하는데, 여기서 쇄는 통상의 베타 유닛과는 반대로 서로에 대해 평행하다(Gaultier et aL, Nucleic Acids Res 15: 6625-6641 (1987)). 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오티드(Inoue et al., Nucleic Acids Res 15: 6131-6148 (1987)) 또는 키메릭 RNA-DNA 아날로그를 포함한다(Inoue et al., FEBS Lett 215: 327-330 (1987)).

종양 백신

본 발명의 펩티드 또는 이의 유사체를 백신 조성물의 형태로 사용하여 신생물 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 개선된 혈청 반감기 이외에 바람직한 특성을 제공하도록 면역자극 작용을 지닌 본 발명의 펩티드 또는 이의 유사체가 변형될 수 있다. 예를 들면, CTL 작용을 유도하기 위핸 팹티드의 역랑은 T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 서열에 결합시키므로써 증진될 수 있다. 특히 바람직한 면역원성 펩티드/T 헬퍼 콘쥬게이트는 스페이서 분자에 의해 결합하여 있다. 일반적으로, 이 스페이서는 비교적 작은, 중성의 분자로 구성되어 있는데, 이의 예로는 아미노산, 또는 아미노산 모사물을 들 수 있으며, 이들은 생리적 조건하에서 실질적으로 변화되지 않은 것으로서 직쇄 또는 측쇄를 가질 수도 있다. 이러한 스페이서는 일반적으로 비극성 아미노산, 또는 중성의 극성 아미노산으로 이루어진 Ala, Gly, 또는 다른 중성 스페이서에서 일반적으로 선택된다. 임의적으로 존재하는 스페이서는 동일한 잔기를 가질 필요는 없으므로 헤테로- 또는 호모-올리고머일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 존재하는 경우, 스페이서는 적어도 하나 또는 두 개의 잔기 또는 일반적으로는 그보다 많게 세 개 내지는 여섯 개의 잔 기일 수 있다. 대안적으로, CTL 펩티드를 스페이서 없이 T 헬퍼 펩티드에 결합할 수 있다.

면역원성 펩티드는 CTL 펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단에서 스페이서를 통하여 또는 직접 T 헬퍼 펩티드에 결합할 수 있다. T 헬퍼 펩티드 또는 면역원성 펩티드의 아미노 말단은 아실화될 수 있다. T 헬퍼 펩티드의 예로는 파상풍 톡소이드 830-843, 인플루엔자 307-319, 말라리아 포자소체 382-398 및 378-389가 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물은 적어도 한 성분이 면역 자극성이다. 그러므로 본 발명은 어떤 관점에서 비-핵산 어쥬반트를 사용하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 비-핵산 어쥬반트는 데포(depo) 효과, 면역 자극 어쥬반트를 일으키는 어쥬반트이거나 또는 데포 효과를 일으킨 후 면역계를 자극하는 어쥬반트이다. 바람직하게는, 데포 효과를 일으키는 어쥬반트는 미네랄 오일, 비-미네랄 오일, 유중수 또는 수중유 에멀젼을 비롯한 제제 중의 알루미늄계(예, 수산화알루미늄, 인산 알루미늄) 에멀젼 계, 예를 들면 Montanide 어쥬반트의 Seppic ISA 시리즈); MR-59; 및 PROVAX^TM 로 구성된 군에서 선택된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 면역자극제는 PROVAX^TM이다.

일부 구체예에서, 면역 자극 어쥬반트는 큐.사포나리아(Q. saponaria) 나무의 나무껍질로부터 정제된 사포닌, 예를 들면 QS21; 리포폴리사카라이드의 폴리[디(카르복시라토페녹시)포스파젠(PCPP) 유도체, 예를 들면 모노포스포릴 지질(MPL), 뮤라밀 디펩티드(MDP) 및 트레오닐 뮤라밀 디펩티드(tMDP); OM-174; 및 레쉬마니아 신장 인자로 구성된 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 데포 효과를 창출하고 면역 시스템을 자극하는 어쥬반트는 ISCOMS; SB-AS2; SB-AS4 ;CRL 1005와 같은 미셀을 형성하는 비-이온성 블록 공중합체; Syntex 어쥬반트 제제로 구성된 군에서 선택된다.

면역원성 펩티드는 합성에 의해 제조하거나 재조합 DAN 기술에 의해 합성적으로 제조하거나 또는 전체적으로 바이러스 또는 종양과 같은 자연 공급원으로부터 단리할 수 있다. 펩티드는 자연산 숙주 단백질 및 이의 단편이 실질적으로 유리된 것이 바람직하긴 하지만, 일부 구체예에서, 펩티드는 합성에 의해 천연 단편 또는 입자에 콘쥬게이트될 수 있다. 폴리펩티드 또는 펩티드는 이들의 중성 형태(전하가 없음)로, 또는 염형태이면서 글리코실화반응, 측쇄 산화 반응, 또는 인산화 반응과 같은 변형과정이 없거나 또는 있지만 이러한 변형 과정이 본원의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 형태로 다양한 길이를 지닐 수있다.

대안으로서, 재조합 DNA 기법을 사용하여 대상 면역원성 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 내로 삽입하고, 적절한 숙주 세포 내에서 형질전환하거나 또는 형질감염시키고 발현하기 적당한 조건에서 배양할 수도 있다. 이러한 과정은 일반적으로 종래기술에 알려진 것으로서, Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)에 개시되어 있다. 이 문헌은 본원에 참고로 인용되었다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질을 사용하여 적당한 T 세포 에피토프를 제시할 수 있다.

본 발명의 펩티드와 이의 약학적 백신 조성물은 포유동물, 특히 인간의 신생물 질환을 치료하는 데 유용하게 사용된다. 본 발명의 면역원성 펩티드를 사용하여 치료될 수 있는 신생물 질환의 예로는 폐암, 난소암, 유방암 및 전립선암을 포함한다.

본 발명의 펩티드를 함유하는 백신 조성물은 바이러스 감염의 위험이 크거나 위험에 처한 환자에게 항원에 대한 면역반응을 이끌어 내어 환자 자신의 면역 반응 역량을 증가시킨다. 이러한 양을 "면역학적 유효량"으로 정의한다. 이 용법에 있어서, 정확한 양은 환자의 건강 상태 및 환자의 체중, 투여 모드, 제제의 특성에 따르지만, 일반적으로 70kg의 환자에 대해서 약 1.0㎍ 내지 약 5000㎍, 더욱 바람직하게는 동 환자에 대해서 약 10㎍ 내지 약 500㎍의 범위를 갖는다.

치료 또는 면역 목적상, 본 발명의 펩티드는 약독화된 바이러스 숙주에 의해, 예를 들면 백시니아 또는 가금류 천연두로 발현될 수 있다. 이러한 접근은 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현할 벡터로서 백시니아 바이러스를 사용하는 것이다. 급성으로 또는 만성으로 감염된 숙주 내로 유입될 경우에 또는 비감염 숙주 내로 유입될 경우에는 숙주 CTL 반응이 일어난다. 백시니아 벡터 및 면역화 프로토콜에 유용하게 사용되는 방법은 예를 들면 4,722,848에 기재되어 있다. 이 문헌은 참고로 인용되었다. BCG (Bacille Calmette Guerin). BCG 벡터는 (Stover et al ., Nature 351: 456-460 (1991))에 교시되었으며, 이 문헌도 참고로 인용되었다. 본 발명의 펩티드를 치료적 투여 또는 면역화하는데 유용하게 사용되는 다양한 벡테는 예를 들면 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 벡터 등으로서 이들은 본원의 기술의 당업자에게 확실히 알고 있는 것들이다.

항원 펩티드를 사용하여 CTL 생체 외 반응도 또한 이끌어낼 수 있다. 생성된 CTL을 사용하여 다른 통상적인 치료 형태와는 반응하지 않는 환자에게서 만성 감염 질환(바이러스성 또는 박테리아성) 또는 종양을 치료할 수도 있다. 특정 병원체에 대한 생체 외 CTL 반응은 항원 제시 세포(APC)의 공급원 및 적당한 면역 펩티드의 공급원과 함께 환자의 CTL 전구체 세포(CTLp)를 조직 배지 중에서 인큐베이터로 배양하여 유도된다. 인큐베이터로 적당히 배양한 후에(일반적으로 1-4주)(이때 CTLp가 활성화되며, 성숙하고 성숙 및 이펙터 CTL로 확장된 후), 세포들이 환자에게 주사되면 이들의 특이적 표적 세포를 파괴할 것이다(감염된 세포 또는 종양 세포).

펩티드는 또한 진단 시약으로서의 용도도 가질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드를 사용하면 펩티드 또는 관련 펩티드를 사용하는 치료 투약법에 대한 개개의 감수성을 측정하여 기존의 치료 프로토칼을 변경시키거나 또는 영향받는 개체의 예후를 측정할 수 있다. 또한, 펩티드를 사용하면 만성 감염질환이 진행되는 실질적인 위험에 있는 개체를 예측할 수도 있다.

항 유전형 항체

본 발명은 종양 면역 치료요법 및 면역 예방법에 항 유전형 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료 이점을 위해 면역계의 유전형 네트워크를 조작하는 것에 관한 것이다. 항 유전형 항체(Ab2)로 면역화시키면 면역글로불린의 항-항-유전형 면역글로불린의 형성이 유발되는데, 이것 중 일부는 항 유전형을 유래시키는 데 사용되는 항체(Ab1)와 동일한 항원 특이성을 갖는다. 이는 면역계에서 항원 특이성 인식을 생성하고 증폭하는 메커니즘에 의해 면역 반응을 조작하는 강력한 패러다임을 창출한다. 종양에 대한 면역반응은 종양 항원에 대한 동위 원소형을 특이적으로 인식하는 것을 포함한다; 본 발명은 치료 효과를 달성하기 위한 이러한 인식을 조작하는 전략에 관한 것이다. 본 발명의 특정 구체예는 종양에 대한 면역화를 위해서, 채택된 면역 치료요법에 사용되는 림프구의 활성화를 위해서, 그리고 종양 항원에 대해 동위원소를 발현하는 서프레서 인자 또는 서프레서 T 세포에 의해 중재 되는 면역 억제의 억제작용을 위해서 항 동위원소 항체를 사용하는 것을 포함한다. 이 항 유전형 항체 또는 이의 단편을 사용하면 항종양 항체가 투여되어 종양 항원에 대한 수동 면역화를 겪는 환자에게서 항-항체 유도반응이 모니터 될 수 있다.

특정 구체예에서, 항종양 유전형을 나타내는 면역세포 또는 항종양 항체를 투여함으로써 생체내의 항-동위원소 항체를 유발하는 것은 치료 효과가 있을 수 있다.

본 발명은 또한 IGSF9 또는 LIV-1에 대해서 유전형을 인식하는 항 유전형 Mab 분자, 이의 단편 또는 이의 변형체에 관한 것이다.

본 발명의 MAb 분자는 이들 분자의 전체 모노클로날 항체 분자 및 단편 또는 임의적 화학 변형물을 포함하는데, 이것은 IGSF9 또는 LIV-1에 특이적인 다른 항체 분자의 유전형과 결합하는 항원 결합 부위를 지니고 있다. MAb 분자의 유전형을 함유하는 모노클로날 항체 단편은 여러 가지 기법으로 생성될 수 있다. 이들은 제한하는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 펩신으로 항체 분자를 치료하여 생성될 수 있는 F (ab')₂ 단편; F (ab')₂ 단편의 이황화 결합을 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab'단편, 그리고 파파인 및 환원제로 치료하여 이황화 결합을 환원시킴으로써 생성 될 수 있는 2Fab 또는 Fab 단편.

사용 목적에 따라, 본 발명의 항-유전형 항체는 종래기술에 공지된 커플링 기법을 사용한 다양한 화합물을 부착하여 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 것들로는 예를 들면 면역 분석 목적의 방사성 동위원소를 부착하는 경우에 사용되는 효소 수단, 산화성 치환, 킬레이트 작용 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

분자를 화합물에 화학적으로 결합하거나 또는 커플링 시키는 것은, 예를 들면 분자의 Fc 도메인을 유전형으로 결합하는 데 관여하지 않는 부위와 관련 있다. 이는 커플링 반응을 수행하기 전에 분자의 결합 부위를 보호함으로써 이루어질 수있다. 예를 들면, 커플링 반응 전에 이것이 인식하는 유전형에 분자가 결합될 수 있다. 커플링을 완성한 후에, 분자의 결합부위에 대해서 최소의 효과를 가지는 변형된 분자를 생성하기 위해서 분자는 복합체는 붕괴할 수 있다.

본 발명의 항체 분자의 항 유전형 항체 또는 단편들을 면역원으로 사용하여 특이적 세포 중재의 종양 면역을 유도, 변형 또는 조절할 수 있다. 이는 동계(syngeneic) 종양에 대한 면역화에서 이들 분자를 사용하는 것을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

키트

본 발명은 적당한 표지와 관련되거나 그렇지 않으면 콘쥬게이트된 본 발명의 항체 또는 핵산 프로브를 사용하여 테스트 시료 중에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 이의 동족체중 하나의 존재를 확인 또는 발현하는 방법을 제공한다.

일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법은 시료를 복합체를 형성하기에 충분한 기간 동안 폴리뉴클레오티드와 결합하여 복합체를 형성하는 화합물과 접촉시키고, 이 복합체를 검출하는 단계를 포함하는데, 복합체가 검출된 경우, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 시료 중에서 검출되는 것으로 한다. 이러한 방법은 또한 엄중한 하이브리드화 조건하에서 시료와 이런 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 어닐링되는 핵산 프라이머를 접촉하고, 어닐링된 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계를 포함하는데, 폴리뉴클레오티드가 증폭되면 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 시료 중에서 검출되는 것으로 한다.

일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드를 검출하는 방법은 복합체를 형성하기에 충분한 기간 동안 시료를, 폴리펩티드에 결합하여 폴리펩티드와의 복합체를 형성하는 화합물과 접촉시키고, 이 복합체를 검출하는 단계를 포함하며, 이 복합체가 검출 되면 본 발명의 폴리펩티드가 시료 중에서 검출되는 것으로 한다.

상세하게는, 이러한 방법은 본 발명의 1종 이상의 핵산 프로브 또는 1종 이상의 항체를 테스트 시료와 함께 인큐베이터로 배양하고, 이 핵산 프로브나 항체가 테스트 시료 내의 성분과 결합했는 지를 분석하는 단계를 포함한다.

테스트 시료를 사용하여 핵산 프로브 또는 항체를 인큐베이터로 배양하는 조건은 가변적이다. 인큐베이터로 배양하는 조건은 분석에 사용된 포멧, 분석에 사용된 검출방법, 및 핵산 프로브 또는 항체의 유형과 특성에 의존한다. 당업자라면 상업적으로 보편적으로 사용되는 하이브리드화, 증폭과정 또는 면역학적 분석 포멧중 임의의 하나를 쉽게 적용하여 본 발명의 핵산 프로브 또는 항체를 사용할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 이러한 분석의 예들은 Chard, T., An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques , Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands(1986); Bullock, G. R. et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985) ; Tijssen, P., Practice and Theory of immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology , 27 Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985)에서 발견할 수 있다. 본 발명의 테스트 시료는 세포, 단백질 또는 세포의 막 추출물, 또는 생물학적 유체, 예를 들면 정자, 혈액, 혈청, 혈장, 또는 뇨를 포함한다. 전술된 방법에서 사용된 테스트 시료는 분석 포맷, 검출 방법의 특성 및 조직, 분석하려는 세포 또는 추출물에 따라 변한다. 단백질 추출물 또는 세포의 막 추출물을 제조하는 방법은 종래기술에 잘 공지되어 있으며, 또한 쉽게 사용할 수 있어 이용되는 시스템과 혼화성인 시료를 얻게 한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 키트는 본 발명의 분석을 수행하는 데 필요한 시약을 함유한 상태로 제공된다. 구체적으로, 본 발명은 폐쇄형으로 하나 이상의 컨테이너를 수용하는 하나의 콤파트먼트 키트를 제공하는데, 여기서 컨테이너는 (a) 본 발명의 프로브 또는 항체 중 하나를 포함하는 제1 컨테이너, (b) 세척 시약, 결합한 프로브 또는 항체의 존재를 검출할 수 있는 시약중 하나 이상을 포함하는 1 이상의 다른 컨테이너를 포함한다.

구체적으로, 콤파트먼트 키트는 분리된 컨테이너 내에 시약들이 들어있는 임의의 키트를 포함한다. 이러한 컨테이너는 작은 유리 컨테이너, 플라스틱 컨테이너 또는 플라스틱 스트립 또는 페이퍼 스트립을 포함한다. 이러한 컨테이너는 한 콤파트먼트에서 다른 콤파트먼트로 용이하게 시약이 옮겨지도록 되어 있어 시료와 시약이 서로 오염되는 일이 없으며 각 컨테이너의 제제 또는 용액이 한 구획에서 다른 구획으로 정량적 방식으로 첨가될 수 있다. 이러한 컨테이너는 테스트 시료를 수용하는 컨테이너, 분석에 사용된 항체 또는 프로브를 함유하는 컨테이너, 세척 시약을 함유하는 컨테이너(예를 들면 포스페이트 버퍼 식염수, 트리스-버퍼 등) 및 결합한 항체 또는 프로브를 검출하는데 사용되는 시약을 함유한 컨테이너를 포함할 것이다. 검출 시약의 유형으로는 표지 된 핵산 프로브, 표지된 2차 항체 또는 대안으로서 일차 항체가 표지 되는 경우, 효소 또는 표지된 항체와 반응할 수 있는 항체 결합 시약을 포함한다. 당업자라면 본 발명의 개시된 프로브 및 항체가 당 분야에서 확립된 키트 포맷 중 한 개 내로 쉽게 혼입될 수 있음을 용이하게 알 수있을 것이다.

실시예 1

IGSF9 발현

다양한 정상 조직 및 신생물 조직에서 IGSF9 유전자 발현을 조사하였다. 도 2는 Gene Logic datasuite를 사용하여 측정했을 때 이 유전자의 유전자 발현 프로필을 나타내는 "전자 노던 분석(electronic Northern)" 이다. y 축을 따라 나타난 값은 Gene Logic Unit에서의 발현 강도를 의미한다. 본 도면에서 푸른 색의 각 서클은 개별적 환자 시료를 나타낸다. 본 도면의 좌측에 위치한 바(막대) 그래프는 유전자 단편을 발현하는 것으로 밝혀진 각 조직 유형의 백분율을 나타낸다. 각 조직 유형의 시료 전체 수는 다음과 같다: 악성 유방 종양 (60); 악성 결장 종양 (91); 악성 폐 종양 (40); 악성 난소 종양(37); 악성 전립선 종양 (26); 정상 유방 (30); 정상 결장 (30); 정상 식도 (17), 정상 신장 (27); 정상 간 (19); 정상 폐 (34); 정상 림프 결절 (9); 정상 난소 (22); 정상 췌장 (18); 정상 전립선 (21) ; 정상 직장 (22); 정상 비장 (9); 정상 위 (21).

또한, 정상 및 악성 종양의 인간 조직에서의 IGSF9의 발현은 상업적으로 시판되는 cDNA 패널 및 인간의 조직과 세포주에서 자체적으로 제조한 인간의 cDNA 시료를 사용한 PCR 실험에 의해 더 탐구되었다. 이들 실험의 결과들은 하기의 도 3-7에 제시되어 있다. 하기의 PCR 프라이머를 합성한 후 모든 실험에 사용하였다.

5'-TCTTATCTTCTCTCCGACCGGGAAG-3' (서열 번호: 30)

5'-GCCACAGGGCTGATGTCTTCAATGC-3' (서열 번호: 31)

이들 프라이머의 서열은 이미지 클론 # 2013096/ATCC 카탈로그 # 3068496에 제시된 IGSF9 일부에 함유되어 있는데, 이로부터 얻은 플라스미드 DNA를 사용하여 실험마다 양성 대조군으로 사용하였다. 이들 프라이머는 IGSF9 유전자를 함유하는 임의의 cDNA 템플레이트로부터 387bp의 PCR 생성물을 증폭한다. 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH)의 발현은 모든 실험에서 cDNA 보존에 대한 대조군으로서 측정된다. GAPDH는 모든 인간의 조직에서 풍부하게 발현되는 보편적인 유전자이다. GAPDH 유전자의 증폭에 사용되는 프라이머는 다음과 같다:

5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (서열 번호: 32)

5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (서열 번호: 33)

이들 프라이머는 GAPDH 유전자를 암호화하는 임의의 cDNA 템플레이트로부터 482bp 생성물을 증폭한다. 모든 경우에 있어서, 양성 및 음성 대조군이 포함되며; 양성 대조군은 이미지 클론 4762143의 플라스미드 DNA이며, 음성 대조군은 물(템플레이트 없음)이다.

도 3은 Clontech's Human Multiple Tissue cDNA 패널을 사용하여 측정한 정상 조직에의 IGSF9 발현을 나타낸 것이다(BD Biosciences, 카탈로그 # K1420-1 및 K1421-1). 상부 패널은 IGSF9 발현을 나타낸 것이고, 하부 패널은 GAPDH의 패널을 나타낸 것이다. 각 레인에 존재하는 cDNA 시료는 다음과 같다: (1) 뇌, (2) 태반, (3) 폐, (4) 간, (5) 골격 근육, (6) 신장, (7) 췌장, (8) 비장, (9) 흉선, (10) 전립선, (11) 고환, (12) 난소, (13) 소장, (14) 결장, (15) 말초 혈액 백혈구, (16) 양성 대조군, 및 (17) 음성 대조군. 도면의 우측에 보이는 화살표는 IGSF9 PCR 생성물의 예상 크기를 나타낸다. 본 도면에서의 데이터는 IGSF9가 정상의 간, 췌장, 전립선, 고환 및 결장에서 약하게 발현되며 모든 다른 정상 조직에는 발현되지 않는다는 것을 나타낸다.

도 4에 도시된 것은 인간의 난소 종양 시료 및 두개의 난소 종양 세포주의 패널에서의 IGSF9 발현을 나타낸 것이다. 난소 종양 시료는 The Cooperative Human Tissue Network (CHTN)에서 얻었으며; 세포주 Ovcar-3 및 PA1은 미국 미생물 배양 수집소 (ATCC, Rockville MD)에서 얻었다. RNA는 Qiagen's RNeasy 키트 (카탈로그 번호 75162)를 사용하여 각 시료 및 세포주에서 단리 하였다. cDNA를 Invitrogen's cDNA 합성 시스템(카탈로그 번호 11904-018)을 사용하여 RNA로부터 제조하였다. 상부 패널은 IGSF9 발현을, 하부 패널은 GAPDH 발현을 나타낸다. 각 레인위의 숫자는 다음과 같은 난소 종양 시료에 해당한다: (1) 적절히 분화된 낭샘암종(cystadenocarcinoma), (2) 불량하게 분화된 유두성 장액성 선암종, (3) 불량하게 분화된 유두 장액성 선암종, (4) 불량하게 분화된 자궁 내막 유사 선암종, (5) 유두 장액성 선암종, (6) 자궁 내막 유사 선암종, (7) 불량하게 분화된 선암종, (8) 불량하게 분화된 유두 장액성 선암종, (9) Ovcar-3 세포주, (10) PA-1 세포주, (11) 양성 대조군, 및 (12) 음성 대조군. 본 도면의 우측에 있는 화살표는 IGSF9 PCR 생성물의 예상 크기를 나타낸다. 이 패널의 데이터는 IGSF9이 8개의 종양 시료 중에서 7개에서 발현되었고, 이중에서 5개는 강하게 발현되었음을 나타낸다. 난소 종양 세포주 둘 다에서 발현이 되었다.

도 5는 유방 종양 시료 및 이와 매치된 정상 유방 시료에서의 IGSF9 발현을 도시한 것이다. 유방 조직에서의 발현은 Clontech's Human Breast Matched cDNA 쌍 패널(BD Biosciences, 카탈로그 # K1432-1, 처음 5개 시료 셋트)을 사용하여 측정되었고, Grossmont Hospital, La Mesa CA에서 구입한 5 개의 인-하우스 매치된 시료는 TRIzol 시약(Invitrogen, 카탈로그 # 15596026)을 사용하여 각 시료로부터 단리되었다. cDNA는 Gibco BRL cDNA synthesis system (Life Technologies, catalog # 18267-021)를 사용하여 전체 RNA로부터 제조하였다. 상부 겔은 IGSF9 발현을 나타내며; 하부 겔은 GAPDH 발현을 나타낸다. (N) 정상 조직, (T) 종양 조직. 종양 시료는 다음과 같다: (환자 A) 침윤성 관형 암종; (환자 B) 침윤성 관형 암종; (환자 C) 관형 선암종; (환자 D) 침윤성 관형 암종; (환자 E) 침윤성 관형 암종; (환자 T) 동일계(in situ)의 고등급 및 침습성 관형 암종; (환자 X) 관형 선암종; (환자 W) 관형 및 소엽성 선암종; (환자GHl9) 고등급의 침습성 관형 암종; (환자 GH17) 저등급 관내형 암종. 본 도면의 우측 화살표는 IGSF9 PCR 생성물의 예상 크기를 나타낸다. 여기에 제시된 데이터는 IGSF9가 10개의 유방 종양 시료 중에서 8개가 발현되었고, 10개의 정상 시료 중에서는 오직 4개만이 발현되었음을 보여주었다.

폐 종양에서의 IGSF9 발현은 도 6에 도시되어 있다. 발현은 Clontech's Human Lung Matched cDNA Pair Panel (BD Biosciences, catalog # K1434-1)을 사용하여 측정하였다. 상부 패널은 IGSF9 발현을, 하부 패널은 GAPDH 발현을 나타낸다. (N) 정상 시료; (T) 종양 시료. 분석된 종양 시료는 다음과 같았다:(환자 A) 침윤성 관형 암종, (환자 B) 비늘 모양의 세포 각질화 암종, (환자 C) 선 비늘 암종, (환자 D) 각질화 비늘형 세포 암종, (환자 E) 비늘형 세포 암종. 본 도면 우측의 화살표는 IGSF9 PCR 생성물의 예상 크기를 나타낸다. 여기에 나타난 데이터는 IGSF9가 5개의 폐 종양 시료 중에서 모두 발현되었고, 5개의 정상 시료 중에서는 오직 2개만이 발현되었음을 보여주었다.

결장 종양에서의 IGSF9 발현은 도 7에 도시되어 있다. 결장 종양 시료는 캘리포니아 라 메사에 소재한 Grossmont Hospital에서 얻었다. Colorectal 암 세포주 HCT116는 ATCC(ATCC, Rockville, MD)에서 구입하였다. RNA는 Qiagen's RNeasy^®kit (카탈로그 # 75162)을 사용하여 각 시료와 세포주로부터 단리 하였다. Gibco BRL cDNA 합성 계(Life Technologies, 카탈로그 # 18267-021)를 사용하여 전체 RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 상부 패널은 IGSF9 발현을, 하부 패널은 GAPDH 발현을 나타낸다. 시료는 다음과 같다: (1) 3등급 선암종, (2) 2등급 선암종, (3) 1등급 선암종, (4) 2등급 선암종, (5) 직장 결장 암 세포주 HCT116. 본 도면의 우측 상의 화살표는 IGSF9 PCR 생성물의 예상 크기를 나타낸 것이다. 본 도면에서의 데이터는 IGSF9 이 결장 종양 세포주 HTC116에서의 발현될 수 있음을, 그리고 4개의 종양 시료 중에서 적어도 1개 중에서 약하게 발현될 수 있음을 보여준다.

종합적으로 보았을 때, 제시된 데이터는 IGSF9가 난소, 유방, 폐 및 결장 종양 시료에서 상당한 레벨로 발현되었다는 것을 나타낸다. 그러므로 IGSF9은 판칼시노마(pancarcinoma) 항원 및 상술한 내용에서 종양 치료에 적합한 표적이 된다는 것을 나타낸다.

실시예 2

RT-PCR에 의해 측정된 인간의 종양 세포 중에서의 IGSF9 발현

ATCC(Manassas, VA) 및 아리조나 암 센터((Tucson, AZ)에서 구입한 인간의 종양 세포주 수집소의 IGSF9 발현은 RT-PCR로 관찰하였다. 이 실험의 결과들은 도 8에 나타나 있는데, 이 결과는 IGSF9가 다양한 종양 세포주의 수로 발현됨을 보여준다.

다음의 세포주를 사용하였다:

췌장: PANC-1.

유방: ZR-75-1,MDA-MB468, MAD-MB231, ME-180, UACC812.

난소: UACC326.

폐: A549 (NSCLC), NCI-H69 (소세포),NCI-H1299 (NSCLC),

NCI-H2126 (NSCLC).

결장: HT 29, LoVo, SW 620, Colo201, Colo205, Colo320.

Qiagen RNeasy^® 키트를 사용하여 각 세포주로부터 RNA를 단리하고, 다음에, Invitrogen's cDNA 합성계를 사용하여 cDNA를 제조하였다. PCR 실험 결과가 도 8에 나타나 있는데, 여기에는 각 시료 중에서의 IGSF9의 상대적 발현이 내부 대조군 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH)의 강도 대 IGSF9의 강도비로 제시되었다.

하기의 PCR 프라이머를 합성하고 이를 모든 실험에 사용하였다.

5'-TCTTATCTTCTCTCCGACCGGGAAG-3' (서열 번호: 34)

5'-GCCACAGGGCTGATGTCTTCAATGC-3' (서열번호: 35)

이들 프라이머는 IGSF9 유전자를 함유하는 임의의 cDNA 템플레이트로부터 387bp의 PCR 생성물을 증폭한다. GAPDH 유전자의 발현을 cDNA 보존에 대한 대조군으로서 모든 실험마다 측정하였다. GAPDH 유전자의 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같다:

5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (서열 번호: 36)

5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (서열 번호: 37)

이들 프라이머는 GAPDH 유전자를 암호화하는 임의의 cDNA 템플레이트로부터 482bp 생성물을 증폭한다.

실시예 3

IGSF9 구조물을 발현하는 안정한 포유동물 세포주의 생산

두 개의 교호적인 IGSF9 형태가 공공의 데이터베이스에서 확인되었는데, 여기에서는 이를 '단형의 IGSF9' 및 '장형의 IGSF9'로 지칭한다. 장형의 IGSF9는 2개의 Ig 도메인 사이에 위치한 세포 외 도메인에서의 17개의 아미노산 삽입물을 함유한 교호적으로 스플라이스된 변형체이다. 단형의 IGSF9 뉴클레오티드 및 단백질 서열이 도 1A 및 IB에 도시되어 있다. 도 9E 및 9F는 각기 장형의 IGSF9의 뉴클레오티드 및 단백질 서열을 각기 나타낸다.

표준 분자 클로닝 기술 및 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 상업적으로 시판되는 EST 플라스미드로부터 IGSF9으로부터 구축된다면 단형 및 장형을 암호화하는 전장의 cDNA가 얻어졌다. 전장 클론을 이후에 고유의 포유동물의 발현 벡터내로 삽입하였다(미국 특허 5,648,267, 5,733,779, 6,017,733, 및 6,159,730에 개시됨. 그러나, 상업적으로 시판되는 벡터, 예를 들면 인트로젠(Introgen)에서 구입한 pIND/hygro; 스트라타젠(Stratagen)에서 구입한 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl 및 pSG; 및 파마시아(Pharmacia)에서 구입한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL; 및 이와 유사한 것등을 사용할 수도 있다). 단형 및 장형의 IGSF9의 가용성 형태는 인간의 IgG1 Fc 도메인(면역유착소)을 암호화하는 cDNA에 분자의 세포외 도메인을 암호화하는 cDNA를 유전학적으로 융합하므로써 구축하였다. 단형 및 장형의 IGSF9의 세포 외 도메인은 템플레이트로서 전장 유전자를 사용하여 PCR 방법론에 의해 생성하였다. 이후에, 이들 구조물을 IgG1 Fc의 N-말단 유전자 서열을 함유한 고유의 포유동물 발현 벡터내로 삽입하였다. 클로닝은 N-말단을 갖는 IgG1 Fc와 IGSF9 세포외 도메인의 인프레임 융합을 만들었다(모든 서열에 대해서는 도 9를 참조)

상술한 모든 구축물을 사용하여 형질 감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주을 안정하게 생성하였다. 간단하게는, 발현 구축물을 일렉트로포레이션에 의해 DHFR-CHO DG44 내에서 형질감염시켰다(Urlaub 등, 1985. Som . Cell. Mol . Gen., 12: 555-566). 세포를 세척하고, 계수하고, 이를 얼음으로 차게 만든 SBS 버퍼 (7 mM NaP0₄, 1 mM MgCl₂, 272 mM 슈크로즈, pH 7.4.)중에 재현탁하였다. 플라스미드 DNA는 PacI 제한 효소 분해로 선형화하고 1 또는 0.5㎍/ml DNA 및 4 x 10⁶ DG44 세포를 혼합하고, 일렉트로포레이션 처리하였다. 세포를 96 웰 미량역가 배양 판에 시드하고 세포주를 히포크산틴 + 티미딘(HT, Gibco)이 보충된 CHO S SFM II 배지 (Gibco)중에서 G418 내성을 선택하였다. 가장 낮은 농도의 DNA로 형질 감염되어 건강한 세포 성장을 나타내는 플레이트로부터 얻은 웰에 대해서 ELISA(전장 구조물의 경우에 B7Ig, 및 면역유착 구축물의 경우 CTLA4Ig)에 따른 대리 마커 발현을 스크린 하였다. 가장 많이 생산하는 면역유착 세포주를 스피너 배양기내에서 확장하고, 면역유착 분자를 쥐의 모노클로날 항체 생산에 대한 면역원으로서 이후에 사용된 단백질 A 친화도 크로마토그래치에 의해 배양 상청 액으로부터 정제하였다(실시예 4).

도 10은 정제된 면역유착소의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다. 배양 상청액 10 리터로부터 재료를 정제하였다. 단밸질은 쿠마씨 블루 염색(coomassi blue staining)으로 나타내었다. 예상된 분자량의 강한 밴드는 장형의 IGSF9에 대해서만 나타났다(레인 2). 단형(레인 1)은 다양한 열화 생성물을 생성한다. 도 10의 데이터는 재조합 IGSF9 분자가 포유동물에게서 높은 레벨로 성공적으로 발현되었음을 나타낼 수도 있다.

전장의 IGSF9 구조물의 가장 높은 발현 레벨을 보이는 세포주는 5nM 메토트렉세이트(MTX)에서 증폭하고, 그 후 50nM MTX에서 증폭하였다. 간단하게는, 5nM 세포를 2배의 증분으로 1.5 세포/플레이트에서 3000 세포/플레이트 세포의 밀도 범위로 세포를 심고, MTX 또는 50nM MTX세포를 함유하는 배지 중에서 2주간 배양하였다. 살아있는 세포를 ELISA로 대용의 마커 발현을 스크린 한 후 가장 많이 생산하는 클론을 스피너 배양기안에서 팽창시켰다. 생성된 세포주에서의 IGSF9 메시지 발현은 RT-PCR 및 노턴 블러팅으로 확인하였다. 대표적인 노턴 블럿이 도 11에 나타나있다. 노던 분석의 경우, 전체 RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 Qiagen RNeasy^® Maxi kit를 사용하여 1 x 10⁸ 세포로부터 추출하였다. Qiagen Oligotex^® mRNA DirectMidi/Maxi 키트를 사용하여 mRNA를 단리하였다. 3㎍의 mRNA는 표준 절차에 따라 1% 포름알데히드를 함유하는 3%의 아가로즈 겔상에서 분리하고 블럿트화하였다. GAPDH 대조군 프로브와 함께 IGSF9의 세포 외 영역에 대한 뉴클레오티드 프로브를 제조업자의 지시 사항(Roche)에 따라 DIG 표지 뉴클레오티드 혼합물을 사용하는 PCR에 의해 디옥시게닌(DIG)으로 표지하였다. 전체 50 ng/ml의 동일한 농도에서의 IGSF9 프로브 및 15ng/ml하의 GAPDA 프로브 농도에서 IGSF9을 사용하여 DIG Easy Hyb 용액 (Roche)에서 50℃하에 하이브리드화시켰다. 제조업자의 지시사항(Roche)에 따라 블록 검출 시스템 및 DIG를 사용하여 블럿을 세척하고, 검출하였다. 이후에 블롯을 약 16시간 동안 필름에 노출하였다. 예상 크기를 가진 주 생성물 하나를 도 11의 레인 2-5에 나타낸다. 두 번째로 큰 전사물이 작동 전사때문에 나타나는 것이 가능했다. 본 도면에서 제시된 데이터는 재조합 IGSF9 분자가 악성 종양 세포중에서 검출가능한 레벨로 발현되었음을 확인한다.

실시예 4

항- IGSF9 모노클로날 항체 8F3의 생성

유전자 총을 사용하여 6-8주령의 수컷 BALB/c 마우스들에게 단형의 가용성 IGSF9-Ig를 암호화하는 cDNA 구축물로 유전자 총을 사용하여 5회 주사함으로써 모노클로날 항체를 생산하였다. 이후에 마우스를 단백질-A 친화도 크로마토그래피로 안정하게 발현되는 CHO 세포주의 상청액으로부터 정제된 단형의 IGSF9-Ig 융합 단백질로 항원 투여하였다(전술한 실시예). 11일의 기간 동안 12회의 주사 투여를 5세트로 하는 급속한 면역화 기술을 사용하여 정제된 단백질을 마우스들에게 주사하였다. 마우스에서 12일째에 채혈하고, 정제된 단형의 IGSF9-Ig로 피복한 96 웰 플레이트 상에서 IGSF9 특이적 항체의 역가를 ELISA로 측정하였다. 13일째에, 가장 높은 역가를 나타내는 마우스로부터 채취한 비장을 제거해서 이를 표준 면역기술에 따라 마우스 골수종 Sp2/0 세포에 융합하였다 (Kohler, G. and Milstein, C. 1975. Nature 256, p 495). 도 12는 전술한 바와 같이 면역된 2마리의 마우스의 혈청을 순차적으로 희석한 재료 중에서 IGSF9 반응력을 측정한 대표적인 ELISA 분석을 도시한 것이다.

모든 하이브리도마를 대상으로 ELISA에 의해 단형의 IGSF9-Ig에 대한 반응력을 처음에 스크린한 후, 모든 양성 재료를 부적절한 Ig 융합 단백질에 대해서 스크린 하여 임의의 교차 반응 항체를 제거하였다. 제한 희석을 수행하여 가장 많이 생산하는 클론을 서브클로닝하고 마지막으로 이를 스피너 플라스크 내로 확대하였다. 항체를 10 내지 12일 후에 단백질-A 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 상청 액으로부터 정제한 후, 유전자형 측정을 제조업자의 지시에 따른 마우스 면역글로불린 ELISA 키트(Pharmingen)를 사용하여 수행하였다. 8F3로서 지칭된 하나의 모노클로날 항체를 IGSF9에 대한 높은 역가 및 결합 특이성을 기준으로 추가 선택하였다. 실시예 5 및 6은 다양한 관련 조직중에서 IGSF9의 발현을 관찰하기 위해 이러한 항체를 사용한 실험을 기술한 것이다.

실시예 5

모노클로날 항-IGSF9 항체를 사용하여 검출된 안정한 세포주 및 종양 세포주 상의 IGSF9 발현

유동 세포계수법( flow cytometry )에 의해 측정한 안정하게 형질감염된 CHO 세포 중에서의 I GSF9 표면 발현

안정하게 형질감염된 CHO 세포의 표면상에서의 재조합 IGSF9의 발현은 비오틴화된 항-IGSF9 모노클로날 항체 8F3를 사용하는 유동 세포계수학에 의해 확인하였다. 이 항체는 제조업자의 지시사항(Amersham Pharmacia)에 따라 ECL 단백질 비오틴 모듈을 사용하여 비오틴화된 것이다.

유동 세포계수를 위해서, 세포를 수거하고 PBS로 2회 세척하였다. 이후에 3-5 x 10⁵ 세포를 96 웰 둥근 바닥 클레이트내로 할당하고 FACS 버퍼 (10% 정상의 염소 혈청, 0.2% BSA, 및 0.1% NaN₃를 함유하는 PBS)로 3회 세척하였다. 세포 펠릿을 100 ㎕의 주 항체(비오틴화된 8F3 또는 유전형 대조군)과 함께 100㎕의 FACS 버퍼에 현탁하고 1시간 동안 얼음상에서 인큐베이터로 배양하였다. 플레이트를 원심분리하고 상청앵을 니들로 빨아내었다. 전술한 바와 같이 FACS 버퍼를 사용하여 추가로 세포 펠릿을 2회 더 세척하였다. 이후에 세포를 얼음 상에서 1시간 더 스트라타비딘-PE(Streptavidin-PE, BDPharmingen) 1: 500 희석도로 인큐베이터로 배양하고난 후에, 상술한 바와 같이, 5㎕의 프로피디늄 요오다이드를 함유하는 500 ㎕의 FACS중에 재현탁하여 살아 있는 세포를 죽은 세포로부터 분리하였다. 형광 강도는 Becton Dickinson FACScalibur 세포 계수기를 사용하였는데, 여기서 HLA-APC는 양성으로 그리고 프로피디늄 요오다이드는 음성 세포 집단군으로 나타났다.

도 13 및 14는 안정한 CHO 형질감염 체에서 짧은 형의 IGSF9 및 길다란 형의 IGSF9에 대해 유동 세포계수 분석물을 도시한 것이다. 이 도면에서의 데이터는 이 두가지 형태가 형질감염된 세포 표면에서 발현되었으며, 단형의 형질감염체의 MTX 증폭반응이 증가하면 이 분자의 표면발현이 중가 되었음을 나타낸다.

유동 세포 계수학으로 측정한 종양 세포주 상에서의 IGSF9 표면 발현

주된 항체 8F3의 다양한 농도를 테스트한 것을 제외하고 인간의 폐 종양 세포주 NCI-H69에서의 IGSF9의 내생 표면 발현은 전술한 바와 같이 주로 유동 세포 계수학으로 측정하였다. 이 실험 결과는 도 15에 나타나 있다. 이 실험은 인간 종양 세포주의 표면상에서 내인적으로 발현된 IGSF9가 발견되었음을 입증한다.

웨스턴 블로팅에 의해 측정한 종양 세포주에서의 IGSF9 발현

항-IGSF9 모노클로날 항체 8F3으로 프로브된 인간 종양 세포주로부터 얻은 단백질 용균물을 사용하여 면역블로팅 실험을 수행하면 IGSF9 단백질이 다수의 인간 종양 세포주에서 검출가능한 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 데이터는 도 16에 나타나 있다. 모든 단백질 용균물은 SDS 겔 시료 버퍼 중에서 직접 세포를 용균하여 제조하고 SDS-PAGE에 의해 용해하였다. 제조업자의 지시에 따라 DC 단백질 분석 키트(BioRad)를 사용하여 용균물의 단백질 농도를 측정하였다. 세포 용균물을 SDS-PAGE(6% 아크릴아미드겔)로 분해하고, PVDF 막에 옮기고, 정제된 -IGSF9 mAb(8F39 10, ug/ml)를 사용하여 4℃에서 밤새도록 면역블로팅한후 양고추냉이 페록시다제 (HRP)-콘쥬게이트된 항-마우스 IgG 부 항체(BioRAD)를 1:1,000의 희석비율로 배양하였다. 면역블롯은 제조업자의 지시에 따른 ECL 시약(mersham Pharmacia)을 사용하여 현상되었다.

형광 망원경으로 측정한 종양 세포의 표면상에서의 IGSF9 발현

항-IGSF9 모노클로날 항체 8F3(10 ㎍/ml)와 함께 폴리 L-리신-피복된 유리 카바슬립상에서 성장한 ZR-75-1 유방 종양 세포를 16 시간동안 인큐베이터로 배양하였다. 냉 메탄올을 사용하여 세포를 PBS로 세척하고 고정하였다. 고정된 세포를 차단 버퍼(3% 염소 혈청, PBS 중의 0.5% BSA)중에서 차단하고, 1:2000의 희석 비율로 45분간 실온에서 DAPI (0.5㎍/ml) 및 Alexa 488-염소 항-마우스 2차 항체(Molecular Probes)와 함께 인큐베이터로 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고, ProLong^® Antifade 키트(Molecular Probes)를 사용하여 유리 슬라이드 상에 올려놓고, BioRad Radiance 2100 공초점 현미경 시스템(60 배 대물렌즈)를 사용하여 관찰하였다. 이 실험 결과를 도 17에 도시하였다. 본 도면은 유방 종양 세포의 표면 염색을 나타낸 것이다.

종합적으로 보았을 때, 도 13-17에 나타난 데이터는 단일 클론 항체 8F3가 IGSF9에 대해서 반응성을 나타냈음을 입증하였으며, 또한 IGSF9가 세포 표면 단백질임을 확인하였다. 이러한 데이터는 인간 종양 세포주 표면에서 상당한 레벨로 발현되었기 때문에 IGSF9가 인간 종양에서 적당한 면역 치료요법이 될 수 있다는 가설을 지지한다.

실시예 6

쥐의 종양 이종이식물에서의 IGSF9 발현

쥐의 종양 이종이식물은 다음과 같이 생성되었다: 시험관 내에서 배양된 종양 세포주 NCI-H69 (폐) 및 ZR-75-1 (유방), LS174T (결장) 및 Ovcar-3 (난소)를 수거하고 22 게이지 니들을 사용하는 주사기 내로 세포 현탁물을 통과하여 세포 집합물을 해리시켰다. 세포를 세척하고, 계수하고, PBS중에 재현 탁하였다.

2-lO x 10⁶ cells/100 ㎕을 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하(s.c.)주사하였다. 성장한 지 4-8주 지나서 종양 덩어리를 절제하였다. 생체에 재통과시키기 위해서, 2mm 종양 단편을 피하주사로 누드 마우스의 옆구리내로 재도입하고 4-8 주동안 자라게 하였다.

항-ICGFS 모노클로날 항체를 사용하는 유동 세포 계수에 의해 측정한 쥐의 종양 이종이식물과 세포주에서의 IGSF9 표현 발현

유동 세포 계수 분석을 위해서, 새로운 종양 시료를 자르고 37℃에서 1시간동안 5% BSA 및 0.05% NaN₃를 함유한 콜라게나제 용액으로 분해하였다. 밀도 구배 원심분리에 의해 살아있는 세포를 죽은 세포 및 다른 잔해들과 분리해놓았다. 이후 세포를 96 웰의 둥근 바닥 플레이트내로 심고 실시예 5에서 기술한 유동 세포 계수학으로 가공 처리하였다. 전술한 바와 같이, 배양기에서 자란 세포를 비효소 버퍼를 사용하여 떼어내고, 세척하며, 96 웰 플레이트내로 옮기고, 그리고 전술한 바와 같이 가공처리 하였다.

도 18은 NCI-H69 및 Ovcar-3 쥐의 종양 이종이식 및 배양된 세포중에서 IGSF9의 발현을 측정한 대표적인 FACS 실험을 도시한 것이다. 도 18에서의 데이터는 쥐의 이종이식물에서 유래한 배양기에서 또는 생체내 통과된 세포 둘다에서 자란 세포 표면상에서 IGSF9가 발현되었다. 생체내에서 자라는 인간 종양 세포의 표면에서의 IGSF9 발현은 IGSF9가 적당한 치료 타켓이 된다는 아이디어를 지지한다.

쥐의 종양 이종이식물의 IGSF9 메시지는 RT-PCR 에 의해 검출된다.

종양 이종이식물 시료 중에서의 IGSF9 발현은 인간 IGSF9-특이적 및 GAPDH 대조군 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해 측정되었다. 이종이식물 시료를 생성하고 전에 기술한 바와 같이 절제하였다. Qiagen RNeasy^® 를 사용하여 0.25g 조직 시료로부터 전체 RNA를 단리한 후, DNase로 처리하고, Qiagen minElute^® 칼럼을 사용하여 정제하였다. 올리고-dT 프라이머 및 Invitrogen's Super Script First-Strand 합성 시스템을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 표준 조건하에서 PCR을 수행하였다. IGSF9를 증폭하기 위해 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같았다:

전방 프라이머 5'-GTGGGCCGGGGGCTGCAAGGCCAG-3' (서열 번호: 38)

반대방향 프라이머 5'-AGCAGACAAGACGATTTCGCTGAA-3' (서열 번호: 39)

도 19에는 대표적인 RT-PCR 실험 결과가 나타나 있다. LS174T 및 NCI-H69 종양 세포주의 생체내 통과(PO 및 PI)를 2회 검출하고, 적어도 쥐의 크세노접합물로부터 유래한 Ovcar-3 세포에 1회 (PO)통과하여 IGSF9 메세지를 검출하였다.

IGSF9의 교호적인 스플라이싱 형태는 쥐의 이종이식물 종양에서 발현된다. 쥐의 이종이식물 시료에서 얻은 PCR 생성물의 서열을 분석하면 IGSF9의 다양한 이소형이 종양 유래한 세포에서 발현되었음을 알 수 있다. 전술한 바와 같이, IGSF9 영역에 인접하도록 디자인된 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 이 프라이머는 PCR 프라이머의 서열에서(엑손 9에서) 초기에 분기되어 나타난 것으로 짧은 이소형 및 길다란 이소형은 다음과 같았다:

전방 프라이머 5'-CAGGAACTGGAGCCTGTGACCCT-3' (서열 번호: 40)

반대방향 프라이머 5'-CTCTATAAAAGCTGGGGGAGCCTT-3' (서열 번호: 41)

CR4-TOPO TA 클로닝 시스템(Invitrogen)을 사용하는 새총으로 PCR 생성물을 크론하였다. 두개의 새로운 이소형이 NCI-H69 이종이식물로부터 유래된 클론에서 동정되었으며, 부가의 다양한 신규의 이소형도 Ovcar-3 크세토접합물에서 유래된 클론에서 동정되었다.

모든 신규한 이소형은 AG/GT 스플라이싱 룰을 따르는데, 이는 이소 형들이 진정한 스플라이스 변형체라는 것을 제시한다(Breathnach R. et al, 1978. Proc . Natl . Acad. Sci . USA 75; 4853-7.). 대표적인 PCR 겔은 도 20에 도시되어 있는데, 이것은 교호적인 스플라이싱의 영향을 받는 IGSF9의 엑손의 계통적인 표시와 함께 도 20에 도시되어 있다. 각 뉴클레오티드 서열의 인-프레임 번역은 모든 신규한 서열이 트랜스멤브레인 도메인이 부족한 절단된(truncated) 단백질을 생성할 것임을 예측한다. 얻은 실제적인 뉴클레오티드 서열의 정렬은 이들의 해당하는 추정 단백질 서열과 함께 도 21에 도시되어 있다. 부분적인 뉴클레오티드 서열은 IGSF9 이소형의 엑손 5-10과 함께 정렬되어 있다.

여기에 제시된 서열 데이터는 IGSF9의 다양한 이소형이 인간 종양에게서 나타나며, 많은 이소형들이 면역 치료적 타켓으로서의 가능성을 또한 나타냄을 알려주는 것이다.

실시예 7

LIV -1 발현

도 22는 Gene Logic datasuite를 사용하여 측정한 것으로 이 유전자의 유전자 발현 프로필을 나타내는 "일렉트로닉 노던(electronic Northern)" 이다. y 축을 따라 나타난 값은 Gene Logic Unit에서의 발현 강도를 의미한다. 본 도면에서 푸른 색의 각 서클은 각 환자의 시료를 나타낸다. 본 도면의 좌측 상의 바(막대) 그래프는 유전자 단편을 발현하는 것으로 밝혀진 각 조직 유형에서의 백분율을 나타낸다. 각 조직 유형의 시료 전체 수는 다음과 같다: 악성 유방 종양 (60); 악성 결장 종양 (91); 악성 폐 종양 (40); 악성 난소 종양(37); 악성 전립선 종양 (26); 정상 유방 (30); 정상 결장 (30);정상 식도 (17), 정상 신장 (27); 정상 간 (19); 정상 폐 (34); 정상 림프 결절 (9); 정상 난소 (22); 정상 췌장 (18); 정상 전립선 (21) ; 정상 직장 (22); 정상 비장 (9); 정상 위 (21).

또한, 정상 및 악성 종양의 인간 조직에서의 LIV-1의 발현은, 이전 실시예에서 기재한 바와 같이, 상업적으로 시판되는 인간의 cDNA 패널 및 인간의 조직과 세포주에서 인-하우스로 제조한 인간의 cDNA 시료를 사용한 PCR 실험에 의해 더 탐구되었다. 이들 실험의 결과들은 하기의 도 23-25에 제시되어 있다. 하기의 PCR 프라이머를 합성한 후 모든 실험에 사용하였다.

5'-GGATGGTGATAATGGGTGATGGC-3' (서열번호: 42)

5'-GGTCACTAGCATCATTGTGCAGC-3' (서열번호: 43)

이들 프라이머의 서열은 이미지 클론 # 4697878/ATCC 카탈로그 # 6645729에 제시된 LIV-1 일부에 함유되어 있는데, 이로부터 얻은 플라스미드 DNA를 각 실험시에 양성 대조군으로 사용하였다. 이들 프라이머는 LIV-1 유전자를 함유하는 임의의 cDNA 템플레이트로부터 360bp의 PCR 생성물을 증폭한다. 이전 실시예에서 기술한 바와 같이, GAPDH의 발현은 모든 실험에서 cDNA에 대한 대조군으로서 측정된다.

LIV-1 프라이머는 GAPDH 유전자를 암호화하는 임의의 cDNA 템플레이트로부터 482bp 생성물을 증폭한다. 모든 경우에 있어서, 양성 및 음성 대조군이 포함되며; 양성 대조군은 IMAGE 클론 4762143의 플라스미드 DNA이며, 음성 대조군은 물(템플레이트 없음)이다.

도 23은 Clontech's Human Multiple Tissue cDNA 패널을 사용하여 측정하였을 때 정상 조직에서의 LIV-1 발현을 나타낸 것이다(BD Biosciences, 카탈로그 # K1420-1 및 K1421-1). 상부 패널은 LIV-1 발현을 나타낸 것이고, 하부 패널은 GAPDH의 패널을 나타낸 것이다. 각 레인에 존재하는 cDNA 시료는 다음과 같다: (1) 심장, (2) 뇌, (3) 태반, (4) 폐, (5) 간, (6) 골격 근육, (7) 신장, (8) 췌장, (9) 음성 대조군, 및 (10) 양성 대조군. 도면의 우측에서 화살표는 LIV-1 PCR 생성물의 예상 크기를 나타낸다. 본도면에서의 데이터는 LIV-1이 정상의 뇌, 태반, 폐, 간, 신장에서는 약하게 발현되었지만 정상적인 췌장에서는 약간 큰 규모로 발현되었음을 나타내었다.

도 24는 유방 종양 시료 및 이와 매치된 정상적인 유방 시료에서의 LIV-1 발현을 도시한 것이다. 유방 조직에서의 발현은 Clontech's Human Breast Matched cDNA 쌍 패널(BD Biosciences, 카탈로그 # K1432-1, 좌측 패널)을 사용하여 측정되었고, 5 개의 인-하우스 매치된 시료는 Grossmont Hospital, La Mesa CA(우측 패널). RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, 카탈로그 # 15596026)을 사용하여 각 시료로부터 단리되었다. cDNA는 Gibco BRL cDNA 합성 시스템(Life Technologies, catalog # 18267-021)를 사용하여 전체 RNA로부터 제조하였다. 상부 겔은 LIV-1 발현을 나타내며; 하부 겔은 GAPDH 발현을 나타낸다. 도면 우측의 화살표는 LIV-1 생성물의 예상 크기를 나타낸 것이다. 종양 시료는 다음과 같다: (1-환자 A) 침윤성 관형 암종; (2-환자 B) 침윤성 관형 암종; (3-환자 C) 관형 선암종; (4-환자 D) 침윤성 관형 암종; (5-환자 E) 침윤성 관형 암종; (6-환자 A) 정상, (7-환자 B), (8-환자 C) 정상, (9-환자 D) 정상, (10-환자 E) 정상, (11) 음성 대조군, (12) 양성 대조군, (13-환자 G19) 고등급 침습성 관형 암종; (14-환자 G19) 저등급 침습성 관형 암종, (15-환자 X) 관형 선암종; (16-환자 W) 혼합성 관형 and 소엽성 선암종, (17-환자 T) 동일계의 고등급 및 저등급 관형 선암종, (18-환자 G19) 정상, (19-환자 G17) 정상, (20-환자 X) 정상, (21-환자 W) 정상, (22-환자 T) 정상, (23) 음성 대조군, 및 (24) 양성 대조군. 본 도면에 나타난 데이터는 LIV-1가 분석된 모든 10 개의 유방암 시료 중에서 발현되었음을 나타내었고, 또한 발현은 상응하는 매치된 정상 시료에서보다는 종양 조직에서 높게 나타났다.

결장 종양에서의 LIV-1 발현이 도 25에 도시되어 있다. 결장 종양 시료는 캘리포니아 라 메사에 소재한 Grossmont Hospital에서 얻었다. 직장결장 암세포주 HCT116는 ATCC(ATCC, Rockville, MD)에서 구입하였다. RNA는 Qiagen's RNeasy 키트 (카탈로그 # 75162)을 사용하여 각 시료와 세포주로부터 단리하였다. Gibco BRL cDNA 합성 계(Life Technologies, 카탈로그 #;18267-021)를 사용하여 전체 RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 상부 패널은 LIV-1 발현을, 하부 패널은 GAPDH 발현을 나타낸다. 시료는 다음과 같다: (1) 3 등급 선암종, (2) 2 등급 선암종, (3) 1 등급 선암종, (4) 2 등급 선암종, (5) 직장결장 암세포주 HCT116, (6) 양성 대조군 및 (7) 음성 대조군. 본 도면에서의 데이타는 LIV-1이 테스트된 4개의 결장 종양 시료가 모두 발현되었음을 제시한다.

종합적으로 보았을때, 여기에 나타난 데이터는 LIV-1이 다수의 유방 및 결장 종양 시료에 상당한 레벨로 발현되었다는 것을 나타낸다. 그러므로 Gene Logic 데이터는 이것이 전립선 종양 시료에서 과잉발현됨을 나타낸다. 그러므로 LIV-1은 pancarcinoma 항원 및 상술한 내용에서 종양 치료에 적합한 표적임을 나타낸다.

실시예 8

암 치료 방법

암환자 또는 암을 가진 것으로 추정되는 환자로부터 조직 시료를 얻는다. 이 시료는 생체검사 시료이거나, 조직에서 제거된 후 얻은 병 인성 시료이거나 또는 환자에게서 사전에 얻어놓은 보관된 시료이다. 시료는 실시예 1-7과 유하사게 검사한다.

종양 시료 중에서 IGSF9 또는 LIV-1의 레벨을 분석을 근거로, 치료 투약법은 당 분야에 숙련된 당업자에게 공지된 허용가능한 대체 치료법을 사용하여 결정된다. 이러한 것들로는 제한하는 것은 아니지만 본원 명세서에 기술된 방법, 관찰, 외과 수술 모드, 비-보조 요법, 예를 들면 방사선 요법 그리고 보조 요법, 예를 들면 타목사펜 또는 세포 독성 화학 치료 요법을 포함할 수 있다.

본 발명은 IGSF9 또는 LIV-1의 과잉 발현이 많은 신생물 형성과 관련 있음을 밝혔다. 그러므로 IGSF9 또는 LIV-1 발현 레벨이 다양한 암에 대한 정보를 제공하는 예후성 마커를 나타낸다는 것을 입증한 것은 본 발명이 중요한 일이다. 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 IGSF9 또는 LIV-1의 발현 레벨을 측정할 수 있다. 진단시 및 외과적 제거수술시에 주된 종양에서의 IGSF9 또는 LIV-1 발현 레벨에 관한 지식은 어쥬반트 호르몬 및 화학 치료 요법뿐 아니라 보충 방사선 치료 요법과 관련한 치료 결정에 직접적으로 영향을 줄 수도 있다.

현재 사용되는 암 치료 요법의 선택 및 이용에 영향을 주는 것 이외에도, IGSF9 또는 LIV-1 발현 레벨에 관한 지식은 새로운 암 치료 요법을 적용하는 데도 유용하다. 그러므로 IGSF9 또는 LIV-1의 정상 레벨을 보관하는 치료 요법은 전술한 것에 국한되지 않는다.

실시예 9

화합물을 스크리닝하는 방법

약학 산업은 세포 표면 수용체 길항근 또는 작동근으로 작용하는 약학적으로 유용한 화합물에 관심을 쏟고 있다. 매년 수만 가지의 화합물이 전체 수준으로 또는 "높은 유동률(high flux)" 스크리닝 프로토칼에 따라 테스트할 필요성이 있다. 조사된 수천 가지 화합물에서, 1개 또는 2개가 전체 수준 분석의 일종의 활성도를 보이고 있다. 다음에, 이들 화합물을 선택해서 추가의 개발하고 테스트한다. 이상적으로는, 스크리닝 프로토콜을 자동화하여 한번에 많은 시료들을 처리할 수 있을 것이며, 이 프로토콜은 안전이나 폐기의 문제를 일으키는 방사성 동위원소 또는 다른 화학약품을 사용하지 않을 수 있을 것이다. 세포 표면 수용체 활성의 바람직하거나 또는 바람직하지 않은 약물 조절을 평가하는 항체 기준의 접근방식은 이러한 장점을 제공하며 높은 선택성이라는 부가의 장점을 제공한다.

특히, IGSF9 또는 LIV-1를 인식하는 항체를 사용하여 다양한 스크리닝 프로토칼로 약물을 스크린 할 수 있다. 일반적으로, 두 가지 접근이 사용가능하다. 세포 또는 조직 기준의 접근법은 테스트할 화합물에 노출된 인디케이터 세포주 또는 조직을 사용한다. 세포를 사용하는 경우 이러한 접근 방식은 용해도 또는 약물 투과성 문제를 지닌 약물을 재빨리 제거할 수 있게 한다. 단백질 또는 효소 기준의 스크린은 정제된 단백질을 사용하여 세포내 시그날링에 영향을 주는 IGSF9 또는 LIV-1와 반응하는 약물을 동정할 수 있다.

IGSF9 또는 LIV-1의 발현을 조절(예, 자극, 차단, 억제 또는 억압)하는 약물을 확인하기 위해 세포 또는 조직을 기본으로 하는 스크리닝을 하기 위해서, IGSF9 또는 LIV-1의 면역 조직화학 또는 세포화학을 사용하여 개별적인 제제의 효과를 측정할 수 있다.

IGSF9 또는 LIV-1의 레벨을 정확히 검출하는 면역조직화학 기준의 방법은 또한 고형의 종양 외식 편 배양물 및 organoid 배양물과 함께 사용될 수 있어 다른 방법에 의한 검출방법보다는 더욱 생리적의 연관성을 갖는 설정으로 IGSF9 또는 LIV-1 조절 약물의 정확한 검출을 가능하게 한다는 이점이 있다. 또한, 제시된 방법은 연구 동물 및 인간 생체에 존재하는 조직 및 세포에 IGSF9 또는 LIV-1에서의 약물의 효과를 스크린 및 모니터 할 수있는 방법이다. 연구 동물의 경우에 시료는 생체검사(예, 미세한 니들 침투, 절단) 또는 조직 수거 후 본 발명의 방법을 적용하여 얻을 수 있다.

제시된 방법은 감수성이 매우 높은데 그 이유는 IGSF9 또는 LIV-1 발현 수준이, 원칙적으로, 단일 세포 중에서 모니터 될 수도 있기 때문이다. 실제 용도로서, 더 많은 세포들이 필요하긴 하지만 우수한 분석적 추정물은 20 내지 100 세포수와 같이 적은 수로 얻어질 수도 있다.

특정 구체예와 실시예를 비롯한 전술한 본원 명세서는 본 발명을 설명할 목적으로 기재된 것이지 제한의 목적으로 기재된 것은 아니다. 본 발명의 진정한 정신과 도메인을 벗어나지 않은 범주에서 많은 기타의 변경 및 수정이 가능하다. 본원 명세서에서 사용된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 본원의 개시내용에 참고로 포함되었다.

Claims (43)

1. IGSF9 또는 LIV-1와 결합하는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
2. 서열 번호: 2에 개시된 아미노산 21 내지 718, 서열번호: 8에 개시된 아미노산 21 내지 734, 서열 번호: 22 내지 27에 개시된 아미노산 서열의 IGSF9; 또는 서열 번호 29에 개시된 아미노산 28 내지 317, 373 내지 417, 674 내지 678 또는 742 내지 749의 LIV-1와 결합하는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
3. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 도메인 결손된 항체를 포함하는 것인 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
4. 제3항에 있어서, 세포독성제를 추가로 함유하는 것인 도메인 결손된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
5. 제4항에 있어서, 상기 세포독성제는 방사선 핵종인 것인 도메인 결손된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
7. 제1항에 있어서, 상기 항체는 영장류화된 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
8. 항체 또는 이의 항원 단편이 IGSF9 또는 LIV-1과 관련된 하나 이상의 기능을 억제하는 것인, IGSF9 또는 LIV-1과 결합하는 항체 또는 이의 항원 단편.
9. IGSF9 또는 LIV-1과 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
10. 하나 또는 그 이상의 2 기능성 킬레이트제에 공유 결합된, 도메인 결손된 항-IGSF9 또는 항-LIV-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 신생물 질환치료용 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 2 기능성 킬레이트는 MX-DTPA 및 CHX-DTPA로 구성된 군에서 선택되는 것인 조성물.
12. IGSF9 또는 LIV-1과 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 신생물 질환을 앓고 있는 포유동물을 치료하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 1종 이상의 화학치료제의 치료적 유효량을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고; 상기 화학치료제와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있는 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 항-IGSF9 또는 항-LIV-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 도메인 결손된 항체인 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 도메인 결손된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C_H2 도메인이 결여된 것인 방법.
16. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합이 인간화된 것인 방법.
17. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 세포 독성제와 결합하는 것인 방법.
18. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 화학치료제의 2주 이내에 투여되는 것인 방법.
19. IGSF9 또는 LIV-1 폴리펩티드 또는 이의 단편 및 생리학적 허용 담체를 포함하는 암 치료용 백신.
20. 제19항에서 있어서, 상기 폴리펩티드가, 서열 번호: 2에 개시된 IGSF9의 아미노산 1 내지 1163 또는 아미노산 21 내지 718; 또는 서열 번호 29에 개시된 LIV-1의 아미노산 1 내지 749, 아미노산 28 내지 317, 또는 아미노산 373 내지 417을 포함하는 것인 백신.
21. 제19항에 있어서, 상기 생리적 허용 담체가 어쥬반트(adjuvant) 또는 면역 자극제를 포함하는 것인 백신.
22. 제21항에 있어서, 상기 어쥬반트는 PROVAX^TM인 것인 방법.
23. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 T 헬퍼 펩티드에 융합되는 것인 방법.
24. 제19항의 백신을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 또는 예방이 필요한 환자에서 면역반응을 유도하는 방법.
25. (e) 암의 진단이 필요한 개체로부터 시료를 얻는 단계, (f) 상기 시료 중에서 IGSF9 또는 LIV-1, 또는 이의 단편의 발현을 검출하는 단계, (g) 진단된 개체로부터 얻은 정상 조직, 또는 정상의 개체로부터 얻은 대조군 시료 중에서 IGSF9 또는 LIV-1 또는 이의 단편의 발현을 검출하는 단계 및 (h) 대조군 시료 중에서 얻은 것과 IGSF9 또는 LIV-1 의 발현 수준을 비교하여 암을 진단하는 단계를 포함하는, IGSF9 또는 LIV-1, 또는 이의 단편의 과잉 발현을 검출하여 암을 진단하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 IGSF9 단편은 엑손 5-10을 포함하는 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, 상기 과잉 발현은 핵산의 증폭 또는 하이브리드화에 의해 검출되는 것인 방법.
28. 제25항에 있어서, 상기 과잉발현은 IGSF9 또는 LIV-1에 대한 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 검출되는 것인 방법.
29. (e) 암치료의 예후 예측이 필요한 개체로부터 시료를 얻는 단계, (f) 상기 시료 중에서 IGSF9 또는 LIV-1 또는 이의 단편의 발현을 검출하는 단계, (g) 진단된 개체로부터 얻은 정상조직, 또는 정상 개체로부터 얻은 대조군 시료 중에서 IGSF9 또는 LIV-1 또는 이의 단편의 발현을 검출하는 단계, (h) 대조군 시료 중에서 얻은 것과 IGSF9 또는 LIV-1 또는 이의 단편의 발현 수준을 비교하여 암의 예후를 판단하는 단계를 포함하는, 암치료를 받은 개체의 예후를 측정하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 IGSF9 단편은 엑손 5-10을 포함하는 것인 방법.
31. 활성 성분으로서 IGSF9 또는 LIV-1 항원 또는 이의 단편을 면역학적으로 모방하는 항-유전형 항체를 포함하는 백신.
32. 암의 치료 또는 검출을 위한 사용상 지시사항과 함께 제9항의 조성물을 포함하는 것인 키트.
33. IGSF9 또는 LIV-1에 대한 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 포함하는 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 신생물 세포가 IGSF9 또는 LIV-1 항원을 발현하는 포유동물의 신생물 질환 치료 방법.
34. IGSF9 또는 LIV-1를 포함하는 면역원성 제제의 항-종양 면역 반응을 유발하는 유효량과 약학적 허용 담체를 포함하며, 상기 면역원 제제가 항종양 면역 반응을 유발할 수 있는 것인 백신.
35. IGSF9 또는 LIV-1의 발현을 억제하는 IGSF9 또는 LIV-1의 8개 이상의 뉴클레오티드 부분을 포함하며, 길이가 최대 뉴클레오티드 50개까지인 안티센스 핵산.
36. 제35항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 적어도 한 개의 변형된 뉴클레오티드 간의 결합을 포함하는 것인 핵산.
37. 세포나 조직을 제34항의 핵산과 접촉시켜 IGSF9 또는 LIV-1의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직 중에서 IGSF9 또는 LIV-1의 발현을 억제하는 방법.
38. 서열 번호: 3, 서열 번호: 5; 서열 번호: 12; 서열 번호: 13; 서열 번호: 14; 서열 번호: 15; 서열 번호: 16; 서열 번호: 17; 서열 번호: 18; 서열 번호: 19; 서열 번호: 20; 및 서열 번호: 21로 구성된 군에서 선택되는 단리된 핵산.
39. 제38항의 핵산을 포함하는 벡터.
40. 제38항의 핵산을 포함하는 숙주세포.
41. 서열 번호: 4; 서열 번호: 6; 서열 번호: 22; 서열 번호: 23; 서열 번호: 24; 서열 번호: 25; 서열 번호: 26 및 서열 번호: 27로 구성된 군에서 선택되는 단리된 폴리펩티드.
42. 제41항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
43. 제41항의 폴리펩티드와 생리적 허용 담체를 포함하는 암 치료용 백신.