BRPI0710616A2

BRPI0710616A2 - métodos para tratar, diagnosticar ou detectar cáncer

Info

Publication number: BRPI0710616A2
Application number: BRPI0710616-5A
Authority: BR
Inventors: Mary J Jantapour; Guoying Yu; Robert To; Vivien Chan; Deborah Zimmerman
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2006-04-13
Filing date: 2007-04-12
Publication date: 2011-08-16
Also published as: KR20090010194A; TW200813231A; WO2007120787A2; NO20084795L; JP2009541208A; EP2012827A2; CN101622273A; US20100196377A1; AU2007238636A1; MX2008013121A; EP2407483A1; ZA200808669B; TNSN08401A1; MA30393B1; WO2007120787A3; CA2650126A1

Abstract

<B>MéTODOS PARA TRATAR, DIAGNOSTICAR OU DETECTAR CáNCER.<D> A invenção proporciona, inter alia, métodos para tratar câncer, composições para tratar câncer e métodos e composições para diagnosticar e/ou detectar câncer. Em particular, a presente invenção fornece composições e métodos para tratar, diagnosticar e detectar cânceres associados com a superexpressão de LIV-1.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA TRATAR, DIAGNOSTICAR OU DETECTAR CÂNCER"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se geralmente ao campo de oncolo-gia. Mais particularmente, a invenção refere-se a métodos para tratar câncer,composições para tratar câncer e métodos e composições para diagnosticare/ou detectar câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Câncer é a segunda maior causa de morte nos Estados Unidosda América. Embora "câncer" seja usado para descrever muitos tipos dife-rentes de câncer, isto é, de mama, de próstata, de pulmão, de cólon, depâncreas, cada tipo de câncer difere tanto em nível fenotípico como no nívelgenético. A característica de crescimento não regulado de câncer ocorrequando a expressão de um ou mais genes se torna desregulado devido amutações e o crescimento celular não pode mais ser controlado.

Genes são freqüentemente classificados em duas classes, on-cogenes e genes supressores de tumor. Oncogenes são genes cuja funçãonormal é promover o crescimento celular, mas apenas sob condições espe-cíficas. Quando um oncogene ganha uma mutação e então perde tal contro-le, ele promove crescimento sob quaisquer condições. Entretanto, descobriu-se que para o câncer ser verdadeiramente promissor, ele também deve ad-quirir mutações em genes supressores de tumor. A função normal de genessupressores de tumor é parar o crescimento celular. Exemplos de supresso-res de tumor incluem p53, p16, p21 e APC, todos os quais, quando agemnormalmente, impedem que uma célula se divida e cresça incontrolavelmen-te. Quando um supressor de tumor é mutado ou perdido, tal trava no cresci-mento celular também é perdida, permitindo que as células agora cresçamsem restrições.

Zinco é necessário para o crescimento celular e é um co-fatorpara mais de 300 enzimas. Zinco está envolvido no metabolismo de proteí-nas, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídeos. Zinco também tem uma fun-ção importante no controle de transcrição gênica, crescimento, desenvolvi-mento e diferenciação (Vallee e Falchuk (1993) Physiol. Rev. 73, 79-118).Em mamíferos, a deficiência de zinco pode ser prejudicial, causando atrofiano crescimento e sérios distúrbios metabólicos (Truong-Tran et at., (2001)Biometals 14: 315-330). Um excesso de zinco também pode ser tóxico paracélulas (Koh et ai, (1996) Science 272: 1013-1016). Zinco não pode difundir-se passivamente através de membranas celulares. Conseqüentemente, pro-teínas transportadoras de zinco específicas são requeridas para transportarzinco às células. Como zinco é essencial para o crescimento celular, trans-portadores de zinco têm uma função importante na manutenção do equilíbriocelular entre apoptose e crescimento celular. Aberrações no equilíbrio pode-riam levar ao câncer (Taylor etal., Biochem. J. (2003) 375: 51-59).

Eucariotos têm muitos transportadores de zinco diferentes. Atéhoje, os transportadores de zinco mais estudados pertenciam às famílias detransportadores ZIP, ou CDF (família de difusão de cátion). TransportadoresZIP ou estão situados na membrana plasmática e agem como transportado-res de influxo de zinco ou estão situados nas membranas intracelularespermitindo que eles mobilizam estoques a partir dessas estruturas. A famíliaZIP consiste em pelo menos 86 membros e pode ser dividido em quatro sub-famílias separadas; subfamília ZIP I (com 1 membro humano conhecido),subfamília ZIP Il (com 3 membros humanos conhecidos), subfamília gufa(com 2 membros humanos conhecidos) e a subfamília LIV-1 (com 9 mem-bros humanos conhecidos) (Gaiher e Eide (2001), Biometals 14: 251-270).

LIV-1, também conhecido como Zip6, é um transportador de zin-co que foi identificado como um gene cuja expressão é estimulada por tra-tamento por estrogênio de certas células de câncer de mama (Manning etai, (1988) Mol. Cell. Endocrinol. 59: 205-212). Demonstrou-se que LIV-1 per-tence a uma subfamília de transportadores de zinco ZIP (proteínas seme-lhantes a lrt, Zrt), denominada LZT (subfamília LIV-1 de transportadores dezinco ZIP) (Taylor e Nicholson (2003), Biochim. Biophys. Acta Biomembr.1611: 16-30). Esses transportadores contém um potencial domínio de meta-Ioprotease similar ao domínio presente em metaloproteases de matriz quetêm uma função conhecida em metástase (ltoh e Nagase, (2002), EssaysBiochem. 38: 21-36). A expressão de mRNA de LIV-1 mostra uma associa-ção com a disseminação de câncer de mama para os Iinfonodos regionais. Aestrutura de LIV-1 revela que ele é rico em histidina e tem pelo menos o po-tencial para se ligar e/ou transportar íons de Zn2+ (Taylor (2000) ZUBMB Life49:249-253.

Gastrulação vertebrada é uma etapa crítica no estabelecimentodo plano corporal. A transição epitélio-mesenquimal (EMT) ocorre durantea gastrulação. EMT é um dos eventos centrais do desenvolvimento embrio-nário, regeneração de órgãos e tecidos e metástase de câncer. Transdutorese ativadores de sinal de transcrição (STATs) mediam ações biológicas inclu-indo proliferação, diferenciação e sobrevivência celular em resposta a citoci-nas e fatores de crescimento, em uma variedade de processos biológicos.STATs também são importantes em EMT durante gastrulação, organogêne-se, cicatrização de feridas e progressão de câncer. STAT3 demonstrou serativada durante gastrulação de peixe-zebra e sua atividade é essencial paramovimentos de gastrulação. Os mecanismos moleculares da ação de STATem EMT, entretanto, não foram completamente elucidados. LIV1 é um alvo ajusante de STAT3 em EMT e também é importante na localização nuclear daproteína dedo de zinco Snail, um regulador mestre de EMT.

Até hoje, entretanto, a função de LIV-1 em câncer não foi com-pletamente elucidada. Há uma necessidade de identificar composições emétodos que modulem LIV-1. A presente invenção está direcionada a essas,assim como outras, necessidades importantes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em alguns aspectos, a presente invenção provê composiçõescompreendendo um modulador LIV-1 e um ou mais veículos farmaceutica-mente aceitáveis. Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é umRNA de duplo filamento filamento isolado (dsRNA). Em algumas modalida-des, o modulador de LIV-1 é um oligonucleotídeo isolado compreendendopelo menos 10 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é um anticorpo que seliga a um epítopo em um domínio de LIV-1 selecionado do grupo que consis-te no domínio extracelular N-terminal de LIV-1, no domínio extracelular deLIV-1 entre domínios transmembranares (TM) 2&3, no domínio extracelularde LIV-1 entre TM 4&5, no domínio extracelular de LIV-1 entre TM 6&7 e nodomínio extracelular C-terminal de LIV-1. Em algumas modalidades, o modu-lador de LIV-1 é um dsRNA, siRNA, shRNA ou um oligonucleotídeo anti-sentido.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paratratar câncer ou um sintoma de câncer em um paciente em necessidadedestes compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um modulador de LIV-1.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paramodular uma atividade biológica relacionada a LIV-1 em um paciente com-preendendo administrar ao paciente uma quantidade de um modulador deLIV-1 eficaz para modular a atividade biológica relacionada a LIV-1.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paraidentificar um paciente suscetível a terapia de LIV-1 compreendendo detec-tar a presença ou ausência de expressão diferencial de LIV-1 em uma amos-tra de paciente, administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de mo-dulador de LIV-1 ao paciente se o paciente for um candidato a terapia deLIV-1 e administrar uma terapia de câncer convencional ao paciente se opaciente não for um candidao para terapia de LIV-1.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos parainibir crescimento de células cancerosas que expressam LIV-1 compreen-dendo por em contato uma quantidade de um modulador de LIV-1 eficaz pa-ra inibir crescimento das células com as células.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos parainibir um fenótipo de célula cancerosa em uma população de células expres-sando LIV-1 compreendendo administrar à população de células uma quan-tidade de um modulador de LIV-1 eficaz para inibir o fenótipo de célula can-cerosa.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paradetectar uma ou mais células cancerosas expressando LIV-1 em uma amos-tra compreendendo por em contato a amostra com uma composição com-preendendo um modulador LIV-1 ligado a um agente de visualização e de-tectando a localização do agente de visualização na amostra.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos parainibir a interação de duas ou mais células, pelo menos uma de tais célulasexpressando LIV-1, compreendendo administrar uma quantidade eficaz deum modulador de LIV-1 a uma amostra compreendendo as células.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paraexpressar um anticorpo anti-LIV-1 em uma célula CHO ou de mieloma. Emalgumas modalidades, o anticorpo anti-LIV-1 inibe uma ou mais atividadesbiológicas relacionadas a LIV-1. Em algumas modalidades, o método com-preende expressar um ácido nucléico codificando o anticorpo anti-LIV-1 emuma célula CHO ou de mieloma.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paraidentificar um inibidor de câncer, compreendendo por em contato uma célulaexpressando LIV-1 com um composto candidato e um Iigante de LIV-1 e de-terminar se uma atividade de transporte de zinco relacionada a LIV-1 é inibi-da. Em algumas modalidades, inibição da atividade de transporte de zincorelacionada a LIV-1 é indicativo de um inibidor de câncer.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paraidentificar um inibidor de câncer compreendendo por em contato uma célulaexpressando LIV-1 com um composto candidato e um Iigante de LIV-1 e de-terminar se um marcador a jusante de LIV-1 é inibido. Em algumas modali-dades, inibição do marcador a jusante é indicativo de um inibidor de câncer.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paradeterminar a suscetibilidade de um paciente a um modulador de LIV-1 com-preendendo detectar evidência de expressão diferencial de LIV-1 na citadaamostra de câncer do paciente. Em algumas modalidades, evidência de ex-pressão diferencial de LIV-1 é indicativo da suscetibilidade do paciente a ummodulador de LIV-1.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos parapurificar a proteína LIV-1 de uma amostra compreendendo proteína LIV-1compreendendo prover uma matriz de afinidade compreendendo um anti-corpo de LIV-1 ligado a um suporte sólido, por em contato a amostra com amatriz de afinidade para formar um complexo matriz de afinidade-proteínaLIV-1; separar o complexo matriz de afinidade-proteína LIV-1 do restante daamostra e liberar proteína LIV-1 da matriz de afinidade.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paradistribuir um agente citotóxico ou um agente de diagnóstico a uma ou maiscélulas que expressam LIV-1, o método compreendendo prover o agentecitotóxico ou o agente de diagnóstico conjugado a um anticorpo de LIV-1 oufragmento deste e expor a célula ao conjugado anticorpo-agente ou frag-mento-agente.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paradeterminar o prognóstico de um paciente com câncer compreendendo de-terminar a razão de LIV-1-delta sobre LIV-1 em uma amostra do paciente.Em algumas modalidades, a razão de LIV-1-delta sobre LIV-1 é usada paradeterminar o prognóstico do paciente com câncer.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paradeterminar o prognóstico de um paciente com câncer compreendendo a pre-sença ou ausência de LIV-1 ligado à membrana plasmática de uma célulaem uma amostra do paciente. Em algumas modalidades, a ausência de LIV-1 ligado à membrana plasmática de uma célula em uma amostra do pacienteindica um bom prognóstico para o paciente.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê composiçõescompreendendo um modulador de proteína transportadora de zinco e um oumais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, aproteína transportadora de zinco é um RNA de duplo filamento filamento iso-lado (dsRNA). Em algumas modalidades, a proteína transportadora de zincoé um oligonucleotídeo isolado compreendendo pelo menos 10 nucleotídeosconsecutivos de uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQID NOS: 383-385. Em algumas modalidades, a proteína transportadora dezinco é um anticorpo que se liga a um epítopo em um domínio da proteínatransportadora de zinco selecionado do grupo que consiste no domínio ex-tracelular N-terminal, no domínio extracelular entre domínios transmembra-nares (TM) 2&3, no domínio extracelular entre TM 4&5, no domínio extrace-lular entre TM 6&7 e no domínio extracelular C-terminal. Em algumas moda-lidades, a proteína transportadora de zinco é SLC39A10, SLC39A11 ou S-LC39A13.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paratratar câncer ou um sintoma de câncer em um paciente em necessidadedestes compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um modulador de proteína transportadora de zinco.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paramodular uma atividade biológica relacionada a proteína transportadora dezinco em um paciente compreendendo administrar ao paciente uma quanti-dade de um modulador de proteína transportadora de zinco eficaz para mo-dular a atividade biológica relacionada a proteína transportadora de zinco.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos parainibir crescimento de células cancerosas que expressam proteína transpor-tadora de zinco compreendendo por em contato uma quantidade de um mo-dulador de proteína transportadora de zinco eficaz para inibir crescimentodas células com as células.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paradetectar uma ou mais células cancerosas expressando uma proteína trans-portadora de zinco em uma amostra compreendendo a amostra com umacomposição compreendendo um modulador proteína transportadora de zincoligado a um agente de visualização e detectando a localização do agente devisualização na amostra.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos parainibir a interação de duas ou mais células, pelo menos uma de tais célulasexpressando proteína transportadora de zinco, compreendendo administraruma quantidade eficaz de um modulador de proteína transportadora de zincoa uma amostra compreendendo as células.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paraidentificar um inibidor de câncer, o câncer sendo caracterizado pela super-expressão de uma proteína transportadora de zinco em comparação com umcontrole. Em algumas modalidades, os métodos compreendem por em con-tato uma célula expressando uma proteína transportadora de zinco com umcomposto candidato e um Iigante de proteína transportadora de zinco e de-terminar se atividade de transporte de zinco é inibida. Em algumas modali-dades, inibição da atividade de transporte de zinco é indicativo de um inibi-dor de câncer.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paraidentificar um inibidor de câncer, o câncer sendo caracterizado pela super-expressão de uma proteína transportadora de zinco em comparação com umcontrole. Em algumas modalidades, os métodos compreendem por em con-tato uma célula expressando uma proteína transportadora de zinco com umcomposto candidato e um Iigante de proteína transportadora de zinco e de-terminar se um marcador a jusante da proteína transportadora de zinco éinibido. Em algumas modalidades, inibição do marcador a jusante é indicati-vo de um inibidor de câncer.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paradeterminar a suscetibilidade de um paciente a um modulador de proteínatransportadora de zinco compreendendo detectar evidência de expressãodiferencial de proteína transportadora de zinco na citada amostra de câncerdo paciente. Em algumas modalidades, evidência de expressão diferencialde proteína transportadora de zinco é indicativo da suscetibilidade do paci-ente a um modulador de proteína transportadora de zinco.

Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos parapurificar uma proteína transportadora de zinco de uma amostra compreen-dendo uma ou mais proteínas transportadoras de zinco, compreendendoprover uma matriz de afinidade compreendendo um anticorpo de proteínatransportadora de zinco ligado a um suporte sólido, por em contato a amos-tra com a matriz de afinidade para formar um complexo matriz de afinidade-proteína transportadora de zinco, separar o complexo matriz de afinidade-proteína transportadora de zinco do restante da amostra e liberar proteínatransportadora de zinco da matriz de afinidade.Em alguns aspectos, a presente invenção provê métodos paradistribuir um agente citotóxico ou um agente de diagnóstico a uma ou maiscélulas que expressam proteína transportadora de zinco, o método compre-endendo prover o agente citotóxico ou o agente de diagnóstico conjugado aum anticorpo de proteína transportadora de zinco ou fragmento deste e ex-por a célula ao conjugado anticorpo-agente ou fragmento-agente.

Esses e outros aspectos da presente invenção serão elucidadosna seguinte descrição detalhada da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 retrata a expressão de proteína LIV-1 em várias a-mostras de câncer. Painéis à esquerda retratam câncer ER-positivo, ER-negativo e de mama metastático. A coloração da membrana plasmática évisível em tecidos cancerosos no painel da direita. O painel à direita embaixoretrata uma camada confocal em células não permeabilizadas.

A Figura 2 retrata o nocaute da proteína LIV-1 por siRNAs es-pecíficos para LIV-1.

A Figura 3 retrata a inibição de crescimento, proliferação e so-brevivência de célula cancerosa por siRNAs específicos para LIV-1 em célu-las cancerosas.

A Figura 4 retrata a ativação de caspase induzida por nocautede LIV-1 por siRNAs específicos para LIV-1 em células cancerosas.

A Figura 5 retrata o efeito de siRNAs específicos para LIV-1 naproliferação, atividade de caspase e níveis de mRNA de LIV-1 em célulasnormais.

A Figura 6 retrata a redução de níveis de ciclina D1 em célulascancerosas por siRNAs específicos para LIV-1 em células cancerosas.

A Figura 7 retrata a redução de níveis de zinco citoplasmáticopor anticorpos específicos de LIV-1.

A Figura 8 retrata a expressão de LIV-1 em células normais ecancerosas.

A Figura 9 retrata os efeitos do nocaute de LIV-1 em célulasMCF7 induzindo efeitos em proliferação celular, crescimento em ágar semi-sólido, expressão proteica e sobrevivência.

A Figura 10 retrata a redução de níveis de zinco citoplasmáticopor siRNAs específicos de LIV-1.

A Figura 11 retrata a redução de níveis de ciclina D1 após tra-tamento com anticorpos específicos de LIV-1.

A Figura 12 retrata uma representação gráfica da análise de mi-croarranjo (chip affy U133 plus 2) de tecidos cancerosos e normais analisa-dos usando LIV-1. Tipos de tecidos normais e cancerosos são dispostos aolongo do eixo horizontal. Tecidos cancerosos são marcador com um 'c', porexemplo, "c_duto_mamário" que representa uma amostra de tecido de cân-cer de mama e tecidos normais são de maneira similar representados comum 'n'. Os tipos de tecidos são marcados adicionalmente em relação ao tipoe subtipo do tecido, se for conhecido. Por exemplo "c_duto_mamário" é umtecido canceroso de um câncer de mama que estava localizado em uma du-to mamário. Se o subtipo não estiver claro durante a remoção cirúrgica oufor desconhecido, a marcação exprime 'ns' para 'não especificado'. Cadaponto nos eixos verticais representa uma amostra de tecido de um único pa-ciente e a altura de cada ponto nos eixos verticais (base de log2) representao nível de expressão relativa do probeset. Círculos cheios representam a-mostras com níveis de expressão na faixa de detecção linear. Círculos aber-tos representam um limite superior na expressão gênica em amostras ondeo gene estava abaixo do limite de detecção do probeset. Quadrados abertosrepresentam um limite inferior na expressão gênica em amostras ondo oprobeset estava saturado. (Brevemente, antes de realizar a análise, cadaprobeset é calibrado pela análise do comportamento de suas sondas consti-tuintes através de um grupo diverso, amplo de amostras. Esta calibraçãodetermina a sensibilidade relativa de cada sonda e a faixa de intensidadesdentro das quais a resposta de probeset é linear entre sondas. As intensida-des abaixo desta faixa são chamadas "não detectadas" enquanto aquelasacima dela são chamadas "sauradas". Devido à variação na hibridização eeficiência de marcação entre amostras, cada chip foi normalizado após apli-car-se as calibrações. Isto leva os limites superior e inferior da faixa, em ter-mos de expressão gênica, a variar um pouco de amostra para amostra).

A Figura 13 retrata uma representação gráfica da análise de mi-croarranjo (chip affy U133 plus 2) de tecidos cancerosos e normais analisa-dos usando SLC39A10. A informação de legenda de figura é como providopara a Figura 12, acima.

A Figura 14 retrata uma representação gráfica da análise de mi-croarranjo (chip affy U133 plus 2) de tecidos cancerosos e normais analisa-dos usando SLC39A11. A informação de legenda de figura é como providopara a Figura 12, acima.

A Figura 15 retrata uma representação gráfica da análise de mi-croarranjo (chip affy U133 plus 2) de tecidos cancerosos e normais analisa-dos usando SLC39A13. A informação de legenda de figura é como providopara a Figura 12, acima.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção provê métodos e composições para o tra-tamento, diagnóstico e visualização de câncer, em particular para o trata-mento, diagnóstico e visualização de câncer relacionado a LIV-1.

Os inventores do presente pedido descobriram, inter alia, queLIV-1 está superexpresso em vários cânceres, incluindo câncer de mama, erestringiu a expressão em tecidos normais. A inibição de LIV-1 inibe a prolife-ração de células cancerosas, mas não de células "normais" posivas paraLIV-1. Adicionalmente, foi demonstrado que a inibição de LIV-1 modula ní-veis de zinco citoplasmáticos assim como níveis de marcadores a jusanteincluindo, por exemplo, ciclina D1 e MT1-MMP. Esses e outros aspectos dapresente invenção são providos no presene pedido.

Definições

Várias definições são usadas em todo este documento. A maio-ria das palavras tem o significado que poderia ser atribuído àquelas palavraspor alguém versado na técnica. Palavras especificamente definidas abaixoou em outro lugar neste documento têm o significado provido no contexto dapresente invenção assim como um todo e são como tipicamente entendidopor aqueles versados na técnica.A prática da presente invenção empregará, a menos que indica-do de outro modo, métodos convencionais de química, bioquímica, biologiamolecular, imunologia e farmacologia, dentro da perícia da técnica. Tais téc-nicas são explicadas completamente na literatura. Veja, por exemplo, Re- mington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição (Easton, Pensilvânia: MackPublishing Company, 1990); Methods in Enzymology (S. Colowick e N. Ka-plan, eds., Academic Press, Inc.); e Handbook of Experimental Immunology,Vols. I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Pu-blications); e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2aedição, 1989).

Conforme aqui utilizado, as formas singulares "um(a)" e "o(a)"incluem referências plurais a menos que o conteúdo indique claramente deoutro modo. Assim, por exemplo, referência a "um anticorpo" inclui uma mis-tura de dois ou mais anticorpos. Conforme aqui utilizado, o termo "cerca de" refere-se a +/-20%,+/-10% ou +/-5% de um valor.

Conforme aqui utilizado, os termos "proteína transportadora dezinco" ou "transportador de zinco" se refere a uma molécula biológica quemostra características estruturais de transportadores de zinco. Em algumas modalidades, proteínas transportadoras de zinco incluem LIV-1, SLC39A13,SLC39A11 e SLC39A10.

Conforme aqui utilizado, o termo "LIV-1", também conhecidocomo Zip6, se refere a um transportador de zinco que pertence a uma sub-família de transportadores de zinco ZIP, denominada LZT. No GeneCard LIV- 1 também é referido como SLC39A6 (família de veículo de solut 39 (trans-portador de zinco), membro 6). Uma seqüência nucleotídica de LIV-1 é ex-posta como SEQ ID NO: 1 e uma seqüência de aminoácidos de LIV-1 é ex-posta como SEQ ID NO: 2. Embora para fins de brevidade; a presente in-venção seja exemplificada amplamente em termos de LIV-1, entende-se que definições e modalidades direcionadas a LIV-1 também possam ser usadaspara outros transportadores de zinco descritoos aqui.

Conforme aqui utilizado, o termo "LIV-1-delta" se refere a umavariedade de LIV-1 que carece de pelo menos uma porção da extremidadeamino-terminal quando comparada a LIV-1. Uma seqüência polipeptídica deLIV-1-delta é exposta como SEQ ID NO: 365.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados alternadamen-te e referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer com-primento, o que inclui aminoácidos codificados e não codificados, aminoáci-dos modificados quimicamente ou bioquimicamente ou derivados e polipep-tídeos que têm estruturas peptídicas modificadas. O termo inclui proteínasde fusão, incluindo, mas não limitando a, proteínas de fusão com uma se-qüência de aminoácidos heterólogos, fusões com seqüências líderes heteró-logas e homólogas, com ou sem resíduos de metionina N-terminais; proteí-nas imunologicamente marcadas e semelhantes.

Os termos "indivíduo", "hospedeiro(a)" e "paciente" são usadosalternadamente e referem-se a qualquer indivíduo para o qual seja desejadodiagnóstico, tratamento ou terapia, particularmente humanos. Outros indiví-duos podem incluir gado, cachorros, gatos, porquinho-da-índia, coelhos, ra-tos, camundongos, cavalos e semelhantes. Em algumas modalidades prefe-ridas o indivíduo é um humano.

Conforme aqui utilizado, "câncer" se refere a cânceres primáriosou metastáticos. O termo "células cancerosas" se refere a células que sertãotransformadas. Essas células podem ser isoladas de um paciente que tenhacâncer, ou podem ser células que são transformadas in vitro para tornarem-se cancerosas. Células cancerosas podem ser derivadas de muitos tipos deamostras incluindo qualquer tecido ou linhagem de cultura de células. Emalgumas modalidades, as células cancerosas são hiperplasias, células tumo-rais ou neoplasmas. Em algumas modalidades, as células cancerosas sãoisoladas de câncer de mama, câncer de pele, câncer de esôfago, câncerhepático, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cer-vical, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de ovário, mieloma múlti-plo e melanoma. Em algumas modalidades, as células cancerosas são to-madas a partir de linhagens celulares estabelecidas que estão publicamentedisponíveis. Em algumas modalidades, as células cancerosas são isoladasde amostras de pacientes pré-existentes ou de bibliotecas compreendendocélulas cancerosas. Em algumas modalidades, as células cancerosas sãoisoladas e então implantadas em um hospedeiro diferente, por exemplo, emum xenoenxerto. Em algumas modalidades, células cancerosas são trans-plantadas e usadas em um modelo de camundongo SCID. Em algumas mo-dalidades, o câncer é câncer de mama.

Conforme aqui utilizado, o termo "transformado(a)" se refere aqualquer alteração nas propriedades de uma célula que é estavelmente her-dada por sua progênie. Em algumas modalidades, "transformado(a)" se refe-re a uma mudança de célula normal para uma célula cancerosa, por exem-plo, uma que é capaz de causar tumores. Em algumas modalidades, umacélula transformada é imortalizada. A transformação pode ser causada porvários fatores, incluindo superexpressão de um receptor na ausência de fos-forilação de receptor, infecção viral, mutações em oncogenes e/ou genessupressores de tumor e/ou qualquer outra técnica que altere as propriedadesde imortalização e/ou crescimento de uma célula.

"Fenótipo canceroso" geralmente se refere a quaisquer dentreuma variedade de fenômenos biológicos que são característicos de uma cé-lula cancerosa, tais fenômenos podem variar com o tipo de câncer. O fenóti-po canceroso geralmente é identificado por anormalidades em, por exemplo,crescimento celular ou proliferação (por exemplo, proliferação ou crescimen-to descontrolado), regulação do ciclocelular, mobilidade celular, interaçãocélula-célula ou metástase, ou semelhantes.

Conforme aqui utilizado, o termo "metástase" se refere a umcâncer que se espalhou para um sítio distante da origem do câncer, por e-xemplo, do tumor primário. Sítios de metástase incluem sem limitação, o os-so, linfonodos, pulmão, fígado e cérebro.

Conforme aqui utilizado, o termo "angiogênese" se refere ao de-senvolvimento de vasos sangüíneos em um paciente.

Conforme aqui utilizado, o termo "endpoint clínico" se refere aum evento mensurável indicativo de câncer. Endpoints clínicos incluem semlimitação, tempo até uma primeira metástase, tempo até a metástase subse-qüente, tamanho e/ou número de metástases, tamanho e/ou número de tu-mores, localização de tumores, agressividade de tumores, qualidade de vida,dor e semelhantes. Aqueles versados na técnica acreditam na habilidade dedeterminar e medir endpoints clínicos. Métodos para medir endpoints clínicossão conhecidos por aqueles versados na técnica.

Conforme aqui utilizado, o termo "amostra" se refere a materialbiológico de um paciente. A amostra avaliada pela presente invenção nãoestá limitada a qualquer tipo particular. Amostras incluem, como exemplosnão limitantes, células únicas, células múltiplas, tecidos, tumores, fluidosbiológicos, moléculas biológicas, ou sobrenadantes ou extratos de quaisquerdos antecedentes. Exemplos incluem amostras de tecido removido para bi-ópsia, tecido removido durante resseção, sangue, urina, tecido linfático, flui-do linfático, líquido cerebro-espinhal, mucosa e fezes. A amostra usada vari-ará com base no formato de ensaio, no método de detecção e na naturezados tumores, tecidos, células ou extratos a serem avaliados. Métodos parapreparar amostras são bem-conhecidos na técnica e podem ser prontamenteadaptados a fim de obter uma amostra que é compatível com o método utili-zado.

Conforme aqui utilizado, o termo "molécula biológica" inclui, masnão está limitado a, polipeptídeos, ácidos nucléicos e sacarídeos.

Conforme aqui utilizado, o termo "modular" se refere a uma mu-dança na qualidade ou quantidade de um gene, proteína ou qualquer molé-cula que esteja dentro, fora ou na superfície de uma célula. A mudança podeser um aumento ou diminuição na expressão ou nível da molécula. O termo"modular" também inclui mudança na qualidade ou quantidade de uma fun-ção/atividade biológica incluindo, sem limitação, sinalização célula-a-célula,sinalização intracelular, apoptose, sobrevivência celular, adesão, crescimen-to e proliferação celular e semelhantes.

Conforme aqui utilizado, o termo "modulador" se refere a umacomposição que modula um ou mais eventos fisiológicos ou bioquímicosassociados com câncer. Em algumas modalidades, o modulador inibe umaou mais atividades biológicas associadas com câncer. Em algumas modali-dades, o modulador é uma molécula pequena, um anticorpo, um mimético,um isca ou um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o modulador agepelo bloqueio da ligação de Iigante ou pela competição por um sítio de liga-ção a ligante. Em algumas modalidades, o modulador age independente-mente da ligação de ligante. Em algumas modalidades, o modulador nãocompete por um sítios de ligação a ligante. Em algumas modalidades, o mo-dulador bloqueia a expressão de um produto gênico envolvido em câncer.Em algumas modalidades, o modulador bloqueia uma interação física deduas ou mais biomoléculas envolvidas em câncer. Em algumas modalida-des, moduladores da invenção inibem uma ou mais atividades biológicas deLIV-1 selecionadas do grupo que consiste em crescimento de célula cance-rosa, sobrevivência de célula cancerosa, metástase de célula cancerosa,migração celular, angiogênese, sinalização de LIV-1, adesão célula-célulamediada por LIV-1, interação célula-célula, interação de membrana célula-célula mediada por LIV-1, interação matriz extracelular-célula mediada porLIV-1, atividades mediadas por integrina, expressão de superfície de LIV-1,degradação matriz extracelular-célula mediada por LIV-1, fosforilação deEGFR e localização nuclear de Snail. Em algumas modalidades, o modula-dor de LIV-1 inibe a expressão de LIV-1.

Um "produto gênico" é um produto biopolimérico que é expres-sado ou produzido por um gene. Um produto gênico pode ser, por exemplo,um RNA que não sofre splicing, um mRNA, uma variedade ("splice veriante")de mRNA, um polipeptídeo, m polipeptídeo modificado pós-transducionalmente, um polipeptídeo variedade de splicing, etc. Tambémabrangido por este termo são produtos biopoliméricos que são feitos usandoum produto gênico de RNA como um molde (isto é, cDNA do RNA). Um pro-duto gênico pode ser feito enzimaticamente, recombinantemente, quimica-mente ou dentro de uma célula da qual o gene é nativo. Em algumas moda-lidades, se o produto gênico é proteináceo, ele exibe uma atividade biológi-ca. Em algumas modalidades, se o produto gênico é um ácido nucléico, elepode ser traduzido em um produto gênico proteináceo que exibe uma ativi-dade biológica."Modulação de atividade de LIV-1", conforme aqui utilizado, se

refere a um aumento ou diminuição na atividade de LIV-1 que pode ser umresultado de, por exemplo, interação de um agente com um polinucleotídeoou polipeptídeo de LIV-1, inibição de transcrição e/ou tradução de LIV-1 (porexemplo, através de interação de siRNA ou anti-sentido com o gene de LIV-1ou transcrito de LIV-1, através de modulação de fatores de transcrição quefacilitam a expressão de LIV-1) e semelhantes. Por exemplo, a modulaçãode uma atividade biológica se refere a um aumento em uma atividade bioló-gica ou uma diminuição em uma atividade biológica. A modulação de ativi-dade de LIV-1 que resulta em uma diminuição de atividade de LIV-1 é departicular interesse na presente invenção. A atividade de LIV-1 pode ser es-timada por meio da, incluindo, sem limitação, avaliação atividade de trans-porte de zinco, estimativa de níveis polipeptídicos de LIV-1, ou pela estimati-va de níveis de transcrição de LIV-1. Comparações de atividade de LIV-1também podem ser realizadas pela medição de níveis de um marcador ajusante de LIV-1, medição de inibição de sinalização por LIV-1, medição deinibição de adesão celular mediada por LIV-1, medição de ativação de apop-tose celular mediada por IIV-1, medição de inibição de crescimento de célulacancerosa, medição de inibição de formação de tumor, medição de inibiçãode produção de ciclina, medição de inibição de produção de fibronectina emedição de inibição de transporte de zinco.

Conforme aqui utilizado, o termo "inibe" se refere a uma redu-ção, diminuição, inativação ou regulação para baixo de uma atividade ouquantidade. Por exemplo, no contexto da presente invenção, moduladoresde Liv-1 podem inibir um ou mais de crescimento de célula cancerosa, for-mação de tumor, proliferação de célula cancerosa, sobrevivência de célulacancerosa, metástase de célula cancerosa, migração celular, angiogênese,sinalização de LIV-1, adesão célula-célula mediada por LIV-1, interação célu-la-célula, interação de membrana célula-célula mediada por LIV-1, interaçãomatriz extracelular-célula mediada por LIV-1, atividades mediadas por inte-grina, expressão em superfície de LIV-1, degradação de matriz extracelular-célula mediada por LIV-1, localização nuclear de Snail e expressão de LIV-1.Moduladores de LIV-1 também podem inibir ciclina D1, fibronectina, RhoB,MT1-MMP, FGF, CDK4, VEGF, EGFR, fosforilação de EGFR1 um ou maisgenes na via de SNAIL. Moduladores de LIV-1 também podem inibir trans-porte de zinco e em algumas modalidades podem reduzir níveis de zincocitoplasmáticos. A inibição pode ser de pelo menos 25%, pelo menos 50%,pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelomenos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo me-nos 99%, ou 100%, quando comparada a um controle.

Conforme aqui utilizado, o termo "expressado diferencialmenteem uma célula cancerosa" e "um polinucleotídeo que é expressado diferen-cialmente em uma célula cancerosa" são usados alternadamente aqui e sereferem a um polinucleotídeo que representa ou corresponde a um gene queé diferencialmente expressado em uma célula cancerosa quando comparadocom uma célula do mesmo tipo celular que não é cancerosa, por exemplo, édescoberto mRNA em níveis de pelo menos cerca de 25%, pelo menos cer-ca de 50% até cerca de 75%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cercade 1,5 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes,pelo menos cerca de 10 vezes, ou pelo menos cerca de 50 vezes ou mais,diferente (por exemplo, mais alto ou mais baixo). A comparação pode serfeita em tecido, por exemplo, se alguém está usando hibridização in situ ouum outro método de ensaio que permite algum grau de discriminação entretipos celulares no tecido. A comparação também pode ou senão ser feita en-tre células removidas da fonte tecidual delas, ou entre uma célula in situ euma segunda célula removida de sua fonte tecidual. Em algumas modalida-des, o gene é regulado para cima no gene canceroso quando comparado àcélula normal.

Um câncer associado a LIV-1 é "inibido" se pelo menos um sin-toma do câncer é aliviado, terminado, retardado ou prevenido. Conformeaqui utilizado, um câncer associado a LIV-1 também é "inibido" se a recor-rência ou metástase do câncer é reduzida, retardada, atrasada ou prevenida.

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe adesão celular mediadapor LIV-1" se refere à inibição ou abolição de adesão célula-célula na pre-sença de um inibidor de LIV-1 em que pelo menos uma célula expressa dife-rencialmente LIV-IvNeste contexto, a adesão celular mediada por LIV-1 po-de ser diminuída pelo inibidor de LIV-1 em pelo menos 25%, pelo menos50%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos95%, até 100% em relação à adesão celular mediada por LIV-1 na ausênciade um inibidor de LIV-1. Comparações de adesão celular mediada por LIV-1podem ser realizadas pela medição, por exemplo, pela marcação das célulasde interesse, incubação delas com uma população de células não marcadasque aderem a um substrato e lavagem para separar as populações aderen-tes das não aderentes. Desta maneira, a adesão celular é determinada pelamedição da quantidade de marcador retido no substrato. Exemplos de sis-temas de ensaio incluem, mas não estão limitados à marcação com sondasfluorescentes tal como calceína AM, CFMDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína), 5(6)-CFDA-SE [diacetato de 5-(e -6)-carboxifIuoresceína, éster de succinimidila] e medição de fluorescência emum leitor de placa de fluorescência ou através de citometria de fluxo.

Conforme aqui utilizada, a frase "apoptose de célula cancerosacrescente" se refere à apoptose crescente de células cancerosas que ex-pressam diferencialmente LIV-1 na presença de um inibidor de LIV-1. Nestecontexto, apoptose de célula cancerosa pode ser aumentada por inibidor deLIV-1 em pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, até 100% em relação à apoptosede célula cancerosa na ausência de um inibidor de LIV-1. Comparações deapoptose de célula cancerosa podem ser realizadas pela medição, por e-xemplo, de fragmentação de DNA, atividade de caspase, perda de potencialde membranan mitocondrial, produção aumentada de espécies de oxigênioreativo (ROS), acidificação intracelular, condensação de cromatina, níveis defosfatidil serina (PS) na superfície celular e permeabilidade de membranacelular aumentada.

A fragmentação de DNA pode ser medida, por exemplo, com oensaio TUNEL (marcação de extremidade de quebra de dUTP por transfera-se de desoxinucleotídeo terminal). Versões comerciais do ensaio estão am-j piamente disponíveis, por exemplo, kit para ensaio TUNEL APO-BrdU™ (In-vitrogen), kit APO-DIRECT™ (BD Biosciences Pharmingen) e kit de ensaiode fragmentação de DNA ApoAlert™ (Clontech, uma Companhia Takara Βί-ο).

A atividade de caspase pode ser monitorada através de substra-tos fluorigênicos, cromogênicos e Iuminescentes específicos para caspasesparticulares. Kits de ensaio comercial estão disponíveis para pelo menos ascaspases 1, 2, 3, 6, 7, 8 e 9. (Veja, por exemplo, Invitrogen, Chemicon, Cal-Biochem, BioSource International, Biovision).

Perda de potencial de membrana mitocondrial pode ser medidocom corantes fluorescentes que se acumulam diferencialmente em mitocôn-drias ativas saudáveis. Um exemplo não Iimitante é o sistema MitoTracker

Red da Invitrogen.

A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pode sermedida com corantes fluorescentes incluindo, por exemplo, H2DCFDA (Invi-trogen).

A acidificação intracelular pode ser medida com corantes fluo-rescentes ou cromogênicos.

A condensação da cromatina pode ser medida com corantes flu-orescentes incuindo, por exemplo Hoechst 33342.

Níveis de fosfatidil serina (PS) podem ser medidos na superfíciecelular. Por exemplo, Annexin V tem uma alta afinidade por PS. Em umero-sos ensaios disponíveis comercialmente são adequados para monitorar aligação de Annexin V marcada à superfície celular.

A permeabilidade de membrana celular pode ser medida usandocorantes, al como o corante fluorescente YO-PRO-1 (Invitrogen) que podeentrar em células apoptóticas, mas não em necróticas.

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe crescimento de célulacancerosa" se refere à inibição ou abolição de crescimento de célula cance-rosa na presença de um inibidor de Liv-1 em que a célula expressa diferen-cialmente LIV-1. Neste contexto, o crescimento de célula cancerosa pode serdiminuído por inibidor de LIV-1 em pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelomenos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, até 100%em relação ao crescimento de célula cancerosa na ausência de um inibidorde LIV-1. Comparações de crescimento de célula cancerosa podem ser rea-lizadas usando, por exemplo, ensaio de MTT (por exemplo, o kit de ensaiode proliferação celular de MTT Vybrant® (Invitrogen)); incorporação de BrdU(por exemplo, o ensaio Absolute-S SBIP (Invitrogen)); medição de níveis deATP intracelular (por exemplo, usando kit de ensaio ATPLite™-M, 1.000(PerkinELmer) ou kit de ensaio de viabilidade celular e ATP (BioVision)); en-saio DiOcI 8, um corante permeável à membrana (Invitrogen); ensaio de ati-vidade glicose-6-fosfato desidrogenase (por exemplo, o ensaio de citotoxici-dade Vibrant (Invitrogen)); ou medição de atividade de LDH celular.

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe formação de tumor" se re-fere à inibição ou abolição de formação de tumor na presença de um inibidorde LIV-1 em que o tumor compreende células que expressam diferencial-mente LIV-1. Neste contexto, a formação de tumor pode ser diminuída porum inibidor de LIV-1 em pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, até 100% emrelação à formação de tumor na ausência de um inibidor de LIV-1. Compara-ções de formação de tumor podem ser realizadas usando, por exemplo, en-saios baseados em célula (por exemplo formação de colônia em ágar maci-o); modelos in vivo de formação de tumor tipicamente baseados nà injeçãodas células de interesse em animais (por exemplo, camundongos ou ratosatímicos, camundongos ou ratos irradiados; inoculação em sítios imunologi-camente privilegiados tal como cérebro, bolsa jugal ou olho; inoculação deanimais singênicos) e monitoramento do tamanho da massa após um perío-do definido de tempo.

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe ciclina D1" se refere à i-nibição ou abolição de produção de ciclina mediada por LIV-1. Neste contex-to, a produção de ciclina mediada por LIV-1 pode ser diminuída por um a-gente inibitório em pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pe-lo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, até 100% em relação àprodução de ciclina mediada por LIV-1 na ausência de um inibidor de LIV-1.Comparações de produção de ciclina podem ser realizadas pela medição de,por exemplo, níveis de mRNA de ciclina através de RT-PCR ou transferênciade Northern; níveis polipeptídicos de ciclina através de imunotransferência,imunoprecipitação ou ELISA; ou usando ensaio funcionais, incluindo ensaios de co-imunoprecipitação para medir níveis de ciclina que estão complexadoscom reguladores de ciclina tal como quinases dependentes de ciclina(CDKs) usando, por exemplo, anticorpos que direcionam-se a CDK; p21WAF1, p27 KIP-1 e medição de fosforilação de ciclinas pelas CDKs pode seravaliada através de análise de imunoprecipitação e radiomarcação ou méto- dos baseados em FRET, por exemplo, kit de ensaio de CDK2/ciclina A (Mo-lecular Devices).

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe fosforilação de EGFR" serefere à inibição ou abolição de fosforilação de EGFR mediada por LIV-1.Neste contexto, a fosforilação de EGFR mediada por LIV-1 pode ser diminu- ida por um agente inibitório em pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo me-nos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, até 100%em relação à fosforilação de EGFR mediada por LIV-1 na ausência de uminibidor de LIV-1. Comparações de fosforilação de EGFR podem ser estima-das usando ensaio de fosforilação conhecidos por aqueles versados na téc- nica.

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe sobrevivência de célulacancerosa" se refere à inibição de sobrevivência de células cancerosas queexpressam LIV-1. Em algumas modalidades, o termo se refere à execuçãode apoptose de células cancerosas que expressam LIV-1. Neste contexto, a sobrevivência de célula cancerosa que expressa LIV-1 pode ser diminuídapor um agente inibitório em pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, até 100% emrelação à sobrevivência de célula cancerosa na ausência de um inibidor deLIV-1 e/o em uma célula normal.

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe atividades mediadas porintegrina" se refere à inibição de atividades relacionadas à integrina. Ativida-des mediadas por integrina incluem, sem limitação, adesão celular, quimio-taxia, proliferação, sobrevivência e formação de túbulo. Neste contexto, ati-vidades mediadas por integrina podem ser diminuídas por um agente inibitó-rio em pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, até 100% em relação às atividadesmediadas por integrina na ausência de um inibidor de LIV-1.

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe fibronectina" se refere àinibição de produção de fibronectina mediada por LIV-1. Neste contexto, aprodução de fibronectina mediada por LIV-1 pode ser diminuída por um a-gente inibitório em pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pe-lo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, até 100% em relação àprodução de fibronectina mediada por LIV-1 na ausência de um inibidor deLIV-1. Comparações de produção de fibronectina podem ser realizadas pelamedição, por exemplo, de níveis de mRNA de fibronectina através de RT-PCR ou transferência de Northern; níveis polipeptídicos de fibronectina atra-vés de imunotransferência, imunoprecipitação ou ELISA (por exemplo, o kitde ELISA para fibronectina (AMERICAN DIAGNOSTICA; usando ensaiosfuncionais para medir adesão celular a substratos revestidos com fibronecti-na. Veja, por exemplo, ensaio de adesão celular InnoCyte™ ECM, fibronec-tina (CaIbiochem) e QCMtm-FN [Ensaio de migração celular quantitativo -fibronectina (CHEMICON)].

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe transporte de zinco" serefere à inibição ou abolição de transporte de zinco mediado por LIV-1. Nes-te contexto, o transporte de zinco mediado por LIV-1 pode ser diminuído porum agente inibitório em pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, até 100% emrelação ao transporte de zinco mediado por LIV-1 na ausência de um inibidorde LIV-1. Comparações de transporte de zinco e determinação de níveis dezinco podem ser realizadas usando métodos conhecidos dos versados natécnica incluindo, por exemplo, medir a captação de 65Zn em células ou ve-sículas. (Veja, Kambe et ai, (2002) J. Biol. Chem., 277: 19049-19055); oumedir a captação do indicador de zinco fluorescente permeável à célula,Newport Green Diacetate (Molecular Probes). Reservatórios de zinco emfluidos corporais e meios condicionados por célula podem ser medidos, porexemplo, seguindo as discussões expostas em Zalewski et al. (BioTechni-ques, 2006, 40(4): 509-520).

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe sinalização de LIV-1" serefere à diminuição do efeito de LIV-1 em membros a jusante de cascatas desinalização celular que incluem LIV-1. Cascatas de sinalização celular queincluem LIV-1 incluem a via de SNAIL, entre outras. Em algumas modalida-des, a inibição da sinalização de LIV-1 regula para cima um ou mais marca-dores epiteliais na via de SNAIL. Em algumas modalidades, a inibição dasinalização de LIV-1 regula para baixo um ou mais marcadores mesenqui-mais na via de SNAIL. Em algumas modalidades, os marcadores epiteliaise/ou marcadores mesenquimais estão envolvidos em motilidade e sobrevi-vência celular. Em algumas modalidades, a modulação da sinalização deLIV-1 modula cascatas de sinalização associadas a Stat3. Em algumas mo-dalidades, os elementos da cascata de sinalização associada a Stat3 sãodistintos daqueles da cascata de sinalização associada a SNAIL. A inibiçãoda sinalização de LIV-1 pode ser determinada pela medição de níveis poli-peptídicos ou polinucleotídicos de membros a jusante da via de sinalizaçãocelular. Aqueles versados na técnica são creditados com a habilidade demedir níveis polipeptídicos e/ou polinucleotídicos de LIV-1. Os versados natécnica também podem medir níveis de marcadores a jusante de LIV-1.

Conforme aqui utilizada, a frase "inibe interação célula-célula" serefere à redução ou eliminação de uma interação entre duas ou mais célulasque expressam LIV-1. Em algumas modalidades, a interação entre as célu-Ias leva a um sinal celular. A interação célula-célula pode ser detectada atra-vés de vários métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, incluin-do, sem limitação, a observação de troca de membrana entre células co-cultivadas, pré-marcadas, marcadas, por exemplo, com diferentes corantesde membrana fluorescentes incluindo PKH26 e PKH67 (Sigma).

Um "marcador a jusante de LIV-1", conforme aqui utilizado, é umgene ou atividade que exibe nível de expressão alterado em um tecido can-ceroso ou célula cancerosa comparado com seu nível de expressão em teci-do normal ou saudável, ou é uma propriedade alterada na presença de ummodulador de LIV-1 (por exemplo, níveis de zinco citoplasmáticos). Em al-gumas modalidades, os marcadores a jusante exibem níveis alterados deexpressão quando LIV-1 é perturbado com um modulador da presente in-venção. Marcadores a jusante de LIV-1 incluem, sem limitação, ciclina D1,fibronectina, RhoB, MT1-MMP, FGF, CDK4, VEGF, EGFR, um ou mais genesna via de SNAIL, E-caderina, VE-caderina, Muc-1, claudina, ocludina, des-moplaquina, caspase, p21, p53, BID (agonista de morte que interage combcl), DFF40 (fator de fragmentação de DNA) e citoqueratina. Conforme dis-cutido acima, em algumas modalidades, um marcador a jusante de LIV-1 éum gene na via de Stat3.

Conforme aqui utilizado, o termo "regula para cima" se refere aum aumento, ativação ou estimulação de uma atividade ou quantidade. Porexemplo, no contexto da presente invenção, moduladores de LIV-1 podemaumentar um ou mais de E-caderina, VE-caderina, Muc-1, claudina, ocludi-na, desmoplaquina, caspase, p21, p53, BID (agonista de morte que interagecom bcl), DFF40 (fator de fragmentação de DNA) e citoqueratina. A regula-ção para cima pode ser de pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos250%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% quando comparada a umcontrole.

Conforme aqui utilizado, o termo "N-terminal" se refere aos pri-meiros 10 aminoácidos de uma proteína.

Conforme aqui utilizado, o termo "C-terminal" se refere aos últi-mos 10 aminoácidos de uma proteína.

O termo "domínio" conforme aqui utilizado se refere a uma parteestrutural de uma biomolécula que contribui com uma função conhecida oususpeita da biomolécula. Domínios podem ser co-extensivos com regiões ouporções desses e também podem incorporar uma porção de uma biomolécu-la que é distinta de uma região particular, além do todo ou parte dessa regi-ão.

Conforme aqui utilizado, o termo "domínio extracelular" se refereà porção de um molécula que está do lado de fora ou é externa a uma célu-la. No contexto da presente invenção, um domínio extracelular N-terminal serefere ao domínio extracelular que está presente na extremidade N-terminalda molécula imediatamente antes do primeiro domínio transmembranar. Nocontexto de domínio extracelular entre dois domínios transmembranares(TM), por exemplo entre TM 2&3, domínio extracelular se refere àquela por-ção de LIV-1 externa à membrana celular entre o segundo e terceiro domíniotransmembranar de LIV-1.

Conforme aqui utilizado, o termo "domínio de ligação a ligante"se refre a qualquer porção ou região de um receptor que retém pelo menosuma atividade de ligação qualitativa de uma seqüência nativa corresponden-te de LIV-1.

O termo "região" se refere a uma porção fisicamente contíguada estrutura primária de uma biomolécula. No caso de proteínas, uma regiãoé definida por uma porção contígua da seqüência de aminoácidos daquelaproteína. Em algumas modalidades, uma "região" está associada com umafunção da biomolécula.

O termo "fragmento" conforme aqui utilizado se refere a umaporção fisicamente contígua da estrutura primária de uma biomolécula. Nocaso de proteínas, uma porção é definida por uma porção contígua da se-qüência de aminoácidos daquela proteína e se refere a pelo menos 3-5 ami-noácidos, pelo menos 8-10 aminoácidos, pelo menos 11-15 aminoácidos,pelo menos 17-24 aminoácidos, pelo menos 25-30 aminoácidos e pelo me-nos 30-45 aminoácidos. No caso de oligonucleotídeos, uma porção é defini-da por uma porção contígua da seqüência de ácido nucléico daquele oligo-nucleotídeo e se refere a pelo menos 9-15 nucleotídeos, pelo menos 18-30nucleotídeos, pelo menos 33-45 nucleotídeos, pelo menos 48-72 nucleotí-deos, pelo menos 75-90 nucleotídeos e pelo menos 90-130 nucleotídeos.Em algumas modalidades, porções de biomoléculas têm uma atividade bio-lógica. No contexto da presente invenção, fragmentos polipeptídicos de IIV-1não compreendem a seqüência polipeptídica inteira de LIV-1 exposta emSEQ ID NO: 2.Conforme aqui utilizada, a expressão "células/tumores/amostrasrelacionadas a LIV-1" e semelhantes se referem a células, amostras, tumo-res ou outras patologias que são caracterizadas por expressão diferencial deLIV-1 em relação a células, amostras, tumores ou outras patologias não-cancerosas e/ou não metastáticas. Em algumas modalidades, células, amos-tras, tumores ou outras patologias relacionadas a LIV-1 são caracterizadosevidência aumentada de expressão de LIV-1 em relação a células, amostras,tumores ou outras patologias não metastáticas.

Conforme aqui utilizado, o termo "anticorpo" se refere a anticor- pos monoclonais e policlonais, anticorpos de cadeia única, anticorpos quimé-ricos, anticorpos bifuncionais/biespecíficos, anticorpos humanizados, anti-corpos humanos e anticorpos enxertados com região de determinante decomplementaridade (CDR), que são específicos para a proteína alvo oufragmentos desta. O termo "anticorpo" inclui adicionalmente transferência degene de anticorpo terapêutica in vivo. Fragmentos de anticorpo, incluindoFab, Fab1, F(ab')2, scFv e Fv também são providos pela invenção.

Conforme aqui utilizado, o termo "epítopo" se refere a um de-terminante antigênico de um polipeptídeo. Em algumas modalidades, umepítopo pode compreender 3 ou mais aminoácidos em uma conformaçãoespacial que é única ao epítopo. Em algumas modalidades, epítopos sãoepítopos lineares ou conformacionais. Geralmente, um epítopo consiste empelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 8, pelo menos 10 e pelo menos 12de tais aminoácidos e mais geralmente consiste em pelo menos 8-10 de taisaminoácidos. Métodos para determinar a conformação espacial de aminoá-cidos são conhecidos na técnia e incluem, por exemplo, cristalografia de rai-os-X e ressonância magnética nuclear de 2 dimensões.

Conforme aqui utilizado, o termo "oligonucleotídeo" se refere auma série de resíduos de nucleotídeos ligados. Oligonucleotídeos incluemsem limitação, oligonucleotídeos de siRNA e anti-sentido. Oligonucleotídeoscompreendem porções de uma seqüência de DNA e têm pelo menos cercade 10 nucleotídeos e tanto quanto cerca de 500 nucleotídeos. Em algumasmodalidades, oligonucleotídeos compreendem de cerca de 10 nucleotídeosaté cerca de 50 nucleotídeos, de cerca de 15 nucleotídeos até cerca de 30nucleotídeos e de cerca de 20 nucleotídeos até cerca de 25 nucleotídeos.Oligonucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente e também podemser usados como sondas. Em algumas modalidades, oligonucleotídeos sãode filamento simples. Em algumas modalidades, oligonucleotídeos compre-endem pelo menos uma porção que é de filamento duplo filamento. Em al-gumas modalidades, os oligonucleotídeos são oligonucleotídeos anti-sentido(ASO). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são oligonucleotí-deos de RNAi, siRNAs ou shRNAs.

Conforme aqui utilizado, o termo "oligonucleotídeo anti-sentido"se refere a um ácido nucléico modificado ou não modificado que tem umaseqüência nucleotídica complementar a uma seqüência polinucleotídica deLIV-1 incluindo seqüências polinucleotídicas associadas à transcrição outradução de LIV-1 (por exemplo, um promotor de um polinucleotídeo de LIV-1), em que o polinucleotídeo anti-sentido é capaz de se hibridizar com umaseqüência polinucleotídica de LIV-1. De particular interesse são polinucleotí-deos anti-sentido capazes de inibir a transcrição e/ou tradução de polinu-cleotídeo codificando polipeptídeo de LIV-1 in vitro ou in vivo.

Conforme aqui utilizados, os termos "oligonucleotídeos de SiR-NA", "oligonucleotídeos de RNAi", "RNA curto de interferência", ou "siRNA"são usados alternadamente e se referem a oligonucleotídeos que trabalhamatravés de silenciamento gênico pós-transcricional, também conhecidos co-mo RNA de interferência (RNAi). Os termos se referem a molécula de ácidonucléico de duplo filamento filamento capaz de interferência com RNA"RNAi", (veja Kreutzer et aí., WO 00/44895; Zernicka-Goetz et ai, WO01/36646; Fire, WO 99/32619; Mello e Fire WO 01/29058). Moléculas desiRNA geralmente são moléculas de RNA, mas abrangem adicionalmentenão nucleotídeos e nucleotídeos quimicamente modificados. Experimentosde direcionamento a gene por siRNA foram efetuados por transferência desiRNA transiente em células (concluídos por métodos clássicos como trans-fecção mediada por lipossomo, eletroporação ou microinjeção). Moléculasde siRNA são RNAs de 21 até 23 nucleotídeos, com extremidades 3'-sobrepairantes de 2 até 3 nucleotídeos que se parecem com produtos deprocessamento de RNAse Ill de RNAs de duplo filamento filamento (dsR-NAs) que normalmente iniciam RNAi.

A exploração eficaz da via de siRNA para mediar silenciamentogênico depende, em parte, de métodos eficientes de distribuição intracelularde siRNA. Moléculas de siRNA tendem a ser de vida curta na célula, nãoprontamente distribuíveis a tipos celulares que são difíceis de transfectar erelativamente caras para produzir através de síntese química. (Jacks et al.,(2005) Biotechniques 39: 215-224; Bernards et ai, (2006) Nature Methods 3:701-706).

Um método para distribuição intracelular eficiente de siRNA é ouso de RNAs em grampo curto ou "shRNAs". ShRNAs são moléculas deRNA de filamento simples que incluem duas seqüências complementaresunidas por uma região não complementar. In vivo, as seqüências comple-mentares se ligam para criar uma hélice de duplo filamento filamento comuma alça não pareada em uma extremidade. A estrutura formatada em formade pirulito resultante é chamada alça em haste e pode ser reconhecida pelamaquinaria de RNAi e processada intracelularmente em RNAs dúplex curtosque têm propriedades semelhantes a siRNA.

ShRNA pode ser sintetizado em uma célula por transcrição apartir de um molde de DNA que foi inserido em um vetor apropriado. ShR-NAs úteis possuem tipicamente 50-70 nucleotídeos de comprimento, comduas seqüências complementares de 19-29 nucleotídeos separados por umaalça de 5-10 nucleotídeos. A construção de shRNA geralmente é realizadapor um de três métodos: ligação de oligonucleotídeos complementares; rea-ção em cadeia da polimerase (PCR) baseada em promotor; ou extensão deiniciador. Muitos sistemas de vetores empregam promotores de RNA pol III;a transcrição mediada por Pol Ill é vantajosa porque ela se inicia em um sítiode início bem definido, produz um transcrito que não contém poli(A) e pro-motores de Pol Ill são ativos em todos os tipos celulares. (Brummelkamp etal., (2002) Science 296: 550-553; Mclntyre, G. e Fanning, G. (2006) BMCBiotechnology 6: 1-8).Sistemas de vetores que codificam shRNA provêem uma fonteintracelular renovável de reagentes de silenciamento gênico que podem me-diar silenciamento gênico persistente após integração estável do vetor nogenoma hospedeiro. Além disso, o cassete de shRNA pode ser prontamenteinserido em vetores retrovirais, Ientivirais ou adenovirais para facilitar a dis-tribuição de shRNA em uma ampla gama de tipos celulares, incluindo cultu-ras primárias que não se dividem. Versões reguláveis de vetores de shRNAsão particularmente úteis para varreduras genéticas.

Conforme aqui utilizado, o termo "isca" se refere a um polipeptí-deo compreendendo pelo menos uma porção de um polipeptídeo de LIV-1capaz de se ligar a zinco ou um veículo de zinco. Em algumas modalidades,a isca é capaz de se ligar a um veículo de zinco complexado com zinco. Emalgumas modalidades, a isca se liga a um veículo de zinco não complexadocom zinco.

Conforme aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamenteeficaz" tenciona referir-se a uma quantidade de um medicamento que produzum efeito medicinal observado como redução ou reverso em um ou maisendpoints clínicos, crescimento e/ou sobrevivência de célula cancerosa, oumetástase de células cancerosas em um indivíduo quando uma quantidadeterapeuticamente eficaz do medicamento é administrada ao indivíduo. Quan-tidades terapeuticamente eficazes são tipicamente determinadas pelo efeitoque elas têm comparadas ao efeito observado quando uma composição quenão inclui ingrediente ativo é administrada a um indivíduo situado de maneirasimilar. A quantidade eficaz precisa para um indivíduo dependerá do tama-nho e saúde do indivíduo, da natureza e extensão da doença e da terapia oucombinação de terapias selecionadas para administração. Entretanto, aquantidade eficaz para uma dada situação é determinada pela experimenta-ção de rotina e está dentro do julgamento do clínico.

Conforme aqui utilizados, os termos "em combinação com" ou"em conjunção com" se referem à administração dos moduladores de LIV-1da invenção com outros regimes terapêuticos.

Conforme aqui utilizado, o termo "suscetível" se refere a pacien-tes para os quais terapia de LIV-1 é um método aceitável de tratamento, istoé, pacientes que provavelmente respondem positivamente. Pacientes comcâncer suscetíveis a terapia de LIV-1 expressam altos níveis de LIV-1 emrelação àqueles pacientes não suscetíveis à terapia de LIV-1. Pacientes comcâncer que não são bons candidatos para terapia de LIV-1 incluem pacientescom câncer com amostras de tumor que carecem ou têm baixos níveis deLIV-1 em ou sobre suas células cancerosas.

Conforme aqui utilizado, o termo "detectar" significa estabelecer,descobrir ou verificar evidência de uma atividade (por exemplo, expressãogênica) ou biomolécula (por exemplo, um polipeptídeo).

Conforme aqui utilizada, a expressão "seqüência nucleotídicahomóloga" ou "seqüência de aminoácidos homóloga", ou variações destas,se refere a seqüências caracterizadas por uma homologia, no nível de nu-cleotídeo ou nível de aminoácido, de pelo menos uma porcentagem especifi-cada e é usada alternadamente com "identidade de seqüência". Seqüênciasnucleotídicas homólogas incluem aquelas seqüências que codificam isofor-mas de proteínas. Tais isoformas podem ser expressadas em diferentes te-cidos do mesmo organismo como resultado de, por exemplo, splicing alter-nativo de RNA. Senão, isoformas podem ser codificadas por genes diferen-tes. Seqüências nucleotídicas homólogas incluem seqüências nucleotídicasque codificam uma proteína de uma espécie fora seres humanos, incluindo,mas não limitando a, mamíferos. Seqüências nucleotídicas homólogas tam-bém incluem, mas não limitam a, mutações e variações alélicas que ocorremnaturalmente das seqüências nucleotídicas aqui expostas. Seqüências nu-cleotídicas homólogas incluem seqüências de aminoácidos que contêmsubstituições de aminoácidos conservativas e cujos polipeptídeos têm amesma ligação e/ou atividade.

Porcentual de homologia ou identidade pode ser determinadopor, por exemplo, o programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package,versão 8 para UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park,Madison Wl), usando parâmetros padrões, que usa o algoritmo de Smith eWaterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482-489). Em algumas modalidades,homologia entre a sonda e o alvo esté entre cerca de 50% até cerca de 60%.Em algumas modalidades, ácidos nucléicos têm nucleotídeos que possuemcerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%,cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 97%, cerca de 98%,cerca de 99% e cerca de 100% de homologia com a SEQ ID NO: 1, ou umaporção desta. A presente invenção provê adicionalmente complementos par-ciais ou completos de SEQ ID NO: 1 ou seus homólogos.

Homologia também pode ser em nível de polipeptídeo. Em al-gumas modalidades, polipeptídeos possuem cerca de 60%, cerca de 70%,cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%,cerca de 95%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% e cerca de 100%de homologia com a SEQ ID NO: 2, ou uma porção desta.

Conforme aqui utilizado, o termo "sonda" se refere a seqüênciasde ácido nucléico de comprimento variável. Em algumas modalidades, son-das compreendem pelo menos cerca de 10 e tantos quanto cerca de 6.000nucleotídeos. Em algumas modalidades, sondas compreendem pelo menos12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo me-nos 25, pelo menos 50 pelo menos 75 nucleotídeos consecutivos. Sondassão usadas na detecção de seqüências de ácido nucléico idênticas, simila-res ou complementares. Sondas de comprimento maior são geralmente obti-das a partir de fontes naturais ou recombinantes, são altamente específicasà seqüência alvo e são muito mais vagarosas para se hibridizarem ao alvoque oligômeros. Sondas podem ser de filamento simples ou duplo filamentoe são desenhados para ter especificidade em PCR, hibridização baseada em membrana, hibridização in situ (ISH), hibridização in situ com fluorescência(FISH), ou tecnologias semelhantes a ELISA.

Conforme aqui utilizado, o termo "misturar" se refere ao proces-so de combinar um ou mais compostos, células, moléculas e semelhantesjuntos na mesma área. Isto pode ser realizado, por exemplo, em um tubo deensaio, placa de Petri ou qualquer recipiente que permite que um ou maiscompostos, células ou moléculas sejam misturados.

Conforme aqui utilizado, o termo "isolado(a)" se refere a um po-linucleotídeo, um polipeptídeo, um anticorpo, ou uma célula hospedeira queestá em um meio ambiente diferente daquele em que o polinucleotídeo, opolipeptídeo ou o anticorpo ocorre naturalmente. Métodos para isolar célulassão bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Um polinucleotídeo, um polipeptídeo, ou um anticorpo que é isolado geralmente está considera-velmente purificado.

Conforme aqui utilizado, o termo "consideravelmente purificado"se refere a um composto (por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptí-deo ou um anticorpo) que é removido de seu ambiente natural e está pelo menos 60% livre, pelo menos 75% livre, pelo menos 90% livre de outroscomponentes com os quais ele está naturalmente associado.

Conforme aqui utilizado, o termo "ligação" significa a interaçãofísica ou química entre duas ou mais biomoléculas ou compostos. A ligaçãoinclui interações iônicas, não iônicas, ligações de hidrogênio, de Van der Waals, hidrofóbicas, etc. A ligação pode ser direta ou indireta; indireta sendoatravés ou devido aos efeitos de uma outra biomolécula ou composto. A liga-ção direta se refere a interações que não ocorrem através ou devido ao efei-to de outra molécula ou composto, mas ao contrário, é sem outros interme-diários químicos consideráveis.

Conforme aqui utilizado, o termo "por em contato" significa colo-car junto, diretamente ou indiretamente, uma molécula em proximidade físicacom uma segunda molécula. A molécula pode estar em vários de tampões,sais, soluções, etc. "Por em contato" inclui, por exemplo, colocar um polinu-cleotídeo em um copo, placa de microtitulação, frasco de cultura de células ou um microarranjo, ou semelhantes, que contenham uma molécula de ácidonucléico. Por em contato também inclui, por exemplo, colocar um anticorpoem um copo, placa de microtitulação, frasco de cultura de células ou um mi-croarranjo, ou semelhantes, que contenham um polipeptídeo. Por em conta-to pode ocorrer in vivo, ex vivo ou in vitro.

Conforme aqui utilizada, a expressão "condições de hibridizaçãoestringentes" ou "condições estringentes" se refere a condições sob as quaisuma sonda, iniciador ou oligonucleotídeo se hibridizará a sua seqüência al-vo, mas em um número mínimo a outras seqüências. Condições estringen-tes são dependentes de seqüências e serão diferentes em diferentes cir-cunstâncias. Seqüências mais longas se hibridizarão com especificidade aosseus complementos de sonda em temperaturas mais altas. Geralmente,condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5°C mais bai-xas que a temperatura de fusão térmica (Tm) para a seqüência específicaem uma força e iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força e tô-nica, pH e concentração de ácido nucléico definidos) em que 50% das son-das complementares à seqüência alvo se hibridizam à seqüência alvo emequilíbrio. Já que as seqüências alvo geralmente estão presentes em exces-so, na Tm, 50% das sondas estão hibridizadas aos seus complementos emequilíbrio. Tipicamente, condições estringentes serão aquelas em que a con-centração salina é menos de cerca de 1,0 M de íon sódio, tipicamente cercade 0,01 até 1,0 M de íon sódio (ou outros sais) em pH 7,0 até 8,3 e a tempe-ratura é pelo menos cerca de 30°C para sondas, iniciadores ou oligonucleo-tídeos curtos (por exemplo, 10 até 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de60°C para sondas, iniciadores ou oligonucleotídeos maiores. Condições es-tringentes também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabili-zadores, tal como formamida.

Conforme aqui utilizado, o termo "condições de estringênciamoderada" se refere a condições sob as quais uma sonda, iniciador ou oli-gonucleotídeo se hibridizará a sua seqüência alvo, mas a um número limita-do de outras seqüências. Condições moderadas são dependentes de se-qüência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Condições modera-das são bem-conhecidas pelos versados na técnica e são descritas em, en-tre outras coisas, Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 2a edição (1989)).

As composições de ácido nucléico descritas aqui podem ser u-sadas, por exemplo, para produzir polipeptídeos, como sondas para a detec-ção de mRNA em amostras biológicas (por exemplo, extratos de células hu-manas) ou cDNA produzido de tais amostras, para gerar cópias adicionaisdos polinucleotídeos, para gerar ribozimas ou oligonucleotídeos (de filamen-to simples ou duplo filamento) e como sondas de DNA de filamento simplesou como oligonucleotídeos formadores de filamento triplo. As sondas descri-tas aqui podem ser usada para, por exemplo, determinar a presença ou au-sência dos polinucleotídeos providos aqui em uma amostra. Os polipeptí-deos podem ser usados para gerar anticorpos específicos para um polipep-tídeo associado ao câncer, tais anticorpos são por sua vez úteis em métodosdiagnósticos, métodos prognósticos e semelhantes como discutido em maio-res detalhes aqui. Polipeptídeos também são úteis como alvos para inter-venção terapêutica, como discutido em maiores detalhes aqui. Anticorpos dapresente invenção também podem ser usados, por exemplo, para purificar,detectar e se direcionar aos polipeptídeos da presente invenção, incluindotanto métodos terapêuticos e de diagnóstico in vitro como in vivo. Por exem-plo, os anticorpos são úteis em imunoensaios para medir qualitativamente equantitativamente níveis dos polipeptídeos da presente invenção em amos-tras biológicas. Veja, por exemplo, Harlow et ai, Antibodies: A LaboratoryManual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988). Esses e outrosusos são descritos em maiores detalhes abaixo.

Conforme aqui utilizado, o termo "agente de visualização" se re-fere a uma composição ligada a um anticorpo, molécula pequena ou sondada invenção que pode ser detectada usando técnicas conhecidas pelos ver-sados na técnica. Conforme aqui utilizado, o termo "evidência de expressãogênica" se refere a quaisquer indícios mensuráveis de que um gene é ex-presso.

O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a umveículo para administração de um agente terapêutico, tal como anticorpos ouum polipeptídeo, genes e outros agentes terapêuticos. O termo se refere aqualquer veículo farmacêutico que não induza por si só a produção de anti-corpos nocivos para o indivíduo que recebe a composição e que pode seradministrado sem toxicidade indevida. Veículos adequados podem ser ma-cromoléculas grandes, vagarosamente metabolizadas tal como proteínas,polissacarídeos, ácido poliláticos, ácido poliglicólicos, aminoácidos poliméri-cos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos e partículas de vírusinativo. Tais veículos são bem-conhecidos por aqueles de conhecimento or-dinário da técnica. Veículos farmaceuticamente aceitáveis em composiçõesterapêuticas podem incluir líquidos tal como água, salina, glicerol e etanol.Substâncias auxiliares, tal como agentes umidificadores ou emulsificantes,substâncias tamponantes de pH e semelhantes, também podem estar pre-sentes em tais veículos.

Exemplos específicos de cânceres que podem ser tratados pe-los métodos e composições da presente invenção incluem, mas não estãolimitados a, cânceres associados a LIV-1. Conforme aqui utilizado, "câncerassociado a LIV-1" se refere a um câncer caracterizado por células que ex-pressam diferencialmente LIV-1 em relação a células não cancerosas. A pre-sente invenção também é aplicável a qualquer tipo celular de tumor ondeLIV-1 tenha uma função em crescimento de célula cancerosa, formação detumor, proliferação de célula cancerosa, metástase de célula cancerosa, mi-gração celular, angiogênese, sinalização de LIV-1, adesão célula-célula me-diada por LÍV-1, interação célula-célula, interação de membrana célula-célulamediada por LIV-1, interação matriz extracelular-célula mediada por LIV-1,atividades mediadas por integrina, expressão de superfície de LIV-1, degra-dação matriz extracelular-célula mediada por LIV-1, localização nuclear deSnail e expressão de LIV-1. Em algumas modalidades, o câncer é câncer demama, câncer de pele, câncer de esôfago, câncer hepático, câncer pancreá-tico, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical, câncer de pulmão,câncer de bexiga, câncer de ovário, mieloma múltiplo e melanoma. Em al-gumas modalidades, o câncer é câncer de mama ER-positivo. Em algumasmodalidades, o câncer é câncer de mama ER-negativo. Em algumas moda-lidades, tais cânceres exibem expressão diferencial de LIV-1 de pelo menoscerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelomenos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de200%, ou pelo menos cerca de 300% quando comparada a um controle.

A presente invenção provê métodos e composições que prevê-em tratamento, inibição e manejo de doenças e distúrbios associados a su-perexpressão de LIV-1 assim como tratamento, inibição e manejo de sinto-mas de tais doenças e distúrbios. Algumas modalidades da invenção se re-lacionam a métodos e composições compreendendo composições que tra-tam, inibem ou manejam câncer incluindo, sem limitação, metástases decâncer, proliferação de célula cancerosa, crescimento de célula cancerosa einvasão de célula cancerosa.

A presente invenção provê adicionalmente métodos incluindooutros ingredientes ativos em combinação com os moduladores de LIV-1 dapresente invenção. Em algumas modalidades, os métodos compreendemadicionalmente administrar uma ou mais terapias de câncer convencionaisao paciente. Em algumas modalidades, os métodos da presente invençãocompreendem adicionalmente tratar o paciente com um ou mais de quimio-terapia, terapia por radiação ou cirurgia.

A presente invenção também provê métodos e composições pa-ra o tratamento, inibição e manejo de câncer ou outro distúrbio ou doença decélula hiperproliferativa que tenha se tornado parcialmente ou completamen-te refratária a tratamento de câncer corrente ou padrão, tal como cirurgia,quimioterapia, terapia por radiação, terapia hormonal e terapia biológica.

A invenção também provê métodos diagnósticos e/ou de visuali-zação usando os moduladores de LIV-1 da invenção, particularmente anti-corpos de LIV-1, para diagnosticar câncer e/ou prever progressão de câncer.Em algumas modalidades, os métodos da invenção provêem métodos paravisualizar e localizar tumores e/ou metástases e métodos de diagnóstico eprognóstico. Em algumas modalidades, os métodos da invenção provêemmétodos para avaliar conveniência da terapia relacionada a LIV-1.

Moduladores de LIV-1

A presente invenção provê moduladores de LIV-1 para, entre ou-tras coisas, o tratamento, diagnóstico, detecção ou visualização de câncer.Moduladores de LIV-1 também são úteis na preparação de medicamentospara o tratamento de câncer.

Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é um oligonu-cleotídeo, uma molécula pequena, um mimético, uma isca, ou um anticorpo.Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 inibe uma atividade biológi-ca de LIV-1 em 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%,99% ou 100% quando comparada a um controle. Em algumas modalidades,o modulador de LIV-1 inibe a expressão de LIV-1 em pelo menos 25%, 50%,60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% quando compa-rada a um controle.

Anticorpos

Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é um anticorpomonoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpohumano, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia única, ou umfragmento Fab. O anticorpo pode ser marcado com, por exemplo, uma enzi-ma, radioisótopo ou fluoróforo. Em algumas modalidades, o anticorpo temuma afinidade de ligação menor que cerca de IxIO5Ka para um polipeptídeo,fora LIV-1. Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é um anticorpomonoclonal que se liga a LIV-1 com uma afinidade de pelo menos 1x108Ka.

A invenção também provê anticorpos que inibem competitiva-mente a ligação de um anticorpo a um epítopo da invenção como determi-nado por qualquer método conhecido na técnica por determinar ligaçãocompetitiva usando, por exemplo, imunoensaios. Em algumas modalidades,o anticorpo inibe competitivamente a ligação do epítopo em pelo menos95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%.

Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humani-zado. Anticorpos humanizados podem ser obtidos por uma variedade de mé-todos incluindo, por exemplo: (1) enxertar as regiões determinantes de com-plementaridade não humanas (CDRs) em uma estrutura e região constantehumanas (um processo referido na técnica como "humanizar"), ou, senão,(2) transplantar os domínios variáveis não humanos inteiros, mas "disfarçan-do" eles com uma superfície semelhante à humana pela substituição de re-síduos de superfície (um processo referido na técnica como "folhear"). Napresente invenção, anticorpos humanizados incluirão tanto anticorpos "hu-manizados" como "folheados". De maneira similar, anticorpos humanos po-dem ser feitos pela introdução de lócus de imunoglobulina humana em ani-mais transgênicos, por exemplo, camundongos em que genes de imunoglo-bulina endógenos foram parcialmente ou completamente inativados. No de-safio, a produção de anticorpo humano é observada, a qual se parece estrei-tamente com aquela vista em seres humanos em todos os respeitos, incluin-do rearranjo gênico, montagem e repertório de anticorpo. Esta abordagem édescrita, por exemplo, em Patentes U.S. Nos. 5.545.807, 5.545.806,5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016 e nas seguintes publicaçõescientíficas: Marks et ai, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al.,Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994); Fishwildet al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotech-nology 14: 826 (1996); Lonberg e Huszar, lntern. Rev. Immunol. 13: 65-93(1995); Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec.Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan,Molec. Immunol. 31(3): 169-217 (1994)e Kettleborough, C. A. et al., Protein Eng. 4(7): 773-83 (1991) cada uma dasquais é incorporada aqui como referência.

Anticorpos da presente invenção podem funcionar através de di-ferentes mecanismos. Em algumas modalidades, anticorpos desencadeiamcitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), um ataque lítico emcélulas direcionadas por anticorpo. Em algumas modalidades, anticorpostêm múltiplas funções terapêuticas, incluindo, por exemplo, ligação a antíge-no, indução de apoptose e citotoxicidade celular dependente de complemen-to (CDC).

Em algumas modalidades, anticorpos da presente invenção po-dem agir como agonistas ou antagonistas dos polipeptídeos da presente in-venção. Por exemplo, em algumas modalidades a presente invenção provêanticorpos que perturbam as interações receptor/ligante com os polipeptí-deos da invenção parcialmente ou completamente. Em algumas modalida-des, anticorpos da presente invenção se ligam a um epítopo descritoo aqui,ou um porção deste. Em algumas modalidades, são providos anticorpos quemodulam atividade de Iigante ou atividade de receptor em pelo menos 95%,pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelomenos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50% comparada à atividadena ausência do anticorpo.

Em algumas modalidades, anticorpos de LIV-1 inibem a via deSnail e/ou inibem um ou mais de ciclina D1, fibronectina, RhoB, MT1-MMP,FGF, CDK4, VEGF, EGFR e fosforilação de EGFR. Em algumas modalida-des, anticorpos de LIV-1 inibem atividades mediadas por integrina. Em al-gumas modalidades, anticorpos de LIV-1 inibem localização nuclear de Snail.

Em algumas modalidades, anticorpos de LIV-1 regulam para ci-ma um ou mais de E-caderina, VE-caderina, Muc-1, claudina, ocludina,desmoplaquina, caspase, p21, p53, BID (agonista de morte que interagecom bcl), DFF40 (fator de fragmentação de DNA) e citoqueratina. Em algu-mas modalidades, anticorpos de LIV-1 regulam para baixo um ou mais mar-cadores mesenquimais na via de SNAIL.

Em algumas modalidades, a presente invenção provê anticorposneutralizantes. Em algumas modalidades, os anticorpos neutralizantes agemcomo antagonistas de receptor, isto é, inibem todas ou um subgrupo das ati-vidades biológicas da ativação de receptor mediada por ligante. Em algumasmodalidades, os anticorpos podem ser especificados como agonistas, anta-gonistas ou agonistas inversos para atividades biológicas compreendendoas atividades biológicas específicas dos peptídeos da invenção aqui descri-toos.

Os anticorpos da presente invenção podem ser usados sozinhosou em combinação com outras composições. Os anticorpos podem adicio-nalmente ser recombinantemente fusionados a um polipeptídeo heterólogona extremidade N- ou C-terminal ou conjugado quimicamente (incluindo con-jugações covalentes e não covalentes) a polipeptídeos ou outras composi-ções. Por exemplo, anticorpos da presente invenção podem ser recombinan-temente fusionados ou conjugados a moléculas úteis como marcadores emensaios de detecção e moléculas efetoras tal como polipeptídeos heterólo-gos, fármacos; radionuclídeos ou toxinas. Veja, por exemplo, publicaçõesPCT WO 91/14438; WO 89/12624; Patente U.S. No. 5.314.995 e EP396.387.

Além de anticorpos quiméricos e humanizados, anticorpos com-pletamente humanos podem ser derivados de camundongos transgênicosque têm genes de imunoglobulina humana (veja, por exemplo, Patentes U.S.Nos. 6.075.181, 6.091.001 e 6.114.598, todas as quais são incorporadasaqui como referência), ou de bibliotecas de visualização de fago de genes deimunoglobulina humana (veja, por exemplo, McCafferty et ai, Nature, 348:552-554 (1990); Clackson et ai, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et ai,J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)).

Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando o méto-do de Kohler et ai., (1975) Nature 256: 495-496, ou uma modificação deste.Tipicamente, um camundongo é imunizado com uma solução contendo umantígeno. A imunização pode ser realizada misturando ou emulsificando asolução contendo antígeno em solução salina, de preferência em um adju-vante tal como adjuvante completo de Freund e injetando a mistura ou emul-são parenteralmente. Qualquer método de imunização conhecido na técnicapode ser usado para obter os anticorpos monoclonais da invenção. Apósimunização do animal, o baço (e opcionalmente, vários Iinfonodos grandes)é removido e dissociado em células singulares. As células do baço podemser triadas pela aplicação de uma suspensão celular em uma placa ou poçorevestido com um antígeno de interesse. As células B expressando imuno-globulina ligada à membrana específica para o antígeno se ligam à placa enão são rinsadas fora. Células B resultantes, ou todas as células de baçodissociadas, são então induzidas a fundirem-se com células de mieloma pa-ra formar hibridomas e são cultivadas em um meio seletivo. As células resul-tantes são plaqueadas por diluição seriada ou Iimitante e são avaliadas paraa produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antígeno de inte-resse (e que não se ligam a antígenos não relacionados). Os hibridomas quesecretam anticorpo monoclonal (mAb) selecionados são então cultivados invitro (por exemplo, em garrafas de cultura de tecidos ou reatores de fibracôncava), ou in vivo (como ascite em camundongos).Como uma alternativa ao uso de hibridomas para expressão, an-ticorpos podem ser produzidos em uma linhagem de células tal como linha-gens de células CHO ou de mieloma, como descritoo em Patentes U.S. Nos.5.545.403; 5.545.405; e 5.998.144; cada uma incorporada aqui como refe-rência. Em resumo, a linhagem celular é transfectada com vetores capazesde expressar uma cadeia leve e uma cadeia pesada, respectivamente. Pelatransfecção de duas proteínas em vetores separados, anticorpos quiméricospodem ser produzidos. Immunol. 147: 8; Banchereau et al, (1991) Clin. Im-munol. Spectrum 3: 8 e Banchereau et al, (1991) Science 251: 70, todos osquais são aqui incorporados como referência.

Anticorpos humanos também podem ser produzidos usandotécnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de visualização de fago[Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al, J. Mol.Biol., 222: 581 (1991)]. As técnicas de Cole et al, e Boerner et al, tambémestão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos[Cole et al Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985) e Boerner et al, Immunol., 147(1): 86-95 (1991)]. Anticorpos humani-zados podem ser obtidos por uma variedade de métodos incluindo, por e-xemplo: (1) enxertar as regiões determinantes de complementaridade (C-DRs) não humanas em uma região constante e estrutura humana (um pro-cesso referido na técnica como "humanizar"), ou senão, (2) transplantar osdomínios variáveis não humanos inteiros, mas "disfarçando" eles com umasuperfície semelhante à humana pela substituição de resíduos de superfície(um processo referido na técnica como "folhear"). Na presente invenção,anticorpos humanizados incluirão tanto anticorpos "humanizados" como "fo-lheados". De maneira similar, anticorpos humanos podem ser feitos pela in-trodução de lócus de imunoglobulina humana em animais transgênicos, porexemplo, camundongos em que genes de imunoglobulina endógenos foramparcialmente ou completamente inativados. No desafio, a produção de anti-corpo humano é observada, a qual se parece estreitamente com aquela vistaem seres humanos em todos os respeitos, incluindo rearranjo gênico, mon-tagem e repertório de anticorpo. Esta abordagem é descrita, por exemplo,em Patentes U.S. Nos. 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126,5.633.425, 5.661.016 e nas seguintes publicações científicas: Marks et al.,Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859(1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotech-nology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996);Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995); Jones et al., Na-ture 321: 522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1988); Verhoe-yer et al., Science 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3): 169-217 (1994) e Kettleborough,C. A. et al., Protein Eng. 4(7): 773-83 (1991) cada uma das quais é incorpo-rada aqui como referência.

A expressão "região determinante de complementaridade" se re-fere a seqüências de aminoácidos que juntas definem a afinidade e especifi-cidade de ligação da região Fv natural de um sítio de ligação de imunoglobu-Iina nativo. Veja, por exemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917(1987); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services PublicaçãoNIH No. 91-3242 (1991). A expressão "região constante" se refere à porçãoda molécula de anticorpo que confere funções efetoras. Na presente inven-ção, regiões constantes de camundongo são substituídas por regiões cons-tantes humanas. As regiões constantes dos anticorpos submetidos são deri-vadas de imunoglobulinas humanas. A região constante de cadeia pesadapode ser selecionada de qualquer dos cinco isotipos: alfa, delta, epsilon,gama ou mu. Um método para humanizar anticorpos compreende alinhar asseqüências de cadeias pesada e leve não humanas com seqüências de ca-deias pesada e leve humanas, selecionando e substituindo a estrutura nãohumana por uma estrutura humana com base em tal alinhamento, modela-gem molecular para prever a conformação da seqüência humanizada ecomparando a conformação do anticorpo parental. Este processo é seguidopor retro-mutação repetida de resíduos na região CDR que perturba a estru-tura das CDRS até que a conformação prevista do modelo de seqüênciahumanizada se aproxime estreitamente da conformação das CDRs não hu-manas do anticorpo não humano parental. Tais anticorpos humanizados po-dem ser derivados adicionalmente para facilitar captação e depuração, porexemplo, através de receptores de Ashwell. Veja, por exemplo, Patente U.S.Nos. 5.530.101 e 5.585.089 que são incorporados aqui como referência.

Anticorpos humanizados também podem ser produzidos usandoanimais transgênicos que são engenheirados para conter lócus de imuno-globulina humana. Por exemplo, WO 98/24893 descreve animais transgêni-cos que têm um lócus de Ig humana em que os animais não produzem imu-noglobulinas endógenas funcionais devido à inativação de lócus de cadeiaspesada e leve endógenos. WO 91/10741 também descreve hospedeirosmamíferos não primatas capazes de montar uma resposta imune a um imu-nógeno, em que os anticorpos têm regiões constantes e/ou variáveis de pri-mata e em que os lócus que codificam imunoglobulina endógena são substi-tuídos ou inativados. WO 96/30498 descreve o uso do sistema Cre/Lox paramodificar o lócus de imunoglobulina em um mamífero, tal como para substi-tuir o todo ou uma porção da região constante ou variável para formar umamolécula de anticorpo modificada. WO 94/02602 descreve hospedeiros ma-míferos não humanos que têm lócus de Ig endógenos inativados e lócus deIg humana funcionais. Patente U.S. 5.939.598 descreve métodos para fazercamundongos transgênicos em que os camundongos carecem de cadeiaspesadas endógenas e expressam um lócus de imunoglobulina exógenacompreendendo uma ou mais regiões constantes xenogênicas. Anticorposda presente invenção também podem ser produzidos usando técnicas deengenharia humana como discutido em Patente U.S. 5.766.886, que é incor-porada aqui como referência.

Usando um animal transgênico descrito acima, uma respostaimune pode ser produzida para uma molécula antigênica selecionada e célu-las produtoras de anticorpo podem ser removidas do animal e usadas paraproduzir hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos. Proto-colos de imunização, adjuvantes e semelhantes são conhecidos na técnica esão usados em imunização de, por exemplo, um camundongo transgênicocomo descrito em WO 96/33735. Os anticorpos monoclonais podem ser tes-tados para a habilidade de inibir ou neutralizar a atividade biológica ou efeitofisiológico da proteína correspondente.

Anticorpos da presente invenção podem ser administrados a umindivíduo através de transferência de gene de anticorpo terapêutico in vivocomo discutido por Fang et ai, (2005), Nat. Biotechnol. 23, 584-590. Por e-xemplo vetores recombinantes podem ser gerados para distribuir um cassetede expressão multicistrônico compreendendo um peptídeo que media auto-clivagem independente de enzima, co-traducional de polipeptídeos coloca-dos entre seqüências que codificam cadeias pesada e leve de Mab. Expres-são leva a quantidades estequiométricas de ambas as cadeias de Mab. Umexemplo preferido do peptídeo que media auto-clivagem independente deenzima, co-traducional é o peptídeo 2A derivado de febre aftosa.

Fragmentos dos anticorpos são adequados para uso nos méto-dos da invenção contanto que eles retenham a afinidade desejada do anti-corpo completo. Assim, um fragmento de um anticorpo anti-LIV-1 reterá ahabilidade para se ligar a LIV-1. Tais fragmentos são caracterizados por pro-priedades similares ao anticorpo anti-LIV-1 completo correspondente, isto é,os fragmentos se ligarão especificamente a um antígeno de LIV-1 humanoexpressado na superfície de uma célula humana.

Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a um ou maisepítopos em um domínio extracelular de LIV-1. Em algumas modalidades, osanticorpos modulam uma ou mais atividades biológicas relacionadas a LIV-1.Em algumas modalidades, os anticorpos inibem um ou mais de crescimentode célula cancerosa, formação de tumor e proliferação de célula cancerosa.

Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclo-nal que se liga a um ou mais epítopos em um domínio selecionado do grupoque consiste no domínio extracelular N-terminal de LIV-1, no domínio extra-celular de LIV-1 entre domínios transmembranares (TM) 2&3, no domínioextracelular de LIV-1 entre TM 4&5, no domínio extracelular de LIV-1 entreTM 6&7 e no domínio extracelular C-terminal de LIV-1.

Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal se liga a umepítopo de LIV-1 no domínio extracelular de LIV-1 entre TM 2&3. Em algu-mas modalidades, o anticorpo monoclonal se liga a um ou mais epítopos naSEQ ID NO: 388.

Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal se liga a umepítopo de LIV-1 no domínio extracelular N-terminal de LIV-1. Em algumasmodalidades, o anticorpo monoclonal se liga a um ou mais epítopos na SEQID NO: 387.

Anticorpos adequados de acordo com a presente invenção po-dem reconhecer epítopos lineares ou conformacionais, ou combinações des-tes. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção se ligama epítopos de regiões antigênicas de LIV-1 selecionadas do grupo que con-siste em SEQ ID NOS: 3-6. Em algumas modalidades, o anticorpo é especí-fico para um epítopo que tem uma seqüência selecionada do grupo que con-siste em SEQ ID NOS: 3-360. Em algumas modalidades, o anticorpo é es-pecífico para um epítopo que tem uma seqüência selecionada do grupo queconsiste em SEQ ID NOS: 361-364 ou 387-391. Entenda-se que esses pep-tídeos podem não necessariamente mapear precisamente um epítopo, mastambém podem conter seqüência de LIV-1 que não seja imunogênica.

Métodos para prever outros epítopos potenciais aos quais umanticorpo da invenção pode ser ligar são bem-conhecidos por aqueles ver-sados na técnica e incluem sem limitação, análise de Kyte-Doolittle (Kyte, J.e Dolittle, R. F., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132), análise de Hopp e Woods(Hopp, T.P. e Woods, K. R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981) 78: 3824-3828;Hopp, T. J. e Woods, K. R. Mol. Immunol. (1983) 20: 483-489; Hopp, T. J., J.Immunol. Methods (1986) 88: 1-18.), análise de Jameson-Wolf (Jameson, B.A. e Wolf, H., Comput. Appl. Biosci. (1988) 4: 181-186) e análise de Emini(Emini, Ε. A., Schlief, W. A., Colonno, R. J. e Wimmer, E., Virology (1985)140: 13-20).

Anticorpos são definidos como sendo de "ligação específica" se:1) exibem um nível limiar de atividade de ligação e/ou 2) eles não reagemcruzadamente significativamente com moléculas polipeptídicas relacionadasconhecidas. A afinidade de ligação de um anticorpo pode ser prontamentedeterminada por alguém de conhecimento ordinário da técnica, por exemplo,por análise de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sei. 51: 660-672, 1949).Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção se ligam aseus epítopos alvo ou iscas miméticas pelo menos 1,5-vezes, 2-vezes, 5-vezes, 10-vezes, 100-vezes, 103-vezes, 104-vezes, 105-vezes, 106-Vezes oumais para o polipeptídeo associado a câncer alvo mais alto que para outrosmembros conhecidos dos transportadores de zinco ZIP (proteínas semelhan-tes a lrt, Zrt).

Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam com alta afini-dade de 10"4M ou menos, 10"7M ou menos, 10"9M ou menos com afinidadesubnanomolar (0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 nM ou ainda menos).Em algumas modalidades, a afinidade de ligação dos anticorpos para LIV-1é de pelo menos 1 χ 106 Ka. Em algumas modalidades, a afinidade de liga-ção dos anticorpos para LIV-1 é de pelo menos 5 χ 106 Ka, pelo menos 1 χ107 Ka, pelo menos 2 χ 107 Ka, pelo menos 1 χ 108 Ka, ou maior. Anticorposda presente invenção também podem ser descritos ou especificados emtermos de suas afinidades de ligação a um polipeptídeo da invenção. Emalgumas modalidades, afinidades de ligação incluem aquelas com um Kdmenor que 5 χ 10-2M, 10-2M, 5 χ 10-3M, 10-3M, 5 χ 10-4M, 10-4M, 5 χ 10-5M,107-5M, 5 χ 10-6M, 10-6M, 5 χ 10-7M, 10-7M, 5 χ 10-8M, 10-8M, 5 χ 10-9M, 10-9Μ,5 χ 10-10M, 10-10M, 5 χ 10-11Μ, 10-11M, 5 χ 10-12Μ, 10-12Μ, 5 χ 10-13Μ, 10-13M,5 χ 10-14M, 10-14Μ, 5 χ 10-15M, ou 10-15Μ, ou menos.

Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invençãonão se ligam a moléculas polipeptídicas relacionadas conhecidas, por exem-plo, se eles se ligam ao polipeptídeo de LIV-1, mas não a polipeptídeos rela-cionados conhecidos usando uma análise de transferência de Western pa-drão (Ausubel et al.,). Exemplos de polipeptídeos relacionados conhecidosincluem, sem limitação, outros membros da família de proteínas transporta-doras de zinco ZIP (proteínas semelhantes a lrt, Zrt) e semelhantes, incluin-do, sem limitação, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 366 e SEQ ID NO: 386.

Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invençãose ligam a ortólogos, homólogos, parálogos ou variedades, ou combinaçõese subcombinações destes, de LIV-1 ou polipeptídeos de proteína transporta-dora de zinco. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente inven-ção se ligam a ortólogos de LIV-1 ou polipeptídeos de proteína transportado-ra de zinco. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invençãose ligam a homólogos de LIV-1 ou polipeptídeos de proteína transportadorade zinco. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção seligam a parálogos de LIV-1 ou polipeptídeos de proteína transportadora dezinco. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção se li-gam a variedades de LIV-1 ou polipeptídeos de proteína transportadora dezinco. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção não seligam a ortólogos, homólogos, parálogos ou variedades, ou combinações esubcombinações destes, de LIV-1 ou polipeptídeos de proteína transportado-ra de zinco.

Em algumas modalidades, anticorpos podem ser triados contrapolipeptídeos relacionados conhecidos por isolar uma população de anticor-po que se liga especificamente a polipeptídeos de LIV-1. Por exemplo, anti-corpos específicos a polipeptídeos de LIV-1 humano fluirão através de umacoluna compreendendo proteínas transportadoras de zinco ZIP (proteínassemelhantes a lrt, Zrt) (com exceção de LIV-1) aderidas a matriz insolúvelsob condições de tampão apropriadas. Tal varredura permite isolamento deanticorpos policlonais e monoclonais que não reagem cruzadamente a poli-peptídeos estreitamente relacionados (Antibodies: A Laboratory Manual, Har-Iow e Lane (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Proto-cols in lmmunoloogy, Cooligan et ai, (eds.) National Institutes of Health,John Wiley and Sons, Inc., 1995). Varredura e isolamento de anticorpos es-pecíficos são bem-conhecidos na técnica (veja, Fundamental Immunology,Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et ai, Adv. In Immunol. 43: 1-98,1998; Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Goding, J. W. (eds.),Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et ai, Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101,1984). Exemplos representativos de tais ensaios incluem: imunoeletroforesesimultânea, radioimunoensaio (RIA), radioimunoprecipitação, ensaio imuno-adsorvente ligado a enzima (ELISA), ensaio de transferência em pontos outransferência de Western, ensaio de inibição ou competição e ensaio emsanduíche.

Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invençãonão se ligam especificamente a SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 366 ou SEQID NO: 386. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invençãonão se ligam especificamente a epítopos que consistem em resíduos 125-138 de SEQ ID NO: 386, resíduos 252-265 de SEQ ID NO: 386, ou resíduos418-431 de SEQ ID NO: 386. Em algumas modalidades, os anticorpos nãoreagem cruzadamente com ZnT1 ou Zipl.

A invenção também prove anticorpos que são SMIPs ou proteí-nas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação específicas para pro-teína alvo. Esses constructos são polipeptídeos de cadeia única compreen-dendo domínios de ligação antigênica fusionados a domínios de imunoglobu-lina necessários para efetuar funções efetoras de anticorpo. Veja, por exem-plo, WO 03/041600, publicação de Patente U.S. 20030133939 e publicaçãode Patente U.S. 20030118592.

Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invençãosão anticorpos neutralizadores. Em algumas modalidades, os anticorpos sãoanticorpos que se direcionam. Em algumas modalidades, os anticorpos sãointernalizados na ligação a um alvo. Em algumas modalidades, os anticorposnão se tornam internalizados na ligação a um alvo e em vez disso permane-cem na superfície.

Os anticorpos da presente invenção podem ser triados pela ha-bilidade de serem rapidamente internalizados na ligação ao antígeno de cé-lula-tumor em questão, ou pela habilidade de permanecer na superfície celu-lar após a ligação. Em algumas modalidades, por exemplo, na construção dealguns tipos de imunoconjugados, a habilidade de um anticorpo em ser in-ternalizado pode ser desejada se a internalização é requerida para liberar aunidade de toxina. Senão, se o anticorpo está sendo usado para promoverADCC ou CDC, pode ser mais desejável para o anticorpo permanecer nasuperfície celular. Um método de varredura pode ser usado para diferenciaresses tipos de comportamentos. Por exemplo, uma célula portando antígenode célula tumoral pode ser usada onde as células são incubadas com IgGIhumana (anticorpo controle) ou um dos anticorpos da invenção em umaconcentração de aproximadamente 1 pg/mL em gelo (com 0,1% de azidasódica para bloquear internalização) ou 37°C (sem azida sódica) por 3 ho-ras. As células são então lavadas com tampão de marcação gelado (PBS +1% de BSA + 0,1% de azida sódica) e são marcadas com FITC-anti-lgG hu-mana de cabra por 30 minutos em gelo. Intensidade fluorescente média ge-ométrica (MFI) é registrada por FACS Calibur. Se nenhuma diferença emMFI é observada entre células incubadas com o anticorpo da invenção emgelo na presença de azida sódica e células observadas a 37°C na ausênciade azida sódica, o anticorpo será suspeito de ser um que permanece ligadoà superfície celular, em vez de ser internalizado. Se entretanto, uma diminui-ção em anticorpo marcável de superfície é encontrada quando as célulassão incubadas a 37°C na ausência de azida sódica, o anticorpo será suspei-to de ser um que é capaz de internalização.

ConjugadosdeAnticorpo

Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são conju-gados. Em algumas modalidades, os anticorpos conjugados são úteis paraterapia de câncer, diagnóstico de câncer, ou visualização de células cance-rosas.

Para aplicações diagnosticas, o anticorpo tipicamente será mar-cado com uma unidade detectável. Estão disponíveis em umerosos marca-dores que podem geralmente ser agrupados nas seguintes categorias:

(a) Radionuclídeos tal como aqueles discutidos infra. O anticor-po pode ser marcado, por exemplo, com o radioisótopo usando as técnicasdescritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen etal.,ed. Wiley-lnterscience, New York, N.Y., Pubs. (1991) por exemplo e radioati-vidade pode ser medida usando contagem de cintilação.

(b) Marcadores fluorescentes tal como quelatos terrosos raros(quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seusderivados, dansila, lissamina, ficoeritrina e vermelho Texas estão disponí-veis. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados ao anticorpo u-sando as técnicas descritoas em Current Protocols in Immunology, supra,por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada usando um fluorímetro.

(c) Vários marcadores de enzima-substrato estão disponíveis ePat. U.S. No. 4.275.149 provê uma revisão de alguns desses. A enzima ge-ralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que podeser medida usando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisaruma mudança de cor em um substrato, que pode ser medido espectrofoto-metricamente. Senão, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimiolumi-nescência do substrato. Técnicas para quantificar uma alteração em fluores-cência são descritas acima. O substrato quimioluminescente se torna eletro-nicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz a qualpode ser medida (usando um quimioluminômetro, por exemplo) ou doar e-nergia para um aceptor fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticosincluem Iuciferases (por exemplo, luciferase de vaga-lume e Iuciferase bacte-riana; Pat. U.S. No. 4.737.456), luciferina, 2,3-diidroftalazinodionas, malatodesidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rabanete (HR-PO), fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glicoamilase, lisozima, oxidasesde sacarídeo (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tal como uricase e xantinooxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e semelhantes. Técnicas paraconjugar enzimas a anticorpos são descritas em O1SuIIivan et al., Methodsfor the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for use in Enzyme Im-munoassay, em Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Aca-demic Press, New York, 73: 147-166 (1981).

Os anticorpos também podem ser usados para ensaios de diag-nóstico in vivo. Em algumas modalidades, o anticorpo é marcado com umradionuclídeo para que o tumor possa ser localizado usando imunocintilogra-fia. Por uma questão de conveniência, os anticorpos da presente invençãopodem ser providos em um kit, isto é, uma combinação embalada de rea-gentes em quantidades predeterminadas com instruções para realizar o en-saio diagnóstico. Quando o anticorpo é marcado com uma enzima, o kit in-clui substratos e cofatores requeridos pela enzima (por exemplo, um precur-sor de substrato que provê o cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso,outros aditivos podem ser incluídos tal como estabilizantes, tampões (porexemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e semelhantes. Asquantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas amplamentepara prover concentrações em solução dos reagentes que otimizem conside-ravelmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podemser providos como pós secos, geralmente liofilizados, incluindo excipientesque na dissolução proverão uma solução de reagente que têm a concentra-ção apropriada.

Em algumas modalidades, anticorpos são conjugados a uma oumais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 até cerca de 10 mo-léculas de maitansina por molécula de anticorpo). A maitansina pode, porexemplo, ser convertida em Mai-SS-Me que pode ser reduzida a Mai-SH3 ereagida com anticorpo modificado (Chari et al., Câncer Research 52: 127-131 (1992)) para gerar um imunoconjugado de maitansinóide-anticorpo. Emalgumas modalidades, o conjugado pode ser o derivado de maitansina alta-mente potente DM1 (N2'-desacetil-N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina)(veja, por exemplo, WO 02/098883 publicada em 12 de dez. De2002) que tem um IC50 de aproximadamente 10-11 M (revisão, veja Payne(2003) Câncer Cell 3: 207-212) ou DM4 (N2'-desacetil-N2'(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina)(veja, por exemplo, WO 2004/103272 pu-blicada em 2 de dez. de 2004).

Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo compreen-de um anticorpo antiantígeno de célula tumoral conjugado a uma ou maismoléculas de caliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é ca-paz de produzir quebras em DNA de duplo filamento filamento em concen-trações subpicomolares. Análogos estruturais de caliqueamicina que podemser usado incluem, mas não estão limitados a, gamai I, alfa2l, alfa3l, N-acetil-gamall, PSAG e tetall (Hinman et al., Câncer Research 53: 3336-3342 (1993) e Lode et al., Câncer Research 58: 2925-2928 (1998)). Veja,também, Pat. U.S. Nos. 5.714.586; 5.712.374; 5.264.586 e 5.773.001, cadauma das quais é expressamente incorporada aqui como referência.

Em algumas modalidades, o anticorpo é conjugado a um pró-fármaco capaz de ser liberado em sua forma ativa por enzimas superprodu-zidas em muitos cânceres. Por exemplo, conjugados de anticorpo podem serfeitos com uma forma de pró-fármaco de doxorrubicina em que o componen-te ativo é liberado a partir do conjugado por plasmina. Plasmina é conhecidapor ser superproduzida em muitos tecidos cancerosos (veja Decy et al.,(2004) FASEB Journal 18(3): 565-567).

Em algumas modalidades, os anticorpos são conjugados a toxi-nas enzimaticamente ativas e seus fragmentos. Em algumas modalidades,as toxinas incluem, sem limitação, cadeia A de difteria, fragmentos ativosnão Iigantes de toxina diftérica, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas ae-ruginosá), endotoxina de Pseudomonas, cadeia A de ricina, cadeia A de a-brina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, prote-ínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S),ribonuclease (RNAse), desoxirribonuclease (DNAse), proteína antiviral depokeweed. inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sa-paonaria officinalis, mitogelina, restritocina, fenomicina, neomicina e tricote-cenos. Veja, por exemplo, WO 93/21232 publicada em 28 de out. de 1993.Em algumas modalidades, as toxinas têm baixa imunogenicidade intrínsecae um mecanismo de ação (por exemplo, um mecanismo citotóxico contra um mecanismo citostático) que reduz a oportunidade para as células cancerosasse tornarem resistentes à toxina.

Em algumas modalidades, conjugados são feitos entre os anti-corpos da invenção e imunomoduladores. Por exemplo, em algumas modali-dades, oligonucleotídeos imunoestimulatórios podem ser usados. Essas mo-léculas são imunógenos potentes que podem elicitar respostas de anticorpoantígeno-específicas (veja Datta et al., (2003) Ann. N.Y. Acad. Sei. 1002:105-111). Compsotos imunomodulatórios adicionais podem incluir fator decrescimento de célula-tronco tal como "fator S1", Iinfotoxinas tal como fatorde necrose de tumor (TNF), fator hematopoético tal como uma interleucina,fator estimulador de colônia (CSF) tal como fator estimulador de colônia degranulócitos (G-CSF) ou fator estimulador de macrófago e granulócito (GM-CSF), interferon (IFN) tal como interferon alfa, beta ou gama, eritropoetina etrmbopoetina.

Em algumas modalidades, anticorpos radioconjugados são pro-vidos. Em algumas modalidades, tais anticorpos podem ser feitos usando32P, 33P1 47Sc, 59Fe, 64Cu, 67Cu1 75Se, 77As, 89Sr, 90Y1 "Mo, 105Rh, 109Pdl 125I,131I, 142Pr, 149Pm, 161Th, 166Ho, 169Er, 177Lu, 186Re, 189Re, 194Ir, 198Au, 199Au,211Pb, 212Pb, 213Bil 58Co1 67Ga, 80mBr, 99mTc1 103mRh, 109Pt, 161Ho, 189mOs, 192Ir,152Dy, 211At, 212Bil 223Ra1 219Rnl 215Pol 211Bil 225Ac1 221Frl 217Atl 213Bil 255Fm ecombinações e subcombinações destes. Em algumas modalidades, átomosde boro, gadolínio ou urânio são conjugados aos anticorpos. Em algumasmodalidades, o átomos de boro é 10B, o átomo de gadolínio é 157Gd e o áto-mos de urânio é 235U.

Em algumas modalidades, o conjugado de radionuclídeo tem umradionuclídeo com uma energia entre 20 e 10.000 KeV. O radionuclídeo po-de ser um emissor Auger, com uma energia de menos de 1000 keV, um e-missor P com uma energia entre 20 e 5000 keV, ou um emissor alfa ou 'a'com uma energia entre 2000 e 10.000 keV.

Em algumas modalidades, são providos radioconjugados diag-nósticos que compreendem um radionuclídeo que é um isótopo que emitegama, beta ou positron. Em algumas modalidades, o radionuclídeo tem umaenergia entre 20 e 10.000 KeV. Em algumas modalidades, o radionuclídeo éselecionado do grupo de 18F, 51Mn, 52mMn, 52Fe, 55Co, 64Cu1 68Ga1 72As1 75Br176Br1 82mRb1 83Sr1 89Zr1 94mTc1 51Cr, 57Co1 59Fe, 67Ga, 75Se, 97Ru, 99mTe, 114mIn,1231,1251,13Li e 197Hg.

Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são conju-gados a agentes diagnósticos que são fotoativos ou agentes de contraste.Compostos fotoativos podem compreender compostos tal como cromógenosou corantes. Agentes de contraste podem ser, por exemplo, um íon para-magnético, em que o íon compreende um metal selecionado do grupo decrômio (III), manganês (II), ferro (III), ferro (II), cobalto (II)1 níquel (II)1 cobre(II)1 neodímio (III)1 samário (III)1 itérbio (III)1 gadolínio (III)1 vanádio (II)1 térbio(III)1 disprósio (III)1 hólmio (III) e érbio (III). O agente de contraste tambémpode ser um composto radioopaco usado em técnicas de raios-X oü tomo-grafia computadorizada, tal como um composto de iodo, irídio, bário, gálio etálio. Compostos radioopacos podem ser selecionados do grupo de bário,diatrizoato, óleo etiodizado, citrato de gálio, ácido iocármico, ácido iocetâmi-co, iodamida, iodipamida, ácido iodoxâmico, iogulamida, ioexol, iopamidol,ácido iopanóico, ácido ioprocêmico, ácido iosefâmico, ácido iosérico, iosula-mida meglumina, ácido iosemético, iotasul, ácido iotétrico, ácido iotalâmico,ácido iotróxico, ácido ioxáglico, ácido ioxotrizóico, ipodato, meglumina, me-trizamida, metrizoato, propiliodona e cloreto taloso. Em algumas modalida-des, os imunoconjugados diagnósticos podem conter agentes acentuadoresde ultra-som tal como um Iipossomo preenchido com gás que é conjugado aum anticorpo da invenção. Imunoconjugados diagnósticos podem ser usadospara uma variedade de procedimentos incluindo, mas não limitando a, méto-dos intraoperatório, endoscópico ou intravascular de diagnóstico e detecçãode tumor ou câncer.

Em algumas modalidades, conjugados de anticorpo são feitosusando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionaistal como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano (IT), deriva-dos bifuncionais de imidoésteres (tal comoadipimidato de dimetila HCI), és-teres ativos (tao como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tal como gluta-raldeído), compostos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiami-na), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolieno) e com-postos de flúor bis-ativo (tal como 1,5-flúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exem-pio, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitettaet ai, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopentaacético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agentequelante exemplar para conjugação de radionuclídeo ao anticorpo. Veja WO94/11026. O Iigante pode se um "ligante clivável" facilitando a liberação dofármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante ácido-lábil, ligantesensível a peptidase, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chariet ai, Câncer Research 52: 127-131 (1992)) pode ser usado. Agentes po-dem adicionalmente ser ligados aos anticorpos da invenção através de umunidade de carboidrato.

Em algumas modalidades, proteínas de fusão compreendendoos anticorpos da invenção e agentes citotóxicos podem ser feitas, por exem-pio, por técnicas recombinantes ou síntese peptídica. Em algumas modali-dades, tais imunoconjugados compreendendo o anticorpo antiantígeno tu-moral conjugado com um agente citotóxico são administrados ao paciente.Em algumas modalidades, o imunoconjugado e/ou proteína de antígeno decélula tumoral à qual ele está ligado é/são internalizado(s) pela célula, resul-tando em eficácia terapêutica aumentada do imunoconjugado para matar acélula cancerosa à qual ele se liga. Em algumas modalidades, o agente cito-íi tóxico se direciona ou interfere com ácido nucléico na célula cancerosa. E-xemplos de tais agentes citotóxicos incluem maitansinóides, caliqueamici-nas, ribonucleases e endonucleases de DNA.

Em algumas modalidades, os anticorpos são conjugados a um"receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamentotumoral em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente,seguido por remoção de conjugado não ligado a partir da circulação usandoum agente depurador e então a administração de um "ligante" (por exemplo,avidina) que está conjugada a um agente citotóxico (por exemplo, um radio-nuclídeo).

Em algumas modalidades, os anticorpos são conjugados a umamolécula citotóxica que é liberada dentro de um Iisossomo de célula-alvo.Por exemplo, o fármaco monometil auristatina E (MMAE) pode ser conjuga-do através de uma ligação valina-citrulina que será clivada pela enzima Ii-sossomal proteolítica catepsina B após internalização do conjugado de anti-corpo (veja, por exemplo, WO 03/036577 publicada em 3 de abril de 2003).Em algumas modalidades, o MMAE pode ser aderido ao anticorpo usandoum ligante ácido-lábil contendo uma funcionalidade de hidrazona como aunidade clivável (veja, por exemplo, WO 02/088172 publicada em 11 de nov.De 2002).

Terapia de Pró-fármaco Mediada por Enzima Dependente deAnticorpo (ADEPT)

Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invençãopodem ser usados em ADEPT pela conjugação do anticorpo a uma enzimaque ativa pró-fármaco que converte um pró-fármaco (por exemplo, um agen-te quimioterápico de peptidila, veja WO 81/01145) como um fármaco anti-câncer ativo. Veja, por exemplo, WO 88/07378 e Pat. U.S. No. 4.975.278.

Em algumas modalidades, o componente enzima do imunocon-jugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de agir em um pró-fármaco de tal maneira que converta ele em sua forma mais ativa, citotóxica.

Enzimas que são úteis em ADEPT incluem, mas não estão limi-tadas a, fosfatase alcalinas útil para converter pró-fármacos contendo fosfatoem fármacos livres; arilsulfatase útil para converter pró-fármacos contendosulfato em fármacos livres; citosina deaminase útil para converter 5-fluorcitosina não tóxica no fármacos anticâncer, 5-fluoracila; proteases, talcomo protease de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidase e ca-tepsina (tal como catepsinas B e L), que são úteis para converter pró-fármacos contendo peptídeo em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases,úteis para converter pró-fármacos que contêm substituintes de D-aminoácido; enzimas que clivam carboidrato tal como β-galactosidase e neu-raminidase úteis para converter pró-fármacos glicosilados em fármacos li-vres; beta-lactamase útil para converter pró-fármacos derivados de beta-lactâmicos em fármacos livres; e amidases de penicilinam tal como penicilinaV amidase ou penicilina G amidase, útil para converter fármacos derivadosem seus nitrogênios de amina com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, res-pectivamente, em fármacos livres. Em algumas modalidades, anticorposcom atividade enzimática, também conhecidos na técnica como "aczimas",podem ser usados para converter os pró-fármacos da invenção em fármacosativos livres (veja, por exemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Con-jugados anticorpo-abzima podem ser preparados como descrito aqui paradistribuição da aczima a uma população de célula tumoral.

Em algumas modalidades, as enzimas ADEPT podem ser liga-das covalentemente aos anticorpos por técnicas bem-conhecidas na técnicatal como o uso dos reagentes de reticulação heterobifuncionais discutidosacima. Em algumas modalidades, proteínas de fusão compreendendo pelomenos a região de ligação antigênica de um anticorpo da invenção ligado apelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma enzima da invençãopodem ser construídas usando técnicas de DNA recombinante bem-conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984).

Em algumas modalidades, a identificação de um anticorpo queage de uma maneira citostática em vez de uma maneira citotóxica pode serrealizada pela medição de viabilidade de uma cultura de células alvo tratadaem comparação com uma cultura controle não tratada. A viabilidade podeser detectada usando métodos conhecidos na técnica tal como o ensaio deviabilidade celular CelITiter-Blue® ou o ensaio de viabilidade celular Iumi-nescente Ce I ITiter-G Io® (Promega, números de catálogo G8080 e G5750,respectivamente). Em algumas modalidades, um anticorpo é consideradocomo potencialmente citostático se o tratamento causa uma diminuição nonúmero celular em comparação à cultura controle sem qualquer evidência demorte celular como medido pelos meios descritos acima.

Em algumas modalidades, um ensaio de varredura in vitro podeser realizado para identificar um anticorpo que promove ADCC usando en-saio conhecidos na técnica. Um ensaio exemplar é o ensaio de ADCC in vi-tro. Para preparar células alvo marcadas com crômio 51, linhagens de célu-las tumorais são crescidas em placas de cultura de tecidos e recuperadasusando 10 mM de EDTA estéril em PBS. As células desaderidas são lavadasduas vezes com meio de cultura de células. Células (5 χ 106) são marcadascom 200 uCi de crômio 51 (New England Nuclear/DuPonto) em 37°C poruma hora com mistura ocasional. Células marcadas foram lavadas três ve-zes com meio de cultura de células, então foram ressuspendidas em umaconcentração de 1 χ 105 células/mL. Células são usadas sem opsonização,ou são opsonizadas antes do ensaio por incubação com anticorpo teste a100 ng/mL e 1,25 ng/mL em ensaio PBMC ou 20 ng/mL e 1 ng/mL em ensaioNK. Células mononucleares de sangue periférico são preparadas pela coletade sangue em heparina a partir de doadores saudáveis normais e diluídascom um volume igual de salina tamponada com fosfato (PBS). O sangue éentão colocado sobre LYMPHOCYTE SEPARATION MÉDIUM® (LSM: Or-ganon Teknika) e centrifugado de acordo com as instruções do fabricante.

Células mononucleares são coletadas a partir da interface LSM-plasma esão lavadas três vezes com PBS. Células efetoras são suspendidas emmeio de cultura de células em uma concentração final de 1 χ 107 células/mL.Após purificação através de LSM, células natural killer (NK) são isoladas dePBMCs por seleção negativa usando um kit de isolamento de célula NK euma coluna magnética (Miltenyi Biotech) de acordo com as instruções dofabricante. Células NK isoladas são coletadas, lavadas e ressuspendidas emmeio de cultura de células em uma concentração de 2x106 células/mL. A i-dentidade da células NK é confirmada por análise em citometria de fluxo.Razões variáveis de efetor:alvo são preparadas diluindo-se serialmente ascélulas efetoras (PBMC ou NK) em duas vezes ao longo de filas de uma pla-ca de microtitulação (volume final de 100 μL) em meio de cultura de célula. Aconcentração de células efetoras varia de 1,0x107/mL até 2,0x104AnL paraPBMC e de 2,0x106/mL até 3,9x103/mL para NK. Após titulação de célulasefetoras, 100 pL de célula-alvo marcadas com crômio 51 (opsonizadas ounão opsonizadas) a 1x105 células/mL são aderidas a cada poço da placa.Isto resulta em uma razão inicial efetor:alvo de 100:1 para PBMC e 21:1 paracélula NK. Todos os ensaios são corridos em duplicata e cada placa contémcontroles tanto para Iise espontânea (nenhuma célula efetora) como paralise total (células alvo mais 100 pL de 1% de dodecil sulfato de sódio, 1 N dehidróxido de sódio). As placas foram incubadas a 37°C por 18 horas, após oque os sobrenadantes de cultura de células são recuperados usando umsistema de coleta de sobrenadante (Skatron Instrument, Inc.) e contados emum contador gama de série 5000 auto-gama (Packard) por um minuto. Re-sultados são então expressados como citotoxicidade porcentual usando afórmula: % citotoxicidade = (cpm de amostra-lise espontânea)/(lise total-liseespontânea)x100.

Para identificar um anticorpo que promove CDC, o técnico ver-sado pode realizar um ensaio conhecido na técnica. Um ensaio exemplar é oensaio CDC in vitro. In vitro, atividade CDC pode ser medida pela incubaçãode células expressando antígeno de célula tumoral com soro contendo com-plemento humano (ou de fonte alternativa) na ausência ou presença de con-centrações diferentes de anticorpo teste. A citotoxicidade é então medidapela quantificação de células vivas usando ALAMAR BLUE® (Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202 163-171 (1997)). Ensaios controlesão realizados sem anticorpo e com anticorpo, mas usando soro inativadopor calor e/ou usando células que não expressam o antígeno de célula tumo-ral em questão. Senão, células vermelhas do sangue podem ser revestidascom antígeno tumoral ou peptídeos derivados de antígeno tumoral e entãoCDC pode ser avaliado pela observação de Iise de células vermelhas (veja,por exemplo, Karjalainen e Mantyjarvi, Acta Pathol Microbiol Scand [C] 1981;89(5): 315-9).

Para selecionar anticorpos que induzem morte celular, perda deintegridade de membrana como indicado por, por exemplo, captação de7AAD, azul de tripan, ou Pl, pode ser avaliada em relação ao controle. Umensaio exemplar é o ensaio de captação de Pl usando células que expres-sam antígeno tumoral. De acordo com este ensaio, células que expressamanígeno de célula tumoral são cultivadas em meio Eagle modificado por Dul-becco (D-MEM):Ham's F-12 (50:50) suplementado com 10% de SFB inativa-do por calor (HycIone) e 2 mM de L-glutamina. (Assim, o ensaio é realizadona ausência de complemento e células efetoras imunes). As células tumoraissão semeadas em uma densidade de 3x106 por placa em placas de 100 x20 mm e deixadas aderir durante a noite. O meio é então removido e substi-tuído com meio fresco puro ou meio contendo 10 pg/mL do anticorpo mono-clonal apropriado. As células são incubadas por um período de tempo de 3dias. Após cada tratamento, monocamadas são lavadas com PBS e desade-ridas por tripsinização. Células são então centrifugadas a 1200 rpm por 5minutos a 4°C, o peletizado ressuspendido em 3 mL de tampão de ligaçãode Ca2+ gelado (10 mM de HEPES, pH 7,4, 140 mM de NaCl, 2,5 mM deCaCle) e aliquotado em tubos 12x75 tampados com coador de 35 mm (1ml_ por tubo, 3 tubos por grupo de tratamento) para remoção de grumos decélulas. Tubos então recebem Pl (10 pg/mL). Amostras podem ser analisa-das usando um citômetro de fluxo FACSCAN™ e FACSCONVERT™. Soft-ware CeIIQuest (Becton Dickinson). Aqueles anticorpos que induzem níveisestatisticamente significativos de morte celular como determinado pela cap-tação de Pl podem ser selecionados como anticorpos indutores de mortecelular.

Anticorpos também podem ser triados in vivo por atividade a-poptótica usando 18F-anexina como uma agente de visualização PET. Nesteprocedimento, a anexeina V é radiomarcada com 18F e dada a um teste ani-mal seguindo a dosagem com o anticorpo sob investigação. Um dos eventosmais precoces que ocorre no processo apoptótico na eversão de fosfatidilse-rina no sítio interno da membrana celular para a superfície celular externa,onde está acessível a anexina. Os animais são então submetidos a visuali-zação PET (veja, Yagle et ai, J Nucl Med. 2005 46(4): 658-66). Animaistambém podem ser sacrificados e órgãos individuais ou tumores removidose analisados por marcadores apoptóticos seguindo protocolos padrões.

Enquanto em algumas modalidades câncer pode ser caracteri-zado pela superexpressão de um produto de expressão gênica, o presentepedido provê adicionalmente métodos para tratar câncer que não é conside-rado ser um cêncer que superexpressa antígeno tumoral. Para determinarexpressão de antígeno tumoral em câncer, vários ensaios diagnósti-cos/prognósticos estão disponíveis. Em algumas modalidades, superexpres-são de produto de expressão gênica pode ser analisada por IHC. Secçõesde tecido umedecidas com parafina a partir de uma biopsia de tumor podemser submetidas ao ensaio IHC e estar de acordo com critérios de intensidadede marcação de proteína de antígeno tumoral como se segue:

Pontuação 0: nenhuma marcação é observada ou marcação emmembrana é observada em menos de 10% de células tumorais.

Pontuação 1+: uma marcação de membrana perceptível fra-ca/apenas é detectada em mais de 10% de células tumorais. As células a-penas são marcadas em parte de suas membranas.Pontuação 2+: uma marcação de membrana completa fraca amoderada é observada em mais de 10% de células tumorais.

Pontuação 3+: uma marcação de membrana completa modera-da a forte é observada em mais de 10% de células tumorais.

Aqueles tumores com pontuações 0 ou 1+ para avaliação desuperexpressão de antígeno tumoral podem ser caracterizados como nãosuperexpressando o antígeno tumoral, enquanto que aqueles tumores compontuações 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como superexpressando oantígeno tumoral.

Alternativamente, ou adicionalmente, ensaio FISH tal como oINFORM™ (vendido por Ventana, Ariz) ou PATHVISION™ (Vysis, III.) podeser efetuado em tecido tumoral umedecido em parafina fixado em formalinapara determinar a extensão (se houver alguma) de superexpressão de antí-geno tumoral no tumor.

Adicionalmente, anticorpos podem ser quimicamente modifica-dos por conjugação covalente a um polímero para aumentar sua meia-vidade circulação, por exemplo. Cada molécula de anticorpo pode ser aderida auma ou mais (isto é, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais) moléculas de polímero. Moléculasde polímero são de preferência aderidas a anticorpos por moléculas ligantes.

O polímero pode, em geral, ser um polímero sintético ou que ocorra natural-mente, por exemplo, um polímero de polialqueno, polialquileno ou polioxial-quileno de cadeia linear ou ramificada substituída opcionalmente ou um po-lissacarídeo ramificado ou não ramificado, por exemplo, homo- ou hetero-polissacarídeo. Em algumas modalidades, os polímeros são polioxietilenopolióis e polietileno glicol (PEG). PEG é solúvel em água a temperatura am-biente e tem a fórmula geral: R(0—CH2-CH2)n O—R onde R pode ser hi-drogênio, ou um grupo protetor tal como um grupo alquila ou alcanol. Emalgumas modalidades o grupo protetor tem entre 1 e 8 carbonos. Em algu-mas modalidades, o grupo protetor é metila. O símbolo η é um número intei-ro positivo, entre 1 e 1.000, ou 2 e 500. Em algumas modalidades, o PEGtem um peso molecular médio entre 1000 e 40.000, entre 2000 e 20.000, ouentre 3.000 e 12.000. Em algumas modalidades, o PEG tem pelo menos umgrupo hidróxi. Em algumas modalidades, o hidróxi é um grupo de hidróxi ter-minal. Em algumas modalidades, é esse grupo hidróxi que é ativado parareagir com um grupo amino livre no inibidor. Entretanto, entenda-se que otipo e a quantidade dos grupos reativos podem ser variados para obter umPEG/anticorpo conjugado covalentemente da presente invenção. Polímerose métodos para aderi-los a peptídeos, são mostrados em Patentes U. S.Números 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285 e 4.609.546 cada uma das quaisé por meio deste incorporada como referência em sua totalidade.

Oligonucleotídeos

Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é um oligonu-cleotídeo. Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é um oligonucle-otídeo compreendendo uma seqüência selecionada do grupo que consisteem SEQ ID NOS: 367-382.

Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleo-tídeo de RNAi ou anti-sentido incluindo siRNAs e shRNAs. Em algumas mo-dalidades, o oligonucleotídeo é complementar a uma região, domínio, porçãoou segmento do gene LIV-1 ou produto do gene. Em algumas modalidades,o oligonucleotídeo compreende de cerca de 5 até cerca de 100 nucleotídeos,de cerca de 10 até cerca de 50 nucleotídeos, de cerca de 12 até cerca de 35nucleotídeos e de cerca de 18 até cerca de 25 nucleotídeos. Em algumasmodalidades, o oligonucleotídeo é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelomenos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me-nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%homólogo a uma região, porção, domínio, ou segmento do gene LIV-1 ouproduto do gene. Em algumas modalidades, há homologia de seqüênciaconsiderável por pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ou 100 nucleotídeosconsecutivos do gene LIV-1 ou produto do gene. Em algumas modalidades,há homologia de seqüência considerável pelo comprimento inteiro do geneLIV-1 ou produto do gene. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo seliga sob condições de hibridização moderadas ou estringentes a uma molé-cula de ácido nucléico que tem uma seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:1.Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é uma molécu-la de RNA de duplo filamento filamento (dsRNA) e trabalha através de RNAi(RNA de interferência). Em algumas modalidades, uma filamento do dsRNAé pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%,pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelomenos 98%, pelo menos 99%, ou 100% homólogo a uma região, porção,domínio, ou segmento do gene LIV-1. Em algumas modalidades, há homolo-gia de seqüência considerável por pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50,100, 200, 300, 400, 500 ou 1000 nucleotídeos consecutivos do gene LIV-1.Em algumas modalidades, há homologia de seqüência considerável pelocomprimento inteiro do gene LIV-1.

Em algumas modalidades, oligonucleotídeos da invenção sãousados em uma reação em cadeia polimerase (PCR). Essa seqüência podeser baseada em (ou designada a partir de) uma seqüência genômica ou se-qüência de cDNA e é usada para amplificar, confirmar ou detectar a presen-ça de um DNA complementar ou RNA similar, idêntico em uma célula ou te-cido particular.

Pequenas moléculas

Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é uma peque-na molécula. Conforme aqui utilizado, o termo "pequena molécula" se referea um composto não-polimérico orgânico ou inorgânico que tem um peso mo-lecular que é menor que cerca de 10 quilodáltons. Exemplos de pequenasmoléculas incluem peptídeos, oligonucleotídeos, compostos orgânicos, com-postos inorgânicos e semelhantes. Em algumas modalidades, a pequenamolécula tem um peso molecular que é menor que cerca de 9, cerca de 8,cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2, oucerca de 1 quilodálton.

Miméticos

Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é um mimético.Conforme aqui utilizado, o termo "mimético(a)" é usado para referir-se acompostos que imitam a atividade de um peptídeo. Miméticos não são pep-tídeos, mas podem compreender aminoácidos ligados por ligação não peptí-dicas. Patente U.S. No. 5.637.677, depositado em 10 de junho de 1997 epedidos de patente dessa, todos os quais são incorporados aqui como refe-rência, contêm guia detalhado na produção de miméticos. Em resumo, a es-trutura tridimensional do peptídeo que interage especificamente com a estru- tura tridimensional do LIV-1 é duplicada por uma molécula que não é umpeptídeo. Em algumas modalidades, o mimético de LIV-1 é um mimético deLIV-1 ou mimético de um Iigante de LIV-1.

Iscas

Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é uma isca compreendendo pelo menos uma porção de um polipeptídeo de LIV-1. Emalgumas modalidades, a isca compete com polipeptídeos de LIV-1 naturaispor complexos de zinco-veículo de zinco. Em algumas modalidades, a isca émarcada para facilitar quantificação, qualificação e/ou visualização. Em ou-tras modalidades, a isca compreende adicionalmente uma unidade para faci- litar isolamento e/ou separação da isca ou do complexo isca-zinco ou isca-veículo de zinco. Em algumas modalidades, a isca funciona pela captura dezinco e/ou de um veículo de zinco (zinco complexado ou não complexado) eprevenção desse de interagir com polipeptídeo de LIV-1 de sinalização. Emalgumas modalidades, a isca compreende pelo menos uma porção de um polipeptídeo de LIV-1 fusionado a um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Métodos para Tratar/Prevenir Câncer

A presente invenção provê métodos para tratar e/ou prevenircâncer ou sintomas de câncer em um indivíduo compreendendo administrarao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais modu- ladores da presente invenção. Em algumas modalidades, o câncer é umcâncer associado com superexpressão de LIV-1. Em algumas modalidades,o câncer é câncer de mama, câncer de pele, câncer de esôfago, câncer he-pático, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervi-cal, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de ovário, mieloma múltiplo e melanoma. Em algumas modalidades, o câncer é um tecido regulado nãohormonalmente. Em algumas modalidades, o câncer de mama é um câncerde mama ER-positivo, câncer de mama ER-negativo e câncer de mama me-tastático. Em algumas modalidades, o câncer de mama é adenocarcinomade duto, adenocarcinoma Iobular ou adenocarcinoma metastático. Em algu-mas modalidades, o indivíduo foi diagnosticado como tendo um câncer oucomo estando predisposto ao câncer.

Sintomas de câncer são bem-conhecidos por aqueles versadosna técnica e incluem, sem limitação, nódulos na mama, alterações no mami-lo, cistos na mama, dor na mama, morte, perda de peso, fraqueza, excessode fadiga, alimentação dificultosa, perda de apetite, tosse crônica, piora dafalta de respiração, sangue expelido na tosse, sangue na urina, sangue nasfezes, náusea, vômito, metástase hepáticas, metástases pulmonares, metás-tases ósseas, volume abdominal, intumescência, fluido na cavidade perito-neal, sangramento vaginal, constipação, distensão abdominal, perfuração docólon, peritonite aguda, dor, sangue em vômito, sudorese intensa, febre,pressão sangüínea alta, anemia, diarréia, icterícia, tonteira, calafrios, es-pasmos musculares, metástases de cólon, metástases de bexiga, metásta-ses renais e metástases pancreáticas, deglutição dificultosa e semelhantes.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto que mo-dula pode ser determinada empiricamente, de acordo com os procedimentosbem-conhecidos por químicos medicinais e dependerá, entre outras coisas,da idade do paciente, gravidade da condição e da formulação farmacêuticafinal desejada. A administração dos moduladores da presente invenção podeser efetuada, por exemplo, por inalação ou supositório ou para tecido demucosa tal como por lavagem vaginal, retal, eretral, bucal e de tecido sublin-gual, oralmente, topicamente, intranasalmente, intraperitonealmente, paren-teralmente, intravenosamente, intralinfaticamente, intratumoralmente, intra-muscularmente, intersticialmente, intra-arterialmente, subcutaneamente, in-tra-ocularmente, intrasinovial, transepitelial e transdermicamente. Em algu-mas modalidades, os inibidores são administrados por lavagem, oralmenteou inter-arterialmente. Outros métodos adequados de introdução tambémpodem incluir dispositivos recarregáveis ou biodegradáveis e dispositivospoliméricos de liberação prolongada ou controlada. Como discutido acima,as composições terapêuticas desta invenção também podem ser administra-das como parte de uma terapia de combinação com outros agentes anticân-cer ou outro regime de tratamento antidoença óssea conhecido.

A presente invenção provê adicionalmente métodos para modu-lar uma atividade biológica relacionada a LIV-1 em um paciente. Os métodocompreendem administrar ao paciente uma quantidade de um modulador deLIV-1 eficaz para modular uma ou mais atividades biológicas de LIV-1. En-saio adequados para medir atividades biológicas de LIV-1 são expostas su-pra e infra.

A presente invenção também provê métodos para inibir cresci-mento de célula cancerosa em um paciente em necessidade destes com-preendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oumais moduladores de LIV-1 ao paciente. Ensaios adequados para medircrescimento celular relacionado a LIV-1 são conhecidos por aqueles versa-dos na técnica e são expostos supra e infra.

A presente invenção provê adicionalmente métodos para inibircâncer em um paciente em necessidade destes. Os métodos compreendemdeterminar se o paciente é um candidato para terapia LIV-1 como descritoaqui e administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou maismoduladores de LIV-1 ao paciente se o paciente é um candidato para terapiaLIV-1. Se o paciente não for um candidato para terapia de LIV-1, o pacienteé tratado com terapia de câncer convencional.

A presente invenção provê adicionalmente métodos para inibircâncer em um paciente diagnosticado ou suspeito de ter um câncer. Os mé-todos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz deum ou mais moduladores de LIV-1 ao paciente.

A presente invenção também provê métodos para inibir a intera-ção de duas ou mais células em um paciente compreendendo administraruma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador de LIV-1 ao cita-do paciente. Ensaios adequados para medir interação celular relacionada aLIV-1 são conhecidos por aqueles versados na técnica e são expostos suprae infra.

A presente invenção também provê métodos para modular umou mais sintomas de câncer em um paciente compreendendo administrar aocitado paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz das composiçõesde LIV-1 aqui descritas.

A presente invenção provê adicionalmente métodos para inibircrescimento celular em um paciente em necessidade destes compreenden-do administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de ummodulador de LIV-1. Ensaios adequados para medir crescimento celular in-dependente de ancoragem relacionado a LIV-1 são expostos supra e infra.

A presente invenção também provê métodos para inibir a migra-ção de células cancerosas em um paciente em necessidade destes compre-endendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficazde um modulador de LIV-1. Ensaios adequados para medir migração celularrelacionada a LIV-1 são conhecidos por aqueles versados na técnica.

A presente invenção provê adicionalmente métodos para inibiradesão de células cancerosas em um paciente em necessidade destescompreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um modulador de LIV-1. Ensaios adequados para medir adesãocelular relacionada a LIV-1 são conhecidos por aqueles versados na técnica.

A presente invenção também provê métodos para tratar profilati-camente um paciente que está predisposto a desenvolver câncer, uma me-tástase de câncer ou que tenha tido uma metástase e é portanto, suscetívela uma reincidência ou recorrência. Os métodos são particularmente úteis emindivíduos de alto risco que, por exemplo, têm uma história familiar de cân-cer ou de tumores que fazem metástase, ou mostram uma predisposiçãogenética para uma metástase de câncer. Em algumas modalidades, os tu-mores são tumores relacionados a LIV-1. Adicionalmente, os métodos sãoúteis para prevenir pacientes de ter recorrências de tumores relacionados aLIV-1 que tenham tido tumores relacionados a LIV-1 removidos por resecçãocirúrgica ou tratados com um tratamento de câncer convencional.

A presente invenção também provê métodos para inibir progres-são de câncer e/ou causar regressão de câncer compreendendo administrarao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador deLIV-1.

Em algumas modalidades, o paciente em necessidade de trata-mento anticâncer é tratado com os moduladores de LIV-1 da presente inven-ção em conjunto com quimioterapia e/ou terapia por radiação. Por exemplo,seguindo a administração dos moduladores de LIV-1, o paciente tambémpode ser tratado com uma quantidade terapeuticamente eficaz de radiaçãoanticâncer. Em algumas modalidades, tratamento quimioterapêutico é provi-do em combinação com moduladores de LIV-1. Em algumas modalidades,moduladores de LIV-1 são administrados em combinação com quimioterapiae/ou terapia por radiação.

Métodos para tratamento compreendem administrar doses úni-cas ou múltiplas de um ou mais moduladores de LIV-1 ao paciente. Em al-gumas modalidades, os moduladores de LIV-1 são administrados comocomposições farmacêuticas injetáveis que são estéreis, livres de pirógeno ecompreendem os moduladores de LIV-1 em combinação com um veículo oudiluente farmaceuticamente aceitável.

Em algumas modalidades, os regimes terapêuticos da presenteinvenção são usados com regimes de tratamento convencional para câncerincluindo, sem limitação, cirurgia, terapia por radiação, ablação hormonale/ou quimioterapia. A administração dos moduladores de LIV-1 da presenteinvenção pode ocorrer antes de, simultaneamente com, ou após tratamentode câncer convencional. Em algumas modalidades, dois ou mais modulado-res de LIV-1 diferentes são administrados ao paciente.

Em algumas modalidades, a quantidade de modulador de LIV-1administrado ao paciente é eficaz para inibir um ou mais de crescimento decélula cancerosa, formação de tumor, proliferação de célula cancerosa, me-tástase de célula cancerosa, migração celular, angiogênese, sinalização deLIV-1, inibir adesão célula-célula mediada por LIV-1, interação de membranacélula-célula mediada por LIV-1, interação matriz extracelular-célula mediadapor LIV-1, atividades mediadas por integrina, degradação de matriz extrace-lular-célula mediada por LIV-1, e expressão de LIV-1. Em algumas modali-dades, a quantidade de modulador de LIV-1 administrado ao paciente é efi-caz para aumentar morte de célula cancerosa através de apoptose.

Terapia de Combinação

Em algumas modalidades, a invenção provê composições com-preendendo dois ou mais moduladores de LIV-1 para prover eficácia aindamelhorada contra câncer. Em algumas modalidades, os moduladores de LIV-1 são anticorpos monoclonais. Composições compreendendo dois ou maisanticorpos de LIV-a podem ser administradas a pessoas ou mamíferos quesofrem de, ou estão predispostos a sofrer de, câncer. Um ou mais anticorpotambém podem ser administrados com outros agentes terapêuticos, tais co-mo um agente citotóxico, ou quimioterápico de câncer. Administração simul-tânea de dois ou mais agentes terapêuticos não requer que os agentes se-jam administrados ao mesmo tempo ou pela mesma via, visto que há umasobreposição no período de tempo durante o qual os agentes estão exer-cendo seus efeitos terapêuticos. Administração simultânea ou seqüencial écontemplada, como é administração em dias ou semanas diferentes.

Em algumas modalidades, os métodos providos da invençãocontemplam a administração de combinações, ou "coquetéis" de anticorposdiferentes. Tais coquetéis de anticorpos podem ter certas vantagens vistoque elas contêm anticorpos que exploram diferentes mecanismos efetoresou combinam diretamente anticorpos citotóxicos com anticorpos que se ba-seiam em funcionalidade efetora imune. Tais anticorpos em combinação po-dem exibir efeitos terapêuticos sinergísticos.

Um agente citotóxico se refere a uma substância que inibe ouprevine a função de células e/ou causa a destruição de células. O termo des-tina-se a incluir isótopo radioativos (por exemplo, 131I1125I, 90Y e 186Re), agen-tes quimioterápicos e toxinas tal como toxinas enzimaticamente ativas deorigem bacteriana, fúngica, vegetal ou anima ou toxinas sintéticas, ou frag-mentos destas. Um agente não-citotóxico se refere a uma substância quenão inibe ou previne a função de células e não causa destruição de células.Um agente não-citotóxico pode incluir um agente que pode ser ativado paraser citotóxico. Um agente não-citotóxico pode incluir uma microesfera, Iipos-somo, matriz ou partícula (veja, por exemplo, Publicações de Patente U. S.2003/0028071 e 2003/0032995 que são incorporadas como referência aqui).Tais agentes podem ser conjugados, acoplados, ligados ou associados comum anticorpo de acordo com a invenção.

Em algumas modalidades, medicamentos de câncer convencio-5 nais são administrados com as composições da presente invenção. Medi-camentos de câncer convencionais incluem:

a) agentes quimioterápicos de câncer;

b) agentes adicionais;

c) pró-fármacos.

Agentes quimioterápicos de câncer incluem, sem limitação, a-gentes alquilantes, tal como carboplatina e cisplatina; agentes alquilantes demostarda e nitrogênio; agentes alquilantes de nitrosouréia, tal como carmus-tina (BCNU); antimetabólitos, tal como metotrexato; ácido folínico; antimeta-bólitos análogos de purina, mercaptopurina; antimetabólitos análogos de pi-rimidina, tal como fluoracil (5-FU) e gencitabina (Gemzar®); antineoplásicoshormonais, tal como goserelina, Ieuprolida e tamoxifeno; antineoplásicos na-turais, tal como aldesleucina, interleucina-2, docetaxel, etoposídeo (VO-16),interferon alfa, paclitaxel (Taxol®) e tretinoína (ATRA); antineoplásicos natu-rais antibióticos, tal como bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxor-rubicina, daunomicina e mitomicinas incluindo mitomicina C; e antineoplási-cos naturais de vinca alcalóide, tal como vinblastina, vincristina, vindesina;hidroxiuréia; aceglatona, adriamicina, ifosfamida, enocitabina, epitiostanol,aclarrubicina, ancitabina, nimustina, cloreto de procarbazina, carboquona,carboplatina, carmofur, cromomicina A3, polissacarídeos antitumorais, fato-res de plaquetaantitumorais, ciclofosfamida (Cytoxin®), esquizofilan, citara-bina (citosina arabinosídeo), dacarbazina, tioinosina, tiotepa, tegafur, dolas-tatinas, análogos de dolastatina tal como auristatina, CPT-11 (irinotecano),mitozantrona, vinorrelbina, teniposídeo, aminopterina, carminomicina, espe-ramicinas (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 4.675.187), neocarzinostati-na, OK-432, bleomicina, furtulon, broxuridina, bussulfano, honvano, peplomi-cina, bestatina (Ubenimex®), interferon-β, mepitiostano, mitobronitol, melfa-lan, peptídeos de lamicina, lentinano, extrato de Coriolus versicolor, tega-fur/uracila, estramustina (estrégeno/mecloretamina).

Agentes adicionais que podem ser usados como terapia parapaciente com câncer incluem EPO, G-CSF, ganciclovir; antibióticos, Ieuprole-to; meperidina; zidovudina (AZT); interleucinas 1 até 18, incluindo mutantese análogos; interferons ou citocinas, tal como interferons α, β e γ hormônios,tal como hormônio Iiberador de hormônio Iuteinizante (LHRH) e análogos ehormônio Iiberador de gonadotrofina (GnRH); fatores de crescimento, talcomo fator de crescimento e transformante-β (TGF-β), fator de crescimentode fibroblasto (FGF), fator de crescimento neural (NGF), fator Iiberador dehormônio de crescimento (GHRF), fator de crescimento epidérmico (EGF),fator de crescimento homólogo a fator de crescimento de fibroblasto (FG-FHF), fator de crescimento de hepatócito (HGF) e fator de crescimento deinsulina (IGF); fator de necrose de tumor-α & β (TNF-a & β); fator de inibiçãode invasão-2 (IF-2); proteínas morfogenéticas ósseas 1-7 (BMP 1-7); somas-tatina; timosina-a-1; γ-globulina; superóxido dismutase (SOD); fatores com-plemento; fatores antiangiogênese; materiais antigênicos e prós-fármacos.

Pró-fármaco se refere a uma forma precursora ou derivada deuma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica ou não-citotóxica a célula tumorais em comparação com o fármaco parental e é ca-paz de ser enzimaticamente ativado ou convertido em na forma parental ati-va ou na mais ativa. Veja, por exemplo, Wilman, "Prodrugs in Câncer Che-motherapy" Biochemical Society Transactions, 14: 375-382, 615th MeetingBelfast (1986) e Stella et ai, "Produrgs: A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et ai, (ed.), pp. 247-267,Humana Press (1985). Pró-fármacos incluem, mas não estão limitados a,pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo peptídeo, pró-fármacosmodificados com D-aminoácidos, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacoscontendo b-lactâmicos, pró-fármacos contendo fenoxiacetamida opcional-mente substituída ou pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionalmentesubstituída, pró-fármacos de 5-fIuorcitosina e outros 5-fluoruridina que po-dem ser convertidos no fármaco livre citotóxico mais ativo. Exemplos de fár-maços citotóxicos que podem ser derivados em uma forma de pró-fármacopara uso aqui incluem, mas não estão limitados a, aqueles agentes quimiote-rápicos descritos acima.

Aspectos Clínicos

Em algumas modalidades, os métodos e composições da pre-sente invenção são particularmente úteis em câncer de mama, câncer depele, câncer de esôfago, câncer hepático, câncer pancreático, câncer depróstata, câncer uterino, câncer cervical, câncer de pulmão, câncer de bexi-ga, câncer de ovário, mieloma múltiplo e melanoma. Em algumas modalida-des, o câncer é adenocarcinoma de duto, adenocarcinoma Iobular ou ade-nocarcinoma metastático.

Composições Farmacêuticas

A presente invenção também provê composições farmacêuticascompreendendo um ou mais moduladores de LIV-1 descrito aqui e um veícu-lo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, as composiçõesfarmacêuticas são preparadas como injetáveis, como soluções líquidas oususpensões; formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em,veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas. Liposso-mos estão incluídos dentro da definição de um veículo farmaceuticamenteaceitável. Sais farmaceuticamente aceitáveis também podem estar presen-tes na composição farmacêutica, por exemplo, sais de minerais ácidos talcomo cloretos, brometos, fosfatos, sulfatos e semelhantes; e os sais de áci-dos orgânicos tal como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e se-melhantes. Uma discussão completa de excipientes farmaceuticamente acei-táveis está disponível em Remington: The Science and Practice of Pharmacy(1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins.

Métodos para Detectar LIV-1

A presente invenção também provê métodos para detectar LIV-1. Em algumas modalidades, LIV-1 está presente em um paciente ou emuma amostra de paciente. Em algumas modalidades, o método compreendeadministrar uma composição compreendendo um ou mais moduladores deLIV-1 ao paciente e detectar a localização do agente de visualização no pa-ciente. Em algumas modalidades, a amostra do paciente compreende célu-las cancerosas. Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 está ligadoa um agente de visualização ou está detectavelmente marcado. Em algumasmodalidades, o modulador de LIV-1 é um anticorpo de LIV-1 conjugado auma agente de visualização e é administrado a um paciente para detectarum ou mais tumores ou para determinar suscetibilidade do paciente a terapiade LIV-1. Os anticorpos marcados se ligarão à alta densidade de receptoresnas células e desse modo se acumularam nas células tumorais. Usando téc-nicas de visualização padrões, o sítio dos tumores pode ser detectado.

A presente invenção também provê métodos para visuali-zar/detectar células ou tumores expressando ou superexpressando LIV-1compreendendo por em contato uma composição compreendendo um mo-dulador de LIV-1 com uma amostra e detectar a presença do modulador deLIV-1 na amostra. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra dopaciente. Em algumas modalidades, a amostra do paciente compreende cé-lulas cancerosas. Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 está liga-do a um agente de visualização ou está detectavelmente marcado.

A presente invenção também provê métodos para quantificar aquantidade de LIV-1 presente em um paciente, célula ou amostra. Os méto-dos compreendem administrar um ou mais anticorpos, sondas ou moléculaspequenas a um paciente ou amostra e detectar a quantidade de LIV-1 pre-sente na amostra. Em algumas modalidades, os anticorpos, sondas ou mo-léculas pequenas estão ligadas a um agente de visualização ou estão detec-tavelmente marcados. Tal informação indica, por exemplo, se um tumor estárelacionado a LIV-Iou não e, portanto, se tratamentos específicos devem serusados ou evitados. Em algumas modalidades, usando técnicas padrõesbem-conhecidas pelos versados na técnica, amostras que se acredita queincluem células tumorais são obtidas e postas em contato com anticorpos,sondas, oligonucleotídeos e pequenas moléculas marcadas. Após remoçãode quaisquer anticorpos, sondas, oligonucleotídeos ou pequenas moléculasnão ligados, marcados, a quantidade de anticorpos, peptídeos, oligonucleo-tídeos ou miméticos marcados ligados à células, ou a quantidade de anticor-pos, peptídeos, oligonucleotídeos ou miméticos removidos como não ligadosé determinada. A informação se relaciona diretamente à quantidade de LIV-1presente.

A visualização pode ser realizada usando procedimentos bem-conhecidos daqueles de conhecimento ordinário na técnica. Visualizaçãopode ser realizada, por exemplo, por radiocintigrafia, visualização por resso-nância magnética nuclear (MRI) ou tomografia computadorizada (varredurade TC). Os radiomarcadores mais comumente empregados para agentes devisualização incluem iodo e índio radioativo. A visualização por varredura deTC pode empregar um metal pesado tal como quelato de ferro. Varredura deMRI pode empregar quelatos de gadolínio ou manganês. Adicionalmente,tomografia por emissão de pósitron (PET) pode ser possível usando emisso-res de pósitron de oxigênio, nitrogênio, ferro, carbono ou gálio. A visualiza-ção também pode ser realizada usando corantes sensíveis a zinco para mo-nitorar a atividade de Liv-1 in vivo.Tais métodos são conhecidos por aquelesversados na técnica. Exemplos de tais métodos são discutidos por A. Takedaet al, Câncer Research 61, 5065-5069, 1o. de julho de 2001 e C. Frederick-son, Sci STKE, 13 de maio de 2003 (182); cada uma das quais é incorpora-da como referência em sua totalidade.

Em algumas modalidades, o modulador de LIV-1 é um anticorpode LIV-1. Em algumas modalidades, o modulador está ligado a um agente devisualização ou está marcado detectavelmente. Em algumas modalidades, oagente de visualização é 18F, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 77Br, 87MSr, 86Y, 90Y,99MTc, 111In, 1231,1251,127Cs, 129Cs, 131I1132I1197Hg, 203Pb, ou 206Bi.

Métodos de detecção são bem-conhecidos por aqueles versa-dos na técnica. Por exemplo, método para detectar polinucleotídeos incluem,mas não estão limitados a PCR, transferência de Northern, transferência deSouthern, proteção de RNA e hibridização de DNA (incluindo hibridização insitu). Métodos para detectar polipeptídeos incluem, mas não estão limitadosa, transferência de Western, ELISA, ensaios de atividade enzimática, trans-ferência em fenda, impressão digital de massa peptídica, eletroforese, imu-noquímica e imuno-histoquímica. Outros exemplos de métodos de detecçãoincluem, mas não estão limitados a, radioimunoensaio (RIA), imunoensaiopor quimioluminescência, fluorimunoensaio, fluorimunoensaio decidido portempo (TR-FIA), microscopia fluorescente de duas cores, ou ensaio de imu-nocromatografia (ICA), todos bem-conhecidos por aqueles versados na téc-nica. Em algumas modalidades preferidas da presente invenção, a expres-são de polinucleotídeos é detectada usando metodologias de PCR e a pro-dução de polipeptídeo é detectada usando tecnologia de ELISA.

Métodos para distribuir um agente citotóxico ou um agentediagnóstico para uma célula

A presente invenção também provê métodos para distribuir umagente citotóxico ou um agente diagnóstico a uma ou mais células que ex-pressam LIV-1. Em algumas modalidades, os métodos compreendem porem contato um modulador de LIV-1 da presente invenção conjugado a umagente citotóxico ou agente diagnóstico com a célula.

Métodos para determinar o prognóstico de um paciente comcâncer

A presente invenção também provê métodos para determinar oprognóstico de um paciente com um câncer associado a LIV-1. Os métodoscompreendem determinar a razão de LIV-1-delta para LIV-1 em uma amostrade paciente. Embora não desejando estar ligado por teoria, os presentesinventores descobriram que altos níveis de LIV-1-delta em relação a LIV-1 secorrelacionam com câncer menos agressivo e/ou câncer mais receptivo atratamento. Conseqüentemente, em algumas modalidades, altos níveis deLIV-1-delta em relação a LIV-1 são indicativos de um paciente com um bomprognóstico para sobrevivência prolongada e/ou tratamento bem-sucedidocom um modulador de LIV-1 da presente invenção e/ou medicamento decâncer convencional. Em algumas modalidades, um bom prognóstico é indi-cado por uma razão LIV-1-delta:LIV-1 de pelo menos 2:1, pelo menos 3:1,pelo menos 4:1, ou pelo menos 5:1. Em algumas modalidades, razões deLIV-1-delta:LIV-1 são determinadas pela medição de níveis de mRNA de pro-teína.

Em algumas modalidades, métodos para determinar o prognós-tico de um paciente com um câncer associado a LIV-1 compreende detectarLIV-1 ligado à membrana plasmática de uma célula em uma amostra de pa-ciente. Em algumas modalidades, a detecção de LIV-1 ligado à membranaplasmática de uma célula em uma amostra de paciente não é indicativo deum bom prognóstico para sobrevivência prolongada e ou tratamento bem-sucedido com um modulador de LIV-1 da presente invenção e/ou medica-mento de câncer convencional.

Em algumas modalidades, LIV-1 é codificado por um ácido nu-cléico que tem uma seqüência de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades,LIV-1 tem uma seqüência de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, LIV-1-delta tem uma seqüência de SEQ ID NO: 365.

Método para determinar suscetibilidade a terapia de LIV-1A presente invenção também provê métodos para determinar asuscetibilidade de um paciente a terapia de LIV-1. Os métodos compreen-dem detectar a presença ou ausência de evidência de expressão diferencialde LIV-1 em um paciente ou amostra de paciente. A presença de evidênciade expressão diferencial de LIV-1 no paciente ou amostra é indicativo de umpaciente que é suscetível a terapia de LIV-1. Em algumas modalidades, aausência de evidência de expressão diferencial de LIV-1 no paciente ou a-mostra é indicativo de um paciente que não é candidato para terapia de LIV-1.

Em algumas modalidades, os métodos terapêuticos compreen-dem primeiro identificar pacientes suscetíveis a terapia de LIV-1 compreen-dendo administrar ao paciente em necessidade destes uma composiçãocompreendendo um modulador de LIV-1 ligado a um agente de visualizaçãoe detectar a presença ou ausência de evidência do gene ou produto gênicono paciente. Em algumas modalidades, os métodos terapêuticos compreen-dem adicionalmente administrar um ou mais moduladores de LIV-1 ao paci-ente se o paciente é um candidato para terapia de LIV-1 e tratar o pacientecom tratamento de câncer convencional se o paciente não é um candidato aterapia de LIV-1.

Em alguns métodos terapêuticos, um ou mais moduladores deLIV-1 são administrados aos pacientes sozinhos ou em combinação comoutros medicamentos anticâncer quando o paciente é identificado como ten-do um câncer ou estando suscetível a um câncer.

Métodos para estimar a progressão de câncer

A invenção também provê métodos para estimar a progressãode câncer em um paciente compreendendo comparar o nível de um produtode expressão de LIV-1 em uma amostra biológica em um primeiro ponto detempo com o nível do mesmo produto de expressão em um segundo pontode tempo. Uma mudança no nível do produto de expressão no segundo pon-to de tempo em relação ao primeiro ponto de tempo é indicativo da progres-são do câncer.

Métodos para Triar

A presente invenção também provê métodos para triar agentesanticâncer. Os métodos compreendem por em contato uma célula expres-sando LIV-1 com um composto candidato e determinar se uma atividade bio-lógica relacionada a LIV-1 é modulada. Em algumas modalidades, a inibiçãode um ou mais de crescimento de célula cancerosa, atividades mediadas porintegrina, formação de tumor, proliferação de célula cancerosa, metástase decélula cancerosa, migração celular, angiogênese, sinalização de LIV-1, ade-são célula-célula mediada por LIV-1, interação de membrana célula-célulamediada por LIV-1, interação matriz extracelular-célula mediada por LIV-1,degradação de matriz extracelular-célula mediada por LIV-1, e expressão deLIV-1 é indicativo de um agente anticâncer.

A presente invenção provê adicionalmente métodos para identi-ficar um inibidor de câncer. Os métodos compreendem por em contato umacélula expressando LIV-1 com um composto candidato e um Iigante de LIV-1e determinar se uma atividade biológica relacionada a LIV-1 é modulada. Emalgumas modalidades, a inibição de um ou mais de crescimento de célulacancerosa, atividades mediadas por integrina, formação de tumor, prolifera-ção de célula cancerosa, metástase de célula cancerosa, migração celular,angiogênese, sinalização de LIV-1, adesão célula-célula mediada por LIV-1,interação de membrana célula-célula mediada por LIV-1, interação matrizextracelular-célula mediada por LIV-1, degradação de matriz extracelular-célula mediada por LIV-1 e expressão de LIV-1 é indicativo de um inibidor decâncer. Em algumas modalidades, quantidade de modulador de LIV-1 admi-nistrada ao paciente é eficaz para aumentar apoptose de célula cancerosa.

Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para triaragentes anticâncer, particularmente agentes anticâncer metastático pela, porexemplo, varredura de moduladores putativos por uma habilidade de modu-lar a atividade ou nível de um marcador a jusante. Em algumas modalidades,agentes candidatos que diminuem níveis de ciclina D1, reduzem níveis deMT1-MMP1 ou reduzem níveis de zinco citoplasmático são identificados co-mo agente anticâncer.

Métodos para purificar LIV-1

Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para puri-ficar proteína LIV-1 de uma amostra compreendendo LIV-1. Os métodoscompreendem prover uma matriz de afinidade compreendendo um anticorpode LIV-1 da presente invenção ligado a um suporte sólido, por em contato aamostra com a matriz de afinidade para formar um complexo matriz de afini-dade-proteína LIV-1, separar o complexo matriz de afinidade-proteína LIV-1do restante da amostra e liberar proteína LIV-1 da matriz de afinidade.

Kits

Em algumas modalidades, a invenção provê kits para visualizare/ou detectar um gene ou produto gênico correlacionado a superexpressãode LIV-1. Kits da invenção compreendem anticorpos detectáveis, moléculaspequenas, oligonucleotídeos, iscas, miméticos ou sondas, assim como ins-truções para realizar os métodos da invenção. Opcionalmente, kits tambémpodem conter um ou mais dos seguintes: controles (positivo e/ou negativo),recipientes para controles, fotografias ou ilustrações de exemplos represen-tativos de resultados positivo e/ou negativo.

Cada uma das patentes, publicações de patente, números deacesso e publicações aqui descritas é por meio deste incorporada como re-ferência em sua totalidade.

Várias modificações da invenção, além daquelas aqui descritas,serão evidentes para aqueles versados na técnica em vista da descrição an-tecedente. Tais modificações também destinam-se a cair no âmbito das mo-dalidades anexadas. A presente invenção é demonstrada adicionalmentenos seguintes exemplos que são para fins de ilustração e não se destinam alimitar o âmbito da presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplos 1: Imunoprecipitação

Tampão de imunoprecipitação (IP) foi preparado contendo 50nM de Tris-HCI pH 7,5, 150 mM de NaCI1 1% de TritonX-100 e 1 comprimido de inibidor de protease (Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN) por 10 mLde volume total. Um anticorpo (Ab) policlonal de coelho gerado em laborató-rio, anti-LIV-1, foi combinado em diluição 1:100 com tampão IP e adicionadoa Iisado de células em um tubo de tarraxa, que foi deixado misturar-se emuma plataforma oscilatória por 1-2 horas a 4°C. Para imunoprecipitação, 40 μL de microeesferas conjugadas a anti-lgG de coelho ou 120 μL de microe-esferas de estreptavidina foram adicionados a cada tubo e a incubação foicontinuada durante a noite e 4°C na plataforma oscilante. Subseqüentemen-te, os tubos foram centrifugados a 7000 χ g por 2 minutos a 4°C e o sobre-nadante removido. Peletizados de microesferas foram lavados 4 vezes com tampão de lavagem gelado e então 30 μΙ_ de tampão de amostra SDSTris/Glicina 2X contendo agente redutor foram adicionados a cada tubo. Asmicroesferas em tampão de amostra foram então fervidas duas vezes a95°C por 5 minutos cada vez para liberar o imunoprecipitado das microesfe-ras. A solução de microesferas fervidas foi então centrifugada a 14.000 χ g por 5 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadante então removido etransferido para um novo tubo. Imunoprecipitados foram imediatamente ana-lisados por eletroforese em um gel SDS-PAGE ou estocados a -20°C. Análi-se de transferência de Western foi realizada usando métodos padrão. Imu-noprecipitados submetidos a eletroforese foram transferidos do gel de polia- crilamida para membrana e a membrana foi então submetida à sonda por 1hora em temperatura ambiente com oscilação gentil usando um segundoanticorpo de LIV-1 (em 1:1000). Após várias lavagens com PBS contendo0,05% de Tween20 (PBST)1 o anticorpo secundário espécie-específico apro-priado conjugada a peroxidase de rabanete (HRP) foi adicionado e incubadoem um plataforma oscilatória por 30 minutos em temperatura ambiente. Apósvárias lavagens, bandas reativas na membrana foram então visualizadasusando sistema de detecção ECL (Amersham Biosciences, UK).

Exemplo 2: análise por FACS

Células não permeabilizadas foram usadas para a análise. Tam-pão de FACS foi preparado contendo PBS (gelado), 1% de albumina séricabovina (BSA), 2% de soro fetal bovino (FBS) e 0,1% de azida sódica. Célu-las foram recuperadas pela desaderência de células aderentes usando tam-pão de dissociação (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Para neutralizar o tam-pão de dissociação, um volume igual de meios de crescimento foi adiciona-do. Células foram então aliquotadas em um tubo de fundo redondo de poli-estireno de 5 mL. Para cada marcação, um milhão de células foram centrifu-gadas a 1000 rpm por 5 minutos a 4°C e então o anticorpo primário (até 6 pgem 100 uL de tampão de FACS) foi adicionado ao peletizado de células, mis-turado em vórtex e incubado em gelo por 30 minutos até uma hora. Célulasforam então lavadas duas vezes com 3 ml_ de tampão de FACS após sedi-mentação por centrifugação a 1000 rpm por 5 minutos a 4°C. Após a segun-da lavagem e centrifugação, anticorpo secundário (1 pg em 50 uL de tampãode FACS) foi então adicionado ao peletizado de células, misturado em vórtexe incubado em gelo por 30 minutos no escuro. Células foram então lavadasduas vezes com 3 mL de tampão de FACS após sedimentação por centrifu-gação a 1000 rpm por 5 minutos a 4°C. Após a segunda lavagem e centrifu-gação, células foram ressuspendidas em 500 pg em 50 uL de tampão deFACS contendo iodeto de propídio (PI). (PI foi preparado como um estoquede 1 ug/uL e usado a 1:100). Análise de FACS/citometria de fluxo foi realiza-da dentro de uma hora.

Exemplo 3: Oligonucleotídeos de LIV-1 Inibem Crescimentoem Ágar Macio

Células MDA231, MCF-7, ZR75-1 e T47D1 foram tratadas comoligonucleotídeos para LIV-1 (SEQ ID NOS: 369 e 370). As células foramplaqueadas em ágar macio 0,35% e crescimento quantificado usando Ala-mar Blue após 7 dias em cultura.

O efeito da expressão do gene de LIV-1 no crescimento celularindependente de ancoragem de células T47D1 foi medido por formação decolônia em ágar macio. Ensaios de ágar macio foram realizados primeiropelo revestimento de uma placa não tratada com cultura de tecidos com poli-HEMA para prevenir que células aderam à placa. Células não transfectadasforam recuperadas usando tripsina e lavando duas vezes em meios. As célu-las foram contadas usando um hemacitômetro e ressuspendidas até 104 cé-lulas por mL em meios. Alíquotas de cinqüenta μL foram colocadas em pla-cas de 96 cavidade revestidas com poliHEMA e transfectadas. Para cadamistura de transfecção, uma molécula veículoa, de preferência um lipitóideou colesteróide, foi preparada para uma concentração de trabalho de 0,5 nMem água, sonicada para dar uma solução uniforme, a filtrada através demembrana de PVDF de 0,45 μm. O oligonucleotídeo anti-sentido ou controlefoi então preparado a uma concentração de trabalho de 100 nM em águaMillipore estéril. Os oligonucleotídeos foram diluídos adicionalmente em Op-tiMEM™ (Gibco/BRL) em um tubo de microcentrífuga até 2 μΜ, ou aproxi-madamente 20 μg de oligo/mL de OptiMEM™. Em um tubo de microcentrí-fuga separado, lipitóide ou colesteróide, tipicamente na quantidade de cercade 1,5-2 mmol de lipitóide^g de oligonucleotídeo anti-sentido, foi diluído nomesmo volume de OptiMEM™ usado para diluir oligonucleotídeo. O oligonu-cleotídeo anti-sentido diluído foi imediatamente adicionado ao lipitóide diluí-do e misturado por pipetagem para cima e para baixo. Oligonucleotídeo foiadicionado às células a uma concentração final de cerca de 300 nM. Apóstransfecção a 37°C por cerca de 30 minutos, 3% de agarose GTG foram adi-cionados às células para uma concentração final de 0,35% de agarose porpipetagem para cima e para baixo. Após a agarose de camada de célula tersolidificado, 100 μL de meios foram gotejados em cima de cada poço. Colô-nias foram formadas em cerca de 7 dias. Para um leitura de crescimento, 20μL de Alamar Blue foram adicionados a cada poço e a placa foi agitada porcerca de 15 minutos. Leituras de fluorescência (excitação em 530nm/emissão em 590 nm) foram tomadas após incubação por 6-24 horas.

A inibição de formação de colônia em linhagens de célula cance-rosa usando moduladores de LIV-1 indica que LIV-1 é importante na produ-ção e/ou manutenção do fenótipo metastático.

Exemplo 4: Regulação de Expressão Gênica

A expressão de gene expressados diferencialmente representa-dos pelos polinucleotídeos nas células cancerosas foi analisada usando oli-gonucleotídeos para confirmar o papel e função de LIV-1 na tumorigênese,por exemplo, na promoção de um fenótipo metastático.Oligonucleotídeos de LIV-1 foram gerados e testados por suahabilidade em suprimir expressão de LIV-1. Uma vez sintetizados e quantifi-cados, os oligômeros foram triados por eficiência de um transcrito nocauteem um painel de linhagens celulares. A eficiência do nocaute foi determinadapela análise de níveis de RNA usando quantificação de GeneAmp.

A habilidade de cada oligonucleotídeo em inibir expressão gêni-ca foi testada através da transfecção em células T47D1, T47D-T1 MCF-7,ZR75-1, MDA231, 184B5 ou HMEC.

Para cada mistura de transfecção, uma molécula veículoa (talcomo um lipídeo, derivado lipídico, molécula semelhante a lipídeo, coleste-rol, derivado de colesterol ou molécula semelhante a colesterol) foi prepara-da em uma concentração de trabalho de 0,5 mM em água, sonicada paradar uma solução uniforme e filtrada através de uma membrana de PVDF de0,45 pm. Os oligonucleotídeos de siRNA e anti-sentido foram então prepara-dos em uma concentração de trabalho de cerca de 100 μΜ em água Millipo-re estéril. Os oligonucleotídeos foram diluídos adicionalmente em Opti-MEM™ (Gibco/BRL) em um tubo de microcentrífuga, até 2 μΜ, ou aproxi-madamente 20 pg de oligo/mL de OptiMEM™. Em um tubo de microcentrí-fuga separado, a molécula veículoa, tipicamente na quantidade de cerca de1,5-2 mmol de veículo/pg de oligonucleotídeo anti-sentido, foi diluída nomesmo volume de OptiMEM™ usado para diluir o oligonucleotídeo. O oligo-nucleotídeo anti-sentido diluído é imediatamente adicionado ao veículo diluí-do e misturado por pipetagem para cima e para baixo. SiRNAs foram adicio-nados ás células em uma concentração final de 67 nM.

O nível de mRNA alvo que corresponde a um gene alvo de inte-resse nas células transfectadas foi quantificado nas linhagens celulares u-sando a máquina de PCR em tempo real ABI GeneAMp 7000™. Valores pa-ra o mRNA alvo foram normalizados contra um controle interno. Para cada20 μL de reação, RNA extraído (geralmente 0,2-1 pg do total) foi colocadoem um tubo de microcentrífuga de 0,5 ou 1,5 ml_ e água adicionada em umvolume total de 12,5 μΙ_. Em cada tubo foram adicionados 7,5 μ!_ de misturade tampão/enzima, preparada por mistura (na ordem listada) de 2,5 pL deH2O, 2,0 pL de tampão de reação 10X, 10 pL de oligo dT (20 pmol), 1,0 pLde mistura de dNTP (10 mM cada), 0,5 pL de RNAsin® (20u) (Ambion, Inc.,Hialeah, FL) e 0,5 pL de transcriptase reversa MMLV (50u) (Ambion, Inc.).Os conteúdos foram misturados por pipetagem para cima e para baixo e amistura de reação foi incubada a 42°C por 1 hora. Os conteúdos de cadatubo foram centrifugados antes da amplificação.

Uma mistura de amplificação foi preparada usando mistura mes-tre de ABI sybr, mais 0,175 pmol de cada oligonucleotídeo. SYBR® Green(Molecular Probes, Eugene, OR) é um corante que fluoresce quando ligadaa DNA duplo filamento filamento. Conforme o produto de PCR de duplo fila-mento filamento é produzido durante a amplificação, a fluorescência de SY-BR® Green aumenta. Para cada 20 pL de alíquota de mistura de amplifica-ção, 2 pL de RT molde foram adicionados e amplificação efetuada de acordocom protocolos padrões. Os resultados foram expressados como a diminui-ção porcentual na expressão do produto gênico correspondente em relaçãoa células não transfectadas, células transfectadas apenas com veículo(transfectadas em simulação), ou células transfectadas com oligonucleotí-deos controle reversos.

Embora oligonucleotídeos de LIV-1 tenham inibido expressão deLIV-1 em todas as linhagens testadas, oligonucleotídeos de LIV-1 tiveramconseqüências funcionais apenas em linhagens tumorigênicas. Nenhumaconseqüência funcional dos oligonucleotídeos de LIV-1 foi observada emlinhagens não tumorigênicas, indicando que células cancerosas e células"normais" têm dependências que diferem em atividade de Livl.

Exemplo 5: Efeito de Expressão em Proliferação

0 efeito de expressão gênica na inibição de proliferação celularfoi estimado em linhagens celulares incluindo células de T47D1, T47D-T1,MCF-7, ZR75-1, 184B5, MDA231 e HMEC usando metodologias de siRNA.

Células foram plaqueadas em uma densidade que estará cercade 80-95% confluente após dias em placas de 96 cavidade. Oligonucleotí-deos (anti-sentido ou siRNA) foram diluídos a 2 μΜ em OptiMEM™. O oligo-nucleotídeo-OptiMEM™ foi então adicionado a um veículo de distribuição,selecionado para que fosse otimizado para o tipo celular particular a ser u-sado no ensaio. A mistura oligo/veículo de distribuição foi então diluída adi-cionalmente em meio com soro nas células. A concentração final de oligonu-cleotídeos anti-sentido foi de cerca de 300 nM e a concentração final de oli-gonucleotídeos de siRNA foi de 67-100 nM.

Oligonucleotídeos foram preparados como descrito acima. Célu-las foram transfectadas de cerca de 4 horas até durante a noite a 37°C e amistura de transfecção foi substituída por meio fresco. A transfecção foi efe-tuada como descrito acima.

Oligonucleotídeos de LIV-1 inibiram proliferação de células can-cerosas, mas não inibiram a proliferação de células HMEC (células epitelíaisde mama primárias) ou 184B5 (linhagem celular epitelial de mama não tumo-rigênica), indicando que LIV-1 têm uma função na produção e/ou manuten-ção do fenótipo canceroso em células cancerosas.

Exemplo 6: Ensaio de sobrevivência

Para estimar o efeito de depleção de uma mensagem alvo namorte celular, células de T47D-T1, MCF-7, Zr-75-1 e MDA-MB231 foramtransfectadas por ensaios de citotoxicidade. A citotoxicidade foi monitoradapela medição da quantidade de enzima LDH liberada no meio devido à lesãoda membrana. A atividade de LDH foi medida usando o kit de detecção decitotoxicidade da Roche Molecular Biochemicals. Os dados são providoscomo uma razão de LDH liberado no meio X o LDH total presente no poçono mesmo ponto de tempo e tratamento (rLDH/tLDH). Um controle positivousando oligonucleotídeos controle reverso e anti-sentido para BCL2 (um ge-ne anti-apoptótico conhecido) é incluído; perda de mensagem para BCL2leva a um aumento em morte celular comparado com tratamento com o oli-gonucleotídeo controle (citotoxicidade de ruído devido a transfecção).

Exemplo 7: Metodologia de caspase/M30

Pró-caspase e M30 foram estimados usando análises de Wes-tern em Iisados de células tratadas com siRNA. Em vários pontos de tempopós-tratamento, células (tanto células aderentes como desaderidas, que sãopeletizadas por centrifugação rápida) foram Iisadas e submetidas a análisesde Western usando anticorpos para pró-caspase e M30. O desaparecimentode pró-caspase correspondeu à ativação de caspase. O aparecimento doepítopo de M30 foi reflexo da clivagem da caspase de citoqueratina 18. Anti-corpos usados foram Axxora/Alexis M30 (CytoDeath: CAT# ALX-804-590) eAc de pró-caspase (R&D Systems, cat no. MAB707).

Exemplo 8: Metodologia de Ciclina D1

Células foram transfectadas com siRNA para nocaute de Livl outratadas com Acs específicos de Liv-1. Para células transfectadas, Iisadosforam coletados 48 horas pós-transfecção. Para tratamento de Ac, Iisadosforam coletados 6 horas pós-tratamento. Usados foram submetidos a análi-ses de Western, usando Ac anti-ciclina D1: cyclinDI Abcam Cat#-ab24249.Os siRNAs usados foram SEQ ID NOS: 369 e 370. Acs de LIV-1 testadosforam gerados em laboratório contra extremidade N-terminal & TM2-3 ECD.O anticorpo contra o TM2-3 ECD pareceu mostrar o maior efeito.

Exemplo 9: Níveis de zinco

Células foram tratadas com siRNA 24, 48 ou 72 horas antes doexemplo G ou com Acs 30 minutos antes do Exemplo 10. Os siRNAs usadosforam SEQ ID NOS: 369 e 370. Acs de LIV-1 testados foram gerados emlaboratório contra extremidade N-terminal & TM2-3 ECD. O anticorpo contrao TM2-3 ECD pareceu mostrar o maior efeito.

Exemplo 10: Ensaio de Transporte de ZincoTransporte de zinco foi avaliado usando o indicador fluorescentesensível a zinco permeável à célula, verde de Newport. Na clivagem por es-terases intracelulares, o verde de Newport se liga a íons de zinco livres eage como um indicador fluorescente para conteúdo de zinco livre intracelular.

Uma solução de trabalho de 10 μΜ de corante PDX verde deNewport (formas de éster permeável, Cat# N24191, Invitrogen-MolecularProbes™) e 0,02% de F-127 plurônico (20% de F-127 plurônico em DMSO;Cat # P3000, Invitrogen-Molecular Probes™) em tampão de Krebs-Ringer-HEPES (KRH) (120 mM de NaCI, 25 mM de HEPES, pH 7,5, 4,8 mM de Kcl,1,2 mM de KH2PO4, 1,2 mM de MgSO4, 1,3 mM de CaCI2) foi preparada co-mo se segue. Verde de Newport foi obtido em alíquotas de 50 pg que foramestocadas dessecadas a -20°C, protegidas da luz e descongeladas logo an-tes do uso. Uma solução estoque de 2,5 mM de corante verde de Newportfoi feita pela rexonstituição de 50 pg de verde de Newport em 16,8 pL dedimetil sulfóxido anidro (DMSO) (Cat # 276855-1 OOmL, Sigma-AIdrich). Asolução de trabalho de 10 μΜ de corante verde de Newport foi preparadapela adição de um volume igual (16,8 μL) do agente de dispersão, F-127plurônico, aos 2,5 mM de solução estoque e então diluindo o volume inteirode corante em 8,366 mLde tampão KRH.

Células aderentes foram lavadas uma vez em soluçaão salinatamponado por fosfato (PBS) sem Ca2+ e Mg2+ e recuperadas com tampãode dissociação com base em Hanks, livre de enzima (Invitrogen, Cat #13150-016). Tanto o PBS como o tampão de dissociação foram equilibradosa 37°C antes do uso. O pH da suspensão celular foi então neutralizado pelaadição de um volume igual de meios de crescimento. As células foram cole-tadas por centrifugação a 1000 rpm por 5 minutos; o peletizado de célulasresultante foi ressuspendido em PBS em uma concentração de 1 χ 106 célu-las/mL. Para análise, 1,5 χ 106 células foram aliquotadas em um tubo deFACS de fundo redondo de poliestireno de 5 mL (Becton Dickinson, Cat #352054). As células foram peletizadas novamente por centrifugação e o PBSremovido.

O peletizado de células foi ressuspendido por agitação em vór-tex em 0,5 mL de solução de corante verde de Newport; o tubo de FACS foitampado e incubado em um banho-maria a 30°C por 45 minutos. Um ml_ detampão KRH sem corante foi adicionado à suspensão celular e as célulasforam peletizadas por centrifugação a 1000 rpm por 5 minutos. O sobrena-dante foi aspirado, as células foram lavadas novamente em 1 mL de tampãoKRH sem corante, o peletizado de células foi ressuspendido em 0,5 mL detampão KRH sem corante e incubado em um banho-maria a 30°C por 30minutos. Um mL de tampão KRH sem corante foi adicionado à suspensãocelular e as células foram peletizadas por centrifugação a 1000 rpm por 5minutos. O sobrenadante foi aspirado, as células foram lavadas novamenteem 1 mL de tampão KRH sem corante e o peletizado de células foi ressus-pendido por agitação em vórtex em 2,0 mL de tampão KRH sem corante.

A fluorescência intracelular foi monitorada por FAGS (FACSCali-bur) (BD Biosciences). Células foram coletadas em tempo real e a fluores-cência de corante verde de Newport (ajuste de FITC) foi plotada sobre tem-po (ajustes de coleta em 2 milhões de células em 10 minutos). Após o esta-belecimento de um linha basal de fluorescência em 1,5 até 2 minutos de co-leta, 100 mM de cloreto de zinco (Cat # Z0152-100G, Sigma-AIdrich, dissol-vidos em 29 mM de HCI) foram adicionados às células em uma concentra-ção final de 1-100 μΜ. O tubo de células foi imediatamente retornado à má-quina de FACS; captação de zinco foi manifestada por um aumento instan-tâneo de fluorescência. Os dados de FACS foram exportados para softwareFlowjo (Tree Star Inc., Ashland, Oregon) e analisados usando a plataformade cinética. O número médio dos dados foi visualizado com a opção de sua-vizar a média móvel e uma sobreposição gráfica foi criada no editor de exibi-ção.

Exemplo 11: Epítopos de LIV-1

Epítopos lineares de LIV-1 para reconhecimento de anticorpo epreparação podem ser identificados por quaisquer de em umerosos métodosconhecidos na técnica. Alguns métodos exemplares incluem sondagem dahabilidade de ligação a anticorpo de peptídeos derivados de seqüência deaminoácidos do antígeno. A ligação pode ser estimada pelo uso de métodosde BIACORE ou ELISA. Outras técnicas incluem expor bibliotecas peptídicasem suportes sólidos planares ("chip") a anticorpos e detectar ligação atravésde quaisquer de múltiplos métodos usados em varredura de fase sólida. Adi-cionalmente, visualização de fago pode ser usada para triar uma bibliotecade peptídeos com seleção de epítopos após várias rodadas de biogarimpo.

A Tabela 1 abaixo prove regiões de LIV-1 (SEQ ID NO: 2) queforam identificadas como epítopos lineares adequados para o reconhecimen-to por anticorpos anti-LIV1.Tabela 1

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Legenda: antigenic region = região antigênica<table>table see original document page 92</column></row><table>

Legenda: antigenic region = região antigênica<table>table see original document page 93</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table>

Legenda: antigenic region = região antigênicaAnOpenic region 2 ECD#'1 158-180 170-178 RNVKDSVSA 264Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 171-179 NVKDSVSAS 265Antiqenic reaion 2 ECD#'1 158-180 172-180 VKDSVSASE 266Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 158-167 KGAHRPEHAS 267Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 159-168 GAHRPEHASG 268Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 160-169 AHRPEHASGR 269Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 161-170 HRPEHASGRR 270Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 162-171 RPEHASGRRN 271Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 163-172 PEHASGRRNV 272Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 164-173 EHASGRRNVK 273Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 165-174 HÁSGRRNVKD 274Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 166-175 ASGRRNVKDS 275Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 167-176 SGRRNVKDSV 276Antigenic region 2 ECO#'1 158-180 168-177 GRRNVKDSVS 277Antigenic.region 2 ECD#'1 158-180 169-178 RRNVKDSVSA 278Antigenic region 2 ECD#"1 158-180 170-179 RNVKDSVSAS 279Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 171-180 NVKDSVSASE 280Antigenic region 2 ECD#"1 158-180 158-168 KGAHRPEHASG 281Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 159-169 GAHRPEHASGR 282Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 160-170 AHRPEHASGRR 283Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 161-171 HRPEHASGRRN 284Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 162-172 RPEHASGRRNV 285Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 163-173 PEHASGRRNVK 286Antigenic region 2 ECD#"1 158-180 164-174 EHASGRRNVKD 287Antigenic reaion 2 ECD#"1 158-180 165-175 HASGRRNVKDS 288Antigenic region 2 ECCW1 158-180 166-176 ASGRRN.VKDSV 289Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 167-177 SGRRNVKDSVS 290Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 168-178 GRRNVKDSVSA 291Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 169-179 RRNVKDSVSAS 292Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 170-180 RNVKDSVSASE 293Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 158-169 KGAHRPEHASGR 294Antigenic region 2 ECD#"1 158-180 159-170 GAHRPEHASG RR 295Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 160-171 AHRPEHASGRRN 296Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 161-172 HRPEHASGRRNV 297Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 162-173 RPEHASGRRNVK 298Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 163-174 PEHASGRRNVKD 299Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 164-175 EHASGRRNVKDS 300Antigenic region 2 ECD#"1 158-180 165-176 HASGRRNVKDSV 301Antigenic region 2 ECD#"1 158-180 166-177 ASGRRNVKDSVS 302Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 167-178 SGRRNVKDSVSA 303Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 168-179 GRRNVKDSVSAS 304Antigenic region 2 ECD#'1 158-180 169-180 RRNVKDSVSASE 305Antigenic region 3 ECD#'2 360-379 360-367 HLLPHSHA 306Antigenic region 3 ECD#'2 360-379 361-368 LLPHSHAS 307Antigenic region 3 ECD#'2 360-379 362-369 LPHSHASH 308Antigenic region 3 ECD#'2 360-379 363-370 PHSHASHH 309Antigenic region 3 ECD#'2 360-379 364-371 HSHASHHH 310Antigenic reqion 3 ECD#'2 360-379 365-372 SHASHHHS 311Antigenic region 3 ECD#'2 360-379 366-373 HASHHHSH 312Antigenic region 3 ECD#'2 360-379 367-374 ASHHHSHS 313Antigenic region 3 ECD#'2 360-379 368-375 SHHHSHSH 314Antigenic region 3 ECD#'2 360-379 369-376 HHHSHSHE 315

Legenda: antigenic region = região antigênica<table>table see original document page 97</column></row><table>

Legenda: antigenic region = região antigênica

Exemplo 12: Imunoistoquímica

Microarranjos em tecido humano embebido em parafina comer-cialmente disponíveis foram usados para avaliar a expressão de LIV-1 atra-vés de imunoistoquímica. (Zymed Laboratories Inc1 São Francisco CA; Cybr-di, Gaithersburg1 MD; Clinomics Biosciences lnc, Cambridge Reino Unido).

Células 293T transfectadas com LIV-1 e simples foram usadas como contro-les para validar a expressão.

A desparafinização da seção tecidual e a recuperação do antí-geno foram efetuadas em Ventana Discovery usando o condicionamentocelular padrão seguido por uma incubação de 60 minutos nos anticorposprimários. Um anticorpo LIV-1 anti-humano de coelho (Chiron, Emeryville,CA) e o controle de IgG de coelho Prebleed (Chiron, Emeryville, CA) foramusados a 10 ug/mL. O reagente secundário Universal Ventana (Ventana Me-dical Systems, Inc., Tucson, Az), seguido pelo kit de mapeamento DAB Ven-tana (Ventana Medicai Systems, Inc.) foi usado para detecção. A hematoxili-na Ventana e os reagentes de anil (Ventana Medicai Systems, Inc.) foramusados para contar as manchas e as seções foram desidratadas em alcoóisgraduados, limpa em xileno e cobertas usando um meio de montagem sinté-tico.

Exemplo 13. Câncer versus tecido normal; análise spotfire

Dados de microarranjo também foram usados para determinar aexpressão de LIV-1, SLC39A10, SLC39A11 e SLC39A13 em uma variedadede tipos de cânceres tumorais e em uma variedade de tecidos de amostrasnormais. O software DecisionSite (Spotfire, Sommerville, MA) e os protoco-los pilotos de fonte de informações desenvolvido in house (SciTegic, SanDiego, CA, desenvolvedor in-house Josef Ringgenberg) foram usados paragerar as descrições gráficas mostradas nas Figuras 12 a 15. Os resultadosapresentam uma elevada expressão para cada um dos antígenos de célulastumorais de interesse em uma variedade de tipos de cânceres com um baixonível de expressão em uma variedade de tipos de tecidos normais.

Exemplo 14: Seqüências

Seqüência de nucleotídeo LIV-1; SEQ ID NO: 1:CTCGTGCGGAATTCGGCACGAGACCGCGTGTTCGCGCCTGGTRGAGATTTCTCGAAGACACCAGTGGGCCCGTGTGGAACCAAACCTGCGCGÇGTGGCCGGGCCGTGGGACAACGAGGCCGCGGAGACGAAGGCGCAATGGCGAGGAAGTTATCTGTAATCTTGATCCTGACCTTTGCCCTCTCTGTCACAAATC.CCCTTCATGAACTAAAAGCAGCXGCTTTCCCCCAGACCACTGAGAAAATTAGTCCGAATTGGGAATCTGGCATTAATGTTGACTTGGCAATTTCCACACGGCAATATCATCTACAACAGCTTTTCTACCGCTATGGAGAAAATAATTCTTTGTCAGTTGAAGGGTTCAGAAAATTACTTCAAAATATAGGCATAGATAAGATTAAAAGAATCCATATACACCATGACCACGACCATCACTCAGACCACGAGCATCACTCAGACCATGAGCGTCACTCAGACCATGAGCATCACTCAGACCACGAGCATCACTCTGACCATGATCATCACTCTCACCATAATCATGCTGCTTCTGGTAAAAATAAGCGAAAAGCTCTTTGCCCAGACCATGACTCAGATAGTTCAGGTAAAGATCCTAGAAACAGCCAGGGGAAAGGAGCTCACCGACCAGAACÁTGCCAGTGGTAGAAGGAATGTCAAGGACAGTGTTAGXGCTAGTGAAGTGACCTCAACTGTGTACAACACTGTCTCTGAAGGAACTCACTTTCTAGAGACAATAGAGACTCCAAGACCTGGAAAÁCTCTTCCCCAAAGATGTAAGCAGCTCCACTCCACCCAGTGTCACATCAAAGAGCCGGGTGAGCCGGCTGGCTGGTAGGAAAACAAATGAATCTGTGAGTGAGCCCCGAAAAGGCTTTATGTATTCCAGAAACACAAATGAAAATCCTCAGGAGTGTTTCAATGCATCAAAGCXACTGACATCTCATGGCATGGGCATCCAGGTTCCGCTGAATGCAACAGAGTTCAACTATCTCTGTCCAGCCATCATCAACCAAATTGATGCTAGATCTTGTCTGATTCATACAAGTGAAAAGAAGGCTGAAATCCCTCCAAAGACCTATTCATTACAAATAGCCTGGGXTGGTGG XTTTATAGCCATTTCCATCAXCAGXXTCCTGXCTCTGCTGGGGGTTATCTXAGTGCCXCTCATGAATCGGGTGTTTTTCAAATTTCTCCTGAGTTTCCXTGXGGCACTGGCCGXIGGGACXTXGAGTGGXGATGCTTXTTTACACCTTCTTCCACATICXCATGCAAGICACCACCATAGTCATAGCCAXGAAGAACCAGCAAXGGAAATGAAAAGAGGACCACTTTTCAGTCATCTGTCXTCXCAAAACATAGAAGAAAGTGCCTATTTTGATTCCACGTGGAAGGGTCTAACAGCTCTAGGAGGCCTGTATTTCAXGTTTCTTGTTGAACATGTCCXCACATTGATCAAACAAXTXAAAGATAAGAAGAAAAAGAATCAGAAGAAACCTGAAAATGATGATGATGTGGAGATTAAGAAGCAGTTGTCCAAGTATGAATCXCAACTTTCAACAAATGAGGAGAAAGTAGATACAGATGATCGT^ACTGAAGGCTAXXTACGAGCAGACTCACAAGAGCCCTCCCACTTTG'ATTCTCAGCAGCCTGCAGTCTTGGAAGAAG71AGAGGTCATGATAGCTCAXGCTCATCCACAGGAAGTCXACAATGAATATGTACCCAGAGGGXGC71AGAATAAATGCCATXCACATITCCACGATACACTCGGCCAGXCAGACGATCTCA 'TTCACCACCAXCAXGACTACCATCATATXCTCCATCATCACCACCACCTVAAACCACCATCCTCACAGTCACAGCCAGCGCTACTCTCGGGAGGAGCTGAAAGATGCCGGCGXCGCCACTTXGGCCXGGATGGXGATAATGGGTGATGGCCTGCACAATTTCAGCGATGGCCTAGCAATTGGTGCTGCTTTTACTGAAGGCTTAT-CAAGTGGTTTAAGTACTTCTG

TTGCTGTGTTCTGTCATGAGTTGCCTCATGAATTAGGTGACTTTGCTGTTCTACTAAAGGCTGGCATGACCGTTAAGCAGGCXGTCCTXTATAATGÇAXTGTCAGCCATGCTGGCGTAXCTTGGAATGGCAACAGGAATXTTCATTGGTCATTATGCTGAAAATGTTTCTÂTGTGGATATTTGCACTTACTGCTGGCTTATTCATGTATGTTGCTCTGG TTGATATGGTACCTGAAATGCTGCAC^TGATGCTAGTGACCATGGATGTAGCCGCTC^GGGTATTTCTTTTTACÂGÁATGCTGGGÁTGCTTTTGGGTTTTGGAATTATGTTACTTATTTCCATATTTGAACATAAAATCGTGTTTCGTATAAATTTCTAGTTAAGGTTTAAATGCTAGAGTAGCTTAAAAAGTTGTCATAGTTTCAGTAGGTCATÃGGGAGATGAGTTTGTATGCTGTACTATGCAGCGTTTAAAGTTAGTGGGTTTTGTGATTTTTGTATTGAATATTGCTGTCTGTTACAAAGTCAGTTAAAGGTACGTTTTAATATTTAAGTTATTCTATCTTGGAGATAAAAXCTGTATGTGCAATTCACCGGTATTACCAGTTXAXTAXGTAAACAAGAGATTTGGCATGACATGTTCTGTATGTTTCAGGGAAAAATGTCTTTAATGCTTTTTCAAGAACTAACACAGTTATXCCTATACTGGATTTTAGGTCTCTGAAGAACTGCTGGTG

Seqüência de aminoácidos LIV-1; SEQ ID NO: 2.

MARKLSVILILTFALSVTNPLHELKAAAFPQTTEKISPIWESGINVD:

RKLLQNIGIDKIKRIHIHHDHDHHSDHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDHDHHSHHNHAASGKNKRKALCPDHD

SDSSGKDPRNSOGKGAHRPEHASGRRNVKDSVSASEVTSTVYWTVSEGTHPLETIETPRPGKIiFPKDVSSSTPPS

VTSKSRVSRIAGRKTNESVSEPRKGFMYSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPmATEFNTYLCPAIINQXDA

RSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLOIAVr^GGFXAISIISFLSLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVAIiAVGTLSGDAFIi

HLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDSXWKGLXALGGLVFMFI.VEHVI.TIjIKQFKDK

KKKNQKKPENTODDVEIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYXjRADSQEPSHFDSQQPAVLEEEEVMIAHAHPQ

EVYNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGOSDDLIHHHHDYHHILHHHHHONHHPHSHSORYSREELKDAGVATIiAWMVX '

MGDGLHNFSDGIAIGAAFTPGLESGLSTSVAVFCHELPHEI^DFAVLLKAGMTVKOAVLYNALSAMLAYLGMATG

IFIGHYAENVSMWIFALTAGLFMYVALVDMVPEMLHiroASDHGCSRWGYFFLCNAGMLLGFGIMLLISIFEHKXV.

FRXNF

Em algumas modalidades da presente invenção, os modulado-res LIV-1 compreendem ou são direcionados para regiões antigênicas dopolipeptídeo LIV-1. As regiões antigênicas de LIV-1 incluem, sem limitação,as SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 abaixo.

HHDHDHHSDHEHHSDHEHHSDHEHHSDHEHHSDHNHAASGKNKRKALCPDHDSDS (SEQ ID NO:3)KGAHRPEHASGRRNVKDSVSASE (SEQ ID NO:4)HliLPHSHASHHHSHSHEEPA (SEQ ID NO: 5)

Em algumas modalidades da presente invenção, os modulado-

res LIV-1 compreendem e/ou se ligam especificamente a uma ou mais se-qüências da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, os moduladores LIV-1 se ligam especificamente a um ou mais epítopos LIV-1 com uma seqüên-cia selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 361 até a SEQ ID NO:

364 ou da SEQ ID NO: 387 até a SEQ ID NO: 391, abaixo:hshsheepamemkrgplfsh; SEQID NO:361

cfnaskllshgm; SEQID NO: 362

gmgiqvplnatefnyl; SEQID NO:363

svsasevtstvyntvsegt; SEQID NO:364

LHELKAAAFPOTTEKISPNWESGimmiiAISTROYHLOOLFYRyGEmiSLSVEGPRKLLONXGIDKIKRIHIHHDhdhhsdhehhsdherhsdhehhsdhehhsdhnhaasgknkrkalcpdhdsdssgkdprnsqgkgflhrpeaiasgrr·nvkdsvsasevtstvyntvsegthfletietprpgklfpkdvgsstppsvtsksrvsrlagrktnesvseprkgfmysrimíenpqecnjaskiiltshgmgiqvplnatefot^

ggfx; SEQ ID NO:387;

hllphshashhhshsheepámemkrgplfshlssqnieesayfdst; SEQ ID NO:388; TM 2/3teglss; SEQID NO:389; TM 4/5

hyaenvsm; SEQID N0:390; TM 6/7

VFRINF; SEQ ID NO: 391; C-terminal

Em algumas modalidades, os moduladores LIV-1 da presenteinvenção têm as seguintes seqüências:CHIR296-4SI; aaaggctggcatgaccgttaa (SEQ ID NÒ:367)CHIR296-3SI; gacagtgttagtgctagtgaa (SEQID NO:368).CHIR296-2SI,· ctagttaaggtttaaatgcta (SEQ ID NO:369)CHIR296-1 SI; aaggcttatcaagtggtttaa (SEQ ID N0:370)CHIR296-7RC; gcaaccctgaaactcaccactacga (SEQ ID NO:37í)CHIR296-5RC; taccgtacccgtaggtccaaggcg (SEQ ID NO:372)CHIR296-2RC; tgtggtactggtgctggtagtgagt (SEQ ID NO:373)CHIR296-9; tggtgaatgagatcgtctgactggc (SEQ ID NO:374)CHIR296-8; agggctcttgtgagtctgctcgtaa (SEQ ID NO:375)CHIR296-7; agcatcaccactcaaagtcccaacg (SEQ ID NO:376)CHIR296-6;gccagtgccacaaggaaactcagg (SEQ ID NO:377)CH3R296-5; gqggaacctggatgcccatgccat (SEQ ID NO:378)CHIR296-4; actggcatgttctggtcggtgagc (SEQ ID NÒ:379) ■CHIF^ó-.S; atgctcatggtctgagtgacgctca (SEQ ID N0:380)CHIR296-2; tgagtgatggtcgtggtcatggtgt (SEQ ID NO:381)CHIR296-1; gagagggcaaaggtcaggatcaaga (SEQ ID NO:382).SLC39A10; SEQ ID NO: 383; NP_065075.1

MKVHMHTKFCLICLLTFI FHHCNHCHEEHDHGPEAiHRQHRGMTELEPS KFS KQAAENE KKYYIEKLFERYGENGRLSFFGLEKLLTNLGLGERKWEINHEDLGHDHVSHLDILAVQEGKHFHSHNHQHSHNHLNS ENQTVTS VS TKRNHKCDPEKETVEVSVKSDDKHMHDHNHRLRHHHRLHHHLDHNNTHHFHNDSITPSERGEPS1TOPSTETNKTQEQSDVKLPKGKRKKKGRKSNENSEVITPGFPPNHDQGEQYEHNRVHKPDRVHNPGHSHVHLPERNGHDPGRGHQDLTÍPDNEGELRHTRKREAPHVKNNAIIS LRKDLNEDDHHHECLNVTQLLKYYGHGANS PI STDLFTYLCPALLYQIDSRLCIEHFDKLLVEDINKDKNLVPEDEÁNIGASAWICGIISITVISLLSLLGVILVPIINQGCFKFLLTFLVALAVGTMSGDALLHLLPHSQGGHDHSHQHAHGHGHSHGHESNKFLEEYDAVLKGLVALGGΊ YLLFI IEHCIRMFKHYKQQRGKQKWFMKQNTEESTIGRKLSDHKLNNTPDSDWIjQLKPIiA<3TDDSWSEDRLNETELTDLEGQQESPPKl^LCIEEEKIIDHSHSDGLHTIHEHDLHAAAlÓaHHGENKTVLRKHNHQVraHraSHHSHGPCHSGSDLKETGIANIAWlWIMGDGIHNFSDGLAIGAAFSAGLTGGISTSIAWCHELPHELGDFAVLLKAGMTVKQAIVYNLLSAMMAYIGMLIGTAVGQYANNITLWIFAVTAGMFLYVALVDMLPEMLHGDGDNEEHGFCPVGQFILQNLGLLFGFAIMLVIALiYEDKI VFDIQF λ

SLC39A11; SEQ ID NO: 384; NP_631916

mlqghssvfqallgtfftwgmtaagaalvfvfssgqrrildgslgfaagvmlaasyttfsllapavematssggfgà

faffpvavgftlgaafvyladllmphlgaaedpqtaiju^fgstlmkkksdpegpallfpeselsiridksenge

ayqrkkaaatglpegpavpvpsrgot^qpggesvtrriallilaitihnvpeglavgvgfgaiektasatfesaknlaigigiqnfpeglavslplrgag^twrafhygqlsgmveplagvfgafavvijaepilpyalafaagamvyvvmddiipeaqisgngklaswasilgfwmmsldvglg

SLC39A13; SEQ ID NO: 385; NP_689477.2MPGCPCPGCGMAGPRLLFLTALALELLGRAGGSQPALRSRGTATACRLDNKESESWGALLSGERLDTWICSLLGSLMVGLSGVFPLLVIPLEMGTMLRS EAGAW RLKQLL S FAIiGGLLGNVFLHLLPEAWAYTCSASPGGEGQSLQQQQQLGLWVIAGILTFLALEIOíFLDSKEÉGTSQAPMKDPTAAAAALNGGHCLAQPAAE PGLGAVVRS IKVSGYLNLLÀNTIDNFTHGLAVAAS FLVSKKIGLLTTMAILLHEIPHEVGDFAILLRAGFDRWSAAKLQLSTALGGLLGAGFAICTQSPKGVEETAAWVLPFTS GGFLY IALVNVLPDLLEEEDPWRSLQQLLLLCAGIVVMVLFSLFVD

SEQ ID NO: 386

GFIAISIISFLSLLGVLVPLMNRVFFKFLLSLVALAVGTLSGDAFLLLPHSHASHHHSHSHEPAMEMKRGPLFSHLSQNIEESAYFDSTWKLTALGGLYFMFLVEHLTLIKQFKDKKKKNQKPENDDDVEIKKQLSYESQLSTNEEKVDTDRTEGYLRADSQEPSHDSQQPAVLEEEEVMIHAHPQEVYNEYVPRGKNKCHSHFHDTLGQSDLIHHHHDYHHILHHHHQNHHPHSHSQRYSEELKDAGVATLAWMVMGDGLHNFSDGLAIGAFTEGLSSGLSTSVAFCHELPHELGDFAVLKAGMTVKQAVLYNALAMLAYLGMATGIFIGYAENVSMWIFALTAGFMYVALVDMVPEMLHDASDHGCSRWGYFFLNAGMLLGFGIMLLIPLNIKSCSYKFLVKV

LIV-1 delta; SEQ ID NO: 365

MGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLQIAWVGGFIAIS11SFLSLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVAIAVGTLSGDAFLHLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVLTLIKQFKDKKKKNQKKPENDDDVr EIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQEPSHFDSQQPAVLEEEEVMIAHAHPQEV

YNE YVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIHHHHpYHHILHHHHHQNHHPHSHSQRYSREELKDAGVATLAWMVIMGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSVAVFCHELPHELGDFAVLLKAGMTVKQAVL YNALSAMLAYLGMATGIFIGHYAENVSMWIFALTAGLFMYVALVDMVS F

5

SEQ ID NO: 366

MARKLSVILILTFALSVTNPLHELKAAAFPQTTEKISPNVJESGINVDLAISTRQYHLQQLFYRYGENNSLSVEGFRKLLQNIGIDKIKRIHIHHDHD HHSDHEHHSDHERHSDHEHHSDHEHHSDH .DHHSHHNHAASGKNKRKALCPDHDSDSSGKDPRNSQGKGAHRPEHASGRRNVKDSVSASEVTS• TVYNTVSEGTHFLETIETPRPGKLFPKDVSSSTPPSVTSKSRVSRLAGRKTNESVSEPRKGFMYSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIHTSEKKAEIP·PKTYSLQIAWVGGFIAISIISFLSLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVALAVGTLSGDAFLHIjL

PHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVLTLIKQFKDKKKKNQKKPENDDD^IKKQLSKYESQBBTNEEKVDDSQQPAVLEEEEVMIAHAHPQEVYNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIHH^HHHQNHHPHSHSQRYSREELKDAGVATLAWMVIMGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSVAVFCHELPHELGDFAVLLKADMTVKQAVLYNALS AMLAYLGMATGIFI GHYAENVSMWI FALTAGL FMYVALVDMVPEMLHNDA SDHG C SRWGYFFLQNAGMLLGFGIMLLISIFEHKIVFRINF

Enquanto que a presente invenção tem sido descrita com refe-10 rência às suas modalidades específicas, deve ser entendido pelas pessoasversadas na técnica que várias alterações podem ser feitas e equivalentespodem ser substituídos sem sair do verdadeiro espírito e escopo da inven-ção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar umasituação, material, composição de matéria, processo, passo ou passos de15 processo particulares ao objetivo, espírito e escopo da presente invenção.Todas tais modificações são tencionadas a estarem dentro do escopo dapresente invenção.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Novartis Vaccfnes & Diagnosticsjanatpour, Mary 3.Yu, Guoyi ngTo, RobertChen, vivienZimmerman, Deborah

<12 0> MÉTODOS PARA TRATAR, DIAGNOSTICAR OU DETECTAR CÂNCER

<130> 20366-039WO1

<150> US 60/791,871<151> 2006-04-13

<160> 391

<170> FastSEQ para windows Versiori 4.0

<210> 1<211> 2762<212> DNA<213> Homo sapiens

<400> 1

ctcgtgccga attcggcacg agaccgcgtg ttcgcgcctg gtagagattt ctcgaagaca 60ccagtgggcc cgtgtggaac caaacctgcg cgcgtggccg ggccgtggga caacgaggcc 120gcggagacga aggcgcaatg gcgaggaagt tatctgtaat cttgatcctg acctttgccc 180tctctgtcac aaatcccctt catgaactaa aagcaçctgc tttcccccag accactgaga 240aaattagtcc gaattgggaa tctggcatta atgttgactt ggcaatttcc acacggcaat 300atcatctaca acagcttttc taccgctatg gagaaaataa ttctttgtca gttgaagggt 360tcagaaaatt acttcaaaat ataggcatag ataagattaa aagaatccat atacaccatg 420accacgacca tcactcagac cacgagcatc actcagacca tgagcgtcac tcagaccatg 480agcatcactc agaccacgag catcactctg accatgatca tcactctcac cataatcatg 540ctgcttctgg taaasataag cgaaaagctc tttgcccaga ccatgactca gatagttcag 600gtaaagatcc tagaaacagc caggggaaag gagctcaccg accagaacat gccagtggta 660gaaggaatgt caaggacagt gttagtgcta gtgaagtgac ctcaactgtg tacaacactg 720tctctgaagg aactcacttt ctagagacaa tagagactcc aagacctgga aaactcttcc 780ccaaagatgt aagcagctcc actccaccca gtgtcacatc aaagagccgg gtgagccggc 840tggctggtag gaaaacaaat gaatctgtga gtgagccccg aaaaggcttt atgtattcca 900gaaacacaaa tgaaaatcct caggagtgtt tcaatgcatc aaagctactg acatctcatg 960gcatgggcat ccaggttccg ctgaatgcaa cagagttcaa ctatctctgt ccagccatca 1020tcaaccaaat.tgatgctaga tcttgtctga ttcatacaag tgaaaagaag getgaaatcc 1080ctccaaagac ctattcatta caaatagcct gggttggtgg ttttatagcc atttccatca 1140tcagtttcct gtctctgctg ggggttatct tagtgcctct catgaatcgg gtgtttttca 1200aatttctcct gagtttcctt gtggcactgg ccgttggg^c tttgagtggt gatgcttttt 1260tacaccttct tccacattct catgcaagtc accaccatag tcatagccat gaagaaccag 1320caatggaaat gaaaagagga ccacttttca gtcatctgtc ttctcaaaac atagaagaaa 1380gtgcctattt tgattccacg tggaagggtc taacagctct aggaggcctg tatttcatgt 1440ttcttgttga acatgtcctc acattgatca aacaatttaa agataagaag aaaaagaatc 1500agaagaaacc tgaaaatgat gatgatgtgg agattaagaa gcagttgtcc aagtatgaat 1560ctcaactttc aacaaatgag gagaaagtag atacagatga tcgaactgaa ggctatttac 1620gagcagactc acaagagccc tcccactttg attctcagca gcctgcagtc ttggaagaag 1680aagaggtcat gatagctcat gctcatccac aggaagtcta caatgaatat gtacccagag 1740ggtgcaagaa taaatgccat tcacatttcc acgatacact cggccagtca gacgatctca 1800ttcaccacca tcatgactac catcatattc tccatcatca ccaccaccaa aaccaccatc 1860ctcacagtca cagccagcgc tactctcggg aggagctgaa agatgccggc gtcgccactt 1920tggcctggat ggtgataatg ggtgatggcc tgcacaattt cagcgatggc ctagcaattg 1980gtgctgcttt tactgaaggc ttatcaagtg gtttaagtac ttctgttgct gtgttctgtc 2040atgagttgcc tcatgaatta ggtgactttg ctgttctact aaaggctggc atgaccgtta 2100agcaggctgt cctttataat gcattgtcag ccatgctggc gtatcttggà atggcaacag 2160gaattttcat tggtcattat gctgaaaatg tttctatgtg gatatttgca cttactgctg 2220gcttattcat gtatgttgct ctggttgata tggtacctga aaxgctgcac aatgatgcta 2280gtgaccatgg atgtagccgc tgggggtatt tctttttaca gaatgctggg atgcttttgg 2340<211> 8<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 11

His His Ser Asp His Glu His His1 5

<210> 12<211> 8 <212> PRT<21Β> Homo sapiens

<40Ò> 12

His Ser Asp His GlU His HÍS 5ΘΓ1 5

<210> 13<211> 8<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 13

Ser Asp His Glu His His ser Asp1 · 5

<210> 14<211> 8<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 14

Asp His GlU His His Ser Asp His1 5

<210> 15<211> 8 <212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 15

His Glu His His Ser Asp His GTu1 5

<210> 16<211> 8<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 16

Glu His His ser Asp His Glu Arg1 5

<210> 17<211> 8<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 17

His His Ser Asp His Glu Arg His ·1 5<210> 18<211> 8 <212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 18.

His Ser Asp His Glu Arg His ser1 5

<210> 19<211> 8<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 19

Ser Asp His GTu Arg His Ser Asp

I- 5

<210> 20<211> 8<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 20

Asp His Glu Arg His ser Ásp His1 5

<210> 21<211> 8<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 21

His Glu Arg His Ser Asp His Glu1 5

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Glu Arg His Ser Asp His Glu His1 5

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Arg His ser Asp Mis Glu His His1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapieris

<400> 24

His ser Asp His Glu His His ser.<213> Honio sapiens<400> 72

His ser Asp His Glu His His Ser Asp1 5

<210> 73<211> 9<212> prt-<213> ηοιπο sapiens

<400> 73

Ser Asp His Glu His His Ser Asp His

1 5

<210>.74

<211>· 9

<212>- prt

<213> Homo sapiens

<400> 74

Asp His Glu His His Ser Asp His Glu1 5 · '

<210> 75<211> 9<212> prt

<213> Homo sapiens<400> 75

His Glu His His Ser Asp His Glu HisI- · 5

<210> 76

<211> 9 ·

<212> prt

<2·13> Homo sapiens

<400> 76

Glu His His ser Asp His Glu His His1' 5

<210> 77

<211> 9.

<212> prt

<213> Homo sapiens

<400> 77

His His ser Asp His Glu His His Ser1 5

<210> 78<213> 9·<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 78

His ser Asp His Glu His His Ser Asp1 5

<210>.79465 470 4/5 480

Glu Glu Lys Val Asp Thr Asp Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala

485 490 495

Asp ser Gln Glu Pro ser'His Phe Asp ser Gln Gln pro Ala vai Leu"

500 505 510

Glu Glu Glu Glu vai Met.lle Ala His Ala His Pro Gln Glu vai Tyr

515 520 525

Asn Glu Tyr vai Pro Arg Gly Cys Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe

530 535 540

His Asp Thr Leu Gly Gln Ser Asp Asp Leu Ile His His His His Asp545 550 555 560

Tyr His His lie Leu His His His His His Gln Asn His His Pro His

565 570 575

ser His ser Gln Arg Tyr Ser Arg Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly vai

580 585 590

Ala Thr Leu Ala Trp Met vai Ile Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe

595 600 605

Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala Ala Phe Thr Glu Gly Leu ser ser

610 615 620

Gly Leu ser Thr Ser vai Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu-625 630 635 640

Leu Gly Asp Phe Ala vai- Leu Leu Lys- Ala Asp Met Thr Val Lys Gln

645 650 655

Ala vai Leu Tyr Asn Alà Leu Ser Ala Met Leu Ala Tyr Leu Gly Met

660 665 670

Ala Thr Gly lie Phe lie Gly His Tyr Ala Glu Asn vai Ser Met Trp

675 680 685

lie Phe Ala Leu Thr Ala Gly Leu Phe Met Tyr Val Ala Leu vai· Asp

690 695 700

Met vai Pro Glu Met Leu His Asn Asp. Ala Ser Asp His Gly Cys ser705 710 715 720

Arg Trp Gly Tyr Phe Phe Leu Gln Asn Ala Gly Met Leu Leu Gly Phe

725 730 735

Gly lie Met Leu teu Ile ser Ile Phe Glu His Lys Ile Val Phe Arg740 745 750

Ile Asn Phe

755

<210> 367<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<223> Nucleotídeo gerado sinteticamente<400> 367

aaaggctggc atgaccgtta a

<210> 368<211> 21<212> ONA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Nucleotídeo gerado sinteticamente<400> 368

gacagtgtta gtgctagtga a

<210> 369<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Nucleotídeo gerado sinteticamente<400> 369

ctagttaagg tttaaatgct a .

<?ιη> *7C><2li> 21<212> DNA

<2.13> Seqüência artificial<220>

<223>Nucleotídeo gerado sinteticamente<400> 370

•aaggcttatc aagtggttta a

<21Ó> 371<211> .25<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Synthefically generated oiigonucleotide<400> 371

gcaaccctga aactcaccac tacga

<210> 372<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

. <223> Nucleotídeo gerado sinteticamente<400> 372

.taccgtaccc gtaggtccaa-ggcg

<210> 373<211> 25

<212> DNA

<2^·3> Seqüência artificial

<223> Nucleotídeo gerado sinteticamente

<400> 373

tgtggtactg gtgctggtag tgagt

<210> 374<211> 25<212> DNA

<Z13> Seqüência artificial<220>

<223> Nucleotídeo gerado sinteticamente<400> 374

tggtgaatga gatcgtctga ctggc

<210> 375

<211> 25

<212> DNA . <213> Seqüência artificial

<223> Nucleotídeo gerado sinteticamente

<400> 375agggctcttg tgagtctgct cgtaa 25

<210> 376<211> 25<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Nucleotídeo gerado sinteticamente

<400> 376agcatcacca ctcaaagtcc caacg 25

<210> 377<211> 24<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Nucleotídeo gerado sinteticamente

<400> 377gccagtgcca caaggaaact cagg 25

<21Ò> 378<211> 24<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Nucleotídeo gerado sinteticamente<400> 378gcggaacctg gatgcccatg ccat 25

<210> 379<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Nucleotídeo gerado sinteticamente<400> 379actggcatgt tctggtcggt gagc 25

<210> 380<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223> Nucleotídeo gerado sinteticamente

<400> 380atgctcatgg tctgagtgac gctca 25

<210> 381<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Nucleotídeo gerado sinteticamente<400> 381tgagtgatgg tcctggtcat ggtgt 25<210> 382

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetically generated oligonucleotide

<400> 382aagagggcaa aggtcaggat caaga

<210> 383

<211> 831

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 383

Met Lys vai His Met His Thr Lys Phe cys Leu Xle cys Leu Leu Thr

1 5 10 15

Phe Ile Phe His His Cys Asn His Cys His Glu Glu His Asp His Gly

20 25 30

Pro Glu Ala Leu His Arg Gln His Arg Gly Met Thr Glu Leu Glu Pro

35 40 45

ser Lys Phe Ser Lys Gln Ala Ala Glu Asn Glu Lys Lys Tyr Tyr Ile

50 55.. 60 .

Glu Lys Leu Phe Glu Arg Tyr Gly Glu Asn Gly Arg Leu ser Phe Phe65 70 75 80

Gly Leu Glu Lys Leu .Leu Thr Asn Leu Gly Leu Gly Glu Arg Lys Val

85 90 95

Val Glu xle Asn His Glu Asp Leu Gly His Asp His Val ser His Leu

100 105 110 .

Asp Ile Leu Ala vai Gln Glu Gly Lys His Phe His Ser His Asn His

115 120 .125

Gln His Ser His Asn His Leu Asn ser Glu Asn Gln Thr vai Thr Ser

130 135 140

vai Ser Thr Lys Arg Asn His Lys Cys Asp Pro Glu Lys Glu Thr vai-145 150 155 160

Glu vai ser vai Lys Ser Asp Asp Lys His Met His Asp His Asn His

165 170 175

Arg Leu Arg His His His Arg Leu His His His Leu Asp His Asn Asn

180 185 190

Thr His His Phe His Asn Asp Ser Ile Thr Pro Ser Glu Arg Gly Glu

195 200 .205

Pro Ser Asn Glu Pro ser Thr Glu Thr Asn.Lys Thr Gln Glu Gln Ser

210 215 220

Asp Val Lys Leu Pro Lys Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Arg Lys ser225 230 235 240

Asn Glu Asn ser Glu Val lie Thr pro Gly Phe Pro Pro As η His Asp

245 250 255

Gln Gly-Glu Gln Tyr Gl u. His Asn Arg Val His Lys Pro Asp Arg vai

260 265 270

His Asn pro Gly His ser His vai His Leu Pro Glu Arg Asn Gly His

275 280 285

Asp Pro Gly Arg Gly His Gln Asp Leu Asp Pro Asp Asn Glu Gly Glu

290 295 300

Leu Arg His Thr Arg Lys Arg Glu.Ala Pro His Val Lys Asn Asn Ala305 310 315 320

Ile Ile ser Leu Arg Lys Asp Leu Asn Glu Asp Asp His His His Glu

325 330 335

Cys Leu Asn Val Thr Gln Leu Leu Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Asn

340 345 350'

Ser Pro Ile Ser Thr.Asp Leu Phe Thr Tyr Leu cys Pro Ala Leu Leu

355 360 365

Tyr Gln Ile Asp Ser Arg Leu Cys Ile Glu His Phe Asp Lys Leu Leu

370 375 380

Val Glu Asp Ile Asn Lys Asp Lys Asn Leu vai Pro Glu Asp Glu Ala385 390 395 400

Asn lie Gly Ala Ser Ala Trp Ile Cys Gly IleJIle Ser lie Thr Val405 410 415

Ile ser Leu Leu ser Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Xle Ile Asn

420 425 430

Gln Gly Cys Phe Lys Phe Leu Leu Thr Phe Leu Val Ala Leu Ala Val'

435 440 445

Gly Thr Met Ser Gly Asp Ala Leu Leu His Leu Leu Pro His Ser Gln

450 455 460

Gly Gly His Asp His ser His Gln His Ala His Gly His Gly His ser465 470 475 480

His Gly His Glu ser Asn Lys phe Leu Glu Glu Tyr Asp Ala vai Leu

485 490 495

Lys Gly Leu Val Ala Leu Gly Gly Ile Tyr Leu Leu Phe Ile Ile Glu

500 505 510

His Cys Ile Arg Met Phe Lys His Tyr Lys Gln Gln Arg Gly Lys Gln

515 520 525

Lys Trp Phe Met Lys Gln Asn Thr Glu Glu ser Thr Ile Gly Arg Lys

530 535 540

Leu ser Asp His Lys Lèu Asn Asn Thr Pro Asp ser Asp Trp Leu Gln545 550 555 560

Leu Lys Pro Leu Ala Gly Thr Asp Asp Ser Val vai Ser Glu Asp Arg

565 570 575

Leu Asn Glu Thr Glu Leu Thr Asp Leu Glu Gly Gln Gln Glu Ser Pro

580 585 590

Pro Lys Asn Tyr Leu Cys Ile Glu Glu Glu Lys Ile Ile Asp His Ser

595 600 605

His Ser Asp Gly Leu His Thr Ile His Glu His Asp Leu H.is Ala Ala

610 615 620

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His Gln Trp His His Lys His ser His His ser His Gly Pro Cys His

645 650 655

Ser Gly Ser Asp Leu Lys Glu Thr Gly Ile Ala Asn Ile Ala Trp Met

660 665 670

Val Ile Met Gly Asp Gly Ile His Asn Phe Ser Asp Gly Leu Ala Ile

675 680 685

Gly Ala Ala Phe Ser Ala Gly Leu Thr Gly Gly Ile ser Thr Ser Ile

690 695 700

Ala Val Phe Cys Kis Glu Leu pro His Glu Leu Gly Asp Phe Ala Val705 710 715 720

Leu Leu Lys Ala Gly Met Thr Val Lys Gln Ala lie Val Tyr Asn Leu

725 730 735

Leu ser Ala Met Met Ala Tyr Ile Gly Met Leu Ile Gly Thr Ala Val

740 745 750

Gly Gln Tyr Ala Asn Asn He Thr Leu Trp Ile Phe Ala vai Thr Ala

755 760 765

Gly Met Phe Leu Tyr Val Ala Leu Val Asp Met Leu Pro Glu Met Leu

770 775 780

His Gly Asp Gly Asp Asn Glu Glu His Gly Phe Cys Pro Val Gly Gln785 790 795 800

Phe Ile Leu Gln Asn Leu Gly Leu Leu Phe Gly Phe Ala Ile Met Leu

805 810 815

vai He Ala Leu Tyr Clu Asp Lys lie vai Phe Asp Ile Gln Phe820 825 830

<21C> 384<211> 335<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 384

Met Leu Gln Gly His Ser Ser Val Phe Gln Ala Leu Leu <3ly Thr Phe

1 5 10 15

Phe Thr Trp Gly Met Thr Ala Ala Gly Ala Ala Leu Val Phe Val Phe

20 25 30

ser ser Gly Gln Arg Arg Ile Leu Asp Gly ser Leu Gly Phe Ala Ala

35 40 45

Gly Val Met Leu Ala Ala Ser Tyr Trp Ser Leu Leu Ala Pro Ais vai50 55 60

Glu Met Alá Thr Ser ser Gly Gly Phe-Gly Ala Phe Ala Phe Phe. Pro65 70 75 80

Val Ala vai Gly Phe Thr Leu Gly Ala Ala Phe vai Tyr Leu Ala Àsp

85 90 95

Leu Leu Met Pro His Leu Gly Ala Ala Glu Asp Pro Gln Thr Ala Leu

100 105 110

Ala Leu Asn Phe Gly Ser Thr Leu Met Lys Lys Lys Ser Asp Pro Glu

115 120 125

Gly Pro Ala Leu Leu Phe Pro Glu ser Glu Leu Ser Ile Arg Ile Asp

130 135 140

Lys ser Glu Asn Gly Glu Ala Tyr Gln Arg Lys Lys Ala Ala Ala Thr145 150 155 160

Gly Leu Pro Glu Gly Pro Ala Val Pro Val Pro Ser Arg Gly Asn Leu

165 170 175

Ala Gln Pro Gly Gly ser ser Trp Arg Arg Ile Ala Leii Leu Xle Leu

180 185 190

Ala Ile Thr Xle His Asn vai Pro Glu Gly Leu Ala vai Gly Val Gly

195 200 205

Phe Gly Ala Ile-Glu Lys Thr Ala Sér Ala Thr Phe Glu ser Ala. Arg210 215 220

Asn Leu Ala Ile Gly Ile Gly Ile Gln Asn Phe Pro Glu Gly Leu Ala225 230 235 240

vai Ser Leu Pro Leu Arg Gly Ala Gly Phe ser Thr Trp Arg Ala Phe

245 250 255

Trp Tyr Gly Gln Leu ser Gly Met Val Glu Pro Leu Ala Gly Val Phe

260 265 270

Gly Ala Phe Ala vai vai Leii Ala Glu Pro Ile Leu Pro Tyr Ala Leu

275 280 285

Ala Phe Ala Ala Gly Ala Met Val Tyr vai vai Met Asp- Asp ilé Ile

290 295 300

Pro Glu Ala Gln Ile Ser Gly Asn Gly Lys Leu Ala ser Trp Ala Ser305 310 315 320

Ile Leu Gly Phe vai vai Met Met Ser Leu Asp Val Gly Leu Gly325 330 335

<210> 385<211> 364<212> PRT<213> Homo -sapiens

<400> 385

Met Pro Gly Cys Pro Cys Pro Gly Cys Gly Met Ala Gly Pro Arg Leu

1 5 10 15

Leu Phe Leu Thr Ala Leu Ala Leu Glü Leu Leu Gly Arg Ala Gly Gly

20 25 30

Ser Gln Pro Ala Leu Arg ser Arg Gly Thr Alá Thr Ala cys Arg Leu

35 40 45

Asp Asn Lys Glu ser Glu.ser Trp Gly Ala Leu Leu Ser Gly Glu-Arg

50 55 60

Leu Asp Thr Trp Ile cys ser Leu Leu Gly ser Leu Met vai Gly Leu65 70 75 80

ser Gly Val Phe Pro Leu Leu vai Xle. Pro- Leu Glu Met Gly Thr Met

85 90 95

Leu Arg ser Glu Ala Gly Ala Trp Arg Leu Lys Gln Leu Leu ser Phe

100 105 110

Ala Leu Gly Gly Leu Leu Gly Asn Val Phe Leu His Leu Leu Pro Glu

115 120 125

Ala Trp Ala Tyr -Thr cys Ser. Ala Ser Pro Gly Gly Glu Gly Gln ser

130 135 140

Leu Gln Gln Gln Gln.Gln Leu Gly Leu Trp vai Ile Ala Gly Ile Leu145 150 155 160

Thr Phe Leu Ala Leu Glu Lys Met Phe Leu Asp ser Lys Glu Glu Gly

165 170 175

Thr Ser Gln Ala Pro Asn Lys Asp Pro Thr .Ala Ala Ala Ala Ala Leu

180 185 190

Asn Gly Gly His cys Leu Ala Gln Pro Ala Ala Glu Pro Gly Leu Gly195 200 205

Ala vai vai Arg ser Ile Lys vai ser Gly Tyr Leu Asn Leu Leu Ala

210 215 220

Ásn Thr Ile Asp Asn Phe Thr His Gly Leu Ala Val Ala Ala Ser Phe"225 230 235 240

Leu vai Ser Lys Lys lie. Gly Leu Leu Thr Thr Met Ala Ile Leu Leu

245 250 255

His Glu xle Pro His Glu vai Gly Asp Phe Ala Ile Leu Leu Arg Ala

260 265 270

Gly Phe Asp Arg Trp Ser Ala Ala Lys Leu Gln Leu Ser Thr Ala Leu

275 280 285

Gly Gly Leu Leu Gly Ala Gly-Phe Ala lie Cys Thr Gln ser Pro Lys

290 295 300

Gly vai Glu Glu Thr Ala Ala Trp vai Leu Pro Phe Thr ser Gly Gly305 310 315 320

Phe Leu Tyr Xle Ala Leu Val Asn Val Leu Pro Asp Leu Leu Glu Glu

325 330 335

Glu Asp Pro Trp Arg Ser Leu Gln Gln Leu Leu Leu Leu Cys Ala Gly

340 345 350

lie vai Val Met Val Leu Phe ser Leu Phe vai Asp355 360

<210> 386<211> 405<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 386

Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser Phe Leu ser Leu Leu Gly Val15 10 15

Leu vai Pro Leu Met asπ Arg vai Phe Phe Lys Phe Leu Leu ser Leu

20 25 30

Val Ala Leu Ala Val Gly Thr Leu Ser Gly Asp Ala Phe Leu Leu Leu

35 40 45

Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu Pro Ala

50 55 60

Met Glu Met Lys Arg Gly Pro Leu Phe Ser His Lèu Ser GlrvAsn Il e"65 70 75 80

Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Asp Ser Thr Trp Lys Leu Thr Ala Leu Gly

85 90 95

Gly Leu Tyr Phe Met Phe Leu vai Glu His Leu Thr Leu Ile Lys Gln

100 105 110

Phe Lys Asp Lys Lys Lys Lys Asn Gln Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp

115 120 125

Val Glu Ile Lys Lys Gln Leu Ser Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn

130 135 140

Glu Glu Lys vai Asp Thr Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala Asp145 150 155 160

Ser Gln Glu Pro ser His Asp ser Gln Gln Pro Ala vai Leu Glu Glu

165 170 175

Glu Glu Val Met lie His Ala His Pro Gln Glu ValTyr Asn Glu Tyr

180 185 190

Val Pro Arq Glv Lys-Asn Lys Cys His Ser. His Phe His Asp Thr Leu

195 200 205

Gly Gln Ser Asp Leu Ile His His His His Asp Tyr His His Ile Leu

210 215 220

His His His His Glr Asn His His Pro His Ser His ser Gln Arg Tyr225 230 235 240

Ser Glu Glu Leu LVs Asp Ala Gly vai Ala Tnr Leu Ala Trp Met Val

245 250 255

Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala

260 265 270

Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser Gly Leu Ser Thr ser Val Ala Phe Cys

275 280 285

Kis Glu Leu Pro His Glu Leu Gly Asp Phe Ala vai Leu Lys Ala Gly

290 295 300

Met Thr Val Lys Gln Ala vas Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Met Leu Ala1 5 IU 15

Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg Gly Pro Leu Phe Ser His Leu

20 25 30

ser Ser Gln Asn lie Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Asp ser Thr35 .40 45

<210> 389<211> 6<212> PRT<213> Horao sapiens

<400> 389

Thr Glu Gly Leu Ser Ser1 5

<210> 390

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 390

His Tyr Ala Glu Asn vai Ser Met1 5

<210> 391

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapi ens

<400> 391

Val Phe Arg Ile Asn Phe1 5

Claims

1. Composição compreendendo um modulador de LIV-1 e umou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, em que o modulador de LIV--1 é selecionado do grupo que consiste em: um RNA de duplo filamento iso-lado (dsRNA); um oligonucleotídeo isolado compreendendo pelo menos 10nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de SEQ ID NO: 1 e um anti-corpo que se liga a um epítopo em um domínio de LIV-1 selecionado do gru-po que consiste no domínio extracelular N-terminal de LIV-1, no domínio ex-tracelular de LIV-1 entre domínios transmembranares (TM) 2&3, no domínioextracelular de LIV-1 entre TM 4&5, no domínio extracelular de LIV-1 entreTM 6&7 e no domínio extracelular C-terminal de LIV-1.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que ooligonucleotídeo é um dsRNA, um siRNA, um shRNAou um oligonucleotídeoanti-sentido.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, que temuma ou mais atividades selecionadas do grupo que consiste em aumentarapoptose de célula cancerosa, inibir crescimento de célula cancerosa, inibirformação de tumor, inibir sobrevivência de célula cancerosa, inibir prolifera-ção de célula cancerosa, inibir metástase de célula cancerosa, inibir migra-ção celular, inibir angiogênese, inibir sinalização de LIV-1, inibir adesão célu-la-célula mediada por LIV-1, inibir interação de membrana célula-célula me-diada por LIV-1, inibir interação matriz extracelular-célula mediada por LIV-1,inibir degradação matriz extracelular-célula mediada por LIV-1 e inibir ex-pressão de LIV-1.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que acomposição é uma injetável estéril.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que omodulador de LIV-1 inibe um ou mais de crescimento de célula cancerosa,sobrevivência de célula cancerosa, formação de tumor e proliferação de cé-lula cancerosa.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que oreferido modulador de LIV-1 inibe um ou mais de ciclina D1, fibronectina,RhoB1 ΜΤ1-ΜΜΡ, FGF1 CDK4, VEGF, EGFR e fosforilação deEGFR

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que oreferido modulador de LIV-1 modula atividades mediadas por integrina.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que omodulador de LIV-1 inibe um ou mais genes na via SNAIL.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que omodulador de LIV-1 inibe a localização nuclear de Snail.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que oreferido modulador de LIV-1 supra-regular é um ou mais de E-caderina, VE-caderina, Muc-1.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que oreferido modulador de LIV-1 supra-regular é um ou mais de claudina, ocludi-na, desmoplaquina, caspase, p21, p53, BID (agonista de morte que interagecom bcl), DFF40 (fator de fragmentação de DNA) e citoqueratina.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que omodulador de LIV-1 inibe o transporte de zinco.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que omodulador de LIV-1 reduz os níveis de zinco citoplasmático.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que omodulador de LIV-1 é um anticorpo monoclonal que se liga a um polipeptí-deo LIV-1 com uma afinidade de pelo menos 1x108 Ka.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, em que opolipeptídeo LIV-1 tem uma seqüência SEQ ID NO: 2.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 14, em que oanticorpo monoclonal modula uma ou mais atividades biológicas relaciona-das a LIV-1.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 14, em que oanticorpo monoclonal inibe um ou mais dentre crescimento de célula cance-rosa, sobrevivência de célula cancerosa, formação de tumor e proliferaçãode célula cancerosa.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que oanticorpo monoclonal é um anticorpo mono, um anticorpo policlonal, um an-ticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anti-corpo de cadeia única, um anticorpo biespecífico, um anticorpo multi-específico ou um fragmento Fab.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 14, em que oanticorpo monoclonal se liga a um ou mais epítopos de LIV-1, o referido epí-topo tendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ IDNOS: 3-364 e 388-391.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 14, em que oanticorpo monoclonal se liga a um epítopo de LIV-1 no domínio extracelularde LIV-1 entre TM 2&3.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 19, em que oanticorpo monoclonal se liga a um ou mais epítopos de SEQ ID NO: 388.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 14, em que oanticorpo monoclonal se liga a um epítopo LIV-1 no domínio extracelular N-terminal de LIV-1.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, em que oanticorpo monoclonal se liga a um ou mais epítopos de SEQ ID NO: 387.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que omodulador de LIV-1 é um oligonucleotídeo que tem uma seqüência selecio-nada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 367-382.

25. Célula isolada que produz o anticorpo de acordo com a rei-vindicação 14.

26. Hibridoma que produz o anticorpo de acordo com a reivin-dicação 14.

27. Animal transgênico não humano que produz o anticorpo deacordo com a reivindicação 14.

28. Polipeptídeo portando epítopo isolado compreendendo umou mais epítopos de SEQ ID NO: 2, os referidos epítopos selecionados dogrupo que consiste em SEQ ID NOS: 6-364 e 387-391.

29. Polipeptídeo portando epítopo isolado, de acordo com areivindicação 28, limitado adicionalmente pela condição de que o polipeptí-.deo não compreenda a seqüência de aminoácidos inteira de SEQ ID NO: 2.

30. Polinucleotideo que codifique um polipeptideo portando e-pítopo isolado de acordo com a reivindicação 28.

31. Polipeptídeo portando epítopo, de acordo com a reivindica-ção 28, em que cada um dos referidos epítopos consiste entre cerca de 6 ecerca de 20 aminoácidos contíguos ao epítopo selecionado do grupo queconsiste em SEQ ID NOS: 6-364 e 387-391.

32. Polipeptídeo portando epítopo, de acordo com a reivindica-ção 28, que compreende pelo menos dois epítopos de SEQ ID NO: 2 e emque cada um dos referidos epítopos consiste em entre cerca de 6 e 20 ami-noácidos contíguos ao epítopo selecionado do grupo que consiste em SEQID NOS: 6-364 e 387-391.

33. Polipeptídeo portando epítopo, de acordo com a reivindica-ção 28, em que pelo menos um dos referidos epítopos consiste em pelo me-nos 21 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2.

34. Anticorpo LIV-1 isolado que é obtido por imunização de umindivíduo com o polipeptídeo portando epítopo como definido na reivindica-ção 28.

35. Método para tratar câncer ou sintoma de câncer em umpaciente necessitado deste compreendendo administrar ao paciente umaquantidade terapeuticamente eficaz do modulador de LIV-1 de acordo com areivindicação 1.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que 0 mo-dulador de LIV-1 inibe crescimento de células cancerosas que expressamLIV-1 em pelo menos 25% em um ensaio in vitro para medir o crescimentocelular.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o mo-dulador de LIV-1 é eficaz em uma concentração de menos de cerca de 1 mMem induzir apoptose em pelo menos 25% de células postas em contato emum ensaio in vitro para medir apoptose.

38. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o mo-dulador de LIV-1 reduz níveis de zinco citoplasmático em pelo menos 25%quando comparados a um controle.

39. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o refe-rido moduladorde LIV-1 inibe um ou mais de ciclina D1, fibronectina, RhoB,MT1 -MMP, FGF1 CDK4, VEGF, EGFR e fosforilação de EGFR.

40. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o mo-dulador de LIV-1 inibe a expressão de LIV-1 em pelo menos 25% quandocomparada a um controle.

41. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o mo-dulador de LIV-1 é um siRNA, um shRNA, ou um oligonucleotídeo anti- sentido.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, em que o mo-dulador de LIV-1 é um oligonucleotídeo que tem uma seqüência selecionadado grupo que consiste em SEQ ID NO: 367-382.

43. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o mo- dulador de LIV-1 é um anticorpo monoclonal.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que o anti-corpo monoclonal se liga a um ou mais epítopos, o referido epítopo tendouma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 3-364 e-388-391.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que o anti-corpo monoclonal se liga a um epítopo de LIV-1 no domínio extracelular deLIV-1 entre domínios transmembranares (TM) 2&3.

46. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que o anti-corpo monoclonal se liga a um ou mais epítopos de SEQ ID NO: 388.

47. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que o anti-corpo monoclonal se liga a um epítopo LIV-1 no domínio extracelular N-terminal de LIV-1.

48. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que o anti-corpo monoclonal se liga a um ou mais epítopos de SEQ ID NO: 387.

49. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o cân-cer é câncer de mama, câncer de pele, câncer de esôfago, câncer hepático,câncer pancreático, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical, cân-cer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de ovário, mieioma múltiplo e me-lanoma.

50. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o cân-cer é um tecido regulado não hormonalmente.

51. Método, de acordo com a reivindicação 49, em que o cân-cer de mama é câncer de mama positivo para receptor de estrogênio, câncerde mama negativo para receptor de estrogênio e câncer de mama metastáti-co.

52. Método, de acordo com a reivindicação 49, em que o cân-cer de mama é selecionado do grupo que consiste em adenocarcinoma duc-tal, adenocarcinoma Iobular e adenocarcinoma metastático.

53. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o cân-cer é carcinoma de células escamosas.

54. Método, de acordo com a reivindicação 35, compreenden-do adicionalmente a administração de uma terapia de câncer convencionalao paciente.

55. Método, de acordo com a reivindicação 35, compreenden-do adicionalmente o tratamento do paciente com um ou mais de quimiotera-pia, radioterapia ou cirurgia.

56. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o sin-toma de câncer é selecionado do grupo que consiste em nódulos na mama,alterações no mamilo, cistos na mama, dor na mama, morte, perda de peso,fraqueza, excesso de fadiga, alimentação dificultosa, perda de apetite, tossecrônica, piora da falta de respiração, sangue expelido na tosse, sangue naurina, sangue nas fezes, náusea, vômito, metástases hepáticas, metástasespulmonares, metástases ósseas, volume abdominal, intumescência, fluidona cavidade peritoneal, sangramento vaginal, constipação, distensão abdo-minal, perfuração do cólon, metástases do pulmão peritonite aguda, dor,sangue em vômito, sudorese intensa, febre, pressão sangüínea alta, anemia,diarréia, icterícia, tonteira, calafrios, espasmos musculares, metástases decólon, metástases de bexiga, metástases renais e metástases pancreáticas,deglutição dificultosa e semelhantes.

57. Método para modular uma atividade biológica relacionadaa LIV-I em um paciente, o método compreendendo administrar ao pacienteuma quantidade do modulador de LIV-1, de acordo com a reivindicação 1,eficaz para modular a atividade biológica relacionada a LIV-1.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, em que o mo-dulador de LIV-1 é um anticorpo monoclonal que seletivamente se liga a LIV--1.

59. Método, de acordo com a reivindicação 57, em que o paci-ente tem ou está predisposto a ter um ou mais de câncer de mama, câncerde pele, câncer de esôfago, câncer hepático, câncer pancreático, câncer depróstata, câncer uterino, câncer cervical, câncer de pulmão, câncer de bexi-ga, câncer de ovário, mieloma múltiplo e melanoma.

60. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o mo-dulador de LIV-1 é um anticorpo e é administrado ao indivíduo através detransferência gênica de anticorpo terapêutico in vivo.

61. Método para identificar um paciente suscetível à terapiaLIV-1 compreendendo:(a) detectar a presença ou ausência de expressão diferencial deLIV-1 em uma amostra de paciente, em que a presença de expressão dife-rencial de LIV-1 na citada amostra é indicativo de um paciente que é umcandidato para terapia LIV-1 e a ausência de expressão diferencial de LIV-1na citada amostra é indicativo de um paciente que não é um candidato paraterapia LIV-1;(b) administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz dacomposição, como definida na reivindicação 1, ao paciente se o paciente forum candidato para terapia LIV-1; e(c) administrar uma terapia para câncer convencional ao pacien-te se o paciente não for um candidato para terapia LIV-1.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, em que a ex-pressão de LIV-1 no paciente está aumentada em pelo menos 50% compa-rada a um controle.

63. Método, de acordo com a reivindicação 61, em que a ex-pressão diferencial de LIV-1 é detectada pela medição de RNA de LIV-1.

64. Método, de acordo com a reivindicação 61, em que a ex-pressão diferencial de LIV-1 é detectada pela medição de produtos de ex-pressão de LIV-1.

65. Método, de acordo com a reivindicação 61, compreenden-do ainda a administração de uma terapia para câncer convencional ao paci-ente.

66. Método para inibir crescimento de células cancerosas queexpressam LIV-1 compreendendo por em contato uma quantidade do modu-lador de LIV-1, de acordo com a reivindicação 1, eficaz para inibir crescimen-to das células com as células.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66, em que o mo-dulador de LIV-1 reduz níveis de zinco citoplasmático em pelo menos 25%quando comparados a um controle.

68. Método, de acordo com a reivindicação 66, em que o mo-dulador de LIV-1 reduz níveis de ciclina D1 em pelo menos 25% quandocomparados a um controle.

69. Método para inibir um fenótipo de célula cancerosa emuma população de células que expressam LIV-1, o referido método compre-endendo administrar à citada população uma quantidade do modulador deLIV-1, de acordo com a reivindicação 1, eficaz para inibir o fenótipo de célulacancerosa.

70. Método, de acordo com a reivindicação 69, em que as cé-lulas cancerosas são selecionadas do grupo que consiste em câncer demama, câncer de pele, câncer de esôfago, câncer hepático, câncer pancreá-tico, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical, câncer de pulmão,câncer de bexiga, câncer de ovário, mieloma múltiplo e melanoma.

71. Método para detectar uma ou mais células cancerosas queexpressam LIV-1 em uma amostra compreendendo por em contato a amos-tra com uma composição compreendendo o modulador de LIV-1, de acordocom a reivindicação 1, ligado a um agente de visualização e detectar a loca-lização do agente de visualização na amostra.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71, em que a com-posição compreende um anticorpo LiV-i conjugado a um agente de visuali-zação.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, em que o agen-te de visualização é 18F, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 77Br, 87MSr, 86Y, 90Y,-99MTc, 111In, 1231,1251,127Cs, 129Cs, 131I11321,197Hg, 203Pb1 ou 206Bi.

74. Método para inibir a interação de duas ou mais células, emque pelo menos uma das citadas células expressa LIV-1, compreendendoadministrar uma quantidade eficaz do modulador, de acordo com a reivindi-cação 1, a uma amostra compreendendo as células.

75. Método, de acordo com a reivindicação 74, em que a inte-ração é in vivo.

76. Método, de acordo com a reivindicação 74, em que o mo-dulador de LIV-1 é um anticorpo monoclonal que reduz níveis de zinco cito-plasmático em pelo menos 25% quando comparados a um controle.

77. Método, de acordo com a reivindicação 74, em que o mo-dulador de LIV-1 é um anticorpo monoclonal que reduz níveis de ciclina D1em pelo menos 25% quando comparados a um controle.

78. Método para expressar um anticorpo anti-LIV-1 em uma cé-lula CHO ou de mieloma em que o anticorpo anti-LIV-1 inibe uma ou maisatividades biológicas relacionadas a LIV-1, o método compreendendo ex-pressar um ácido nucléico que codifica o anticorpo anti-LIV-1 na citada célulaCHO ou de mieloma.

79. Método para identificar um inibidor de câncer, o referidocâncer caracterizado pela superexpressão de LIV-1 comparada a um contro-le, o referido método compreendendo por em contato uma célula que ex-pressa LIV-1 com um composto candidato e um Iigante de LIV-1 e determi-nar se uma atividade transportadora de zinco relacionada a LIV-1 é inibida,em que inibição da atividade transportadora de zinco relacionada a LIV-1 éindicativo de um inibidor de câncer.

80. Método para identificar um inibidor de câncer, o referidocâncer caracterizado pela superexpressão de LIV-1 comparada a um contro-le o referido método compreendendo por em contato uma célula que ex-pressa LIV-I com um composto candidato e um iiganie de LiV-I e determi-nar se um marcador a jusante de LIV-1 é inibido, em que inibição do marca-dor a jusante é indicativo de um inibidor de câncer.

81. Método, de acordo com a reivindicação 80, em que o mar-cador a jusante é ciclina D1 ou níveis de zinco citoplasmático.

82. Método para determinar a suscetibilidade de um paciente aum modulador de LIV-1 compreendendo detectar evidência de expressãodiferencial de LIV-1 na citada amostra de câncer do paciente, em que evi-dência de expressão diferencial de LIV-1 é indicativo da suscetibilidade dopaciente ao referido modulador de LIV-1.

83. Método, de acordo com a reivindicação 82, em que a cita-da evidência de expressão diferencial de LIV-1 é a supra-regulação de LIV-1na citada amostra de câncer do paciente.

84. Método para purificar proteína LIV-1 de uma amostra com-preendendo proteína LIV-1 compreendendo:a) prover uma matriz de afinidade compreendendo o anticorpo,de acordo com a reivindicação 1, ligada a um suporte sólido;b) por em contato a amostra com a matriz de afinidade paraformar um complexo matriz de afinidade-proteína LIV-1;c) separar o complexo matriz de afinidade-proteína LIV-1 do res-tante da amostra; ed) liberar proteína LIV-1 da matriz de afinidade.

85. Método para distribuir um agente citotóxico ou um agentediagnóstico para uma ou mais células que expressam LIV-1, o referido mé-todo compreendendo:a) prover o agente citotóxico ou o agente diagnóstico conjugadoa um anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação 1; eb) expor a célula ao conjugado anticorpo-agente ou fragmento-agente.

86. Método para determinar o prognóstico de um paciente decâncer compreendendo determinar a proporção de LIV-1-delta para LIV-1 emuma amostra do referido paciente, em que a proporção de LIV-1-delta paraLiV-I é usada para determinar o prognóstico do paciente de câncer.

87. Método para determinar o prognóstico de um paciente decâncer compreendendo a presença ou ausência de LIV-1 ligado à membranaplasmática de uma célula em uma amostra do referido paciente, em que aausência de LIV-1 ligado à membrana plasmática de uma célula em umaamostra do referido paciente indica um bom prognóstico para o paciente.

88. Método, de acordo com a reivindicação 86 ou 87, em que oLIV-1 é codificado por um ácido nucléico que tem uma seqüência de SEQ IDNO: 1.

89. Método, de acordo com a reivindicação 86 ou 87, em que oLIV-1 tem uma seqüência de SEQ ID NO: 2.

90. Método, de acordo com a reivindicação 86, em que o LIV--1-delta tem uma seqüência de SEQ ID NO: 365.

91. Método, de acordo com a reivindicação 86, em que a pro-porção LIV-1-delta:LIV-1 de pelo menos 2:1 é indicativo de um paciente comum bom prognóstico.

92. Composição compreendendo um modulador de proteínatransportadora de zinco e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitá-veis, em que o modulador de proteína transportadora de zinco é selecionadodo grupo que consiste em: um RNA duplo filamento isolado(dsRNA); um oli-gonucleotídeo isolado compreendendo pelo menos 10 nucleotídeos conse-cutivos de uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ IDNOS: 383-385 e um anticorpo que se liga a um epítopo em um domínio daproteína transportadora de zinco selecionado do grupo que consiste no do-mínio extracelular N-terminal, no domínio extracelular entre domínios trans-membranares (TM) 2&3, no domínio extracelular entre TM 4&5, no domínioextracelular entre TM 6&7 e no domínio extracelular C-terminal.

93. Composição, de acordo com a reivindicação 92, em que aproteína transportadora de zinco é SLC39A10, SLC39A11 ou SLC39A13.

94. Composição, de acordo com a reivindicação 92, em que oreferido modulador de proteína transportadora de zinco modula atividadesmediadas por integrina, inibe transporte de zinco, ou reduz níveis de zincocitopiasmáíicos.

95. Composição, de acordo com a reivindicação 92, em que ooligonucleotídeo é um siRNA ou um oligonucleotídeo anti-sentido.

96. Composição, de acordo com a reivindicação 92, em que omodulador de proteína transportadora de zinco é um anticorpo monoclonalque se liga a uma proteína transportadora de zinco com afinidade de pelomenos 1x108Ka.

97. Composição, de acordo com a reivindicação 97, em que oanticorpo monoclonal se liga a um ou mais epítopos do domínio extracelularN-terminal da proteína transportadora de zinco.

98. Composição, de acordo com a reivindicação 97, em que oanticorpo monoclonal se liga a um ou mais epítopos no domínio extracelularda proteína transportadora de zinco entre domínios transmembranares (TM) 2&3.

99. Composição, de acordo com a reivindicação 97, em que oanticorpo monoclonal inibe um ou mais de crescimento de célula cancerosa,sobrevivência de célula cancerosa, formação de tumor e proliferação de cé-lula cancerosa.

100. Método para tratar câncer ou um sintoma de câncer em umpaciente em necessidade deste compreendendo administrar ao pacienteuma quantidade terapeuticamente eficaz do modulador de proteína transpor-tadora de zinco, de acordo com a reivindicação 92.

101. Método, de acordo com a reivindicação 100, em que o mo-dulador de proteína transportadora de zinco tem uma ou mais atividades se-lecionadas do grupo que consiste em aumentar apoptose de célula cancero-sa, inibir crescimento de célula cancerosa, inibir sobrevivência de célulacancerosa, inibir formação de tumor, inibir proliferação de célula cancerosa,inibir metástase de célula cancerosa, inibir migração celular, inibir angiogê-nese, inibir sinalização de LIV-1, inibir adesão célula-célula mediada por LIV--1, inibir interação de membrana célula-célula mediada por LIV-1, inibir inte-ração matriz extracelular-célula mediada por LIV-1, inibir degradação matrizextracelular-célula mediada por LIV-1 e inibir expressão de LIV-1.

102. ívlétoao, de acordo com a reivindicação IOu1 em que o mo-dulador de proteína transportadora de zinco inibe o crescimento celular decélulas cancerosas que expressam proteína transportadora de zinco em pelomenos 30% em um ensaio in vitro para medir crescimento celular.

103. Método, de acordo com a reivindicação 100, em que o mo-dulador de proteína transportadora de zinco é eficaz em uma concentraçãode menos de cerca de 1 mM para induzir apoptose em pelo menos 20% decélulas postas em contato em um ensaio in vitro para medir apoptose.

104. Método, de acordo com a reivindicação 100, em que o mo-dulador de proteína transportadora de zinco inibe o transporte de zinco.

105. Método, de acordo com a reivindicação 100, em que o mo-dulador de proteína transportadora de zinco modula níveis de zinco cito-plasmático.

106. Método, de acordo com a reivindicação 100, em que o mo-dulador de proteína transportadora de zinco modula atividades mediadas porintegrina.

107. Método, de acordo com a reivindicação 101, em que o mo-dulador de proteína transportadora de zinco inibe expressão de proteínatransportadora de zinco em pelo menos 25% quando comparada a um con-trole.

108. Método, de acordo com a reivindicação 100, em que o mo-dulador de proteína transportadora de zinco é um anticorpo monoclonal.

109. Método, de acordo com a reivindicação 108, em que o an-ticorpo tem uma afinidade menos de cerca de 1x105 Ka por um polipeptídeodiferente da proteína transportadora de zinco.

110. Método, de acordo com a reivindicação 109, em que o an-ticorpo monoclonal induz apoptose celular.

111. Método, de acordo com a reivindicação 109, em que o an-ticorpo monoclonal inibe formação de tumor.

112. Método para modular uma atividade biológica relacionadaa proteína transportadora de zinco em um paciente, o método compreen-dendo administrar ao paciente uma quantidade do modulador de proteínatransportadora de zinco, de acordo com a reivindicação 92, eficaz para mo-dular a atividade biológica relacionada à proteína transportadora de zinco.

113. Método, de acordo com a reivindicação 112, em que o mo-dulador de proteína transportadora de zinco é um anticorpo monoclonal queseletivamente se liga à proteína transportadora de zinco.

114. Método, de acordo com a reivindicação 100 ou 112, emque o paciente tem ou está predisposto a ter um ou mais de câncer de ma-ma, câncer de pele, câncer de esôfago, câncer hepático, câncer pancreático,câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical, câncer de pulmão, cân-cer de bexiga, câncer de ovário, mieloma múltiplo e melanoma.

115. Método para inibir crescimento de células cancerosas queexpressam proteína transportadora de zinco compreendendo por em contatocélulas com uma quantidade do modulador de proteína transportadora dezinco, de acordo com a reivindicação 92, eficaz para inibir o crescimento dascélulas.

116. Método, de acordo com a reivindicação 115, em que o mo-dulador de proteína transportadora de zinco é um anticorpo monoclonal queseletivamente se liga à proteína transportadora de zinco e modula os níveisde zinco citoplasmático em pelo menos 30% quando comparados a um con-trole.

117. Método para detectar uma ou mais células cancerosas queexpressam uma proteína transportadora de zinco em uma amostra compre-endendo a amostra com uma composição compreendendo o modulador deproteína transportadora de zinco, de acordo com a reivindicação 92, ligado aum agente de visualização e detectar a localização do agente de visualiza-ção na amostra.

118. Método, de acordo com a reivindicação 117, em que acomposição compreende um anticorpo de proteína transportadora de zincoconjugado a um agente de visualização.

119. Método, de acordo com a reivindicação 118, em que o a-gente de visualização é 18Fj 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 77Br, 87MSr, 86Y, 90Y,-99MTc, 111In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb, ou 206Bi.

120. Método para inibir a interação cie duas ou mais céiuias, emque pelo menos uma das citadas células expressa proteína transportadorade zinco, compreendendo administrar uma quantidade eficaz do moduladorde proteína transportadora de zinco, de acordo com a reivindicação 92, auma amostra compreendendo as células.

121. Método, de acordo com a reivindicação 120, em que a inte-ração é in vivo.

122. Método para identificar um inibidor de câncer, o referidocâncer caracterizado pela superexpressão de uma proteína transportadorade zinco comparada a um controle, o referido método compreendendo porem contato uma célula que expressa uma proteína transportadora de zincocom um composto candidato e um Iigante de proteína transportadora de zin-co e determinar se uma atividade transportadora de zinco é inibida, em queinibição da atividade transportadora de zinco é indicativo de um inibidor decâncer.

123. Método para identificar um inibidor de câncer, o referidocâncer caracterizado pela superexpressão de uma proteína transportadorade zinco comparada a um controle, o referido método compreendendo porem contato uma célula que expressa proteína transportadora de zinco comum composto candidato e um Iigante de proteína transportadora de zinco edeterminar se um marcador a jusante da proteína transportadora de zinco éinibido, em que inibição do marcador a jusante é indicativo de um inibidor decâncer.

124. Método para determinar a suscetibilidade de um paciente aum modulador de proteína transportadora de zinco compreendendo detectarevidência de expressão diferencial de proteína transportadora de zinco nacitada amostra de câncer do paciente, em que evidência de expressão dife-rencial de proteína transportadora de zinco é um indicativo da suscetibilidadedo paciente ao referido modulador de proteína transportadora de zinco.

125. Método, de acordo com a reivindicação 124, em que a ci-tada evidência de expressão diferencial da proteína transportadora de zincoé supra-regulação da proteína transportadora de zinco na citada amostra decâncer do paciente.

126. Método para purificar uma proteína transportadora de zincode uma amostra compreendendo uma ou mais proteínas transportadoras dezinco compreendendo:a) prover uma matriz de afinidade compreendendo o anticorpo,de acordo com a reivindicação 92, ligado a um suporte sólido;b) por em contato a amostra com a matriz de afinidade paraformar um complexo matriz de afinidade-proteína transportadora de zinco;c) separar o complexo matriz de afinidade-proteína transporta-dora de zinco do restante da amostra; ed) liberar proteína transportadora de zinco da matriz de afinida-de.

127. Método para distribuir um agente citotóxico ou um agentediagnóstico para uma ou mais células que expressam proteína transportado-ra de zinco, o referido método compreendendo:a) prover o agente citotóxico ou o agente diagnóstico conjugadoa um anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação 92; eb)expor a célula ao conjugado anticorpo-agente ou fragmento-agente.