KR20090010194A - 암의 치료, 진단 또는 검출 방법 - Google Patents

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KR20090010194A
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메리 제이. 잔타포어
궈잉 유
로버트 토
비비엥 찬
데보라 짐머먼
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노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 특히 암의 치료 방법, 암 치료용 조성물, 및 암의 진단 및/또는 검출을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 LIV-1 과다발현과 관련된 암의 치료, 진단 및 검출을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
Figure P1020087027681
LIV-1, LIV-1 과다발현, LIV-1 조정인자, 암

Description

암의 치료, 진단 또는 검출 방법 {METHODS OF TREATING, DIAGNOSING OR DETECTING CANCER}
본 발명은 일반적으로 종양학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암의 치료 방법, 암 치료용 조성물, 및 암의 진단 및/또는 검출을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
암은 미국에서 사망의 두번째 주요 원인이다. "암"은 많은 상이한 유형의 암, 즉 유방암, 전립선암, 폐암, 결장암, 췌장암을 기술하는데 사용되나, 각 유형의 암은 표현형 수준 및 유전자 수준 둘 모두에서 상이하다. 하나 이상의 유전자의 발현이 돌연변이로 인해 조절곤란하게 되고 세포 성장이 더이상 제어될 수 없는 경우에 암의 비조절된 성장 특징이 야기된다.
유전자는 종종 두가지 부류, 종양 형성 유전자 및 종양 억제 유전자로 분류된다. 종양 형성 유전자는 정상적인 기능이 특정 조건 하에서만 세포 성장을 촉진하는 유전자이다. 종양 형성 유전자가 돌연변이를 얻은 후 제어를 손실하는 경우, 이는 모든 조건하에 성장을 촉진한다. 그러나, 암이 진실로 성공적이기 위해서는 암은 또한 종양 억제 유전자에서 돌연변이를 획득해야만 한다는 것이 밝혀졌다. 종양 억제 유전자의 정상적인 기능은 세포 성장을 정지시키는 것이다. 종양 억제 제의 예로는 p53, p16, p21 및 APC를 들 수 있으며, 이들은 모두 정상적으로 작용하는 경우에는 세포가 비제어적으로 분할하고 성장하는 것을 정지시킨다. 종양 억제제가 돌연변이되거나 또는 손실되는 경우, 세포 성장에 대한 상기 브레이크가 또한 손실되어, 세포가 제한없이 성장하게 한다.
아연은 세포 성장에 필수적이며, 300종 초과의 효소에 대한 보조인자이다. 아연은 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질 대사에 관여된다. 아연은 또한 유전자 전사, 성장, 발달 및 분화의 제어에 중요한 역할을 한다 (문헌 [Vallee and Falchuk (1993) Physiol. Rev. 73, 79-118]). 포유동물에서, 아연 결핍은 유해할 수 있으며, 이는 부진한 성장 및 심각한 대사 장애를 야기한다 (문헌 [Truong-Tran et al. (2001) Biometals 14, 315-330]). 과량의 아연은 또한 세포에 독성일 수 있다 (문헌 [Koh et al., (1996) Science 272, 1013-1016]). 아연은 세포 막을 가로질러 수동적으로 확산할 수 없다. 따라서, 아연을 세포로 수송하는데 특정 아연 수송 단백질이 필요하다. 아연은 세포 성장에 필수적이기 때문에, 아연 수송체는 세포자멸(apoptosis)과 세포 성장 사이의 세포 균형을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 균형의 이상은 암을 유발할 수 있다 (문헌 [Taylor et al., Biochem. J. (2003) 375, 51-59]).
진핵생물은 많은 상이한 아연 수송체를 갖는다. 최근까지, 가장 많이 연구된 아연 수송체는 ZIP 또는 CDF (음이온 확산 족) 수송체 족에 속한다. ZIP 수송체는 원형질막 상에 위치하고 아연 유입 수송체로서 작용하거나, 또는 세포내 막 상에 위치하여 이들 구조로부터 저장부를 이동하게 한다. ZIP 족은 86종 이상의 구성원으로 구성되며, 4종의 별개의 아족; ZIP 아족 I (1종의 공지된 인간 구성원으로 구성됨), ZIP 아족 II (3종의 공지된 인간 구성원으로 구성됨), gufa 아족 (2종의 공지된 인간 구성원으로 구성됨), 및 LIV-1 아족 (9종의 공지된 인간 구성원으로 구성됨)으로 나누어질 수 있다 (문헌 [Gaither and Eide (2001), Biometals 14, 251-270]).
LIV-1 (Zip6이라고도 공지됨)은 발현이 특정 유방암 세포의 에스트로겐 치료에 의해 자극되는 유전자로서 확인된 아연 수송체이다 (문헌 [Manning et al., (1988), Mol. Cell. Endocrinol. 59, 205-212]). LIV-1은 ZIP (Zrt-유사 단백질, Irt-유사 단백질) 아연 수송체의 아족 (소위 LZT (ZIP 아연 수송체의 LIV-1 아족)이라 함)에 속하는 것으로 나타났다 (문헌 [Taylor and Nicholson (2003), Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1611, 16-30]). 이들 수송체는 전이에서 공지된 역할을 하는 매트릭스 메탈로프로테아제에 존재하는 모티프와 유사한 잠재적인 메탈로프로테아제 모티프를 함유한다 (문헌 [Itoh and Nagase, (2002), Essays Biochem. 38, 21-36]). LIV-1 mRNA 발현은 국소 림프절로의 유방암의 확산과의 관련을 나타낸다. LIV-1 구조는 히스티딘-풍부이고 적어도 Zn2+ 이온의 결합 및/또는 수송에 대한 잠재성을 갖는다는 것을 나타낸다 (문헌 [Taylor, (2000), ZUBMB Life 49:249-253]).
척추동물 창자배형성은 신체 계획의 확립에서 중요한 단계이다. 상피-간엽 전이 (EMT)는 창자배형성 중에 일어난다. EMT는 배아 발달, 기관 및 조직 재생, 및 암 전이의 중요 사건 중 하나이다. 신호 변환기 및 전사의 활성인자 (STAT)는 다양한 생물학적 프로세스에서 사이토카인 및 성장 인자에 대한 반응으로 세포 증식, 분화 및 생존을 비롯한 생물학적 작용을 매개한다. STAT는 창자배형성, 기관발생, 창상 치유 및 암 진행 중에 EMT에서 또한 중요하다. STAT3은 제브라피시(zebrafish) 창자배형성 중에 활성화되는 것으로 나타났으며, 그의 활성은 창자배형성 이동에 필수적이다. 그러나, EMT에서 STAT의 작용의 분자 메카니즘은 완전히 밝혀지지 않았다. LIV-1은 EMT에서 STAT3의 하류 표적이고, EMT의 주종 조정인자인 아연-손가락 단백질 SNAIL의 핵 국소화에 또한 중요하다.
그러나, 최근까지 암에서 LIV-1의 역할은 완전히 밝혀지지 않았다. LIV-1을 조절하는 조성물 및 방법을 확인하는 것에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이들 뿐만 아니라 다른 중요한 필요성에 관한 것이다.
<발명의 요약>
몇몇 측면에서, 본 발명은 LIV-1 조정인자 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 단리된 이중 가닥 RNA (dsRNA)이다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 서열 1의 서열의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 올리고뉴클레오티드이다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 LIV-1의 N-말단 세포외 도메인, 막횡단 도메인 (TM) 2와 3 사이의 LIV-1 세포외 도메인, TM 4와 5 사이의 LIV-1 세포외 도메인, TM 6과 7 사이의 LIV-1 세포외 도메인, 및 LIV-1의 C-말단 세포외 도메인으로 구성된 군에서 선택된 LIV-1 도메인의 에피토프에 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 dsRNA, siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 LIV-1 조정인자를 암 또는 암 증상의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서의 암 또는 암 증상 치료 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 LIV-1-관련 생물학적 활성의 조절 유효량의 LIV-1 조정인자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 LIV-1-관련 생물학적 활성의 조절 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 환자 샘플에서 LIV-1의 차별적 발현의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 환자가 LIV-1 치료요법에 대한 후보인 경우에는 치료 유효량의 제1항의 조성물을 환자에게 투여하는 단계; 및 환자가 LIV-1 치료요법에 대한 후보가 아닌 경우에는 통상적인 암 치료제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, LIV-1 치료요법에 감수성인 환자의 확인 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 암 세포 성장의 억제 유효량의 LIV-1 조정인자를 LIV-1을 발현하는 암 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, LIV-1을 발현하는 암 세포의 성장 억제 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 암 세포 표현형의 억제 유효량의 LIV-1 조정인자를 LIV-1을 발현하는 세포 집단에 투여하는 것을 포함하는, LIV-1을 발현하는 세포 집단에서 암 세포 표현형의 억제 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 영상화제에 연결된 LIV-1 조정인자를 포함하는 조 성물과 샘플을 접촉시키고, 상기 샘플에서 영상화제의 국소화를 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 LIV-1을 발현하는 하나 이상의 암 세포의 검출 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 유효량의 LIV-1 조정인자를 세포를 포함하는 샘플에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 둘 이상의 세포 중 하나 이상은 LIV-1을 발현하는 것인, 둘 이상의 세포의 상호작용 억제 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 CHO 또는 골수종 세포에서 항-LIV-1 항체의 발현 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항-LIV-1 항체는 하나 이상의 LIV-1-관련 생물학적 활성을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 CHO 또는 골수종 세포에서 항-LIV-1 항체를 코딩하는 핵산을 발현하는 것을 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 LIV-1을 발현하는 세포를 후보 화합물 및 LIV-1 리간드와 접촉시키고, LIV-1-관련 아연 수송 활성이 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, 암 억제제의 확인 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1-관련 아연 수송 활성의 억제는 암 억제제에 대한 지표이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 LIV-1을 발현하는 세포를 후보 화합물 및 LIV-1 리간드와 접촉시키고, LIV-1의 하류 마커가 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, 암 억제제의 확인 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 하류 마커의 억제는 암 억제제에 대한 지표이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 환자의 암 샘플에서 LIV-1의 차별적 발현의 증거를 검출하는 것을 포함하는, LIV-1 조정인자에 대한 환자의 감수성 결정 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1의 차별적 발현의 증거는 LIV-1 조정인자에 대 한 환자 감수성의 지표가다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 고체 지지체에 결합된 LIV-1 항체를 포함하는 친화도 매트릭스를 제공하는 단계; LIV-1 단백질을 포함하는 샘플을 친화도 매트릭스와 접촉시켜서 친화도 매트릭스-LIV-1 단백질 복합체를 형성하는 단계; 친화도 매트릭스-LIV-1 단백질 복합체를 샘플의 나머지로부터 분리하는 단계; 및 LIV-1 단백질을 친화도 매트릭스로부터 방출하는 단계를 포함하는, LIV-1 단백질을 포함하는 샘플로부터의 LIV-1 단백질 정제 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 LIV-1 항체 또는 그의 단편에 접합된 세포독성제 또는 진단제를 제공하는 단계; 및 세포를 항체-작용제 또는 단편-작용제 접합체에 노출시키는 단계를 포함하는, LIV-1을 발현하는 하나 이상의 세포로의 세포독성제 또는 진단제 전달 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 암 환자의 샘플에서 LIV-1-델타:LIV-1의 비율을 결정하는 것을 포함하는, 암 환자의 예후 결정 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1-델타:LIV-1의 비율이 암 환자의 예후 결정에 이용된다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 암 환자의 샘플에서 세포의 원형질막에 결합된 LIV-1의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 암 환자의 예후 결정 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 암 환자의 샘플에서 세포의 원형질막에 결합된 LIV-1의 부재는 암 환자의 양호한 예후를 나타낸다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 아연 수송 단백질 조정인자 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 아연 수송 단 백질은 단리된 이중 가닥 RNA (dsRNA)이다. 몇몇 실시양태에서, 아연 수송 단백질은 서열 383-385로 구성된 군에서 선택된 서열의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 올리고뉴클레오티드이다. 몇몇 실시양태에서, 아연 수송 단백질은 N-말단 세포외 도메인, 막횡단 도메인 (TM) 2와 3 사이의 세포외 도메인, TM 4와 5 사이의 세포외 도메인, TM 6과 7 사이의 세포외 도메인, 및 C-말단 세포외 도메인으로 구성된 군에서 선택된 아연 수송 단백질 도메인의 에피토프에 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 아연 수송 단백질은 SLC39A10, SLC39A11 또는 SLC39A13이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 아연 수송 단백질 조정인자를 암 또는 암 증상의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서의 암 또는 암 증상 치료 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 아연 수송 단백질-관련 생물학적 활성의 조절 유효량의 아연 수송 단백질 조정인자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 아연 수송 단백질-관련 생물학적 활성의 조절 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 아연 수송 단백질을 발현하는 암 세포의 성장 억제 유효량의 아연 수송 단백질 조정인자를 아연 수송 단백질을 발현하는 암 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 아연 수송 단백질을 발현하는 암 세포의 성장 억제 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 영상화제에 연결된 아연 수송 단백질 조정인자를 포함하는 조성물과 샘플을 접촉시키고, 상기 샘플에서 영상화제의 국소화를 검출하 는 것을 포함하는, 샘플에서 아연 수송 단백질을 발현하는 하나 이상의 암 세포의 검출 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 유효량의 아연 수송 단백질 조정인자를 세포를 포함하는 샘플에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 둘 이상의 세포 중 하나 이상은 아연 수송 단백질을 발현하는 것인, 둘 이상의 세포의 상호작용 억제 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 대조군과 비교하여 아연 수송 단백질의 과다발현을 특징으로 하는 암의 억제제 확인 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 아연 수송 단백질을 발현하는 세포를 후보 화합물 및 아연 수송 단백질 리간드와 접촉시키고, 아연 수송 활성이 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 아연 수송 활성의 억제는 암 억제제에 대한 지표이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 대조군과 비교하여 아연 수송 단백질의 과다발현을 특징으로 하는 암의 억제제 확인 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 아연 수송 단백질을 발현하는 세포를 후보 화합물 및 아연 수송 단백질 리간드와 접촉시키고, 아연 수송 단백질의 하류 마커가 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 하류 마커의 억제는 암 억제제에 대한 지표이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 환자의 암 샘플에서 아연 수송 단백질의 차별적 발현의 증거를 검출하는 것을 포함하는, 아연 수송 단백질 조정인자에 대한 환자의 감수성 결정 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 아연 수송 단백질의 차별적 발 현의 증거는 아연 수송 단백질 조정인자에 대한 환자 감수성의 지표가다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 고체 지지체에 결합된 아연 수송 단백질 항체를 포함하는 친화도 매트릭스를 제공하는 단계; 하나 이상의 아연 수송 단백질을 포함하는 샘플을 친화도 매트릭스와 접촉시켜서 친화도 매트릭스-아연 수송 단백질 복합체를 형성하는 단계; 친화도 매트릭스-아연 수송 단백질 복합체를 샘플의 나머지로부터 분리하는 단계; 및 아연 수송 단백질을 친화도 매트릭스로부터 방출하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 아연 수송 단백질을 포함하는 샘플로부터의 아연 수송 단백질 정제 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 아연 수송 단백질 항체 또는 그의 단편에 접합된 세포독성제 또는 진단제를 제공하는 단계; 및 세포를 항체-작용제 또는 단편-작용제 접합체에 노출시키는 단계를 포함하는, 아연 수송 단백질을 발현하는 하나 이상의 세포로의 세포독성제 또는 진단제 전달 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 발명의 상세한 설명에서 밝혀질 것이다.
도 1은 여러 암 샘플에서 LIV-1 단백질의 발현을 나타낸다. 좌측의 패널은 ER-양성, ER-음성 및 전이성 유방암을 나타낸다. 원형질막 염색은 우측 패널의 암 조직에서 시각적으로 표시된다. 우측 패널 아래는 비투과화 세포 상의 동일초점의 오버레이를 나타낸다.
도 2는 LIV-1 특이적 siRNA에 의한 LIV-1 단백질의 넉다운(knockdown)을 나 타낸다.
도 3은 암 세포에서 LIV-1 특이적 siRNA에 의한 암 세포 성장, 증식 및 생존의 억제를 나타낸다.
도 4는 암 세포에서 LIV-1 특이적 siRNA에 의한 LIV-1 넉다운에 의해 유도된 카스파제 활성화를 나타낸다.
도 5는 정상적인 세포에서 증식, 카스파제 활성, 및 LIV-1 mRNA의 수준에 대한 LIV-1 특이적 siRNA의 효과를 나타낸다.
도 6은 암 세포에서 LIV-1 특이적 siRNA에 의한 암 세포 중 사이클린 D1 수준의 감소를 나타낸다.
도 7은 LIV-1 특이적 항체에 의한 세포질 아연 수준의 감소를 나타낸다.
도 8은 정상적인 세포 및 암 세포에서 LIV-1 발현을 나타낸다.
도 9는 세포 증식, 연질 한천 성장, 단백질 발현 및 생존에 대한 효과를 비롯한, MCF7 세포에서 LIV-1 넉다운의 효과를 나타낸다.
도 10은 LIV-1 특이적 siRNA에 의한 세포질 아연 수준의 감소를 나타낸다.
도 11은 LIV-1 특이적 항체에 의한 처리후 사이클린 D1 수준의 감소를 나타낸다.
도 12는 LIV-1을 사용하여 분석된 암성 조직 및 정상적인 조직의 마이크로어레이 분석 (affy U133 + 2 칩)의 도표를 나타낸다. 정상적인 조직 유형 및 암성 조직 유형은 가로 축을 따라 배치되어 있다. 암성 조직은 'c'로 표지되어 있으며, 예를 들어, "c_breast_duct"은 유방암 조직 샘플을 나타내고, 정상적인 조직은 유 사하게 'n'으로 표지되어 있다. 조직 유형은 공지된 경우에는 조직의 유형 및 하위유형과 관련하여 추가로 표지된다. 예를 들어 "c_breast_duct"은 유방 관에 위치된 유방암으로부터의 암성 조직이다. 하위유형이 수술적 제거 중에 명백하지 않거나 또는 비공지된 경우, 표지에는 '비-특정화된'에 대한 'ns'이라고 기재되어 있다. 세로 축 상의 각 점은 단일 환자로부터의 조직 샘플을 나타내며, 세로 축 상의 각 점의 높이 (log2 기준)는 프로브세트의 상대적인 발현 수준을 나타낸다. 흑색 원은 선형 검출 범위 내의 발현 수준을 갖는 샘플을 나타낸다. 백색 원은 유전자가 프로브세트의 검출 한계의 미만인 샘플에서 유전자 발현에 대한 상한을 나타낸다. 백색 사각형은 프로브세트가 포화된 샘플에서 유전자 발현에 대한 하한을 나타낸다. (요약해서, 분석의 수행전, 프로브세트 각각은 샘플의 큰 다양한 세트를 교차하여 그의 요소 프로브의 행동을 분석함으로써 교정된다. 이 교정은 프로브 각각의 상대적인 감수성, 및 프로브세트 반응이 프로브 간에 선형인 범위 내의 세기의 범위를 결정한다. 이 범위 미만의 세기는 "비검출된"이라고 지칭되며, 이 범위 초과의 세기는 "포화된"이라고 지칭된다. 샘플 사이의 혼성화 및 표지화 효율의 다양성때문에, 칩 각각은 교정의 적용후 표준화되었다. 이는 샘플로부터 샘플까지 소정의 다양성에 대해 유전자 발현의 측면에서 범위의 상한 및 하한을 유발한다.)
도 13은 SLC39A10을 사용하여 분석된 암성 조직 및 정상적인 조직의 마이크로어레이 분석 (affy U133 + 2 칩)의 도표를 나타낸다. 도면 범례 정보는 상기 도 12에서 제공된 바와 같다.
도 14는 SLC39A11을 사용하여 분석된 암성 조직 및 정상적인 조직의 마이크로어레이 분석 (affy U133 + 2 칩)의 도표를 나타낸다. 도면 범례 정보는 상기 도 12에서 제공된 바와 같다.
도 15는 SLC39A13을 사용하여 분석된 암성 조직 및 정상적인 조직의 마이크로어레이 분석 (affy U133 + 2 칩)의 도표를 나타낸다. 도면 범례 정보는 상기 도 12에서 제공된 바와 같다.
본 발명은 암의 치료, 진단 및 영상화, 특히 LIV-1-관련 암의 치료, 진단 및 영상화를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 출원의 발명자들은 특히 LIV-1이 유방암을 비롯한 여러 암에서 과다발현되고, 정상적인 조직에서 발현이 제한된다는 것을 발견하였다. LIV-1의 억제는 암 세포의 증식을 억제하나, LIV-1-양성 "정상적인" 세포의 증식은 억제하지 않는다. 추가로, LIV-1의 억제가 예를 들어, 사이클린 D1 및 MT1-MMP를 비롯한 하류 마커의 수준 뿐만 아니라 세포질 아연 수준을 조정한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 이들 및 다른 측면은 본원에서 제공된다.
정의
본원에 걸쳐 다양한 정의가 사용된다. 대부분의 단어는 당업자에 의해 해당 단어에 지정되는 의미를 갖는다. 본원에서 하기 또는 다른 부분에서 구체적으로 정의된 단어는 전적으로 및 전형적으로 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 본 발명의 문맥에서 제공되는 의미를 갖는다.
본 발명의 실시는 달리 지시가 없으면 해당 분야의 기술 내에서 화학, 생화학, 분자생물학, 면역학 및 약물학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명된다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)]; [Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)]; 및 [Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and CC. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 단수 형태 "a," "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 둘 이상의 항체들의 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 값의 +/- 20%, +/-10%, 또는 +/- 5%를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "아연 수송 단백질" 또는 "아연 수송체"는 아연 수송체의 구조적 특징을 나타내는 생물학적 분자를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 아연 수송 단백질로는 LIV-1, SLC39A13, SLC39A11 및 SLC39A10을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "LIV-1" (Zip6이라고도 공지됨)은 ZIP 아연 수송체의 아족 (LZT이라고 함)에 속하는 아연 수송체를 지칭한다. 유전자카드에서, LIV-1은 또한 SLC39A6 (용질 담체 족 39 (아연 수송체), 구성원 6)이라고 지칭된다. LIV-1의 뉴클레오티드 서열은 서열 1로서 기재되어 있으며, LIV-1의 아미노산 서열은 서열 2로서 기재되어 있다. 간결성을 위해, 본 발명은 LIV-1의 면에서 많이 예시되어 있으나, LIV-1에 대한 정의 및 실시양태는 또한 본원에 개시된 다른 아연 수송체를 위해 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "LIV-1-델타"는 LIV-1과 비교하여 아미노 말단의 적어도 부분이 결핍된 LIV-1의 변이체를 지칭한다. LIV-1-델타의 폴리펩티드 서열는 서열 365로서 기재되어 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭하며, 이는 코딩된 및 비-코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 주쇄를 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 용어는 N-말단 메티오닌 잔기를 함유하거나 또는 비함유한, 이종 및 동종 리더 서열과 융합된, 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 융합 단백질; 면역학적으로 태그된 단백질 등을 포함한다.
용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 상호교환가능하게 사용되며, 진단, 치료, 또는 치료요법이 바람직한 임의의 대상체, 특히 인간을 지칭한다. 다른 대상체로는 소, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말 등을 들 수 있다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 "암"은 원발성 암 또는 전이성 암을 지칭한다. 용어 "암 세포"는 형질전환된 세포를 지칭한다. 이들 세포는 암을 가진 환자로부터 단리되거나, 또는 시험관내에서 형질전환되어 암성이 된 세포일 수 있다. 암 세포는 임의의 조직 또는 세포주 배양을 비롯한 많은 유형의 샘플로부터 유래될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 암 세포는 과형성물, 종양 세포 또는 신생물이다. 몇몇 실시양태에서, 암 세포는 유방암, 피부암, 식도암, 간암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 난소암, 다발성 골수종 및 흑색종으로부터 단리된다. 몇몇 실시양태에서, 암 세포는 공개적으로 이용가능한 확립된 세포주로부터 취해진다. 몇몇 실시양태에서, 암 세포는 이미 존재하는 환자 샘플로부터 또는 암 세포를 포함하는 라이브러리로부터 단리된다. 몇몇 실시양태에서, 암 세포는 단리된 후, 상이한 숙주, 예를 들어, 이종이식편에서 이식된다. 몇몇 실시양태에서, 암 세포는 SCID 마우스 모델에서 이식되고 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 암은 유방암이다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환된"은 그의 자손에 의해 안정하게 유전된 세포의 특성의 임의의 변경을 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, "형질전환된"은 정상적인 세포의 암성 세포로의 변화, 예를 들어 종양을 유발할 수 있는 변화를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 형질전환된 세포는 불멸화된다. 형질전환은 수용체 인산화의 부재하에 수용체의 과다발현, 바이러스 감염, 종양 형성 유전자 및/또는 종양 억제 유전자의 돌연변이, 및/또는 세포의 성장 및/또는 불멸화 특성을 변화시키는 임의의 다른 기술을 비롯한 수많은 인자에 의해 유발될 수 있다.
"암성 표현형"은 일반적으로 암성 세포의 특징인 임의의 다양한 생물학적 현상을 지칭하며, 이러한 현상은 암의 유형에 따라 달라질 수 있다. 암성 표현형은 일반적으로 예를 들어, 세포 성장 또는 증식 (예를 들어, 비제어된 성장 또는 증식), 세포 주기의 조절, 세포 이동성, 세포-세포 상호작용, 또는 전이 등의 비정상성에 의해 확인된다.
본원에서 사용되는 용어 "전이"는 암의 기원으로부터, 예를 들어 원발성 종양으로부터 원거리의 부위로 확산하는 암을 지칭한다. 전이의 부위에는 골, 림프절, 폐, 간 및 뇌가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "혈관형성(angiogenesis)"은 환자의 혈관의 발생을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "임상적 종점"은 암의 측정가능한 사건 지표를 지칭한다. 임상적 종점에는 제1 전이에 대한 시간, 후속적 전이에 대한 시간, 전이의 크기 및/또는 개수, 종양의 크기 및/또는 개수, 종양의 위치, 종양의 공격성, 삶의 질, 통증 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 당업자에게 임상적 종점을 결정하고 측정하는 능력이 주어지며; 임상적 종점의 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 환자로부터의 생물학적 물질을 지칭한다. 본 발명에 의해 검정되는 샘플은 임의의 특정 유형으로 제한되지 않는다. 샘플로는 비제한적인 예로서 단일 세포, 다중 세포, 조직, 종양, 생체액, 생물학적 분자, 또는 임의의 상기 물질의 상등액 또는 추출물을 들 수 있다. 예로는 생검을 위해 제거된 조직, 절제 중에 제거된 조직, 혈액, 뇨, 림프 조직, 림프액, 뇌척수액, 점막 및 대변 샘플을 들 수 있다. 사용된 샘플은 검정 형식, 검출 방법, 및 검정되는 종양, 조직, 세포 또는 추출물의 성질을 기초로 다양할 것이다. 샘플의 제조 방법은 당분야에 익히 공지되어 있으며, 사용되는 방법과 상용성이 있는 샘플을 얻기 위해 용이하게 개조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생물학적 분자"에는 폴리펩티드, 핵산 및 사카라이드가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "조정"은 유전자, 단백질, 또는 세포의 내부, 외부 또는 표면 상의 임의의 분자의 질 또는 양의 변화를 지칭한다. 상기 변화는 분자의 발현 또는 수준의 증가 또는 감소일 수 있다. 용어 "조정하다"는 또한 세포 증식, 성장, 접착, 세포 생존, 세포자멸, 세포내 신호전달, 세포-대-세포 신호전달 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 생물학적 기능/활성의 질 또는 양의 변화를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "조정인자"는 암과 관련된 하나 이상의 생리적 또는 생화학적 사건을 조정하는 조성물을 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 조정인자는 암과 관련된 하나 이상의 생물학적 활성을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 조정인자는 소분자, 항체, 모방체, 유인물 또는 올리고뉴클레오티드이다. 몇몇 실시양태에서, 조정인자는 리간드 결합의 차단에 의해 또는 리간드-결합 부위에 대한 경쟁에 의해 작용한다. 몇몇 실시양태에서, 조정인자는 리간드 결합에 대해 독립적으로 작용한다. 몇몇 실시양태에서, 조정인자는 리간드 결합 부위에 대해 경쟁하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 조정인자는 암과 관련된 유전자 생성물이 발현을 차단한다. 몇몇 실시양태에서, 조정인자는 암과 관련된 둘 이상의 생체분자의 물리적 상호작용을 차단한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조정인자는 암 세포 성장, 종양 형성, 암 세포 증식, 암 세포 생존, 암 세포 전이, 세포 이동, 혈관형성, LIV-1 신호전달, LIV-1-매개 세포-세포 접착, 세포-세포 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포 막 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 상호작용, 인테그린-매개 활성, LIV-1 표면 발현, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 분해, EGFR 인산화, 및 SNAIL 핵 국소화로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 LIV-1 생물학적 활성을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 LIV-1 발현을 억제한다.
"유전자 생성물"은 유전자에 의해 발현되거나 또는 생성된 생체중합체 생성물이다. 유전자 생성물은 예를 들어, 비스플라이싱된 RNA, mRNA, 스플라이스 변이체 mRNA, 폴리펩티드, 번역후 변형된 폴리펩티드, 스플라이스 변이체 폴리펩티드 등일 수 있다. 또한, 주형 (즉, RNA의 cDNA)으로서 RNA 유전자 생성물을 사용하여 제조되는 생체중합체 생성물이 이 용어에 포함된다. 유전자 생성물은 효소적으로, 재조합으로, 화학적으로, 또는 유전자가 천연인 세포 내에서 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 유전자 생성물이 단백질성인 경우, 이는 생물학적 활성을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 유전자 생성물이 핵산인 경우, 이는 생물학적 활성을 나타내는 단백질성 유전자 생성물로 번역될 수 있다.
본원에서 사용되는 "LIV-1 활성의 조정"은 예를 들어, LIV-1 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 작용제의 상호작용, LIV-1 전사 및/또는 번역 (예를 들어, LIV-1 유전자 또는 LIV-1 전사체와의 안티센스 또는 siRNA 상호작용을 통해, LIV-1 발현을 촉진하는 전사 인자의 조정을 통해)의 억제 등의 결과일 수 있는 LIV-1 활성의 증가 또는 감소를 지칭한다. 예를 들어, 생물학적 활성의 조정은 생물학적 활성의 증가 또는 생물학적 활성의 감소를 지칭한다. LIV-1 활성의 감소를 야기하는 LIV-1 활성의 조정은 본 발명에서 특정 관심있는 조정이다. LIV-1 활성은 아연 수송 활성의 검정, LIV-1 폴리펩티드 수준의 평가, 또는 LIV-1 전사 수준의 평가를 포함하나 이에 제한되지 않는 수단에 의해 평가될 수 있다. LIV-1 활성의 비교는 또한 LIV-1 하류 마커의 수준의 측정, LIV-1 신호전달의 억제의 측정, LIV-1 매개된 세포 접착의 억제의 측정, LIV-1 매개된 암 세포 세포자멸의 활성화의 측정, 암 세포 성장의 억제의 측정, 종양 형성의 억제의 측정, 사이클린 생성의 억제의 측정, 피브로넥틴 생성의 억제의 측정, 및 아연 수송의 억제의 측정에 의해 성취될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "억제하다"는 활성 또는 양의 저하, 감소, 불활성화 또는 하향조절을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 문맥에서, LIV-1 조정인자는 암 세포 성장, 종양 형성, 암 세포 증식, 암 세포 생존, 암 세포 전이, 세포 이동, 혈관형성, LIV-1 신호전달, LIV-1-매개 세포-세포 접착, 세포-세포 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포 막 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 상호작용, 인테그린-매개 활성, LIV-1 표면 발현, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 분해, SNAIL 핵 국소화, 및 LIV-1 발현 중 하나 이상을 억제할 수 있다. LIV-1 조정인자는 또한 사이클린 D1, 피브로넥틴, RhoB, MT1-MMP, FGF, CDK4, VEGF, EGFR, EGFR 인산화, SNAIL 경로의 하나 이상의 유전자를 억제할 수 있다. LIV-1 조정인자는 또한 아연 수송을 억제할 수 있으며, 몇몇 실시양태에서, 세포질 아연 수준을 감소시킬 수 있다. 억제는 대조군과 비교하여 25% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "암 세포에서 차별적으로 발현된" 및 "암 세포에서 차별적으로 발현된 폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 암성이 아닌 동일한 세포 유형의 세포와 비교하여, 암성 세포에서 차별적으로 발현된 유전자를 나타내거나 또는 이에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 예를 들어, mRNA는 약 25% 이상, 약 50% 이상 내지 약 75%, 약 90% 이상, 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 또는 약 50배 이상의 수준으로 상이하게 (예를 들어, 더 높거나 또는 더 낮음) 발견된다. 비교는 예를 들어, 조직에서 세포 유형 중에서 소정의 정도로 식별하게 하는, 계내(in situ) 혼성화 또는 다른 검정 방법을 사용하는 경우에는 조직에서 수행될 수 있다. 비교는 또한 또는 대안으로 그의 조직 공급원으로부터 제거된 세포 간에, 또는 하나의 세포 계내 및 그의 조직 공급원으로부터 제거된 제2 세포 간에 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 유전자는 정상적인 세포와 비교하여 암 유전자에서 상향조절된다.
암의 하나 이상의 증상이 완화되거나, 종료되거나, 늦춰지거나, 또는 방지되는 경우에 LIV-1 관련-암은 "억제된다". 본원에서 사용되는 바와 같이, 암의 재발 또는 전이가 감소되거나, 늦춰지거나, 지연되거나 또는 방지된 경우에도 LIV-1 관련-암은 또한 "억제된다".
본원에서 사용되는 어구 "LIV-1 매개된 세포 접착의 억제"는 하나 이상의 세포가 LIV-1을 차별적으로 발현하는, LIV-1 억제제의 존재하에 세포-대-세포 접착의 억제 또는 폐지를 지칭한다. 이 문맥에서, LIV-1 매개된 세포 접착은 LIV-1 억제제의 부재하에 LIV-1 매개된 세포 접착에 대해 상대적으로, LIV-1 억제제에 의해 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100%까지 감소될 수 있다. LIV-1 매개된 세포 접착의 비교는 관심있는 세포의 측정, 예를 들어 표지에 의해, 기질에 접착하는 비표지된 세포의 집단으로 배양에 의해, 및 비접착성 집단으로부터 접착물을 분리하는 세척에 의해 성취될 수 있다. 이 방식으로, 세포 접착은 기질 상에 보유된 표지의 양의 측정에 의해 결정된다. 검정 시스템의 예로는 형광 프로브, 예컨대 칼세인 AM, CFMDA (5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트), 5(6)-CFDA-SE [5-(및-6)-카르복시플루오레세인 디아세테이트, 숙신이미딜 에스테르]에 의한 표지, 및 형광 플레이트 판독기에서 또는 유동 세포계측법을 통한 형광의 측정을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 어구 "암 세포 세포자멸의 증가"는 LIV-1 억제제의 존재하에 LIV-1을 차별적으로 발현하는 암 세포 세포자멸의 증가를 지칭한다. 이 문맥에서, 암 세포 세포자멸은 LIV-1 억제제의 부재하의 암 세포 세포자멸에 대해 상대적으로, LIV-1 억제제에 의해 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100%까지 증가될 수 있다. 암 세포 세포자멸의 비교는 예를 들어 DNA 단편화, 카스파제 활성, 미토콘드리아 막 전압의 손실, 반응성 산소 종 (ROS)의 증가된 생성, 세포내 산성화, 크로마틴 축합, 세포 표면에서의 포스파티딜 세린 (PS) 수준, 및 증가된 세포 막 투과성의 측정에 의해 성취될 수 있다.
DNA 단편화는 예를 들어 TUNEL 검정 (말단 데옥시뉴클레오티드 트랜스퍼라제 dUTP 닉 말단 표지화)에 의해 측정될 수 있다. 검정법의 상업적인 버전, 예를 들어, APO-BrdU™ TUNEL 검정 키트 (인비트로젠(Invitrogen)), APO-DIRECT™ 키트 (비디 바이오사이언시스 파민겐(BD Biosciences Pharmingen)) 및 ApoAlert™ DNA 단편화 검정 키트 (클론테크(Clontech), 타카라 바이오 캄파니(Takara Bio Company))가 광범위하게 이용가능하다.
카스파제 활성은 특정 카스파제에 특이적인 형광성, 발색성 및 발광성 기질을 통해 모니터링될 수 있다. 상업적인 검정 키트는 적어도 카스파제 1, 2, 3, 6, 7, 8 및 9에 대해 이용가능하다 (예를 들어, 인비트로젠, 케미콘(Chemicon), 칼바이오켐(CalBiochem), 바이오소스 인터내셔널(BioSource International), 바이오비젼(BioVision) 참조).
미토콘드리아 막 전압의 손실은 건강한 활성 미토콘드리아에서 차별적으로 축적되는 형광 염료로 측정될 수 있다. 한 비제한적인 예는 인비트로젠으로부터의 미토트랙커 레드 시스템(MitoTracker Red system)이다.
반응성 산소 종 (ROS)의 생성은 예를 들어 H2DCFDA (인비트로젠)를 비롯한 형광 염료에 의해 측정될 수 있다.
세포내 산성화는 형광 또는 발색성 염료에 의해 측정될 수 있다.
크로마틴 축합은 예를 들어 훽스트(Hoechst) 33342를 비롯한 형광 염료에 의해 측정될 수 있다.
포스파티딜 세린 (PS) 수준은 세포 표면에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 아넥신(Annexin) V는 PS에 대해 높은 친화도를 갖는다. 수많은 시판되는 검정법이 세포 표면으로의 표지된 아넥신 V의 결합의 모니터링에 적합하다.
세포 막 투과성은 괴사 세포가 아닌 세포자멸 세포에 들어갈 수 있는 형광 염료, YO-PRO-1 (인비트로젠)과 같은 염료를 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "암 세포 성장의 억제"는 세포가 LIV-1을 차별적으로 발현하는 LIV-1 억제제의 존재하에 암 세포 성장의 억제 또는 폐지를 지칭한다. 이 문맥에서, 암 세포 성장은 LIV-1 억제제의 부재하의 암 세포 성장에 대해 상대적으로, LIV-1 억제제에 의해 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100%까지 감소될 수 있다. 암 세포 성장의 비교는 예를 들어 MTT 검정법의 사용 (예를 들어, 비브란트(Vybrant)® MTT 세포 증식 검정 키트 (인비트로젠)); BrdU 인코포레이션(BrdU incorporation) (예를 들어, 앱솔루트-S SBIP 검정 (인비트로젠)); 세포내 ATP 수준의 측정 (예를 들어, ATPLite™-M, 1,000 검정 키트 (퍼킨엘머(PerkinElmer)) 또는 ATP 세포 생존성 검정 키트 (바이오비젼(BioVision))의 사용); DiOc 18 검정, 막 투과성 염료 (인비트로젠); 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 검정 (예를 들어, 비브란트(Vibrant) 세포독성 검정 (인비트로젠)); 또는 세포 LDH 활성의 측정에 의해 성취될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "종양 형성의 억제"는 종양이 LIV-1을 차별적으로 발현하는 세포를 포함하는, LIV-1 억제제의 존재하의 종양 형성의 억제 또는 폐지를 지칭한다. 이 문맥에서, 종양 형성은 LIV-1 억제제의 부재하의 종양 형성에 대해 상대적으로, LIV-1 억제제에 의해 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 및 100%까지 감소될 수 있다. 종양 형성의 비교는 예를 들어, 세포 기재 검정법의 사용 (예를 들어, 연질 한천 중 콜로니 형성); 관심있는 세포를 동물로 주사하는 것에 전형적으로 의존하는 종양 형성의 생체내 모델 (예를 들어, 무흉선 마우스 또는 래트, 방사선조사 마우스 또는 래트; 면역학적 특별격리 부위, 예컨대 뇌, 협낭 또는 눈으로의 접종; 동계 동물의 접종), 및 정의된 기간후 덩어리의 크기의 모니터링에 의해 성취될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "사이클린 D1의 억제"는 LIV-1 매개된 사이클린 생성의 억제 또는 폐지를 지칭한다. 이 문맥에서, LIV-1 매개된 사이클린 생성은 LIV-1 억제제의 부재하의 LIV-1 매개된 사이클린 생성에 대해 상대적으로, 억제제에 의해 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100%까지 감소될 수 있다. 사이클린 생성의 비교는 예를 들어 RT-PCR 또는 노던 블럿팅을 통한 사이클린 mRNA 수준의 측정에 의해; 면역블럿팅, 면역침강법 또는 ELISA를 통한 사이클린 폴리펩티드 수준의 측정에 의해; 또는 예를 들어 CDK, p21WAF1, p27 KIP-1을 표적화하는 항체를 사용하여, 사이클린 조절인자, 예컨대 사이클린-의존성 키나제 (CDK)와 복합체를 형성하는 사이클린의 수준을 측정하는 공동면역침강 검정법을 비롯한 기능적 검정법의 사용에 의해; 및 방사선표지화 및 면역침강 분석 또는 FRET-기재 방법, 예를 들어, CDK2/사이클린 A 검정 키트 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 통해 검정될 수 있는 CDK에 의한 사이클린의 인산화의 측정에 의해 성취될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "EGFR 인산화의 억제"는 LIV-1 매개된 EGFR 인산화의 억제 또는 폐지를 지칭한다. 이 문맥에서, LIV-1 매개된 EGFR 인산화는 LIV-1 억제제의 부재하의 LIV-1 매개된 EGFR 인산화에 대해 상대적으로, 억제제에 의해 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100%까지 감소될 수 있다. EGFR 인산화의 비교는 당업자에게 공지된 인산화 검정법을 사용하여 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "암 세포 생존의 억제"는 LIV-1을 발현하는 암 세포의 생존의 억제를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 용어는 LIV-1을 발현하는 암 세포 세포자멸의 수행을 지칭한다. 이 문맥에서, LIV-1 발현하는 암 세포 생존은 LIV-1 억제제의 부재하에 및/또는 정상적인 세포에서 암 세포 생존에 대해 상대적으로, 억제제에 의해 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100%까지 감소될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "인테그린-매개 활성의 억제"는 인테그린과 관련된 활성의 억제 또는 폐지를 지칭한다. 인테그린-매개 활성에는 세포 접착, 주화성, 증식, 생존, 및 튜불린 형성이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이 문맥에서, LIV-1 매개된 인테그린 활성은 LIV-1 억제제의 부재하의 LIV-1 매개된 인테그린 활성에 대해 상대적으로, 억제제에 의해 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100%까지 감소될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "피브로넥틴의 억제"는 LIV-1 매개된 피브로넥틴 생성의 억제 또는 폐지를 지칭한다. 이 문맥에서, LIV-1 매개된 피브로넥틴 생성은 LIV-1 억제제의 부재하의 LIV-1 매개된 피브로넥틴 생성에 대해 상대적으로, 억제제에 의해 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100%까지 감소될 수 있다. 피브로넥틴 생성의 비교는 예를 들어 RT-PCR 또는 노던 블럿팅을 통한 피브로넥틴 mRNA 수준; 면역블럿팅, 면역침강법 또는 ELISA (예를 들어, 피브로넥틴 ELISA 키트 (아메리칸 디아그노스티카(AMERICAN DIAGNOSTICA))를 통한 피브로넥틴 폴리펩티드 수준의 측정에 의해; 피브로넥틴 코팅된 기질로의 세포 접착을 측정하는 기능적 검정법의 사용에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 이노사이트(InnoCyte)™ ECM 세포 접착 검정법, 피브로넥틴 (칼바이오켐) 및 QCM™-FN [정량적 세포 이동 검정법 - 피브로넥틴 (케미콘)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 어구 "아연 수송의 억제"는 LIV-1 매개된 아연 수송의 억제 또는 폐지를 지칭한다. 이 문맥에서, LIV-1 매개된 아연 수송은 LIV-1 억제제의 부재하의 LIV-1 매개된 아연 수송에 대해 상대적으로, 억제제에 의해 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100%까지 감소될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 억제제는 세포질 아연 수준을 감소시킨다. 아연 수송의 비교 및 아연 수준의 결정은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 세포 또는 소포로의 65Zn의 흡수의 측정에 의해 (문헌 [Kambe et al., (2002) J. Biol. Chem., 277: 19049-19055] 참조); 또는 세포-투과성 형광 아연 인디케이터, 뉴포트 그린 디아세테이트(Newport Green Diacetate) (몰레큘라 프로브)의 흡수의 측정에 의해 성취될 수 있다. 체액 및 세포-조건화 배지 중 아연의 풀은 예를 들어 문헌 [Zalewski et al. (BioTechniques, 2006, Volume 40, Number 4: pp 509-520)]에 기재된 논의에 따라 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "LIV-1 신호전달의 억제"는 LIV-1을 포함하는 세포 신호전달 캐스케이드의 하류 구성원에 대한 LIV-1의 효과의 감소를 지칭한다. LIV-1을 포함하는 세포 신호전달 캐스케이드에는 다른 것 중에서 SNAIL 경로가 포함된다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 신호전달의 억제는 SNAIL 경로에서 하나 이상의 상피 마커를 상향조절한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 신호전달의 억제는 SNAIL 경로에서 하나 이상의 간엽 마커를 하향조절한다. 몇몇 실시양태에서, 상피 마커 및/또는 간엽 마커는 운동성 및 세포 생존에 관여된다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 신호전달의 조정은 Stat3-관련 신호전달 캐스케이드를 조정한다. 몇몇 실시양태에서, Stat3-관련 신호전달 캐스케이드의 요소는 SNAIL-관련 신호전달 캐스케이드의 다른 요소와 다르다. LIV-1 신호전달의 억제는 세포 신호전달 경로의 하류 구성원의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 수준의 측정에 의해 결정될 수 있다. 당업자에게 LIV-1 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 수준을 측정하는 능력이 주어진다. 당업자는 또한 LIV-1 하류 마커의 수준을 측정할 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "세포-세포 상호작용의 억제"는 LIV-1을 발현하는 둘 이상의 세포 사이의 상호작용의 감소 또는 제거를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 세포 사이의 상호작용은 세포 신호를 야기한다. 세포-세포 상호작용은 공동배양된, 예비표지된 세포, 예를 들어 PKH26 및 PKH67 (시그마(Sigma))을 비롯한 상이한 형광 막 염색에 의해 표지된 세포 사이의 막 교환의 관찰을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 수많은 방법을 통해 검출될 수 있다.
본원에서 사용되는 "LIV-1 하류 마커"는 정상적인 조직 또는 건강한 조직에서의 그의 발현 수준과 비교하여, 암 조직 또는 암 세포에서의 발현의 변경된 수준을 나타내는 유전자 또는 활성이거나, 또는 LIV-1 조정인자의 존재하에 변경된 특성 (예를 들어, 세포질 아연 수준)이다. 몇몇 실시양태에서, 하류 마커는 LIV-1이 본 발명의 LIV-1 조정인자에 의해 동요되는 경우에 변경된 발현 수준을 나타낸다. LIV-1 하류 마커에는 사이클린 D1, 피브로넥틴, RhoB, MT1-MMP, FGF, CDK4, VEGF, EGFR, SNAIL 경로의 하나 이상의 유전자, E-카드헤린, VE-카드헤린, Muc-1, 클라우딘, 오클루딘, 데스모플라킨, 카스파제, p21, p53, BID (bcl-상호작용 제거(death) 효능제(agonist)), DFF40 (DNA 단편화 인자) 및 사이토케라틴이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 상기 논의된 바와 같이, 몇몇 실시양태에서, LIV-1 하류 마커는 Stat3 경로의 유전자이다.
본원에서 사용되는 용어 "상향조절"은 활성 또는 양의 증가, 활성화 또는 자극을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 문맥에서, LIV-1 조정인자는 E-카드헤린, VE-카드헤린, Muc-1, 클라우딘, 오클루딘, 데스모플라킨, 카스파제, p21, p53, BID (bcl-상호작용 제거 효능제), DFF40 (DNA 단편화 인자) 및 사이토케라틴 중 하나 이상을 증가시킬 수 있다. 상향조절은 대조군과 비교하여 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "N-말단"은 단백질의 처음 10개의 아미노산을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "C-말단"은 단백질의 마지막 10개의 아미노산을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "도메인"은 생체분자의 공지된 기능 또는 추측되는 기능에 기여하는 생체분자의 구조적 부분을 지칭한다. 도메인은 그의 영역 또는 부분과 동일공간에 있을 수 있으며, 또한 상기 영역의 전체 또는 부분 이외에, 특정 영역과 상이한, 생체분자의 부분을 혼입할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "세포외 도메인"은 세포의 바깥 또는 외부에 있는 분자의 부분을 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, N-말단 세포외 도메인은 제1 막횡단 도메인 직전에 분자의 N-말단에 존재하는 세포외 도메인을 지칭한다. 2개의 막횡단 (TM) 도메인 사이의 세포외 도메인, 예를 들어 TM 2와 3 사이의 세포외 도메인의 문맥에서, 세포외 도메인은 LIV-1의 제2 및 제3 막횡단 도메인 사이의 세포 막의 외부의 LIV-1의 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "리간드 결합 도메인"은 LIV-1의 상응하는 천연 서열의 하나 이상의 정성적인 결합 활성을 보유하는 수용체의 임의의 부분 또는 영역을 지칭한다.
용어 "영역"은 생체분자의 1차 구조의 물리적 인접 부분을 지칭한다. 단백질의 경우에, 영역은 상기 단백질의 아미노산 서열의 인접 부분에 의해 정의된다. 몇몇 실시양태에서, "영역"은 생체분자의 기능과 관련되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단편"은 생체분자의 1차 구조의 물리적 인접 부분을 지칭한다. 단백질의 경우에, 부분은 상기 단백질의 아미노산 서열의 인접 부분에 의해 정의되며, 3 내지 5개 이상의 아미노산, 8 내지 10개 이상의 아미노산, 11 내지 15개 이상의 아미노산, 17 내지 24개 이상의 아미노산, 25 내지 30개 이상의 아미노산, 및 30 내지 45개 이상의 아미노산을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드의 경우에, 부분은 상기 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열의 인접 부분에 의해 정의되며, 9 내지 15개 이상의 뉴클레오티드, 18 내지 30개 이상의 뉴클레오티드, 33 내지 45개 이상의 뉴클레오티드, 48 내지 72개 이상의 뉴클레오티드, 75 내지 90개 이상의 뉴클레오티드, 및 90 내지 130개 이상의 뉴클레오티드를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 생체분자의 부분은 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 문맥에서, LIV-1 폴리펩티드 단편은 서열 2에 기재된 전체 LIV-1 폴리펩티드 서열을 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 어구 "LIV-1-관련 세포/종양/샘플" 등은 비암성 및/또는 비전이성 세포, 샘플, 종양 또는 다른 병리상태에 대해 상대적인 LIV-1의 차별적 발현을 특징으로 하는 세포, 샘플, 종양 또는 다른 병리상태를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1-관련 세포, 샘플, 종양 또는 다른 병리상태는 비전이성 세포, 샘플, 종양 또는 다른 병리상태에 대해 상대적인 LIV-1 발현의 증가된 증거를 특징으로 한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 표적 단백질 또는 그의 단편에 특이적인, 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 단일 쇄 항체, 키메라 항체, 이관능성/이중특이적 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 상보성 결정 영역 (CDR)-그라프팅된 항체를 지칭한다. 용어 "항체"는 생체내 치료 항체 유전자 전달을 추가로 포함한다. Fab, Fab', F(ab')2, scFv 및 Fv를 비롯한 항체 단편이 또한 본 발명에 의해 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 폴리펩티드의 항원성 결정부위를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 에피토프는 에피토프에 고유한 공간 형태의 3개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 에피토프는 선형 또는 형태 에피토프이다. 일반적으로, 에피토프는 4개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 10개 이상 및 12개 이상의 아미노산으로 구성되며, 보다 통상적으로 8개 내지 10개 이상의 아미노산으로 구성된다. 아미노산의 공간 형태의 결정 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, X선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일련의 연결된 뉴클레오티드 잔기를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드에는 안티센스 및 siRNA 올리고뉴클레오티드가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 서열의 부분을 포함하며, 약 10개 이상의 뉴클레오티드 및 약 500개만큼 많은 뉴클레오티드를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 및 약 20개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성될 수 있으며, 또한 프로브로서 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 몇몇 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥인 하나 이상의 부분을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)이다. 몇몇 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 RNAi 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA이다.
본원에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 LIV-1의 전사 또는 번역과 관련된 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, LIV-1 폴리뉴클레오티드의 프로모터)를 비롯한, LIV-1 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 뉴클레오티드 서열 상보성을 갖는 비변형된 또는 변형된 핵산을 지칭하며, 여기서 안티센스 폴리뉴클레오티드는 LIV-1 폴리뉴클레오티드 서열로 혼성화할 수 있다. LIV-1 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역을 시험관내에서 또는 생체내에서 억제할 수 있는 안티센스 폴리뉴클레오티드에 특히 관심있다.
본원에서 사용되는 용어 "siRNA 올리고뉴클레오티드", "RNAi 올리고뉴클레오티드", "짧은 방해 RNA", 또는 "siRNA"는 상호교환가능하게 사용되며, RNA 방해 (RNAi)라고도 공지된, 전사후 유전자 침묵을 통해 작동하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 용어는 RNA 방해 "RNAi"가 가능한 이중 가닥 핵산 분자를 지칭한다 (크로이처(Kreutzer) 등의 제WO 00/44895호; 제르니카-괴츠(Zernicka-Goetz) 등의 제WO 01/36646호; 파이어(Fire)의 제WO 99/32619호; 멜로(Mello) 및 파이어(Fire)의 제WO 01/29058호 참조). siRNA 분자는 일반적으로 RNA 분자이나, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드를 추가로 포함한다. siRNA 유전자-표적화 실험은 세포로의 일과성 siRNA 전이에 의해 수행되었다 (리포좀-매개 형질감염, 전기천공 또는 미세주사와 같은 전통적인 방법에 의해 성취됨). siRNA의 분자는 정상적으로 RNAi를 개시하는 긴 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 RNase III 프로세싱 생성물과 유사한, 특징적 2 내지 3개의 뉴클레오티드 3'-오버행 말단을 갖는 21 내지 23개의 뉴클레오티드 RNA이다.
유전자 침묵을 매개하는 siRNA 경로의 효과적인 활용은 siRNA의 세포내 전달의 효율적인 방법에 부분적으로 의존한다. siRNA 분자는 세포에서 단생하는 경향이 있으며, 형질감염시키기 곤란한 세포 유형으로 용이하게 전달가능하지 않으며, 화학적 합성을 통해 제조하기에 상대적으로 고가이다 (문헌 [Jacks et al., (2005) Biotechniques 39: 215-224]; [Bernards et al., (2006) Nature Methods 3: 701-706]).
siRNA의 효율적인 세포내 전달의 한 방법은 짧은 머리핀 RNA 또는 "shRNA"의 사용이다. shRNA는 비상보성 영역에 의해 연결된 2개의 상보성 서열을 포함하는 단일 가닥 RNA 분자이다. 생체내에서 상보성 서열은 어닐링하여 하나의 말단에서 홑 루프를 갖는 이중 가닥 나선을 만든다. 얻어진 롤리팝-형상 구조는 스템 루프라고 불리며, RNAi 기구에 의해 인식되고, siRNA-유사 특성을 갖는 짧은 이중나선 RNA로 세포내에서 프로세싱될 수 있다.
shRNA는 적절한 벡터로 삽입된 DNA 주형으로부터 전사에 의해 세포에서 합성될 수 있다. 유용한 shRNA는 전형적으로 5 내지 10개의 뉴클레오티드 루프에 의해 분리된 19 내지 29개의 뉴클레오티드의 2개의 상보성 서열을 갖는, 길이가 50 내지 70개의 뉴클레오티드이다. shRNA 구축은 일반적으로 세가지 방법 중 하나에 의해 수행된다: 상보성 올리고뉴클레오티드의 어닐링; 프로모터-기재 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR); 또는 프라이머 연장. 많은 벡터 시스템은 RNA Pol III 프로모터를 사용하며; Pol III-매개 전사가 이로운데, 이는 잘 정의된 개시 부위에서 개시하고, 비-폴리 (A) 함유 전사체를 생성하고, Pol III 프로모터가 모든 세포 유형에서 활성이기 때문이다 (문헌 [Brummelkamp et al., (2002) Science 296: 550-553]; [McIntyre, G. and Fanning, G. (2006) BMC Biotechnology 6: 1-8]).
shRNA-코딩 벡터 시스템은 숙주 게놈으로의 벡터의 안정한 통합후 지속적인 유전자 침묵을 매개할 수 있는 유전자-침묵 시약의 재생가능한 세포내 공급원을 제공한다. 또한, shRNA 카세트는 비분할 초대(primary) 배양물을 비롯한 광범위한 세포 유형으로 shRNA의 전달을 촉진하기 위해, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터로 용이하게 삽입될 수 있다. shRNA 벡터의 조절가능한 버젼은 유전자 스크린에 특히 유용하다.
본원에서 사용되는 용어 "유인물"은 아연 또는 아연 담체에 결합할 수 있는 LIV-1 폴리펩티드의 적어도 부분을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 유인물은 아연과 복합체를 형성한 아연 담체에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 유인물은 아연과 복합체를 형성하지 않은 아연 담체에 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 치료 유효량의 의약이 개체에게 투여되는 경우에 개체에서 하나 이상의 임상적 종점, 암 세포의 성장 및/또는 생존, 또는 암 세포의 전이의 감소 또는 반전으로서 관찰된 의약 효과를 생성하는 의약의 양을 지칭하는 것으로 의미된다. 치료 유효량은 전형적으로 활성 성분을 포함하지 않은 조성물이 유사한 상황의 개체에게 투여되는 경우에 관찰되는 효과와 비교된 효과에 의해 결정된다. 대상체에 대한 정확한 유효량은 대상체의 크기 및 건강, 상태의 성질 및 정도, 및 투여에 선택된 치료제 또는 치료제들의 조합에 따라 달라질 것이다. 그러나, 주어진 상황에 대한 유효량은 통상적인 실험에 의해 결정되며, 이는 의사의 판단 내에 있다.
본원에서 사용되는 용어 "와 조합하여" 또는 "와 함께"는 다른 치료 요법과 본 발명의 LIV-1 조정인자의 투여에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "감수성"은 LIV-1 치료요법이 허용되는 치료 방법인 환자, 즉 긍정적으로 반응하기 쉬운 환자를 지칭한다. LIV-1 치료요법에 감수성이 있는 암 환자는 LIV-1 치료요법에 감수성이 없는 환자에 대해 상대적으로 높은 수준의 LIV-1을 발현한다. LIV-1 치료요법에 대한 양호한 후보가 아닌 암 환자는 그의 암 세포 중에 또는 그 상에 낮은 수준의 LIV-1을 갖거나 또는 결핍된 종양 샘플을 갖는 암 환자를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "검출"은 활성 (예를 들어, 유전자 발현) 또는 생체분자 (예를 들어, 폴리펩티드)의 증거의 확립, 발견 또는 확인을 의미한다.
본원에서 사용되는 어구 "상동성 뉴클레오티드 서열," 또는 "상동성 아미노산 서열," 또는 그의 변형물은 특정 퍼센트 이상의 뉴클레오티드 수준 또는 아미노산 수준에서의 상동성을 특징으로 하는 서열을 지칭하며, "서열 동일성"과 상호교환가능하게 사용된다. 상동성 뉴클레오티드 서열에는 단백질의 이소형을 코딩하는 서열이 포함된다. 이러한 이소형은 예를 들어, RNA의 대안적인 스플라이싱의 결과로서 동일한 유기체의 상이한 조직에서 발현될 수 있다. 대안으로, 이소형은 상이한 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 상동성 뉴클레오티드 서열에는 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 인간 이외의 종의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함한다. 상동성 뉴클레오티드 서열은 또한 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열의 천연 대립유전자 변이체 및 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상동성 아미노산 서열에는 보존적 아미노산 치환을 함유하며, 폴리펩티드가 동일한 결합 및/또는 활성을 갖는 아미노산 서열이 포함된다.
퍼센트 상동성 또는 동일성은 예를 들어 스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman)의 알고리즘 (문헌 [Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489])을 사용하여, 디폴트 설정을 사용하는, 갭 프로그램 (위스콘신 서열 분석 패키지, UNIX용 버젼 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 유니버서티 리써치 파크(University Research Park), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 의해 결정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 프로브와 표적 사이의 상동성은 약 50% 내지 약 60%이다. 몇몇 실시양태에서, 핵산은 서열 1과의 상동성이 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 및 약 100%인 뉴클레오티드, 또는 그의 부분을 갖는다. 본 발명은 추가로 서열 1의 전체 보체의 부분 또는 그의 상동체를 제공한다.
상동성은 또한 폴리펩티드 수준에서 존재할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 2와의 상동성이 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 및 약 100%이거나 또는 그의 부분이다.
본원에서 사용되는 용어 "프로브"는 가변 길이의 핵산 서열을 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 프로브는 약 10개 이상 및 약 6,000개만큼 많은 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 프로브는 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상 또는 75개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브는 동일한, 유사한 또는 상보성 핵산 서열의 검출에 사용된다. 더 긴 길이의 프로브는 통상적으로 천연 또는 재조합 공급원으로부터 얻어지며, 표적 서열에 매우 특이적이고, 올리고머보다 표적으로의 혼성화에 많이 더 느리다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, PCR, 막-기재 혼성화, 계내 혼성화 (ISH), 형광 계내 혼성화 (FISH), 또는 ELISA-유사 기술에서 특이성을 갖도록 고안된다.
본원에서 사용되는 용어 "혼합"은 동일한 구역에서 하나 이상의 화합물, 세포, 분자 등을 함께 조합하는 공정을 지칭한다. 이는 예를 들어 하나 이상의 화합물, 세포 또는 분자가 혼합되는 시험 튜브, 페트리 접시, 또는 임의의 용기에서 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된"은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체가 천연으로 발생하는 환경과 상이한 환경에 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체 또는 숙주 세포를 지칭한다. 세포의 단리 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체는 일반적으로 실질적으로 정제된다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 정제된"은 그의 천연 환경으로부터 제거되고, 천연에서 회합되는 다른 성분이 60% 이상, 75% 이상 및 90% 이상 없는 화합물 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 항체)을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "결합"은 둘 이상의 생체분자 또는 화합물 사이의 물리적 또는 화학적 상호작용을 의미한다. 결합에는 이온 결합, 비이온 결합, 수소 결합, 반 데르 발스, 소수성 상호작용 등이 포함된다. 결합은 직접 결합, 또는 다른 생체분자 또는 화합물의 효과를 통한 또는 이로 인한 간접 결합일 수 있다. 직접 결합은 다른 분자 또는 화합물의 효과를 통해 또는 이로 인해 유발되지 않으나 대신에 다른 실질적인 화학적 중간체가 없는 상호작용을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "접촉"은 직접적으로 또는 간접적으로 한 분자를 제2 분자에 물리적으로 함께 인접하게 하는 것을 의미한다. 분자는 완충제, 염, 용액 등에 임의의 개수로 존재할 수 있다. "접촉"에는 예를 들어 핵산 분자를 함유하는, 비이커, 마이크로역가 플레이트, 세포 배양 플라스크 또는 마이크로어레이 등으로 폴리뉴클레오티드를 배치하는 것이 포함된다. 접촉에는 또한 예를 들어 폴리펩티드를 함유하는, 비이커, 마이크로역가 플레이트, 세포 배양 플라스크 또는 마이크로어레이 등으로 항체를 배치하는 것이 포함된다. 접촉은 생체내에서, 생체외에서 또는 시험관내에서 실시될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드가 그의 표적 서열로 혼성화되나 다른 서열의 최소 개수로 혼성화될 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 더 긴 서열은 더 높은 온도에서 그의 적합한 보체에 대한 특이성으로 혼성화할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 세기 및 pH에서 특정 서열에 대한 열융점 (Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. Tm은 표적 서열과의 상보성이 50%인 프로브가 평형에서 표적 서열로 혼성화하는 온도 (정의된 이온 세기, pH 및 핵산 농도하)이다. 표적 서열은 일반적으로 Tm에서 과량 존재하기 때문에, 프로브의 50%가 평형에서 그의 보체로 혼성화된다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 (또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해 약 30℃ 이상이고, 더 긴 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드에 대해 약 60℃ 이상인, 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가에 의해 성취될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "중간의 엄격한 조건"은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드가 그의 표적 서열로 혼성화하나 제한된 개수의 다른 서열로 혼성화하는 조건을 지칭한다. 중간의 조건은 서열-의존적이며, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 중간의 조건은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 특히 문헌 [Manitatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 2nd Edition (December 1989))]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 핵산 조성물은 예를 들어 생물학적 샘플 (예를 들어, 인간 세포의 추출물) 중 mRNA 또는 이러한 샘플로부터 생성된 cDNA의 검출을 위한 프로브로서 폴리펩티드의 생성에, 폴리뉴클레오티드의 추가 카피의 생성에, 단일 가닥 DNA 프로브로서 또는 삼중 가닥 형성 올리고뉴클레오티드로서 리보자임 또는 올리고뉴클레오티드 (단일 가닥 및 이중 가닥)의 생성에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 프로브는 예를 들어 샘플 중 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재의 결정에 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 암과 관련된 폴리펩티드에 특이적인 항체의 생성에 사용될 수 있으며, 상기 항체는 다시 본원에 보다 상세히 논의된 바와 같이 진단 방법, 예후 방법 등에서 유용하다. 폴리펩티드는 본원에 보다 상세히 논의된 바와 같이 치료적 개입을 위한 표적으로서 또한 유용하다. 본 발명의 항체는 또한 예를 들어 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 방법을 비롯한, 본 발명의 폴리펩티드의 정제, 검출 및 표적화에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 생물학적 샘플 중 본 발명의 폴리펩티드의 수준의 정성적 및 정량적 측정을 위한 면역검정법에 유용하다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]을 참조한다. 이들 및 다른 용도는 하기 보다 상세히 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "영상화제"는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 검출될 수 있는 본 발명의 항체, 소분자 또는 프로브에 연결된 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "유전자 발현의 증거"는 유전자가 발현된 것을 표시하는 임의의 측정가능한 표시를 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는 담체"는 치료제, 예컨대 항체 또는 폴리펩티드, 유전자, 및 다른 치료제의 투여를 위한 담체를 지칭한다. 상기 용어는 그 자체가 조성물을 투여받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유발하지 않고 과도한 독성없이 투여될 수 있는 임의의 제약 담체를 지칭한다. 적합한 담체는 크고 천천히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 집합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다. 이러한 담체는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 치료 조성물 중 제약상 허용되는 담체로는 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 들 수 있다. 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 또한 이러한 비히클 중에 존재할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암의 특정 예로는 LIV-1-관련 암을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 "LIV-1-관련 암"은 비암성 세포에 대해 상대적으로 LIV-1을 차별적으로 발현하는 세포를 특징으로 하는 암을 지칭한다. 본 발명은 또한 LIV-1이 암 세포 성장, 종양 형성, 암 세포 증식, 암 세포 전이, 세포 이동, 혈관형성, LIV-1 신호전달, LIV-1-매개 세포-세포 접착, 세포-세포 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포 막 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 상호작용, 인테그린-매개 활성, LIV-1 표면 발현, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 분해, SNAIL 핵 국소화, 및 LIV-1 발현에서 역할을 하는 임의의 종양 세포-유형에 적용가능하다. 몇몇 실시양태에서, 암은 유방암, 피부암, 식도암, 간암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 난소암, 다발성 골수종 및 흑색종이다. 몇몇 실시양태에서, 암은 ER-양성 유방암이다. 몇몇 실시양태에서, 암은 ER-음성 유방암이다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 암은 대조군과 비교하여 약 25% 이상, 약 50% 이상, 약 75% 이상, 약 100% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상, 또는 약 300% 이상 LIV-1의 차별적 발현을 나타낸다.
본 발명은 LIV-1 과다발현과 관련된 질환 및 장애의 치료, 억제 및 관리, 뿐만 아니라 상기 질환 및 장애의 증상의 치료, 억제 및 관리를 제공하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태는 암 전이, 암 세포 증식, 암 세포 성장 및 암 세포 침윤을 포함하나 이에 제한되지 않는, 암의 치료, 억제 또는 관리를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 LIV-1 조정인자와 조합하여 다른 활성 성분을 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 통상적인 암 치료제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 화학요법, 방사선 요법 또는 수술 중 하나 이상에 의해 환자를 치료하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 현재 또는 표준 암 치료, 예컨대 수술, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 치료요법 및 생물학적 치료요법에 부분적으로 또는 완전히 불응하게 되는, 암 또는 다른 과증식성 세포 장애 또는 질환의 치료, 억제 및 관리를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 암의 진단 및/또는 암 진행의 예측을 위한, 본 발명의 LIV-1 조정인자, 구체적으로 LIV-1 항체를 사용하는, 진단 및/또는 영상화 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 종양 및/또는 전이의 영상화 및 국소화 방법, 및 진단 및 예후의 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 LIV-1-관련 치료요법의 적절성을 평가하는 방법을 제공한다.
LIV -1 조정인자
본 발명은 LIV-1 조정인자, 특히 암의 치료, 진단, 검출 또는 영상화를 위한 LIV-1 조정인자를 제공한다. LIV-1 조정인자는 또한 암 치료용 의약의 제조에 유용하다.
몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 올리고뉴클레오티드, 소분자, 모방체, 유인물 또는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 대조군과 비교하여 LIV-1 생물학적 활성을 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 억제한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 대조군과 비교하여 LIV-1 발현을 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 억제한다.
항체
몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체 또는 Fab 단편이다. 항체는 예를 들어 효소, 방사선 동위원소 또는 형광단으로 표지될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 LIV-1 이외의 폴리펩티드에 대해 약 1×105 Ka 미만의 결합 친화도를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 1×108 Ka 이상의 친화도로 LIV-1에 결합하는 모노클로날 항체이다.
본 발명은 또한 예를 들어 면역검정법을 사용하여 경쟁적 결합을 결정하는, 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정되는 바와 같이, 본 발명의 에피토프로의 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 에피토프로의 결합을 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상 또는 50% 이상 경쟁적으로 억제한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 예를 들어 (1) 인간 프레임워크 및 불변 영역 상으로의 비인간 상보성 결정 영역 (CDR)의 그라프팅 (당분야에서 "인간화"라고 지칭되는 프로세스), 또는, 대안으로, (2) 전체 비인간 가변 도메인의 이식 (표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 표면으로 "은폐"하는 것은 아님) (당분야에서 "베니어링(veneering)"이라고 지칭되는 프로세스)을 비롯한 다양한 방법에 의해 성취될 수 있다. 본 발명에서, 인간화 항체는 "인간화" 및 "베니어링" 항체 둘 모두를 포함할 것이다. 유사하게, 인간 항체는 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스로 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 도입함으로써 제조될 수 있다. 항원투여시 인간 항체 생성이 관찰되며, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 면에서 인간에서 보여지는 바와 매우 유사하다. 이 접근법은 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 하기 과학 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)]; [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A., 81:6851-6855 (1984)]; [Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)]; [Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988)]; [Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991)]; [Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994)]; 및 [Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991)]에 기재되어 있다 (상기 문헌들은 각각 본원에 참고로 도입됨).
본 발명의 항체는 상이한 메카니즘을 통해 기능할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC), 항체-표적 세포에 대한 용균 공격을 촉발한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 예를 들어, 항원-결합, 세포자멸의 유도, 및 보체-의존성 세포 세포독성 (CDC)을 비롯한 여러가지 치료 기능을 갖는다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 수용체/리간드 상호작용을 본 발명의 폴리펩티드에 의해 부분적으로 또는 완전히 방해하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 개시된 에피토프 또는 그의 부분에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 항체의 부재하의 활성과 비교하여, 리간드 활성 또는 수용체 활성을 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상 또는 50% 이상 조정하도록 제공된다.
몇몇 실시양태에서, LIV-1 항체는 SNAIL 경로를 억제하고/거나 사이클린 D1, 피브로넥틴, RhoB, MT1-MMP, FGF, CDK4, VEGF, EGFR 및 EGFR 인산화 중 하나 이상을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 항체는 인테그린-매개 활성을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 항체는 SNAIL 핵 국소화를 억제한다.
몇몇 실시양태에서, LIV-1 항체는 E-카드헤린, VE-카드헤린, Muc-1, 클라우딘, 오클루딘, 데스모플라킨, 카스파제, p21, p53, BID (bcl-상호작용 제거 효능제), DFF40 (DNA 단편화 인자) 및 사이토케라틴 중 하나 이상을 상향조절한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 항체는 SNAIL 경로에서 하나 이상의 간엽 마커를 하향조절한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 중화 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 중화 항체는 수용체 길항제로서 작용한다, 즉 리간드-매개 수용체 활성화의 생물학적 활성의 전체 또는 서브세트를 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 본원에 개시된 본 발명의 펩티드의 특정 생물학적 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대한 효능제, 길항제 또는 역효능제로서 구체화될 수 있다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 항체는 추가로 N-말단 또는 C-말단에서 이종 폴리펩티드로 재조합으로 융합되거나, 또는 폴리펩티드 또는 다른 조성물로 화학적으로 접합될 수 있다 (공유결합 및 비공유결합 접합 포함). 예를 들어, 본 발명의 항체는 검출 검정법에서 표지로서 유용한 분자, 및 이펙터(effector) 분자, 예컨대 이종 폴리펩티드, 약물, 방사선핵종 또는 독소에 재조합으로 융합되거나 또는 접합될 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 제WO 92/08495호; 제WO 91/14438호; 제WO 89/12624호; 미국 특허 제5,314,995호; 및 제EP 396,387호를 참조한다.
키메라 및 인간화 항체 이외에, 완전한 인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스로부터 (예를 들어, 본원에 참고로 도입된, 미국 특허 제6,075,181호, 제6,091,001호 및 제6,114,598호 참조), 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 파지 디스플레이 라이브러리로부터 (예를 들어, 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)], [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)] 참조) 유래될 수 있다.
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256:495-496]의 방법 또는 그의 변형법을 사용하여 제조될 수 있다. 전형적으로, 마우스는 항원을 함유하는 용액으로 면역화된다. 면역화는 염수, 바람직하게는 아쥬반트 예컨대 프로인트(Freund)의 완전 아쥬반트에 항원-함유 용액을 혼합하거나 또는 유화하고, 혼합물 또는 에멀젼을 비경구로 주사함으로써 수행될 수 있다. 당분야에 공지된 임의의 면역화 방법은 본 발명의 모노클로날 항체의 수득에 사용될 수 있다. 동물의 면역화 후, 비장 (및 임의로, 여러 큰 림프절)이 제거되고, 단일 세포로 분리된다. 비장 세포는 세포 현탁액을 플레이트에 적용함으로써 스크리닝되거나, 또는 관심있는 항원으로 잘 코팅될 수 있다. 항원에 특이적인 막 결합 이뮤노글로불린을 발현하는 B 세포는 플레이트에 결합하며, 헹궈도 떨어지지 않는다. 그 후, 얻어진 B 세포, 또는 모든 분리된 비장 세포는 골수종 세포와 융합되도록 유도되어, 하이브리도마를 형성하고, 선택적인 배지에서 배양된다. 얻어진 세포는 일련의 또는 제한 희석에 의해 플레이팅되고, 관심있는 항원에 특이적으로 결합하는 (항원에 특이적으로 결합하고 비관련 항원에 결합하지 않는) 항체의 생성에 대해 검정된다. 그 후, 선택된 모노클로날 항체 (mAb)-분비 하이브리도마는 시험관내에서 (예를 들어, 조직 배양 병 또는 중공사 반응기에서) 또는 생체내에서 (마우스에서 복수로서) 배양된다.
발현을 위한 하이브리도마의 사용에 대한 대안으로서, 항체는 미국 특허 제5,545,403호; 제5,545,405호; 및 제5,998,144호에 개시된 바와 같이 CHO 또는 골수종 세포주와 같은 세포주에서 제조될 수 있다 (상기 문헌 각각은 본원에 참고로 도입됨). 요약해서, 세포주는 경쇄 및 중쇄를 각각 발현할 수 있는 벡터로 형질감염된다. 별개의 벡터 상의 2개의 단백질의 형질감염에 의해 키메라 항체가 제조될 수 있다 (문헌 [Immunol. 147:8; Banchereau et al. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3:8]; 및 [Banchereau et al. (1991) Science 251:70] (상기 문헌은 모두 본원에 참고로 도입됨)).
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리 (문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)])를 비롯한, 당분야에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조에 콜(Cole) 등 및 뵈르너(Boerner) 등의 기술이 또한 이용가능하다 (문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86 95 (1991)]). 인간화 항체는 예를 들어 (1) 인간 프레임워크 및 불변 영역 상으로의 비인간 상보성 결정 영역 (CDR)의 그라프팅 (당분야에서 "인간화"라고 지칭되는 프로세스), 또는, 대안으로, (2) 전체 비인간 가변 도메인의 이식 (표면 잔기의 대체 의해 인간-유사 표면으로 "은폐"하는 것은 아님) (당분야에서 "베니어링(veneering)"이라고 지칭되는 프로세스)을 비롯한 다양한 방법에 의해 성취될 수 있다. 본 발명에서, 인간화 항체는 "인간화" 및 "베니어링" 항체 둘 모두를 포함할 것이다. 유사하게, 인간 항체는 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스로 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 도입함으로써 제조될 수 있다. 항원투여시, 인간 항체 생성이 관찰되며, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 면에서 인간에서 보여지는 바와 매우 유사하다. 이 접근법은 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 하기 과학 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)]; [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A., 81:6851-6855 (1984)]; [Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)]; [Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988)]; [Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991)]; [Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994)]; 및 [Kettleborough, CA. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991)]에 기재되어 있다 (상기 문헌들은 각각 본원에 참고로 도입됨).
어구 "상보성 결정 영역"은 천연 이뮤노글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publication No. 91-3242 (1991)]을 참조한다. 어구 "불변 영역"은 이펙터 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 지칭한다. 본 발명에서, 마우스 불변 영역은 인간 불변 영역에 의해 치환된다. 대상체 인간화 항체의 불변 영역은 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된다. 중쇄 불변 영역은 임의의 5개의 이소타입, 알파, 델타, 엡실론, 감마 또는 뮤에서 선택될 수 있다. 항체의 인간화 방법 중 한 방법은 비인간 중쇄 및 경쇄 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 서열로 정렬하고, 상기 정렬을 기초로 하여 비인간 프레임워크를 인간 프레임워크로 선택하여 대체하고, 인간화 서열의 형태를 예측하는 분자 모델링하고, 모 항체의 형태를 비교하는 것을 포함한다. 이 방법에 이어서, 인간화 서열 모델의 예상되는 형태가 모 비인간 항체의 비인간 CDR의 형태에 매우 접근할 때까지 CDR의 구조를 방해하는 CDR 영역의 잔기의 역돌연변이가 반복된다. 이러한 인간화 항체는 예를 들어 애쉬웰(Ashwell) 수용체를 통해 흡수 및 청소를 촉진하도록 추가로 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 도입된, 미국 특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호를 참조한다.
인간화 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 함유하도록 조작된 트랜스제닉 동물을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 제WO 98/24893호에는 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 불활성화로 인해 기능적 내인성 이뮤노글로불린을 생성하지 못하는, 인간 Ig 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 동물이 개시되어 있다. 제WO 91/10741호에는 또한 항체가 영장류 불변 및/또는 가변 영역을 가지며, 내인성 이뮤노글로불린-코딩 유전자좌가 치환되거나 또는 불활성화된, 면역원에 대한 면역 반응을 탑재할 수 있는 트랜스제닉 비-영장류 포유동물 숙주가 개시되어 있다. 제WO 96/30498호에는 포유동물에서 이뮤노글로불린 유전자좌를 변형하는, 예컨대 변형된 항체 분자를 형성하는 불변 또는 가변 영역의 전체 또는 부분을 대체하는, Cre/Lox 시스템의 용도가 개시되어 있다. 제WO 94/02602호에는 불활성화된 내인성 Ig 유전자좌 및 기능적 인간 Ig 유전자좌를 갖는 비인간 포유동물 숙주가 개시되어 있다. 미국 특허 제5,939,598호에는 내인성 중쇄가 결핍되어 있고, 하나 이상의 이종 불변 영역을 포함하는 외인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 제조 방법이 개시되어 있다. 본 발명의 항체는 또한 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,766,886호에 논의된 바와 같은 인간 공학 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
상기 기재된 트랜스제닉 동물을 사용하여, 선택된 항원성 분자에 대한 면역 반응이 생성될 수 있으며, 항체-생성 세포가 동물로부터 제거되고, 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마의 제조에 사용될 수 있다. 면역화 프로토콜, 아쥬반트 등은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 제WO 96/33735호에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 마우스의 면역화에 사용된다. 모노클로날 항체는 상응하는 단백질의 생물학적 활성 또는 생리적 효과를 억제하거나 또는 중화하는 능력에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 항체는 문헌 [Fang et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23, 584-590]에서 논의된 바와 같이, 생체내 치료 항체 유전자 전달을 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터는 MAb 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 간에 위치된 폴리펩티드의 효소 독립적 동시번역 자가 절단을 매개하는 펩티드를 포함하는 다중시스트론 발현 카세트의 전달을 위해 제조될 수 있다. 발현은 MAb 쇄 둘 모두의 화학량론적 양을 야기한다. 효소 독립적 동시번역 자가 절단을 매개하는 펩티드의 바람직한 예는 구제역 유래된 2A 펩티드이다.
항체의 단편은 전장 항체의 원하는 친화도를 유지하는 한 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하다. 그러므로, 항-LIV-1 항체의 단편은 LIV-1에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 이러한 단편은 상응하는 전장 항-LIV-1 항체와 유사한 특성을 특징으로 한다, 즉 단편은 인간 세포의 표면 상에 발현된 인간 LIV-1 항원에 특이적으로 결합할 것이다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 LIV-1의 세포외 도메인의 하나 이상의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 LIV-1-관련 생물학적 활성을 조정한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 암 세포 성장, 종양 형성 및 암 세포 증식 중 하나 이상을 억제한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 LIV-1의 N-말단 세포외 도메인, 막횡단 도메인 (TM) 2와 3 사이의 LIV-1 세포외 도메인, TM 4와 5 사이의 LIV-1 세포외 도메인, TM 6과 7 사이의 LIV-1 세포외 도메인, 및 LIV-1의 C-말단 세포외 도메인으로 구성된 군에서 선택된 도메인의 하나 이상의 LIV-1 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체이다.
몇몇 실시양태에서, 모노클로날 항체는 TM 2와 3 사이의 LIV-1 세포외 도메인의 LIV-1 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 모노클로날 항체는 서열 388의 하나 이상의 에피토프에 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 모노클로날 항체는 LIV-1의 N-말단 세포외 도메인의 LIV-1 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 모노클로날 항체는 서열 387의 하나 이상의 에피토프에 결합한다.
본 발명에 따른 적합한 항체는 선형 또는 형태 에피토프, 또는 이들의 조합을 인식할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 3-6으로 구성된 군에서 선택된 LIV-1의 항원성 영역의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 3-360으로 구성된 군에서 선택된 서열을 갖는 에피토프에 특이적이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 361-364 또는 387-391로 구성된 군에서 선택된 서열을 갖는 에피토프에 특이적이다. 이들 펩티드가 하나의 에피토프를 필수적으로 정확히 맵핑할 수 없으나, 면역원성이 아닌 LIV-1 서열을 또한 함유할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 항체가 결합할 수 있는 다른 잠재적인 에피토프의 예측 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 카이트(Kyte)-둘리틀(Doolittle) 분석법 (문헌 [Kyte, J. and Doolittle, R.F., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132]), 호프(Hopp) 및 우즈(Woods) 분석법 (문헌 [Hopp, T.P. and Woods, K.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:3824-3828]; [Hopp, T.J. and Woods, K.R., Mol. Immunol. (1983) 20:483-489]; [Hopp, T.J., J. Immunol. Methods (1986) 88:1-18]), 제임슨(Jameson)-울프(Wolf) 분석법 (문헌 [Jameson, B.A. and Wolf, H., Comput. Appl. Biosci. (1988) 4:181-186]), 및 에미니(Emini) 분석법 (문헌 [Emini, E.A., Schlief, W.A., Colonno, R.J. and Wimmer, E., Virology (1985) 140:13-20])을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
항체는 1) 결합 활성의 역치 수준를 나타내는 경우, 및/또는 2) 공지된 관련 폴리펩티드 분자와 유의하게 교차-반응하지 않는 경우에 "특이적으로 결합한다"고 정의된다. 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스캐차드(Scatchard) 분석법 (문헌 [Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949])에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 표적 암-관련 폴리펩티드에 대해 ZIP (Zrt-유사 단백질, Irt-유사 단백질) 아연 수송체의 다른 공지된 구성원보다 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 106배 더 많이 그의 표적 에피토프 또는 모방체 유인물에 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 10-4 M 이하, 10-7 M 이하, 10-9 M 이하의 높은 친화도로, 또는 나노몰이하 친화도 (0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 nM 이하)로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1에 대한 항체의 결합 친화도는 1×106 Ka 이상이다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1에 대한 항체의 결합 친화도는 5×106 Ka 이상, 1×107 Ka 이상, 2×107 Ka 이상, 1×108 Ka 이상이다. 본 발명의 항체는 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 그의 결합 친화도의 면에서 기재되거나 또는 특정화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결합 친화도는 5×10-2 M 미만, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M 이하의 Kd를 갖는 결합 친화도를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 표준 웨스턴 블럿팅 분석 (Ausubel et al.)을 사용하여 LIV-1 폴리펩티드에 결합하나 공지된 관련 폴리펩티드에 결합하지 않는 경우, 공지된 관련 폴리펩티드 분자에 결합하지 않는다. 공지된 관련 폴리펩티드의 예로는 서열 365, 서열 366 및 서열 386을 포함하나 이에 제한되지 않는, ZIP (Zrt-유사 단백질, Irt-유사 단백질) 아연 수송체 단백질 족 등의 다른 구성원을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 LIV-1 또는 아연 수송 단백질 폴리펩티드의 오르토로그, 상동체, 파라로그 또는 변이체, 또는 이들의 조합 및 하위조합에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 LIV-1 또는 아연 수송 단백질 폴리펩티드의 오르토로그에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 LIV-1 또는 아연 수송 단백질 폴리펩티드의 상동체에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 LIV-1 또는 아연 수송 단백질 폴리펩티드의 파라로그에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 LIV-1 또는 아연 수송 단백질 폴리펩티드의 변이체에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 LIV-1 또는 아연 수송 단백질 폴리펩티드의 오르토로그, 상동체, 파라로그 또는 변이체, 또는 이들의 조합 및 하위조합에 결합하지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 LIV-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 집단의 단리를 위해 공지된 관련 폴리펩티드에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 인간 LIV-1 폴리펩티드에 특이적인 항체는 적절한 완충제 조건하에 불용성 매트릭스에 접착된 ZIP (Zrt-유사 단백질, Irt-유사 단백질) 아연 수송체 단백질 (LIV-1은 제외)을 포함하는 컬럼을 통해 유동할 것이다. 이러한 스크리닝은 밀접하게 관련된 폴리펩티드에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체 비-교차반응성의 단리를 허용한다 (문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]; [Current Protocols in Immunology, Cooligan et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995]). 특이적 항체의 스크리닝 및 단리는 당분야에 익히 공지되어 있다 (문헌 [Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993]; [Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988]; [Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J. W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996]; [Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984] 참조). 이러한 검정법의 대표적인 예로는 동시 면역전기영동법, 방사선면역검정법 (RIA), 방사선면역침강법, 효소결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 도트 블럿팅 또는 웨스턴 블럿팅 검정법, 억제 또는 경쟁 검정법, 및 샌드위치 검정법을 들 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 365, 서열 366 또는 서열 386에 특이적으로 결합하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 386의 잔기 125-138, 서열 386의 잔기 252-265, 또는 서열 386의 잔기 418-431로 구성된 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 ZnT1 또는 Zip1과 교차반응하지 않는다.
본 발명은 또한 표적 단백질에 대해 특이적인 SMIP 또는 결합 도메인 이뮤노글로불린 융합 단백질인 항체를 제공한다. 이들 구축물은 항체 이펙터 기능의 수행에 필수적인 이뮤노글로불린 도메인에 융합된 항원 결합 도메인을 포함하는 단일쇄 폴리펩티드이다. 예를 들어, 제WO 03/041600호, 미국 특허 공개 제20030133939호 및 미국 특허 공개 제20030118592호를 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중화 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 표적화 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 표적에 결합시 내부화된다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 표적에 결합시 내부화되지 않고 대신에 표면 상에 남아있는다.
본 발명의 항체는 해당 종양-세포 항원에 결합시 급속히 내부화되는 능력, 또는 결합후 세포 표면 상에 남아있는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 예를 들어 몇몇 유형의 면역접합체의 구축에서, 내부화가 독소 잔기의 방출에 필요한 경우, 내부화되는 항체의 능력이 바람직할 수 있다. 대안으로, 항체가 ADCC 또는 CDC의 촉진에 사용되는 경우, 항체가 세포 표면 상에 남아있는 것이 보다 바람직할 수 있다. 스크리닝 방법이 이들 유형 행동의 식별에 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포 항원 보유 세포는 얼음 상에서 (내부화의 차단을 위해 0.1% 아지드화나트륨 함유) 또는 37℃ (아지드화나트륨 비함유)에서 3시간 동안 대략 1 ㎍/mL의 농도에서 인간 IgG1 (대조군 항체) 또는 본 발명의 항체 중 하나로 인큐베이션되는 경우에 사용할 수 있다. 그 후, 세포를 냉 염색 완충제 (PBS + 1% BSA + 0.1% 아지드화나트륨)로 세척하고, 염소 항-인간 IgG-FITC로 30분 동안 얼음 상에서 염색한다. 기하 평균 형광 강도 (MFI)를 FACS 캘리버(Calibur)에 의해 기록한다. 아지드화나트륨의 존재하에 얼음 상에서 본 발명의 항체로 인큐베이션된 세포와, 아지드화나트륨의 부재하에 37℃에서 관찰된 세포 간에 MFI의 차이가 관찰되지 않는다면, 항체는 내부화된 것이 아니라 세포 표면에 결합된 상태로 남아있다고 추측될 것이다. 그러나, 세포를 아지드화나트륨의 부재하에 37℃에서 인큐베이션하는 경우에 표면 염색가능한 항체의 감소가 발견된다면, 항체는 내부화할 수 있다고 추측될 것이다.
항체 접합체
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 접합된다. 몇몇 실시양태에서, 접합된 항체는 암 치료제, 암 진단, 또는 암성 세포의 영상화에 유용하다.
진단 적용을 위해, 항체는 전형적으로 검출가능한 잔기로 표지될 것이다. 일반적으로 하기 카테고리로 그룹화될 수 있는 수많은 표지가 이용가능하다:
(a) 하기 논의되는 바와 같은 방사선핵종. 항체는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 방사선 동위원소로 표지될 수 있으며, 예를 들어 방사성은 섬광 계수기를 사용하여 측정될 수 있다.
(b) 형광 표지, 예컨대 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드가 이용가능하다. 형광 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 참조]에 개시된 기술을 사용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광측정기를 사용하여 정량될 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 미국 특허 제4,275,149호는 이들 중 몇몇의 검토를 제공한다. 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 분광광도적으로 측정될 수 있는 기질의 색 변화를 촉매할 수 있다. 대안으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기 기재되어 있다. 화학발광성 기질은 화학적 반응에 의해 전기적으로 여기된 후, (예를 들어, 화학발광계를 사용하여) 측정될 수 있는 빛을 방출할 수 있거나, 또는 형광 수령체로 에너지를 공여한다. 효소 표지의 예로는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼록시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼록시다제 (HRPO), 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼록시다제, 마이크로퍼록시다제 등을 들 수 있다. 효소를 항체에 접합하는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
항체는 또한 생체내 진단 검정법에 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 면역섬광조영술을 사용하여 종양을 국소화할 수 있도록 항체를 방사선핵종으로 표지한다. 편리성을 위해, 본 발명의 항체는 키트, 즉 진단 검정법의 수행에 대한 지시사항을 포함하는, 예정된 양의 시약의 패키지 조합물로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 의해 필요로 되는 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 수 있다. 또한, 다른 첨가제, 예컨대 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충제 또는 용균 완충제) 등이 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 검정법의 감수성을 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중 농도를 제공하도록 광범위하게 다양할 수 있다. 구체적으로, 시약은 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 부형제를 비롯한, 건조 분말, 통상적으로 동결건조 분말로서 제공될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 마이탄신 분자에 접합된다 (예를 들어, 항체 분자 당 약 1 내지 약 10개의 마이탄신 분자). 마이탄신은 예를 들어 May-SH3으로 환원되고 변형된 항체와 반응할 수 있는 May-SS-Me으로 전환되어 (문헌 [Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)]), 마이탄시노이드-항체 면역접합체를 생성할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 접합체는 대략 10 내지 11 M의 IC50을 갖는 매우 효력있는 마이탄신 유도체 DM1 (N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신) (예를 들어, 2002년 12월 12일에 공개된 제WO 02/098883호) (문헌 [Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212] 참조) 또는 DM4 (N2'-데아세틸-N2'(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신) (예를 들어, 2004년 12월 2일에 공개된 제WO 2004/103272호 참조)일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항체 접합체는 하나 이상의 칼리케아마이신 분자에 접합된 항-종양 세포 항원 항체를 포함한다. 칼리케아마이신 족의 항생제는 피코몰이하 농도에서 이중 가닥 DNA 파괴를 생성할 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아마이신의 구조 유사체에는 감마1I, 알파2I, 알파3I, N-아세틸-감마1I, PSAG 및 세타I1 (문헌 [Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)] 및 [Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)])가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 또한, 미국 특허 제5,714,586호; 제5,712,374호; 제5,264,586호; 및 제5,773,001호를 참조한다 (상기 특허는 각각 본원에 참고로 도입됨).
몇몇 실시양태에서, 항체는 많은 암에서 과다생성된 효소에 의해 그의 활성 형태로 방출될 수 있는 전구약물에 접합된다. 예를 들어, 항체 접합체는 활성 성분이 플라스민에 의해 접합체로부터 방출되는, 독소루비신의 전구약물 형태로 제조될 수 있다. 플라스민은 많은 암성 조직에서 과다생성된다고 공지되어 있다 (문헌 [Decy et al., (2004) FASEB Journal 18(3): 565-567] 참조).
몇몇 실시양태에서, 항체는 효소적 활성 독소 및 그의 단편에 접합된다. 몇몇 실시양태에서, 독소에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 슈도모나스 내독소, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 리보뉴클레아제 (Rnase), 데옥시리보뉴클레아제 (Dnase), 억세풀 항바이러스 단백질, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 티모겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 네오마이신 및 트리코테센이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 1993년 10월 28일에 공개된 제WO 93/21232호를 참조한다. 몇몇 실시양태에서, 독소는 낮은 내인성 면역원성, 및 암성 세포가 독소에 대해 내성이 되는 기회를 감소시키는 작용 메카니즘 (예를 들어, 세포독성 메카니즘 vs. 세포증식억제성 메카니즘)을 갖는다.
몇몇 실시양태에서, 접합체는 본 발명의 항체 및 면역조정인자 간에 생성된다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 이들 분자는 항원-특이적 항체 반응을 야기할 수 있는 강력한 면역원이다 (문헌 [Datta et al., (2003) Ann N.Y. Acad. Sci 1002: 105-111] 참조). 추가 면역조정인자 화합물로는 줄기 세포 성장 인자, 예컨대 "S1 인자", 림프독소, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF), 조혈 인자, 예컨대 인터류킨, 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 또는 과립구 대식세포-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론 (IFN), 예컨대 인터페론 알파, 베타 또는 감마, 에리트로포이에틴, 및 트롬보포이에틴을 들 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 방사선접합된 항체가 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 항체는 32P, 33P, 47Sc, 59Fe, 64Cu, 67Cu, 75Se, 77As, 89Sr, 90Y, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 125I, 131I, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 161Th, 166Ho, 169Er, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211Pb, 212Pb, 213Bi, 58Co, 67Ga, 80 mBr, 99 mTc, 103 mRh, 109Pt, 161Ho, 189 mOs, 192Ir, 152Dy, 211At, 212Bi, 223Ra, 219Rn, 215Po, 211Bi, 225Ac, 221Fr, 217At, 213Bi, 255Fm 및 이들의 조합 및 하위조합을 사용하여 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 붕소, 가돌리늄 또는 우라늄 원자가 항체에 접합된다. 몇몇 실시양태에서, 붕소 원자는 10B이고, 가돌리늄 원자는 157Gd이고, 우라늄 원자는 235U이다.
몇몇 실시양태에서, 방사선핵종 접합체는 20 내지 10,000 keV의 에너지를 갖는 방사선핵종을 갖는다. 방사선핵종은 1000 keV 미만의 에너지를 갖는 오거(Auger) 방출체, 20 내지 5000 keV의 에너지를 갖는 P 방출체, 또는 2000 내지 10,000 keV의 에너지를 갖는 알파 또는 'a' 방출체일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 방사선핵종, 즉 감마-, 베타-, 또는 양전자-방출 동위원소를 포함하는 진단 방사선접합체가 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 방사선핵종은 20 내지 10,000 keV의 에너지를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 방사선핵종은 18F, 51Mn, 52 mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 76Br, 82 mRb, 83Sr, 89Zr, 94 mTc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Ga, 75Se, 97Ru, 99 mTc, 114 mIn, 123I, 125I, 13Li 및 197Hg의 군에서 선택된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 광활성제 또는 조영제인 진단제로 접합된다. 광활성 화합물은 크로마겐 또는 염료와 같은 화합물을 포함할 수 있다. 조영제는 예를 들어 상자성 이온일 수 있으며, 여기서 상기 이온은 크롬 (III), 망간 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (II), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄 (III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III) 및 에르븀 (III)의 군에서 선택 금속을 포함한다. 조영제는 또한 X선 기술 또는 전산화 단층촬영술에서 사용되는 방사성-불투과성 화합물, 예컨대 요오드, 이리듐, 바륨, 갈륨 및 탈륨 화합물일 수 있다. 방사성-불투과성 화합물은 바륨, 디아트리조에이트, 에티오드화 오일, 시트르산갈륨, 이오캄산, 이오세탐산, 요오드아미드, 요오디파미드, 요오독삼산, 이오굴아미드, 이오헥솔, 이오파미돌, 이오판산, 이오프로셈산, 이오세팜산, 이오세르산, 이오술아미드, 메글루민, 이오세메트산, 이오타술, 이오테트르산, 이오탈람산, 이오트록산, 이옥사글산, 이옥소트리조산, 이포데이트, 메글루민, 메트리즈아미드, 메트리조에이트, 프로필요오돈 및 염화탈륨의 군에서 선택될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 진단 면역접합체는 본 발명의 항체에 접합된 기체 충전된 리포좀과 같은 초음파-증강제를 함유할 수 있다. 진단 면역접합체는 종양 또는 암 진단 및 검출의 수술내, 내시경 또는 혈관내 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 시술에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항체 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체로의 방사선뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이팅제이다. 제WO 94/11026호를 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)])가 사용될 수 있다. 작용제가 탄수화물 잔기를 통해 본 발명의 항체에 추가로 연결될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포독성제와 접합된 항-종양 항원 항체를 포함하는 이러한 면역접합체가 환자에게 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 결합되는 면역접합체 및/또는 종양 세포 항원 단백질은 세포에 의해 내부화되며, 이는 면역접합체가 결합하는 암 세포의 사멸에서 면역접합체의 증가된 치료 효능을 야기한다. 몇몇 실시양태에서, 세포독성제는 암 세포에서 핵산을 표적화하거나 또는 핵산을 방해한다. 이러한 세포독성제의 예로는 마이탄시노이드, 칼리케아마이신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제를 들 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 종양 예비표적화에서 사용하기 위한 "수용체" (예컨대, 스트렙타비딘)에 접합되고, 여기서 항체-수용체 접합체는 환자에게 투여된 후, 비결합된 접합체는 세정제를 사용하여 순환으로부터 제거되고, 그 후 세포독성제 (예를 들어, 방사선뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)가 투여된다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 표적 세포 리소좀의 내부로 방출된 세포독성 분자에 접합된다. 예를 들어, 약물 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)는 항체 접합체의 내부화후 단백질분해성 리소좀 효소 카테프신 B에 의해 절단되는 발린-시트룰린 연결을 통해 접합될 수 있다 (예를 들어, 2003년 4월 3일에 공개된 제WO 03/026577호 참조). 몇몇 실시양태에서, MMAE는 절단가능한 잔기로서 히드라존 관능성을 함유하는 산-불안정성 링커를 사용하여 항체에 부착될 수 있다 (예를 들어, 2002년 11월 11일에 공개된 제WO 02/088172호 참조).
항체 의존성 효소 매개된 전구약물 치료요법 ( ADEPT )
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제, 제WO 81/01145호 참조)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 항체를 접합시킴으로써 ADEPT에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제WO 88/07378호 및 미국 특허 제4,975,278호를 참조한다.
몇몇 실시양태에서, ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분에는 더 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방법으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소가 포함된다.
ADEPT에 유용한 효소에는 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 테르몰리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카테프신 (예컨대, 카테프신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; 베타-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 베타-락타마제; 및 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 각각 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 당분야에 "촉매성 항체(abzyme)"라고도 공지된, 효소 활성이 있는 항체가 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Massey, Nature 328: 457-458 (1987)] 참조). 항체-촉매성 항체 접합체는 종양 세포 집단으로 촉매성 항체를 전달하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, ADEPT 효소는 상기 논의된 헤테로이관능성 가교 시약의 사용과 같은 당분야에 익히 공지된 기술에 의해 항체에 공유결합으로 결합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당분야에 익히 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 구축될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)] 참조).
몇몇 실시양태에서, 세포독성 방식보다는 세포증식억제성 방식으로 작용하는 항체의 확인은 비처리된 대조군 배양물과 비교하여 처리된 표적 세포 배양물의 생존성을 측정함으로써 성취될 수 있다. 생존성은 당분야에 공지된 방법, 예컨대 셀타이터-블루(CellTiter-Blue)® 세포 생존성 검정법 또는 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광성 세포 생존성 검정법 (프로메가(Promega), 각각 카탈로그 번호 G808O 및 G5750)을 사용하여 검출될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 기재된 수단에 의해 측정된 바와 같이 세포 사멸의 임의의 증거없이 대조군 배양물과 비교하여 처리가 세포수의 감소를 유발하는 경우, 항체는 잠재적으로 세포증식억제성으로 고려된다.
몇몇 실시양태에서, 시험관내 스크리닝 검정법은 당분야에 공지된 검정법을 사용하여 ADCC를 촉진하는 항체를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 한 예시적인 검정법은 시험관내 ADCC 검정법이다. 크롬 51-표지된 표적 세포의 제조를 위해, 종양 세포주를 조직 배양 플레이트에서 성장시키고, PBS 중 멸균 10 mM EDTA를 사용하여 수확한다. 박리된 세포를 세포 배양 배지로 2회 세척한다. 세포 (5×106)를 1시간 동안 종종 혼합하면서 37℃에서 크롬 51 (뉴 잉글랜드 뉴클레어(New England Nuclear)/듀퐁(DuPont)) 200 μCi으로 표지한다. 표지된 세포를 세포 배양 배지로 3회 세척한 후, 1×105개 세포/mL의 농도로 재현탁한다. 세포를 옵소닌화없이 사용하거나, 또는 PBMC 검정법에서 100 ng/mL 및 1.25 ng/mL, 또는 NK 검정법에서 20 ng/mL 및 1 ng/mL으로 시험 항체와의 인큐베이션에 의해 검정 전에 옵소닌화한다. 정상적인 건강한 공여자로부터 헤파린 상 혈액을 수집함으로써 말초 혈액 단핵구를 제조하고, 동일 부피의 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 희석한다. 그 후, 림프구 분리 배지® (LSM: 오르가논 테크니카(Organon Teknika)) 상에서 혈액을 층형성하고, 제조자의 지시사항에 따라 원심분리한다. LSM-혈장 계면으로부터 단핵구를 수집하고, PBS로 3회 세척한다. 이펙터 세포를 세포 배양 배지에서 1×107개 세포/mL의 최종 농도로 현탁한다. LSM을 통한 정제후, 제조자의 지시사항에 따라 NK 세포 단리 키트 및 자성 컬럼 (밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotech))을 사용하여 음성 선택에 의해 PBMC로부터 천연 킬러 (NK) 세포를 단리한다. 단리된 NK 세포를 수집하고, 세척하고, 세포 배양 배지에 2×106개 세포/mL의 농도로 재현탁한다. NK 세포의 동일성을 유동 세포계측 분석법에 의해 확인한다. 세포 배양 배지에서 마이크로역가 플레이트 (최종 부피 100 ㎕)의 줄을 따라 이펙터 (PBMC 또는 NK) 세포를 일련으로 2배 희석함으로써 다양한 이펙터:표적 비율을 제조한다. 이펙터 세포의 농도는 PBMC에 대해 1.0×107/mL 내지 2.O×104/mL, 및 NK에 대해 2.0×106/mL 내지 3.9×103/mL의 범위이다. 이펙터 세포의 역가측정후, 1×105개 세포/mL의 크롬 51-표지된 표적 세포 (옵소닌화된 또는 비옵소닌화된) 100 ㎕를 플레이트의 웰 각각에 첨가한다. 이는 PBMC에 대해 100:1 및 NK 세포에 대해 20:1의 초기 이펙터:표적의 비율을 야기한다. 모든 검정법은 이중으로 실시하고, 플레이트 각각은 자발적 용균 (이펙터 세포 없음) 및 총 용균 (표적 세포 + 100 ㎕ 1% 나트륨 도데실 술페이트, 1 N 수산화나트륨) 둘 모두에 대한 대조군을 함유한다. 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션한 후, 상등액 수집 시스템 (스카트론 인스트루먼트, 인크.(Skatron Instrument, Inc.))을 사용하여 세포 배양 상등액을 수확하고, 1분 동안 미낙시 오토-감마 (Minaxi auto-gamma) 5000 시리즈 감마 계수기 (패커드(Packard))에서 계수한다. 그 후, 결과는 식: 세포독성 % = (샘플 cpm-자발적 용균)/(총 용균-자발적 용균)×100을 사용하여 세포독성 퍼센트로서 나타낸다.
CDC를 촉진하는 항체를 확인하기 위해, 당업자는 당분야에 공지된 검정법을 수행할 수 있다. 한 예시적인 검정법은 시험관내 CDC 검정법이다. 상이한 농도의 시험 항체의 부재 또는 존재하에 인간 (또는 대안적인 공급원) 보체-함유 혈청으로 종양 세포 항원을 발현하는 세포를 인큐베이션함으로써 시험관내에서 CDC 활성을 측정할 수 있다. 그 후, 알라마르 블루® (문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202 163-171 (1997)])을 사용하여 살아있는 세포를 정량함으로써 세포독성을 측정한다. 열 불활성화된 혈청을 사용하고/거나 해당 종양 세포 항원을 발현하지 않는 세포를 사용하여 항체에 의하지 않은 대조군 검정법 및 항체에 의한 대조군 검정법을 수행한다. 대안으로, 종양 항원 또는 종양 항원으로부터 유래된 펩티드로 적혈구를 코팅할 수 있으며, 그 후 적혈구 용균을 관찰함으로써 CDC를 검정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Karjalainen and Mantyjarvi, Acta Pathol Microbiol Scand [C]. 1981 Oct; 89(5):315-9]).
세포 사멸을 유도하는 항체의 선택을 위해, 예를 들어 PI, 트립판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 표시되는 막 통합성의 손실을 대조군에 상대적으로 평가할 수 있다. 한 예시적인 검정법은 종양 항원을 발현하는 세포를 사용하는 PI 흡수 검정법이다. 이 검정법에 따라, 10% 열-불활성화된 FBS (하이클론(Hyclone)) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지 (D-MEM):Ham의 F-12 (50;50)에서 종양 세포 항원을 발현하는 세포를 배양한다 (그러므로, 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재하에 검정법을 수행함). 100 x 20 mm 접시에 접시 당 3×106개의 밀도로 종양 세포를 접종하고, 밤새 부착하게 한다. 그 후, 배지를 제거하고, 신선한 배지 단독으로, 또는 적절한 모노클로날 항체 10 ㎍/mL를 함유하는 배지로 대체한다. 세포를 3일의 기간 동안 인큐베이션한다. 각 처리 후, 단일층을 PBS로 세척하고, 트립신화에 의해 박리한다. 그 후, 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하고, 펠렛을 빙냉 Ca2 + 결합 완충제 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) 3 mL에 재현탁하고, 세포 응집의 제거를 위해 35 mm 스트레이너-캡핑된 12 x 75 튜브 (튜브 당 1 mL, 처리군 당 3개 튜브)로 분취한다. 그 후, 튜브를 PI (10 ㎍/mL)를 채운다. 팍스캔(FACSCAN)™ 유동 세포계측법 및 팍스컨버트(FACSCONVERT)™ 셀케스트(CellQuest) 소프트웨어 (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson))를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 결정되는 세포 사멸의 통계적으로 유의한 수준을 유도하는 상기 항체를 세포 사멸-유도 항체로서 선택할 수 있다.
항체는 또한 PET 영상화제로서 18F-아넥신을 사용하여 세포자멸 활성에 대해 생체내에서 스크리닝될 수 있다. 이 절차에서, 아넥신 V를 18F로 방사성표지하고, 연구하에 항체를 하기 투여량으로 시험 동물에게 제공한다. 가장 초기 사건 중 하나는 세포 막의 내부측으로부터 외부 세포 표면 (아넥신에 접근가능함)으로 포스파티딜세린의 외번에서 세포자멸 프로세스의 유발이다. 그 후, 동물을 PET 영상화 (문헌 [Yagle et al., J Nucl Med. 2005 Apr;46(4):658-66] 참조)로 처리한다. 또한, 동물을 희생시키고, 개별 기관 또는 종양을 제거하고, 표준 프로토콜에 따라 세포자멸 마커에 대해 분석한다.
몇몇 실시양태에서, 암은 유전자 발현 생성물의 과다발현을 특징으로 할 수 있지만, 본 출원은 종양 항원-과다발현 암으로 고려되지 않는 암의 치료 방법을 추가로 제공한다. 암에서 종양 항원 발현을 결정하기 위해 다양한 진단/예후 검정법이 이용가능하다. 몇몇 실시양태에서, 유전자 발현 생성물 과다발현을 IHC에 의해 분석할 수 있다. 종양 생검으로부터의 파라핀에 묻힌 조직 절편을 IHC 검정법으로 처리하고, 다음과 같이 종양 항원 단백질 염색 강도 기준에 일치시킬 수 있다:
스코어 0: 염색이 관찰되지 않거나, 또는 막 염색이 종양 세포의 10% 미만에서 관찰된다.
스코어 1+: 엷은/거의 지각가능하지 않은 막 염색이 종양 세포의 10% 초과에서 검출된다. 세포는 그의 막의 부분에만 염색된다.
스코어 2+: 약한 내지 중간의 완전한 막 염색이 종양 세포의 10% 초과에서 관찰된다.
스코어 3+: 중간 내지 강한 완전한 막 염색이 종양 세포의 10% 초과에서 관찰된다.
종양 항원 과다발현 평가에 대해 0 또는 1+ 스코어를 갖는 종양은 종양 항원을 과다발현하지 않는 것을 특징으로 할 수 있으나, 2+ 또는 3+ 스코어를 갖는 종양은 종양 항원을 과다발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.
대안으로 또는 또한, FISH 검정법, 예컨대 인폼(INFORM)™ (벤타나, 미국 애리조나주 소재에 의해 시판됨) 또는 패스비젼(PATHVISION)™ (비시스(Vysis), I11.)을 포르말린에 고정되고 파라핀에 묻힌 종양 조직 상에서 수행하여, 종양에서 종양 항원 과다발현 (있는 경우)의 정도를 결정할 수 있다.
또한, 항체는 중합체로의 공유결합 접합에 의해 화학적으로 변형되어, 예를 들어 그의 순환 반감기를 증가시킬 수 있다. 항체 분자는 각각 하나 이상의 (즉 1, 2, 3, 4, 5개 이상) 중합체 분자에 부착될 수 있다. 중합체 분자는 바람직하게는 링커 분자에 의해 항체로 부착된다. 중합체는 일반적으로 합성 또는 천연 중합체, 예를 들어 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알켄, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지된 또는 비분지된 폴리사카라이드, 예를 들어 호모- 또는 헤테로-폴리사카라이드일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 중합체는 폴리옥시에틸렌 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. PEG는 실온에서 수용성이며, 일반식: R(O--CH2--CH2)n O--R (식 중, R은 수소, 또는 보호기, 예컨대 알킬 또는 알칸올 기일 수 있음)을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 보호기는 1 내지 8개의 탄소를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 보호기는 메틸이다. 심볼 n은 양의 정수, 1 내지 1,000, 또는 2 내지 500이다. 몇몇 실시양태에서, PEG는 1000 내지 40,000, 2000 내지 20,000, 또는 3,000 내지 12,000의 평균 분자량을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, PEG는 하나 이상의 히드록시기를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 히드록시는 말단 히드록시기이다. 몇몇 실시양태에서, 이는 억제제 상의 유리 아미노기와 반응하기 위해 활성화된 히드록시기이다. 그러나, 반응기의 유형 및 양이 공유결합으로 접합된 PEG/본 발명의 항체를 성취하기 위해 다양할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 중합체, 및 이를 펩티드에 부착시키는 방법은 미국 특허 제4,766,106호; 제4,179,337호; 제4,495,285호 및 제4,609,546호에 기재되어 있다 (상기 특허는 각각 그 전문이 본원에 참고로 도입됨).
올리고뉴클레오티드
몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 올리고뉴클레오티드이다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 서열 367-382로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
몇몇 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스, 또는 siRNA 및 shRNA를 비롯한 RNAi 올리고뉴클레오티드이다. 몇몇 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 LIV-1 유전자 또는 유전자 생성물의 영역, 도메인, 부분 또는 세그먼트에 대해 상보성이 있다. 몇몇 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 12 내지 약 35개의 뉴클레오티드, 및 약 18 내지 약 25개의 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 LIV-1 유전자 또는 유전자 생성물의 영역, 부분, 도메인 또는 세그먼트에 대해 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 상동성이 있다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 유전자 또는 유전자 생성물의 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 또는 100개의 연속적인 뉴클레오티드에 대해 실질적인 서열 상동성이 있다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 유전자 또는 유전자 생성물의 전장에 대해 실질적인 서열 상동성이 있다. 몇몇 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 중간의 또는 엄격한 혼성화 조건하에 결합한다.
몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자이며, RNAi (RNA 방해)를 통해 작용한다. 몇몇 실시양태에서, dsRNA의 한 가닥은 LIV-1 유전자의 영역, 부분, 도메인 또는 세그먼트에 대해 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 상동성이 있다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 유전자의 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 또는 1000개의 연속적인 뉴클레오티드에 대해 실질적인 서열 상동성이 있다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 유전자의 전장에 대해 실질적인 서열 상동성이 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에서 사용된다. 이 서열은 게놈 서열 또는 cDNA 서열을 기초로 할 수 있고 (또는 이로부터 고안될 수 있음), 특정 세포 또는 조직에서 동일한, 유사한 또는 상보성 DNA 또는 RNA의 존재의 증폭, 확인 또는 검출에 사용된다.
소분자
몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 소분자이다. 본원에서 사용되는 용어 "소분자"는 약 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 비-중합체 화합물을 지칭한다. 소분자의 예로는 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 유기 화합물, 무기 화합물 등을 들 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 소분자는 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2 또는 약 1 kDa 미만의 분자량을 갖는다.
모방체
몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 모방체이다. 본원에서 사용되는 용어 "모방체"는 펩티드의 활성을 모방하는 화합물을 지칭하는데 사용된다. 모방체는 비-펩티드이나, 비-펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산을 포함할 수 있다. 1997년 6월 10일에 허여된 미국 특허 제5,637,677호, 및 그의 모 출원 (이들 모두는 본원에 참고로 도입됨)은 모방체의 제조에 대한 상세한 지침을 포함한다. 요약해서, LIV-1의 3차원 구조와 특이적으로 상호작용하는 펩티드의 3차원 구조는 펩티드가 아닌 분자에 의해 2배로 된다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 모방체는 LIV-1의 모방체, 또는 LIV-1의 리간드의 모방체이다.
유인물
몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 LIV-1 폴리펩티드의 적어도 부분을 포함하는 유인물이다. 몇몇 실시양태에서, 유인물은 아연 또는 아연 담체-아연 복합체에 대해 천연 LIV-1 폴리펩티드와 경쟁한다. 몇몇 실시양태에서, 유인물은 정량, 정성 및/또는 시각화를 촉진하기 위해 표지된다. 다른 실시양태에서, 유인물은 유인물 또는 유인물-아연 또는 유인물-아연 담체 복합체의 단리 및/또는 분리를 촉진하기 위해 잔기를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 유인물은 아연 및/또는 아연 담체 (아연과 복합된 또는 비복합된)를 포획하고, 이를 신호전달 LIV-1 폴리펩티드와 상호작용하지 못하게 함으로써 기능한다. 몇몇 실시양태에서, 유인물은 항체 또는 항체 단편에 융합된 LIV-1 폴리펩티드의 적어도 부분을 포함한다.
암의 치료/예방 방법
본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 하나 이상의 LIV-1 조정인자를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 또는 암 증상의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 암은 LIV-1의 과다발현과 관련된 암이다. 몇몇 실시양태에서, 암은 유방암, 피부암, 식도암, 간암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 난소암, 다발성 골수종 또는 흑색종이다. 몇몇 실시양태에서, 암은 비-호르몬 조절 조직에 있다. 몇몇 실시양태에서, 유방암은 ER-양성 유방암, ER-음성 유방암, 또는 전이성 유방암이다. 몇몇 실시양태에서, 유방암은 도관 선암종, 소엽 선암종 또는 전이성 선암종이다. 몇몇 실시양태에서, 대상체는 암을 갖고 있거나, 또는 암에 소지가 있는 것으로 진단된다.
암의 증상은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 유방 종괴, 유두 변화, 유방 낭, 유방 통증, 사망, 체중 손실, 약화, 과도한 피로, 식사 곤란, 식욕 손실, 만성 기침, 호흡곤란의 악화, 객혈, 혈뇨, 혈변, 오심, 구토, 간 전이, 폐 전이, 골 전이, 복부 충만, 고창증(bloating), 복강액, 질 출혈, 변비, 복부 팽창, 결장 천공, 급성 복막염 (감염, 열, 통증), 통증, 토혈, 다한, 열, 고혈압, 빈혈, 설사, 황달, 현기증, 오한, 근경련, 결장 전이, 폐 전이, 방광 전이, 간 전이, 골 전이, 신장 전이, 및 췌장 전이, 연하(swallowing) 곤란 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
조정 화합물의 치료 유효량은 의약 화학자에게 익히 공지된 방법에 따라 경험적으로 결정될 수 있으며, 특히 환자의 연령, 상태의 중증도, 및 원하는 궁극적인 제약 제형에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 조정인자의 투여는 예를 들어 흡입 또는 좌제에 의해, 또는 점막 조직으로, 예컨대 질, 직장, 요도, 협측 및 설하 조직으로의 세척에 의해, 경구로, 국소로, 비강내로, 복강내로, 비경구로, 정맥내로, 림프내로, 종양내로, 근내로, 간질내로, 동맥내로, 피하로, 안구내로, 활액낭내로, 경상피로 및 경피로 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 억제제는 세척에 의해, 경구로 또는 동맥내로 투여된다. 다른 적합한 도입 방법에는 또한 재충전가능한 또는 생분해성 디바이스 및 완속형 또는 서방형 중합체 디바이스가 포함될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 치료 조성물은 또한 다른 공지된 항암제 또는 다른 공지된 항-골 질환 치료 요법과의 조합 치료요법의 일부로서 투여될 수 있다.
본 발명은 환자에서 LIV-1-관련 생물학적 활성의 조정 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 LIV-1 생물학적 활성의 조정 유효량의 LIV-1 조정인자를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. LIV-1 생물학적 활성의 측정을 위한 적합한 검정법은 상기 및 하기 기재되어 있다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 하나 이상의 LIV-1 조정인자를 암 세포 성장의 억제가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암 세포 성장의 억제 방법을 제공한다. LIV-1-관련 세포 성장의 측정을 위한 적합한 검정법은 당업자에게 공지되어 있으며, 상기 및 하기 기재되어 있다.
본 발명은 암의 억제가 필요한 환자에서 암의 억제 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같이 환자가 LIV-1 치료요법에 대한 후보인가를 결정하고, 환자가 LIV-1 치료요법에 대한 후보인 경우에는 치료 유효량의 하나 이상의 LIV-1 조정인자를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 환자가 LIV-1 치료요법에 대한 후보가 아닌 경우, 환자는 통상적인 암 치료에 의해 치료된다.
본 발명은 암으로 진단되거나 또는 암을 갖는 것으로 추측되는 환자에서 암의 억제 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 치료 유효량의 하나 이상의 LIV-1 조정인자를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 LIV-1 조정인자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 둘 이상의 세포의 상호작용 억제 방법을 제공한다. LIV-1-관련 세포 상호작용의 측정을 위한 적합한 검정법은 당업자에게 공지되어 있으며, 상기 및 하기 기재되어 있다.
본 발명은 또한 환자에게 치료 유효량의 본원에 기재된 LIV-1 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암의 하나 이상의 증상의 조정 방법을 제공한다.
본 발명은 치료 유효량의 LIV-1 조정인자를 세포 성장의 억제가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 세포 성장의 억제 방법을 추가로 제공한다. LIV-1-관련 고정-독립성 세포 성장의 측정을 위한 적합한 검정법은 상기 및 하기 기재되어 있다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 LIV-1 조정인자를 암 세포 이동의 억제가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암 세포 이동의 억제 방법을 제공한다. LIV-1-관련 세포 이동의 측정을 위한 적합한 검정법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명은 치료 유효량의 LIV-1 조정인자를 암 세포 접착의 억제가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암 세포 접착의 억제 방법을 추가로 제공한다. LIV-1-관련 세포 접착의 측정을 위한 적합한 검정법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명은 또한 암의 발병, 암 전이에 소지가 있거나, 또는 전이를 갖고 있으므로 도짐 또는 재발에 걸리기 쉬운 환자의 예방적 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 고위험 개체, 예를 들어 암 또는 종양 전이의 가족력을 갖거나, 암 전이에 대한 유전적 소지를 나타내는 개체에게 특히 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 종양은 LIV-1-관련 종양이다. 또한, 상기 방법은 수술적 절제에 의해 제거된 LIV-1-관련 종양을 갖거나, 또는 통상적인 암 치료에 의해 치료된, 환자를 LIV-1-관련 종양의 재발로부터 예방시키는데 유용하다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 LIV-1 조정인자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 진행의 억제 및/또는 암 퇴행의 유발 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 항암 치료를 필요로 하는 환자는 화학요법 및/또는 방사선 요법과 함께 본 발명의 LIV-1 조정인자로 치료된다. 예를 들어, LIV-1 조정인자의 투여후, 환자는 또한 치료 유효량의 항암 방사선조사로 치료될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 화학요법 치료는 LIV-1 조정인자와 조합하여 제공된다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 화학요법 및 방사선 요법과 조합하여 투여된다.
상기 치료 방법은 단일 또는 다중 용량의 하나 이상의 LIV-1 조정인자를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 멸균, 발열원 비함유 주사가능한 제약 조성물로서 투여되며, 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 LIV-1 조정인자를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 치료 요법은 수술, 방사선 요법, 호르몬 제거 및/또는 화학요법을 포함하나 이에 제한되지 않는, 암을 위한 통상적인 치료 요법과 함께 사용된다. 본 발명의 LIV-1 조정인자의 투여는 통상적인 암 치료의 전에, 동시에, 또는 후에 실시될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 둘 이상의 상이한 LIV-1 조정인자가 환자에게 투여된다.
몇몇 실시양태에서, 환자에게 투여되는 LIV-1 조정인자의 양은 암 세포 성장, 종양 형성, 암 세포 증식, 암 세포 전이, 세포 이동, 혈관형성, LIV-1 신호전달, LIV-1-매개 세포-세포 접착, LIV-1-매개 세포-세포 막 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 상호작용, 인테그린-매개 활성, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 분해, 및 LIV-1 발현 중 하나 이상의 억제에 유효하다. 몇몇 실시양태에서, 환자에게 투여되는 LIV-1 조정인자의 양은 세포자멸을 통한 암 세포 사멸의 증가에 유효하다.
조합 치료요법
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 암에 대한 더 증가된 효능을 제공하기 위해 둘 이상의 LIV-1 조정인자를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 모노클로날 항체이다. 둘 이상의 LIV-1 항체를 포함하는 조성물은 암에 걸리거나, 또는 암에 걸릴 소지가 있는 인간 또는 포유동물에게 투여될 수 있다. 하나 이상의 항체는 또한 다른 치료제, 예컨대 세포독성제, 또는 암 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 둘 이상의 치료제의 동시 투여는 작용제가 그의 치료 효과를 발현하는 동안의 기간에 중첩되는 한, 동일한 시간에 또는 동일한 경로에 의해 투여되는 것을 필요로 하지 않는다. 동시 또는 순차적 투여는 상이한 날에 또는 상이한 주에 투여되는 것으로 고려된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 상이한 항체의 조합 또는 "칵테일"의 투여를 포함한다. 이러한 항체 칵테일은 상이한 이펙터 메카니즘을 활용하는 항체를 함유하거나, 면역 이펙터 관능성에 의존적인 항체와 세포독성 항체를 직접적으로 조합하기 때문에 특정 장점을 가질 수 있다. 조합 중 이러한 항체는 상승적인 치료 효과를 나타낼 수 있다.
세포독성제는 세포의 기능을 억제하거나 또는 방지하는 물질, 및/또는 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, 131I, 125I, 90Y 및 186Re), 화학요법제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 합성 독소, 또는 그의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 비-세포독성제는 세포의 기능을 억제하지 않거나 또는 방지하지 않는 물질, 및/또는 세포의 파괴를 유발하지 않는 물질을 지칭한다. 비-세포독성제는 세포독성으로 활성화될 수 있는 작용제를 포함할 수 있다. 비-세포독성제는 비드, 리포좀, 매트릭스 또는 입자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2003/0028071호 및 제2003/0032995호 (상기 문헌들은 본원에 참고로 도입됨). 이러한 작용제는 본 발명에 따른 항체에 접합, 커플링, 연결 또는 회합될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 통상적인 암 의약이 본 발명의 조성물과 함께 투여된다. 통상적인 암 의약에는
a) 암 화학요법제;
b) 추가 작용제;
c) 전구약물
이 포함된다.
암 화학요법에는 알킬화제, 예컨대 카르보플라틴 및 시스플라틴; 질소 머스타드 알킬화제; 니트로소우레아 알킬화제, 예컨대 카르무스틴 (BCNU); 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트; 엽산; 퓨린 유사체 항대사물질, 머캅토퓨린; 피리미딘 유사체 항대사물질, 예컨대 플루오로우라실 (5-FU) 및 겜시타빈 (젬자(Gemzar)®); 호르몬 항신생물제, 예컨대 고세렐린, 류프롤라이드 및 타목시펜; 천연 항신생물제, 예컨대 알데스류킨, 인터류킨-2, 도세탁셀, 에토포시드 (VP-16), 인터페론 알파, 파클리탁셀 (탁솔®), 및 트레티노인 (ATRA); 항생제 천연 항신생물제, 예컨대 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 다우노마이신 및 마이토마이신, 예를 들어 마이토마이신 C; 및 빈카 알칼로이드 천연 항신생물제, 예컨대 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신; 히드록시우레아; 아세글락톤, 아드리아마이신, 이포스파마이드, 에노시타빈, 에피티오스탄올, 아클라루비신, 안시타빈, 니무스틴, 프로카르바진 히드로클로라이드, 카르보콘, 카르보플라틴, 카르모푸르, 크로모마이신 A3, 항종양 폴리사카라이드, 항종양 혈소판 인자, 시클로포스파마이드 (사이톡신®), 스키조필란, 시타라빈 (시토신 아라비노사이드), 다카르바진, 티오이노신, 티오테파, 테가푸르, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체, 예컨대 아우리스타틴, CPT-11 (이리노테칸), 마이토잔트론, 비노렐빈, 테니포시드, 아미노프테린, 카르미노마이신, 에스페라마이신 (예를 들어, 미국 특허 제4,675,187호 참조), 네오카르지노스타틴, OK-432, 블레오마이신, 푸르툴론, 브록스우리딘, 부술판, 혼반, 페플로마이신, 베스타틴 (우베니멕스(Ubenimex)®), 인터페론-β, 메피티오스탄, 미토브로니톨, 멜팔란, 라미닌 펩티드, 렌티난, 코리올루스 베르시칼라(Coriolus versicolor) 추출물, 테가푸르/우라실, 에스트라무스틴 (에스트로겐/메클로레타민)이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
암 환자를 위한 치료요법제로서 사용될 수 있는 추가 작용제에는 EPO, G-CSF, 간시클로비르; 항생제, 류프롤라이드; 메페리딘; 지도부딘 (AZT); 인터류킨 1 내지 18, 예를 들어 돌연변이체 및 유사체; 인터페론 또는 사이토카인, 예컨대 인터페론 α, β 및 γ 호르몬, 예컨대 황체형성 호르몬 분비 호르몬 (LHRH) 및 유사체, 및 생식선자극호르몬 분비 호르몬 (GnRH); 성장 인자, 예컨대 형질전환 성장 인자-β (TGF-β), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 신경 성장 인자 (NGF), 성장 호르몬 분비 인자 (GHRF), 상피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 상동 인자 (FGFHF), 간세포 성장 인자 (HGF), 및 인슐린 성장 인자 (IGF); 종양 괴사 인자-α 및 β (TNF-α 및 β); 침윤 억제 인자-2 (IIF-2); 골 형태발생 단백질 1-7 (BMP 1-7); 소마토스타틴; 티모신-α-1; γ-글로불린; 과산화물 디스무타제 (SOD); 보체 인자; 항-혈관형성 인자; 항원성 물질; 및 전구약물이 포함된다.
전구약물은 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태, 즉 모 약물과 비교하여 종양 세포에 대해 덜 세포독성 또는 비-세포독성이고, 효소적으로 활성화되거나 활성 또는 더 활성 모 형태로 전환될 수 있는 형태를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]을 참조한다. 전구약물에는 더 활성의 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 글리코실화된 전구약물, b-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 상기 기재된 화학요법제를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
임상적 측면
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 유방암, 피부암, 식도암, 간암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 난소암, 다발성 골수종 및 흑색종에 특히 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 암은 도관 선암종, 소엽 선암종 또는 전이성 선암종이다.
제약 조성물
본 발명은 또한 본원에 기재된 하나 이상의 LIV-1 조정인자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 제약 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로 제조되고; 주사전에 액체 비히클 중에 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 리포좀은 제약상 허용되는 담체의 정의 내에 포함된다. 제약상 허용되는 염은 또한 제약 조성물, 예를 들어, 광산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등에 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제의 철저한 논의는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkins]에서 입수가능하다.
LIV -1의 검출 방법
본 발명은 또한 LIV-1의 검출 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1은 환자 또는 환자 샘플에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 LIV-1 조정인자를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하고, 환자에서 영상화제의 국소화를 검출하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 환자 샘플은 암 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 영상화제에 연결되거나 또는 검출가능하게 표지된다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 영상화제에 접합된 LIV-1 항체이고, 하나 이상의 종양의 검출, 또는 LIV-1 치료요법에 대한 환자의 감수성의 결정을 위해 환자에게 투여된다. 표지된 항체는 세포 상의 고밀도의 수용체에 결합하며, 이에 의해 종양 세포 상에 축적될 것이다. 표준 영상화 기술을 사용하여, 종양의 부위가 검출될 수 있다.
본 발명은 또한 LIV-1 조정인자를 포함하는 조성물을 샘플에 접촉시키고, 샘플 중 LIV-1 조정인자의 존재를 검출하는 것을 포함하는, LIV-1을 발현 또는 과다발현하는 세포 또는 종양의 영상화/검출 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 환자 샘플이다. 몇몇 실시양태에서, 환자 샘플은 암 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 영상화제에 연결되거나 또는 검출가능하게 표지된다.
본 발명은 또한 환자, 세포 또는 샘플에 존재하는 LIV-1의 양의 정량 방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 항체, 프로브 또는 소분자를 환자 또는 샘플에 투여하고, 샘플에 존재하는 LIV-1의 양을 검출하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체, 프로브 또는 소분자는 영상화제에 연결되거나 또는 검출가능하게 표지된다. 이러한 정보는 예를 들어 종양이 LIV-1과 관련되는가, 및 그러므로, 특정 치료를 사용하거나 또는 이를 피해야 하는가를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 당업자에게 익히 공지된 표준 기술을 사용하여, 종양 세포를 포함하는 것으로 여겨지는 샘플을 얻고, 표지된 항체, 프로브, 올리고뉴클레오티드 및 소분자와 접촉시킨다. 임의의 비결합된, 표지된 항체, 프로브, 올리고뉴클레오티드 또는 소분자를 제거한 후, 세포에 결합된 표지된 항체, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 모방체의 양, 또는 비결합된 것으로 제거된 항체, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 모방체의 양을 결정한다. 상기 정보는 존재하는 LIV-1의 양과 직접적으로 관련된다.
영상화는 당업자에게 익히 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 영상화는 예를 들어 방사성섬광조영술, 핵 자기 공명 영상화 (MRI) 또는 전산화 단층촬영술 (CT scan)에 의해 수행될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 영상화제용 방사성표지에는 방사성 요오드 및 인듐이 포함된다. CT 스캔에 의한 영상화는 중금속 예컨대, 철 킬레이트를 사용할 수 있다. MRI 스캐닝은 가돌리늄 또는 망간의 킬레이트를 사용할 수 있다. 또한, 양전자 방출 단층촬영술 (PET)은 산소, 질소, 철, 탄소 또는 갈륨의 양전자 방출체를 사용할 수 있다. 영상화는 또한 LIV-1 활성을 생체내에서 모니터링하기 위해 아연-감수성 염료를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법의 예는 문헌 [A. Takeda et al., Cancer Research 61, 5065-5069, July 1, 2001]; 및 [C. Frederickson, Sci STKE. 2003 May 13;2003(182)]에 논의되어 있으며, 상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 LIV-1 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 조정인자는 영상화제에 연결되거나 또는 검출가능하게 표지된다. 몇몇 실시양태에서, 영상화제는 18F, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 77Br, 87MSr, 86Y, 90Y, 99MTc, 111In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb 또는 206Bi이다.
검출 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 검출 방법에는 PCR, 노던 블럿팅, 서던 블럿팅, RNA 보호, 및 DNA 혼성화 (계내 혼성화 포함)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드의 검출 방법에는 웨스턴 블럿팅, ELISA, 효소 활성 검정법, 슬롯 블럿팅, 펩티드 질량 손가락프린팅, 전기영동법, 면역화학법 및 면역조직화학법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 검출 방법의 다른 예로는 방사선면역검정법 (RIA), 화학발광 면역검정법, 플루오로면역검정법, 시간-분할 플루오로면역검정법 (TR-FIA), 2종 컬러 형광 현미경검사법, 또는 면역크로마토그래피 검정법 (ICA)이 포함되나 이에 제한되지 않으며, 이들 모두는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 본 발명의 몇몇 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 발현은 PCR 방법을 사용하여 검출되며, 폴리펩티드 생성은 ELISA 기술을 사용하여 검출된다.
세포로 세포독성제 또는 진단제를 전달하는 방법
본 발명은 또한 LIV-1을 발현하는 하나 이상의 세포로의 세포독성제 또는 진단제 전달 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 세포독성제 또는 진단제에 접합된 본 발명의 LIV-1 조정인자를 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
암 환자의 예후 결정 방법
본 발명은 또한 LIV-1-관련 암을 갖는 환자의 예후 결정 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자 샘플에서 LIV-1-델타:LIV-1의 비율을 결정하는 것을 포함한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지 않으나, 본 발명자들은 LIV-1에 상대적인 LIV-1-델타의 더 높은 수준이 덜 공격적인 암 및/또는 치료가 더 용이한 암과 상관관계가 있다는 것을 밝혀내었다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, LIV-1에 상대적인 LIV-1-델타의 높은 수준은 본 발명의 LIV-1 조정인자 및/또는 통상적인 암 의약에 의한 성공적인 치료 및/또는 연장된 생존에 대한 양호한 예후를 갖는 환자에 대한 지표이다. 몇몇 실시양태에서, 양호한 예후는 LIV-1-델타:LIV-l의 비율 2:1 이상, 3:1 이상, 4:1 이상 또는 5:1 이상에 의해 표시된다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1-델타:LIV-1의 비율이 mRNA 또는 단백질 수준의 측정에 의해 결정된다.
몇몇 실시양태에서, LIV-1-관련 암이 있는 환자의 예후 결정 방법은 환자 샘플에서 세포의 원형질막에 결합된 LIV-1을 검출하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 환자 샘플에서 세포의 원형질막에 결합된 LIV-1의 검출은 본 발명의 LIV-1 조정인자 및/또는 통상적인 암 의약에 의한 성공적인 치료 및/또는 연장된 생존에 대한 양호한 예후의 지표가 아니다.
몇몇 실시양태에서, LIV-1은 서열 1의 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩된다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1은 서열 2의 서열을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1-델타는 서열 365의 서열을 갖는다.
LIV -1 치료요법에 대한 감수성의 결정 방법
본 발명은 또한 LIV-1 치료요법에 대한 환자의 감수성의 결정 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자 또는 환자 샘플에서 LIV-1의 차별적 발현의 증거의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 환자 또는 샘플에서 LIV-1의 차별적 발현의 증거의 존재는 LIV-1 치료요법에 감수성인 환자에 대한 지표이다. 몇몇 실시양태에서, 환자 또는 샘플에서 LIV-1의 차별적 발현의 증거의 부재는 LIV-1 치료요법에 대한 후보가 아닌 환자에 대한 지표이다.
몇몇 실시양태에서, 치료 방법은 LIV-1 치료요법에 감수성인 환자를 먼저 확인하고, 영상화제에 연결된 LIV-1 조정인자를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하고, 상기 환자에서 유전자 또는 유전자 생성물의 증거의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 치료 방법은 환자가 LIV-1 치료요법에 대한 후보인 경우에는 하나 이상의 LIV-1 조정인자를 환자에게 투여하고, 환자가 LIV-1 치료요법에 대한 후보가 아닌 경우에는 통상적인 암 치료로 환자를 치료하는 것을 추가로 포함한다.
몇몇 치료 방법에서, 하나 이상의 LIV-1 조정인자는 환자가 암을 갖고 있거나 또는 암에 감수성인 것으로 확인된 경우, 상기 환자에게 단독으로, 또는 다른 항암 의약과 조합하여 투여된다.
암의 진행의 평가 방법
본 발명은 또한 제1 시점에서의 생물학적 샘플 중 LIV-1의 발현 생성물의 수준을 제2 시점에서의 동일한 발현 생성물의 수준과 비교하는 것을 포함하는, 환자에서 암의 진행의 평가 방법을 제공한다. 제1 시점에 대해 상대적인 제2 시점에서의 발현 생성물의 수준의 변화는 암의 진행에 대한 지표이다.
스크리닝 방법
본 발명은 또한 항암제에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 LIV-1을 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, LIV-1-관련 생물학적 활성이 조정되는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 암 세포 성장, 인테그린-매개 활성, 종양 형성, 암 세포 증식, 암 세포 전이, 세포 이동, 혈관형성, LIV-1 신호전달, LIV-1-매개 세포-세포 접착, LIV-1-매개 세포-세포 막 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 분해, 및 LIV-1 발현 중 하나 이상의 억제는 항암제에 대한 지표이다.
본 발명은 추가로 암 억제제의 확인 방법을 제공한다. 상기 방법은 LIV-1을 발현하는 세포를 후보 화합물 및 LIV-1 리간드와 접촉시키고, LIV-1-관련 생물학적 활성이 조정되는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 암 세포 성장, 인테그린-매개 활성, 종양 형성, 암 세포 증식, 암 세포 전이, 세포 이동, 혈관형성, LIV-1 신호전달, LIV-1-매개 세포-세포 접착, LIV-1-매개 세포-세포 막 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 상호작용, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 분해, 및 LIV-1 발현 중 하나 이상의 억제는 암 억제제에 대한 지표이다. 몇몇 실시양태에서, 환자에게 투여되는 LIV-1 조정인자의 양은 암 세포 세포자멸을 증가시키는데 효과적이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 하류 마커의 활성 또는 수준을 조정하는 능력에 대한 추정적인 조정인자의 스크리닝에 의한, 항암제, 특히 전이성 항암제에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 사이클린 D1 수준을 감소시키거나, MT1-MMP 수준을 감소시키거나, 또는 세포질 아연 수준을 감소시키는 후보 작용제는 항암제로서 확인된다.
LIV -1의 정제 방법
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 LIV-1을 포함하는 샘플로부터의 LIV-1 단백질 정제 방법을 제공한다. 상기 방법은 고체 지지체에 결합된 본 발명의 LIV-1 항체를 포함하는 친화도 매트릭스를 제공하고, 친화도 매트릭스-LIV-1 단백질 복합체를 형성시키기 위해 샘플를 친화도 매트릭스와 접촉시키고, 샘플의 나머지로부터 친화도 매트릭스-LIV-1 단백질 복합체를 분리하고, 친화도 매트릭스로부터 LIV-1 단백질을 방출시키는 것을 포함한다.
키트
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 LIV-1 과다발현과 상관관계가 있는 유전자 또는 유전자 생성물의 영상화 및/또는 검출용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 검출가능한 항체, 소분자, 올리고뉴클레오티드, 유인물, 모방체 또는 프로브, 뿐만 아니라 본 발명의 방법의 수행에 대한 지시사항을 포함한다. 임의로, 키트는 대조군 (양성 및/또는 음성), 대조군을 위한 용기, 양성 및/또는 음성 결과의 대표적인 예의 사진 또는 설명 중 하나 이상을 또한 함유할 수 있다.
본원에 기재된 특허, 특허 출원, 접속 번호 및 공개는 각각 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
본원에 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명의 관점에서 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 실시양태의 범위내에 포함되도록 의도된다. 본 발명은 추가로 예시 목적을 위한 하기 실시예에서 입증되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 면역침강법
총 부피 10 mL 당 50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% 트리톤X-100 및 1개 프로테아제 억제제 정제 (로슈 디아그노스틱 코포레이션(Roche Diagnostic Corp.), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)를 함유하는 면역침강법 (IP) 완충제를 제조하였다. 사내 제조된 토끼 폴리클로날 항체 (Ab), 항-LIV-1을 IP 완충제와 1:100 희석으로 합하고, 스크류-탑 튜브에서 세포 용균물에 첨가하고, 이를 락커 플랫폼에서 1 내지 2시간 동안 4℃에서 혼합하였다. 면역침강법을 위해, 항-토끼 IgG-접합된 비드 40 ㎕ 또는 스트렙타비딘 비드 120 ㎕를 튜브 각각에 첨가하고, 락커 플랫폼에서 밤새 4℃에서 계속 인큐베이션하였다. 후속적으로, 튜브를 7000 x g에서 2분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 비드 펠렛을 냉 세척 완충제로 4회 세척한 후, 환원제를 함유하는 2X SDS 트리스/글리신 샘플 완충제 30 ㎕를 튜브 각각에 첨가하였다. 그 후, 샘플 완충제 중 비드를, 비드로부터 면역침전물을 방출할 때마다 5분 동안 95℃에서 2회 끓였다. 그 후, 끓인 비드 용액을 14,000 x g에서 5분 동안 실온에서 원심분리한 다음, 상등액을 제거하고, 새로운 튜브로 이동시켰다. 면역침전물을 SDS-PAGE 겔 상의 전기영동에 의해 즉시 분석하거나, 또는 -20℃에서 저장하였다. 표준 방법을 사용하여 웨스턴 블럿팅 분석을 수행하였다. 전기영동된 면역침전물을 폴리아크릴아미드 겔로부터 막으로 이동시킨 후, 제2 LIV-1 항체 (1:1000)를 사용하여 천천히 진탕하면서 막을 1시간 동안 실온에서 프로빙하였다. 0.05% Tween20 (PBST)을 함유하는 PBS로 여러번 세척한 후, 양고추냉이 퍼록시다제 (HRP)에 접합된 적절한 종-특이적 2차 항체를 첨가하고, 락커 플랫폼에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 여러번 세척한 후, ECL 검출 시스템 (아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences) UK)을 사용하여 막 상의 반응성 밴드를 시각화하였다.
실시예 2: FACS 분석
본 분석을 위해 비투과화 세포를 사용하였다. (냉) PBS, 1% 소 혈청 알부민 (BSA), 2% 소 태아 혈청 (FBS) 및 0.1% 아지드화나트륨을 함유하는 FACS 완충제를 제조하였다. 해리 완충제 (인비트로젠 코포레이션, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 사용하여 접착성 세포의 박리에 의해 세포를 수확하였다. 해리 완충제를 중화하기 위해, 동일한 부피의 성장 배지를 첨가하였다. 그 후, 세포를 5 mL 폴리스티렌 둥근바닥 튜브에 분취하였다. 염색 각각을 위해, 백만개의 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리한 후, 1차 항체 (FACS 완충제 100 ㎕ 중 6 ㎍까지)를 세포 펠렛에 첨가하고, 볼텍싱에 의해 혼합하고, 얼음 상에서 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 1000 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 펠렛화한 후, 세포를 FACS 완충제 3 mL로 2회 세척하였다. 2차 세척 및 원심분리후, 2차 항체 (FACS 완충제 50 ㎕ 중 1 ㎍)를 세포 펠렛에 첨가하고, 볼텍싱에 의해 혼합하고, 얼음상에서 30분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 그 후, 1000 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 펠렛화한 후, 세포를 FACS 완충제 3 mL로 2회 세척하였다. 2차 세척 및 원심분리후, 요오드화프로피듐 (PI) (PI를 1 ㎍/㎕ 스톡으로서 제조하고, 1:100으로 사용함)을 함유하는 FACS 완충제 50 ㎕에 세포 500 ㎍을 재현탁하였다. FACS/유동 세포계측 분석법을 1시간 내에 수행하였다.
실시예 3: LIV -1 올리고뉴클레오티드는 연질 한천 성장을 억제한다.
MDA231, MCF-7, ZR75-1 및 T47D1 세포를 LIV-1 (서열 369 및 370)에 대한 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 세포를 0.35% 연질 한천에 플레이팅하고, 배양 7일 후 알라마르 블루를 사용하여 성장을 정량하였다.
T47D1 세포의 고정-독립성 세포 성장에 대한 LIV-1 유전자 발현의 효과를 연질 한천에서의 콜로니 형성에 의해 측정하였다. 세포가 플레이트에 부착하는 것을 방지하기 위해 비-조직 배양 처리된 플레이트를 폴리-HEMA로 먼저 코팅함으로써 연질 한천 검정법을 수행하였다. 트립신을 사용하고, 배지에서 2회 세척하여 비형질 감염된 세포를 수확하였다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고, 배지 1 ml 당 104개 세포로 재현탁하였다. 분취액 50 ㎕를 폴리HEMA 코팅된 96-웰 플레이트에 배치하고, 형질감염시켰다. 형질감염 혼합물 각각을 위해, 담체 분자, 바람직하게는 리피토이드 또는 콜레스테로이드를 물 중 0.5 nM의 작업 농도로 제조하고, 초음파처리하여 균일한 용액을 얻고, 0.45 ㎛ PVDF 막을 통해 여과하였다. 그 후, 안티센스 또는 대조군 올리고뉴클레오티드를 멸균 밀리포어(Millipore) 물 중 100 μM의 작업 농도로 제조하였다. 올리고뉴클레오티드를 마이크로퓨지(microfuge) 튜브에서 OptiMEM™ (Gibco/BRL)에서 2 μM로 또는 대략 20 ㎍ 올리고/OptiMEM™ ml로 추가로 희석하였다. 별개의 마이크로퓨지 튜브에서, 리피토이드 또는 콜레스테로이드를, 전형적으로 약 1.5 내지 2 nmol 리피토이드/㎍ 안티센스 올리고뉴클레오티드의 양으로, 올리고뉴클레오티드를 희석하는데 사용된 동일한 부피의 OptiMEM™에서 희석하였다. 희석된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 희석된 리피토이드에 즉시 첨가하고, 상하 피펫팅에 의해 혼합하였다. 올리고뉴클레오티드를 약 300 nM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 37℃에서 약 30분 동안 형질감염 후, 상하 피펫팅에 의해 0.35% 아가로스의 최종 농도를 위해 3% GTG 아가로스를 세포에 첨가하였다. 세포 층 아가로스를 응고시킨 후, 웰 각각의 상부에 배지 100 ㎕를 적가하였다. 약 7일에 콜로니가 형성되었다. 성장의 판독을 위해, 알라마르 블루 20 ㎕를 웰 각각에 첨가하고, 플레이트를 약 15분 동안 교반하였다. 형광 판독은 (530 nm여기/590 nm 방출) 6 내지 24시간 동안 인큐베이션후 수행하였다.
LIV-1 조정인자를 사용한, 암 세포주에서의 콜로니 형성의 억제는 LIV-1이 전이성 표현형의 생성 및/또는 유지에 중요하다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 유전자 발현의 조절
암성 세포에서 폴리뉴클레오티드에 의해 제공된, 차별적으로 발현된 유전자의 발현은 종양발생에서의 LIV-1의 역할 및 기능 (예를 들어, 전이성 표현형의 촉진)을 확인하기 위해 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석하였다.
LIV-1 올리고뉴클레오티드를 제조하고, LIV-1의 발현을 억제하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 합성하고 정량한 후, 올리고머를 세포주의 패널에서 전사체 넉아웃의 효율에 대해 스크리닝하였다. 진앰프(GeneAmp) 정량법을 사용하여 mRNA 수준을 분석함으로써 넉아웃의 효율을 결정하였다.
T47D1, T47D-T1 MCF7, ZR-75-1, MDA231, 184B5 또는 HMEC 세포로의 형질감염을 통해 유전자 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드 각각의 능력을 시험하였다.
형질감염 혼합물 각각을 위해, 담체 분자 (예컨대, 지질, 지질 유도체, 지질-유사 분자, 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, 또는 콜레스테롤-유사 분자)를 물 중 0.5 mM의 작업 농도로 제조하고, 초음파처리하여 균일한 용액을 얻고, 0.45 ㎛ PVDF 막을 통해 여과하였다. 그 후, 안티센스 또는 siRNA 올리고뉴클레오티드를 멸균 밀리포어 물 중 약 100 μM의 작업 농도로 제조하였다. 올리고뉴클레오티드를 마이크로퓨지 튜브에서 OptiMEM™ (Gibco/BRL)에서 2 μM로, 또는 대략 20 ㎍ 올리고/OptiMEM™ ml로 추가로 희석하였다. 별개의 마이크로퓨지 튜브에서, 담체 분자를, 전형적으로 약 1.5 내지 2 nmol 담체/㎍ 안티센스 올리고뉴클레오티드의 양으로, 올리고뉴클레오티드를 희석하는데 사용된 동일한 부피의 OptiMEM™에서 희석하였다. 희석된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 희석된 담체에 즉시 첨가하고, 상하 피펫팅에 의해 혼합하였다. siRNA를 약 67 nM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다.
형질감염된 세포 중 관심있는 표적 유전자에 상응하는 표적 mRNA의 수준을, ABI 진앰프 7000™ 실시간 PCR 기계를 사용하여 세포주에서 정량하였다. 표적 mRNA에 대한 값 vs. 내부 대조군에 대해 표준화하였다. 반응물 20 ㎕ 각각을 위해, 추출된 RNA (일반적으로, 총 0.2 내지 1 ㎍)를 멸균 0.5 또는 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에 배치하고, 물을 총 부피 12.5 ㎕까지 첨가하였다. H2O 2.5 ㎕, 1OX 반응 완충제 2.0 ㎕, 올리고 dT 10 ㎕ (20 pmol), dNTP 혼합물 1.0 ㎕ (각각 10 mM), RNAsin® (2Ou) (암비온, 인크.(Ambion, Inc.), 미국 플로리다주 히알레어 소재) 0.5 ㎕, 및 MMLV 역전사효소 (50u) (암비온, 인크.) 0.5 ㎕의 혼합 (나열된 순서로)에 의해 제조된, 완충제/효소 혼합물 7.5 ㎕를 튜브 각각에 첨가하였다. 내용물을 상하 피펫팅에 의해 혼합하고, 반응 혼합물을 42℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 튜브 각각의 내용물을 증폭전에 원심분리하였다.
ABI sybr 마스터 믹스 + 올리고뉴클레오티드 각각 0.175 pmol을 사용하여 증폭 혼합물을 제조하였다. SYBR® 그린 (몰레큘라 프로브, 미국 오리건주 유진 소재)은 이중 가닥 DNA에 결합시 형광을 나타내는 염료이다. 이중 가닥 PCR 생성물이 증폭 중에 생성되기 때문에, SYBR® 그린으로부터 형광이 증가한다. 증폭 혼합 물의 분취액 20 ㎕ 각각에 주형 RT 2 ㎕를 첨가하고, 표준 프로토콜에 따라 증폭을 수행하였다. 비형질감염된 세포, 오직 비히클만 형질감염된 (모의-형질감염된) 세포, 또는 역 대조군 올리고뉴클레오티드로 형질감염된 세포에 대해 상대적인, 상응하는 유전자 생성물의 발현의 감소율 %로서 결과를 나타내었다.
LIV-1 올리고뉴클레오티드는 시험된 모든 세포주에서 LIV-1 발현을 억제하였으나, LIV-1 올리고뉴클레오티드는 종양발생 주에서만 기능적 결과를 가졌다. LIV-1 올리고뉴클레오티드의 기능적 결과는 비종양발생 주에서 관찰되지 않았으며, 이는 암 세포 및 "정상적인" 세포가 LIV-1 활성에 대한 상이한 의존성을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 증식에 대한 발현의 효과
T47D1, T47D-T1, MCF7, ZR-75-1, 184B5, MDA231 및 HMEC 세포를 비롯한 여러 세포주에서 siRNA 방법을 사용하여 세포 증식의 억제에 대한 유전자 발현의 효과를 평가하였다.
96-웰 접시에서 수일 후 약 80 내지 95% 전면성장할 밀도로 세포를 플레이팅하였다. 올리고뉴클레오티드 (안티센스 또는 siRNA)를 OptiMEM™에서 2 μM로 희석하였다. 그 후, 검정법에서 사용되는 특정 세포 유형을 위해 최적화하기 위해 선택된, 전달 비히클에 올리고뉴클레오티드-OptiMEM™를 첨가하였다. 그 후, 세포 상에 혈청을 함유한 배지로 올리고/전달 비히클 혼합물을 추가로 희석하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 약 300 nM이고, siRNA 올리고뉴클레오티드의 최종 농도 67 내지 100 nM이었다.
올리고뉴클레오티드를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 세포를 약 4시간 내지 밤새 37℃에서 형질감염시키고, 형질감염 혼합물을 신선한 배지로 대체하였다. 형질감염을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
LIV-1 올리고뉴클레오티드는 암 세포의 증식을 억제하였으나, HMEC (초대 유방 상피 세포) 또는 184B5 (비종양발생 유방 상피 세포주) 세포의 증식은 억제하지 않았으며, 이는 LIV-1이 암 세포에서 암성 표현형의 생성 및/또는 유지에 역할을 한다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 생존 검정법
세포 사멸에 대한 표적 메시지의 고갈의 효과를 평가하기 위해, T47D-T1, MCF7, Zr-75-1 및 MDA-MB231 세포를 세포독성 검정법을 위해 형질감염시켰다. 막 손상으로 인해 배지에서 방출된 LDH 효소의 양의 측정에 의해 세포독성을 모니터링하였다. 로슈 몰레큘라 바이오케미칼스로부터의 세포독성 검출 키트를 사용하여 LDH의 활성을 측정하였다. 데이타는 배지에서 방출된 LDH:동일한 시점 및 처리에서 웰에 존재하는 총 LDH의 비율로서 제공된다 (rLDH/tLDH). 안티센스를 사용하는 양성 대조군, 및 BCL2 (공지된 항세포자멸 유전자)에 대한 역 대조군 올리고뉴클레오티드를 포함시키고, BCL2에 대한 메시지의 손실은 대조군 올리고뉴클레오티드 (형질감염으로 인한 배경 세포독성)에 의한 처리와 비교하여 세포 사멸의 증가를 유발하였다.
실시예 7: 카스파제 / M30 방법
siRNA로 처리된 세포로부터의 용균물에 대한 웨스턴 분석법을 사용하여 프로 카스파제 및 M30을 평가하였다. 처리후 여러 시점에서, 세포 (접착성 및 박리된 세포 둘 모두 (이들은 스핀 다운됨))를 용균시키고, 프로카스파제 및 M30에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 분석법으로 처리하였다. 프로카스파제의 소멸은 카스파제 활성화에 상응하였다. M30 에피토프의 출현은 사이토케라틴 18의 카스파제 절단을 반영하였다. 사용된 항체는 Axxora/Alexis M30 (사이토데스(CytoDeath): CAT# ALX-804-590) 및 프로카스파제 Ab (R&D 시스템스, cat no. MAB707)이었다.
실시예 8: 사이클린 D1 방법
세포를 넉다운 LIV-1에 대한 siRNA로 형질감염시키거나, 또는 LIV-1 특이적 Ab로 처리하였다. 형질감염된 세포를 위해, 용균물을 형질감염후 48시간에 수집하였다. Ab 처리를 위해, 용균물을 처리후 6시간에 수집하였다. 항-사이클린 D1 Ab: 사이클린 D1 Abeam Cat#-ab24249를 사용하여 용균물을 웨스턴 분석법으로 처리하였다. 사용된 siRNA는 서열 369 및 370이었다. 시험된 LIV-1 Ab를 N-말단 및 TM2-3 ECD에 대해 사내 제조하였다. TM2-3 ECD에 대한 항체는 가장 큰 효과를 나타내는 것으로 보였다.
실시예 9: 아연 수준
실시예 G전 24, 48 또는 72시간에 siRNA로, 또는 실시예 10전 30분에 Ab로 세포를 처리하였다. 사용된 siRNA는 서열 369 및 370이었다. 시험된 LIV-1 Ab를 N-말단 및 TM2-3 ECD에 대해 사내 제조하였다. TM2-3 ECD에 대한 항체는 가장 큰 효과를 나타내는 것으로 보였다.
실시예 10: 아연 수송 검정법
세포-투과성 아연-선택적인 형광 인디케이터, 뉴포트 그린을 사용하여 아연 수송을 검정하였다. 세포내 에스테라제에 의한 절단시, 뉴포트 그린은 유리 아연 이온에 결합하고, 세포내 유리 아연 함량에 대한 형광 인디케이터로서 작용하였다.
다음과 같이 크렙스-링거(Krebs-Ringer)-HEPES 완충제 (KRH) 완충제 (120 mM NaCl, 25 mM HEPES, pH 7.5, 4.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 1.3 mM CaCl2) 중 10 μM 뉴포트 그린 PDX 염료 (투과성 에스테르 형태, Cat # N24191, 인비트로젠-몰레큘라 프로브™) 및 0.02% 플루로닉(Pluronic) F-127 (DMSO 중 20% 플루로닉 F-127; Cat # P3000, 인비트로젠-몰레큘라 프로브™)의 작업 용액을 제조하였다. 뉴포트 그린을 분취액 50 ㎍ (-2O℃에서 건조 저장하고, 빛으로부터 보호하고 사용 직전 해동함)으로 얻었다. 무수 디메틸 술폭시드 (DMSO) (Cat # 276855-100 mL, 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)) 16.8 ㎕에 뉴포트 그린 50 ㎍을 재구성함으로써 뉴포트 그린 염료의 2.5 mM 스톡 용액을 제조하였다. 동일한 부피 (16.8 ㎕)의 분산제, 플루로닉 F-127을 2.5 mM 스톡 용액에 첨가한 후, 염료의 전체 부피를 KRH 완충제 8.366 mL로 희석함으로써 뉴포트 그린 염료의 10 μM 작업 용액을 제조하였다.
접착성 세포를 Ca2 + 및 Mg2 + 비함유 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 1회 세척하고, 효소-비함유, 행크스(Hanks)-기재 해리 완충제 (인비트로젠, Cat # 13150-016)로 수확하였다. PBS 및 해리 완충제 둘 모두를 사용전에 37℃로 평형화하였다. 그 후, 동일한 부피의 성장 배지를 첨가하여 세포 현탁액의 pH를 중화시켰다. 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고; 얻어진 세포 펠렛을 1×106개 세포/mL의 농도에서 PBS에 재현탁하였다. 분석을 위해, 1.5×106개 세포를 5 ml 폴리스티렌 둥근바닥 FACS 튜브 (벡톤 딕킨슨, Cat # 352054)로 분취하였다. 세포를 다시 원심분리에 의해 펠렛화하고, PBS를 제거하였다.
세포 펠렛을 10 μM 뉴포트 그린 염료 용액 0.5 mL에서 볼텍싱에 의해 재현탁하고; FACS 튜브를 캡핑하고, 3O℃ 수조에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 염료-비함유 KRH 완충제 1 mL를 세포 현탁액에 첨가하고, 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하였다. 상등액을 흡입하고, 세포를 다시 염료-비함유 KRH 완충제 1 mL에서 세척하고, 세포 펠렛을 염료-비함유 KRH 완충제 0.5 mL에 재현탁하고, 3O℃ 수조에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 염료-비함유 KRH 완충제 1 mL를 세포 현탁액에 첨가하고, 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하였다. 상등액을 흡입하고, 세포를 다시 염료-비함유 KRH 완충제 1 mL에서 세척하고, 세포 펠렛을 염료-비함유 KRH 완충제 2.0 mL에 볼텍싱에 의해 재현탁하였다.
세포내 형광을 FACS (FACS캘리버) (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 의해 모니터링하였다. 세포를 실시간에 수집하고, 뉴포트 그린 염료 형광 (FITC 설정)을 시간에 대해 플롯팅하였다 (10분에 걸쳐 2백만개의 세포에서 수집 설정). 수집의 1.5 내지 2분 내에 형광 기준선의 확립 후, 100 mM 염화아연 (Cat # Z0152-100G, 시그마-알드리히, 29 mM HCl에 용해됨)을 1 내지 100 μM의 최종 농도로 세 포에 첨가하였다. 세포의 튜브를 FACS 기계로 즉시 회수하고; 형광의 즉시 증가에 의해 아연 흡수를 나타내었다. FACS 데이타를 플로우조(Flowjo) 소프트웨어 (트리 스타 인크.(Tree Star Inc.), 미국 오리건주 애쉬랜드 소재)으로 이출하고, 동력학 플랫폼을 사용하여 분석하였다. 데이타의 평균은 이동하는 평균 평활 옵션으로 나타내고, 그래픽 오버레이는 레이아웃 에디터(Layout Editor)에서 만들었다.
실시예 11: LIV -1 에피토프
항체 인식 및 제조를 위한 LIV-1의 선형 에피토프는 당분야에 공지된 임의의 수많은 방법에 의해 확인할 수 있다. 몇몇 예시적인 방법에는 항원의 아미노산 서열로부터 유래된 펩티드의 항체-결합 능력을 프로빙하는 것이 포함된다. BIACORE 또는 ELISA 방법을 사용함으로써 결합을 평가할 수 있다. 다른 기술에는 평평한 고체 지지체 ("칩") 상에 펩티드 라이브러리를 항체에 노출시키고, 고체상 스크리닝에서 사용된 임의의 다중 방법을 통해 결합을 검출하는 것이 포함된다. 또한, 파지 디스플레이는 바이오패닝(biopanning)의 여러 순환 후 에피토프의 선택으로 펩티드의 라이브러리를 스크리닝하는데 사용할 수 있다.
하기 표 1은 항-LIV-1 항체에 의한 인식에 적합한 선형 에피토프로서 확인된 LIV-1의 영역 (서열 2)을 제공한다.
Figure 112008078198814-PCT00001
Figure 112008078198814-PCT00002
Figure 112008078198814-PCT00003
Figure 112008078198814-PCT00004
Figure 112008078198814-PCT00005
Figure 112008078198814-PCT00006
Figure 112008078198814-PCT00007
실시예 12: 면역조직화학
면역조직화학에 의한 LIV-1의 발현을 평가하는데, 시판되는 파라핀에 묻힌 인간 조직 마이크로어레이를 사용하였다 (자임드 래보러토리즈 인크.(Zymed Laboratories Inc.), 미국 캘리포니아주 샌 프란시스코 소재; 시브르디(Cybrdi), 미국 메릴랜드주 가이테르스부르그 소재; 클리노믹스 바이오사이언시스 인크.(Clinomics Biosciences Inc.), 영국 캠브리지 소재). 천연 및 LIV-1-형질감염된 293T 세포를, 발현의 확인을 위해 대조군으로서 사용하였다.
표준 세포 조건화를 사용하여 벤타나 디스커버리(Ventana Discovery) 상에서 조직 절편 탈파라핀화 및 항원 검색을 수행한 후, 1차 항체에서 60-분 인큐베이션하였다. 토끼 항-인간 LIV-1 항체 (카이론(Chiron), 미국 캘리포니아주 에메리빌 소재) 및 토끼 IgG 예비출혈 대조군 (카이론, 미국 캘리포니아주 에메리빌 소재)을 10 ug/ml으로 사용하였다. 벤타나 유니버셜(Ventana Universal) 2차 시약 (벤타나 메디칼 시스템즈, 인크.(Ventana Medical Systems, Inc.), 미국 애리조나주 투크슨 소재), 이어서 벤타나 DAB Map 키트 (벤타나 메디칼 시스템즈, 인크.)를 검출에 사용하였다. 벤타나 헤마톡실린 및 블루잉 시약 (벤타나 메디칼 시스템즈, 인크.)을 계수기 염색에 사용하고, 등급화 알콜에서 절편을 탈수시키고, 크실렌으로 세정하고, 합성 탑재 배지를 사용하여 덮었다.
실시예 13: 암 조직 vs . 정상적인 조직; 스팟파이어 분석법
수많은 암성 종양 유형 및 정상적인 샘플로부터의 수많은 조직에서 LIV-1, SLC39A10, SLC39A11 및 SLC39A13의 발현을 결정하는데 마이크로어레이 데이타를 또한 사용하였다. 디시젼사이트 소프트웨어 (DecisionSite Software) (스팟파이어, 미국 메사추세츠주 소머빌 소재) 및 사내 개발된 피펠린 파일럿(Pipeline Pilot) (사이테직(SciTegic), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재, 사내 개발자 조세프 링겐베르그(Josef Ringgenberg)) 프로토콜을, 도 12 내지 15에 나타낸 그래프 도표를 작성하는데 사용하였다. 결과는 다양한 정상적인 조직 유형에서 발현의 더 낮은 수준과 함께 수많은 암 유형에서 관심있는 종양 세포 항원 각각에 대한 증가된 발현을 나타내었다.
실시예 14: 서열
LIV-1 뉴클레오티드 서열; 서열 1:
Figure 112008078198814-PCT00008
LIV-1 아미노산 서열; 서열 2:
Figure 112008078198814-PCT00009
본 발명의 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 LIV-1 폴리펩티드의 항원성 영역을 포함하거나 이에 지정된다. LIV-1의 항원성 영역에는 하기 서열 3, 서열 4 및 서열 5이 포함되나 이에 제한되지 않는다:
Figure 112008078198814-PCT00010
본 발명의 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 서열 2의 하나 이상의 서열을 포함하고/거나 이에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, LIV-1 조정인자는 하기 서열 361 내지 서열 364 또는 서열 387 내지 서열 391로 구성된 군에서 선택된 서열을 갖는 하나 이상의 LIV-1 에피토프에 특이적으로 결합한다:
Figure 112008078198814-PCT00011
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 LIV-1 조정인자는 하기 서열은 갖는다:
Figure 112008078198814-PCT00012
Figure 112008078198814-PCT00013
Figure 112008078198814-PCT00014
Figure 112008078198814-PCT00015
Figure 112008078198814-PCT00016
Figure 112008078198814-PCT00017
Figure 112008078198814-PCT00018
본 발명이 그의 특정 실시양태와 관련하여 기재되었으나, 본 발명의 진정한 취지 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화가 만들어질 수 있으며 균등물로 치환될 수 있다는 것을 당업자는 이해해야 한다. 또한, 특정 상황, 물질, 물질의 조성물, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 취지 및 범위에 맞도록 많은 변형이 만들어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis Vaccines & Diagnostics Janatpour, Mary J. Yu, Guoying To, Robert Chen, Vivien Zimmerman, Deborah <120> METHODS OF TREATING, DIAGNOSING OR DETECTING CANCER <130> 20366-039WO1 <150> US 60/791,871 <151> 2006-04-13 <160> 391 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2762 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctcgtgccga attcggcacg agaccgcgtg ttcgcgcctg gtagagattt ctcgaagaca 60 ccagtgggcc cgtgtggaac caaacctgcg cgcgtggccg ggccgtggga caacgaggcc 120 gcggagacga aggcgcaatg gcgaggaagt tatctgtaat cttgatcctg acctttgccc 180 tctctgtcac aaatcccctt catgaactaa aagcagctgc tttcccccag accactgaga 240 aaattagtcc gaattgggaa tctggcatta atgttgactt ggcaatttcc acacggcaat 300 atcatctaca acagcttttc taccgctatg gagaaaataa ttctttgtca gttgaagggt 360 tcagaaaatt acttcaaaat ataggcatag ataagattaa aagaatccat atacaccatg 420 accacgacca tcactcagac cacgagcatc actcagacca tgagcgtcac tcagaccatg 480 agcatcactc agaccacgag catcactctg accatgatca tcactctcac cataatcatg 540 ctgcttctgg taaaaataag cgaaaagctc tttgcccaga ccatgactca gatagttcag 600 gtaaagatcc tagaaacagc caggggaaag gagctcaccg accagaacat gccagtggta 660 gaaggaatgt caaggacagt gttagtgcta gtgaagtgac ctcaactgtg tacaacactg 720 tctctgaagg aactcacttt ctagagacaa tagagactcc aagacctgga aaactcttcc 780 ccaaagatgt aagcagctcc actccaccca gtgtcacatc aaagagccgg gtgagccggc 840 tggctggtag gaaaacaaat gaatctgtga gtgagccccg aaaaggcttt atgtattcca 900 gaaacacaaa tgaaaatcct caggagtgtt tcaatgcatc aaagctactg acatctcatg 960 gcatgggcat ccaggttccg ctgaatgcaa cagagttcaa ctatctctgt ccagccatca 1020 tcaaccaaat tgatgctaga tcttgtctga ttcatacaag tgaaaagaag gctgaaatcc 1080 ctccaaagac ctattcatta caaatagcct gggttggtgg ttttatagcc atttccatca 1140 tcagtttcct gtctctgctg ggggttatct tagtgcctct catgaatcgg gtgtttttca 1200 aatttctcct gagtttcctt gtggcactgg ccgttgggac tttgagtggt gatgcttttt 1260 tacaccttct tccacattct catgcaagtc accaccatag tcatagccat gaagaaccag 1320 caatggaaat gaaaagagga ccacttttca gtcatctgtc ttctcaaaac atagaagaaa 1380 gtgcctattt tgattccacg tggaagggtc taacagctct aggaggcctg tatttcatgt 1440 ttcttgttga acatgtcctc acattgatca aacaatttaa agataagaag aaaaagaatc 1500 agaagaaacc tgaaaatgat gatgatgtgg agattaagaa gcagttgtcc aagtatgaat 1560 ctcaactttc aacaaatgag gagaaagtag atacagatga tcgaactgaa ggctatttac 1620 gagcagactc acaagagccc tcccactttg attctcagca gcctgcagtc ttggaagaag 1680 aagaggtcat gatagctcat gctcatccac aggaagtcta caatgaatat gtacccagag 1740 ggtgcaagaa taaatgccat tcacatttcc acgatacact cggccagtca gacgatctca 1800 ttcaccacca tcatgactac catcatattc tccatcatca ccaccaccaa aaccaccatc 1860 ctcacagtca cagccagcgc tactctcggg aggagctgaa agatgccggc gtcgccactt 1920 tggcctggat ggtgataatg ggtgatggcc tgcacaattt cagcgatggc ctagcaattg 1980 gtgctgcttt tactgaaggc ttatcaagtg gtttaagtac ttctgttgct gtgttctgtc 2040 atgagttgcc tcatgaatta ggtgactttg ctgttctact aaaggctggc atgaccgtta 2100 agcaggctgt cctttataat gcattgtcag ccatgctggc gtatcttgga atggcaacag 2160 gaattttcat tggtcattat gctgaaaatg tttctatgtg gatatttgca cttactgctg 2220 gcttattcat gtatgttgct ctggttgata tggtacctga aatgctgcac aatgatgcta 2280 gtgaccatgg atgtagccgc tgggggtatt tctttttaca gaatgctggg atgcttttgg 2340 gttttggaat tatgttactt atttccatat ttgaacataa aatcgtgttt cgtataaatt 2400 tctagttaag gtttaaatgc tagagtagct taaaaagttg tcatagtttc agtaggtcat 2460 agggagatga gtttgtatgc tgtactatgc agcgtttaaa gttagtgggt tttgtgattt 2520 ttgtattgaa tattgctgtc tgttacaaag tcagttaaag gtacgtttta atatttaagt 2580 tattctatct tggagataaa atctgtatgt gcaattcacc ggtattacca gtttattatg 2640 taaacaagag atttggcatg acatgttctg tatgtttcag ggaaaaatgt ctttaatgct 2700 ttttcaagaa ctaacacagt tattcctata ctggatttta ggtctctgaa gaactgctgg 2760 tg 2762 <210> 2 <211> 755 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Arg Lys Leu Ser Val Ile Leu Ile Leu Thr Phe Ala Leu Ser 1 5 10 15 Val Thr Asn Pro Leu His Glu Leu Lys Ala Ala Ala Phe Pro Gln Thr 20 25 30 Thr Glu Lys Ile Ser Pro Asn Trp Glu Ser Gly Ile Asn Val Asp Leu 35 40 45 Ala Ile Ser Thr Arg Gln Tyr His Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Tyr 50 55 60 Gly Glu Asn Asn Ser Leu Ser Val Glu Gly Phe Arg Lys Leu Leu Gln 65 70 75 80 Asn Ile Gly Ile Asp Lys Ile Lys Arg Ile His Ile His His Asp His 85 90 95 Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser 100 105 110 Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asp His 115 120 125 His Ser His His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala 130 135 140 Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser Ser Gly Lys Asp Pro Arg Asn 145 150 155 160 Ser Gln Gly Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg 165 170 175 Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Val Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Ser Glu Gly Thr His Phe Leu Glu Thr Ile Glu Thr Pro 195 200 205 Arg Pro Gly Lys Leu Phe Pro Lys Asp Val Ser Ser Ser Thr Pro Pro 210 215 220 Ser Val Thr Ser Lys Ser Arg Val Ser Arg Leu Ala Gly Arg Lys Thr 225 230 235 240 Asn Glu Ser Val Ser Glu Pro Arg Lys Gly Phe Met Tyr Ser Arg Asn 245 250 255 Thr Asn Glu Asn Pro Gln Glu Cys Phe Asn Ala Ser Lys Leu Leu Thr 260 265 270 Ser His Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu Asn Ala Thr Glu Phe Asn 275 280 285 Tyr Leu Cys Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ala Arg Ser Cys Leu 290 295 300 Ile His Thr Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile Pro Pro Lys Thr Tyr Ser 305 310 315 320 Leu Gln Ile Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser 325 330 335 Phe Leu Ser Leu Leu Gly Val Ile Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val 340 345 350 Phe Phe Lys Phe Leu Leu Ser Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Gly Thr 355 360 365 Leu Ser Gly Asp Ala Phe Leu His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser 370 375 380 His His His Ser His Ser His Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg 385 390 395 400 Gly Pro Leu Phe Ser His Leu Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala 405 410 415 Tyr Phe Asp Ser Thr Trp Lys Gly Leu Thr Ala Leu Gly Gly Leu Tyr 420 425 430 Phe Met Phe Leu Val Glu His Val Leu Thr Leu Ile Lys Gln Phe Lys 435 440 445 Asp Lys Lys Lys Lys Asn Gln Lys Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp Val 450 455 460 Glu Ile Lys Lys Gln Leu Ser Lys Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn 465 470 475 480 Glu Glu Lys Val Asp Thr Asp Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala 485 490 495 Asp Ser Gln Glu Pro Ser His Phe Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu 500 505 510 Glu Glu Glu Glu Val Met Ile Ala His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr 515 520 525 Asn Glu Tyr Val Pro Arg Gly Cys Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe 530 535 540 His Asp Thr Leu Gly Gln Ser Asp Asp Leu Ile His His His His Asp 545 550 555 560 Tyr His His Ile Leu His His His His His Gln Asn His His Pro His 565 570 575 Ser His Ser Gln Arg Tyr Ser Arg Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val 580 585 590 Ala Thr Leu Ala Trp Met Val Ile Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe 595 600 605 Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala Ala Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser 610 615 620 Gly Leu Ser Thr Ser Val Ala Val Phe Cys His Glu Leu Pro His Glu 625 630 635 640 Leu Gly Asp Phe Ala Val Leu Leu Lys Ala Gly Met Thr Val Lys Gln 645 650 655 Ala Val Leu Tyr Asn Ala Leu Ser Ala Met Leu Ala Tyr Leu Gly Met 660 665 670 Ala Thr Gly Ile Phe Ile Gly His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met Trp 675 680 685 Ile Phe Ala Leu Thr Ala Gly Leu Phe Met Tyr Val Ala Leu Val Asp 690 695 700 Met Val Pro Glu Met Leu His Asn Asp Ala Ser Asp His Gly Cys Ser 705 710 715 720 Arg Trp Gly Tyr Phe Phe Leu Gln Asn Ala Gly Met Leu Leu Gly Phe 725 730 735 Gly Ile Met Leu Leu Ile Ser Ile Phe Glu His Lys Ile Val Phe Arg 740 745 750 Ile Asn Phe 755 <210> 3 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His His Asp His Asp His His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His 1 5 10 15 Glu Arg His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Glu His His Ser 20 25 30 Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys 35 40 45 Pro Asp His Asp Ser Asp Ser 50 55 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Gly Ala His Arg Pro Glu His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His 1 5 10 15 Glu Glu Pro Ala 20 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 His His Asp His Asp His His Ser 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 His Asp His Asp His His Ser Asp 1 5 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His Glu His His Ser Asp His Glu 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 His Glu His His Ser Asp His Glu Arg 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Glu His His Ser Asp His Glu Arg His 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 His His Ser Asp His Glu Arg His Ser 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 His Glu Arg His Ser Asp His Glu His 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Glu Arg His Ser Asp His Glu His His 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Arg His Ser Asp His Glu His His Ser 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 His Ser Asp His Glu His His Ser Asp 1 5 <210> 73 <211> 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Ser Val Phe Gln Ala Leu Leu Gly Thr Phe 1 5 10 15 Phe Thr Trp Gly Met Thr Ala Ala Gly Ala Ala Leu Val Phe Val Phe 20 25 30 Ser Ser Gly Gln Arg Arg Ile Leu Asp Gly Ser Leu Gly Phe Ala Ala 35 40 45 Gly Val Met Leu Ala Ala Ser Tyr Trp Ser Leu Leu Ala Pro Ala Val 50 55 60 Glu Met Ala Thr Ser Ser Gly Gly Phe Gly Ala Phe Ala Phe Phe Pro 65 70 75 80 Val Ala Val Gly Phe Thr Leu Gly Ala Ala Phe Val Tyr Leu Ala Asp 85 90 95 Leu Leu Met Pro His Leu Gly Ala Ala Glu Asp Pro Gln Thr Ala Leu 100 105 110 Ala Leu Asn Phe Gly Ser Thr Leu Met Lys Lys Lys Ser Asp Pro Glu 115 120 125 Gly Pro Ala Leu Leu Phe Pro Glu Ser Glu Leu Ser Ile Arg Ile Asp 130 135 140 Lys Ser Glu Asn Gly Glu Ala Tyr Gln Arg Lys Lys Ala Ala Ala Thr 145 150 155 160 Gly Leu Pro Glu Gly Pro Ala Val Pro Val Pro Ser Arg Gly Asn Leu 165 170 175 Ala Gln Pro Gly Gly Ser Ser Trp Arg Arg Ile Ala Leu Leu Ile Leu 180 185 190 Ala Ile Thr Ile His Asn Val Pro Glu Gly Leu Ala Val Gly Val Gly 195 200 205 Phe Gly Ala Ile Glu Lys Thr Ala Ser Ala Thr Phe Glu Ser Ala Arg 210 215 220 Asn Leu Ala Ile Gly Ile Gly Ile Gln Asn Phe Pro Glu Gly Leu Ala 225 230 235 240 Val Ser Leu Pro Leu Arg Gly Ala Gly Phe Ser Thr Trp Arg Ala Phe 245 250 255 Trp Tyr Gly Gln Leu Ser Gly Met Val Glu Pro Leu Ala Gly Val Phe 260 265 270 Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Ala Glu Pro Ile Leu Pro Tyr Ala Leu 275 280 285 Ala Phe Ala Ala Gly Ala Met Val Tyr Val Val Met Asp Asp Ile Ile 290 295 300 Pro Glu Ala Gln Ile Ser Gly Asn Gly Lys Leu Ala Ser Trp Ala Ser 305 310 315 320 Ile Leu Gly Phe Val Val Met Met Ser Leu Asp Val Gly Leu Gly 325 330 335 <210> 385 <211> 364 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 385 Met Pro Gly Cys Pro Cys Pro Gly Cys Gly Met Ala Gly Pro Arg Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Thr Ala Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gly Arg Ala Gly Gly 20 25 30 Ser Gln Pro Ala Leu Arg Ser Arg Gly Thr Ala Thr Ala Cys Arg Leu 35 40 45 Asp Asn Lys Glu Ser Glu Ser Trp Gly Ala Leu Leu Ser Gly Glu Arg 50 55 60 Leu Asp Thr Trp Ile Cys Ser Leu Leu Gly Ser Leu Met Val Gly Leu 65 70 75 80 Ser Gly Val Phe Pro Leu Leu Val Ile Pro Leu Glu Met Gly Thr Met 85 90 95 Leu Arg Ser Glu Ala Gly Ala Trp Arg Leu Lys Gln Leu Leu Ser Phe 100 105 110 Ala Leu Gly Gly Leu Leu Gly Asn Val Phe Leu His Leu Leu Pro Glu 115 120 125 Ala Trp Ala Tyr Thr Cys Ser Ala Ser Pro Gly Gly Glu Gly Gln Ser 130 135 140 Leu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gly Leu Trp Val Ile Ala Gly Ile Leu 145 150 155 160 Thr Phe Leu Ala Leu Glu Lys Met Phe Leu Asp Ser Lys Glu Glu Gly 165 170 175 Thr Ser Gln Ala Pro Asn Lys Asp Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Leu 180 185 190 Asn Gly Gly His Cys Leu Ala Gln Pro Ala Ala Glu Pro Gly Leu Gly 195 200 205 Ala Val Val Arg Ser Ile Lys Val Ser Gly Tyr Leu Asn Leu Leu Ala 210 215 220 Asn Thr Ile Asp Asn Phe Thr His Gly Leu Ala Val Ala Ala Ser Phe 225 230 235 240 Leu Val Ser Lys Lys Ile Gly Leu Leu Thr Thr Met Ala Ile Leu Leu 245 250 255 His Glu Ile Pro His Glu Val Gly Asp Phe Ala Ile Leu Leu Arg Ala 260 265 270 Gly Phe Asp Arg Trp Ser Ala Ala Lys Leu Gln Leu Ser Thr Ala Leu 275 280 285 Gly Gly Leu Leu Gly Ala Gly Phe Ala Ile Cys Thr Gln Ser Pro Lys 290 295 300 Gly Val Glu Glu Thr Ala Ala Trp Val Leu Pro Phe Thr Ser Gly Gly 305 310 315 320 Phe Leu Tyr Ile Ala Leu Val Asn Val Leu Pro Asp Leu Leu Glu Glu 325 330 335 Glu Asp Pro Trp Arg Ser Leu Gln Gln Leu Leu Leu Leu Cys Ala Gly 340 345 350 Ile Val Val Met Val Leu Phe Ser Leu Phe Val Asp 355 360 <210> 386 <211> 405 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 386 Gly Phe Ile Ala Ile Ser Ile Ile Ser Phe Leu Ser Leu Leu Gly Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Leu Met Asn Arg Val Phe Phe Lys Phe Leu Leu Ser Leu 20 25 30 Val Ala Leu Ala Val Gly Thr Leu Ser Gly Asp Ala Phe Leu Leu Leu 35 40 45 Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His Glu Pro Ala 50 55 60 Met Glu Met Lys Arg Gly Pro Leu Phe Ser His Leu Ser Gln Asn Ile 65 70 75 80 Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Asp Ser Thr Trp Lys Leu Thr Ala Leu Gly 85 90 95 Gly Leu Tyr Phe Met Phe Leu Val Glu His Leu Thr Leu Ile Lys Gln 100 105 110 Phe Lys Asp Lys Lys Lys Lys Asn Gln Lys Pro Glu Asn Asp Asp Asp 115 120 125 Val Glu Ile Lys Lys Gln Leu Ser Tyr Glu Ser Gln Leu Ser Thr Asn 130 135 140 Glu Glu Lys Val Asp Thr Asp Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Ala Asp 145 150 155 160 Ser Gln Glu Pro Ser His Asp Ser Gln Gln Pro Ala Val Leu Glu Glu 165 170 175 Glu Glu Val Met Ile His Ala His Pro Gln Glu Val Tyr Asn Glu Tyr 180 185 190 Val Pro Arg Gly Lys Asn Lys Cys His Ser His Phe His Asp Thr Leu 195 200 205 Gly Gln Ser Asp Leu Ile His His His His Asp Tyr His His Ile Leu 210 215 220 His His His His Gln Asn His His Pro His Ser His Ser Gln Arg Tyr 225 230 235 240 Ser Glu Glu Leu Lys Asp Ala Gly Val Ala Thr Leu Ala Trp Met Val 245 250 255 Met Gly Asp Gly Leu His Asn Phe Ser Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ala 260 265 270 Phe Thr Glu Gly Leu Ser Ser Gly Leu Ser Thr Ser Val Ala Phe Cys 275 280 285 His Glu Leu Pro His Glu Leu Gly Asp Phe Ala Val Leu Lys Ala Gly 290 295 300 Met Thr Val Lys Gln Ala Val Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Met Leu Ala 305 310 315 320 Tyr Leu Gly Met Ala Thr Gly Ile Phe Ile Gly Tyr Ala Glu Asn Val 325 330 335 Ser Met Trp Ile Phe Ala Leu Thr Ala Gly Phe Met Tyr Val Ala Leu 340 345 350 Val Asp Met Val Pro Glu Met Leu His Asp Ala Ser Asp His Gly Cys 355 360 365 Ser Arg Trp Gly Tyr Phe Phe Leu Asn Ala Gly Met Leu Leu Gly Phe 370 375 380 Gly Ile Met Leu Leu Ile Pro Leu Asn Ile Lys Ser Cys Ser Tyr Lys 385 390 395 400 Phe Leu Val Lys Val 405 <210> 387 <211> 304 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 387 Leu His Glu Leu Lys Ala Ala Ala Phe Pro Gln Thr Thr Glu Lys Ile 1 5 10 15 Ser Pro Asn Trp Glu Ser Gly Ile Asn Val Asp Leu Ala Ile Ser Thr 20 25 30 Arg Gln Tyr His Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Tyr Gly Glu Asn Asn 35 40 45 Ser Leu Ser Val Glu Gly Phe Arg Lys Leu Leu Gln Asn Ile Gly Ile 50 55 60 Asp Lys Ile Lys Arg Ile His Ile His His Asp His Asp His His Ser 65 70 75 80 Asp His Glu His His Ser Asp His Glu Arg His Ser Asp His Glu His 85 90 95 His Ser Asp His Glu His His Ser Asp His Asn His Ala Ala Ser Gly 100 105 110 Lys Asn Lys Arg Lys Ala Leu Cys Pro Asp His Asp Ser Asp Ser Ser 115 120 125 Gly Lys Asp Pro Arg Asn Ser Gln Gly Lys Gly Ala His Arg Pro Glu 130 135 140 His Ala Ser Gly Arg Arg Asn Val Lys Asp Ser Val Ser Ala Ser Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Thr Val Tyr Asn Thr Val Ser Glu Gly Thr His Phe Leu 165 170 175 Glu Thr Ile Glu Thr Pro Arg Pro Gly Lys Leu Phe Pro Lys Asp Val 180 185 190 Ser Ser Ser Thr Pro Pro Ser Val Thr Ser Lys Ser Arg Val Ser Arg 195 200 205 Leu Ala Gly Arg Lys Thr Asn Glu Ser Val Ser Glu Pro Arg Lys Gly 210 215 220 Phe Met Tyr Ser Arg Asn Thr Asn Glu Asn Pro Gln Glu Cys Phe Asn 225 230 235 240 Ala Ser Lys Leu Leu Thr Ser His Gly Met Gly Ile Gln Val Pro Leu 245 250 255 Asn Ala Thr Glu Phe Asn Tyr Leu Cys Pro Ala Ile Ile Asn Gln Ile 260 265 270 Asp Ala Arg Ser Cys Leu Ile His Thr Ser Glu Lys Lys Ala Glu Ile 275 280 285 Pro Pro Lys Thr Tyr Ser Leu Gln Ile Ala Trp Val Gly Gly Phe Ile 290 295 300 <210> 388 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 388 His Leu Leu Pro His Ser His Ala Ser His His His Ser His Ser His 1 5 10 15 Glu Glu Pro Ala Met Glu Met Lys Arg Gly Pro Leu Phe Ser His Leu 20 25 30 Ser Ser Gln Asn Ile Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Asp Ser Thr 35 40 45 <210> 389 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 389 Thr Glu Gly Leu Ser Ser 1 5 <210> 390 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 390 His Tyr Ala Glu Asn Val Ser Met 1 5 <210> 391 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 391 Val Phe Arg Ile Asn Phe 1 5

Claims (127)

  1. 단리된 이중 가닥 RNA (dsRNA); 서열 1의 서열의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 올리고뉴클레오티드; 및 LIV-1의 N-말단 세포외 도메인, 막횡단 도메인 (TM) 2와 3 사이의 LIV-1 세포외 도메인, TM 4와 5 사이의 LIV-1 세포외 도메인, TM 6과 7 사이의 LIV-1 세포외 도메인, 및 LIV-1의 C-말단 세포외 도메인으로 구성된 군에서 선택된 LIV-1 도메인의 에피토프에 결합하는 항체로 구성된 군에서 선택된 LIV-1 조정인자, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 dsRNA, siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 암 세포 세포자멸(apoptosis)의 증가, 암 세포 성장의 억제, 종양 형성의 억제, 암 세포 생존의 억제, 암 세포 증식의 억제, 암 세포 전이의 억제, 세포 이동의 억제, 혈관형성(angiogenesis)의 억제, LIV-1 신호전달의 억제, LIV-1-매개 세포-세포 접착의 억제, LIV-1-매개 세포-세포 막 상호작용의 억제, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 상호작용의 억제, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 분해의 억제, 및 LIV-1 발현의 억제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 활성을 갖는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 멸균 주사가능한 조성물.
  5. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 암 세포 성장, 암 세포 생존, 종양 형성 및 암 세포 증식 중 하나 이상을 억제하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 사이클린 D1, 피브로넥틴, RhoB, MT1-MMP, FGF, CDK4, VEGF, EGFR 및 EGFR 인산화 중 하나 이상을 억제하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 인테그린-매개 활성을 조절하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 SNAIL 경로에서 하나 이상의 유전자를 억제하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 SNAIL 핵 국소화를 억제하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 E-카드헤린, VE-카드헤린, Muc-1 중 하나 이상을 상향조절하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 클라우딘, 오클루딘, 데스모플라킨, 카스 파제, p21, p53, BID (bcl-상호작용 제거(death) 효능제), DFF40 (DNA 단편화 인자) 및 사이토케라틴 중 하나 이상을 상향조절하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 아연 수송을 억제하는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 세포질 아연 수준을 감소시키는 조성물.
  14. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 1×108 Ka 이상의 친화도로 LIV-1 폴리펩티드에 결합하는 모노클로날 항체인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, LIV-1 폴리펩티드가 서열 2의 서열을 갖는 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 모노클로날 항체가 하나 이상의 LIV-1-관련 생물학적 활성을 조절하는 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 모노클로날 항체가 암 세포 성장, 암 세포 생존, 종양 형성 및 암 세포 증식 중 하나 이상을 억제하는 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키 메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체 또는 Fab 단편인 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 모노클로날 항체가 LIV-1의 하나 이상의 에피토프에 결합하며, 상기 에피토프는 서열 3-364 및 388-391로 구성된 군에서 선택된 서열을 갖는 조성물.
  20. 제14항에 있어서, 모노클로날 항체가 TM 2와 3 사이의 LIV-1 세포외 도메인의 LIV-1 에피토프에 결합하는 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 모노클로날 항체가 서열 388의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 조성물.
  22. 제14항에 있어서, 모노클로날 항체가 LIV-1의 N-말단 세포외 도메인의 LIV-1 에피토프에 결합하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 모노클로날 항체가 서열 387의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 조성물.
  24. 제1항에 있어서, LIV-1 조정인자가 서열 367-382로 구성된 군에서 선택된 서 열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 조성물.
  25. 제14항의 항체를 생성하는 단리된 세포.
  26. 제14항의 항체를 생성하는 하이브리도마.
  27. 제14항의 항체를 생성하는 비인간 트랜스제닉 동물.
  28. 서열 6-364 및 387-391로 구성된 군에서 선택된 서열 2의 하나 이상의 에피토프를 포함하는, 단리된 에피토프-보유 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서, 서열 2의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는다는 조건으로 추가로 한정되는 단리된 에피토프-보유 폴리펩티드.
  30. 제28항의 단리된 에피토프-보유 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  31. 제28항에 있어서, 에피토프가 각각 서열 6-364 및 387-391로 구성된 군에서 선택된 에피토프의 약 6개 내지 약 20개의 인접 아미노산으로 구성된 에피토프-보유 폴리펩티드.
  32. 제28항에 있어서, 서열 2의 2개 이상의 에피토프를 포함하며, 상기 에피토프가 각각 서열 6-364 및 387-391로 구성된 군에서 선택된 에피토프의 약 6개 내지 20개의 인접 아미노산으로 구성된 에피토프-보유 폴리펩티드.
  33. 제28항에 있어서, 에피토프 중 1개 이상이 서열 2의 21개 이상의 인접 아미노산으로 구성된 에피토프-보유 폴리펩티드.
  34. 제28항의 에피토프-보유 폴리펩티드를 사용한 대상체의 면역화에 의해 얻은 단리된 LIV-1 항체.
  35. 치료 유효량의 제1항의 LIV-1 조정인자를 암 또는 암 증상의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 암 증상의 치료가 필요한 환자에서의 암 또는 암 증상 치료 방법.
  36. 제35항에 있어서, LIV-1 조정인자가 세포 성장을 측정하는 시험관내 검정에서 LIV-1을 발현하는 암 세포의 성장을 25% 이상 억제하는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, LIV-1 조정인자가 세포자멸을 측정하는 시험관내 검정에서 접촉된 세포의 25% 이상에서 세포자멸을 유도하는데 있어서 약 1 mM 미만의 농도에서 효과적인 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, LIV-1 조정인자가 대조군과 비교하여 세포질 아연 수준을 25% 이상 감소시키는 것인 방법.
  39. 제35항에 있어서, LIV-1 조정인자가 사이클린 D1, 피브로넥틴, RhoB, MT1-MMP, FGF, CDK4, VEGF, EGFR 및 EGFR 인산화 중 하나 이상을 억제하는 것인 방법.
  40. 제35항에 있어서, LIV-1 조정인자가 대조군과 비교하여 LIV-1 발현을 25% 이상 억제하는 것인 방법.
  41. 제35항에 있어서, LIV-1 조정인자가 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  42. 제41항에 있어서, LIV-1 조정인자가 서열 367-382로 구성된 군에서 선택된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 방법.
  43. 제35항에 있어서, LIV-1 조정인자가 모노클로날 항체인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 모노클로날 항체가 서열 3-364 및 388-391로 구성된 군에서 선택된 서열을 갖는 하나 이상의 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 모노클로날 항체가 막횡단 도메인 (TM) 2와 3 사이의 LIV-1 세포외 도메인의 LIV-1 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 모노클로날 항체가 서열 388의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  47. 제43항에 있어서, 모노클로날 항체가 LIV-1의 N-말단 세포외 도메인의 LIV-1 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  48. 제43항에 있어서, 모노클로날 항체가 서열 387의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  49. 제35항에 있어서, 암이 유방암, 피부암, 식도암, 간암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 난소암, 다발성 골수종 및 흑색종인 방법.
  50. 제35항에 있어서, 암이 비-호르몬 조절 조직에 있는 것인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 유방암이 에스트로겐 수용체 양성 유방암, 에스트로겐 수용체 음성 유방암 및 전이성 유방암인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 유방암이 도관 선암종, 소엽 선암종 및 전이성 선암종으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  53. 제35항에 있어서, 암이 편평 세포 암종인 방법.
  54. 제35항에 있어서, 환자에게 통상적인 암 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  55. 제35항에 있어서, 화학요법, 방사선 요법 또는 수술 중 하나 이상으로 환자를 치료하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  56. 제35항에 있어서, 암 증상이 유방 종괴, 유두 변화, 유방 낭, 유방 통증, 사망, 체중 손실, 약화, 과도한 피로, 식사 곤란, 식욕 손실, 만성 기침, 호흡곤란의 악화, 객혈, 혈뇨, 혈변, 오심, 구토, 간 전이, 폐 전이, 골 전이, 복부 충만, 고창증(bloating), 복강액, 질 출혈, 변비, 복부 팽창, 결장 천공, 급성 복막염, 통증, 토혈(vomiting blood), 다한, 열, 고혈압, 빈혈, 설사, 황달, 현기증, 오한, 근경련, 결장 전이, 폐 전이, 방광 전이, 간 전이, 골 전이, 신장 전이, 및 췌장 전이, 연하(swallowing) 곤란 등으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  57. LIV-1-관련 생물학적 활성의 조절 유효량의 제1항의 LIV-1 조정인자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 LIV-1-관련 생물학적 활성의 조절 방법.
  58. 제57항에 있어서, LIV-1 조정인자가 LIV-1에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 환자가 유방암, 피부암, 식도암, 간암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 난소암, 다발성 골수종 및 흑색종 중 하나 이상을 갖고 있거나 그러한 소지가 있는 것인 방법.
  60. 제35항에 있어서, LIV-1 조정인자가 항체이고, 생체내 치료 항체 유전자 전달을 통해 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  61. (a) 환자 샘플에서 LIV-1의 차별적 발현의 존재가 LIV-1 치료요법에 대한 후보인 환자에 대한 지표이고, 환자 샘플에서 LIV-1의 차별적 발현의 부재가 LIV-1 치료요법에 대한 후보가 아닌 환자에 대한 지표인, 환자 샘플에서 LIV-1의 차별적 발현의 존재 또는 부재를 검출하는 단계,
    (b) 환자가 LIV-1 치료요법에 대한 후보인 경우에는 치료 유효량의 제1항의 조성물을 환자에게 투여하는 단계, 및
    (c) 환자가 LIV-1 치료요법에 대한 후보가 아닌 경우에는 통상적인 암 치료 제를 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, LIV-1 치료요법에 감수성인 환자의 확인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 환자에서 LIV-1의 발현이 대조군과 비교하여 50% 이상 증가되는 것인 방법.
  63. 제61항에 있어서, LIV-1의 차별적 발현이 LIV-1 RNA의 측정에 의해 검출되는 것인 방법.
  64. 제61항에 있어서, LIV-1의 차별적 발현이 LIV-1 발현 생성물의 측정에 의해 검출되는 것인 방법.
  65. 제61항에 있어서, 통상적인 암 치료제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  66. 세포 성장의 억제 유효량의 제1항의 LIV-1 조정인자를 LIV-1을 발현하는 암 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, LIV-1을 발현하는 암 세포의 성장 억제 방법.
  67. 제66항에 있어서, LIV-1 조정인자가 대조군과 비교하여 세포질 아연 수준을 25% 이상 감소시키는 것인 방법.
  68. 제66항에 있어서, LIV-1 조정인자가 대조군과 비교하여 사이클린 D1 수준을 25% 이상 감소시키는 것인 방법.
  69. 암 세포 표현형의 억제 유효량의 제1항의 LIV-1 조정인자를 LIV-1을 발현하는 세포 집단에 투여하는 것을 포함하는, LIV-1을 발현하는 세포 집단에서의 암 세포 표현형 억제 방법.
  70. 제69항에 있어서, 암 세포가 유방암, 피부암, 식도암, 간암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 난소암, 다발성 골수종 및 흑색종으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  71. 영상화제에 연결된 제1항의 LIV-1 조정인자를 포함하는 조성물과 샘플을 접촉시키고, 상기 샘플에서 영상화제의 국소화를 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 LIV-1을 발현하는 하나 이상의 암 세포의 검출 방법.
  72. 제71항에 있어서, 조성물이 영상화제에 접합된 LIV-1 항체를 포함하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 영상화제가 18F, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 77Br, 87MSr, 86Y, 90Y, 99MTc, 111In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb 또는 206Bi인 방법.
  74. 유효량의 제1항의 LIV-1 조정인자를 둘 이상의 세포 중 하나 이상이 LIV-1을 발현하는 둘 이상의 세포를 포함하는 샘플에 투여하는 것을 포함하는, 둘 이상의 세포 중 하나 이상이 LIV-1을 발현하는 둘 이상의 세포의 상호작용 억제 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상호작용이 생체내인 방법.
  76. 제74항에 있어서, LIV-1 조정인자가 대조군과 비교하여 세포질 아연 수준을 25% 이상 감소시키는 모노클로날 항체인 방법.
  77. 제74항에 있어서, LIV-1 조정인자가 대조군과 비교하여 사이클린 D1 수준을 25% 이상 감소시키는 모노클로날 항체인 방법.
  78. CHO 또는 골수종 세포에서 하나 이상의 LIV-1-관련 생물학적 활성을 억제하는 항-LIV-1 항체를 코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, CHO 또는 골수종 세포에서 하나 이상의 LIV-1-관련 생물학적 활성을 억제하는 항-LIV-1 항체의 발현 방법.
  79. LIV-1을 발현하는 세포를 후보 화합물 및 LIV-1 리간드와 접촉시키고, LIV-1-관련 아연 수송 활성이 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 LIV-1-관련 아연 수송 활성의 억제가 암 억제제에 대한 지표인, 대조군과 비교하여 LIV-1의 과다발현을 특징으로 하는 암의 억제제 확인 방법.
  80. LIV-1을 발현하는 세포를 후보 화합물 및 LIV-1 리간드와 접촉시키고, LIV-1의 하류 마커가 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 하류 마커의 억제가 암 억제제에 대한 지표인, 대조군과 비교하여 LIV-1의 과다발현을 특징으로 하는 암의 억제제 확인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 하류 마커가 사이클린 D1 또는 세포질 아연 수준인 방법.
  82. 환자의 암 샘플에서 LIV-1의 차별적 발현의 증거를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 LIV-1의 차별적 발현의 증거가 LIV-1 조정인자에 대한 환자 감수성의 지표인, LIV-1 조정인자에 대한 환자의 감수성 결정 방법.
  83. 제82항에 있어서, LIV-1의 차별적 발현의 증거가 상기 환자의 암 샘플에서의 LIV-1 상향조절인 방법.
  84. a) 고체 지지체에 결합된 제1항의 항체를 포함하는 친화도 매트릭스를 제공하는 단계,
    b) LIV-1 단백질을 포함하는 샘플을 친화도 매트릭스와 접촉시켜서 친화도 매트릭스-LIV-1 단백질 복합체를 형성하는 단계,
    c) 친화도 매트릭스-LIV-1 단백질 복합체를 샘플의 나머지로부터 분리하는 단계, 및
    d) LIV-1 단백질을 친화도 매트릭스로부터 방출하는 단계
    를 포함하는, LIV-1 단백질을 포함하는 샘플로부터의 LIV-1 단백질 정제 방법.
  85. a) 제1항의 항체 또는 그의 단편에 접합된 세포독성제 또는 진단제를 제공하는 단계, 및
    b) LIV-1을 발현하는 하나 이상의 세포를 항체-작용제 또는 단편-작용제 접합체에 노출시키는 단계
    를 포함하는, LIV-1을 발현하는 하나 이상의 세포로의 세포독성제 또는 진단제 전달 방법.
  86. 암 환자의 샘플에서 LIV-1-델타:LIV-1의 비율을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 LIV-1-델타:LIV-1의 비율이 암 환자의 예후 결정에 이용되는 것인, 암 환자의 예후 결정 방법.
  87. 암 환자의 샘플에서 세포의 원형질막에 결합된 LIV-1의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 상기 환자의 샘플에서 세포의 원형질막에 결합된 LIV-1의 부재가 환자의 양호한 예후를 나타내는 것인, 암 환자의 예후 결정 방법.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, LIV-1이 서열 1의 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 것인 방법.
  89. 제86항 또는 제87항에 있어서, LIV-1이 서열 2의 서열을 갖는 것인 방법.
  90. 제86항에 있어서, LIV-1-델타가 서열 365의 서열을 갖는 것인 방법.
  91. 제86항에 있어서, 2:1 이상의 LIV-1-델타:LIV-1의 비율이 양호한 예후를 갖는 환자에 대한 지표인 방법.
  92. 단리된 이중 가닥 RNA (dsKNA); 서열 383-385로 구성된 군에서 선택된 서열의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 올리고뉴클레오티드; 및 N-말단 세포외 도메인, 막횡단 도메인 (TM) 2와 3 사이의 세포외 도메인, TM 4와 5 사이의 세포외 도메인, TM 6과 7 사이의 세포외 도메인, 및 C-말단 세포외 도메인 으로 구성된 군에서 선택된 아연 수송 단백질 도메인의 에피토프에 결합하는 항체로 구성된 군에서 선택된 아연 수송 단백질 조정인자 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  93. 제92항에 있어서, 아연 수송 단백질이 SLC39A10, SLC39A11 또는 SLC39A13인 조성물.
  94. 제92항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 인테그린-매개 활성을 조절하거나, 아연 수송을 억제하거나, 또는 세포질 아연 수준을 감소시키는 조성물.
  95. 제92항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 조성물.
  96. 제92항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 1×108 Ka 이상의 친화도로 아연 수송 단백질에 결합하는 모노클로날 항체인 조성물.
  97. 제97항에 있어서, 모노클로날 항체가 아연 수송 단백질의 N-말단 세포외 도메인의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 모노클로날 항체가 막횡단 도메인 (TM) 2와 3 사이의 아연 수송 단백질 세포외 도메인의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 조성물.
  99. 제97항에 있어서, 모노클로날 항체가 암 세포 성장, 암 세포 생존, 종양 형성 및 암 세포 증식 중 하나 이상을 억제하는 조성물.
  100. 치료 유효량의 제92항의 아연 수송 단백질 조정인자를 암 또는 암 증상의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 암 증상의 치료가 필요한 환자에서의 암 또는 암 증상 치료 방법.
  101. 제100항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 암 세포 세포자멸의 증가, 암 세포 성장의 억제, 암 세포 생존의 억제, 종양 형성의 억제, 암 세포 증식의 억제, 암 세포 전이의 억제, 세포 이동의 억제, 혈관형성의 억제, LIV-1 신호전달의 억제, LIV-1-매개 세포-세포 접착의 억제, LIV-1-매개 세포-세포 막 상호작용의 억제, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 상호작용의 억제, LIV-1-매개 세포-세포외 매트릭스 분해의 억제, 및 LIV-1 발현의 억제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
  102. 제100항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 세포 성장을 측정하는 시험관내 검정에서 아연 수송 단백질을 발현하는 암 세포의 암 세포 성장을 30% 이상 억제하는 것인 방법.
  103. 제100항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 세포자멸을 측정하는 시험관내 검정에서 접촉된 세포의 20% 이상에서 세포자멸을 유도하는데 있어서 약 1 mM 미만의 농도에서 효과적인 것인 방법.
  104. 제100항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 아연 수송을 억제하는 것인 방법.
  105. 제100항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 세포질 아연 수준을 조절하는 것인 방법.
  106. 제100항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 인테그린-매개 활성을 조절하는 것인 방법.
  107. 제101항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 대조군과 비교하여 아연 수송 단백질 발현을 25% 이상 억제하는 것인 방법.
  108. 제100항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 모노클로날 항체인 방법.
  109. 제108항에 있어서, 항체가 아연 수송 단백질 이외의 폴리펩티드에 대해 약 1×105 Ka 미만의 결합 친화도를 갖는 것인 방법.
  110. 제109항에 있어서, 모노클로날 항체가 세포의 세포자멸을 유도하는 것인 방법.
  111. 제109항에 있어서, 모노클로날 항체가 종양 형성을 억제하는 것인 방법.
  112. 아연 수송 단백질-관련 생물학적 활성의 조절 유효량의 제92항의 아연 수송 단백질 조정인자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 아연 수송 단백질-관련 생물학적 활성의 조절 방법.
  113. 제112항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 아연 수송 단백질에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체인 방법.
  114. 제100항 또는 제112항에 있어서, 환자가 유방암, 피부암, 식도암, 간암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 난소암, 다발성 골수종 및 흑색종 중 하나 이상을 갖고 있거나 그러한 소지가 있는 것인 방법.
  115. 아연 수송 단백질을 발현하는 암 세포의 성장 억제 유효량의 제92항의 아연 수송 단백질 조정인자와 아연 수송 단백질을 발현하는 암 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 아연 수송 단백질을 발현하는 암 세포의 성장 억제 방법.
  116. 제115항에 있어서, 아연 수송 단백질 조정인자가 아연 수송 단백질에 선택적으로 결합하고, 대조군과 비교하여 세포질 아연 수준을 30% 이상 조절하는 모노클로날 항체인 방법.
  117. 영상화제에 연결된 제92항의 아연 수송 단백질 조정인자를 포함하는 조성물과 샘플을 접촉시키고, 상기 샘플에서 영상화제의 국소화를 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 아연 수송 단백질을 발현하는 하나 이상의 암 세포의 검출 방법.
  118. 제117항에 있어서, 조성물이 영상화제에 접합된 아연 수송 단백질 항체를 포함하는 것인 방법.
  119. 제118항에 있어서, 영상화제가 18F, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 77Br, 87MSr, 86Y, 90Y, 99MTc, 111In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb 또는 206Bi인 방법.
  120. 유효량의 제92항의 아연 수송 단백질 조정인자를 둘 이상의 세포 중 하나 이상이 아연 수송 단백질을 발현하는 둘 이상의 세포를 포함하는 샘플에 투여하는 것을 포함하는, 둘 이상의 세포 중 하나 이상이 아연 수송 단백질을 발현하는 둘 이상의 세포의 상호작용 억제 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상호작용이 생체내인 방법.
  122. 아연 수송 단백질을 발현하는 세포를 후보 화합물 및 아연 수송 단백질 리간드와 접촉시키고, 아연 수송 활성이 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 아연 수송 활성의 억제가 암 억제제에 대한 지표인, 대조군과 비교하여 아연 수송 단백질의 과다발현을 특징으로 하는 암의 억제제 확인 방법.
  123. 아연 수송 단백질을 발현하는 세포를 후보 화합물 및 아연 수송 단백질 리간드와 접촉시키고, 아연 수송 단백질의 하류 마커가 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 하류 마커의 억제가 암 억제제에 대한 지표인, 대조군과 비교하여 아연 수송 단백질의 과다발현을 특징으로 하는 암의 억제제 확인 방법.
  124. 환자의 암 샘플에서 아연 수송 단백질의 차별적 발현의 증거를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 아연 수송 단백질의 차별적 발현의 증거가 아연 수송 단백질 조정인자에 대한 환자 감수성의 지표인, 아연 수송 단백질 조정인자에 대한 환자의 감수성 결정 방법.
  125. 제124항에 있어서, 아연 수송 단백질의 차별적 발현의 증거가 상기 환자의 암 샘플에서 아연 수송 단백질의 상향조절인 방법.
  126. a) 고체 지지체에 결합된 제92항의 항체를 포함하는 친화도 매트릭스를 제공하는 단계,
    b) 하나 이상의 아연 수송 단백질을 포함하는 샘플을 친화도 매트릭스와 접촉시켜서 친화도 매트릭스-아연 수송 단백질 복합체를 형성하는 단계,
    c) 친화도 매트릭스-아연 수송 단백질 복합체를 샘플의 나머지로부터 분리하는 단계, 및
    d) 아연 수송 단백질을 친화도 매트릭스로부터 방출하는 단계
    를 포함하는, 하나 이상의 아연 수송 단백질을 포함하는 샘플로부터의 아연 수송 단백질 정제 방법.
  127. a) 제92항의 항체 또는 그의 단편에 접합된 세포독성제 또는 진단제를 제공하는 단계, 및
    b) 아연 수송 단백질을 발현하는 하나 이상의 세포를 항체-작용제 또는 단편-작용제 접합체에 노출시키는 단계
    를 포함하는, 아연 수송 단백질을 발현하는 하나 이상의 세포로의 세포독성 제 또는 진단제 전달 방법.
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