KR20090080082A - 암을 치료, 진단 또는 검출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특히 암을 치료하기 위한 방법, 암 치료용 조성물, 및 암을 진단 및/또는 검출하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 FZD10 과다발현과 연관된 암을 치료, 진단 및 검출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
암, 치료, 진단, 검출, FZD10, 과다발현, 조성물

Description

암을 치료, 진단 또는 검출하는 방법 {METHODS OF TREATING, DIAGNOSING OR DETECTING CANCER}
본 발명은 일반적으로 종양학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암을 치료하기 위한 방법, 암 치료용 조성물, 및 암을 진단하고/하거나 검출하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
암은 미국에서 두 번째로 주요한 사망 원인이다. "암"은 많은 상이한 종류의 암, 즉, 유방, 전립선, 폐, 대장, 췌장암을 설명하기 위해 사용되지만, 각각의 종류의 암은 표현형 수준 및 유전자 수준에서 모두 상이하다. 암의 조절되지 않은 성장 특징은 하나 이상의 유전자의 발현이 돌연변이로 인해 조절곤란하게 되고, 세포 성장이 더 이상 제어될 수 없을 때 발생한다.
프리즐드 (Frizzled) 항원은 Wnt 단백질 리간드에 대한 결합 부위를 갖는 G 단백질 커플링된 수용체-유사 수용체의 패밀리이고, 이는 유전자 발현의 상향조절자 (upregulator)로서 작용하는 분비형 분자이다. 수용체-리간드쌍의 상기 패밀리의 멤버는 배아 발달에서 일정 역할을 하고, 세포 증식 및 배아발생 동안 세포의 최종 운명에서 일정한 역할을 수행할 수 있다. 대부분의 프리즐드 수용체는 β-카테닌 표준 (canonical) 신호전달 경로에 커플링되고, 이는 Dishevelled 단백질의 활성화, GSK-3 키나제의 억제, β-카테닌의 핵 축적 및 Wnt 표적 유전자의 활성화를 일으킨다. PKC 및 칼슘 흐름을 포함하는 제2 신호전달 경로가 일부 패밀리 멤버에 대해 보였지만, 상기 경로가 별개의 경로를 나타내는지 또는 표준 경로에 통합될 수 있는지는 아직 명확하지 않다.
18개의 Wnt 및 10개의 프리즐드 유전자가 존재하고, 이들은 모두 구조가 고도로 상동성이고, 이는 지금까지는 인간 게놈 데이타베이스로부터 확인되었다 (Science, 291:1304-1351 (2001)). 또한, 5개의 분비형 프리즐드 형태가 존재한다. 각각의 Fz 유전자는 큰 세포외 부분, 7개의 추정 막횡단 도메인, 및 세포질 테일을 갖는 내재형 (integral) 막 단백질을 코딩한다 ([Wang, et al., J. Biol. Chem. 271, 4468-4476(1996)]; [Vinson et al., Nature (London) 338, 263-264(1989)]). 세포외 부분의 NH2 말단 가까이에 FZ 패밀리의 다른 멤버들 사이에 잘 보존된 시스테인-풍부 도메인 (CRD)이 존재한다 (Wang, et al., J. Biol. Chem. 271, 4468-4476(1996)). 10개의 불변 시스테인을 포함한 110개의 아미노산 잔기로 이루어지는 CRD는 Wnt 리간드에 대한 추정 결합 부위이다 (Bhanot et al., Nature (London) 382, 225-230(1996)).
프리즐드 수용체는 이량체화할 수 있고, 상기 이량체화는 Wnt/β-카테닌 경로의 활성화와 상호관련된다 (Carron et al., Journal of Cell Science, 116:2541-2550 (2003)).
프리즐드-10 (FZD10)은 클로닝되고 특성화되었다 (Koike et al., Biochem Biophys Res Commun., 262(1):39-43(1999)). 뉴클레오티드 서열 분석에서는 인간 FZD10 유전자가 N-말단 시스테인-풍부 도메인과 C-말단 Ser/Thr-Xxx-Val 모티프를 갖는 581개 아미노산의 7-막횡단-수용체를 코딩하는 것을 보여주었다. 다량의 FZD10 mRNA (크기 4.0 kb)가 태반 및 태아 신장에 이어 태아 폐 및 뇌에서 검출되었다. 성인 뇌에서, FZD10 mRNA는 소뇌에서 풍부하였다. FZD10 유전자는 인간 염색체 12q24.33에 매핑되었다. FZD10은 프리즐드-9 (FZD9)와 65.7% 아미노산 동일성을 공유한다. FZD10 및 FZD9는 프리즐드 유전자 사이에서 서브패밀리를 구성한다.
암에서 일정 역할을 하는 분자를 조정하는 조성물 및 방법을 확인하는 것이 필요하다. 본 발명은 상기한 필요성과 다른 중요한 필요성에 관한 것이다.
<발명의 개요>
본 발명의 물질 및 방법은 당업계에서 상기한 필요성과 다른 관련 필요성을 만족시킨다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, FZD10 조정자 (modulator) 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 FZD10 조정자는 Dishevelled 인산화, c-Jun 인산화, 및 β-카테닌 인산화로 이루어지는 군 중에서 선택된 하나 이상의 활성을 갖는다. 다른 실시태양에서, 조성물이 주사가능한 무균 조성물을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 Dishevelled의 인산화를 감소시키고, c-Jun의 인산화를 감소시키고, β-카테닌의 인산화를 증가시키는 억제제인 조성물을 제공한다. 관련 실시태양에서, FZD10 조정자가 Dishevelled 의 인산화를 감소시키거나 FZD10 조정자가 Dishevelled에 대한 FZD10 결합을 억제하는 것인 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 올리고뉴클레오티드, 소분자, 모방체 (mimetic), 가용형 수용체, 데코이 (decoy), 또는 항체인 상기한 조성물을 제공한다. 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 적어도 1x108 Ka의 친화도로 FZD10에 결합하는 모노클로날 항체인 조성물을 제공한다. 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 적어도 1x107 Ka, 적어도 1x106 Ka, 적어도 1x105 Ka, 적어도 1x104 Ka의 친화도로 FZD10에 결합하는 모노클로날 항체인 조성물을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 FZD10에 선택적으로 결합하고 하나 이상의 FZD10-관련 생물학적 활성을 조정하는 모노클로날 항체인 조성물을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 (chimera) 항체이다. 관련 실시태양에서, 모노클로날 항체는 FZD10의 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프는 제1 세포외 도메인 (ECD), 제2 ECD, 제3 ECD, 제4 ECD 및 리간드-결합 도메인으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 또 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 FZD10의 ECD의 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 제1 ECD의 에피토프에 결합한다. 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 제1 ECD에 결합하지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 FZD9와 교차-반응하지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 다른 진단 또는 치료제에 컨쥬게이팅된다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 환자에게 치료 유효량의 상기한 FZD10 조정자를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서 암 또는 암 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 Dishevelled의 인산화를 감소시키는 것인 상기한 방법을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 대조군에 비해 FZD10 발현을 적어도 50% 억제하는 것인 상기한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 올리고뉴클레오티드, 소분자, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체, 또는 항체인 상기한 방법을 제공한다. 관련 실시태양에서, FZD10 조정자는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체, 또는 Fab 단편이다. 다른 실시태양에서, 항체가 표지되는 것인 상기한 방법을 제공한다. 관련 실시태양에서, 표지는 효소, 방사성 동위원소, 독소 또는 형광단이다.
다른 실시태양에서, 항체가 FZD10 이외의 폴리펩티드에 대해 약 1x105 Ka 미만의 결합 친화도를 갖는 것인 상기한 방법을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 모노클로날 항체인 상기한 방법을 제공한다. 관련 실시태양에서, 모노클로날 항체는 적어도 1x108 Ka의 친화도로 FZD10에 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 FZD10의 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프는 제1 ECD, 제2 ECD, 제3 ECD, 제4 ECD 및 리간드-결합 도메인으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 FZD10의 제1 ECD의 에피토프에 결합한다. 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체는 FZD10의 제1 ECD에 결합하지 않 는다. 다른 실시태양에서, 모노클로날 항체가 FZD9에 결합하지 않는 것인 상기한 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 모노클로날 항체가 Dishevelled의 인산화를 감소시키고, c-Jun의 인산화를 감소시키고, β-카테닌의 인산화를 증가시키는 것인 상기한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 암이 난소, 대장, 폐, 위 또는 자궁암인 상기한 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 올리고뉴클레오티드인 상기한 방법을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 상기한 방법은 환자에 대한 전통적인 암 치료제의 투여를 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기한 방법은 환자를 하나 이상의 화학요법, 방사선 요법 또는 수술을 이용하여 치료하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 암 증상이 통증, 사망, 체중 감소, 쇠약, 섭식 곤란, 혈변, 구역, 구토, 간 전이, 폐 전이, 뼈 전이, 복부 팽만감, 더부룩함 (bloating), 복막강 내의 체액, 질 출혈, 변비, 복부 팽만, 대장의 천공, 급성 복막염 (감염, 열, 통증), 토혈, 및 연하 곤란으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 상기한 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 환자에게 FZD10의 생물학적 활성을 조정하기 위해 효과적인 양의 상기한 FZD10 조정자를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 FZD10-관련 생물학적 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, FZD10 조정자는 FZD10에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체이다. 또 다른 실시태양에서, 환자는 하나 이상의 난소, 대장, 폐 또는 자궁암에 걸리거나 소인이 있 다. 또 다른 실시태양에서, FZD10 조정자는 항체이고, 생체내 치료 항체 유전자 전달을 통해 대상에게 투여된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 샘플 내에서 FZD10 발현의 증거의 존재 또는 부재를 검출하고 (여기서, 샘플 내의 FZD10 발현의 증거의 존재는 환자가 FZD10 요법에 대한 후보임을 나타내고, 샘플 내에 FZD10 발현의 증거의 부재는 환자가 FZD10 요법에 대한 후보가 아님을 나타낸다); 환자가 FZD10 요법에 대한 후보이면 치료 유효량의 상기한 조성물을 환자에게 투여하고; 환자가 FZD10 요법에 대한 후보가 아니면 전통적인 암 치료제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, FZD10 요법에 감수성인 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 관련 실시태양에서, FZD10의 발현은 대조군에 비해 적어도 30% 증가한다. 다른 관련 실시태양에서, FZD10의 발현은 대조군에 비해 적어도 50% 증가한다. 또다른 관련 실시태양에서, FZD10의 발현은 대조군에 비해 적어도 100% 증가한다.
다른 실시태양에서, FZD10 발현의 증거가 FZD10 RNA를 측정함으로써 검출되는 것인 상기한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, FZD10 발현의 증거는 FZD10 발현 산물을 측정함으로써 검출된다. 다른 실시태양에서, 환자가 하나 이상의 난소, 대장, 폐 또는 자궁암에 걸리거나 소인이 있는 것인 상기한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기한 방법은 환자에 대한 전통적인 암 치료제의 투여를 추가로 포함한다.
다른 실시태양에서, 치료 유효량의 상기한 FZD10 조정자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서 암 세포 성장을 억제하는 방법을 제 공한다. 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 FZD10에 특이적으로 결합하고 Dishevelled의 인산화를 감소시키는 모노클로날 항체인 상기한 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 환자에게 치료 유효량의 상기한 FZD10 조정자를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서 암 세포 표현형을 억제하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 암 세포 표현형이 연질 아가 내의 콜로니 형성 및 3차원 기저 막 또는 세포외 막 제제 내의 관상 (tubular) 네트워크 형성 중 하나 이상인 상기한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기한 방법은 환자에 대한 전통적인 암 치료제의 투여를 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기한 방법은 하나 이상의 화학요법, 방사선 요법 또는 수술을 사용하는 환자의 치료를 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 암 세포가 난소, 대장, 폐 또는 자궁암 세포로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 상기한 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 환자에게 영상화제에 연결된 상기한 FZD10 조정자를 포함하는 조성물을 투여하고, 환자에서 영상화제가 존재하는 부위를 검출하는 것을 포함하는, 환자에서 종양을 검출하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 소분자, 올리고뉴클레오티드, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체, 또는 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 상기한 방법을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 조성물이 영상화제에 컨쥬게이팅된 항-FZD10 항체를 포함하는 상기한 방법을 제공한다. 관련 실시태양에서, 영상화제는 18F, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 77Br, 87MSr, 86Y, 90Y, 99MTc, 111In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb 또는 206Bi이다.
다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 소분자, 올리고뉴클레오티드, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체, 또는 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 상기한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, FZD10 조정자가 FZD10에 선택적으로 결합하고 Dishevelled의 인산화를 감소시키는 모노클로날 항체인 상기한 방법을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 항체가 독성 효과기 분자에 컨쥬게이팅된 것인 상기한 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, CHO 또는 골수종 세포 내에서 항-FZD10 항체를 코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, CHO 또는 골수종 세포에서 항-FZD10 항체를 발현하는 방법을 제공하고, 여기서 항-FZD10 항체는 하나 이상의 FZD10-관련 생물학적 활성을 억제한다. 또 다른 실시태양에서, FZD10을 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, FZD10-관련 생물학적 활성이 유도되는지 결정하는 것을 포함하고, 여기서 조정된 FZD10-관련 생물학적 활성이 Dishevelled, c-Jun, 및 β-카테닌의 인산화로 이루어지는 군 중에서 선택되고, FZD10-관련 생물학적 활성의 조정은 화합물이 암 억제제임을 나타내는 것인, 대조군에 비해 FZD10의 과다발현을 특징으로 하는 암의 억제제를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 측면은 본 발명의 다음 상세한 설명에서 설명될 것이다.
도 1은 폐, 난소 및 자궁암에서 FZD10의 상향조절을 보여준다.
도 2는 LCM 절제된 대장암에서 FZD10의 상향조절을 보여준다.
도 3은 원발 대장, 폐 및 난소암 환자의 FZD10 정량적 RT-PCR을 보여준다.
도 4는 상이한 암 세포주에서 FZD10의 표면 발현을 보여준다.
도 5는 siRNA가 NCI-H460 세포에서 FZD10 단백질 및 mRNA의 표면 발현을 감소시키는 것을 보여준다.
도 6은 FZD10 녹다운 (knockdown)이 NCI-H460 NSCLC 세포주에서 성장을 억제하고 세포자멸을 유도하는 것을 보여준다.
도 7은 FZD10 녹다운이 EKVX NSCLC 세포주에서 성장을 억제하고 세포자멸을 유도하는 것을 보여준다.
도 8은 FZD10 녹다운이 APC 돌연변이된 대장암 세포주 SW620에서 성장을 억제하고 세포자멸을 유도하지 않는 것을 보여준다.
도 9는 FZD10 녹다운이 APC 돌연변이된 대장암 세포주 Colo320DM에서 성장을 억제하고 세포자멸을 유도하지 않는 것을 보여준다.
도 10은 항-FZD1-항체가 암 세포주에서 FZD10을 인식하는 것을 보여준다.
도 11은 FZD9 또는 FZD10의 과다발현이 Dvl2 및 Dvl3 모두의 과다-인산화를 일으킨 것을 보여준다.
본 발명은 암의 치료, 진단 및 영상화, 특히 FZD10-관련 암의 치료, 진단 및 영상화를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
<정의>
본원 전체에서 다양한 정의가 사용된다. 대부분의 단어는 당업자가 그 단어의 것이라고 생각할 의미를 갖는다. 아래에서 또는 본원의 다른 부분에서 구체적으로 정의한 단어는 대체로 및 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같이 본 발명의 문맥에서 제공되는 의미를 갖는다.
본 발명의 실시에서는 달리 지시하지 않으면 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약물학의 통상적인 방법을 사용할 것이고, 이는 당업계의 기술 범위 내에 있다. 그러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다 (예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)]; [Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)]; 및 [Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)] 참조).
본원에서 사용될 때, 단수형 관사 ("a", "an" 및 "the")는 내용이 명료하게 달리 지시하지 않는다면 복수 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항체"에 대한 참조는 2개 이상의 항체의 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "약"은 값의 +/- 30%, +/- 20%, +/- 10%, 또는 +/- 5%를 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 용어 "FZD10" 또는 "프리즐드-10"은 서열 2의 수용체, 또는 그의 자연 발생 스플라이스 (splice) 또는 대립유전자 변이체를 나타낸다. Wnt-1, Wnt3a (Munji, R. N et al., Developmental Biology 271(2): 605-605, 2004-abstract from Meeting), Wnt-2 (Saitoh, T et al., International Journal of Oncology 20(1): 117-120, 2002), Wnt-7a (Kawakami, Y. et al., Dev Growth Differ 42(6): 561-9, 2000), Wnt7b (Wang, Z. et al., Mol Cell Biol 25(12): 5022-30, 2005), Wnt-8 (Terasaki, H. et al., Int J Mol Med 9(2): 107-12, 2002), Wnt-3 및 비-WNT 리간드 HIG2 (Togashi, A. et al., Cancer Res 65(11): 4817-26, 2005)는 프리즐드-10의 리간드인 것으로 생각된다.
GeneCard에서, FZD10은 또한 FZ-10, 프리즐드 (초파리 (Drosophila)) 상동체 10, 프리즐드 상동체 10 (초파리), 프리즐드 10 전구체, 프리즐드-10, Fz-10, FzE7, FzE7, hFz10 및 hFz10로서 알려져 있다. FZD10의 서열은 기탁 번호 NM_007197에 기재되어 있다. 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열 1 및 서열 2에 기재되어 있다. 프리즐드-10은 추정 세포외 결합 도메인을 함유하는 서열 2의 위치 29-150에서 N-말단 시스테인-풍부 세포외 도메인을 갖는 581개 아미노산의 7-막횡단 수용체이다. 다른 도메인은 큰 제1 세포외 도메인으로서 서열 2의 위치 21-221; 제2 세포외 도메인으로서 서열 2의 위치 284-312; 제3 세포외 도메인으로서 서열 2의 위치 373-394; 제4 세포외 도메인으로서 서열 2의 위치 465-503; 제1 막횡단 도메인으로서 서열 2의 위치 226-246; 제2 막횡단 도메인으로서 서열 2의 위치 263-283; 제3 막횡단 도메인으로서 서열 2의 위치 312-332; 제4 막횡단 도메인으로서 서열 2의 위치 352-372; 제5 막횡단 도메인으로서 서열 2의 위치 394-414; 제6 막횡단 도메인으로서 서열 2의 위치 444-464; 제7 막횡단 도메인으로서 서열 2의 위치 503-523에 위치한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 교환가능하게 사용되고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 나타내고, 이는 코딩된 및 비-코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 용어는 융합 단백질, 비제한적으로 예를 들어 이종성 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, 이종성 및 상동성 리더 (leader) 서열을 갖는 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기를 갖거나 갖지 않는 것; 면역학적으로 태깅된 단백질 등을 포함한다.
용어 "개인", "대상", "숙주" 및 "환자"는 교환가능하게 사용되고, 진단, 치료 또는 요법이 요망되는 임의의 대상, 특히 인간을 나타낸다. 다른 대상은 소, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말 등을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시태양에서, 대상은 인간이다.
본원에서 사용될 때, "암"은 원발 또는 전이암을 나타낸다. 용어 "암 세포"는 형질전환되는 세포를 나타낸다. 이들 세포는 암에 걸린 환자로부터 단리될 수 있거나, 암성이 되도록 시험관 내에서 형질전환된 세포일 수 있다. 암 세포는 임의의 조직 또는 세포 배양주를 포함하는 많은 종류의 샘플로부터 유래할 수 있다. 일부 실시태양에서, 암 세포는 과다형성, 종양 세포, 또는 신생물이다. 일부 실시태양에서, 암 세포는 난소, 자궁, 대장, 식도, 유방, 전립선, 백혈병, 흑색종, 폐, 뇌, 간, 췌장 및 림프종 암으로부터 단리된다. 일부 실시태양에서, 암 세포는 공개적으로 이용가능한 확립된 세포주로부터 취한다. 일부 실시태양에서, 암 세포는 기존의 환자 샘플로부터 또는 암 세포를 포함하는 라이브러리로부터 단리된다. 일부 실시태양에서, 암 세포는 단리된 후 상이한 숙주에, 예를 들어, 이종이식편으로 이식된다. 일부 실시태양에서, 암 세포는 SCID 마우스 모델 내에 이식되어 사용된다. 일부 실시태양에서, 암은 난소, 대장, 폐 또는 자궁암이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "형질전환된"은 그의 자손에 안정하게 유전되는 세포의 특성의 임의의 변경을 나타낸다. 일부 바람직한 실시태양에서, "형질전환된"은 정상 세포의 암성 세포, 예를 들어, 종양을 유발할 수 있는 것으로의 변화를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 형질전환된 세포는 불멸화된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "전이"는 암의 기원, 예를 들어 원발 종양으로부터 먼 부위로 퍼진 암을 나타낸다. 전이 부위는 비제한적으로 뼈, 림프절, 폐, 간 및 뇌를 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "임상 종점 (endpoint)"은 암을 나타내는 측정가능한 사건을 나타낸다. 임상 종점은 비제한적으로 첫 번째 전이까지의 시간, 후속 전이까지의 시간, 전이의 크기 및/또는 수, 종양의 크기 및/또는 수, 종양의 위치, 종양의 침습성, 삶의 질, 통증 등을 포함한다. 당업자는 임상 종점을 결정하고 측정하는 능력이 있는 것으로 생각된다. 임상 종점을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "샘플"은 환자로부터의 생물학적 물질을 나타낸다. 본 발명에서 분석되는 샘플은 임의의 특정 종류에 제한되지 않는다. 샘플은 비-제한적인 예로서 단일 세포, 다수 세포, 조직, 종양, 생물학적 유체, 생물학적 분자, 또는 임의의 상기한 것의 상등액 또는 추출물을 포함한다. 그 예로는 생검으로부터 제거된 조직, 절제 동안 제거된 조직, 혈액, 소변, 림프 조직, 림프액, 뇌척수액, 점액 및 대변 샘플을 포함한다. 사용되는 샘플은 분석 포맷, 검출 방법 및 분석할 종양, 조직, 세포 또는 추출물의 성질에 따라 변할 것이다. 샘플을 제조하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 사용된 방법과 합치하는 샘플을 얻기 위해 쉽게 변경될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "생물학적 분자"는 폴리펩티드, 핵산 및 당류를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때, 용어 "조정하는"은 세포의 내부, 외부 또는 표면 상의 유전자, 단백질 또는 임의의 분자의 품질 또는 양의 변화를 나타낸다. 변화는 분자의 발현 또는 수준의 증가 또는 감소일 수 있다. 용어 "조정하다"는 또한 비제한적으로 증식, 분비, 부착, 세포자멸, 세포-대-세포 신호전달 등을 포함하는 생물학적 기능/활성의 품질 또는 양을 변화시키는 것을 포함한다. 예를 들어, "세포 분할을 조정하는" 문맥에서, 상기 용어는 세포 분할의 속도, 양 또는 정도에 영향을 미치는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 방법은 세포 분할을 완전히 억제할 것이다. 다른 실시태양에서, 방법은 세포 분할의 양을 감소시킬 것이다. 다른 실시태양에서, 방법은 세포 분할을 방지할 것이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "N-말단"은 단백질의 처음 10개의 아미노산을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "C-말단"은 단백질의 마지막 10개의 아미노산을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "세포-세포 상호작용"은 2개 이상의 세포들 사이의 상호작용을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 세포들 사이의 상호작용은 세포 신호를 일으킨다. 세포-세포 상호작용은 비제한적으로 예를 들어, PKH26 및 PKH67 (시그마 (Sigma))를 포함하는 상이한 형광 막 염료를 사용하여 표지된 동시-배양된 예비-표지된 세포들 사이의 막 교환의 관찰을 포함한 당업자에게 공지된 많은 방법을 통해 검출될 수 있다.
용어 "도메인"은 본원에서 사용될 때 생체분자의 공지의 또는 추측되는 기능에 기여하는 생체분자의 구조적 부분을 나타낸다. 도메인은 그의 구역 또는 부분과 공동연장성일 수 있고, 또한 그 구역의 전부 또는 일부에 추가로 특정 구역과 별개의 생체분자의 부분을 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "리간드 결합 도메인"은 상응하는 천연 서열 FZD10 수용체의 적어도 하나의 정성적인 결합 활성을 보유하는 수용체의 임의의 일부 또는 구역을 나타낸다.
용어 "구역"은 생체분자의 1차 구조의 물리적으로 인접한 부분을 나타낸다. 단백질의 경우에, 구역은 그 단백질의 아미노산 서열의 인접한 부분에 의해 규정된다. 일부 실시태양에서, "구역"은 생체분자의 기능과 연관된다.
용어 "부분"은 본원에서 사용될 때 생체분자의 1차 구조의 물리적으로 인접한 부분을 나타낸다. 단백질의 경우에, 부분은 그 단백질의 아미노산 서열의 인접한 부분에 의해 규정되고, 적어도 3-5개의 아미노산, 적어도 5-7개의 아미노산, 적어도 8-10개의 아미노산, 적어도 11-15개의 아미노산, 적어도 17-24개의 아미노산, 적어도 25-30개의 아미노산, 및 적어도 30-45개의 아미노산을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드의 경우에, 부분은 그 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열의 인접한 부분에 의해 규정되고, 적어도 9-15개의 뉴클레오티드, 적어도 18-30개의 뉴클레오티드, 적어도 33-45개의 뉴클레오티드, 적어도 48-72개의 뉴클레오티드, 적어도 75-90개의 뉴클레오티드, 및 적어도 90-130개의 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 생체분자의 부분들은 생물학적 활성을 갖는다.
본원에서 사용될 때, 용어 "효능제"는 FZD10에 결합하고 FZD10의 하나 이상의 생물학적 활성을 활성화시킬 수 있는 분자를 나타낸다. FZD10 효능제는 Wnt-1, Wnt-3 및 Wnt-7b를 포함하는 천연 FZD10 리간드, 및 FZD10에 결합하여 FZD10의 하나 이상의 생물학적 활성을 활성화시키는 항체, 다른 단백질 또는 소분자를 포함한다.
본원에서 사용될 때, 어구 "유도하다"는 활성의 자극을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 어구 "FZD10의 생물학적 활성"은 수용체의 활성화에 의해 영향을 받는 FZD10의 생물학적, 생리학적 또는 생화학적 활성을 나타낸다. FZD10은 FZD10의 리간드 또는 그의 돌연변이체, 올리고뉴클레오티드 조정자, 소분자, 모방체, 데코이 또는 항체를 포함한 FZD10 조정자에 의해 활성화되거나 억제될 수 있다. FZD10의 생물학적 활성의 예는 비제한적으로 RHOA, RAC, APC, β-카테닌, JNK, pS63c-Jun의 활성화, 세포 부착, 세포 이동, 세포 생존, 세포 증식, 세포 세포자멸, 수용체의 이량체화, 수용체의 내재화, Disheveled의 활성화, 및 β-카테닌의 유도 또는 안정화, 또는 임의의 2 이상 또는 3 이상의 상기한 활성 등을 포함한다.
본원에서 사용될 때, 어구 "FZD10-관련 세포/종양/샘플" 등은 비-암성 및/또는 비-전이 세포, 샘플, 종양 또는 다른 병리학에 비해 FZD10 발현의 증거의 증가를 특징으로 하는 세포, 샘플, 종양 또는 다른 병리학을 나타낸다. 일부 바람직한 실시태양에서, FZD10-관련 세포, 샘플, 종양 또는 다른 병리학은 비-전이 세포, 샘플, 종양 또는 다른 병리학에 비해 FZD10 발현의 증거의 증가를 특징으로 한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "조정자"는 암과 연관된 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 사건을 조정하는 조성물을 나타낸다. 일부 바람직한 실시태양에서, 조정자는 암과 연관된 하나 이상의 생물학적 활성을 억제한다. 일부 실시태양에서, 조정자는 소분자, 본원에서 정의한 바와 같은 항체, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체, 또는 본원에서 정의한 바와 같은 올리고뉴클레오티드 조정자이다. 일부 실시태양에서, 조정자는 리간드 결합을 차단함으로써 또는 리간드-결합 부위에 대해 경쟁함으로써 작용한다. 일부 실시태양에서, 조정자는 리간드 결합에 관계없이 작용한다. 일부 실시태양에서, 조정자는 리간드 결합 부위에 대해 경쟁하지 않는다. 일부 실시태양에서, 조정자는 암에 관련된 유전자 산물의 발현을 차단한다. 일부 실시태양에서, 조정자는 암에 관련된 2개 이상의 생체분자들의 물리적 상호작용을 차단한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 조정자는 하나 이상의 FZD10의 생물학적 활성을 유도하거나 억제한다. 일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 FZD10 발현을 억제한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "항체"는 표적 단백질 또는 그의 단편에 특이적인 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 이중기능적/이중특이적 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 상보성 결정 구역 (CDR)-그라프팅된 (grafted) 항체를 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 용어 "항체"는 무손상 분자뿐만 아니라 해당 항원 결정자에 결합할 수 있는 그의 단편, 예를 들어 Fab, F(ab')2 및 Fv를 나타낸다. 항체의 추가의 예는 완전 조립된 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 단일쇄 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 공학처리된 (engineered) 항체, 인간 항체, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody), 미니바디 (minibody), 선형 항체, 킬레이팅 재조합 항체, 인트라바디 (intrabody), 나노바디 (nanobody), 작은 모듈 (small modular) 면역약품 (SMIP), 항원-결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질, 낙타화 (camelized) 항체, VHH 함유 항체, 또는 항체의 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는 이들 항체의 임의의 하나의 뮤테인 (mutein), 및 목적하는 생물학적 활성 (예를 들어, FZD10의 세포외 도메인에 대한 결합)을 나타내는 한 상기한 것을 포함하는 재조합 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "에피토프"는 폴리펩티드의 항원 결정자를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 에피토프는 3개 이상의 아미노산을 에피토프에 독특한 공간적 입체형태로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 에피토프는 선형 또는 입체형태적 에피토프이다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 4개의 그러한 아미노산, 적어도 5-7개의 아미노산으로 이루어지고, 보다 대체로 적어도 8-10개의 그러한 아미노산으로 이루어진다. 아미노산의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵자기 공명을 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일련의 연결된 뉴클레오티드 잔기 또는 염기를 나타내고, 자연 발생 또는 인공적인 또는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드 조정자"는 안티센스 RNA 또는 DNA, siRNA 또는 RNAi, 리보자임 및 DNAzyme을 포함하고, 서열 1의 단편에 상보성이고 그의 단백질 생성물의 발현을 조정하는 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 연속적인 염기 (이는 비-천연, 변형된 염기를 포함할 수 있다)를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "데코이 수용체"는 FZD10 리간드에 결합할 수 있는 폴리펩티드, 모방체, 또는 다른 거대분자의 적어도 일부를 포함하는 수용체를 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "치료 유효량"은 치료 유효량의 의약을 개인에게 투여할 때 개인에서 하나 이상의 임상 종점, 암 세포의 성장 및/또는 생존, 또는 암 세포의 전이에서 감소 또는 역전으로서 관찰되는 의약 효과를 생성하는 의약의 양을 나타내는 것을 의미한다. 치료 유효량은 대개 활성 성분을 포함하지 않는 조성물을 유사한 상황의 개인에게 투여할 때 관찰되는 효과에 비해 이들이 갖는 효과에 의해 결정된다. 대상에 대한 정확한 유효량은 대상의 크기 및 건강, 병태의 성질 및 정도, 및 투여를 위해 선택되는 치료제 또는 치료제의 조합에 따를 것이다. 그러나, 주어진 상황에 대한 유효량은 일상적인 실험에 의해 결정되고 임상의의 판단 범위 내에 있다.
본원에서 사용될 때, 어구 "세포-세포 부착을 조정하는"은 하나의 세포와 다른 세포와의 부착 또는 세포 대 세포 접촉의 변화를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 세포 부착은 본 발명의 조정자에 의해 억제된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "와 조합으로" 또는 "와 함께"는 다른 치료 요법과 함께 본 발명의 FZD10 조정자의 투여를 나타낸다. 하나 이상의 FZD10 조정자를 포함하는 조성물은 암에 걸린 또는 암에 걸릴 소인이 있는 개인 또는 포유동물에게 투여될 수 있다. FZD10 조정자는 또한 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제, 또는 암 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 2개의 치료제의 동시 투여는 치료제들이 치료 효과를 발휘하는 기간이 겹치는 한, 치료제들을 동일한 시간에 또는 동일한 경로에 의해 투여하는 것을 요구하지 않는다. 동시의 또는 순차적인 투여가 고려되고, 상이한 날 또는 주의 투여도 고려된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "감수성"은 그를 위해 FZD10 요법이 허용되는 치료 방법인 환자, 즉, 긍정적으로 반응할 환자를 나타낸다. FZD10 요법에 감수성인 암 환자는 FZD10 요법에 감수성이 아닌 환자에 비해 높은 수준의 FZD10을 발현한다. FZD10 요법에 대한 우수한 후보가 아닐 수 있는 암 환자는 그들의 암 세포 내에 또는 상에 FZD10이 결핍되거나 낮은 수준의 FZD10을 갖는 종양 샘플을 갖는 암 환자를 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "검출하는"은 활성 (예를 들어, 유전자 발현) 또는 생체분자 (예를 들어, 폴리펩티드)의의 증거를 확립하거나, 발견하거나, 확인하는 것을 의미한다.
본원에서 사용될 때, 어구 "상동성 뉴클레오티드 서열", 또는 "상동성 아미노산 서열", 또는 그의 변형은 적어도 명시된 백분율의 상동성 (뉴클레오티드 수준 또는 아미노산 수준에서)을 특징으로 하는 서열을 나타내고, "서열 동일성"과 교환가능하게 사용된다. 상동성 뉴클레오티드 서열은 단백질의 이소형을 코딩하는 서열을 포함한다. 그러한 이소형은 예를 들어, RNA의 선택적 (alternative) 스플라이싱의 결과로서 동일한 유기체의 상이한 조직 내에서 발현될 수 있다. 별법으로, 이소형은 상이한 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 상동성 뉴클레오티드 서열은 포유동물을 포함하고 이로 제한되지 않는, 인간 이외의 종의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상동성 뉴클레오티드 서열은 또한 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열의 자연 발생 대립유전자 변이 및 돌연변이를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상동성 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환을 함유하고 그의 폴리펩티드가 동일한 결합 및/또는 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
% 상동성 또는 동일성은 디폴트 (default) 세팅을 이용하여 예를 들어, Gap 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group, 미국 위스콘신주 매디슨 유니버시티 리서치 파크))에 의해 결정할 수 있고, 이는 스미스 (Smith) 및 워터맨 (Waterman) (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)의 알고리즘을 이용한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 프로브와 표적 사이의 상동성은 약 50% 내지 약 60%이다. 일부 실시태양에서, 핵산은 서열 1 또는 그의 일부에 약 60%, 바람직하게는 약 70%, 보다 바람직하게는 약 80%, 보다 바람직하게는 약 85%, 보다 바람직하게는 약 90%, 보다 바람직하게는 약 92%, 보다 바람직하게는 약 94%, 보다 바람직하게는 약 95%, 보다 바람직하게는 약 97%, 보다 바람직하게는 약 98%, 보다 바람직하게는 약 99% 및 가장 바람직하게는 약 100% 상동성인 뉴클레오티드를 갖는다.
상동성은 또한 폴리펩티드 수준에서 존재할 수 있다. 일부 실시태양에서, 폴리펩티드는 서열 2 또는 그의 일부에 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 및 약 100% 상동성이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "프로브"는 가변 길이의 핵산 서열을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 프로브는 적어도 약 10개 및 많게는 약 6,000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 프로브는 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 50 또는 적어도 75개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브는 동일한, 유사한, 또는 상보성 핵산 서열의 검출에서 사용된다. 길이가 보다 긴 프로브는 대체로 천연 또는 재조합 공급원으로부터 얻어지고, 표적 서열에 고도로 특이적이고, 올리고머보다 훨씬 더 느리게 표적에 혼성화한다. 프로브는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고, PCR, 혼성화 막-기반, 계내 (in situ) 혼성화 (ISH), 형광 계내 혼성화 (FISH), 또는 ELISA-유사 기술에서 특이성을 갖도록 설계된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "혼합하는"은 하나 이상의 화합물, 세포, 분자 등을 동일한 영역 내에서 함께 화합시키는 과정을 나타낸다. 이는 예를 들어, 시험관, 페트리 디쉬, 또는 하나 이상의 화합물, 세포 또는 분자가 혼합되도록 허용하는 임의의 용기 내에서 수행될 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "단리된"은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 항체가 자연에서 발생하는 것과 상이한 환경 내에 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체, 또는 숙주 세포를 나타낸다. 세포를 단리하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 단리되는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 항체는 일반적으로 실질적으로 정제된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "실질적으로 정제된"은 그의 천연 환경으로부터 제거되고 그와 자연적으로 회합된 다른 성분이 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 98% 및 99% 존재하지 않는 화합물 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 항체)을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "결합"은 2개 이상의 생체분자 또는 화합물 사이의 물리적 또는 화학적 상호작용을 의미한다. 결합은 이온성, 비-이온성, 수소 결합, 반 데어 발스 (Van der Waals), 소수성 상호작용 등을 포함한다. 결합은 직접적 또는 간접적일 수 있고, 간접적인 결합은 다른 생체분자 또는 화합물의 효과를 통하거나 그러한 효과로 인한 것이다. 직접 결합은 다른 분자 또는 화합물의 효과를 통하거나 그러한 효과로 인해 일어나지 않고 대신에 다른 실질적인 화학적 중간체 없이 존재하는 상호작용을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "접촉하는"은 직접적으로 또는 간접적으로 하나의 분자를 제2 분자에 대해 물리적으로 근접하게 함께 놓는 것을 의미한다. 분자는 임의의 많은 버퍼, 염, 용액 등일 수 있다. "접촉하는"은 예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 핵산 분자를 함유하는 비이커, 미세적정 플레이트, 세포 배양 플라스크 또는 마이크로어레이 등에 넣는 것을 포함한다. 접촉은 또한 예를 들어, 항체를 폴리펩티드를 함유하는 비이커, 미세적정 플레이트, 세포 배양 플라스크 또는 마이크로어레이 등에 넣는 것을 포함한다. 접촉은 생체 내에서, 생체 외에서, 또는 시험관 내에서 일어날 수 있다.
본원에서 사용될 때, 어구 "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 프로브, 프라이머, 또는 올리고뉴클레오티드가 그의 표적 서열에 혼성화하지만 최소수의 다른 서열에 혼성화할 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 상황에서는 상이할 것이다. 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 그들의 적절한 상보체에 특이성을 갖고 혼성화할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열에 상보성인 프로브의 50%가 평형에서 표적 서열에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에)이다. 표적 서열은 일반적으로 과잉으로 존재하므로, Tm에서, 프로브의 50%가 평형에서 그들의 상보체에 혼성화한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0 M 나트륨 이온 미만, 일반적으로 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 (또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 3O℃ 및 보다 긴 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드에 대해 적어도 약 6O℃인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "중등 엄격성 조건"은 프로브, 프라이머, 또는 올리고뉴클레오티드가 그의 표적 서열에 혼성화하지만 제한된 수의 다른 서열에 혼성화할 조건을 나타낸다. 중등 조건은 서열-의존적이고, 상이한 상황에서는 상이할 것이다. 중등 조건은 당업자에게 잘 알려져 있고, 특히 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 2nd Edition (December 1989)]에 설명되어 있다.
본원에 설명된 핵산 조성물은 예를 들어, 폴리펩티드를 생산하기 위해, 생물학적 샘플 (예를 들어, 인간 세포의 추출물) 또는 상기 샘플로부터 제조된 cDNA 내에서 mRNA의 검출을 위한 프로브로서, 폴리뉴클레오티드의 추가의 카피를 생성하기 위해, 리보자임 또는 올리고뉴클레오티드 (단일 및 이중 가닥)를 생성하기 위해, 및 단일 가닥 DNA 프로브로서 또는 삼중 가닥 형성 올리고뉴클레오티드로서 사용될 수 있다. 본원에 설명된 프로브는 예를 들어, 샘플 내에서 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 암과 연관된 폴리펩티드에 특이적인 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있고, 상기 항체는 차례로 본원에서 보다 상세히 논의한 바와 같이 진단 방법, 예측 방법 등에 유용하다. 폴리펩티드는 또한 본원에서 보다 상세히 논의한 바와 같이 치료적 개입을 위한 표적으로서 유용하다. 본 발명의 항체는 또한 예를 들어, 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 방법 모두를 포함하여, 본 발명의 폴리펩티드를 정제하고, 검출하고, 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 생물학적 샘플 내의 본 발명의 폴리펩티드의 수준을 정성적으로 및 정량적으로 측정하기 위한 면역분석에서 유용하다 (예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)] 참조). 상기 및 다른 용도는 아래에서 보다 상세히 설명된다.
본원에서 사용될 때 용어 "영상화제"는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 검출될 수 있는 본 발명의 항체, 소분자 또는 프로브에 연결된 조성물을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 용어 "유전자 발현의 증거"는 유전자가 발현된다는 임의의 측정가능한 표시를 나타낸다.
용어 "제약상 허용되는 담체"는 치료제, 예를 들어 항체 또는 폴리펩티드, 유전자 및 다른 치료제의 투여를 위한 담체를 나타낸다. 상기 용어는 그 자체는 조성물을 투여받는 개인에게 해로운 항체의 생산을 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 제약학상 담체를 나타낸다. 적합한 담체는 큰 느리게 대사되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 액체 응집물 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다. 그러한 담체는 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 치료 조성물 내의 제약상 허용되는 담체는 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함할 수 있다. 습윤 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 또한 상기 비히클 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암의 특정한 예는 FZD10을 과다발현하는 암을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 FZD10이 세포 부착, 이동 또는 반발 (repulsion)에서 일정 역할을 하는 임의의 종양 세포-종류에 적용가능하다. 일부 실시태양에서, 암은 난소, 대장, 폐 또는 자궁암이다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 치료 및/또는 진단을 받을 수 있는 암은 FZD10의 과다발현을 특징으로 한다. 일부 실시태양에서, 그러한 암은 대조 비-암성 세포 또는 비-암성 조직에 비해 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300%의 FZD10의 과다발현을 나타낸다.
본 발명은 FZD10 과다발현과 연관된 질병 및 질환의 치료, 억제 및 관리, 및 상기 질병 및 질환의 증상의 치료, 억제 및 관리를 제공하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 일부 실시태양은 암 세포 증식 및 침습을 억제하는 조성물을 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 암 또는 암 전이의 치료, 억제 또는 관리를 위한 방법 및 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명의 추가의 조성물 및 방법은 본 발명의 FZD10 조정자와 조합으로 다른 활성 성분을 포함한다. 일부 실시태양에서, 방법은 하나 이상의 전통적인 암 치료제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 환자를 하나 이상의 화학요법, 방사선 요법 또는 수술로 치료하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 현재의 또는 표준 암 치료, 예를 들어 수술, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법 및 생물학적 요법에 부분적으로 또는 완전히 불응성이 된 암 또는 다른 과다증식 세포 질환 또는 질병의 치료, 억제 및 관리를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 암을 진단하고/하거나 암 진행을 예측하기 위해 본 발명의 FZD10 조정자, 특히 FZD10 항체를 사용하는 진단 및/또는 영상화 방법을 제공한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 종양 및/또는 전이를 영상화 및 국소화하는 방법, 및 진단 및 예측의 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 FZD10-관련 요법의 적합성을 평가하는 방법을 제공한다.
FZD10 조정자
본 발명은 특히, 암의 치료, 진단, 검출 또는 영상화를 위한 FZD10 조정자를 제공한다. 일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 올리고뉴클레오티드, 소분자, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체 또는 항체이다. 일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 RHOA, RAC, APC, β-카테닌, JNK, pS63c-Jun의 활성화, 세포 부착, 세포 이동, 세포 생존, 세포 증식, 세포자멸, 수용체의 이량체화, 수용체의 내재화, Disheveled의 인산화, 및 β-카테닌의 유도 또는 안정화, 또는 임의의 2 이상의, 또는 3 이상의 상기한 활성 등을 유도한다. 일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 세포내 어댑터 (adaptor) 단백질에 대한 FZD10 결합을 억제한다. 일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 세포내 어댑터 단백질, 예를 들어 Dishevelled에 대한 결합을 자극한다. 일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 c-Jun 및/또는 β-카테닌 경로를 억제하고/하거나 불활성화한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "세포내 어댑터 단백질"은 신호전달 복합체의 상이한 세그먼트를 연결하는 단백질을 나타낸다. 어댑터 단백질은 효소 활성을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 일부 실시태양에서, 어댑터 단백질은 Dishevelled이다.
일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 대조군에 비해 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 정도로 β-카테닌 인산화를 증가시키고/시키거나, c-Jun 인산화를 감소시키고/시키거나, Disevelled 인산화를 감소시킨다. 수용체 인산화의 수준을 결정하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 그들의 특성을 결정하도록 후보 FZD10 조정자를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법의 예를 본원에서 설명한다.
일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 FZD10 발현을 억제한다. 일부 실시태양에서, FZD10 발현은 대조군에 비해 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 억제된다. FZD10 발현의 수준을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
항체
본 발명은 FZD10 유전자에 의해 발현된 FZD10 폴리펩티드에 결합하고 바람직하게는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한다. 용어 "특이적으로 결합하는"은 항체가 다른 관련 폴리펩티드에 대한 그들의 친화도보다 그들의 표적 FZD10 폴리펩티드에 대해 실질적으로 더 큰 친화도를 갖는 것을 의미한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "항체"는 무손상 분자 및 그의 단편, 예를 들어 Fab, F(ab')2 및 Fv를 나타내고, 이는 해당 항원 결정자에 결합할 수 있다. 항체의 추가의 예는 완전 조립된 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 단일쇄 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 공학처리된 항체, 인간 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 선형 항체, 킬레이팅 재조합 항체, 인트라바디, 나노바디, 작은 모듈 면역약품 (SMIP), 항원-결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질, 낙타화 항체, VHH 함유 항체, 또는 항체의 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는 이들 항체의 임의의 하나의 뮤테인, 및 목적하는 생물학적 활성 (예를 들어, FZD10의 세포외 도메인에 대한 결합)을 나타내는 한 상기한 것을 포함하는 재조합 펩티드를 포함한다. "실질적으로 보다 큰 친화도"는 다른 관련 폴리펩티드에 대한 친화도에 비해 본 발명의 표적 FZD10 폴리펩티드에 대한 친화도에서 측정가능한 증가가 있음을 의미한다. 바람직하게는, 친화도는 표적 FZD10 폴리펩티드에 대해 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 106배 이상 더 크다.
바람직하게는, 항체는 FZD10에 높은 친화도로, 바람직하게는 10-4M, 10-5M, 10-6M 이하, 바람직하게는 10-7M, 10-8M 이하, 가장 바람직하게는 10-9M 또는 10-10M 이하의 해리 상수로 결합하고; 나노몰 미만의 친화도 (0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 nM 또는 그 미만)가 바람직하다. 항체는 FZD10의 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
FZD10 폴리펩티드가 예를 들어 면역요법을 위한 항체를 생성하기 위해 사용되어야 할 때, FZD10은 전장 단백질과 적어도 하나의 에피토프 또는 결정자를 공유할 것이다. 본원에서 "에피토프" 또는 "결정자"는 MHC의 문맥에서 항체 또는 T-세포 수용체를 생성하고/하거나 그에 결합할 단백질의 부분을 의미한다. 따라서, 대부분의 경우에, 보다 작은 FZD10 폴리펩티드로 제조된 항체는 전장 단백질에 결합할 수 있을 것이다. 다른 실시태양에서, 에피토프는 특유하고; 즉, 특유한 에피토프에 대해 생성된 항체는 교차-반응성을 거의 또는 전혀 보이지 않는다.
FZD10 유전자에 의해 코딩되는 임의의 폴리펩티드 서열은 폴리펩티드의 특정 바람직한 구역을 결정하기 위해 분석될 수 있다. 고 항원성의 구역은 항원 인식이 면역 반응의 개시의 과정에서 일어날 수 있는 환경에서 폴리펩티드의 표면 상에 노출될 가능성이 있는 폴리펩티드의 구역을 나타내는 값을 선택함으로써 DNASTAR 분석에 의한 데이타로부터 결정된다. 예를 들어, FZD10 유전자 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 DNASTAR 컴퓨터 알고리즘의 디폴트 파라미터를 이용하여 분석될 수 있다 (디엔에이스타, 인크. (DNASTAR, Inc., 미국 위스콘신주 매디슨); http://www.dnastar.com/).
바람직하게는, 본 발명의 항체는 FZD10의 비-보존된 구역에 특이적이다. '비-보존된 구역'은 프리즐드 패밀리의 다른 멤버와 더 낮은 상동성을 갖는 구역을 나타낸다. 바람직하게는, 이들 비-보존된 구역에서 다른 프리즐드 패밀리 멤버에 대한 유사성은 50%보다 낮다.
하나의 실시태양에서, 항-FZD10 항체는 FZD10에 대해 특이적이고, 프리즐드 패밀리의 다른 멤버 (예를 들어, FZD9)와 교차 반응하지 않는다. 별법으로, 항-FZD10 항체는 또한 풍부한 기능을 가질 수 있는 다른 FZD 패밀리 멤버를 차단한다. 다른 실시태양에서, 항-FZD10 항체는 또한 쥐 FZD10에 결합한다. 별법으로, 항-FZD10 항체는 쥐 FZD10과 교차 반응하지 않는다.
DNASTAR 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 일상적으로 얻을 수 있는 폴리펩티드 특색은 가니어-롭슨 (Garnier-Robson) 알파-구역, 베타-구역, 턴 (turn)-구역 및 코일 (coil)-구역 (Garnier et al. J. Mol. Biol., 120: 97 (1978)); 초우-파스만 (Chou-Fasman) 알파-구역, 베타-구역 및 턴-구역 (Adv. in Enzymol., 47:45-148 (1978)); 카이트-두리틀 (Kyte-Doolittle) 친수성 구역 및 소수성 구역 (J. Mol. Biol., 157:105-132 (1982)); 아이젠버그 (Eisenberg) 알파- 및 베타-양친매성 구역; 카플러스-슐츠 (Karplus-Schulz) 가요성 구역; 에미니 (Emini) 표면-형성 구역 (J. Virol., 55(3):836-839 (1985)); 및 고 항원성 지수의 제임슨-울프 (Jameson-Wolf) 구역 (CABIOS, 4(1):181-186 (1988))을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 카이트-두리틀 친수성 구역 및 소수성 구역, 에미니 표면-형성 구역, 및 고 항원성 지수의 제임슨-울프 구역 (즉, 제임슨-울프 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용하여 확인될 때 항원성 지수가 1.5 이상인 4개 이상의 인접한 아미노산을 함유하는)은 항원성에 대한 높은 정도의 가능성을 나타내는 폴리펩티드 구역을 결정하기 위해 일상적으로 사용될 수 있다. 단백질에 대한 항체를 제조하기 위한 하나의 방안은 단백질의 전부 또는 일부의 아미노산 서열의 선택 및 제조, 서열을 화학적으로 합성하고, 이를 적절한 동물, 대개 토끼, 햄스터 또는 마우스 내로 주사하는 것이다. 올리고펩티드는 친수성 구역 내에 놓여있는 올리고펩티드에 기반한 FZD10 단백질에 대한 항체의 생산을 위한 후보로서 선택될 수 있고, 이는 따라서 성숙 단백질에서 노출될 것 같다. 추가의 올리고펩티드는 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌 [Antigenicity Index, Welling, G. W. et al., FEBS Lett. 188:215-218 (1985)]을 이용하여 결정할 수 있다.
용어 "모노클로날 항체"는 본원에서 사용될 때 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 나타내고, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 적은 양으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 생성된다. 추가로, 일반적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 생성된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 생성된다. 그들의 특이성에 추가로, 모노클로날 항체는 균일 배양에 의해 합성되고, 상이한 특이성 및 특징을 갖는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 점에서 유리하다.
수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 집단의 항체로부터 얻어지는 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 설명된 하이브리도마 (hybridoma) 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 ([Clackson et al., Nature, 352:624628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)])에 설명된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스에 배정될 수 있다. 5개의 주요 클래스, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 또는 이소형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있다. 상이한 이소형은 상이한 효과기 기능을 갖는다; 예를 들어, IgG1 및 IgG3 이소형은 ADCC 활성을 갖는다.
"항체 단편"은 무손상 전장 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 구역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 소위 "Fab" 단편을 생산하고, 이는 각각 단일 항원-결합 부위 및 나머지 "Fc" 단편 (그의 이름은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다)을 갖는다. 펩신 처리는 2개의 "단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편을 갖는 F(ab')2 단편을 생성시키고, 이는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 Fv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성하도록 하는, VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해서는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "초가변" 구역은 항원-결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 구역은 상보성 결정 구역 또는 CDR로부터의 아미노산 잔기 (즉, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서 설명된 바와 같이 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인에서 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)) 및/또는 초가변 루프로부터의 잔기 (즉, 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에서 설명된 바와 같이 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3))를 포함한다.
"프레임워크 (framework)" 또는 FR 잔기는 초가변 구역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
폴리클로날 항체
폴리클로날 항체를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어, 면역화제 및 원하는 경우에 면역보강제 (adjuvant)의 1회 이상의 주사에 의해 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및/또는 면역보강제는 다수의 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에 주사될 것이다. 면역화제는 그 숫자의 핵산에 의해 코딩되는 단백질 또는 그의 단편 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화제를 면역화되는 포유동물에서 면역원성인 것으로 알려진 단백질에 컨쥬게이팅하는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 갑상선 글로불린, 및 대두 트립신 억제제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 면역보강제의 예는 프로인트 (Freund) 완전 면역보강제 및 MPL-TDM 면역보강제 (모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로스 디코르니노마이콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자가 선택할 수 있다.
모노클로날 항체
바람직하게는, 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 설명된 것과 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 일반적으로 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하도록 면역화제로 면역화시킨다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 면역화제는 대개 FZD10 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 바람직한 경우에 말초혈 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원이 바람직한 경우에 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화된 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 불멸화된 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 대체로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 내에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍되면, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 대개 HGPRT-결핍 세포의 성장의 방지하는 물질인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이다.
모노클로날 항체 기술은 연구, 진단 및 요법을 실시하는데 사용된다. 모노클로날 항체는 시험관내 진단 및 생체내 진단을 위한 방사성 면역분석, 효소-결합 면역흡착 분석, 면역세포병리학 및 유동 세포측정, 및 인간 질병의 면역요법에서 사용된다 (Waldmann, T. A. (1991) Science 252:1657-1662). 특히, 모노클로날 항체는 정상 조직을 피하면서 악성 병변을 표적화하는 것이 바람직한 암의 진단 및 요법에 널리 적용되었다 (예를 들어, 미국 특허 4,753,894 (Frankel 등); 4,938,948 (Ring 등); 및 4,956,453 (Bjorn 등) 참조).
FZD10에 대한 모노클로날 항체는 난소, 대장, 폐 또는 자궁암의 진단 방법에서 단독으로 또는 혈청 내의 L1 부착 분자의 검출을 위한 방법과 함께 사용될 수 있다.
항체 단편
용어 "항체"는 본원에서 사용될 때 당업계에 공지된 바와 같이 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함하는 항체 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적, 삼중특이적 항체 등; 미니바디; 킬레이팅 재조합 항체; 트리바디 (tribody); 바이바디 (bibody); 인트라바디; 나노바디; 작은 모듈 면역약품 (SMIP), 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질; 낙타화 항체; VHH 함유 항체, 키메라 항체 등, 및 전체 항체의 변형에 의해 생산되거나 재조합 DNA 기술을 이용하여 새로 (de novo) 합성된 항체 단편으로부터 형성된 다른 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH VL) 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 짝 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들은 다른 사슬의 상보성 도메인과 짝을 형성하게 되고 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 충분히 설명되어 있다.
항체의 파파인 소화는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 소위 "Fab" 단편 (VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어지는 1가 단편)을 생산하고, 이는 각각 단일 항원-결합 부위 및 나머지 "Fc" 단편 (그의 이름은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다)을 갖는다. 펩신 처리는 2개의 "단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편을 갖는 F(ab')2 단편 (힌지 구역에서 디술피드 브릿지로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편)을 생성시키고, 이는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 Fv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성하도록 하는, VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하여, 단일쇄 항체 (scFv)를 생성하고, 여기서 VL 및 VH 구역은 짝을 형성하여, 이들을 단일 단백질 사슬로서 제조되도록 하는 합성 링커를 통해 1가 분자를 형성한다 ([Bird et al., Science 242:423-426, 1988], 및 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988]). sFv의 검토를 위해서는 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 이루어진다.
추가의 항체 단편은 VH 도메인으로 이루어지는 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989)을 포함한다.
"선형 항체"는 한 쌍의 항원 결합 구역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 (tandem) Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다 (Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)).
펩티드 링커를 통해 (힌지가 없는) 또는 IgG 힌지를 통해 CH3에 융합된 scFv로 이루어지는 "미니바디"는 문헌 [Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):315-23]에 설명되어 있다.
경쇄가 없는 기능적 중쇄 항체는 대서양 수염 상어 (nurse shark) (Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995), 수염 상어 (wobbegong shark) (Nuttall et al., Mol. Immunol. 38:313-26, 2001) 및 낙타과 (Camelidae) ([Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-8, 1993]; [Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275: 413, 1998]), 예를 들어 낙타, 단봉낙타 (dromedary), 알파카 및 라마에서 자연 발생한다. 이들 동물에서 항원-결합 부위는 단일 도메인, 즉, VHH 도메인으로 감소된다. 이들 항체는 중쇄 가변 구역만을 사용하여 항원-결합 구역을 형성하고, 즉, 이들 기능적 항체는 구조 H2L2를 갖는 중쇄만의 동종이량체 ("중쇄 항체" 또는 "HCAb"로서 칭함)이다. 낙타화 VHH는 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 함유하고 CH1 도메인이 결핍되는 IgG2 및 IgG3 불변 구역과 재조합하는 것으로 보고되었다 (Hamers-Casterman et al., 상기 문헌). 예를 들어, 라마 IgG1은 통상적인 (H2L2) 항체 이소형이고, 여기서 VH는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 불변 구역과 재조합하는 반면, 라마 IgG2 및 IgG3은 CH1 도메인이 결핍되고 경쇄를 함유하지 않는 중쇄만의 이소형이다. 전통적인 VH만의 단편은 가용형 형태로 제조하기 어렵지만, 프레임워크 잔기를 보다 VHH와 유사하게 변경시키면 용해도 및 특이적 결합의 개선을 얻을 수 있다 (예를 들어, Reichman, et al. J Immunol Methods 1999, 231:25-38. 참조). 낙타화 VHH 도메인은 높은 친화도로 항원에 결합하고 (Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001), 용액 내에서 높은 안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002). 낙타화 중쇄를 갖는 항체를 생성하는 방법은 예를 들어 미국 특허 공개 20050136049와 20050037421에 설명되어 있다.
중쇄 항체의 가변 도메인은 분자 질량이 단지 15 kDa인 최소 완전 기능적 항원-결합 단편이므로, 상기 엔티티 (entity)는 나노바디로서 칭한다 (Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). 나노바디 라이브러리는 문헌 [Conrath et al., Antimicrob Agents Chemother 45:2807-12, 2001]에 설명된 바와 같이 면역화된 단봉낙타로부터, 또는 재조합 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
이중특이적 Fab-scFv ("바이바디") 및 삼중특이적 Fab-(scFv)(2) ("트리바디")의 생산은 문헌 ([Schoonjans et al., J Immunol. 165:7050-57, 2000] 및 [Willems et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003]에 설명되어 있다. 바이바디 또는 트리바디를 위해, scFv 분자는 VL-CL (L) 및 VH-CH1 (Fd) 사슬 중 하나 또는 둘 모두에 융합되어, 예를 들어, 트리바디 (2개의 scFv가 Fab의 C-말단에 융합된다), 또는 바이바디 (하나의 scFv가 Fab의 C-말단에 융합된다)를 생산한다.
인트라바디는 세포내 발현을 나타내고 세포내 단백질 기능을 조작할 수 있는 단일쇄 항체이다 ([Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990]; [Colby et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:17616-21, 2004]). 인트라바디 (세포내 구역 내에 항체 구성체를 보유하는 세포 신호 서열을 포함하는)는 문헌 ([Mhashilkar et al, EMBO J 14:1542-51, 1995] 및 [Wheeler et al., FASEB J. 17:1733-5. 2003])에 설명된 바와 같이 생산될 수 있다. 트랜스바디 (transbody)는 단백질 도입 도메인 (PTD)이 단일쇄 가변 단편 (scFv) 항체와 융합된 세포-침투성 항체이다 (Heng et al., Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).
표적 단백질에 특이적인 SMIP 또는 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질인 항체가 추가로 고려된다. 이들 구성체는 항체 효과기 기능을 수행하기 위해 필수적인 면역글로불린 도메인에 융합된 항원 결합 도메인을 포함하는 단일쇄 폴리펩티드이다 (예를 들어, WO03/041600, 미국 특허 공개 20030133939 및 미국 특허 공개 20030118592 참조).
다중특이적 항체
일부 실시태양에서, 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 다중특이적 (예를 들어 이중특이적, 삼중특이적 등) 모노클로날 항체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 이중특이적 항체는 FZD10의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 별법으로, 항-FZD10 아암 (arm)은 세포 방어 메카니즘을 FZD10-발현 세포에 집중하기 위해 백혈구 상의 촉발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 결합될 수 있다.
다른 예에서, 결합 특이성 중 하나는 FZD10 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 예를 들어, 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛, 바람직하게는 종양 특이적 또는 조직 특이적인 것에 대한 것이다. 그 예는 신장암 특이적 항원, 난소암 특이적 항원, 대장암 특이적 항원, 폐암 특이적 항원, 또는 자궁암 특이적 항원을 포함한다.
이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 FZD10을 발현하는 세포에 국소화시키기 위해 사용될 수 있다. 이들 항체는 FZD10-결합 아암, 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-60, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 다른 방안에 따라, 한 쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 공학처리될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 적어도 일부의 CH3 도메인을 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써, 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "공동 (cavity)"이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종-제품, 예를 들어 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다 (WO96/27011 (1996년 9월 6일 공개) 참조).
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종컨쥬게이트 (heteroconjugate)" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이종컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 공지되어 있고, 미국 특허 4,676,980에 많은 가교결합 기술과 함께 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 연결기를 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에서는 무손상 항체를 단백분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 설명한다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 복합화제 아비소산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 물질로서 사용될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 이. 콜라이 (E. coli)로부터 직접 회수된 Fab'-SH 단편은 시험관 내에서 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다 (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)).
문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 설명한다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 따로 분비되고, 유도된 시험관내 화학적 커플링에 의해 이중특이적 항체를 형성하였다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있고, 또한 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양액으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다 (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 구역에서 환원시켜 단량체를 형성한 후, 재-산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산을 위해 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에서 설명된 "디아바디" 기술이 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 메카니즘을 제공하였다.
단편은 동일한 사슬 상의 2개의 도메인들 사이에 짝을 형성하기에 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 구역 (VL)에 연결된 중쇄 가변 구역 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 짝을 형성하여, 2개의 항원-결합 부위를 형성하게 된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용에 의한 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 다른 전략이 또한 보고되었다 (문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994)] 참조).
별법으로, 이중특이적 항체는 문헌 [Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)]에 설명된 바와 같이 생산된 "선형 항체"일 수 있다. 간단히 설명하면, 이들 항체는 한 쌍의 항원 결합 구역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
2가를 초과하는 항체도 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (199I)). "킬레이팅 재조합 항체"는 표적 항원의 인접하고 비-겹치는 에피토프를 인식하고 두 에피토프에 동시에 결합하기에 충분히 가요성인 이중특이적 항체이다 (Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995).
다른 실시태양에서, FZD10에 대한 항체는 본원에 설명된 바와 같이 FZD10의 생물학적 기능을 감소 또는 제거할 수 있다. 즉, 항-FZD10 항체 (폴리클로날 또는 바람직하게는 모노클로날)의 첨가는 FZD10 활성을 감소 또는 제거할 수 있다. 일반적으로, 활성의 적어도 25% 감소가 검출되고, 적어도 약 50% 및 약 95-100% 감소가 예시적인 실시태양이다.
항체의 재조합 생산
항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입한다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열결정된다. 많은 벡터는 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 선택 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하고 이로 제한되지 않고, 그 예는 당업계에 잘 공지되어 있다.
당업자에게 잘 알려진 다양한 이종성 시스템이 재조합 폴리펩티드의 기능적 발현을 위해 이용가능하다. 상기 시스템은 세균 (Strosberg, et al., Trends in Pharmacological Sciences (1992) 13:95-98), 효모 (Pausch, Trends in Biotechnology (1997) 15:487-494), 몇몇 종류의 곤충 세포 (Vanden Broeck, Int. Rev. Cytology (1996) 164:189-268), 양서류 세포 (Jayawickreme et al., Current Opinion in Biotechnology (1997) 8: 629-634) 및 몇몇 포유동물 세포주 (CHO, HEK293, COS 등; Gerhardt, et al., Eur. J. Pharmacology (1997) 334:1-23)를 포함한다. 이들 예는 선충류로부터 얻은 세포주 (PCT 출원 WO 98/37177)를 포함한 다른 가능한 세포 발현 시스템의 사용을 배제하지 않는다.
키메라 , 인간화, 인간 공학처리 ( Human Engineering )™ 및 인간 항체
설치류 항체는 단독으로 또는 컨쥬게이트로서 인간에서 반복된 생체내 투여 시에 설치류 항체에 대하여 수여체에서 면역 반응; 소위 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 일으킬 것이다. HAMA 반응은 반복된 투약이 요구되는 경우에 약품의 유효성을 제한할 수 있다. 항체의 면역원성은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 친수성 중합체를 사용하는 항체의 화학적 변형에 의해 또는 항체 결합 구조를 보다 인간과 유사하게 만드는 유전 공학 방법을 사용함으로써 감소시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, FZD10에 대한 항체는 인간화 또는 키메라 항체이다. "인간화" 항체는 실질적으로 비-인간 종의 면역글로불린으로부터 유래하는 항원 결합 부위, 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반하는 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 갖는 분자를 나타낸다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에 융합된 완전 가변 도메인, 또는 가변 도메인 내에서 적절한 프레임워크 구역 상에 그라프팅된 상보성 결정 구역 (CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있고, 예를 들어, 인간 면역글로불린에 보다 가깝게 닮도록 변형될 수 있다. 별법으로, 인간화 항체는 비-인간 모 항체의 항원-결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하지만 인간에게 투여될 때 모 항체에 비해 감소된 면역원성을 보이는 키메라 항체로부터 유래될 수 있다. 어구 "키메라 항체"는 본원에서 사용될 때 대개 상이한 종으로부터 기원하는 2개의 상이한 항체로부터 유래된 서열을 함유하는 항체 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조)를 나타낸다. 일반적으로, 이들 키메라 항체에서, 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 구역은 하나의 종의 포유동물로부터 유래된 항체의 가변 구역을 모방하지만, 불변 부분은 다른 종으로부터 유래된 항체 내의 서열에 상동성이다. 가장 일반적으로, 키메라 항체는 인간 및 쥐 항체 단편, 일반적으로 인간 불변 구역 및 마우스 가변 구역을 포함한다. 키메라 모노클로날 항체 (여기서, 설치류 모노클로날 항체의 가변 Ig 도메인은 인간 불변 Ig 도메인에 융합된다)는 당업계에 공지된 표준 절차를 이용하여 생성될 수 있다 ([Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855]; 및 [Boulianne, G. L., et al., Nature 312, 643-646. (1984)] 참조). 일부 키메라 모노클로날 항체는 인간에서 보다 덜 면역원성인 것으로 입증되었지만, 마우스 가변 Ig 도메인은 여전히 유의한 인간 항-마우스 반응을 일으킬 수 있다.
인간화 항체는 인간 항체 (수여 항체)의 상보성 결정 구역 (CDR)을 목적하는 특이성, 친화도 및 용적을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 항체 (공여 항체)로부터의 것으로 교체함으로써 제조된다. 몇몇 경우에, 인간 "수여" 항체의 Fv 프레임워크 잔기는 "공여" 항체로부터의 상응하는 비-인간 잔기에 의해 교체된다. 인간화 항체는 또한 수여체 항체에서 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이고, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 구역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 잔기 (FR) 구역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열에 상응한다. 인간화 항체는 적합하게는 또한 면역글로불린 불변 구역 (Fc), 일반적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다 ([Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323 329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992)]). 상기 키메라 형태의 하나의 분명한 잇점은 예를 들어, 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 구역과 조합으로 예를 들어, 가변 구역이 비-인간 숙주 유기체로부터 쉽게 이용가능한 하이브리도마 또는 B 세포를 이용하여 현재 공지된 공급원으로부터 편리하게 유래될 수 있다는 점이다. 가변 구역은 제조의 용이성, 및 특이성이 그의 공급원에 의해 영향을 받지 않는다는 잇점을 갖지만, 인간의 것인 불변 구역은 항체가 주사될 때 비-인간 공급원으로부터의 불변 구역보다 인간 대상으로부터 면역 반응을 유도할 가능성이 더 적다. 그러나, 정의는 상기 특정한 예로 제한되지 않는다.
인간화 항체는 모 마우스 모노클로날 항체보다 인간에서 훨씬 덜 면역원성이기 때문에, 아나필락시스 (anaphylaxis)의 위험이 훨씬 더 적으면서 인간의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 이들 항체는 인간에 대한 생체내 투여를 포함하는 치료 용도에서, 예를 들어, 신생물성 질병의 치료를 위한 방사선 감작제로서 용도 또는 예를 들어, 암 요법의 부작용을 감소시키는 방법에서 용도에서 바람직할 수 있다. 비-인간 항체를 인간화하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 도입 잔기로서 칭해지고, 이는 대개 도입 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, 본질적으로 윈터 (Winter) 및 공동 연구자들 ([Jones et al., Nature 321:522 525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323 327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239:1534 1536 (1988)])의 방법에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 상기 인간화 항체는 키메라 항체 (미국 특허 4,816,567)이고, 여기서 실질적으로 무손상 미만의 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환되었다. 실제에서, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환되는 인간 항체이다.
그러나, CDR 그라프팅의 단점은 프레임워크 구역의 아미노산이 항원 결합에 기여할 수 있기 때문에, 및 CDR 루프의 아미노산은 2개의 가변 Ig 도메인의 회합에 영향을 미칠 수 있기 때문에 원래의 마우스 항체보다 실질적으로 더 낮은 결합 친화도를 갖는 인간화 항체를 생성시킬 수 있다는 점이다. 인간화 모노클로날 항체의 친화도를 유지하기 위해, CDR 그라프팅 기술은 원래의 마우스 항체의 프레임워크 구역에 가장 가깝게 닮은 인간 프레임워크 구역을 선택함으로써, 및 항원 결합 부위에 의한 컴퓨터 모델링에 의해 지원된 프레임워크 또는 CDR 내의 단일 아미노산의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 개선될 수 있다 (예를 들어, Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976).
항체를 인간화하는 하나의 방법은 비-인간 중쇄 및 경쇄 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 서열에 정렬시키고, 비-인간 프레임워크를 선택하여 상기 정렬에 기반한 인간 프레임워크로 교체하고, 인간화 서열의 입체형태를 예측하기 위해 분자 모델링하고, 모 항체의 입체형태에 비교하는 것을 포함한다. 상기 과정 이후, 인간화 서열 모델의 예측된 입체형태가 모 비-인간 항체의 비-인간 CDR의 입체형태에 가깝게 모방할 때까지 CDR의 구조를 교란시키도록 CDR 구역 내의 잔기를 반복 역 돌연변이시킨다.
비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위를 포함하는 많은 "인간화" 항체 분자, 예를 들어 인간 불변 도메인에 융합된 설치류 V 구역 및 그들의 연관된 CDR을 갖는 키메라 항체 ([Winter et al. (1991) Nature 349:293-299]; [Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224]; [Shaw et al. (1987) J Immunol. 138:4534-4538]; 및 [Brown et al. (1987) Cancer Res. 47:3577-3583]), 적절한 인간 항체 불변 도메인으로 융합하기 전에 인간 지지 FR 내로 그라프팅된 설치류 CDR ([Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536]; 및 [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]), 및 재조합 방식으로 베니어링된 (veneered) 설치류 FR에 의해 지지된 설치류 CDR (유럽 특허 공개 519,596 (1992년 12월 23일 공개))가 설명되었다.
인간화 항체는 예를 들어: (1) 비-인간 상보성 결정 구역 (CDR)을 인간 프레임워크 및 불변 구역 상에 그라프팅하거나 (당업계에서 "인간화하는"으로 칭하는 과정), 별법으로 (2) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 교체에 의해 이들을 인간-유사 표면으로 "덮는 (cloaking)" 것 (당업계에서 "베니어링"으로 칭하는 과정)을 포함한 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에서, 인간화 항체는 "인간화" 및 "베니어링된" 항체를 모두 포함할 것이다. 이와 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 로커스 (locus)를 내재성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 (transgenic) 동물, 예를 들어, 마우스 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 챌린지 (challenge) 시에, 인간 항체 생산이 관찰되고, 이는 유전자 재배열, 조립 및 항체 레파토리 (repertoire)를 포함한 모든 측면에서 인간에서 보이는 것을 가깝게 닮는다. 상기 방안은 예를 들어 각각 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016과 다음 학술 문헌 ([Marks et al., Bio/Technology 10, 779 783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368 856 859 (1994)]; [Morrison, Nature 368, 812 13 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845 51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65 93 (1995)]; [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A., 81:6851-6855 (1984)]; [Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)]; [Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988)]; [Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991)]; [Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994)]; 및 [Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991)])에 설명되어 있다. 어구 "상보성 결정 구역"은 함께 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 구역의 결합 친화도 및 특이성을 규정하는 아미노산 서열을 나타낸다 (예를 들어, [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publication No. 91-3242 (1991)] 참조). 어구 "불변 구역"은 효과기 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 나타낸다. 본 발명에서, 마우스 불변 구역은 인간 불변 구역에 의해 치환된다. 대상 인간화 항체의 불변 구역은 인간 면역글로불린으로부터 유래한다. 중쇄 불변 구역은 5개의 이소형: 알파, 델타, 엡실론, 감마 또는 뮤 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 항체를 인간화하는 하나의 방법은 비-인간 중쇄 및 경쇄 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 서열에 정렬시키고, 비-인간 프레임워크를 선택하여 상기 정렬에 기반한 인간 프레임워크로 교체하고, 인간화 서열의 입체형태를 예측하기 위해 분자 모델링하고, 모 항체의 입체형태에 비교하는 것을 포함한다. 상기 과정 이후, 인간화 서열 모델의 예측된 입체형태가 모 비-인간 항체의 비-인간 CDR의 입체형태에 가깝게 모방할 때까지 CDR의 구조를 교란시키도록 CDR 구역 내의 잔기를 반복 역 돌연변이시킨다. 상기 인간화 항체는 예를 들어 Ashwell 수용체를 통해 섭취 및 청소를 용이하게 하도록 더욱 유도체화될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,530,101과 5,585,089 참조).
인간 공학처리™
항체 가변 도메인의 인간 공학처리™는 스튜드니카 (Studnicka) (예를 들어, 미국 특허 5,766,886 (스튜드니카 등); [Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] 참조)에 의해 항체 분자의 결합 활성을 유지하면서 면역원성을 감소시키는 방법으로서 설명되었다. 상기 방법에 따르면, 각각의 가변 구역 아미노산에 치환 위험이 배정되었다. 아미노산 치환은 3개의 위험 카테고리 중 하나에 의해 구별된다: (1) 저 위험 변화는 항원 결합을 파괴하는 최저 기회를 가지면서 면역원성을 감소시키는 최대 가능성을 갖는 것이고; (2) 중등 위험 변화는 면역원성을 더욱 감소시키지만, 항원 결합 또는 단백질 폴딩 (folding)에 영향을 미치는 기회가 더 큰 것이고; (3) 고 위험 잔기는 결합을 위해 또는 항체 구조를 유지하기 위해 중요하고 항원 결합 또는 단백질 폴딩이 영향을 받을 최고 위험을 갖는 것이다. 프롤린의 3차원 구조적 역할로 인해, 프롤린에서의 변형이, 위치가 대개 저 위험 위치에 있는 경우에도 적어도 중등 위험 변화인 것으로 일반적으로 여겨진다.
설치류 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 구역은 항원 결합 또는 단백질 폴딩에 불리하게 영향을 미치는 것 같지 않지만, 인간 환경에서 면역원성을 감소시킬 가능성이 있는 것으로 결정된 위치에서 인간 아미노산을 치환하기 위해 다음과 같이 인간 공학처리된다™. "저 위험" 위치에 있고 상기 방법에 따른 변형에 대한 후보인 아미노산 잔기는 설치류 가변 구역의 아미노산 서열을 인간 가변 구역 서열과 정렬시킴으로써 확인된다. 임의의 인간 가변 구역, 예를 들어 개별 VH 또는 VL 서열 또는 인간 컨센서스 VH 또는 VL 서열, 또는 개별 또는 컨센서스 인간 생식계열 (germline) 서열이 사용될 수 있다. 임의의 수의 저 위험 위치, 또는 모든 저 위험 위치에서 아미노산 잔기가 변화될 수 있다. 예를 들어, 정렬된 쥐 및 인간 아미노산 잔기가 상이한 각각의 저 위험 위치에서, 설치류 잔기를 인간 잔기로 교체하는 아미노산 변형이 도입된다. 별법으로, 모든 저 위험 위치 및 임의의 많은 중등 위험 위치에서 아미노산 잔기가 변화될 수 있다. 이상적으로, 최저 면역원성을 달성하기 위해, 모든 저 및 중등 위험 위치가 설치류에서 인간 서열로 변화된다.
변형된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 구역을 함유하는 합성 유전자를 제작하고, 인간 γ 중쇄 및/또는 카파 경쇄 불변 구역에 연결시킨다. 임의의 인간 중쇄 및 경쇄 불변 구역은 IgA (임의의 서브클래스, 예를 들어 IgA1 또는 IgA2의), IgD, IgE, IgG (임의의 서브클래스, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의) 또는 IgM을 포함하는 인간 공학처리된™ 항체 가변 구역과 조합으로 사용될 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포 내로 도입하고, 생성되는 재조합 면역글로불린 산물을 얻고 특성화시킨다. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리 ([Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)])를 포함한 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해 콜 (Cole) 등과 뵈르너 (Boerner) 등의 기술이 또한 이용가능하다 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86 95 (1991)]). FZD10 폴리펩티드에 대한 인간 항체는 또한 인간 면역글로불린 로커스를 함유하도록 공학처리된 트랜스제닉 동물을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, WO 98/24893에서는 인간 Ig 로커스를 갖는 트랜스제닉 동물을 개시하고 있고, 여기서 동물은 내재성 중쇄 및 경쇄 로커스의 불활성화로 인해 기능적 내재성 면역글로불린을 생산하지 않는다. WO 91/10741에서는 또한 면역원에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 트랜스제닉 비-영장류 포유동물 숙주를 개시하고 있고, 여기서 항체는 영장류 불변 및/또는 가변 구역을 갖고, 내재성 면역글로불린을 코딩하는 로커스는 치환되거나 불활성화된다. WO 96/30498에서는 포유동물에서 면역글로불린 로커스를 변형시키기 위해, 예를 들어 불변 또는 가변 구역의 전부 또는 일부를 교체하여 변형된 항체 분자를 형성하기 위해 Cre/Lox 시스템의 사용을 개시하고 있다. WO 94/02602에서는 불활성화된 내재성 Ig 로커스 및 기능적 인간 Ig 로커스를 갖는 비-인간 포유동물 숙주를 개시하고 있다. 미국 특허 5,939,598에서는 트랜스제닉 마우스를 제조하는 방법을 개시하고 있고, 여기서 마우스는 내재성 중쇄가 결핍되고, 하나 이상의 이종성 불변 구역을 포함하는 외인성 면역글로불린 로커스를 발현한다.
상기 설명된 트랜스제닉 동물을 사용하여, 선택된 항원성 분자에 대해 면역 반응이 생성될 수 있고, 항체-생산 세포가 동물로부터 제거되어, 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 면역화 프로토콜, 면역보강제 등은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, WO 96/33735에 설명된 바와 같이 트랜스제닉 마우스의 면역화에 사용된다. 모노클로날 항체를 상응하는 단백질의 생물학적 활성 또는 생리학적 효과를 억제 또는 중화하는 능력에 대해 시험할 수 있다 (또한 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immune, 7:33 (1993)]); 및 미국 특허 5,591,669, 미국 특허 5,589,369, 미국 특허 5,545,807; 및 미국 특허 출원 20020199213, WO 96/34096 및 미국 특허 출원 20030194404; 및 미국 특허 출원 20030031667 참조). 미국 특허 출원 20030092125에서는 동물의 면역 반응을 목적하는 에피토프로 편향시키는 방법을 설명하고 있다. 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (미국 특허 5,567,610과 5,229,275 참조).
모노클로날 항체를 제조하기 위해 유용한 추가의 트랜스제닉 동물은 Medarex HuMAb-MOUSE(등록상표) (미국 특허 5,770,429 및 문헌 [Fishwild, et al., Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996]에 설명됨)을 포함하고, 이는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 재배열되지 않은 인간 항체 유전자로부터의 유전자 서열을 함유한다. HuMAb-MOUSE(등록상표)의 면역화는 표적 단백질에 대한 모노클로날 항체의 생산을 가능하게 한다.
또한, 문헌 [Ishida et al., Cloning Stem Cells. 4:91-102, 2002]에서는 TransChromo 마우스 (TCMOUSE™)을 설명하고 있고, 이는 인간 DNA의 메가염기-크기의 세그먼트를 포함하고, 전체 인간 면역글로불린 (hIg) 로커스를 포함한다. TCMOUSE는 IgG의 모든 서브클래스 (IgG1-G4)를 포함한 hIg의 전체 다양성 레파토리를 갖는다. 각종 인간 항원으로 TCMouse를 면역화시키면 인간 항체를 포함하는 항체 반응을 생성시킨다.
섬유상 박테리오파지의 표면 상에, 재조합 인간 항체 유전자의 레파토리 및 코딩된 항체 단편의 디스플레이를 제조하기 위한 기술의 개발은 인간 항체를 직접 제조하기 위한 수단을 제공하였다. 파지 기술에 의해 생산된 항체는 세균 내에서 항원 결합 단편 (보통 Fv 또는 Fab 단편)으로서 생산되고, 따라서 효과기 기능이 결핍된다. 효과기 기능은 2가지 전략 중 하나에 의해 도입될 수 있다: 단편은 포유동물 세포에서 발현을 위해 완전 항체로, 또는 효과기 기능을 촉발할 수 있는 제2 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체 단편으로 공학처리될 수 있다.
일반적으로, 항체의 Fd 단편 (VH-CH1) 및 경쇄 (VL-CL)은 PCR에 의해 따로 클로닝되고, 조합 파지 디스플레이 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이어서 이는 특정 항원에 대한 결합을 위해 선택될 수 있다. Fab 단편은 파지 표면 상에서 발현되고, 즉, 그를 코딩하는 유전자에 물리적으로 연결된다. 따라서, 항원 결합에 의한 Fab의 선택은 Fab 코딩 서열에 대해 동시-선택하고, 이는 후속적으로 증폭될 수 있다. 몇몇 라운드의 항원 결합 및 재-증폭 (패닝 (panning)으로 불리는 절차)에 의해, 항원에 특이적인 Fab가 농축되고 마지막으로 단리된다.
1994년에, "유도 선택 (guided selection)"으로 불리는 항체의 인간화를 위한 방안이 설명되었다. 유도 선택에서는 마우스 모노클로날 항체의 인간화를 위해 파지 디스플레이 기술력을 이용한다 ([Jespers, L.S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)] 참조). 이를 위해, 마우스 모노클로날 항체의 Fd 단편은 인간 경쇄 라이브러리와 조합으로 디스플레이될 수 있고, 이어서, 생성되는 하이브리드 Fab 라이브러리는 항원을 사용하여 선택될 수 있다. 그에 의해 마우스 Fd 단편은 선택을 유도하는 템플레이트를 제공한다. 후속적으로, 선택된 인간 경쇄는 인간 Fd 단편 라이브러리와 결합된다. 생성되는 라이브러리의 선택은 전적으로 인간 Fab를 생성시킨다.
파지-디스플레이 라이브러리로부터 인간 항체를 유도하기 위한 다양한 절차가 설명되었다 (예를 들어, 문헌 ([Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)]); 미국 특허 5,565,332 및 5,573,905; [Clackson, T., and Wells, J.A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)] 참조). 특히, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 항체의 시험관내 선택 및 진화는 강력한 도구가 되었다 ([Burton, D.R., and Barbas III, C.F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994)]; 및 [Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994)]; 미국 특허 출원 20020004215 및 WO92/01047; 미국 특허 출원 20030190317 (2003년 10월 9일 공개) 및 미국 특허 6,054,287; 미국 특허 5,877,293 참조).
문헌 [Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193] 및 미국 특허 출원 20030044772 (2003년 3월 6일 공개)에서는 포획 리프트 (lift)에 의해 파지-발현된 항체 라이브러리 또는 다른 결합 분자를 스크리닝하기 위한 방법을 설명하고 있고, 상기 방법은 고체 지지체 상에 후보 결합 분자의 고정을 포함한다.
항체 생성물은 본원에서 "스크리닝 방법" 표제의 섹션에 설명된 바와 같은 분석을 사용하여 또는 당업계에 공지된 임의의 적합한 분석을 사용하여 활성에 대해 및 본 발명의 치료 방법에서의 적합성에 대해 스크리닝될 수 있다.
본 발명에서, 상기 열거된 FZD10 폴리펩티드 및 그의 변이체는 상기 설명한 바와 같이 트랜스제닉 동물을 면역화하기 위해 사용될 수 있다. 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조되고, 항체의 특이성은 단리된 FZD10 폴리펩티드를 사용하여 시험된다. 인간 또는 영장류 FZD10 또는 그의 에피토프의 제조를 위한 방법은 화학적 합성, 재조합 DNA 기술, 또는 생물학적 샘플로부터의 단리를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 펩티드의 화학적 합성은 예를 들어, 고상 펩티드 합성의 전통적인 메리필드 (Merrifeld) 방법 (본원에 참고로 포함되는 문헌 [Merrifeld, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963]), 또는 Rapid Automated Multiple Peptide Synthesis 시스템 상의 FMOC 전략 (이. 아이. 듀퐁 드 네므와 컴퍼니 (E. I. du Pont de Nemours Company), 미국 델라웨어주 윌밍턴) (본원에 참고로 포함되는 문헌 [Caprino and Han, J. Org. Chem. 37:3404, 1972])에 의해 수행될 수 있다.
폴리클로날 항체는 항원을 주사한 후 적절한 간격에서 후속적인 추가접종 (boost)에 의해 토끼 또는 다른 동물을 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 대체 동물은 마우스, 래트, 닭, 기니 피그, 양, 말, 원숭이, 낙타 및 상어를 포함한다. 동물을 출혈시키고, FZD10의 작용을 차단하는 능력에 기반하여 대체로 ELISA 또는 생물분석에 의해 정제된 FZD10 단백질에 대해 혈청 분석한다. 조류 종, 예를 들어, 닭, 칠면조 등을 사용할 때, 항체는 난황으로부터 단리할 수 있다. 모노클로날 항체는 면역화된 마우스로부터의 비 세포 (splenocyte)를 계속 복제하는 종양 세포, 예를 들어 골수종 또는 림프종 세포와 융합시킴으로써 밀스테인 (Milstein) 및 콜러 (Kohler)의 방법 후에 제조될 수 있다 (본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Milstein and Kohler, Nature 256:495-497, 1975]; [Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46], [Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981]). 이어서, 이렇게 형성된 하이브리도마 세포를 제한 희석법에 의해 클로닝하고, 상등액을 ELISA, RIA 또는 생물분석에 의해 항체 생산에 대해 분석한다.
표적 단백질을 인식하고 특이적으로 결합하는 항체의 독특한 능력은 단백질의 과다발현을 치료하기 위한 방안을 제공한다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 환자를 FZD10에 대한 특이적 항체로 치료함으로써, FZD10 폴리펩티드의 과다발현을 포함하는 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
FZD10에 특이적인 항체 (폴리클로날 또는 모노클로날)는 상기 논의한 바와 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 쥐 또는 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술에 의해 생산될 수 있거나, 별법으로, FZD10을 인식하고 결합할 수 있는 항체의 생산을 유도하기 위해 FZD10 단백질 또는 그의 면역학적 활성 단편, 또는 항-개별특이형 항체 또는 그의 단편을 동물에게 투여할 수 있다. 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE, 또는 조류 종의 경우에 IgY를 포함하고 이로 제한되지 않는 항체의 임의의 클래스로부터 및 항체의 임의의 서브클래스로부터의 것일 수 있다.
아미노산 서열 변이체
돌연변이유발을 위해 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 구역의 확인을 위해 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 설명된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 (scanning) 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 전하를 띈 잔기, 예를 들어 arg, asp, his, lys 및 glu), 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미치도록 중성 또는 음전하를 띈 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체된다. 이어서, 치환에 대한 기능적인 감수성을 나타내는 아미노산 위치는 추가의 또는 다른 변이체를 치환의 부위에 또는 치환의 부위를 위해 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 예정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 구역에서 수행하고, 발현된 항체 변이체를 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그 (tag) 또는 샐비지 (salvage) 수용체 에피토프에 융합된 항체 (항체 단편 포함)를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서 폴리펩티드에 대한 융합 (이는 항체의 혈청 반감기를 증가시킨다)을 포함한다.
용어 "에피토프 태깅된 (tagged)"은 에피토프 태그에 융합된 항체를 나타낸다. 에피토프 태그 폴리펩티드는 그에 대한 항체가 제조될 수 있는 에피토프를 제공하기 위해 충분한 잔기를 갖지만, 항체의 활성을 저해하지 않도록 충분히 짧다. 에피토프 태그는 그에 대한 항체가 실질적으로 다른 에피토프와 교차-반응하지 않도록 바람직하게는 충분히 독특하다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기, 및 대체로 약 8-50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 9-30개의 잔기)를 갖는다. 그 예는 flu HA 태그 폴리펩티드와 그의 항체 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)); 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그와 그의 항체 (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990))를 포함한다. 다른 예시적인 태그는 니켈 킬레이션을 이용하여 표지된 화합물의 단리를 허용하는 폴리-히스티딘 서열, 일반적으로 약 6개의 히스티딘 잔기이다. 다른 표지 및 태그, 예를 들어 FLAG(등록상표) 태그 (이스트만 코닥 (Eastman Kodak, 미국 뉴욕주 로체스터))는 잘 알려져 있고 당업계에서 일상적으로 사용되고, 본 발명에 포함된다.
또 다른 종류의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항체 분자 내에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고, 그의 자리에 상이한 잔기가 삽입된다. 임의의 초가변 또는 CDR 구역 또는 프레임워크 구역 내의 치환적 돌연변이유발이 고려된다. 보존적 치환을 표 1에 나타낸다. 대부분의 보존적 치환은 "바람직한 치환" 표제 하에 나타낸다. 그러한 치환이 생물학적 활성을 변화시키지 않으면, 표 1에서 "예시적인 치환"으로 부르거나 아미노산 클래스를 참조하여 아래에 더욱 설명되는 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입시킬 수 있고, 생성물을 스크리닝한다.
Figure 112009028604632-PCT00001
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 치환의 영역에서 폴리펩티드 백본의 구조를 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태로서, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크 (bulk)를 유지하는데 대한 그들의 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 여러 집단으로 나누어진다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
보존적 치환은 아미노산을 그의 클래스의 다른 멤버로 교체하는 것을 포함한다. 비-보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 멤버를 다른 클래스의 멤버로 교체하는 것을 포함한다.
모노클로날, 인간, 인간화 또는 변이체 항체의 적합한 입체형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 분자의 산화적 안정성을 개선하고 비정상 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 이와 반대로, 시스테인 결합(들)은 그의 안정성을 개선하기 위해 항체에 첨가될 수 있다 (특히 항체가 항체 단편, 예를 들어 Fv 단편인 경우).
친화도 포화는 모 항체의 CDR 내에 치환을 갖는 항체 변이체를 제조하고 스크리닝하고, 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성, 예를 들어 결합 친화도를 갖는 변이체를 선택하는 것을 포함한다. 그러한 치환적 변이체를 생성하기 위한 편리한 방식은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 포화이다. 간단히 설명하면, 몇몇 초가변 구역 부위 (예를 들어 6-7개 부위)를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성시킨다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합체로서 섬유상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 그들의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다.
알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 구역 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기와 이웃 잔기는 본원에 상술된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 설명된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.
예를 들어, 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키고/하거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위를 첨가하여, 모 항체에 비해 변형된 당화 패턴을 갖는 항체 변이체가 또한 제조될 수 있다.
항체의 당화는 대개 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 나타낸다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 폴리펩티드 내의 상기 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 당화 부위를 생성한다. 따라서, N-연결된 당화 부위는 하나 이상의 이들 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 항체에 첨가될 수 있다. O-연결된 당화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 나타내지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신이 또한 사용될 수 있다. O-연결된 당화 부위는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 원래의 항체의 서열에 삽입하거나 치환함으로써 항체에 첨가될 수 있다.
변경된 효과기 기능
항체의 다른 변형이 고려된다. 예를 들어, 암을 치료하는데 있어서 항체의 유효성을 향상시키기 위해 예를 들어, 본 발명의 항체를 효과기 기능, 예를 들어, 반감기, CDC 또는 ADCC 활성에 관하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)이 Fc 구역 내에 도입될 수 있어서, 상기 구역 내에 사슬간 디술피드 결합 형성을 허용한다. 이렇게 생성된 동종이량체성 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 치사 및 항체-의존 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 ([Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B.J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)] 참조). 향상된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체성 항체는 또한 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)]에 설명된 바와 같이 이종이중기능적 가교-링커를 사용하여 제조할 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 구역을 갖는 항체가 공학처리될 수 있어서, 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다 (Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989) 참조). 또한, CDR 내의 서열은 항체가 MHC Class II에 결합하고 원치않는 헬퍼 T-세포 반응을 촉발하도록 할 수 있는 것으로 나타났다. 보존적 치환은 항체가 결합 활성을 보유하지만 원치않는 T-세포 반응을 촉발하는 그의 능력을 잃도록 할 수 있다. 또한 그 전문을 본원에 참고로 포함하는 문헌 [Steplewski et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1988;85(13):4852-6]을 참조하고, 여기서는 쥐 가변 구역이 인간 감마 1, 감마 2, 감마 3 및 감마 4 불변 구역과 연결된 키메라 항체를 설명하였다. 또한 그 전문을 본원에 참고로 포함하는 문헌 [Presta et al., Biochem Soc Trans. 2002;30(4):487-90]을 참조하고, 여기서는 특이적 Fc 감마 수용체 (R)에 대한 결합만을 개선하거나 한 종류의 Fc 감마 R에 대한 결합을 동시에 개선하고, 다른 종류에 대한 결합을 감소시키는 IgG1의 Fc 구역에서 몇몇 위치가 발견된 것을 설명하였다. 이어서, Fc 감마 RIIIa에 대한 결합이 개선된 선택된 IgG1 변이체를 시험관내 항체-의존 세포성 세포독성 (ADCC) 분석으로 시험하였고, 말초혈 단핵 세포 또는 내추럴 킬러 세포가 사용될 때 ADCC의 향상을 보여주었다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 예를 들어, 종양 침투를 증가시키기 위해 무손상 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 상기한 경우에, 예를 들어, 반감기를 증가시키기 위해 항체 단편에 PEG 또는 다른 수용성 중합체, 예를 들어 다당류 중합체와 같은 분자를 첨가함으로써 그의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 또한 예를 들어, 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체 단편 내로 포함시킴으로써 (예를 들어, 항체 단편에서 적절한 구역의 돌연변이에 의해 또는 에피토프를 펩티드 태그 내로 포함시키고, 이어서 예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의해 두 단부에서 또는 중간에서 항체 단편에 융합시킴으로써) 달성할 수 있다 (예를 들어, WO96/32478 참조).
추가로, 항체는 예를 들어, 그들의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 컨쥬게이션에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 각각의 항체 분자는 하나 이상 (즉, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 중합체 분자에 부착될 수 있다. 중합체 분자는 바람직하게는 링커 분자에 의해 항체에 부착된다. 중합체는 일반적으로 합성 또는 천연 발생 중합체, 예를 들어 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알켄, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체, 또는 분지되거나 분지되지 않은 다당류, 예를 들어 동종- 또는 이종-다당류일 수 있다. 바람직한 중합체는 폴리옥시에틸렌 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. PEG는 실온에서 물에 용해성이고, 일반식 R(O--CH2--CH2)nO--R (여기서, R은 수소 또는 보호기, 예를 들어 알킬 또는 알칸올기일 수 있다)을 갖는다. 바람직하게는, 보호기는 1 내지 8개의 탄소를 갖고, 보다 바람직하게는 메틸이다. 기호 n은 양의 정수, 바람직하게는 1 내지 1,000, 보다 바람직하게는 2 내지 500이다. PEG는 바람직한 평균 분자량이 1000 내지 40,000, 보다 바람직하게는 2000 내지 20,000, 가장 바람직하게는 3,000 내지 12,000이다. 바람직하게는, PEG는 적어도 하나의 히드록시기, 보다 바람직하게는 말단 히드록시기를 갖는다. 억제제 상의 유리 아미노기와 반응하도록 바람직하게 활성화되는 것은 상기 히드록시기이다. 그러나, 반응성기의 종류 및 양은 본 발명의 공유 컨쥬게이팅된 PEG/항체를 달성하기 위해 변화될 수 있음이 이해될 것이다. 바람직한 중합체 및 이를 펩티드에 부착시키는 방법은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; 및 4,609,546에 나타나 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 것을 책임지는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 구역의 에피토프를 나타낸다.
샐비지 수용체 결합 에피토프는 바람직하게는 Fc 도메인의 1 또는 2개의 루프로부터 임의의 하나 이상의 아미노산 잔기가 항체 단편의 유사한 위치로 전달되는 구역을 구성한다. 훨씬 더 바람직하게는, Fc 도메인의 1 또는 2개의 루프로부터 3개 이상의 잔기가 전달된다. 에피토프가 Fc 구역 (예를 들어, IgG의)의 CH2 도메인으로부터 취해져서 항체의 CH1, CH3 또는 VH 구역, 또는 하나 초과의 그러한 구역에 전달되는 것이 훨씬 더 바람직하다. 별법으로, 에피토프는 Fc 구역의 CH2 도메인으로부터 취해져서 항체의 CL 구역 또는 VL 구역 또는 두 구역으로 전달된다. 또한, Fc 변이체 및 이들의 샐비지 수용체와의 상호작용을 설명하는 국제 특허 출원 WO 97/34631 및 WO 96/32478을 참조한다.
따라서, 본 발명의 항체는 인간 Fc 부분, 인간 컨센서스 Fc 부분, 또는 Fc 샐비지 수용체와 상호작용하는 능력을 보유하는 그의 변이체, 예를 들어 디술피드 결합에 관여하는 시스테인이 변형 또는 제거되는 변이체, 및/또는 N-말단 및/또는 하나 이상의 N-말단 20개의 아미노산에 첨가되는 met가 제거되는 변이체, 및/또는 C1q 결합 부위와 같은 보체와 상호작용하는 구역이 변경 또는 제거되는 변이체, 및/또는 ADCC 부위가 변경 또는 제거되는 변이체를 포함할 수 있다 (예를 들어, Molec. Immunol. 29(5): 633-9 (1992) 참조).
선행 연구에서는 FcR에 대한 인간 및 쥐 IgG 상의 결합 부위를 주로 IgG 잔기 233-239로 이루어지는 하부 힌지 구역에 매핑하였다. 다른 연구에서는 추가의 넓은 세그먼트, 예를 들어 인간 Fc 수용체 I에 대해 Gly316-Lys338, 인간 Fc 수용체 III에 대해 Lys274-Arg301 및 Tyr407-Arg416을 제안하거나, 하부 힌지 외부의 몇몇 특이적 잔기, 예를 들어 쥐 Fc 수용체 II와 상호작용하는 쥐 IgG2b에 대해 Asn297 및 Glu318을 발견하였다. 인간 Fc 수용체 IIIA를 갖는 인간 IgG1 Fc 단편의 3.2-Å 결정 구조의 보고에서는 IgG1 잔기 Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299 및 Ala327-Ile332를 Fc 수용체 IIIA에 대한 결합에 관여하는 것으로서 서술하였다. 결정 구조에 기초하여, 하부 힌지 (Leu234-Gly237)에 추가로, IgG CH2 도메인 루프 FG (잔기 326-330) 및 BC (잔기 265-271) 내의 잔기가 Fc 수용체 IIA에 대한 결합에서 일정 역할을 할 수 있음이 제안되었다 (그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001)] 참조). Fc 수용체 결합 부위 내의 잔기의 돌연변이는 ADCC 또는 CDC 활성과 같은 효과기 기능을 변경하거나, 반감기를 변경할 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 잠재적인 돌연변이는 하나 이상의 잔기의 삽입, 결실 또는 치환, 예를 들어 알라닌을 사용한 치환, 보존적 치환, 비-보존적 치환, 또는 상이한 IgG 서브클래스로부터 동일한 위치에서 상응하는 아미노산 잔기로의 교체 (예를 들어, IgG1 잔기를 그 위치에서 상응하는 IgG2 잔기로 교체)를 포함한다.
쉴즈 (Shields) 등은 모든 인간 Fc 수용체에 대한 결합에 관여되는 IgG1 잔기가 힌지에 근접한 CH2 도메인 내에 위치하고, 다음과 같은 2개의 카테고리에 포함되는 것으로 보고하였다: 1) 모든 FcR과 직접 상호작용할 수 있는 위치는 Leu234-Pro238, Ala327, 및 Pro329 (및 가능하게는 Asp265)를 포함하고; 2) 탄수화물 성질 또는 위치에 영향을 미치는 잔기는 Asp265 및 Asn297을 포함한다. Fc 수용체 II에 대한 결합에 영향을 미치는 추가의 IgG1 잔기는 다음과 같다: (최대 효과) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298 및 (적은 효과) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378 및 Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A 및 D270A는 결합을 감소시켰다. 모든 FcR에 대한 상기 확인된 잔기에 추가로, Fc 수용체 IIIA에 대한 결합을 40% 이상 감소시키는 추가의 IgG1 잔기는 다음과 같다: Ser239, Ser267 (오직 Gly만), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338, 및 Asp376. FcRIIIA에 대한 결합을 개선시킨 변이체는 T256A, K290A, S298A, E333A, K334A 및 A339T를 포함한다. Lys414는 FcRIIA 및 FcRIIB에 대한 결합에서 40% 감소를 보였고, Arg416은 FcRIIA 및 FcRIIIA에 대해 30% 감소를 보였고, Gln419는 FcRIIA에 대해 30% 감소 및 FcRIIB에 대해 40% 감소를 보였고, Lys360은 FcRIIIA에 대해 23% 개선을 보여주었다 (또한 [Presta et al., Biochem. Soc. Trans. (2001) 30, 487-490] 참조).
예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,194,551에서는 아미노산 위치 329, 331 또는 322 (Kabat 넘버링 사용)에서 인간 IgG Fc 구역에서 돌연변이를 함유하는, 변경된 효과기 기능을 갖는 변이체를 설명하고, 그의 일부는 감소된 C1q 결합 또는 CDC 활성을 보인다. 다른 예로서, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,737,056에서는 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 (Kabat 넘버링 사용)에서 인간 IgG Fc 구역에서 돌연변이를 함유하는, 변경된 효과기 또는 Fc-감마-수용체 결합을 갖는 변이체를 설명하고, 그의 일부는 감소된 ADCC 또는 CDC 활성과 연관된 수용체 결합 프로필을 보인다. 이들 중에서, 아미노산 위치 238, 265, 269, 270, 327 또는 329에서 돌연변이는 FcRI에 대한 결합을 감소시키는 것으로 진술되고, 아미노산 위치 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 또는 439에서 돌연변이는 FcRII에 대한 결합을 감소시키는 것으로 진술되고, 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 또는 437에서 돌연변이는 FcRIII에 대한 결합을 감소시키는 것으로 진술된다.
그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,624,821에서는 쥐 항체의 C1q 결합 활성이 중쇄의 아미노산 잔기 318, 320 또는 322를 돌연변이시킴으로써 변경될 수 있고, 잔기 297 (Asn)을 교체하는 것은 용해 활성을 제거하는 것으로 보고하였다.
그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 20040132101에서는 아미노산 위치 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328 또는 332 (Kabat 넘버링 사용) 또는 위치 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 또는 332 (Kabat 넘버링 사용)에서 돌연변이를 갖는 변이체를 설명하고, 이 중 위치 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 또는 332에서 돌연변이는 ADCC 활성을 감소시키거나, Fc 감마 수용체에 대한 결합을 감소시킬 수 있다.
그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Chappel et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 88(20):9036-40]에서는 IgG1의 세포친화 활성이 그의 중쇄 CH2 도메인의 고유한 특성임을 보고하였다. IgG1의 아미노산 잔기 234-237 중 임의의 것에서 단일 점 돌연변이는 그의 활성을 유의하게 저하시키거나 제거하였다. 전체 결합 활성을 회복하기 위해 모든 IgG1 잔기 234-237 (LLGG)를 IgG2 및 IgG4로 치환하는 것이 요구되었다. 전체 ELLGGP 서열 (잔기 233-238)을 함유하는 IgG2 항체는 야생형 IgG1보다 더 활성인 것으로 관찰되었다.
그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Isaacs et al., J Immunol. 1998; 161(8):3862-9]에서는 Fc 감마R 결합에 중요한 모티프 내의 돌연변이 (글루타메이트 233에서 프롤린으로, 류신/페닐알라닌 234에서 발린으로, 및 류신 235에서 알라닌으로)가 표적 세포의 고갈을 완전히 방지하는 것으로 보고하였다. 글루타메이트 318에서 알라닌으로의 돌연변이는 마우스 IgG2b의 효과기 기능을 제거하고, 또한 인간 IgG4의 효력을 감소시켰다.
그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Armour et al., Mol Immunol. 2003; 40(9):585-93]에서는 야생형 IgG1보다 적어도 10배 덜 효율적으로 활성화 수용체 Fc감마RIIa와 반응하지만 억제성 수용체 Fc감마RIIb에 대한 그의 결합은 단지 4배 감소되는 IgG1 변이체를 확인하였다. 돌연변이는 아미노산 233-236의 구역 내에 및/또는 아미노산 위치 327, 330 및 331에서 이루어졌다 (또한 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 WO 99/58572 참조).
그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Xu et al., J Biol Chem. 1994; 269(5):3469-74]에서는 IgG1 Pro331을 Ser으로 돌연변이시키면 C1q 결합을 현저하게 감소시키고, 용해 활성을 실질적으로 제거하는 것으로 보고하였다. 이와 반대로, IgG4에서 Ser331을 Pro로 치환시키면 IgG4 Pro331 변이체에 부분 용해 활성 (40%)을 제공하였다.
그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Schuurman et al.,. Mol Immunol. 2001; 38(1): 1-8]에서는 중쇄간 결합 형성에 관여하는 힌지 시스테인 중의 하나, 즉 Cys226를 세린으로 돌연변이시키면 보다 안정한 중쇄간 연결을 생성시키는 것으로 보고하였다. IgG4 힌지 서열 Cys-Pro-Ser-Cys를 IgG1 힌지 서열 Cys-Pro-Pro-Cys로 돌연변이시키면 또한 중쇄 사이의 공유 상호작용을 현저하게 안정화시킨다.
그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Angal et al., Mol Immunol. 1993; 30(1):105-8]에서는 IgG4에서 아미노산 위치 241에서 세린을 프롤린 (IgG1 및 IgG2에서 그 위치에서 발견되는)으로 돌연변이시키면 균일한 항체의 생산을 일으키고, 또한 원래의 키메라 IgG4에 비해 혈청 반감기를 연장시키고 조직 분포를 개선하는 것으로 보고하였다.
본 발명은 또한 효과기 활성을 변경시키는 변경된 탄수화물 구조를 갖는 항체 분자, 예를 들어 개선된 ADCC 활성을 보이는 푸코실화 (fucosylation)가 부재하거나 감소된 항체 분자의 생산을 고려한다. 이들 달성하기 위한 다양한 방식이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, ADCC 효과기 활성은 FcγRIII 수용체에 대한 항체 분자의 결합에 의해 매개되고, 이는 CH2 도메인의 Asn-297에서 N-연결된 당화의 탄수화물 구조에 의존적인 것으로 나타났다. 비-푸코실화된 항체는 상기 수용체에 증가된 친화도로 결합하고, FcγRIII-매개된 효과기 기능을 천연의 푸코실화된 항체보다 더 효율적으로 촉발한다. 예를 들어, 알파-1,6-푸코실 트랜스퍼라제 효소가 녹아웃된 CHO 세포 내에서 비-푸코실화된 항체의 재조합 생산은 100배 증가된 ADCC 활성을 갖는 항체를 생성시킨다 [Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. 2004 Sep 5; 87(5):614-22]. 유사한 효과는 예를 들어, siRNA 또는 안티센스 RNA 처리를 통한 푸코실화 경로에서 상기 또는 다른 효소의 활성을 감소시키거나, 효소(들)을 녹아웃시키도록 세포주를 공학처리하거나, 선택적 당화 억제제와 함께 배양하는 것을 통하여 달성할 수 있다 [Rothman et al., Mol Immunol. 1989 Dec; 26(12):1113-23]. 일부 숙주 세포 균주, 예를 들어 Lec13 또는 래트 하이브리도마 YB2/0 세포주는 자연적으로 보다 낮은 푸코실화 수준을 갖는 항체를 생산한다 ([Shields et al., J Biol Chem. 2002 Jul 26; 277(30):26733-40]; [Shinkawa et al., J Biol Chem. 2003 Jan 31; 278(5):3466-73]). 예를 들어 GnTIII 효소를 과다발현하는 세포 내에서 항체를 재조합 방식으로 생산하는 것을 통한 이등분된 탄수화물의 수준의 증가가 또한 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 결정되었다 (Umana et al., Nat Biotechnol. 1999 Feb; 17(2):176-80). 2개의 푸코스 잔기 중 단지 하나의 부재도 ADCC 활성을 증가시키기 위해 충분할 수 있는 것으로 예측되었다 (Ferrara et al., Biotechnol Bioeng. 2006 Apr 5;93(5):851-61).
다른 공유 변형
항체의 공유 변형도 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이들은 적용가능하다면 화학적 합성에 의해 또는 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조할 수 있다. 항체의 다른 종류의 공유 변형은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내로 도입된다.
시스테이닐 잔기는 가장 일반적으로 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예를 들어 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드과 반응하여 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디술피드, 메틸 2-피리딜 디술피드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응에 의해 유도체화된다.
히스티딜 잔기는 pH 5.5-7.0에서 디에틸피로카르보네이트와의 반응에 의해 유도체화되고, 이는 상기 물질이 히스티딜 측쇄에 대해 비교적 특이적이기 때문이다. 파라-브로모페나실 브로마이드가 또한 유용하고; 반응은 바람직하게는 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 내에서 pH 6.0에서 수행된다.
라이시닐 및 아미노-말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응한다. 이들 물질을 사용한 유도체화는 라이시닐 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 갖는다. α-아미노-함유 잔기를 유도체화하기 위해 적합한 다른 시약은 이미도에스테르, 예를 들어 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드리드, 트리니트로벤젠술폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온, 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매된 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 몇몇 통상적인 시약, 특히 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 관능기의 높은 pKa 때문에 반응이 알칼리성 조건에서 수행되는 것을 요구한다. 추가로, 이들 시약은 라이신의 기 및 아르기닌 엡실론-아미노기와 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특이적 변형은 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 분광 표지를 티로실 잔기 내로 도입함으로써 이루어질 수 있다. 가장 일반적으로, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄이 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성하기 위해 사용된다. 방사성 면역분석에서 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조하기 위해 티로실 잔기를 125I 또는 131I를 사용하여 요오드화시킨다.
카르복실 측쇄기 (아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드 (R-N=C=N-R' (여기서, R 및 R'는 상이한 알킬기임), 예를 들어 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카르보디이미드이다))와의 반응에 의해 선택적으로 변형된다. 추가로, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 종종 탈아미드화되어 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기가 된다. 이들 잔기는 중성 또는 염기성 조건 하에 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화 형태는 본 발명의 범위 내에 있다.
다른 변형은 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
다른 종류의 공유 변형은 글리코시드를 항체에 화학적으로 또는 효소적으로 커플링하는 것을 포함한다. 이들 절차는 N- 또는 O-연결된 당화에 대한 당화 능력을 갖는 숙주 세포 내에서 항체의 생산을 요구하지 않는 점에서 유리하다. 사용된 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 술프히드릴기, (d) 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것과 같은 유리 히드록실기, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 WO87/05330 (1987년 9월 11일 공개)와 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 설명되어 있다.
항체 상에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성할 수 있다. 화학적 탈당화는 항체를 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 동등한 화합물에 노출시키는 것을 필요로 한다. 상기 처리는 항체를 무손상으로 남기면서, 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 절단을 일으킨다. 화학적 탈당화는 문헌 ([Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52(1987)] 및 [Edge et al. Anal. Biochem., 118: 131(1981)])에 설명되어 있다. 항체 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350(1987)]에 설명된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다.
항체의 또 다른 종류의 공유 변형은 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리옥시에틸화 소르비톨, 폴리옥시에틸화 글루코스, 폴리옥시에틸화 글리세롤, 폴리옥시알킬렌, 또는 다당류 중합체, 예를 들어 덱스트란 중 하나에 연결하는 것을 포함한다. 상기 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 미국 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192, 4,179,337, 4,766,106, 4,179,337, 4,495,285, 4,609,546 또는 EP 315 456 참조).
유전자 요법
적절한 세포로의 치료 항체의 전달은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방안의 사용에 의해, 예를 들어 물리적 DNA 전달 방법 (예를 들어, 리포좀 또는 화학적 처리)의 사용에 의해 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 또는 레트로바이러스)의 사용에 의해 생체 외에서, 계내, 또는 생체 내에서 유전자 요법을 통해 수행할 수 있다. 예를 들어, 생체내 요법을 위해, 목적하는 항체를 코딩하는 핵산을 단독으로 또는 벡터, 리포좀 또는 침전물과 함께 대상에 직접 주사할 수 있고, 일부 실시태양에서는 항체 화합물의 발현이 요망되는 부위에 주사할 수 있다. 생체외 치료를 위해, 대상의 세포를 제거하고, 핵산을 이들 세포 내로 도입하고, 변형된 세포를 직접 또는 예를 들어, 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화하여 대상에게 되돌려 보낸다 (예를 들어 미국 특허 4,892,538과 5,283,187 참조). 핵산을 생존가능 세포 내로 도입하기 위해 다양한 기술이 이용가능하다. 기술은 핵산이 배양된 세포 내로 시험관 내에서 또는 의도된 숙주의 세포에서 생체 내에서 전달되는지에 따라 변한다. 시험관 내에서 포유동물 세포로 핵산의 전달을 위해 적합한 기술은 리포좀, 전기천공, 마이크로주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란 및 인산칼슘 침전의 사용을 포함한다. 핵산의 생체외 전달을 위한 일반적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
다른 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 I 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스) 및 지질-기반 시스템을 사용한 형질감염을 포함한다. 핵산 및 형질감염제는 임의로 마이크로입자와 회합된다. 예시적인 형질감염제는 인산칼슘 또는 염화칼슘 동시-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 4급 암모늄 양친매성 (amphiphile) DOTMA ((디올레오일옥시프로필) 트리메틸암모늄 브로마이드, Lipofectin으로서 깁코-비알엘 (GIBCO-BRL)로부터 시판됨)) ([Felgner et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417]; [Malone et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 6077-6081]); 매달린 트리메틸암모늄 헤드를 갖는 친지성 글루타메이트 디에스테르 (Ito et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132); 대사가능한 모 지질, 예를 들어 양이온성 지질 디옥타도데실아미도 글리실스퍼민 (DOGS, Transfectam, 프로메가 (Promega)) 및 디팔미토일포스파티딜 에탄올아밀스퍼민 (DPPES) ([J.P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864]; [J.P. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986]); 대사가능한 4급 암모늄 염 (DOTB, N-(1-[2,3-디올레오일옥시]프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 (DOTAP) (뵈링거 만하임 (Boehringer Mannheim)), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디올레오일 에스테르, ChoTB, ChoSC, DOSC) (Leventis et al. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241); 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일] 콜레스테롤 (DC-Chol), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE)/3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol)의 1 대 1 혼합물 (Gao et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), 스퍼민, 스퍼미딘, 리포폴리아민 (Behr et al., Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389), 친지성 폴리라이신 (LPLL) (Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), 과잉의 포스파티딜콜린/콜레스테롤을 갖는 [[(1,1,3,3-테트라메틸부틸)크레속시]에톡시]에틸]디메틸벤질암모늄 히드록시드 (DEBDA 히드록시드) (Balias et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)/DOPE 혼합물 (Pinnaduwage et al., (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), 글루탐산 (TMAG)과 DOPE, CTAB, DEBDA, 디도데실암모늄 브로마이드 (DDAB)의 친지성 디에스테르, 및 포스파티딜에탄올아민과의 혼합물로 스테아릴아민 (Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525), DDAB/DOPE (TransfectACE, 깁코 비알엘), 및 올리고갈락토스 함유 지질을 포함한다. 전달의 효율을 증가시키는 예시적인 형질감염 향상제는 예를 들어, DEAE-덱스트란, 폴리브렌, 라이소좀-파괴성 펩티드 (Ohmori N I et al., Biochem Biophys Res Commun Jun. 27, 1997;235(3):726-9), 콘드로이탄-기반 프로테오글리칸, 황산화 프로테오글리칸, 폴리에틸렌이민, 폴리라이신 (Pollard H et al. J Biol Chem, 1998 273 (13):7507-11), 인테그린-결합 펩티드 CYGGRGDTP, 선형 덱스트란 구당류, 글리세롤, 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오시드간 연결에 매어진 콜레스테릴기 (Letsinger, R.L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: (17):6553-6), 라이소포스파티드, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 및 1-올레오일 라이소포스파티딜콜린을 포함한다.
일부 상황에서, 핵산에 핵산-함유 벡터를 표적 세포로 지정하는 물질을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 "표적화" 분자는 표적 세포 상의 세포-표면 막 단백질에 특이적인 항체, 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 포함한다. 리포좀이 사용되는 경우에, 표적화하기 위해 및/또는 섭취를 용이하게 하도록 세포내이입과 연관된 세포-표면 막 단백질에 결합하는 단백질을 사용할 수 있다. 상기 단백질의 예는 특정 세포 종류 지향성인 캡시드 단백질 및 그의 단편, 사이클링에서 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국재화를 표적하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 포함한다. 다른 실시태양에서, 수용체-매개 세포내이입을 사용할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 문헌 ([Wu et al., 1987] 또는 [Wagner et al., 1990])에 설명되어 있다. 현재 알려진 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜에 대한 검토를 위해, 문헌 [Anderson 1992]를 참조한다 (또한 WO 93/25673과 여기에 인용된 문헌 참조). 유전자 요법 기술의 추가의 검토를 위해, 문헌 ([Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989)]; [Anderson, Nature, supplement to vol. 392, no 6679, pp. 25-30 (1998)]; [Verma, Scientific American: 68-84 (1990)]; 및 [Miller, Nature, 357: 455460 (1992)])을 참조한다.
스크리닝 방법
효과적인 치료제는 유의한 독성이 없는 효능있는 물질을 확인하는 것에 의존한다. 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 결합 친화도에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 겔-쉬프트 (gel-shift) 분석, 웨스턴 (Western) 블롯, 방사성 표지된 경쟁 분석, 크로마토그래피에 의한 동시-분획화, 동시-침전, 가교결합, ELISA 등을 사용할 수 있고, 이는 예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY]에 설명되어 있다.
FZD10 상의 목적하는 에피토프 (예를 들어, FZD10의 세포외 도메인)에 결합하는 항체를 초기에 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 설명된 것과 같은 일상적인 교차-차단 분석을 수행할 수 있다. 일상적인 경쟁 결합 분석을 또한 사용할 수 있고, 여기서 미지의 항체를 본 발명의 FZD10 특이적 항체에 대한 FZD10의 결합을 억제하는 그의 능력에 의해 특성화한다. 에피토프 매핑은 문헌 [Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995)]에 설명되어 있다.
시험관내 결합 분석의 한 변형에서, 본 발명은 (a) 고정된 FZD10을 후보 항체와 접촉시키고, (b) FZD10에 대한 후보 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 후보 항체가 고정되고, FZD10의 결합이 검출된다. 고정은 당업계에 잘 공지된 임의의 방법, 예를 들어 지지체, 비드 또는 크로마토그래피 수지에 대한 공유 결합, 및 비-공유 고 친화도 상호작용, 예를 들어 항체 결합을 이용하여, 또는 스트렙타비딘/비오틴 결합 (여기서, 고정된 화합물은 비오틴 모이어티를 포함한다)을 사용하여 달성한다. 결합의 검출은 (i) 고정되지 않은 화합물 상의 방사성 표지를 사용하여, (ii) 비-고정된 화합물 상의 형광 표지를 사용하여, (iii) 비-고정된 화합물에 면역특이적인 항체를 사용하여, (iv) 고정된 화합물이 그에 부착되는 형광 지지체를 여기시키는 비-고정된 화합물 상의 표지를 사용하여, 및 당업계에 잘 알려져 있고 일상적으로 실시되는 다른 기술을 사용하여 달성할 수 있다.
FZD10의 활성 또는 발현을 조정하는 (즉, 증가시키거나, 감소시키거나, 차단하는) 항체는 추정 조정자를 FZD10을 발현하는 세포와 함께 인큐베이팅하고, FZD10의 활성 또는 발현에 대한 추정 조정자의 효과를 결정함으로써 확인할 수 있다. FZD10 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성을 조정하는 항체의 선택성은 FZD10 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 그의 효과를 다른 관련 화합물에 대한 그의 효과에 비교함으로써 평가할 수 있다. 선택적인 조정자는 예를 들어, 항체, 및 FZD10 폴리펩티드에 또는 FZD10 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 다른 단백질, 펩티드 또는 유기 분자를 포함할 수 있다. FZD10 활성의 조정자는 FZD10 폴리펩티드의 정상 또는 비정상 활성이 관여되는 질병 및 생리학적 상태의 치료에서 치료상 유용할 것이다.
암을 예방 또는 치료하는데 있어서 잠재적으로 유용한 화합물은 다양한 분석을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 후보 길항제를 먼저 Dishevelled의 인산화를 감소시키고, c-Jun의 인산화를 감소시키고, β-카테닌의 인산화를 증가시키는 그의 능력을 결정하기 위해 배양된 세포 시스템 내에서 특성화할 수 있다.
특정 FZD10 항체, 또는 FZD10 항체들의 조합물의 항-종양 활성은 적합한 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 평가할 수 있다 (Loukopoulos et al., Pancreas, 29(3): 193-203 (2004)). 또한, 특정 FZD10 항체의 항-종양 활성은 예를 들어, Dishevelled-1, Dishevelled-2, Dishevelled-3, LRP5, LRP6 및 β-카테닌의 인산화 상태, 및 β-카테닌 조절된 유전자, 예를 들어 c-myc (He TC et al., Science. 1998 Sep 4; 281(5382):1509-12) 및 cyclinD1 (Tetsu O & McCormick F, Nature. 1999 Apr 1; 398(6726):422-6)의 발현의 수준을 분석함으로써 평가할 수 있다. FZD10의 비-β-카테닌 또는 비-표준 신호전달 활성을 모니터링하기 위해 c-JUN의 세린 63 및 세린 73과 같은 인산화 상태를 또한 사용할 수 있다. 추가로, 본원에 설명된 바와 같은 증식 분석, 연질 아가 분석 및/또는 세포독성 분석을 포함하는 세포성 분석을 특정 FZD10 항체를 평가하기 위해 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 항-FZD10 항체에 잘 반응할 세포 집단을 확인하기 위해 LRP5 (WNT-7b의 공지의 공동-수용체 (Wang, Z. et al., Mol. Cell Biol 25 (12): 5022-30, 2005))의 인산화 상태를 평가한다. 다른 실시태양에서, LRP5의 인산화 상태는 임의로 항-FZD10 항체를 사용하는 치료 동안 모니터링된다.
본 발명은 또한 FZD10 폴리펩티드와 상호작용하거나 FZD10 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 (즉, 효소적 활성, 결합 활성 등을 억제하는) 항체를 확인하기 위해 초고속 스크리닝 (HTS) 분석을 포함한다. HTS 분석은 효율적인 방식으로 다수의 화합물의 스크리닝을 허용한다. 세포-기반 HTS 시스템은 FZD10 폴리펩티드와 그들의 결합 파트너 사이에서 상호작용을 조사하기 위해 고려된다. HTS 분석은 목적하는 특성을 갖는 "유효 (hit)" 또는 "선도 (lead) 화합물"을 확인하기 위해 설계되고, 목적하는 특성을 개선하기 위해 그로부터의 변형이 설계될 수 있다. "유효" 또는 "선도 화합물"의 화학적 변형은 종종 "유효"와 FZD10 폴리펩티드 사이의 확인가능한 구조/활성 관계에 기반한다.
본 발명의 다른 측면은 FZD10을 항체와 접촉시키고, 항체가 FZD10의 활성을 변형시키는지 결정하는 것을 포함하는, FZD10의 활성을 조정하는 (즉, 감소시키는) 항체를 확인하는 방법에 관한 것이다. 시험 항체의 존재 하의 활성을 시험 항체의 부재 하의 활성과 비교한다. 시험 항체를 함유하는 샘플의 활성이 시험 항체가 없는 샘플의 활성보다 더 낮은 경우, 항체는 억제될 활성을 가질 것이다.
항체 컨쥬게이트
항-FZD10 항체는 그들의 "네이키드 (naked)" 또는 비컨쥬게이팅된 형태로 투여될 수 있거나, 다른 치료 또는 진단제에 직접 컨쥬게이팅될 수 있거나, 그러한 다른 치료 또는 진단제를 포함하는 담체 중합체에 간접적으로 컨쥬게이팅될 수 있다.
항체는 방사성 동위원소, 친화도 표지 (예를 들어, 비오틴, 아비딘 등), 효소적 표지 (예를 들어, 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제 등), 형광 또는 발광 또는 생물발광 표지 (예를 들어, FITC 또는 로다민 등), 상자성 (paramagnetic) 원자 등의 사용을 통해 검출가능하게 표지될 수 있다. 그러한 표지를 달성하기 위한 절차는 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ([Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970)]; [Bayer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979)]; [Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972)]; [Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)]) 참조).
항체 모이어티의 컨쥬게이션은 미국 특허 6,306,393에 설명되어 있다. 일반적인 기술은 또한 문헌 ([Shih et al., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988)]; [Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990)]); 및 미국 특허 5,057,313 (Shih 등)에 설명되어 있다. 상기 일반적인 방법은 산화된 탄수화물 부분을 갖는 항체 성분을 적어도 하나의 유리 아민 기능을 갖고, 복수의 약물, 독소, 킬레이터, 붕소 부가물 또는 다른 치료제가 로딩되는 담체 중합체와 반응시키는 것을 포함한다. 상기 반응은 초기 쉬프 (Schiff) 염기 (이민) 연결을 생성시키고, 이는 최종 컨쥬게이트를 형성하기 위해 2차 아민으로 환원시켜 안정화시킬 수 있다.
담체 중합체는 예를 들어, 아미노덱스트란 또는 적어도 50개의 아미노산 잔기의 폴리펩티드일 수 있다. 약물 또는 다른 물질을 담체 중합체에 컨쥬게이팅하기 위한 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 폴리펩티드 담체가 아미노덱스트란 대신 사용될 수 있지만, 폴리펩티드 담체는 사슬 내에 적어도 50개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 100-5000개의 아미노산 잔기를 가져야 한다. 아미노산의 적어도 일부는 라이신 잔기 또는 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기이어야 한다. 라이신 잔기의 매달린 아민, 및 글루타민 및 아스파르테이트의 매달린 카르복실레이트는 약물, 독소, 면역조정자, 킬레이터, 붕소 부가물 또는 다른 치료제를 부착시키기 위해 편리하다. 적합한 폴리펩티드 담체의 예는 폴리라이신, 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 그의 공중합체, 및 생성되는 로딩된 담체 및 컨쥬게이트에 바람직한 용해도 특성을 부여하기 위해 이들 아미노산과 다른 것, 예를 들어, 세린의 혼합된 중합체를 포함한다.
별법으로, 컨쥬게이팅된 항체는 항체 성분을 치료제와 직접 컨쥬게이팅함으로써 제조할 수 있다. 치료제가 산화된 항체 성분에 직접 부착되는 것을 제외하고는 일반적인 절차는 간접적 컨쥬게이션 방법과 유사하다. 예를 들어, 반감기를 연장시키기 위해 항체의 탄수화물 모이어티는 폴리에틸렌글리콜에 부착될 수 있다.
별법으로, 치료제는 디술피드 결합 형성을 통해, 또는 이종이중기능적 가교-링커, 예를 들어 N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)를 사용하여 환원된 항체 성분의 힌지 구역에 부착될 수 있다 (Yu et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994)). 그러한 컨쥬게이션을 위한 일반적인 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ([Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991)]; [Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)]; [Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Enineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)]) 참조). 다양한 이중기능적 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능적 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스-(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)가 당업계에 공지되어 있다.
마지막으로, 하나 이상의 항-FZD10 항체 모이어티 및 다른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제작할 수 있다. 항체 융합 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 6,306,393 참조). 인터루킨-2 모이어티를 포함하는 항체 융합 단백질은 문헌 ([Boleti et al., Ann. Oncol. 6:945 (1995)], [Nicolet et al., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995)], [Becker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996)], [Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996)] 및 [Hu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996)])에 설명되어 있다.
면역컨쥬게이트
본 발명은 또한 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 독소 (예를 들어 효소적 활성 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 예를 들어 그의 단편 및/또는 변이체), 전구약물 또는 다른 물질, 예를 들어 면역조정자, 호르몬 또는 호르몬 길항제, 및 효소 또는 효소 억제제, 광활성 치료제, 예를 들어 크로마겐 또는 염료, 혈관생성 억제제, 별도의 항체 또는 그의 단편, 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 컨쥬게이트)에 컨쥬게이팅된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트에 관한 것이다 (검토를 위해 문헌 [Schrama et al., (2006) Nature Reviews 5: 147-159]을 참조한다).
상기 면역컨쥬게이트의 생성에 유용한 화학요법제는 상기 설명되었다. 항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄신 (미국 특허 5,208,020), 트리코텐, 두오카르마이신 ('Ultra Potent Toxins'로도 알려짐; 일반적으로 문헌 [Lillo et al., (2004) Chemistry and Biology 11; p. 897-906] 참조) 및 CC-1065의 컨쥬게이트가 또한 본원에서 고려된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 항체는 하나 이상의 메이탄신 분자에 컨쥬게이팅된다 (예를 들어, 항체 분자 당 약 1 내지 약 10개의 메이탄신 분자. 메이탄신은 예를 들어, May-SS-Me로 전환될 수 있고, 이는 May-SH3으로 환원되어 변형된 항체와 반응하여 (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)), 메이탄시노이드-항체 면역컨쥬게이트를 생성할 수 있다. 별법으로, 선택된 약물은 IC50이 약 10-11 M (검토를 위해 문헌 [Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212]을 참조한다)인 고도로 강한 메이탄신 유도체 DM1 (N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신) (예를 들어, WO02/098883 (2002년 12월 12일 공개) 참조) 또는 DM4 (N2'-데아세틸-N2'(4-메틸--4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신) (예를 들어, WO2004/103272 (2004년 12월 2일 공개) 참조)일 수 있다.
중요한 다른 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 컨쥬게이팅된 항-종양 세포 항원 항체를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중가닥 DNA 절단체 (break)를 생성할 수 있다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ1I, α2I, α3I, N-아세틸-γ1I, PSAG 및 θI1 ([Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)] 및 [Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)])를 포함하고 이로 제한되지 않는다 (또한 명백하게 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; 및 5,773,001 참조).
또 다른 방안은 종양 세포 항원 항체를 많은 암에서 과다생산된 효소에 의해 그의 활성 형태로 방출될 수 있는 전구약물에 컨쥬게이팅하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체 컨쥬게이트는 독소루비신의 전구약물 형태를 사용하여 제조할 수 있고, 여기서 활성 성분은 플라스민에 의해 컨쥬게이트로부터 방출된다. 플라스민은 많은 암성 조직에서 과다생산되는 것으로 알려져 있다 (Decy et al., (2004) FASEB Journal 18(3): 565-567 참조).
사용할 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)의), 슈도모나스 내독소, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 리보뉴클레아제 (Rnase), 데옥시리보뉴클레아제 (Dnase), 미국 자리공 (pokeweed) 항바이러스 단백질, 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 네오마이신 및 트리코테센을 포함한다 (예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개) 참조). 고유 면역원성이 적고, 암성 세포가 독소에 대해 내성이 될 기회를 감소시키는 작용 메카니즘 (예를 들어, 세포독성 메카니즘 대 세포증식 억제 메카니즘)을 갖는 독소가 특히 바람직하다.
본 발명의 항체와 면역조정자 사이에서 제조된 컨쥬게이트가 고려된다. 예를 들어, 면역자극 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 이들 분자는 항원-특이적 항체 반응을 유도할 수 있는 강력한 면역원이다 (Datta et al., (2003) Ann N.Y. Acad. Sci 1002: 105-111 참조). 추가의 면역조정 화합물은 줄기세포 성장 인자, 예를 들어 "S1 인자", 림포톡신, 예를 들어 종양 괴사 인자 (TNF), 조혈 인자, 예를 들어 인터루킨, 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 또는 과립구 대식세포-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론 (IFN), 예를 들어 인터페론 알파, 베타 또는 감마, 에리트로포이에틴 및 트롬보포이에틴을 포함할 수 있다.
다양한 방사성 동위원소가 방사성 컨쥬게이팅된 항-종양 세포 항원 항체의 생산을 위해 이용가능하다. 치료적 방사성 컨쥬게이트는 32P, 33P, 47Sc, 59Fe, 64Cu, 67Cu, 75Se, 77As, 89Sr, 90Y, 99Mo, 105Rh, 109Pd, Ag-111, 125I, 131I, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 161Th, 166Ho, 169Er, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211Pb, 212Pb 및 213Bi, 58Co, 67Ga, 80Brm, 99Tcm, 103Rhm, 109Pt, In-111, 119Sb, I-125, 161Ho, 189Osm, 192Ir, 152Dy, 211At, 212Bi, 223Ra, 219Rn, 215Po, 211Bi, 225Ac, 221Fr, 217At, 213Bi, 255Fm 및 이들의 조합물을 사용하여 제조할 수 있다. 추가로, 붕소, 가돌리늄 또는 우라늄 원자를 사용할 수 있고, 여기서 붕소 원자는 바람직하게는 10B이고, 가돌리늄 원자는 157Gd이고, 우라늄 원자는 235U이다.
바람직하게는, 치료적 방사성 핵종 컨쥬게이트는 20 내지 10,000 keV의 에너지를 갖는 방사성 핵종을 갖는다. 방사성 핵종은 1000 keV 미만의 에너지를 갖는 오거 (Auger) 방출체, 20 내지 5000 keV의 에너지를 갖는 P 방출체, 또는 2000 내지 10,000 keV의 에너지를 갖는 알파 또는 'a' 방출체일 수 있다.
진단적 방사성 컨쥬게이트는 감마-, 베타- 또는 양전자-방출 동위원소인 방사성 핵종을 함유할 수 있고, 여기서 방사성 핵종은 20 내지 10,000 keV의 에너지를 갖는다. 방사성 핵종은 18F, 51Mn, 52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 86y, 89Zr, 94mTc, IIn, 120I, 124I, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 67Ga, 75Se, 97Ru, 99mTc, 111In, 114mIn, 123I, 125I, 131I, 169Er, 197Hg 및 21Tl의 군 중에서 선택될 수 있다.
추가의 종류의 진단적 면역컨쥬게이트가 고려된다. 본 발명의 항체 또는 단편은 광활성 또는 조영제 (contrast agent)인 진단제에 연결될 수 있다. 광활성 화합물은 크로마겐 또는 염료과 같은 화합물을 포함할 수 있다. 조영제는 예를 들어 상자성 이온일 수 있고, 여기서 이온은 크롬 (III), 망간 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (III), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄 (III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III) 및 에르븀 (III)의 군 중에서 선택된 금속을 포함한다. 조영제는 또한 X-선 기술 또는 컴퓨터 단층촬영에서 사용되는 방사선-비투과성 (radio-opaque) 화합물, 예를 들어 요오드, 이리듐, 바륨, 갈륨 및 탈륨 화합물일 수 있다. 방사선-비투과성 화합물은 바륨, 디아트리조에이트, 에티오다이즈드 (ethiodized) 오일, 시트르산갈륨, 이오캄산, 이오세탐산, 이오다미드, 이오디파미드, 이오독삼산, 요굴아미드, 이오헥솔, 이오파미돌, 이오판산, 이오프로셈산, 이오세팜산, 이오세르산, 이오술아미드 메글루민, 이오세메트산, 이오타술, 이오테트르산, 이오탈람산, 이오트록신 (iotroxic acid), 이옥사글린산, 이옥소트리조산, 이포데이트, 메글루민, 메트리자미드, 메트리조에이트, 프로필요오돈 및 염화탈륨의 군 중에서 선택될 수 있다. 별법으로, 진단적 면역컨쥬게이트는 본 발명의 항체에 컨쥬게이팅된 기체 충전된 리포좀과 같은 초음파-향상제를 함유할 수 있다. 진단적 면역컨쥬게이트는 종양 또는 암 진단 및 검출의 수술중, 내시경 또는 혈관내 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 절차에 사용될 수 있다.
항체와 세포독성제의 컨쥬게이트는 다양한 이중기능적 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능적 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체로의 방사성 핵종의 컨쥬게이션에 대한 예시적인 킬레이팅제이다 (WO94/11026 참조). 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992))를 사용할 수 있다. 상기 물질은 탄수화물 모이어티를 통해 본 발명의 항체에 추가로 연결될 수 있다.
별법으로, 항-종양 세포 항원 항체와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 항체는 종양 예비표적화에서 사용하기 위해 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 컨쥬게이팅될 수 있고, 여기서 항체-수용체 컨쥬게이트를 환자에게 투여한 후, 청소제 (clearing agent)를 사용하여 혈류로부터 비결합된 컨쥬게이트를 제거하고, 세포독성제 (예를 들어, 방사성 핵종)에 컨쥬게이팅된 "리간드" (예를 들어 아비딘)을 투여한다.
항-종양 세포 항원 항체는 표적 세포 라이소좀 내에서만 방출되는 세포독성 분자에 추가로 컨쥬게이팅될 수 있다. 예를 들어, 약물 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE)는 항체 컨쥬게이트의 내재화 후에 단백분해적 라이소좀 효소 카텝신 B에 의해 절단될 발린-시트룰린 연결기를 통해 컨쥬게이팅될 수 있다 (예를 들어 WO03/026577 (2003년 4월 3일 공개) 참조). 별법으로, MMAE는 절단가능한 모이어티로서 히드라존 관능기를 함유하는 산-불안정성 링커를 사용하여 항체에 부착될 수 있다 (예를 들어 WO02/088172 (2002년 11월 11일 공개) 참조).
빠르게 내재화하기 위해서는 상기한 항체 컨쥬게이트가 바람직하지만, 항-종양 활성이 주로 ADCC를 통해 매개되는 경우에 느리게-내재화하는 항체가 바람직할 것이다. "느리게-내재화하는 항체"는 유의한 시간 동안 세포 표면 상에 배치되어 남아있는 항체를 의미한다. 당업자가 알 바와 같이, 상기 특성은 요법이 효과적이기 위해서는 실제로 항체-수용체 복합체의 내재화를 요구하는 많은 치료 용도에 대해 유리한 것으로 보이는 특성과 대비된다. 이러한 맥락에서, 유의한 시간은 일반적으로 3시간, 바람직하게는 6시간, 보다 바람직하게는 12시간, 보다 바람직하게는 24시간, 36시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간, 168시간 이상을 초과한다.
항체의 내재화는 다양한 분석에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, FZD10로 형질감염된 세포주 또는 표면 상에 FZD10을 발현하는 세포주 (예를 들어, NCI-H460 세포)가 내재화에 대한 후보 항체 결합의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 세포를 인간 IgG1 (대조 항체) 또는 후보 항체와 함께 얼음 상에서 (내재화를 차단하기 위해 0.1% 나트륨 아지드와 함께) 또는 37℃에서 (나트륨 아지드 없이) 일정 시간, 적합하게는 3시간 동안 인큐베이팅한다. 냉 염색 버퍼 (예를 들어 PBS + 1% BSA + 0.1% 나트륨 아지드)로 세척한 후, 세포를 예를 들어, 염소 항-인간 IgG-FITC로 30분 동안 얼음 상에서 염색한다. 이어서, 염색 정도를 평가할 수 있고; 본 예에서, 기하 평균 형광 강도 (MFI)를 예를 들어 FACS Calibur에 의해 기록할 수 있다. 다른 적합한 분석은 당업자에게 공지될 것이다.
조합 요법
동물 모델에서 효과적인 하나 초과의 FZD10 항체를 확인하면, 암에 대한 더욱 개선된 효능을 제공하기 위해 2개 이상의 그러한 FZD10 항체를 함께 혼합하는 것이 더욱 유리할 수 있다. 하나 이상의 FZD10 항체를 포함하는 조성물을 암에 걸리거나 암에 걸릴 소인이 있는 개인 또는 포유동물에게 투여할 수 있다. FZD10 항체를 또한 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제 또는 전통적인 암 화학요법제와 함께 투여할 수 있다. 2개의 치료제의 동시 투여는 치료제들이 치료 효과를 발휘하는 동안의 시간이 겹치는 한, 치료제들을 동일한 시간에 또는 동일한 경로에 의해 투여하는 것을 요구하지 않는다. 동시의 또는 순차적인 투여가 고려되고, 상이한 날 또는 주의 투여도 고려된다.
본 발명의 방법은 단일 항-FZD10 항체, 및 상이한 항체들의 조합물 또는 "칵테일 (cocktail)"의 투여를 고려한다. 상기 항체 칵테일은 상이한 효과기 메카니즘을 이용하는 항체를 함유하거나 세포독성 항체를 면역 효과기 기능성에 의존하는 항체와 직접 조합하므로 특정 잇점을 가질 수 있다. 조합물 내의 그러한 항체들은 상승적 치료 효과를 나타낼 수 있다.
세포독성제는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 일으키는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법제 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 합성 독소 또는 그의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 비-세포독성제는 세포의 기능을 억제 또는 방지하지 않고/않거나 세포의 파괴를 일으키지 않는 물질을 나타낸다. 비-세포독성제는 세포독성이 되도록 활성화될 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 비-세포독성제는 비드, 리포좀, 매트릭스 또는 입자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 공개 2003/0028071과 2003/0032995 참조). 상기 물질은 본 발명에 따른 항체와 컨쥬게이팅되거나, 커플링되거나, 연결되거나, 회합될 수 있다.
전통적인 암 화학요법제는 비제한적으로 알킬화제, 예를 들어 카르보플라틴 및 시스플라틴; 질소 머스타드 알킬화제; 니트로소우레아 알킬화제, 예를 들어 카르무스틴 (BCNU); 항대사물질, 예를 들어 메토트렉세이트; 폴린산; 퓨린 유사체 항대사산물, 머캅토퓨린; 피리미딘 유사체 항대사산물, 예를 들어 플루오로우라실 (5-FU) 및 겜시타빈 (Gemzar(등록상표)); 호르몬 항신생물제, 예를 들어 고세렐린, 류프롤리드 및 타목시펜; 천연 항신생물제, 예를 들어 알데스루킨, 인터루킨-2, 도세탁셀, 에토포시드 (VP-16), 인터페론 알파, 파클리탁셀 (Taxol(등록상표)) 및 트레티노인 (ATRA); 항생물질 천연 항신생물제, 예를 들어 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 다우노마이신 및 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C; 및 빈카 알칼로이드 천연 항신생물제, 예를 들어 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신; 히드록시우레아; 아세글라톤, 아드리아마이신, 이포스파미드, 에노시타빈, 에피티오스타놀, 아클라루비신, 안시타빈, 니무스틴, 프로카르바진 염산염, 카르보쿠온, 카르보플라틴, 카르모푸르, 크로모마이신 A3, 항종양 다당류, 항종양 혈소판 인자, 시클로포스파미드 (Cytoxin(등록상표)), 쉬조필란, 시타라빈 (시토신 아라비노시드), 다카르바진, 티오이노신, 티오테파, 테가푸르, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체, 예를 들어 오리스타틴, CPT-11 (이리노테칸), 미토잔트론, 비노렐빈, 테니포시드, 아미노프테린, 카르미노마이신, 에스페라미신 (예를 들어, 미국 특허 4,675,187 참조), 네오카르지노스타틴, OK-432, 블레오마이신, 푸르툴론, 브록수리딘, 부술판, 혼반, 페플로마이신, 베스타틴 (Ubenimex(등록상표)), 인터페론-β, 메피티오스탄, 미토브로니톨, 멜팔란, 라미닌 펩티드, 렌티난, 운지버섯 (Coriolus versicolor) 추출물, 테가푸르/우라실, 에스트라무스틴 (에스트로겐/메클로에타민)을 포함한다.
또한, 전통적인 암 치료제는 EPO, G-CSF, 간시클로버; 항생제, 류프롤리드; 메페리딘; 지도부딘 (AZT); 돌연변이체 및 유사체를 포함한 인터루킨 1 내지 18; 인터페론 또는 시토킨, 예를 들어 인터페론 α, β 및 γ, 호르몬, 예를 들어 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH)과 유사체 및 고나도트로핀 방출 호르몬 (GnRH); 성장 인자, 예를 들어 전환 성장 인자-β (TGF-β), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 신경 성장 인자 (NGF), 성장 호르몬 방출 인자 (GHRF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 상동성 인자 (FGFHF), 간세포 성장 인자 (HGF) 및 인슐린 성장 인자 (IGF); 종양 괴사 인자-α & β (TNF-α & β); 침습 억제 인자-2 (IIF-2); 뼈 형태 형성 단백질 1-7 (BMP 1-7); 소마토스타틴; 티모신-α-1; γ-글로불린; 수퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD); 보체 인자; 항-혈관신생 인자; 항원성 물질; 및 전구약물을 포함한다.
전구약물은 모 약물에 비해 종양 세포에 세포독성이 적거나 비-세포독성이고, 활성 또는 보다 활성 모 형태로 효소적으로 활성화되거나 전환될 수 있는 제약상 허용되는 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 나타낸다 (예를 들어, 문헌 ([Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]) 참조). 전구약물은 보다 활성의 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 글리코실화된 전구약물, D-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기한 화학요법제를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
그 전문이 본원에 참고로 포함되는 WO2005/044294에서는 항체의 ADCC-매개 항-종양 활성을 개선하기 위해 IL-2가 암성 세포 상에 발현된 항원 (예를 들어, CD40)에 결합하는 항체와 조합으로 투여될 수 있음을 개시한다. 모노클로날 항체 ADCC 활성은 호중구 및 단핵세포/대식세포 집단로부터 활성에서 야기할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Hernandez-Ilizaliturri et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9 (16, Pt 1): 5866-5873]; 및 [Uchida et al. (2004) J. Exp. Med. 199 (12): 1659-1669]) 참조). IL-2는 이들 세포 집단을 활성화하는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 하나의 실시태양은 길항제 항-FZD10 항체와 항체의 ADCC-매개 항-종양 활성을 개선할 수 있는 IL-2 또는 그의 생물학적 활성 변이체의 조합 요법을 제공한다.
올리고뉴클레오티드
일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 또는 RNAi 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 FZD10의 구역, 도메인, 부분 또는 세그먼트를 코딩하는 뉴클레오티드에 상보성이다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 12 내지 약 35개 및 약 18 내지 약 25개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 FZD10 유전자의 구역, 부분, 도메인 또는 세그먼트에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 상동성이다. 일부 실시태양에서, FZD10 유전자의 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 또는 100개의 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 실질적인 서열 상동성이 존재한다. 일부 실시태양에서, FZD10 유전자의 전체 길이에 걸쳐 실질적인 서열 상동성이 존재한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 중등도 또는 엄격한 혼성화 조건 하에 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 결합한다.
일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 서열 3-22로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이다:
Figure 112009028604632-PCT00002
일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자이고, RNAi (RNA 간섭)을 통해 작용한다. 일부 실시태양에서, dsRNA의 하나의 가닥은 FZD10 유전자의 구역, 부분, 도메인 또는 세그먼트에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 상동성이다. 일부 실시태양에서, FZD10 유전자의 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 또는 1000개의 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 실질적인 서열 상동성이 존재한다. 일부 실시태양에서, FZD10 유전자의 전체 길이에 걸쳐 실질적인 서열 상동성이 존재한다.
일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 사용된다. 상기 서열은 게놈 서열 또는 cDNA 서열에 기초할 수 있고 (또는 이들 서열로부터 설계될 수 있고), 특정 세포 또는 조직에서 동일한, 유사한 또는 상보성 DNA 또는 RNA를 증폭하거나, 확인하거나, 그 존재를 검출하기 위해 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 또한 유전자의 발현을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 조정자는 DNA 서열의 일부를 포함하고, 적어도 약 10개의 뉴클레오티드 및 많게는 약 500개의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 및 약 20개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성될 수 있고, 프로브로도 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 조정자는 단일 가닥이다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 조정자는 이중 가닥인 적어도 하나의 부분을 포함한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)이다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭 올리고뉴클레오티드 (RNAi 올리고뉴클레오티드)이다.
소분자
일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 소분자이다. 본원에서 사용될 때, 용어 "소분자"는 분자량이 약 10 킬로달톤 미만인 유기 또는 무기 비-중합체 화합물을 의미한다. 소분자의 예는 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 유기 화합물, 무기 화합물 등을 포함한다. 일부 실시태양에서, 소분자의 분자량은 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2 또는 약 1 킬로달톤 미만이다.
모방체
일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 모방체이다. 본원에서 사용될 때, 용어 "모방체"는 펩티드의 활성을 모방하는 화합물을 의미하기 위해 사용된다. 모방체는 비-펩티드이지만, 비-펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산을 포함할 수 있다. 모두 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,637,677 (1997년 6월 10일자 허여) 및 그의 모 출원에 모방체 생산에 대한 상세한 설명이 포함되어 있다. 간단히 설명하면, FZD10 수용체의 3차원 구조와 특이적으로 상호작용하는 펩티드의 3차원 구조는 펩티드가 아닌 분자에 의해 복제된다. 일부 실시태양에서, FZD10 모방체는 FZD10 수용체의 모방체 또는 FZD10 수용체의 리간드의 모방체이다.
가용형 수용체
일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 가용형 수용체이다. 본원에서 사용될 때, 용어 "가용형 수용체"는 막 도메인이 본질적으로 존재하지 않거나 또는 파괴된 막 도메인을 갖는 프리즐드 수용체, 바람직하게는 FZD10 수용체를 의미한다.
데코이 수용체
일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 FZD10 수용체의 적어도 일부를 포함하는 데코이 수용체이다. 일부 실시태양에서, 데코이 수용체는 FZD10 리간드에 대해 천연 FZD10 수용체와 경쟁한다. 일부 실시태양에서, 데코이 수용체는 정량, 정성 및/또는 가시화를 용이하게 하기 위해 표지된다. 다른 실시태양에서, 데코이 수용체는 데코이 수용체 및/또는 데코이 수용체-FZD10 복합체의 단리 및/또는 분리를 용이하게 하는 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 데코이 수용체는 FZD10 수용체 리간드 결합시에 증가된 신호 (천연 FZD10 수용체에 비해)를 초래하도록 한다. 일부 실시태양에서, 데코이 수용체는 FZD10 리간드를 포획하여 신호전달 FZD10 수용체와의 상호작용을 방지함으로써 기능하는 비-신호전달 분자이다. 일부 실시태양에서, 데코이 수용체는 항체 또는 항체 단편에 융합된 FZD10 수용체의 적어도 일부를 포함한다.
암을 치료/예방하는 방법
본 발명은 대상에게 치료 유효량의 하나 이상의 FZD10 조정자를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암 또는 암의 증상을 치료하고/하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 암은 FZD10의 과다발현과 연관된 암이다. 일부 실시태양에서, 암은 대장, 난소, 폐 또는 자궁암이다. 일부 실시태양에서, 대상은 암에 걸린 것으로 또는 암에 소인이 있는 것으로 진단되었다.
암의 증상은 당업자에게 잘 알려져 있고, 비제한적으로 통증, 사망, 체중 감소, 쇠약, 섭식 곤란, 혈변, 구역, 구토, 간 전이, 폐 전이, 뼈 전이, 복부 팽만감, 더부룩함, 복막강 내의 체액, 질 출혈, 변비, 복부 팽만, 대장의 천공, 급성 복막염 (감염, 열, 통증), 토혈, 연하 곤란 등을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 예방적 또는 치료적 치료 방법은 FZD10 조정자로 대상을 치료하기 전에 FZD10 조정자, 예를 들어 항-FZD10 항체 또는 억제성 폴리뉴클레오티드를 사용하는 요법에 반응성일 가능성이 있는 대상을 확인하는 방법을 또한 포함할 수 있다. 반응성 대상을 확인하는 방법은 대상으로부터의 종양 세포에서 LRP5의 발현 수준 및/또는 인산화 상태를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 LRP5의 증가된 발현 또는 인산화는 FZD10 항체 또는 siRNA 요법에 반응성일 가능성과 상호관련될 수 있다. 별법으로 또는 LRP5 상태를 검출하는 것에 추가로, 반응성 대상은 대상으로부터의 종양 세포에서 FZD10의 발현 수준을 검출함으로써 확인할 수 있고, 여기서 FZD10의 증가된 발현은 FZD10 항체 또는 siRNA 요법에 반응성일 가능성과 상호관련될 수 있다. 대상으로부터의 조직 샘플에서 단백질의 발현 수준은 임의의 많은 상이한 방식, 예를 들어, LRP5 또는 FZD10에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학으로, 및 mRNA의 상대적인 수준을 검출하기 위해 PCR에 의해 분석할 수 있다. 면역조직화학은 조직 샘플을 단백질에 특이적인 항체 (예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날)와 접촉시키고, 샘플에 대한 항체의 상대적인 결합을 검출하는 것을 포함한다. 핵산 기반 방법은 샘플로부터 핵산을 추출하고 증폭시키고, 증폭된 핵산을 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 프로브 또는 프라이머와 접촉시키고, 증폭된 핵산에 대한 프로브 또는 프라이머의 혼성화를 검출하는 것을 포함한다. 관련 실시태양에서, 상기한 프로브 또는 프라이머는 표지된다. LRP5의 인산화 상태는 LRP6의 트레오닌 1479, 세린 1490 및 트레오닌 1493 상의 상동성 포스포-아미노산 잔기인 LRP5의 트레오닌 1492, 세린 1503 및 트레오닌 1506에 대한 포스포-특이적 항체에 의해 검출할 수 있다. LRP6 상의 이들 특이적 잔기는 β-카테닌 매개된 표준 경로의 WNT 리간드 매개된 활성화 시에 인산화되는 것으로 나타났다 ([Zeng et al., Nature. 2005 Dec 8; 438(7069):873-7]; [Davidson et al., Nature. 2005 Dec 8; 438(7069):867-72]). LRP6과 상호작용하는 상기 포스포-특이적 항체의 사용을 통해 LRP5의 인산화 상태를 검출하는 것이 충분할 수 있다. LRP5에 특이적인 항체를 사용하여 LRP5와 LRP6을 구별하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
관련 실시태양에서, FZD10 조정자를 사용하는 대상의 치료를 대상으로부터의 조직 샘플 내의 LRP5 및/또는 FZD10의 발현 수준, 또는 LRP5의 인산화 상태를 검출함으로써 치료 개시 후 일정 간격으로, 예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월 또는 매월 또는 4분기마다, 반년마다 또는 매년 모니터링한다. 상기 모니터링은 임의로 예후를 예측하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 LRP5 및/또는 FZD10의 감소된 발현, 또는 LRP5의 감소된 인산화는 개선된 예후와 상호관련된다.
조정 화합물의 치료 유효량은 의약 화학자에게 잘 알려진 절차에 따라 경험적으로 결정될 수 있고, 특히 환자의 연령, 병태의 중증도, 및 요망되는 궁극적인 제약 제형에 따를 것이다. 본 발명의 조정자의 투여는 예를 들어, 흡입 또는 좌약에 의해 또는 질, 직장, 요도, 볼 안 및 혀밑 조직으로의 세척액 (lavage)에 의해서와 같이 점막 조직으로, 경구, 국소 (topical), 코 안, 복강내, 비경구, 정맥내, 림프계내, 종양내, 근육내, 사이질로, 동맥내, 피하, 눈 안, 윤활강내, 경상피 및 경피로 수행할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 억제제는 세척에 의해, 경구로 또는 동맥 사이로 투여된다. 다른 적합한 도입 방법은 또한 재충전가능한 또는 생분해성 장치 및 서방형 또는 지연 방출형 중합성 장치를 포함할 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 치료 조성물은 또한 다른 공지의 항암제 또는 다른 공지의 항-뼈 질병 치료 요법과의 조합 요법의 일부로서 투여될 수 있다.
본 발명은 환자에서 FZD10-관련 생물학적 활성을 조정하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 환자에게 하나 이상의 FZD10의 생물학적 활성을 조정하기 위해 효과적인 FZD10 조정자의 양을 투여하는 것을 포함한다. FZD10의 생물학적 활성을 측정하기 위해 적합한 분석은 위에 및 아래에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 하나 이상의 FZD10 조정자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서 암 세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. FZD10-관련 세포 성장을 측정하기 위해 적합한 분석은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명은 또한 그를 필요로 하는 환자에서 암을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자가 본원에 설명된 바와 같은 FZD10 요법에 대한 후보인지 결정하고, 환자가 FZD10 요법에 대한 후보이면 치료 유효량의 하나 이상의 FZD10 조정자를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 환자가 FZD10 요법에 대한 후보가 아니면, 환자를 통상적인 암 치료를 이용하여 치료한다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 FZD10 조정자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 2개 이상의 세포의 상호작용을 억제하는 방법을 제공한다. FZD10-관련 세포 상호작용을 측정하기 위해 적합한 분석은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명은 또한 환자에게 치료 유효량의 본원에 설명된 FZD10 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암의 하나 이상의 증상을 조정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 환자에게 치료 유효량의 FZD10 조정자를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서 부착 (anchorage)-비의존성 세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. FZD10-관련 부착-비의존성 세포 성장을 측정하기 위해 적합한 분석은 실시예에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 환자에게 치료 유효량의 FZD10 조정자를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서 암 세포의 이동을 억제하는 방법을 제공한다. FZD10-관련 세포 이동을 측정하기 위해 적합한 분석은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명은 또한 환자에게 치료 유효량의 FZD10 조정자를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서 암 세포의 부착을 억제하는 방법을 제공한다. FZD10-관련 세포 부착을 측정하기 위해 적합한 분석은 당업자에게 공지되어 있다.
또한, 본 발명은 암, 암 전이를 발병할 소인이 있거나, 전이되어 재현 또는 재발에 감수성인 환자를 예방적으로 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 예를 들어, 암 또는 전이 종양의 가족력이 있거나, 암 전이에 대한 유전적 소인을 보이는 고-위험 개인에서 특히 유용하다. 일부 실시태양에서, 종양은 FZD10-관련 종양이다. 추가로, 상기 방법은 FZD10-관련 종양을 수술적 절제에 의해 제거하거나 통상적인 암 치료로 치료한 환자가 FZD10-관련 종양을 재발하는 것을 예방하기 위해 유용하다.
또한, 본 발명은 환자에게 치료 유효량의 FZD10 조정자를 투여하는 것을 포함하는, 암 진행을 억제하고/하거나 암 퇴보를 유발하는 방법을 제공한다.
일부 실시태양에서, 항암 치료를 필요로 하는 환자를 화학요법 및/또는 방사선 요법과 함께 항체, 소분자, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체 또는 올리고뉴클레오티드 조정자로 치료한다. 예를 들어, 항체, 소분자, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체 또는 올리고뉴클레오티드 조정자의 투여 후에, 환자를 또한 치료 유효량의 항암 방사선으로 치료할 수 있다. 일부 실시태양에서, 화학요법 치료는 항체, 소분자, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체 또는 올리고뉴클레오티드 조정자와 조합으로 제공된다. 일부 실시태양에서, 항체, 소분자, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체 또는 올리고뉴클레오티드 조정자는 화학요법 및 방사선 요법과 조합으로 투여된다.
치료 방법은 단일 또는 다수 용량의 하나 이상의 FZD10 조정자를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 무균이고 발열원이 없고 FZD10 조정자를 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합으로 포함하는 주사가능한 제약 조성물로서 투여된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 치료 요법은 비제한적으로 수술, 방사선 요법, 호르몬, 절제 및/또는 화학요법을 포함한 암에 대한 전통적인 치료 요법과 함께 사용된다. 본 발명의 FZD10 조정자의 투여는 전통적인 암 치료 전에, 동시에 또는 후에 일어날 수 있다.
일부 실시태양에서, 2개 이상의 상이한 FZD10 조정자를 환자에게 투여한다.
일부 실시태양에서, 환자에게 투여되는 FZD10 조정자의 양은 Dishevelled 인산화 억제에 효과적이다. 일부 실시태양에서, 환자에게 투여되는 FZD10 조정자의 양은 c-Jun 인산화를 억제하기에 효과적이다. 일부 실시태양에서, 환자에게 투여되는 FZD10 조정자의 양은 β-카테닌 인산화를 유도하기 위해 효과적이다. 일부 실시태양에서, 환자에게 투여되는 FZD10 조정자의 양은 암 진행을 억제하고/하거나 암 퇴보를 일으키기에 효과적이다.
임상 측면
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 대장암, 난소암, 폐 세포암, 및 자궁암에서 특히 유용하다. 일부 실시태양에서, 방법 및 조성물은 암 전이, 예를 들어, 폐 전이를 치료 및/또는 진단하는데 있어서 유용하다.
제약 조성물
본 발명은 또한 본원에 설명된 하나 이상의 FZD10 조정자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시태양에서, 제약 조성물은 주사가능한 것으로서, 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조되고; 주사 전에 액체 비히클 내에 용해 또는 현탁하기에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 리포좀은 제약상 허용되는 담체의 정의 내에 포함된다. 제약상 허용되는 염, 예를 들어, 광물 산 염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기산의 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 또한 제약 조성물 내에 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제의 전체 논의는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkins]에서 이용가능하다.
FZD10 의 검출 방법
본 발명은 또한 FZD10을 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, FZD10은 환자 또는 환자 샘플 내에 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 환자에게 하나 이상의 FZD10 조정자를 포함하는 조성물을 투여하고, 환자에서 영상화제가 존재하는 부위를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 환자 샘플은 암 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 영상화제에 연결되거나, 검출가능하게 표지된다. 일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 영상화제에 컨쥬게이팅된 항-FZD10 항체이고, 하나 이상의 종양을 검출하기 위해 또는 FZD10 요법에 대한 환자의 감수성을 결정하기 위해 환자에게 투여된다. 표지된 항체는 세포 상의 고밀도의 수용체에 결합하여, 종양 세포 상에 축적할 것이다. 표준 영상화 기술을 이용하여, 종양 부위를 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 FZD10 조정자를 포함하는 조성물을 샘플에 접촉시키고, 샘플 내의 FZD10 조정자의 존재를 검출하는 것을 포함하는, FZD10을 발현 또는 과다발현하는 세포 또는 종양을 영상화/검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 샘플은 환자 샘플이다. 일부 실시태양에서, 환자 샘플은 암 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, FZD10 조정자는 영상화제에 연결되거나 검출가능하게 표지된다.
본 발명은 또한 환자, 세포 또는 샘플 내에 존재하는 FZD10의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 항체, 프로브 또는 소분자를 환자 또는 샘플에 투여하고, 샘플 내에 존재하는 FZD10의 양을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체, 프로브 또는 소분자는 영상화제에 연결되거나, 검출가능하게 표지된다. 그러한 정보는 예를 들어 종양이 FZD10에 관련되는지 여부 및 따라서 특이적 치료를 사용하여야 하는지 피하여야 하는지 여부를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 당업자에게 잘 알려져 있는 표준 기술을 사용하여, 종양 세포를 포함하는 것으로 생각되는 샘플을 얻고, 표지된 항체, 프로브, 올리고뉴클레오티드 및 소분자와 접촉시킨다. 임의의 비결합된 표지된 항체, 프로브, 올리고뉴클레오티드 또는 소분자를 제거한 후, 세포에 결합된 표지된 항체, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 모방체의 양, 또는 비결합된 상태로 제거된 항체, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 모방체의 양을 결정한다. 정보는 존재하는 FZD10의 양에 직접 관련된다.
영상화는 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 절차를 이용하여 수행할 수 있다. 영상화는 예를 들어, 방사선 신티그래피 (scintigraphy), 핵 자기 공명 영상 (MRI) 또는 컴퓨터 단층 촬영 (CT 스캔)에 의해 수행할 수 있다. 영상화제에 대한 가장 일반적으로 사용되는 방사성 표지는 방사성 요오드 및 인듐을 포함한다. CT 스캔에 의한 영상화에서는 철 킬레이트와 같은 중금속을 사용할 수 있다. MRI 스캐닝에서는 가돌리늄 또는 망간의 킬레이트를 사용할 수 있다. 추가로, 산소, 질소, 철, 탄소 또는 갈륨의 양전자 방출체를 사용하여 양전자 방출 단층 촬영 (PET)이 가능할 수 있다.
검출 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 검출 방법은 PCR, 노던 (Northern) 블로팅, 서던 (Southern) 블로팅, RNA 보호 및 DNA 혼성화 (계내 혼성화 포함)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 폴리펩티드의 검출 방법은 웨스턴 블로팅, ELISA, 효소 활성 분석, 슬롯 (slot) 블로팅, 펩티드 질량 지문검사 (fingerprinting), 전기영동, 면역화학 및 면역조직화학을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 검출 방법의 다른 예는 방사성 면역분석 (RIA), 화학발광 면역분석, 형광 면역분석, 시간차 (resolved) 형광면역분석 (TR-FIA), 2색 형광 현미경 또는 면역크로마토그래피 분석 (ICA)을 포함하고 이로 제한되지 않고, 이들은 모두 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 일부의 바람직한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드 발현은 PCR 방법을 이용하여 검출하고, 폴리펩티드 생산은 ELISA 기술을 이용하여 검출한다.
FZD10 요법에 대한 감수성을 측정하는 방법
본 발명은 또한 FZD10 요법에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법을 제공한다. 방법은 환자 또는 환자 샘플 내의 FZD10 발현의 증거의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 환자 또는 샘플 내의 FZD10 발현의 증거의 존재는 환자가 FZD10 요법에 감수성임을 나타낸다. 환자 또는 환자 샘플 내의 FZD10 발현의 증거의 부재는 환자가 FZD10 요법에 대한 후보가 아님을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 치료 방법은 먼저 그를 필요로 하는 환자에게 영상화제에 연결된 FZD10 항체, 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 투여하고, 환자에서 유전자 또는 유전자 산물의 증거의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, FZD10 요법에 감수성인 환자를 확인하는 것을 포함한다. 환자에서 FZD10 발현, 특히 FZD10 과다발현의 증거의 존재는 환자가 FZD10 요법에 대한 후보임을 나타내고, 환자에서 FZD10 발현의 증거의 부재는 환자가 FZD10 요법에 대한 후보가 아님을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 치료 방법은 환자가 FZD10 요법에 대한 후보이면 하나 이상의 FZD10 조정자를 환자에게 투여하고, 환자가 FZD10 요법에 대한 후보가 아니면 환자를 통상적인 암 치료로 치료하는 것을 추가로 포함한다.
스크리닝 방법
본 발명은 또한 항암제에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 FZD10을 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, FZD10-관련 생물학적 활성이 조정되는지 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, Dishevelled의 인산화의 감소, c-Jun의 인산화의 감소, 및 β-카테닌의 인산화의 증가는 화합물이 암 억제제임을 나타내는 것이다. 일부 실시태양에서, FZD10 발현의 억제는 화합물이 암 억제제임을 나타내는 것이다.
본 발명은 암 억제제를 확인하는 방법을 추가로 제공한다. 방법은 FZD10을 발현하는 세포를 후보 화합물 및 FZD10 리간드와 접촉시키고, FZD10-관련 생물학적 활성이 조정되는지 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, Dishevelled의 인산화의 감소, c-Jun의 인산화의 감소, 및 β-카테닌의 인산화의 증가는 화합물이 암 억제제임을 나타내는 것이다. 일부 실시태양에서, FZD10 발현의 억제는 화합물이 암 억제제임을 나타내는 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 예를 들어, 추정 조정자를 Dishevelled의 인산화를 감소시키고, c-Jun의 인산화를 감소시키고, β-카테닌의 인산화를 증가시키는 능력에 대해 스크리닝함으로써 항암제, 특히 항-전이암제에 대한 스크리닝 방법을 제공한다.
키트
일부 실시태양에서, 본 발명은 FZD10 과다발현과 상호관련된 유전자 또는 유전자 산물을 영상화 및/또는 검출하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 검출가능한 항체, 소분자, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 조정자, 가용형 수용체, 데코이 수용체, 모방체 또는 프로브, 및 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시서를 포함한다. 임의로, 키트는 또한 대조물 (양성 및/또는 음성), 대조물을 위한 용기, 양성 및/또는 음성 결과의 대표적인 예의 사진 또는 도해 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 설명된 각각의 특허, 특허 출원, GenBank 기탁 번호 및 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에 설명된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명의 면에서 당업자에게 자명할 것이다. 그러한 변형은 또한 첨부된 청구의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 발명은 예시의 목적이고 본 발명의 범위를 제한하려고 의도되지 않는 하기 실시예에서 추가로 입증된다.
실시예 1: 폐, 난소, 자궁 및 대장암에서 FZD10 의 상향조절
프리즐드 10 mRNA를 나타내는 뉴클레오티드 서열의 세트 ("프로브 세트")를 폴리뉴클레오티드 어레이 (애피메트릭스 (Affymetrix, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)) 상에 배열된 뉴클레오티드 서열로부터 선택하고, 다양한 종양 또는 건강한 조직 샘플 내의 mRNA의 상대적인 발현 수준을 스크리닝하기 위해 사용하였다. 관심있는 세포주 또는 조직으로부터 단리된 mRNA로부터의 cDNA 단편을 제조하고, 통상적인 방법에 따라 표지하고, 제조사의 지시에 따라 폴리뉴클레오티드 어레이에 혼성화시켰다. 다양한 암성 조직 샘플 및 정상 조직 샘플로부터의 mRNA를 분석하였다.
도 1은 FZD10을 사용하여 분석된 암성 및 정상 조직의 마이크로어레이 분석 (affy U133 플러스 2 칩)의 그래프이다. 정상 및 암성 조직 종류를 수평축을 따라 펼쳐 놓았다. 암성 조직은 'c'로 표지하고, 예를 들어, "c_breast_duct"는 유방암 조직 샘플을 나타내고, 정상 조직은 유사하게 'n'으로 나타냈다. 조직 종류를 알려진 경우에 그 조직의 종류 및 아형에 관하여 더욱 표지하였다. 예를 들어, "c_breast_duct"는 유방 도관 내에 집중된 유방암으로부터의 암성 조직이다. 아형이 수술적 제거 동안 명료하지 않거나 알려져 있지 않으면, 표지는 '비-특정화된'에 대해 'ns'로 말한다. 수직축 상의 각각의 점은 단일 환자로부터의 조직 샘플을 나타내고, 수직축 상의 각각의 점의 높이 (log2 기초)는 프로브 세트의 상대적인 발현 수준을 나타낸다. 채워진 원은 선형 검출 범위 내의 발현 수준을 갖는 샘플을 나타낸다. 빈 원은 유전자가 프로브 세트의 검출 한계 아래에 있는 경우에 샘플 내의 유전자 발현에 대한 상한을 나타낸다. 빈 사각형은 프로브 세트가 포화된 경우에 샘플 내의 유전자 발현에 대한 하한을 나타낸다. 간단히 설명하면, 분석을 수행하기 전에, 각각의 프로브 세트를 샘플의 큰 다양성 세트를 가로질러 그의 구성 프로브의 거동을 분석함으로써 보정하였다. 상기 보정은 각각의 프로브의 상대적인 감도, 및 그 범위 내에서 프로브 세트 반응이 프로브들 사이에서 선형인 강도의 범위를 결정한다. 상기 범위 미만의 강도는 "검출되지 않은"으로 부르는 반면, 그를 넘는 강도는 "포화된"으로 부른다. 샘플들 사이의 혼성화 및 표지 효율의 차이 때문에, 본 발명자들은 보정을 적용한 후에 각각의 칩을 정규화시킨다. 이는 유전자 발현의 면에서 범위의 상한과 하한이 샘플마다 다소 변하도록 한다).
DecisionSite 소프트웨어 (스폿파이어 (Spotfire, 미국 매사추세츠주 소머빌)) 및 사내 개발된 Pipeline Pilot (사이테직 (SciTegic, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)) 프로토콜을 사용하여 도 1에 도시된 그래프를 생성하였다. 그 결과는 다양한 정상 조직 종류에서 그의 발현에 비해 화살표로 표지한 강조한 종양 표시에서 FZD10에 대한 상승된 발현을 보여준다. 환자의 수를 표시한 표를 나타낸 후, 암과 정상 샘플 사이의 상대적인 발현을 나타낸다. 결과는 다양한 정상 조직 종류에서 그의 발현에 비해 난소, 폐 및 자궁암 조직에서 FZD10 mRNA의 상승된 발현을 보여준다.
도 2에서, mRNA를 레이저 포획 미세절제된 (LCM) 대장암 조직으로부터 단리하고, mRNA를 각각의 정상 조직 (RSM= 참조 표준물질 혼합물) 또는 각각의 조직 샘플 내에서 암 세포에 인접한 정상 세포의 풀에 비교하였다. 샘플을 올리고뉴클레오티드 어레이 분석에 의해 Affymetrix(등록상표) GeneChips(등록상표) U133A & B (애피메트릭스, 인크.) 상에서 시험하였다. Y축은 상대적인 비가공 (raw) 발현 수준이다. 환자의 수를 표시한 표를 나타낸 후, 암과 정상 샘플 사이의 상대적인 발현을 나타낸다. ("%GE2X" 및 ">=2X"는 2배의 상향조절을 나타내고; "%LE.5X" 및 "<=2x"는 2배의 하향조절을 나타낸다). 결과는 FZD10이 각각의 정상 조직 또는 인접한 정상 세포에 비해 대장암 환자 샘플의 하위세트에서 상향조절됨을 입증하였다.
실시예 2: 원발 대장, 폐 및 난소암 환자 샘플의 정량적 RT - PCR
원발 종양 샘플의 RT-PCR 분석은 다음의 4개의 주요 단계로 나누어졌다: 1) 원발 정상 및 종양 조직으로부터 RNA 정제; 2) 실시간 정량적 PCR을 위해 정제된 조직 RNA로부터 제1 가닥 cDNA의 생성; 3) 384-웰 반응에 적합화된 ABI PRISM 7900HT 서열 검출 시스템을 사용한 유전자 발현을 위한 RT-PCR 설정; 4) 암에서 차별적으로 발현되는 (상향조절되는) 유전자를 확인하기 위한 통계적 방법에 의한 RT-PCR 데이타의 분석.
Qiagen RNeasy 미니 키트 CAT#74106을 사용할 때, 조직 샘플은 일반적으로 약 30 ㎍의 RNA를 생성하였고, 150 ㎕의 용출 버퍼를 사용하면 일반적으로 약 200 ng/㎕의 최종 농도를 생성하였다. RNA를 추출한 후, Ribogreen 정량 시약 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes))을 제조사 프로토콜에 따라 사용하여 RNA의 수율 및 농도를 결정하였다. 추출된 RNA의 통합성은 28S 및 18S 밴드가 동일한 강도를 갖는지를 결정하기 위해 EtBr 염색된 아가로스 겔 상에서 평가하였다. 또한, 추출된 RNA의 통합성은 제조사 프로토콜에 따라 Agilent 2100을 사용하여 평가하였다. Agilent Bioanalyzer/"Lab-On-A-Chip"은 RNA 샘플의 전기영동도를 생성하는 마이크로-유체 시스템이다. 18S 및 28S 밴드의 비 및 기저선의 평탄도를 관찰함으로써, RNA 분해 수준을 결정할 수 있다. 28S:18S 비가 1 미만인 샘플은 폐기하였다.
추출 동안 게놈 DNA의 오염 수준을 결정하기 위해 RNA 샘플을 또한 RT-PCR에 의해 검사하였다. RNA를 cDNA 합성을 위해 배열하였다. 일반적으로, 최소 10개의 정상 샘플 및 20개의 종양을 각각의 종양 종류에 대해 분석하였다. 사용되는 프라이머는 다음과 같았다: SGP758 (정방향 서열; ctggtcatgcgcagggt (서열 23); 역방향 서열; ctcaccggcttcgtgctc (서열 24); 프로브 서열; ggcagcatggacgtcaacgcg (서열 25))을 FZD10에 대해 사용하였다.
정상 및 종양 샘플 내의 표적 유전자의 발현 수준은 ABI PRISM 7900HT 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티))을 사용하는 정량적 RT-PCR을 이용하여 결정하였다. 상기 방법은 참 조군 (정규화군 (normalizer)) 하우스키퍼 (housekeeper) 유전자 (Pre-Developed TaqMan(등록상표) Assay Reagents Gene Expression Quantification Protocol, Applied Biosystems, 2001)에 비해 표적 템플레이트의 초기 카피 수의 정량에 기초한다. 각각의 PCR 사이클에서 DNA 산물의 축적은 앰플리콘 효율 및 초기 템플레이트 농도에 관련된다. 따라서, 표적과 정규화군의 증폭 효율은 유사해야 한다. 출발 템플레이트 카피 수 및 DNA 증폭 효율에 의존하는 역치 사이클 (CT)은 그 동안 PCR 산물 성장이 지수 성장을 보이는 PCR 사이클이다. 각각의 분석은 4중으로 수행하고; 따라서, 주어진 샘플 내의 표적 유전자에 대해 4개의 CT 값을 얻었다.
이와 동시에, 하우스키퍼 유전자 군의 발현 수준도 또한 동일한 방식으로 측정하였다. 4중 실험 내에서 바깥점 (outlier)을 검출하고, 나머지 3중 실험의 표준 편차가 원래의 4중 실험의 표준 편차에 비해 30% 이하이면 제거한다. 각각의 종양 종류에 대해 시험된 이소형의 유병율도 결정하였다. 그 결과를 도 3에 제시하였다. 간단히 설명하면, 원발 종양 (최소 10개의 정상 & 20개의 종양 샘플 패널)에 대한 정량적 PCR 데이타는 FZD10이 42%의 폐암 환자 샘플, 30%의 난소암 환자 샘플 및 36%의 대장암 환자 샘플에서 과다발현되었음을 나타냈다.
실시예 3: 상이한 암 세포주에서 FZD10 의 표면 발현
상이한 암 세포주 상의 FZD10의 표면 발현을 다음과 같이 분석하였다. 암 세포주 상의 FZD10의 표면 발현을 GUAVA Express 시스템 및 GUAVA 96-PCA 기구 (GUAVA (미국 캘리포니아주 헤이워드))의 분석에 의해 결정하였다. 암 세포주를 실시예 2에 설명된 절차를 사용하여 정량적 RT-PCR에 의해 FZD10 mRNA 발현에 대해 평가하였다. FZD10 mRNA 발현 세포 (SW620, NCI-H460, DOV13) 및 FZD10 mRNA 비-발현 세포 (HCT116, A549 및 SKOV3)인 선택된 대장, 폐 및 난소암 세포주를 80-90% 융합도 (confluence)로 성장시키고, GUAVA-96 발현 시스템을 사용하여 유동 세포측정 분석을 위해 수거하였다. 96-웰 둥근 바닥 플레이트를 실온에서 20분 동안 웰 당 50 ㎕의 염색 버퍼 (1X PBS, 2% BSA, 0.05% 나트륨 아지드)에 의해 예비-차단하였다. 세포를 분취하기 전에 플레이트로부터 염색 버퍼를 제거하였다. 적절한 부피의 세포를 각각의 세포주에 대해 15 ml 원뿔형 튜브에 옮기고, 염색 버퍼 내에서 세척하고 5 X 104 세포/100 ㎕ 농도로 희석하였다. 각각의 세포주에 대해, 100 ㎕의 희석된 세포를 3중 샘플에 대해 각각의 웰로 예비-차단된 96 웰 둥근 바닥 플레이트로 분취하였다. 세포를 50 ㎕의 FZD10에 대한 폴리클로날 항체 (10 ㎍/ml 농도) 또는 대조 항체, 예를 들어 전면역 토끼 IgG로 얼음 상에서 30분 동안 염색하고, 1차 항체 인큐베이션 직후에, 염색된 세포를 200 ㎕의 세척 버퍼 (1X PBS, 0.05% 나트륨 아지드)로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 2차 항체인 염소 (Fab'2) 항-토끼 IgG-PE-컨쥬게이팅된으로 얼음 상에서 30분 동안 염색하고, 2차 항체 인큐베이션 직후에, 염색된 세포를 200 ㎕의 세척 버퍼 (1X PBS, 0.05% 나트륨 아지드)로 2회 세척하였다. 이어서, 염색된 세포가 존재하는 96-웰 플레이트를 Guava-96 PCA 기구 및 Guava Express 시스템을 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 분석하여, PE-컨쥬게이팅된 2차 항체에 의해 방출되는 형광 신호에 기초하여 각각의 암 세포주의 FZD10의 상대적인 표면 발현을 결정하였다.
도 4에 제시된 결과는 GUAVA Express 시스템으로부터 데이타 출력의 도면이다. 그래프는 로그 척도의 형광 신호에 대비한 세포 계수로 플로팅한다. 음성 대조군으로서 전-면역 토끼 IgG에 비교할 때 FZD10의 단백질 표면 발현이 대장암 세포주 SW620, 폐암 세포주 NCI-H460에서 검출되었고, 일부 표면 발현이 난소암 세포주 DOV13에서 검출가능하였지만, 세포주 HCT116, A549 및 SKOV3에서는 검출되지 않았다. 데이타는 정량적 PCR 분석에 기초한 이들 암 세포주의 FZD10 mRNA 발현 수준과 일치하였다.
실시예 4: siRNA는 FZD10의 표면 발현을 감소시킨다.
상이한 수준에서 FZD10을 발현하는 다양한 세포주 (H460 폐암, EKVX 비-소세포 폐암, NCI-H2126 폐암, SW620 대장 및 Colo320DM 대장), 및 FZD10을 발현하지 않는 2개의 세포주 (MCF7 유방 및 A549 폐)로부터의 세포를 다음과 같이 FZD10 siRNA-매개된 녹다운의 효과에 대해 분석하였다. 상이한 세포주는 상이한 siRNA 형질감염 조건을 가질 수 있다. H460의 경우에 (도 5), 세포를 형질감염 1일 전에 10 ml의 배지 내에 10 cm 디쉬에 600,000 세포/웰로 접종하였다. 플레이트를 37℃ O/N에서 인큐베이팅하였다. 다음날 배지를 제거하고, 3 ml의 완전 배지를 첨가하였다. 에펜도르프 (Eppendorf) 관 내에서, 1.2 ml의 OptiMem을 250 pmol의 siRNA와 혼합하였다. 별개의 관 내에서, 1.2 ml의 OptiMem을 사용하여 25 ㎕의 Dhamarfect-1 지질 시약 (다마콘 (Dharmacon, 미국 콜로라도주 라파예트))을 희석하였다. 희석된 지질을 희석된 siRNA와 혼합하여 실온에서 25분 동안 복합체를 형성시킨 후, 세포에 적가하였다. 세포 배지 내의 siRNA의 최종 농도는 50 nM이었 다. siRNA가 존재하는 세포를 37℃에서 4 h 내지 철야 인큐베이팅하고, 완전 배지로 교체하였다. 실시예 3에 확립된 방법에 따라 RNA/FZD10 표면 발현 수준을 모니터링하기 위해 세포를 24-72시간에서 수거하였다. EKVX 세포의 경우에, 접종 세포 밀도는 1,000,000 세포/10 cm 디쉬였고, 형질감염마다 5 ㎕의 Dharmafect-2 지질 (다마콘)을 사용하였다. NCI-H2126의 경우에, 접종 세포 밀도는 750,000 세포/10 cm 디쉬였고, 형질감염마다 15 ㎕의 Dharmafect-1 지질 (다마콘)을 사용하였다. SW620의 경우에, 접종 세포 밀도는 1,200,000 세포/10 cm 디쉬였고, 형질감염마다 15 ㎕의 Lipofectamine-RNAiMAX (인비트로겐 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드) 지질을 사용하였다. Colo320DM의 경우에, 접종 세포 밀도는 1,000,000 세포/10 cm 디쉬였고, 형질감염마다 15 ㎕의 Dharmafect-2 지질 (다마콘)을 사용하였다. 모든 siRNA를 모든 세포 종류에서 50 nM 농도에서 형질감염시켰다.
사용된 FZD10 특이적 siRNA는 CHIR317.1.4 또는 FZD10-1: GCACAAGTGCAAAATGAAC (서열 26); CHIR317.2.2 또는 FZD10-2: AGCAGGTGTGCAGCCGTAGGTTAAA (서열 27)이었고; 음성 대조군 siRNA로서, 앰비온 (Ambion) (CHIR317.1.4 또는 NC-I)의 화학에 매칭된 사일렌서 (Silencer) 음성 대조군 #2 (앰비온, Cat#4637)를 구입하고 모든 siRNA 실험에 사용하였다. 음성 대조군 siRNA로서, 인비트로겐 스텔스 (Stealth) siRNA (CHIR317.2.2 또는 NC-2)의 화학에 매칭된 인비트로겐 스텔스 RNAi 음성 대조군 중간 (medium) GC 이중체 (인비트로겐, Cat# 12935-300)를 구입하고 모든 siRNA 실험에 사용하였다. CHIR109.2.4 또는 Eg5-1: GGGAGCAAAUGAACCUGAUTT (서열 28)을 모든 기능적 연구에 서 앰비온의 화학에 매칭된 양성 대조군으로서 사용하였다. CHIR109.1.2 또는 Eg5-2: UCCAAACUGGAUCGUAAGAAGGCAG (서열 29)를 모든 기능적 연구에서 인비트로겐 스텔스 RNAi의 화학에 매칭된 양성 대조군으로서 사용하였다.
mRNA 발현은 siRNA 형질감염 24시간 후에 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 측정하였다. 각각의 siRNA 형질감염된 샘플의 mRNA는 실시예 2에 설명된 방법에 의해 추출하고 정량하였다. 모든 샘플을 반-정량적 RT-PCR (GeneAmp(등록상표), 어플라이드 바이오시스템즈)에 의해 비교하였다. 2개의 프라이머 세트는 유사한 시험 결과를 보여주었다 ("ABTP 500/501"로 명명된 프라이머 세트로부터의 데이타를 도 5에 나타냈다). FZD10-1 siRNA는 음성 대조군-1에 비해 66%의 FZD10 mRNA를 녹다운시켰고, FZD10-2 siRNA는 음성 대조군-2에 비해 77%의 FZD10 mRNA를 녹다운시켰다. 상대적인 발현을 모든 샘플의 HPRT 유전자 발현에 의해 정규화하였다. 그 결과는 두 siRNA 모두가 24시간 시점에서 H460 내의 FZD10 mRNA 수준을 적어도 60% 녹다운시켰음을 입증하였다.
NCI-H460 세포 상에서 siRNA 형질감염 후 FZD10의 표면 발현을 상기 실시예 3에 설명된 바와 같이 측정하였다. 도 5는 전면역 토끼 IgG 항체 음성 대조군에 비해 표면 염색된 세포의 백분율의 그래프이다. NCI-H460 상에서 FZD10의 표면 발현의 siRNA 매개된 녹다운의 운동학을 모니터링하기 위해, 형질감염된 세포를 3개의 상이한 시점 (형질감염 24, 48 및 72 hr 후)에 수집하였다. NC-I siRNA 형질감염된 샘플의 FZD10 표면 발현 %는 FZD10-1 siRNA 형질감염된 샘플에 의한 표면 발현의 감소 %와 비교하기 위해 임의로 100%로 설정하였다. 이와 유사하게, NC-2 siRNA 형질감염된 샘플의 FZD10 표면 발현 %는 FZD10-2 siRNA 형질감염된 샘플에 의한 표면 발현의 감소 %와 비교하기 위해 임의로 100%로 설정하였다. 모의 (mock) 비형질감염된 샘플은 NC-I에 상대적이었다. 그 결과는 FZD10-1 siRNA가 48 및 72시간 시점에서 FZD10 표면 발현을 보다 명백하게 감소시키고, FZD10-2 siRNA는 또한 48 및 72시간 시점에서 FZD10 표면 발현의 가장 강한 녹다운을 보여주지만 FZD10-1 siRNA의 녹다운에 비해 강하지 않고, 이는 FZD10-2 siRNA 형질감염된 샘플 상에서 FZD10의 표면 발현의 적어도 20%가 남아있기 때문임을 제시하였다. 도 5는 또한 각각의 형질감염된 샘플 내에 검출된 신호의 양을 입증하기 위해 72시간 시점에서 각각의 샘플에 대한 막대그래프 데이타를 보여준다. 종합하면, RT-PCR 및 GUAVA Express 분석은 두 siRNA에 의한 FZD10 표면 발현의 감소를 입증하였고, FZD10-1가 FZD10-2보다 더 효과적이다.
발광성 세포 적정 (cell titer glow; ATP 측정; 프로메가) 분석을 이용하여 부착-의존성 세포 성장을 측정하였다. siRNA 형질감염의 24시간 후에, 세포를 96-웰 플레이트 상에 세포 종류에 따라 1000-5000 세포/웰로 플레이팅하였고, NCI-H460에 대해 1600 세포/웰을 접종하였다. 형질감염 후 다양한 시점에서 (24시간, 48시간, 72시간, 96시간); 세포를 용해시키고 제조사의 지시에 따라 발광성세포 적정을 이용하여 분석하였다. 발광성 세포 적정 분석의 출력은 상대적인 세포 수에 비례하는 형광을 제공한다. 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 부착-의존성 세포 성장의 감소가 Eg5에 대한 대조 항-증식 siRNA (Eg5-1 및 Eg5-2)에 동등한 정도로 FZD10-1 및 FZD10-2 siRNA 모두에 의해 NCI-H460 폐암 세포 및 EKVX 폐암 세포에서 관찰되었다. 증식은 2개의 상이한 siRNA 합성 화학의 2개의 음성 대조군 (NC-1 & NC-2)에 의해 억제되지 않았다. 이들 결과는 NCI-H460 및 EKVX 폐암 세포주에서 FZD10의 녹다운이 증식을 억제함을 보여주었다.
카스파제 3/7 Glow (프로메가 # G8090) 분석을 이용하여 암 세포주에서 siRNA 형질감염에 의해 유도된 세포자멸을 측정하였다. siRNA 형질감염 24시간 후에, 세포를 96-웰 플레이트 상에 세포 종류에 따라 1000-5000 세포/웰로 플레이팅하였고, NCI-H460에 대해 1600 세포/웰로 접종하였다. 형질감염 후 다양한 시점에서 (48시간 & 72시간), 세포를 용해시키고 제조사의 지시에 따라 세포 적정 블루 (cell titre blue) 생활력 분석 (프로메가 #G8O8O)을 이용하여 분석하였다. 세포 적정 블루 분석의 출력은 상대적인 세포 수에 비례하는 형광을 제공한다. 플레이트 판독기에 의해 형광 신호를 기록할 때, 동일한 96-웰 플레이트를 사용하여 동일 부피의 카스파제 3/7 Glow 시약과 함께 암소에서 1시간 동안 인큐베이팅함으로써 카스파제 3/7 활성을 측정하였다. 발광 신호를 제조사의 지시에 따라 플레이트 판독기로 측정하고, 세포 적정 블루 분석을 이용하여 초기에 기록된 생활력 신호로 정규화함으로써 데이타를 분석하였다. 정규화된 신호가 보다 큰 것은 카스파제 3/7 활성의 증가를 나타냈고, 이것은 세포자멸을 나타내는 것이다. 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이, 카스파제 3/7 활성의 증가가 Eg5에 대한 양성 대조군 siRNA (Eg5-1 및 Eg5-2)에 동등한 정도로 FZD10-1 및 FZD10-2 siRNA 모두에 의해 NCI-H460 폐암 세포 및 EKVX 폐암 세포에서 관찰되었다. 카스파제 3/7 활성은 2가지 상이한 siRNA 합성 화학의 2개의 음성 대조군 (NC-I & NC-2)에 의해 유도되지 않았 다. 이들 결과는 NCI-H460 및 EKVX 폐암 세포주에서 FZD10의 녹다운이 카스파제 3/7 활성을 유도하는 메카니즘을 통한 세포자멸을 유도하였음을 보여주었다.
연질-아가 분석을 이용하여 부착-비의존성 세포 성장을 측정하였다. 연질 아가 분석은 세포가 플레이트에 부착하는 것을 방지하기 위해 먼저 비-조직 배양 처리된 플레이트를 Poly-HEMA로 코팅함으로써 수행하였다. 트립신을 사용하고 배지 내에 2회 세척함으로써 비-형질감염된 세포를 수거하였다. 세포는 혈구계를 사용하여 계수하고, 배지 내에 104 세포/ml로 재현탁시켰다. 50 ㎕ 분취액을 polyHEMA 코팅된 96-웰 플레이트에 넣고 형질감염시켰다.
형질감염 다음날에, 세포를 트립신 처리하고, 재현탁시키고 계수하였다. 세포를 약 1000 세포/100 ㎕/웰로 희석하고, 딥 (deep) 웰 블록 (최대 부피 = 1 ml/웰, 3중으로, 표준 배치에 따라)으로 전달하였다. 세포를 2개의 플레이트에 플레이팅하였다: 분석을 위한 Corning #7007 Ultra Low Adherent U-플레이트, 및 플레이팅 효능 검사를 위한 Corning #3799. Seaplaque GTG 아가로스 3%를 마이크로파 오븐 내에서 약 1분 동안 가열함으로써 용융시켰다. 충분히 용융되었을 때, 약 10 ml를 예비-가온한 50 ml 폴리프로필렌 튜브 (Falcon #35-2070)에 붓고, 6O℃ 가열 블록에서 적어도 10분 동안 인큐베이팅하였다. 약 18.6 ml 완전 배지를 50 ml 폴리프로필렌 튜브에 첨가하고, 약 37℃에서 수조에서 인큐베이팅하였다. Multimek™ 피페터 (pipettor)를 사용하여 아가로스를 96웰 플레이트 내의 세포에 분배하였다. 약 18.6 ml의 따뜻한 배지를 10 ml의 아가로스에 붓고, 부드럽게 뒤집어 잘 혼합하였다. 플레이트를 아가로스가 빨리 응고되도록 20-30 min 동안 약 4℃에서 인큐베이팅하였다. 아가로스가 응고된 후, 100 ㎕ 완전 배지를 세포 위에 첨가하였다. 0일 플레이팅 효율을 측정하기 위해, 약 25 ㎕/웰 Alamar Blue를 첨가하고, 37℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 플레이트를 TECAN 플레이트 판독기 상에서 530ex/590em에서 18-24시간 후에 판독하였다. 분석 플레이트를 37℃에서 7일 동안 인큐베이팅한 후 Alamar Blue (25 ㎕/웰)로 현상하였다.
NCI-H460 세포에 대한 대표적인 증식, 세포자멸 및 연질 아가 분석의 결과를 도 6에 제시하였고, 이는 FZD10-1 및 FZD10-2 siRNA 모두가 증식 (부착-의존성 및 비의존성 모두)을 억제하고 상기 세포주의 세포자멸을 유도할 수 있었음을 보여준다.
또한, FZD10 녹다운의 기능적 측면에서의 결과는 폐암 세포주 NCI-H460에서 PARP 절단에 대한 siRNA의 효과를 조사함으로써 시험하였다. PARP 절단은 세포자멸의 매개자인 카스파제의 활성화를 표시한다. 적절한 양성 및 음성 대조군과 함께 siRNA로 형질감염된 세포를 48 hr 및 72 hr에 수거하고 RIPA 버퍼 내에서 용해시켰다. 이어서, 세포 용해물을 로딩 (loading) 대조군으로서 PARP 및 β-튜불린의 발현 및 처리에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. PARP 절단은 양성 대조군 (Eg5-1 및 Eg5-2)에서 증가하였고, 72시간 시점에 보다 강한 신호를 가졌다. FZD10에 대한 siRNA (FZD10-1 & FZD10-2)의 형질감염은 또한 약한 PARP 절단 생성물을 출현시켰지만 음성 대조군 형질감염된 (NC-1 & NC-2) 샘플에서는 나타나지 않았다. 도 6에 도시된 바와 같이, FZD10-1 siRNA (증식을 억제하는데 보다 효과적 임)는 48시간 및 72시간 시점 모두에서 검출가능한 PARP 절단을 제공한 반면, FZD10-2 siRNA (증식을 억제하는데 덜 효과적임)는 검출가능한 PARP 절단을 나중의 72시간 시점에서만 제공하였다. β-튜불린의 발현은 모든 샘플에 걸쳐 균일하고, 이것은 투입 세포 용해물의 동일한 양을 나타낸다. 상기 데이타는 FZD10의 녹다운에 의해 유도되는 성장 억제가 부분적으로는 세포자멸 메카니즘에 의한 것임을 시사하였다.
FZD10을 발현하는 모든 세포주가 FZD10 siRNA에 의해 억제될 수 있는 것은 아니다. FZD10을 발현하지 않는 세포주, 예를 들어 MCF7 및 A549를 동일한 siRNA의 형질감염에 의해 시험하였고, 기능적 효과 (증식, 연질 아가 성장 및 세포자멸)가 관찰되지 않았다. 세포 표면 상에 FZD10을 발현하고 그의 발현이 siRNA에 의해 차단될 수 있는 SW620 (도 8) 및 Colo320DM (도 9)과 같은 세포주는 Eg5 양성 대조군 (Eg5-1 & Eg5-2)에 의해 나타난 우수한 효과에도 불구하고 siRNA 형질감염 후 임의의 기능적 효과를 갖지 않았다. 상기 대장암 세포주는 WNT 신호전달을 매개하기 위한 FZD10의 세포외 요건을 회피할 수 있는 APC 돌연변이를 보유하고, 따라서 siRNA 처리에 반응하지 않는다. 요약하면, 이들 siRNA 데이타는 세포 성장 및 생존을 위한 FZD10의 요건이 상황 의존적임을 제안하였다. APC 상에 β-카테닌 활성화 돌연변이 또는 불활성화 돌연변이를 보유하는 세포주는 FZD10 길항제를 사용하는 치료에 불응성일 수 있다.
Figure 112009028604632-PCT00003
실시예 5: 항- FZD10 ECD 항체 생산
토끼를 면역화시키기 위해 사용되는 FZD10 항원은 다음과 같이 제조하고 정제하였다.
분비형 FZD10-ECD 단백질을 함유한 바큘로바이러스 감염된 TN5 세포의 성장 배지 (10 L를 1.6 L로 농축함)를 단백질 정제를 위한 출발 물질로 사용하였다. 이미다졸을 상등액에 5 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 내독소 부재 버퍼 및 장치를 사용하여 작업하여, 상등액을 Ni 버퍼 A (PBS (pH 7.4)/0.35M NaCl/5 mM 이미다졸)로 평형화시킨 후의 25 ml Ni HP (G.E.) 컬럼 (6cm 높이 x 2.6 cm 길이) 상에 로딩하였다. 컬럼을 버퍼 A로 기저선까지 세척하고, 단백질을 30CV 구배로 100% Ni 버퍼 B (PBS (pH 7.4)/0.35M NaCl/500 mM 이미다졸)에 용출시켰다. 아르기닌을 분획에 100 mM 최종 농도로 첨가하였다. FZD10을 함유하는 분획을 SDS-PAGE 환원 겔을 사용하여 분석하고 모았다. 풀을 SP 버퍼 A (25 mM MES (pH 5.7)/0.1M 아르기닌)에 대해 8 mS/cm의 최종 전도도로 투석하였다. 투석시킨 풀을 SP 버퍼 A로 평형화시킨 5 ml SP Fast Flow Hi Trap 컬럼 (G.E.) 상에 로딩하였다. 컬럼을 SP 버퍼 A로 기저선까지 세척하고, 30CV 구배로 100% SP 버퍼 B (25 mM MES (pH 5.7)/0.1M 아르기닌/500 mM NaCl)에 용출시켰다. FZD10을 함유하는 분획을 SDS-PAGE 환원 겔을 사용하여 분석하고 모았다. SP 풀을 Ni2 버퍼 A (PBS/0.35M NaCl/5 mM 이미다졸/100 mM 아르기닌)로 평형화시킨 5 ml Ni HP Hi Trap (G.E.) 상에 로딩하였다. 컬럼을 Ni2 버퍼 A로 기저선까지 세척하고, 20CV 구배로 100% Ni2 버퍼 B (PBS/0.35M NaCl/500 mM 이미다졸/100 mM 아르기닌)에 용출시켰다. FZD10을 함유하는 분획을 SDS-PAGE 환원 겔을 사용하여 분석하고 모았다. 제2 Ni 풀을 Ultrafree 15 ml 농축기 (밀리포어 (Millipore))를 사용하여 10 ml의 최종 부피로 농축시켰다. 농축물을 GFC 버퍼 (PBS (pH 7.4)/100 mM 아르기닌)로 평형화시킨 Superdex 75 26/60 겔 여과 컬럼 (G.E.) 상에 로딩하였다. FZD10을 함유하는 분획을 SDS-PAGE 환원 겔을 사용하여 분석하고 모았다. 단량체 및 이량체를 따로 모으고, 단량체 물질을 사용하여 항체를 생성시켰다. 단량체 물질의 순도는 Coomassie SDS-PAGE로 분석할 때 95%이었고, 내독소 수준은 0.3 EU/mg 단백질 미만이었다. 최종 농도는 1.1 mg/ml이고, -8O℃에서 보관하였다.
FZD10 단백질을 m-말레이미도 벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS) (피어스 (Pierce, 미국 일리노이주 록포드))를 사용하여 토끼 혈청 알부민 (RSA)에 컨쥬게이팅시켰다. 컨쥬게이팅된 단백질을 사용한 면역화 프로토콜은 표준 방법에 따라 수행하였다. 초기에, 토끼의 예비-출혈을 면역화 전에 수행하였다. 제1 면역화는 프로인트 완전 면역보강제 및 500 ㎍ 컨쥬게이팅된 단백질을 포함하였다. 선행 주사 4주 후에 수행된 모든 후속 면역화는 동일한 양의 단백질을 함유한 프로 인트 불완전 면역보강제를 포함하였다. 출혈을 면역화 후 7 내지 10일 동안 수행하였다. 면역화 77일 후, 분석 및 정제를 위해 혈액을 모았다.
토끼 항-FZD 10-특이적 항체를 다음과 같이 제조하고 정제하였다. FZD10 항원을 NHS 활성화된 HP (G.E. 카탈로그 #10-0716-01)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 HP 수지에 커플링시켰다. 77일에, 토끼 혈청을 버퍼 A (75 mM Tris-HCl (pH 8.0))으로 평형화시킨 FZD10 친화도 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 버퍼 A로 기저선까지 세척하였다. 항체를 버퍼 B (100 mM Glycine (pH 2.7))으로 100 mM Tris (pH 8.0)의 최종 농도에 대해 Tris (pH 8.0)을 함유하는 분획 내로 단계 용출하였다. 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 항체 함유 분획을 모았다. 웨스턴 블롯 분석은 항체가 대조 항원 EPHB3에 또는 FZD9에 결합하지 않았음을 보여주었다.
단백질 용해물을 RIPA 버퍼 (테크노바 (Teknova))로 상이한 세포주의 세포 펠렛으로부터 제조하고, 용해물을 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리한 후, 실험실 내 정제된 항-FZD10 항체 (토끼 A 및 토끼 B는 2개의 별개의 면역화된 동물을 나타낸다)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 세포주는 FZD10을 발현하지 않는 293T 인간 배아 신장 섬유모세포 (음성 대조군); 양성 대조군으로서 FZD10 포유동물 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 293T 세포; 정량 RT-PCR에 기초하여 FZD10을 발현하지 않는 일련의 인간 폐암 세포주, 즉 NCI-H661, NCI-H1915, NCI-H446; 정량 RT-PCR에 기초하여 FZD10을 발현하는 일련의 인간 폐암 세포주, 즉 NCI-H2126, NCI-H23, EKVX 및 NCI-H460; 인간 난소암 세포주 PAI을 포함하였다 (도 10).
3개의 밴드 (~60 kD, ~120 kD & ~18O kD)가 양성 대조군 (FZD10 형질감염된 293T) 세포 용해물에서 관찰되었다. 흐린 밴드 (180kDa)의 보다 고 분자량의 생성물은 SDS-PAGE에 의한 완전히 변성될 수 없는 삼량체 형태의 단백질일 수 있는 한편, 120kDa 밴드는 이량체 형태의 FZD10일 수 있다. 토끼 A 항-FZD10 항체는 단량체 형태의 FZD10을 향한 보다 강한 선호를 갖는 것으로 보이지만, 또한 모든 인간 암 세포주에 걸쳐 적어도 2개의 배경 밴드를 다양한 정도의 강도로 취하였다. 토끼 A 항-FZD10 항체는 또한 FZD9와 교차-반응하였고, 이는 이들 다른 밴드가 FZD9 또는 다른 잠재적인 FZD 패밀리 멤버를 나타낼 수 있음을 제안한다. 토끼 B 항-FZD10 항체는 FZD10의 단량체 및 이량체 형태를 향한 동일한 선호를 갖는 것으로 보이지만, 또한 50 및 36 kDa에서 2개의 배경 밴드를 취하였다. 토끼 B 항-FZD10 항체는 FZD9 (가장 가까운 상동체)와 교차 반응하지 않았으므로, 이는 이들 다른 밴드가 아마도 상기 항체에 의해 인식되는 비-특이적 단백질임을 제안한다. 일반적으로, FZD10 단백질 발현은 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 결정한 정량적 RT-PCR Ct 수준과 일치한다 (표 2). Ct 값은 특정 수의 PCR 사이클 후의 검출 역치를 나타낸다. 보다 높은 Ct 값은 cDNA를 검출하기 위해 보다 높은 사이클 수가 필요함을 나타내고, 따라서 mRNA 수준이 보다 낮음을 표시한다. 표 2는 FZD10이 다수의 인간 폐암 세포주에 유의한 수준으로 발현됨을 나타낸다.
Figure 112009028604632-PCT00004
Figure 112009028604632-PCT00005
실시예 6: 폐 종양 마이크로어레이 ( TMA ) 및 시판되는 다수-종양 TMA 상의 FZD10의 면역조직화학 분석
조직 절편을 파라핀 제거하고, 항원 회복은 Ventana Discovery 기구 ((벤타나 메디칼 시스템즈, 인크. (Ventana Medical Systems, Inc., 미국 애리조나주 투선)) 상에서 수행하였다. 표준 세포 조건화를 수행한 후, 세포를 60분 동안 1차 항체와 함께 인큐베이팅하였다. 토끼 항-인간 FZD10 RbBd77 항체 (키론 (Chiron, 미국 캘리포니아주 에머리빌)) 및 토끼 IgG 예비출혈 대조군 (키론)을 10 ㎍/ml에서 사용하였다. 검출을 위해 Ventana Universal Secondary 시약 (벤타나 메디칼 시스템즈, 인크.)에 이어 Ventana DAB Map 키트 (벤타나 메디칼 시스템즈, 인크.)을 사용하였다. 대조염색을 위해 Ventana Hematoxylin and Bluing 시약 (벤타나 메디칼 시스템즈, 인크.)을 사용하고, 절편을 농도차 (graded) 알콜 내에서 탈수시키고, 자일렌 내에서 깨끗이 하고, 합성 마운팅 배지를 사용하여 커버슬리핑하였다.
FZD10 발현을 핵 점상 (punctate)으로서 관찰하고, BL-2+ 세포질 발현을 혈관계 및 종양 상피에서 관찰하였다. 총 FZD10 발현은 약하고 종양 상피에서 관찰되었다. 전면역 RbBd0은 몇몇 종양 성분에서 일부 세포질 확산 흐림 (blush), 및 염증성 세포에 대한 반응성을 보였다. FZD10의 발현은 대부분의 폐암 성분, 일부 대장암 및 난소암 성분에서 관찰되었다. 방광, 식도, 자궁경부, 유방, 갑상선, 위, 췌장, 피부, 전립선 및 직장 유래 암은 또한 아래 표 3 및 4에 기재된 바와 같이 FZD10 발현에 대해 평가되었다.
Figure 112009028604632-PCT00006
Figure 112009028604632-PCT00007
Figure 112009028604632-PCT00008
Figure 112009028604632-PCT00009
실시예 7: FZD10의 과다발현은 Dishevelled 패밀리 멤버의 인산화를 유도하였다.
293T 세포를 FZD10, FZD9, LRP5, WNT7a 및 WNT7b를 발현하는 포유동물 발현 벡터로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 24시간 후에 수거하고, 세포를 RIPA 버퍼 (테크노바) 내에서 용해시켜 총 세포 용해물을 생성하였다. 각종 트랜스젠의 발현을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. FZD10 발현은 항-FZD10 RbBD77 토끼 폴리클로날 항체에 의해 검출하였다. FZD9 발현은 항-FZD9 염소 폴리클로날 항체 (알&디 시스템즈 (R&D systems))에 의해 검출하였다. LRP5는 항-LRP5 항체 (산타 크루즈 (Santa Cruz))에 의해 검출하였다. Wnt7a-HA 및 Wnt7b-HA 발현은 항-HA 태그 모노클로날 항체 (코방스 (Covance))에 의해 검출하였다. 이들 형질감염된 293T 세포 용해물 내의 Dvl2 및 Dvl3의 인산화 상태는 모든 번역후 변형된 및 비변형된 Dvl2 및 Dvl3 단백질을 인식하는 토끼 폴리클로날 항체 (셀 시그날링 (Cell Signaling))에 의한 Dvl2 및 Dvl3의 이동성 쉬프트에 의해 결정하였다. 도 11은 FZD9 또는 FZD10의 과다발현이 Dvl2 및 Dvl3 모두의 과다-인산화를 야기하였음을 보여주었다. 이러한 관찰은 세포주에서 프리즐드 과다발현의 보고된 효과와 일치하고, 이는 Dvl2 및 Dvl3 인산화 상태가 암 세포주에서 FZD10 과다발현의 직접적인 판독치로서 사용될 수 있음을 시사하였다.
실시예 8: FZD10의 siRNA 녹다운은 인간 폐암 세포주 NCI-H460에서 Dishevelled 패밀리 멤버의 인산화를 감소시켰다.
Dvl2 및 Dvl3의 인산화 상태에 대한 FZD10-1 및 FZD10-2 siRNA에 의한 FZD10 녹다운의 효과를 NCI-H460 폐암 세포주에서 시험하였다 (도 11). 세포를 siRNA 및 상응하는 음성 대조군과 24시간 동안 인큐베이팅한 후, 세포 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. 항-FZD10 항체 RbBd77 (키론, 에머리빌, 캘리포니아)을 사용하여 FZD10 단백질의 감소를 검출하였다. Dvl2 및 Dvl3의 인산화 상태는 모든 번역후 변형된 및 비변형된 Dvl2 및 Dvl3 단백질을 인식하는 항-Dvl2 및 항-Dvl3 토끼 폴리클로날 항체 (셀 시그날링)에 의해 검출되었다. Dvl2 및 Dvl3의 이동성이 보다 느린 종은 24시간에서 FZD10-1 siRNA에 의해서만 감소되었고, 임의의 음성 대조군에 의해서는 그렇지 않았다. FDZ10-2 siRNA의 보다 낮은 효과는 FZD10-1 siRNA에 비해 상기 siRNA의 느린 녹다운 운동학에 의한 것일 수 있다 (실시예 4). 상기 데이타는 FZD10을 과다발현하는 암 세포주, 예를 들어 NCI-H460 내의 Dvl2 및 Dvl3의 인산화 상태가 암 세포주에서 FZD10의 기능적 녹아웃에 대한 표적 조정 바이오마커로서 사용될 수 있음을 제시하였다.
실시예 9: 서열
Figure 112009028604632-PCT00010
Figure 112009028604632-PCT00011
본 발명을 그의 특정한 실시태양을 참고로 하여 설명하였지만, 당업자는 다양한 변경이 가능하고, 본 발명의 진정한 취지 및 범위에서 벗어나지 않는 동등물로 대체될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 많은 변형이 특정 상황, 물질, 주요 조성물, 방법, 방법 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 취지 및 범위에 적합하게 만들기 위해 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Methods of Treating, Diagnosing or Detecting Cancer <130> 28266.000 (227527/42120) <150> 60/858,882 <151> 2006-11-14 <160> 29 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1746 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 atgcagcgcc cgggcccccg cctgtggctg gtcctgcagg tgatgggctc gtgcgccgcc 60 atcagctcca tggacatgga gcgcccgggc gacggcaaat gccagcccat cgagatcccg 120 atgtgcaagg acatcggcta caacatgact cgtatgccca acctgatggg ccacgagaac 180 cagcgcgagg cagccatcca gttgcacgag ttcgcgccgc tggtggagta cggctgccac 240 ggccacctcc gcttcttcct gtgctcgctg tacgcgccga tgtgcaccga gcaggtctct 300 acccccatcc ccgcctgccg ggtcatgtgc gagcaggccc ggctcaagtg ctccccgatt 360 atggagcagt tcaacttcaa gtggcccgac tccctggact gccggaaact ccccaacaag 420 aacgacccca actacctgtg catggaggcg cccaacaacg gctcggacga gcccacccgg 480 ggctcgggcc tgttcccgcc gctgttccgg ccgcagcggc cccacagcgc gcaggagcac 540 ccgctgaagg acgggggccc cgggcgcggc ggctgcgaca acccgggcaa gttccaccac 600 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acaaccagac taaaacgctg gactgcctga tggccgcctc catccccgcc 1500 gtggagatct tcatggtgaa gatctttatg ctgctggtgg tggggatcac cagcgggatg 1560 tggatttgga cctccaagac tctgcagtcc tggcagcagg tgtgcagccg taggttaaag 1620 aagaagagcc ggagaaaacc ggccagcgtg atcaccagcg gtgggattta caaaaaagcc 1680 cagcatcccc agaaaactca ccacgggaaa tatgagatcc ctgcccagtc gcccacctgc 1740 gtgtga 1746 <210> 2 <211> 578 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Met Gln Arg Pro Gly Pro Arg Leu Trp Leu Val Leu Gln Val Met Gly 1 5 10 15 Ser Cys Ala Ala Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly 20 25 30 Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn 35 40 45 Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala 50 55 60 Ala Ile Gln Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His 65 70 75 80 Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr 85 90 95 Glu Gln Val Ser Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gln 100 105 110 Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro 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Val Val Leu Thr Leu Thr Trp Phe Leu 325 330 335 Ala Ala Gly Lys Lys Trp Gly His Glu Ala Ile Glu Ala Asn Ser Ser 340 345 350 Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Ala Ile Pro Ala Val Lys Thr Ile Leu 355 360 365 Ile Leu Val Met Arg Arg Val Ala Gly Asp Glu Leu Thr Gly Val Cys 370 375 380 Tyr Val Gly Ser Met Asp Val Asn Ala Leu Thr Gly Phe Val Leu Ile 385 390 395 400 Pro Leu Ala Cys Tyr Leu Val Ile Gly Thr Ser Phe Ile Leu Ser Gly 405 410 415 Phe Phe His Ile Arg Arg Val Met Lys Thr Gly Gly Glu Asn Thr Asp 420 425 430 Lys Leu Glu Lys Leu Met Val Arg Ile Gly Leu Phe Ser Val Leu Tyr 435 440 445 Thr Val Pro Ala Thr Cys Val Ile Ala Cys Tyr Phe Tyr Glu Arg Leu 450 455 460 Asn Met Asp Tyr Trp Lys Ile Leu Ala Ala Gln His Lys Cys Lys Met 465 470 475 480 Asn Asn Gln Thr Lys Thr Leu Asp Cys Leu Met Ala Ala Ser Ile Pro 485 490 495 Ala Val Glu Ile Phe Met Val Lys Ile Phe Met Leu Leu Val Val Gly 500 505 510 Ile Thr Ser Gly Met Trp Ile Trp Thr Ser Lys Thr Leu Gln Ser Trp 515 520 525 Gln Gln Val Cys Ser Arg Arg Leu Lys Lys Lys Ser Arg Arg Lys Pro 530 535 540 Ala Ser Val Ile Thr Ser Gly Gly Ile Tyr Lys Lys Ala Gln His Pro 545 550 555 560 Gln Lys Thr His His Gly Lys Tyr Glu Ile Pro Ala Gln Ser Pro Thr 565 570 575 Cys Val <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 3 cagccgtagg ttaaagaaga a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 4 ttcttcttta acctacggct g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 5 cccgattatg gagcagttca a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 6 ttgaactgct ccataatcgg g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 7 caggtgtgca gccgtaggtt a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 8 taacctacgg ctgcacacct g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> 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Claims (60)

  1. Dishevelled 인산화, c-Jun 인산화, 및 β-카테닌 인산화로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 활성을 갖는 FZD10 조정자 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 조성물이 주사가능한 무균 조성물인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, FZD10 조정자가 Dishevelled의 인산화를 감소시키고, c-Jun의 인산화를 감소시키고, β-카테닌의 인산화를 증가시키는 억제제인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 FZD10 조정자가 Dishevelled의 인산화를 감소시키는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 FZD10 조정자가 Dishevelled에 대한 FZD10 결합을 억제하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, FZD10 조정자가 올리고뉴클레오티드, 소분자, 모방체 (mimetic), 가용형 수용체, 데코이 (decoy) 수용체, 또는 항체인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, FZD10 조정자가 적어도 1x108 Ka의 친화도로 FZD10에 결합하는 모노클로날 항체인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, FZD10 조정자가, FZD10에 선택적으로 결합하고 하나 이상의 FZD10-관련 생물학적 활성을 조정하는 모노클로날 항체인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체인 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 모노클로날 항체가 FZD10의 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프는 제1 세포외 도메인 (ECD), 제2 ECD, 제3 ECD, 제4 ECD 및 리간드-결합 도메인으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 모노클로날 항체가 FZD10의 ECD의 에피토프에 결합하는 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 모노클로날 항체가 제1 ECD의 에피토프에 결합하는 것인 조성물.
  13. 제7항에 있어서, 모노클로날 항체가 제1 ECD에 결합하지 않는 것인 조성물.
  14. 제7항에 있어서, 모노클로날 항체가 FZD9와 교차-반응하지 않는 것인 조성물.
  15. 제7항에 있어서, 모노클로날 항체가 다른 진단 또는 치료제에 컨쥬게이팅되는 것인 조성물.
  16. 환자에게 치료 유효량의 제1항에 따른 FZD10 조정자를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서 암 또는 암 증상을 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, FZD10 조정자가 Dishevelled의 인산화를 감소시키는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, FZD10 조정자가 FZD10 발현을 대조군에 비해 적어도 50% 억제하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, FZD10 조정자가 올리고뉴클레오티드, 소분자, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체, 또는 항체인 방법.
  20. 제16항에 있어서, FZD10 조정자가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체, 또는 Fab 단편인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 항체가 표지되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 표지가 효소, 방사성 동위원소, 독소 또는 형광단인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 항체가 FZD10 이외의 폴리펩티드에 대해 약 1x105 Ka 미만의 결합 친화도를 갖는 것인 방법.
  24. 제16항에 있어서, FZD10 조정자가 모노클로날 항체인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 모노클로날 항체가 적어도 1x108 Ka의 친화도로 FZD10에 결합하는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 모노클로날 항체가 FZD10의 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프는 제1 ECD, 제2 ECD, 제3 ECD, 제4 ECD 및 리간드-결합 도메인으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 모노클로날 항체가 FZD10의 제1 ECD의 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  28. 제24항에 있어서, 모노클로날 항체가 FZD10의 제1 ECD에 결합하지 않는 것인 방법.
  29. 제24항에 있어서, 모노클로날 항체가 FZD9에 결합하지 않는 것인 방법.
  30. 제24항에 있어서, 모노클로날 항체가 Dishevelled의 인산화를 감소시키고, c-Jun의 인산화를 감소시키고, β-카테닌의 인산화를 증가시키는 것인 방법.
  31. 제16항에 있어서, 암이 난소, 대장, 폐, 위 또는 자궁암인 방법.
  32. 제16항에 있어서, 환자에 대한 전통적인 암 치료제의 투여를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제16항에 있어서, 환자를 하나 이상의 화학요법, 방사선 요법 또는 수술로 치료하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제16항에 있어서, 암 증상이 통증, 사망, 체중 감소, 쇠약, 섭식 곤란, 혈 변, 구역, 구토, 간 전이, 폐 전이, 뼈 전이, 복부 팽만감, 더부룩함 (bloating), 복막강 내의 체액, 질 출혈, 변비, 복부 팽만, 대장의 천공, 급성 복막염 (감염, 열, 통증), 토혈, 및 연하 곤란으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  35. FZD10의 생물학적 활성을 조정하기 위해 효과적인 양의 제1항에 따른 FZD10 조정자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 FZD10-관련 생물학적 활성을 조정하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, FZD10 조정자가 FZD10에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 환자가 난소, 대장, 폐 또는 자궁암 중 하나 이상에 걸리거나 소인이 있는 것인 방법.
  38. 제16항에 있어서, FZD10 조정자가 항체이고, 생체내 치료 항체 유전자 전달을 통해 대상에게 투여되는 것인 방법.
  39. (a) 샘플 내에서 FZD10 발현의 증거의 존재 또는 부재를 검출하고, 여기서, 상기 샘플 내의 FZD10 발현의 증거의 존재는 환자가 FZD10 요법에 대한 후보임을 나타내고, 상기 샘플 내의 FZD10 발현의 증거의 부재는 환자가 FZD10 요법에 대한 후보가 아님을 나타내고;
    (b) 환자가 FZD10 요법에 대한 후보이면 치료 유효량의 제1항에 따른 조성물을 환자에게 투여하고;
    c) 환자가 FZD10 요법에 대한 후보가 아니면 전통적인 암 치료제를 환자에게 투여하는 것
    을 포함하는, FZD10 요법에 감수성인 환자를 확인하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, FZD10의 발현이 대조군에 비해 적어도 30% 증가되는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, FZD10의 발현이 대조군에 비해 적어도 50% 증가되는 것인 방법.
    <청구항 41>
    제39항에 있어서, FZD10의 발현이 대조군에 비해 적어도 100% 증가되는 것인 방법.
  42. 제39항에 있어서, FZD10 발현의 증거가 FZD10 RNA를 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
  43. 제39항에 있어서, FZD10 발현의 증거가 FZD10 발현 산물을 측정함으로써 검 출되는 것인 방법.
  44. 제39항에 있어서, 환자가 난소, 대장, 폐 또는 자궁암 중 하나 이상에 걸리거나 소인이 있는 것인 방법.
  45. 제39항에 있어서, 환자에 대한 전통적인 암 치료제의 투여를 추가로 포함하는 방법.
  46. 치료 유효량의 제1항에 따른 FZD10 조정자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서 암 세포 성장을 억제하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, FZD10 조정자가, FZD10에 특이적으로 결합하고 Dishevelled의 인산화를 감소시키는 모노클로날 항체인 방법.
  48. 환자에게 치료 유효량의 제1항에 따른 FZD10 조정자를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에서 암 세포 표현형을 억제하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 암 세포 표현형이 연질 아가 내의 콜로니 형성 및 3차원 기저 막 또는 세포외 막 제제 내의 관상 (tubular) 네트워크 형성 중 하나 이상인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 환자에 대한 전통적인 암 치료제의 투여를 추가로 포함하는 방법.
  51. 제48항에 있어서, 환자를 화학요법, 방사선 요법 또는 수술 중 하나 이상으로 치료하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  52. 제48항에 있어서, 암 세포가 난소, 대장, 폐 또는 자궁암 세포로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  53. 환자에게 영상화제에 연결된 제1항에 따른 FZD10 조정자를 포함하는 조성물을 투여하고, 환자에서 영상화제가 존재하는 부위를 검출하는 것을 포함하는, 환자에서 종양을 검출하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, FZD10 조정자가 소분자, 올리고뉴클레오티드, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체, 또는 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 조성물이 영상화제에 컨쥬게이팅된 항-FZD10 항체를 포함하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 영상화제가 18F, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 77Br, 87MSr, 86Y, 90Y, 99MTc, 111In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb, 또는 206Bi인 방법.
  57. 제53항에 있어서, FZD10 조정자가 소분자, 올리고뉴클레오티드, 모방체, 가용형 수용체, 데코이 수용체, 또는 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  58. 제53항에 있어서, FZD10 조정자가, FZD10에 선택적으로 결합하고 Dishevelled의 인산화를 감소시키는 모노클로날 항체인 방법.
  59. CHO 또는 골수종 세포에서 항-FZD10 항체를 코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 FZD10-관련 생물학적 활성을 억제하는 항-FZD10 항체를 CHO 또는 골수종 세포에서 발현시키는 방법.
  60. FZD10을 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, FZD10-관련 생물학적 활성이 조정되는지 결정하는 것을 포함하고, 여기서 유도된 FZD10-관련 생물학적 활성이 Dishevelled, c-Jun, 및 β-카테닌의 인산화로 이루어지는 군 중에서 선택 되고, FZD10-관련 생물학적 활성의 조정은 후보 화합물이 암 억제제임을 나타내는 것인, 대조군에 비해 FZD10의 과다발현을 특징으로 하는 암의 억제제를 확인하는 방법.
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