CN115960964A

CN115960964A - 一种过表达zxdc慢病毒载体的构建和应用

Info

Publication number: CN115960964A
Application number: CN202211221337.6A
Authority: CN
Inventors: 何佳; 王旭升; 李新新
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Shenzhen Campus
Priority date: 2022-10-08
Filing date: 2022-10-08
Publication date: 2023-04-14

Abstract

本发明公开了一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建和应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过在pLCAG‑EGFP慢病毒空载体的BamH1和AgeI酶切位点处插入ZXDC基因的转录活性区域及CIITA结合区域构建得到如图1所示的pLCAG‑ZXDC‑EGFP过表达慢病毒载体，再将其与慢病毒包装质粒共同转染宿主细胞得到ZXDC高表达的重组慢病毒，能够感染小胶质细胞并能调控炎症因子的表达。本发明的构建方法不仅实现了ZXDC的高表达，也为后续研究ZXDC的功能提供了一个良好的实验工具，有利于进一步研究ZXDC在中枢神经系统中的功能，具有重要的应用价值。

Description

一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建和应用。

背景技术

ZXDC(zinc finger,X-linked,duplicated family member C)是一个转录调控因子，含有十个锌指结构、一个相对有效的转录激活域和C端的CIITA结合域，其中转录激活域是转录调控所必需的，而锌指结构是非必需的。ZXDC能和ZXDA形成转录活性复合物后与CIITA相结合，并参与主要组织相容性复合体MHCII基因表达的调节，ZXDC与CIITA结构中含有富含亮氨酸重复序列的区域相互作用，ZXDC的过表达导致CIITA超激活，而ZXDC表达的沉默则降低了CIITA的转录活化能力。此外，ZXDC还调节参与髓细胞分化和炎症的基因，包括趋化因子CCL2等，过表达ZXDC在293细胞系中可显著改变多种基因的表达水平，这些基因控制着细胞周期、细胞增殖和分化等细胞行为，其中EGR2、BDNF、CDKN1C和IL5Ra基因显著上调，因此，ZXDC对于调控免疫微环境十分重要。虽然ZXDC在大脑中表达显著，但是其在中枢神经系统中的作用尚未有报道。小胶质细胞是在中枢神经系统中与免疫密切相关的细胞，在衰老或者刺激下小胶质细胞被长期激活，会分泌TNF、IL1β、IL6和活性氧或活性氮(ROS/NOS)等炎症因子而产生神经损伤，同时激活的小胶质细胞MHC-Ⅱ的表达增加。因此，研究ZXDC对于小胶质细胞炎症因子的释放具有重要意义。

慢病毒载体(Lentiviral vectors)来源于单链RNA逆转录病毒HIV-1，由于其感染非分裂细胞、有效整合到宿主基因组、携带大的转基因并具有稳定的长期转基因表达的能力，而被广泛用作中枢神经系统中的基因转移工具。目前，慢病毒载体已被证明能转导中枢神经系统内的大多数细胞类型，并在用于体外纠正基因缺陷的临床试验中已证明其在许多神经遗传疾病中有效。因此，如果能设计一种过表达ZXDC的慢病毒载体，则有利于研究ZXDC在中枢神经系统中的作用。

发明内容

为了解决目前ZXDC在中枢神经系统中的作用尚未涉及的问题，本发明通过将ZXDC的转录激活域和CIITA结合域的序列插入慢病毒载体的BamH1和AgeI酶切位点构建了一种重组慢病毒载体质粒，实现了ZXDC在小胶质细胞中的高表达，同时ZXDC的高表达可以调控小胶质细胞中炎症因子的表达，有利于后续研究ZXDC在中枢神经系统中的作用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

S1：通过PCR扩增如SEQ ID NO.1所示的两端含有BamH1酶切位点和AgeI酶切位点的ZXDC转录激活域及CIITA结合区域得到PCR扩增产物；

S2：双酶切pLCAG-EGFP慢病毒空载体；

S3：将步骤S1制得的扩增产物与步骤S2双酶切后的pLCAG-EGFP慢病毒空载体进行连接后得到重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP，重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP再经转化、挑取单克隆扩增培养、提取质粒后测序验证；

S4：验证步骤S3测序正确的重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP的表达情况，验证正确的即为过表达ZXDC慢病毒载体。

具体地，所述步骤S1中PCR引物序列包括如SEQ ID NO.4所示的ZXDC-GFP-F，如SEQID NO.5所示的ZXDC-GFP-R。

在其中一些实施例中，所述步骤S2具体包括：用BamH1酶和AgeI酶对pLCAG-EGFP慢病毒空载体进行双酶切，然后电泳、回收并检测酶切载体浓度。

在其中一些实施例中，所述步骤S3具体包括：

S3.1：使用重组酶Exnase II将步骤S1的扩增产物和步骤S2双酶切后的pLCAG-EGFP慢病毒空载体连接得到重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP；

S3.2：将重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP加入到感受态细胞中通过热激法进行转化，然后加入不含抗生素的培养基于200-300rpm下摇菌1-2h，离心重悬转化后的菌液，再涂布于含抗生素平板上倒置培养14-16h，在倒置培养后的平板上挑取单克隆细胞加入含抗生素的培养基扩增培养12-16h，最后从培养后的菌液中提取质粒；

S3.3：设计基因片段序列测序引物对步骤S3.2提取的质粒进行测序验证。

优选地，所述抗生素为氨苄青霉素。

在其中一些实施例中，所述测序引物序列包括如SEQ ID NO.6所示的F1，如SEQ IDNO.7所示的F2。

在其中一些实施例中，所述重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP测序序列是如SEQ ID NO.8所示的序列。

本发明还提供了一种慢病毒，所述慢病毒的制备方法包括：将所述构建方法所构建的过表达ZXDC慢病毒载体与慢病毒包装质粒共同转染宿主细胞，制备得到ZXDC过表达重组慢病毒。

在其中一些实施例中，所述慢病毒包装质粒包括pVSV-G、psPAX2、pRev或pRRE。

在其中一些实施例中，所述宿主细胞为293T细胞。

在其中一些实施例中，所述构建方法所构建的过表达ZXDC慢病毒载体、所述的慢病毒在调控小胶质细胞炎症因子表达中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明通过在pLCAG-EGFP慢病毒载体的BamH1和AgeI酶切位点处插入ZXDC基因的转录活性区域及CIITA结合区域构建了一种重组慢病毒载体。本发明的构建方法实现了ZXDC的高表达，并且高表达ZXDC能调控小胶质细胞中炎症因子的表达水平，从而能调控炎症反应，同时构建的重组慢病毒载体为研究ZXDC在小胶质细胞中的功能提供了一个良好的实验工具，有利于进一步研究ZXDC在中枢神经系统中的功能，具有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是重组慢病毒载体pLCAG-ZXDC-EGFP质粒图谱；

图2是ZXDC的转录激活域和CIITA结合域序列经PCR扩增后的电泳条带图；

图3是双酶切pLCAG-EGFP慢病毒空载体后的电泳条带图；

图4是pLCAG-EGFP慢病毒空载体质粒图谱；

图5是Western blot鉴定过表达ZXDC重组慢病毒载的表达效果图；

图6是炎症因子TNFα经过表达ZXDC重组慢病毒载体调控后的表达水平柱状图，图中：**p<0.01，***p<0.001；

图7是炎症因子IL6经过表达ZXDC重组慢病毒载体调控后的相对表达水平柱状图，图中：**p<0.01，***p<0.001；

图8是炎症因子IL1β经过表达ZXDC重组慢病毒载体调控后的相对表达水平柱状图，图中：**p<0.01，***p<0.001；

图9是炎症因子CCL2经过表达ZXDC重组慢病毒载体调控后的相对表达水平柱状图，图中：**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

下面对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规说法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1：一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建及其过表达效果的鉴定

如图1所示，在pLCAG-EGFP慢病毒载体的BamH1和AgeI酶切位点处插入ZXDC基因的转录活性区域及CIITA结合区域构建了一种重组慢病毒载体，具体步骤包括：

1、通过PCR扩增出两端含有限制性内切酶的ZXDC转录活性区域及CIITA结合区域的CDS序列片段，具体包括：

(1)在NCBI中找到ZXDC序列(NM_025112.5)，从CDS序列中找到ZXDC的转录激活区域及CIITA结合区域序列，所述转录激活区域及CIITA结合区域的核苷酸序列(SEQ IDNO.1)如下所示：

GACAGCCCTCTGGTTCTCGGGACAGCAGCCACGGTTCTGCAGCAGGGCAGCTTCAGTGTGGATGACGTGCAGACTGTGAGTGCAGGAGCATTAGGCTGTCTGGTGGCTCTGCCCATGAAGAACTTGAGTGACGACCCACTGGCTTTGACCTCCAATAGTAACTTAGCAGCACATATCACCACACCGACCTCTTCGAGCACCCCCCGAGAAAATGCCAGTGTCCCGGAACTGCTGGCTCCAATCAAGGTGGAGCCGGACTCGCCTTCTCGCCCAGGAGCAGTTGGGCAGCAGGAAGGAAGCCATGGGCTGCCCCAGTCCACGTTGCCCAGTCCAGCAGAGCAGCACGGTGCCCAGGACACAGAGCTCAGTGCAGGCACTGGCAACTTCTATTTGGAAAGTGGGGGCTCAGCAAGAACTGATTACCGAGCCATTCAACTAGCCAAGGAAAAAAAGCAGAGAGGAGCGGGGAGCAATGCAGGAGCCTCACAGTCTACTCAGAGAAAAATAAAAGAAGGCAAAATGAGTCCTCCCCATTTCCATGCAAGCCAGAACAGTTGGTTGTGTGGGAGCCTCGTGGTGCCCAGCGGAGGACGGCCAGGACCAGCTCCAGCAGCTGGGGTGCAGTGCGGGGCGCAGGGCGTCCAGGTCCAGCTGGTGCAGGATGACCCCTCCGGCGAAGGTGTCCTGCCCTCGGCCCGCGGCCCAGCCACCTTCCTCCCCTTCCTCACTGTGGACCTGCCCGTCTACGTCCTCCAGGAGGTGCTCCCCTCATCTGGAGGCCCTGCTGGACCGGAGGCCACCCAGTTCCCAGGAAGCACTATCAACCTGCAGGATCTGCAGTGA。

其中，转录激活区域是如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：GACAGCCCTCTGGTTCTCGGGACAGCAGCCACGGTTCTGCAGCAGGGCAGCTTCAGTGTGGATGACGTGCAGACTGTGAGTGCAGGAGCATTAGGCTGTCTGGTGGCTCTGCCCATGAAGAACTTGAGTGACGACCCACTGGCTTTGACCTCCAATAGTAACTTAGCAGCACATATCACCACACCGACCTCTTCGAGCACCCCCCGAGAAAATGCCAGTGTCCCGGAACTGCTGGCTCCAATCAAGGTGGAGCCGGACTCGCCTTCTCGCCCAGGAGCAGTTGGGCAGCAGGAAGGAAGCCATGGGCTGCCCCAGTCCACGTTGCCCAGT。

CIITA结合区域是如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列：CCAGCAGAGCAGCACGGTGCCCAGGACACAGAGCTCAGTGCAGGCACTGGCAACTTCTATTTGGAAAGTGGGGGCTCAGCAAGAACTGATTACCGAGCCATTCAACTAGCCAAGGAAAAAAAGCAGAGAGGAGCGGGGAGCAATGCAGGAGCCTCACAGTCTACTCAGAGAAAAATAAAAGAAGGCAAAATGAGTCCTCCCCATTTCCATGCAAGCCAGAACAGTTGGTTGTGTGGGAGCCTCGTGGTGCCCAGCGGAGGACGGCCAGGACCAGCTCCAGCAGCTGGGGTGCAGTGCGGGGCGCAGGGCGTCCAGGTCCAGCTGGTGCAGGATGACCCCTCCGGCGAAGGTGTCCTGCCCTCGGCCCGCGGCCCAGCCACCTTCCTCCCCTTCCTCACTGTGGACCTGCCCGTCTACGTCCTCCAGGAGGTGCTCCCCTCATCTGGAGGCCCTGCTGGACCGGAGGCCACCCAGTTCCCAGGAAGCACTATCAACCTGCAGGATCTGCAGTGA。

(2)通过诺唯赞生物科技股份有限公司的引物设计软件CE Design(http://www.vazym e.com)设计含有BamH1酶切位点的PCR引物ZXDC-GFP-F以及含有AgeI酶切位点的PCR引物ZXDC-GFP-R。所述PCR引物核苷酸序列如下表1所示：

表1引物序列表

(2)以人脑cDNA为模板，使用NEB公司的Q5高保真酶进行PCR扩增，配置反应体系为50μL，包括2×Q5 High-Fidelity Q5 Master Mix 25μL、5μM引物ZXDC-GFP-F 4μL、5μM引物ZXDC-GFP-R 4μL、人脑cDNA 4μL、ddH₂O 13μL；PCR反应条件：98℃预变性2min；接着5个循环为98℃变性10s，65℃复性30s，72℃延伸DNA 1min；再接着27个循环为98℃变性30s，70℃复性1min，72℃延伸DNA 2min；在72℃维持2min，最后降温至4℃。

(3)配置1％的琼脂糖凝胶后进行PCR产物电泳，电泳完后用碧云天生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒(货号D0056)对PCR产物进行回收，并使用nanodrop2000超微量分光光度计检测回收产物浓度。

实验结果：

如图2所示，从人脑cDNA中PCR扩增ZXDC的转录激活域和CIITA结合域，片段大小为888bp，回收产物浓度为35.2ng/μL。

2、根据图3所示的pLCAG-EGFP空载体质粒图谱中的酶切位点，用BamH1酶和AgeI酶对pLCAG-EGFP慢病毒空载体进行双酶切，具体包括：

(1)将1μg pLCAG-EGFP慢病毒空载体(购于Addgene公司，货号：Plasmid#14857)进行双酶切反应，酶切反应体系：分别取pLCAG-EGFP慢病毒空载体1μg、10×rCutSmartBuffer 5μL、AgeI-HF 1μL、BamHI-HF 1μL，再用无核酸酶水(Nuclease-free Water)配至50μL。配制好后置于PCR仪中37℃反应1h。

(2)酶切结束后配置0.8％的琼脂糖凝胶，然后进行酶切pLCAG-EGFP慢病毒载体的电泳，电泳完后用碧云天生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒(货号D0056)对酶切载体的凝胶进行回收，并使用nanodrop2000超微量分光光度计检测回收产物浓度。

实验结果：

检测结果如图4所示，双酶切后的pLCAG-EGFP慢病毒空载体片段大小为8544bp，回收产物浓度为18.6ng/μL。

3、使用重组酶Exnase II连接PCR产物和双酶切后pLCAG-EGFP慢病毒空载体

用诺唯赞生物科技股份有限公司ClonExpress II One Step Cloning Kit(货号C112-01)进行重组反应。冰上配制反应体系，反应体系包括：分别取双酶切后的pLCAG-EGFP慢病毒空载171ng、PCR胶回产物17.6ng、5×CE II Buffer 4μL、Exnase II 2μL，用双蒸水(ddH₂O)配至20μL。配制好后用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底后使用PCR仪37℃反应30min，得到重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP，最后降至4℃保存。

4、将重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP使用DH5α感受态细胞进行转化并挑取单克隆、扩增培养和小提质粒后进行测序验证，具体包括：

(1)在冰上解冻DH5α感受态细胞，然后取2.5μL步骤3制得的重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP加入到25μL DH5α感受态细胞中，轻弹管壁混匀后，冰上静置30min；再放入42℃水浴锅中热激1min后立即置于冰上静置2min；然后加入900μL不含抗生素的LB培养基，放在37℃摇床上250rpm摇菌1h；

(2)拿出步骤(1)的菌液，用离心机3000rpm将其离心5min后去掉约820μL上清液，用剩余培养基液重悬菌液，再用移液枪将重悬菌液滴加到预热至37℃的含氨苄的LB固体培养基平板上，并用无菌涂布棒在平板上轻轻涂匀，将涂有菌液的平板放在37℃培养箱中倒置培养14-16h。

(3)设置5个摇菌管，每个摇菌管均加入5mL含氨苄的LB培养基，再用移液枪头从步骤(2)倒置培养后的平板上挑取5个单克隆分别放入5个摇菌管中，然后将摇菌管置于37℃摇床上250rpm摇菌12-16h。

(4)使用碧云天生物科技有限公司的质粒小量抽提试剂盒(货号D0005)从摇菌后的菌液中提取质粒，再根据重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP设计并插入测序引物对提取的质粒进行测序。测序引物核苷酸序列如下表2所示：

表2测序引物序列表

引物	序列(5’-3’)	序列编号
			F1	GCTCTAGAGCCTCTGCTAACC	SEQ ID NO.6
F2	GAGTAGACTGTGAGGCTCCTGC	SEQ ID NO.7

实验结果：

测出的序列正确，测出的核苷酸序列是如SEQ ID NO.8所示的序列：

TTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGGATCCCATGGACAGCCCTCTGGTTCTCGGGACAGCAGCCACGGTTCTGCAGCAGGGCAGCTTCAGTGTGGATGACGTGCAGACTGTGAGTGCAGGAGCATTAGGCTGTCTGGTGGCTCTGCCCATGAAGAACTTGAGTGACGACCCACTGGCTTTGACCTCCAATAGTAACTTAGCAGCACATATCACCACACCGACCTCTTCGAGCACCCCCCGAGAAAATGCCAGTGTCCCGGAACTGCTGGCTCCAATCAAGGTGGAGCCGGACTCGCCTTCTCGCCCAGGAGCAGTTGGGCAGCAGGAAGGAAGCCATGGGCTGCCCCAGTCCACGTTGCCCAGTCCAGCAGAGCAGCACGGTGCCCAGGACACAGAGCTCAGTGCAGGCACTGGCAACTTCTATTTGGAAAGTGGGGGCTCAGCAAGAACTGATTACCGAGCCATTCAACTAGCCAAGGAAAAAAAGCAGAGAGGAGCGGGGAGCAATGCAGGAGCCTCACAGTCTACTCAGAGAAAAATAAAAGAAGGCAAAATGAGTCCTCCCCATTTCCATGCAAGCCAGAACAGTTGGTTGTGTGGGAGCCTCGTGGTGCCCAGCGGAGGACGGCCAGGACCAGCTCCAGCAGCTGGGGTGCAGTGCGGGGCGCAGGGCGTCCAGGTCCAGCTGGTGCAGGATGACCCCTCCGGCGAAGGTGTCCTGCCCTCGGCCCGCGGCCCAGCCACCTTCCTCCCCTTCCTCACTGTGGACCTGCCCGTCTACGTCCTCCAGGAGGTGCTCCCCTCATCTGGAGGCCCTGCTGGACCGGAGGCCACCCAGTTCCCAGGAAGCACTATCAACCTGCAGGATCTGCAGAGACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAA(SEQ IDNO.8)。

5、将上述步骤4测序正确的重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP和空载体质粒pLCAG-EGFP转染293T细胞后用Western blot验证其表达情况，具体包括：

(1)转染前18-24h，将293T细胞种植于6孔板中，待细胞达到70-80％汇合度时，在转染前30-60min换新鲜的DMEM培养基，每孔1mL的DMEM培养基。

(2)配制转染混合物：对于每个孔，将1μg重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP或空载体质粒pLCAG-EGFP的DNA加入到50μL高糖无血清DMEM中，移液枪混匀制成混合物一；再将3μLPolyJet转染试剂(SignaGen公司)加入到50μL高糖无血清DMEM培养基中，移液枪上下3-4次混匀制成混合物二；然后将混合物二加入到混合物一中，移液枪上下3-4次混匀，室温静置15min后滴加到含293T细胞的培养基中。

(3)转染：将含293T细胞的培养基置于37℃细胞培养箱继续培养12h后，去除培养基，再添加2mL新鲜的DMEM完全培养基；然后继续培养293T细胞至转染48h后，去除培养基，用PBS洗一遍，使用200μL/孔的RIPA裂解液加入到培养皿中，用移液枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。RIPA裂解液在使用前加入PMSF(苯甲基磺酰氟)，最终浓度为1mM。

(4)充分裂解后，以10000-14000g的转速4℃离心5分钟，再取60μL上清，之后加20μL4×蛋白上样缓冲液，混匀后使用金属浴95℃加热5min。

(5)使用标准步骤进行Western blot操作，其中蛋白上样15μL/孔，一抗为GFP(美国abcam公司，货号ab6556)，5000×稀释；二抗为山羊抗兔(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，货号111-035-144)，20000×稀释。

实验结果：

验证结果如图5所示，重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP条带大小符合预测结果，说明重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP是过表达ZXDC慢病毒载体。

实施例2：ZXDC过表达对小胶质细胞炎症因子的影响

1、将实施例1测序且Western blot验证正确的重组慢病毒载体pLCAG-ZXDC-EGFP或空载体质粒pLCAG-EGFP与慢病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G共转染293T细胞，并收集含慢病毒颗粒的细胞培养基，具体包括：

(1)转染前18-24h，将293T细胞种植于10cm细胞培养皿中，待细胞达到70-80％汇合度时，在转染前30-60min将每个培养皿换成5mL新鲜的DMEM培养基。

(2)配置转染混合物：对于每个10cm细胞培养皿，将8μg重组慢病毒载体或空载体DNA、8μg病毒包装质粒psPAX2(购自addgene公司，货号为12260)、8μg病毒包装质粒pVSV-G(购自addgene公司，货号为138479)加入到600μL高糖无血清DMEM培养基中，用移液枪混匀制成混合物一；再将30μL PolyJet转染试剂(SignaGen公司)加入到600μL高糖无血清DMEM培养基中，用移液枪上下3-4次混匀制成混合物二。然后将混合物二加入到混合物一中，移液枪上下3-4次混匀，室温静置15min后，滴加到含293T细胞的培养基中。

(3)将含293T细胞的培养基放入37℃细胞培养箱继续培养12h后，去除培养基，添加10mL新鲜的DMEM完全培养基。

(4)转染48h后收集细胞培养基，添加10mL新鲜DMEM培养基于培养皿中，收集的培养基、使用0.45μm滤膜过滤后分装后保存在病毒管中，放入-80℃保存。转染72h后再次收集一次含病毒颗粒的细胞培养基。

2、将慢病毒颗粒侵染未处理的BV2小胶质细胞和脂多糖(LPS)刺激下的小胶质细胞，侵染72h后提取小胶质细胞RNA，具体包括：

(1)培养BV2小胶质细胞：将BV2小胶质细胞以2×10⁵个/孔的细胞密度接种至6孔板中，并置于37℃细胞培养箱中培养16-18h。

(2)设置对照组和ZXDC过表达组，对照组和ZXDC过表达组BV2小胶质细胞换入1mL完全培养基，同时加入500μL含空载体或ZXDC过表达慢病毒颗粒的细胞培养基，再加入1.5μL polybrene帮助病毒侵染。放入细胞培养箱中继续培养至侵染60h，每侵染30h左右换一次新鲜的完全培养基。

(3)侵染60h后，将步骤(2)含正常组细胞的培养基、ZXDC过表达慢病毒的培养基均换成2mL的新鲜的完全培养基的作为无LPS刺激组；而将步骤(2)含正常组细胞的培养基、ZXDC过表达慢病毒的培养基均换成含100ng/mL脂多糖(LPS)的新鲜的完全培养基的作为脂多糖(LPS)刺激组。

(4)侵染72h后，去除培养基，用PBS洗一遍后每孔加1mL RNA提取试剂Trizol试剂(Invitrogen公司)，使用移液枪反复吹打后移入1.5mL去除RNA酶的EP管中，室温放置5min。

(5)每管加200μl氯仿，使用涡旋仪剧烈震荡15s，室温放置5min。然后12000rpm，4℃离心15min。取最上层水相转移至另一个EP管中。

(6)加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，室温放置10min，然后12000rpm，4℃离心30min，丢弃上清。

(7)用0.5mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃离心5min。弃去乙醇，室温干燥RNA沉淀至半透明。

(8)加50μL DEPC水重悬RNA，65℃金属浴加热5min溶解RNA，随后置于-80℃下保存。

3、通过RT-qPCR检测TNFα、IL6、IL1β和CCL2的表达

(1)先使用Nanodrop2000超微量分光光度计测得上述步骤2提取的小胶质细胞RNA浓度为200ng-500ng/μL，测完后取1μg提取的总RNA按照PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒(Takara公司，货号RR047A)逆转为cDNA。

(2)通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成qPCR引物，引物核苷酸序列如下表3所示：

表3引物序列表

(3)使用TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)试剂盒(Takara公司，RR420A)进行qPCR反应，反应体系10μL，具体包括：5μL TB Green Premix Ex Taq(TliRNaseH)、0.2μL引物F(10μM)、0.2μL引物R(10μM)、1μL cDNA、0.2μL ROX Reference Dye II(50×)、3.4μL ddH₂O。将反应体系所有组分使用连续分样枪加入384孔板中，4000rpm离心10min后用封板膜封板。

(4)将384孔板放在QuantStudioTM6Flex Real-Time PCR System仪器中，设置好程序后进行反应，qPCR反应条件：95℃预变性30s；接着40个循环为95℃变性5s，55℃低温退火30s，72℃延伸30s；按仪器操作说明选择熔解曲线分析：95℃15s，60℃1min，95℃15s

(5)以β-actin为内参，采用△△Ct方法对结果进行分析。

实验结果：

相对表达情况如图6-9所示，无LPS刺激组，对照组和ZXDC过表达组的TNFα、IL6、IL1β和CCL2的表达水平均较低；在LPS刺激组，对照组和ZXDC过表达组的TNFα、IL6、IL1β和CCL2的表达水平均较高，且ZXDC过表达组的TNFα、IL6、IL1β和CCL2的表达水平要高于正常组。因此，未刺激组，ZXDC过表达对TNFα、IL6、IL1β和CCL2在BV2小胶质细胞中的表达具有抑制趋势，但是没有显著差异；而在脂多糖(LPS)刺激下，ZXDC过表达能够显著增强TNFα、IL6、IL1β和CCL2在BV2小胶质细胞中的表达。

综上所述，本发明通过在pLCAG-EGFP慢病毒载体的BamH1和AgeI酶切位点处插入ZXDC基因的转录活性区域及CIITA结合区域构建了一种重组慢病毒载体，也为后续研究ZXDC的功能提供了一个良好的实验工具，同时还提供了pLCAG-ZXDC-EGFP过表达重组慢病毒载体在小胶质细胞分泌炎症相关因子中的应用方法。本发明构建的ZXDC重组慢病毒载体不仅实现了ZXDC的高表达，而且ZXDC过表达在脂多糖(LPS)刺激下能显著增强TNFα、IL6、IL1β和CCL2在BV2小胶质细胞中的表达，在未刺激时则抑制TNFα、IL6、IL1β和CCL2在BV2小胶质细胞中的表达。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

S2：双酶切pLCAG-EGFP慢病毒空载体；

2.根据权利要求1所述的一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：用BamH1酶和AgeI酶对pLCAG-EGFP慢病毒空载体进行双酶切。

3.根据权利要求1所述的一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：

S3.2：将重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP加入到感受态细胞中通过热激法进行转化，然后加入不含抗生素的培养基于200-300rpm下摇菌1-2h，离心重悬转化后的菌液，再涂布于含抗生素平板上倒置培养14-16h，在倒置培养后的平板上挑取单克隆细胞加入含抗生素的培养基中扩增培养12-16h，最后从培养后的菌液中提取质粒；

S3.3：设计测序引物对步骤S3.2提取的质粒进行测序验证。

4.根据权利要求3所述的一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述测序引物序列包括如SEQ ID NO.6所示的F1，如SEQ ID NO.7所示的F2。

5.根据权利要求3所述的一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP测序序列是如SEQ ID NO.8所示的序列。

6.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒的制备方法包括：将权利要求1-5所述构建方法所构建的过表达ZXDC慢病毒载体与慢病毒包装质粒共同转染宿主细胞，制备得到ZXDC过表达重组慢病毒。

7.根据权利要求6所述的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒包装质粒包括pVSV-G、psPAX2、pRev或pRRE。

8.根据权利要求6所述的慢病毒，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞。

9.如权利要求1-5所述构建方法所构建的过表达ZXDC慢病毒载体、权利要求6-8所述的慢病毒在调控小胶质细胞炎症因子表达中的应用。