CN113444744A

CN113444744A - 一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板及构建方法、mRNA的体外转录方法和应用

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Publication number: CN113444744A
Application number: CN202110715607.8A
Authority: CN
Inventors: 焦顺昌; 张嵘; 宋文静; 袁翰
Original assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2021-09-28

Abstract

本发明提供了一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板及构建方法、mRNA的体外转录方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明在mRNA的模板上采用一种线性化质粒，省略线性化步骤；在模板中预先加入PolyA₁₂₁结构，舍去额外的加尾工作；采用ARCA抗反帽的帽子类似物，在体外转录过程中同时完成加帽。总之，本发明通过特殊的反应体系和特殊线性化质粒模板，将mRNA的体外转录简化为一步。本发明减少了mRNA的降解，大大降低了对NK细胞的刺激性和毒性；帽子类似物大大提高了mRNA的稳定性，降低了NK细胞炎性反应。本发明利用制备得到的mRNA在NK细胞上可成功过表达细胞因子或人工抗原嵌合受体。

Description

一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板及构建方法、mRNA的体外转录方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板及构建方法、mRNA的体外转录方法和应用。

背景技术

NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)是机体重要的先天免疫细胞，与T细胞、B细胞同为一个家族。它们在人体中循环流通，并且是最早对外来细胞或入侵者(特别是病毒和癌症早期征兆)的存在做出反应的物种之一。目前在NK细胞的临床前和临床开发中，有诸多的前沿的免疫治疗策略，例如过继性NK细胞转移，表达嵌合抗原受体的NK细胞(CAR-NK)，双特异性和三特异性杀伤细胞接合剂(BiKE和TriKE)等。这些应用方式都有不可避免的一环，也是极为重要的一环，那就是NK细胞的基因编辑手段。现有的NK细胞的基因编辑手段主要有病毒转染、DNA转座子系统等，但这些方法都有其不可规避的缺点，如较低的表达效率、整合基因组的安全风险、很难用于体细胞，特别是NK细胞的基因编辑。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板及构建方法、mRNA的体外转录方法和应用，利用一步法获得mRNA，显著提高mRNA的稳定性，降低其细胞毒性，并提高翻译效率，可应用于NK细胞的基因编辑。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板的构建方法，包括以下步骤：(1)将mRNA的DNA模板构建到载体pCI-Neo中，提取质粒，得第一重组质粒；所述mRNA的DNA模板的结构自5’端至3’端，依次包括：ARCA帽子类似物、5’UTR、目的基因开放编码框、3’UTR和PolyA结构；

(2)以所述第一重组质粒为模板，利用PCR方法扩增目的基因的双链DNA片段并钝端修复，连接入线性质粒pJAZZ-OK中，得所述mRNA模板。

优选的，所述目的基因开放编码框包括FMC63和IL21，所述FMC63的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述IL21的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，包含FMC63的mRNA的DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；包含IL21的mRNA的DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，在步骤(2)连接入线性质粒pJAZZ-OK后，还包括将连接产物转化TSA感受态，挑取单菌落进行测序鉴定，将测序正确的重组子抽提质粒，得第二重组质粒。

本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的mRNA模板。

本发明还提供了利用上述mRNA模板体外一步转录mRNA的方法，包括以下步骤：利用所述mRNA模板配制反应体系，37℃反应4h，纯化得mRNA；

所述反应体系以20μL计，包括：T72×ARCA/NTP 10μL、10×T7 Reaction Buffer 2μL、mRNA模板1μg、T7 Enzyme Mix 2μL和余量的无核酶水。

本发明还提供了利用上述方法制备得到的mRNA在编辑NK细胞中的应用。

本发明还提供了一种在NK细胞上表达嵌合抗原受体(CAR)结构或细胞因子的方法，包括以下步骤：利用上述方法制备得到的mRNA转染NK细胞。

优选的，所述NK细胞包括NK92细胞。

优选的，所述NK细胞数量与mRNA的比值为1×10⁷细胞：10～15μg。

本发明提供了一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板的构建方法，采用一种新型的线性化质粒(pJAZZ-OK)，可省略线性化步骤；同时在模板中预先加入PolyA₁₂₁结构，舍去额外的加尾工作；在制备工艺上，采用ARCA抗反帽的帽子类似物，在体外转录过程中同时完成加帽。本发明一步完成mRNA的制备，大大提高了mRNA的稳定性，高效且表达强，避免化学加帽及加尾试剂的引入，同时减少了mRNA的降解，大大降低了细胞毒性。

本发明实施例中，利用制备得到的mRNA在NK92细胞上表达CAR结构和细胞因子IL21，结果显示成功制备得到FMC63-RNA和4D5-RNA，且电转K562细胞24小时后成功检测到FMC63-CAR和4D5-CAR表达，表达率约为40～50％，与NK92野生型相比，电转FMC63的24小时后的NK92有明显FMC63基因表达，表达率为43.19％，且在杀伤实验中检测到约60％的针对CD19靶点的特异性杀伤效果；细胞因子IL21可以通过mRNA的形式在瞬时转染NK92细胞后表达，48小时后表达量为1200pg/mL左右。

附图说明

图1为包含目的基因的pJAZZ-OK质粒的结构图；

图2为实施例1的PCR扩增产物胶图；

图3为FMC63-RNA和4D5-RNA合成及表达结果，其中A：FMC63-RNA的琼脂糖凝胶电泳图；B：4D5-RNA的琼脂糖凝胶电泳图；C：电转FMC63-RNA的K562细胞24小时后表达FMC63情况；D：电转4D5-RNA的K562细胞24小时后表达4D5情况；

图4为实施例3中铺板时的ET布局图；

图5为FMC63-RNA在NK92细胞上的表达结果；

图6为电转FMC63-RNA-CAR 24h培养后的NK92对特定靶点靶细胞的ADCC作用图，其中NK92-4D5-RNA作为电转无意义RNA的阴性对照；

图7为IL15-RNA结果，其中A：IL15-RNA的琼脂糖凝胶电泳结果；B：IL15-ELISA标准曲线；

图8为4D5-RNA琼脂糖凝胶电泳结果，其中A：ARCA加帽一步合成法制得的4D5-RNA琼脂糖凝胶电泳图；B：化学加帽分步合成法制得的4D5-RNA琼脂糖凝胶电泳图，红色箭头所指为未消化的DNA模板；

图9为电转4D5-RNA24小时后的细胞活率；

图10为电转一步4D5-RNA和多步4D5-RNA培养24小时后的NK细胞表达4D5的情况。

具体实施方式

本发明将mRNA的DNA模板构建到载体pCI-Neo中，提取质粒，得重组质粒；所述mRNA的DNA模板的结构自5’端至3’端，依次包括：ARCA帽子类似物、5’UTR、目的基因开放编码框、3’UTR和PolyA结构。本发明所述ARCA帽子类似物优选包括T7 promoter，所述T7 promoter的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示：taatacgactcactataggg；所述5’UTR的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示：gcttgttctttttgcagaagctcagaataaacgctcaactttggcagatc；所述3’UTR的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7所示：AACCAGCCTCAAGAACACCCGAATGGAGTCTCTAAGCTACATAATACCAACTTACACTTTACAAAATGTTGTCCCCCAAAATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAAAAGAAAGTTTCTTCACATTCT；所述PolyA结构优选为PolyA₁₂₁。在本发明中，在模板中预先加入PolyA₁₂₁结构，舍去额外的加尾工作，采用ARCA抗反帽的帽子类似物，在体外转录过程中同时完成加帽；本发明联用ARCA帽子类似物和PolyA₁₂₁尾结构，一步合成mRNA，避免化学加帽及加尾试剂的引入，大大降低了细胞毒性；同时，一步合成mRNA，显著减少了mRNA的降解，降解后的短链mRNA是产生细胞毒性的重要来源之一；还能显著提高mRNA的稳定性，并提高了翻译效率。

本发明所述目的基因开放编码框优选包括FMC63和IL21，所述FMC63的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示，包含FMC63的mRNA的DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述IL21的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示，包含IL21的mRNA的DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明优选将上述mRNA的DNA模板(SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4)合成，并在其5'端添加NheⅠ酶切位点，3'端添加NotⅠ酶切位点，然后将合成好的上述基因通过上游NheⅠ酶切位点和下游NotⅠ酶切位点构建到载体pCI-Neo上，并进行质粒的大提制备和内毒素化处理(委托金唯智生物科技有限公司完成)，得到第一重组质粒(目的基因inpCI-Neo质粒)；本发明所述载体pCI-Neo优选购自Promega公司，货号为E1841。

得所述第一重组质粒后，本发明以所述第一重组质粒为模板，利用PCR方法扩增目的基因的双链DNA片段并钝端修复，连接入线性质粒pJAZZ-OK中，得所述mRNA模板。

本发明优选基于上述第一重组质粒设计引物，并参考Primer STAR MasterMix(Takara R045A)试剂说明书，通过PCR的方法获得目的基因的双链DNA片段；按照

v2.0 Linear Cloning Kits(Lucigen 43036-1)说明书进行DNA钝端的修复，并将目的基因片段连接到pJAZZ-OK质粒中，连接产物转化TSA感受态，挑取单菌落进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒大抽，得第二重组质粒，作为mRNA的模板。

本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的mRNA模板。

在本发明中，所述mRNA模板(命名方式为pJAZZ-OK-目的基因)的结构如图1所示，当目的基因为FMC63时，构建得到的mRNA模板为pJAZZ-OK-FMC63；当目的基因为IL21时，构建得到的mRNA模板为pJAZZ-OK-IL21。

本发明优选根据mMESSAGE

T7 Ultra Kit(Thermo AM1345)说明书配置反应体系，完成mRNA的体外一步法转录。本发明所述纯化优选包括：向上述反应体系中加入1μL TURBO DNase，37℃孵育15min，消化DNA模板；加入30μLNuclease-free Water和30μL LiCl，-20℃反应30min，≥15000*g，4℃离心15min沉淀mRNA，加1mL的75％乙醇洗涤离心，得到纯化后的mRNA。

在本发明中，mRNA的瞬时转染效率更高，编辑效率更强，且不整合到基因组中，安全性更高，更适合用于编辑NK细胞。

利用本发明所述mRNA对NK细胞进行基因编辑，使得NK细胞能够表达CAR结构和细胞因子。

本发明还提供了一种在NK细胞上表达CAR结构或细胞因子的方法，包括以下步骤：利用上述方法制备得到的mRNA转染NK细胞。

本发明所述NK细胞优选包括NK92细胞，所述NK细胞数量与mRNA的比值优选为1×10⁷细胞：10～15μg。本发明所述转染的方法优选包括电转，采用120μL转染缓冲液重悬细胞，120μL电击杯在电转仪(Celetrix，CTX-1500A)上设置参数：600V，30ms进行电转。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板及构建方法、mRNA的体外转录方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1pJAZZ-OK-FMC63质粒的构建

1、目的基因FMC63的获得

1)采用全基因合成技术合成FMC63-CAR结构，并添加5’UTR、3’UTR、PolyA尾等有利于mRNA稳定性和翻译效率的元件，并在其5'端添加NheⅠ酶切位点，3'端添加NotⅠ酶切位点，然后将合成好的FMC63-CAR基因(SEQ ID NO.3)通过上游NheⅠ酶切位点和下游NotⅠ酶切位点构建到载体pCI-Neo(购自Promega公司，E1841)，并进行质粒的大提制备和内毒素化处理(委托金唯智生物科技有限公司完成)，得到质粒FMC63 inpCI-Neo。

2)基于质粒FMC63 inpCI-Neo设计引物(引物需求量2OD)。

FMC63线性化模板扩增引物：

正向扩增引物(SEQ ID NO.8)：

5'-gctggagtcactagtgcggccgcCCAAGCTCTAATACGACTCACTATAGG-3'

反向扩增引物(SEQ ID NO.9)：

5'-aaggtccagttgtaagcggccgcTACGAATTAATTCGAGCTCGCC-3'

委托金唯智生物科技有限公司合成上述引物，并利用ddH₂O稀释至10nM。

3)以FMC63 in pCI-Neo为模板DNA，参考Primer STAR Master Mix(TakaraR045A)试剂说明书配制PCR扩增体系(表1)。

表1 PCR扩增体系

然后在PCR仪(BIO-RAD T100)上运行以下反应程序：98℃预变性1min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸5min。获得FMC63-CAR的完整DNA模板。

4)PCR产物进行琼脂糖(invitrogen 75510-019)凝胶电泳分析，140V，30min。

5)按照Gel Extraction Kit(OMAGAD2500-03)对上述PCR产物进行胶回收。

2、DNA终止修复反应

按照

v2.0Linear Cloning Kits(Lucigen 43036-1)的说明书进行DNA终止修复反应，体系如表2所示，室温反应30min，反应结束后在70℃反应15min终止反应。反应产物进行琼脂糖(invitrogen 75510-019)凝胶电泳分析，140V，30min。而后按照GelExtraction Kit(OMAGAD2500-03)对上述PCR产物进行胶回收。

表2 DNA终止修复反应体系

3、与pJAZZ载体连接

按照

v2.0Linear Cloning Kits(Lucigen 43036-1)的说明书进行连接。

1)于冰上配制表3所示反应体系；

2)使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心将反应液收集至管底；

3)室温(21～25℃)孵育2小时，70℃反应15min，终止反应，将产物置于冰上。

表3载体连接体系

4、重组产物转化

按照

v2.0Linear Cloning Kits(Lucigen 43036-1)的说明书使用TSA感受态进行转化。

5、重组产物鉴定

过夜培养后，重组反应转化平板上形成很多单克隆，挑取若干单克隆进行测序鉴定。

结果如图2所示，FMC63基因PCR产物凝胶电泳结果和经DNA终止修复反应后的电泳结果，在2Kb左右有条带，FMC63基因扩增成功。经测序获知，pJAZZ-OK-FMC63基因序列正确，均与预期相符。

实施例2 FMC63-RNA的制备及其在K562细胞上的表达情况

本发明涉及的原始K562细胞购于美国ATCC细胞库，在本实验室内传代培养保存，细胞使用的细胞活率95％以上。

1、DNA的获得

1)4D5-DNA的获得

采用全基因合成技术合成4D5-CAR结构，并添加5’UTR、3’UTR、PolyA尾等有利于mRNA稳定性和翻译效率的元件，并在其5'端添加NheⅠ酶切位点，3'端添加NotⅠ酶切位点，然后将合成好的4D5-CAR基因通过上游NheⅠ酶切位点和下游NotⅠ酶切位点(SEQ ID NO.10)构建到载体pCI-Neo(购自Promega公司，E1841)，并进行质粒的大提制备和内毒素化处理(委托金唯智生物科技有限公司完成)，得到4D5 inpCI-Neo质粒。

所述4D5的mRNA的DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

基于构建的质粒4D5 inpCI-Neo设计引物(引物需求量2OD)。

4D5线性化模板扩增引物：

正向扩增引物(SEQ ID NO.11)：GCTCGTATGTTGTGTGGAATTG

反向扩增引物(SEQ ID NO.12)：GCTGCAAGGCGATTAAGTTG

委托金唯智生物科技有限公司合成上述引物，并利用ddH₂O分别稀释至10nM。

用质粒4D5 inpCI-Neo作为模板，参考Primer STAR MasterMix(Takara R045A)试剂说明书，按照表1配置PCR扩增体系，然后在PCR仪(BIO-RAD T100)上运行以下反应程序：98℃预变性1min；98℃变性10s，65℃退火15s，72℃延伸10s/kb，30个循环；72℃延伸5min；获得体外转录的线性化模板，扩增结束后，将所得4D5的PCR产物进行琼脂糖(invitrogen75510-019)凝胶电泳，140V，电泳30min。

2)按照Gel Extraction Kit(OMAGAD2500-03)对上述PCR产物进行胶回收。

2、体外转录

按照mMESSAGE

T7 Ultra Kit(Thermo AM1345)试剂盒说明书，取FMC63的线性化质粒和4D5的线性化模板DNA各1μg进行体外转录，体系如表4所示，混匀，37℃水浴过夜反应。

表4体外转录体系

2)加1μL的TURBO DNase，混匀，37℃反应15min，消化DNA模板，得到FMC63和4D5的mMESSAGE

T7 Ultra reaction。

3)LiCl沉淀

按照mMESSAGE

T7 Ultra Kit(Thermo AM1345)试剂盒说明书，将上述所得FMC63和4D5的mRNA产物用LiCl沉淀的方法进行纯化，将得到的FMC63-RNA和4D5-RNA在-20℃或-70℃保存。

3、电转表达

1)取2×10⁷K562细胞悬液于50mL离心管中，400g离心5min，弃上清；

2)取2mL RPMI1640无血清培养基(Gibco^TM，61870036)重悬细胞，分别取1mL细胞悬液到1.5mLEP管中，400g离心5min，弃上清；

3)轻弹EP管底部使细胞呈糊状，分别加入适量的RNA(15μg)，加RPMI1640无血清培养基(Gibco^TM，61870036)至140μL体系，混匀，将细胞悬液转移至电击杯中，避免产生气泡；

4)启动电转仪(Celetrix CTX-1500A)，设置参数：560V，30ms，将电击杯快速放入电击槽中，进行电转，电击完成后快速插入冰中，静置2min；

5)将细胞悬液转移至25mL细胞培养瓶中，补加10mL IMDM培养基(BI，01-058-1ACS，含10％FBS(Gibco^TM，10099-141)+1％Penicillin-Streptomycin(HyClone，SV30010)，37℃恒温培养箱中培养，得到FMC63-RNA-K562和4D5-RNA-K562细胞悬液。

4、流式检测

1)FMC63-RNA-K562+anti-FMC63

i.将电转后的FMC63-RNA-K562细胞于37℃恒温培养箱中培养24h后，于生物安全柜中分别取出1×10⁶的K562(野生型)、FMC63-RNA-K562细胞，400g离心5min，弃上清；用1mLPBS溶液洗一次，400g离心5min，弃上清；

ii.在细胞沉淀中加1μg anti-FMC63(FM3-HPY53)抗体和50μLPBS溶液，轻弹流式管底部混匀，室温孵育25min；

iii.加1mLPBS溶液洗去抗体，400g离心5min，弃上清；

iv.加300μLPBS上机检测；

2)4D5-RNA-K562+9A10

i.将电转后的4D5-RNA-K562细胞于37℃恒温培养箱中培养24h后，于生物安全柜中分别取出1×10⁶的K562(野生型)、4D5-RNA-K562细胞，400g离心5min，弃上清；用1mL PBS溶液洗一次，400g离心5min，弃上清；

ii.在细胞沉淀中加1μg靶向4D5的鼠源单克隆抗体5D1(该鼠源单克隆抗体5D1已在中国专利CN202010506038.1中进行公开)抗体和50μLPBS溶液，轻弹流式管底部混匀，室温孵育40min；

iii.加1mLPBS溶液洗去抗体，400g离心5min，弃上清；

iv.在细胞沉淀中加2μl APC anti-mouse IgG1 Antibody(Biolegend，406609)和50μLPBS溶液，轻弹流式管底部混匀，室温孵育25min；

v.加1mLPBS溶液洗去抗体，400g离心5min，弃上清；

vi.加300μL PBS上机检测；

3)流式上机检测

结果如图3所示，成功制备得到FMC63-RNA和4D5-RNA，且电转K562细胞24小时后成功检测到FMC63-CAR和4D5-CAR表达，表达率约为40～50％。

实施例3检测FMC63-RNA-CAR在NK92上的特异性杀伤效果

本发明涉及的原始NK92细胞购于美国ATCC细胞库，在本实验室内传代培养保存，细胞使用的细胞活率95％以上。

1、电转表达：mRNA转染细胞时参考电转仪(Celetrix，CTX-1500A)说明书进行操作：

1)分别取1×10⁷的NK92细胞悬液于50mL离心管中，取两份，400g离心5min，弃上清，尽可能去除所有液体；

2)分别用120μL的转染缓冲液(Electroporation Buffer 103part A：Electroporation Buffer 103part B＝1:1(Celetrix))重悬细胞，加入适量的4D5-RNA-CAR(无功能对照RNA，15μg)、FMC63-RNA-CAR(15μg)，混匀，轻柔混匀后将细胞悬液转移至120μL电击杯中，避免产生气泡，冰上放置1min；

3)启动电转仪，设置参数：NK92-600V，30ms，将电击管快速放入电击槽中，进行电转，电击完成后快速插入冰中，静置1min；

4)将细胞悬液转移至25mL细胞培养瓶中，NK92细胞补加10mL的预先加入10％胎牛血清FBS(Gibco^TM，10099-141)、1％Penicillin-Streptomycin(HyClone，SV30010)、1000IU/mL IL-2(注射用人重组白介素-2，购自双鹭药业公司)Human Lymphocytes Serum FreeMedia(LY-08)培养基(购自大连珑辉生物技术公司，简称为LY-08培养基)，37℃恒温培养箱中培养。

2、与进行实施例2相同的流式检测

3.ADCC体外杀伤实验

1)靶细胞准备：取4×10⁶个K562-CBG99-CD19-1mono细胞，400g离心5min，弃上清，加入无IL2的LY-08培养基(+10％FBS(Gibco^TM，10099-141))2mL重悬细胞，使细胞密度为2×10⁶cells/mL。

2)效应细胞准备：①将FMC63-RNA-NK92细胞、4D5-RNA-NK92细胞各取8×10⁶个细胞，400g离心5min，弃上清，加入无IL2的LY-08培养基(+10％FBS(Gibco^TM，10099-141))1mL重悬细胞，使细胞密度为8×10⁶cells/mL。

3)铺板：在96孔圆底板中将靶细胞按1×10⁵个细胞每孔(50μL)，三个复孔进行铺板。结束后按照E：T＝4:1的比例加入与之相对应的效应细胞，按4×10⁵个细胞每孔(50μL)布局(图4)。然后将孔板置于37℃，5％CO₂的培养箱中，培养4h。

4)检测Luciferase：700g离心5min，去上清后(尽量去净)参照One LiteLuciferaceAssay System(诺维赞)说明书，配置底物和酶的混合物，每个细胞加入100μL，转入黑色96孔板中。避光2mins后上酶标仪(MD Spectra Max i3X)检测发光信号强度。将读值结果于GraphPad软件上进行分析。

结果如图5和图6所示，与NK92野生型相比，电转FMC63的24小时后的NK92有明显FMC63基因表达，表达率为43.19％；当靶细胞为K562-CBG99-CD19-1mono(CD19靶点)时，相比电转4D5-RNA-CAR的NK92细胞，电转FMC63-RNA-CAR的NK92细对K562-CBG99-CD19-1mono细胞有60％左右的特异性杀伤，且电转4D5-RNA-CAR的NK92细胞的本底杀伤几乎为0。因此NK92细胞在电转FMC63-RNA-CAR后，成功检测到FMC63的表达，表达率为40％左右，且在杀伤实验中检测到约60％的针对CD19靶点的特异性杀伤效果。

实施例4通过mRNA在NK92细胞上表达细胞因子IL21

1、DNA的获得

1)快速基因合成：

采用全基因合成技术合成基因IL21，并添加5’UTR、3’UTR、PolyA尾等有利于mRNA稳定性和翻译效率的元件，并在其5'端添加NheⅠ酶切位点，3'端添加NotⅠ酶切位点，然后将合成好的IL21基因(SEQ ID NO.4)通过上游NheⅠ酶切位点和下游NotⅠ酶切位点构建到载体pCI-Neo(购自Promega公司，E1841)，并进行质粒的大提制备和内毒素化处理(委托金唯智生物科技有限公司完成)，得到IL21 inpCI-Neo质粒。

2)PCR扩增：

基于之前构建的质粒IL21 inpCI-Neo设计引物(引物需求量2OD)。

线性化模板扩增引物:

Primer Forward(SEQ ID NO.13)：GCTCGTATGTTGTGTGGAATTG

Primer Reverse(SEQ ID NO.14)：GCTGCAAGGCGATTAAGTTG

委托金唯智生物科技有限公司合成引物，并利用ddH₂O稀释浓度到10nM。用质粒IL21 in pCI-Neo作为模板，构建表1体系，然后在PCR仪(BIO-RAD T100)上运行以下反应体系：98℃预变性1min；98℃变性10s，65℃退火15s，72℃延伸10s/kb，30个循环；72℃延伸5min。获得体外转录的线性化模板，扩增结束后，将所得IL21的PCR产物进行琼脂糖(invitrogen 75510-019)凝胶电泳，130V，电泳30min。

3)按照Gel Extraction Kit(OMAGA D2500-03)对上述PCR产物进行胶回收。

2、pJAZZ-OK-IL21载体的构建

参照

v2.0Linear Cloning Kits(Lucigen 43036-1)的说明书进行pJAZZ-OK-IL21载体的构建，构建过程与实施例1相同。

3、体外转录

1)按照mMESSAGE

T7 Ultra Kit(Thermo AM1345)试剂盒说明书，取IL21的线性化质粒DNA各1μg进行体外转录，体系同表4，混匀，37℃水浴过夜反应。

2)加1μL的TURBO DNase，混匀，37℃反应15min，消化DNA模板，得到IL21的mMESSAGE

T7 Ultra reaction。

3)LiCl沉淀

按照mMESSAGE

T7 Ultra Kit(Thermo AM1345)试剂盒说明书，将上述所得IL21的mRNA产物用LiCl沉淀的方法进行纯化，得到IL21-RNA，取出3μL进行浓度测定和琼脂糖(invitrogen 75510-019)凝胶电泳分析；将所得IL21-RNA在-20℃或-70℃保存。

4、电转表达

1)取1×10⁷NK92细胞悬液于50mL离心管中，400g离心5min，弃上清；

2)取1mL RPMI1640无血清培养基(Gibco^TM，61870036)重悬细胞，400g离心5min，弃上清；

3)轻弹EP管底部使细胞呈糊状，分别加入适量的RNA(10μg)，加电转缓冲液至140μL体系，混匀，将细胞悬液转移至电击杯中，避免产生气泡；

4)启动电转仪(Celetrix CTX-1500A)，设置参数：600V，30ms，将电击杯快速放入电击槽中，进行电转，电击完成后快速插入冰中，静置2min；

5)将细胞悬液转移至25mL细胞培养瓶中，补加10mL LY-08培养基(含10％FBS(Gibco^TM，10099-141)，1％Penicillin-Streptomycin(HyClone，SV30010)、1000IU/mL IL-2(注射用人重组白介素-2，购自双鹭药业公司)，37℃恒温培养箱中培养，得到IL21-NK92细胞悬液。

5、Elisa试剂盒检测

按照Human IL-21Elisa试剂盒(Biolegend 433804)试剂盒说明书进行操作。

1)ELISA包被：将稀释过的CaptureAntibody溶液(1×)包被ELISA板，100μL/孔，4℃过夜包被。

2)封闭：洗板4次，加200μL 1×Assay DiluentA在每个孔中，室温孵育1h。

3)上样：洗板4次，将IL21按照说明书要求浓度进行稀释，将稀释好的标准品和提前准备好的培养24h后的NK92细胞上清(阴性对照)、IL21-NK92细胞上清按照100μL/孔的体积加入到封闭好的ELISA板中，室温孵育2h。

4)二抗：洗板5次，加100μL稀释的Detection Antibody在每个孔中，室温孵育1h。

5)显色：洗板5次，350μL/孔，每次间隔1min。然后每孔加入100μL TMB显色液避光显色15min后再加入100μL终止液。

6)酶标仪检测波长为450nm时的OD值。

结果如图7所示，pJAZZ-OK-IL21质粒构建成功，成功制备得到IL15-mRNA，并且根据IL21梯度稀释标准品的OD₄₅₀绘制了标准曲线，根据样品的OD450值换算的IL21浓度如表5所示，与NK92细胞培养上清相比，电转IL21-RNA的NK92细胞培养上清中有IL21表达，表达量约为1200pg/mL。

表5 24h IL21表达情况

对比例1不同mRNA制备方法的比较

以实施例2质粒4D5 inpCI-Neo为DNA模板，PCR扩增得到的4D5线性化模板。

1、ARCA加帽一步合成法

1)按照mMESSAGE

T7 Ultra Kit(Thermo AM1345)说明书，以4D5的PCR线性化产物为模板，配制表4所示的体系，混匀，37℃反应4h进行体外转录。

2)加1μL的TURBO DNase，混匀，37℃反应15min，消化DNA模板，得到4D5的mMESSAGE

T7 Ultra reaction。

3)LiCl沉淀

按照mMESSAGE

T7 Ultra Kit(Thermo AM1345)试剂盒说明书，将上述所得4D5的mRNA产物用LiCl沉淀的方法进行纯化，得到4D5-RNA，取出3μL进行浓度测定和琼脂糖(invitrogen 75510-019)凝胶电泳分析；4D5-RNA在-20℃或-70℃保存。

2、化学加帽分步合成法

1)按照T7 HighYield RNATranscription kit(近岸生物，E131-01A)说明书，以4D5的PCR线性化产物为模板，配制表6所示体系进行体外转录，37℃反应4h。

表6体外转录体系

2)按照Cap 1Capping System(近岸生物，M082)试剂盒说明书，用RNase-freewater将适量RNA稀释至67μL，配置表7所示加帽反应体系，37℃反应30min，完成加帽。

表7加帽反应体系

3)加1μL的DNaseⅠ，混匀，37℃反应15min，消化DNA模板。

4)LiCl沉淀

按照T7 High Yield RNA Transcription kit(近岸生物，E131-01A)说明书，将上述所得4D5的mRNA产物用LiCl沉淀的方法进行纯化，得到4D5-RNA，取出3μL进行浓度测定和琼脂糖(invitrogen 75510-019)凝胶电泳分析；4D5-RNA在-20℃或-70℃保存。

结果如图8所示，ARCA加帽一步合成法成功制得4D5-RNA(图8中以一步4D5-RNA进行描述)，且量很多，而化学加帽分步合成法在体外转录过程中仅制得少量4D5-RNA，且在加帽完成后，4D5-RNA(图8中以多步4D5-RNA加帽进行描述)的条带明显变淡，说明4D5-RNA在加帽过程中发生降解，LiCL沉淀未得到4D5-RNA产物。由此，联用ARCA帽子类似物和模板中加PolyA₁₂₁的方法进行体外转录，一步制得mRNA，可有效提高mRNA的制备效率和稳定性。

对比例2

不同方法制备所得的mRNA的转染效果及细胞毒性比较

1、电转表达：mRNA转染细胞时参考电转仪(Celetrix，CTX-1500A)说明书进行操作，具体操作步骤如下。

1)分别取1×10⁷的NK92细胞悬液于50mL离心管中，取2份，400g离心5min，弃上清，尽可能去除所有液体；

2)分别用120μL的转染缓冲液(Electroporation Buffer 103part A：Electroporation Buffer 103part B＝1:1(Celetrix))重悬细胞，加入适量的ARCA加帽一步合成法4D5-RNA-CAR(10μg)、化学加帽分步合成法4D5-RNA-CAR(10μg)，混匀，轻柔混匀后将细胞悬液转移至120μL电击杯中，避免产生气泡，冰上放置1min；

4)将细胞悬液转移至25mL细胞培养瓶中，NK92细胞补加10mL的LY-08培养基(含10％FBS(Gibco^TM，10099-141)+1％Penicillin-Streptomycin(HyClone，SV30010)+1000IU/mL IL2)，37℃恒温培养箱中培养。

2、细胞活率检测

37℃培养24小时后，将ARCA加帽一步合成法4D5-RNA-NK92细胞(简称一步4D5-RNA)、化学加帽分步合成法4D5-RNA-NK92细胞(简称多步4D5-RNA)取出20μL进行细胞计数，观察其细胞活率，比较两种mRNA的细胞毒性。

3、流式检测

1)将上一步电转后的4D5-RNA-NK92细胞于37℃恒温培养箱中培养24h后，于生物安全柜中分别取出1×10⁶个NK92(野生型)、一步4D5-RNA-NK92细胞、多步4D5-RNA-NK92细胞，400g离心5min，弃上清；用1mL PBS溶液洗一次，400g离心5min，弃上清；

2)在细胞沉淀中加1μg可靶向4D5的鼠源单克隆抗体5D1(已在中国专利CN202010506038.1中公开)抗体和50μL PBS溶液，轻弹流式管底部混匀，室温孵育40min；

3)加1mLPBS溶液洗去抗体，400g离心5min，弃上清；

4)在细胞沉淀中加2μl APC anti-mouse IgG1 Antibody(Biolegend，406609)和50μLPBS溶液，轻弹流式管底部混匀，室温孵育25min；

5)加1mLPBS溶液洗去抗体，400g离心5min，弃上清；

6)加300μLPBS上机检测；

4、实验结果

结果如图9和图10所示，电转一步4D5-RNA后的NK92细胞活率为70％，而电转多步4D5-RNA后的NK92细胞活率为27％；与NK92野生型相比，电转一步4D5-RNA24小时后的NK92有明显4D5基因表达，表达率为23.8％左右，电转多步4D5-RNA24小时后的NK92细胞也有表达，但较一步法的低，且死细胞很多，推测，阳性细胞群多为非特异结合。因此，联用ARCA帽子类似物和模板中加PolyA₁₂₁的方法进行体外转录，一步制得mRNA，可显著降低mRNA的细胞毒性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司

<120> 一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板及构建方法、mRNA的体外转录方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1662

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgctgctgc tggtgacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60

atccccgaca ttcagatgac acagaccaca agcagcctga gcgctagcct gggcgacaga 120

gtgaccatca gctgcagagc tagccaagac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180

aagcccgacg gcaccgtgaa gctgctgatc taccacacaa gcagactgca cagcggcgtg 240

cctagcagat tcagtggaag tggtagcggc accgattaca gcctgaccat cagcaacctg 300

gagcaagagg acatcgccac ctacttctgt cagcaaggca acaccctgcc ctacaccttc 360

ggcggcggca ccaagctgga gatcaccgga agcactagcg ggtccggcaa gcccggaagc 420

ggtgagggct cgaccaaagg cgaggtgaag ctgcaagaga gcggccccgg gctggtggcc 480

ccatctcaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540

gtgagctgga tcagacagcc ccctagaaag ggcctggagt ggctgggcgt gatctggggc 600

agcgaaacca cctactacaa cagcgccctg aagagcagac tgaccatcat caaggacaac 660

agcaagagcc aagtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720

tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggattactg gggtcaaggc 780

acaagcgtga ctgttagcag cgccgccgca ttcgtgcccg tgtttcttcc tgccaagccg 840

accaccactc cggcgccaag accccccacg cctgcaccaa cgatagctag ccaaccccta 900

agcctgcgtc ccgaggcctg taggcccgcc gccggcggtg ctgtgcacac aagaggcctg 960

gacttcgcct gcgacatcta catctgggcc cccctggccg gcacctgcgg cgtgctgctg 1020

ctgagcctgg tgatcaccct gtactgcaac cacagaaaca gaagcaagag aagcagactg 1080

ctgcacagcg actacatgaa catgacccct agaagacccg gccccacaag aaagcactat 1140

cagccctacg ccccccctag agacttcgcc gcctacagat ctcggtttag cgtcgtgaag 1200

agaggcagaa agaagctgct gtacatcttc aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagacc 1260

acccaagagg aggacggctg cagctgcaga ttccccgagg aggaggaggg cggctgcgag 1320

ctgagagtga agttcagcag aagcgccgac gcccccgcct atcagcaagg gcagaatcag 1380

ctgtacaacg agctgaacct gggcagaaga gaggagtacg acgtgctgga caagagaaga 1440

ggccgggacc ccgagatggg cggcaagcct agaagaaaga acccccaaga gggcctgtac 1500

aacgaactgc aaaaggacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag 1560

agaagaagag gcaagggcca cgacggcctg taccaaggcc tgagcaccgc caccaaggac 1620

acctacgacg ccctgcacat gcaagccctg ccccctagat ga 1662

<210> 2

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atgagaagca gccccggcaa catggagaga atcgtgatct gcctgatggt gatcttcctg 60

ggcaccctgg tgcacaagag cagcagccaa ggccaagaca gacacatgat cagaatgaga 120

cagctgatcg acatcgtgga tcagctgaag aactacgtga acgacctggt gcccgagttc 180

ctgcccgccc ccgaggacgt ggagaccaac tgcgagtgga gcgccttcag ctgctttcag 240

aaggctcagc tgaagagcgc caacaccggc aacaacgaga gaatcatcaa cgtgagcatc 300

aagaagctga agagaaagcc ccctagcacc aacgccggca gaagacagaa gcacagactg 360

acctgcccta gctgcgacag ctacgagaag aagcccccca aggagttcct ggagagattc 420

aagagcctgc tgcagaagat gatccatcag cacctgagca gcagaaccca cggcagcgag 480

gacagctga 489

<210> 3

<211> 2066

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggc tagcgagaca agcttgcttg ttctttttgc agaagctcag 60

aataaacgct caactttggc agatcggtac cgaattcgcc gccaccatgc tgctgctggt 120

gacaagcctg ctgctgtgcg agctgcccca ccccgccttc ctgctgatcc ccgacattca 180

gatgacacag accacaagca gcctgagcgc tagcctgggc gacagagtga ccatcagctg 240

cagagctagc caagacatca gcaagtacct gaactggtat cagcagaagc ccgacggcac 300

cgtgaagctg ctgatctacc acacaagcag actgcacagc ggcgtgccta gcagattcag 360

tggaagtggt agcggcaccg attacagcct gaccatcagc aacctggagc aagaggacat 420

cgccacctac ttctgtcagc aaggcaacac cctgccctac accttcggcg gcggcaccaa 480

gctggagatc accggaagca ctagcgggtc cggcaagccc ggaagcggtg agggctcgac 540

caaaggcgag gtgaagctgc aagagagcgg ccccgggctg gtggccccat ctcagagcct 600

gagcgtgacc tgcaccgtga gcggcgtgag cctgcccgac tacggcgtga gctggatcag 660

acagccccct agaaagggcc tggagtggct gggcgtgatc tggggcagcg aaaccaccta 720

ctacaacagc gccctgaaga gcagactgac catcatcaag gacaacagca agagccaagt 780

gttcctgaag atgaacagcc tgcagaccga cgacaccgcc atctactact gcgccaagca 840

ctactactac ggcggcagct acgccatgga ttactggggt caaggcacaa gcgtgactgt 900

tagcagcgcc gccgcattcg tgcccgtgtt tcttcctgcc aagccgacca ccactccggc 960

gccaagaccc cccacgcctg caccaacgat agctagccaa cccctaagcc tgcgtcccga 1020

ggcctgtagg cccgccgccg gcggtgctgt gcacacaaga ggcctggact tcgcctgcga 1080

catctacatc tgggcccccc tggccggcac ctgcggcgtg ctgctgctga gcctggtgat 1140

caccctgtac tgcaaccaca gaaacagaag caagagaagc agactgctgc acagcgacta 1200

catgaacatg acccctagaa gacccggccc cacaagaaag cactatcagc cctacgcccc 1260

ccctagagac ttcgccgcct acagatctcg gtttagcgtc gtgaagagag gcagaaagaa 1320

gctgctgtac atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg cagaccaccc aagaggagga 1380

cggctgcagc tgcagattcc ccgaggagga ggagggcggc tgcgagctga gagtgaagtt 1440

cagcagaagc gccgacgccc ccgcctatca gcaagggcag aatcagctgt acaacgagct 1500

gaacctgggc agaagagagg agtacgacgt gctggacaag agaagaggcc gggaccccga 1560

gatgggcggc aagcctagaa gaaagaaccc ccaagagggc ctgtacaacg aactgcaaaa 1620

ggacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagagaa gaagaggcaa 1680

gggccacgac ggcctgtacc aaggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct 1740

gcacatgcaa gccctgcccc ctagatgaac tagtgactga ctaggatctg gttaccacta 1800

aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacacttt 1860

acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc tcctaataaa aagaaagttt 1920

cttcacattc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040

aaaaaaaaaa aggagaccgc ggccgc 2066

<210> 4

<211> 893

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

taatacgact cactataggc tagcgagaca agcttgcttg ttctttttgc agaagctcag 60

aataaacgct caactttggc agatcggtac cgaattcgcc gccaccatga gaagcagccc 120

cggcaacatg gagagaatcg tgatctgcct gatggtgatc ttcctgggca ccctggtgca 180

caagagcagc agccaaggcc aagacagaca catgatcaga atgagacagc tgatcgacat 240

cgtggatcag ctgaagaact acgtgaacga cctggtgccc gagttcctgc ccgcccccga 300

ggacgtggag accaactgcg agtggagcgc cttcagctgc tttcagaagg ctcagctgaa 360

gagcgccaac accggcaaca acgagagaat catcaacgtg agcatcaaga agctgaagag 420

aaagccccct agcaccaacg ccggcagaag acagaagcac agactgacct gccctagctg 480

cgacagctac gagaagaagc cccccaagga gttcctggag agattcaaga gcctgctgca 540

gaagatgatc catcagcacc tgagcagcag aacccacggc agcgaggaca gctgaactag 600

tgactgacta ggatctggtt accactaaac cagcctcaag aacacccgaa tggagtctct 660

aagctacata ataccaactt acactttaca aaatgttgtc ccccaaaatg tagccattcg 720

tatctgctcc taataaaaag aaagtttctt cacattctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagg agaccggcgc cgc 893

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg 20

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gcttgttctt tttgcagaag ctcagaataa acgctcaact ttggcagatc 50

<210> 7

<211> 131

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacacttt 60

acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc tcctaataaa aagaaagttt 120

cttcacattc t 131

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

gctggagtca ctagtgcggc cgcccaagct ctaatacgac tcactatagg 50

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

aaggtccagt tgtaagcggc cgctacgaat taattcgagc tcgcc 45

<210> 10

<211> 2808

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

taatacgact cactataggc tagcgagaca agcttgcttg ttctttttgc agaagctcag 60

aataaacgct caactttggc agatcggtac cgaattcgcc gccaccatgc ttcttcttgt 120

gacatcactt cttctttgcg aacttcctca ccctgcattt cttcttatcc ctgattacaa 180

agatgatgat gataaagata tccaaatgac acaatcacct tcatcacttt cagcatcagt 240

gggagataga gtgacaatca catgcagagc atcacaagat gtgaacacag cagtggcatg 300

gtaccaacag aagccaggca aggctcctaa actcctgatc tactcagcat catttcttta 360

ctcaggagtg ccttcgaggt tctctgggag tagatcagga acagatttca ctctaacaat 420

ctcatcactt caacctgaag atttcgccac ttactactgc caacaacact acacaacacc 480

tcctacattt gggcagggaa cgaaggtaga gatcaagcgt accggatcaa catcaggatc 540

aggaaagccg ggttcaggag aaggatcaac aaagggcgag gtgcaacttg tggaatcagg 600

aggaggactt gtgcaacctg gaggatcact tagactttca tgcgcagcat caggatttaa 660

catcaaagat acatacattc actgggtgag acaagcacct ggaaagggtt tggagtgggt 720

ggcaagaatc taccctacaa acggatacac aagatacgca gattcagtga aaggaagatt 780

tacaatctca gcagatacat caaagaatac tgcatacctt caaatgaact cacttagagc 840

agaagataca gcagtgtact actgctcaag atggggcggg gatggattct atgccatgga 900

tgtgtgggga caaggcaccc tcgtcacagt gtcatcattt gtgcctgtgt ttcttcctgc 960

aaagccgact acaactccgg cgccgcgacc tccaacaccg gctcccacga ttgcatcaca 1020

acctctttca cttagacctg aagcatgcag acctgcagca ggaggagcag tgcacacaag 1080

aggacttgat ttcgcttgtg atatctacat ctgggcacct cttgcaggaa catgcggagt 1140

gcttcttctt tcacttgtga tcacacttta ctgcaaccac agaaacagat caaagaggag 1200

tagacttctt cactcagatt acatgaacat gacacctaga agacctggac ctacaagaaa 1260

gcattatcaa ccttacgcac ctcctagaga tttcgcggct tacagatcgc gcttctcagt 1320

ggtcaagcga ggacgcaaga agttactcta catctttaaa caacctttca tgcgccctgt 1380

gcaaacaaca caagaagaag atggatgctc atgcagattt cctgaagaag aagaaggagg 1440

atgcgaactt agagtgaaat tcagccgttc agcagatgca cctgcatacc aacaaggaca 1500

gaatcagctc tacaacgaac taaacctggg aagaagagaa gaatacgatg tgcttgataa 1560

gaggcgcgga agagatcctg aaatgggagg aaagcccagg agaaagaatc cgcaggaggg 1620

attgtacaac gaactccaga aagacaagat ggcagaagca tactcagaaa tcggaatgaa 1680

aggagaaaga agaagaggaa agggtcatga tggactttac caaggacttt caacagcaac 1740

aaaagataca tacgatgctc ttcacatgca agcacttcct cctagatgag gatccattac 1800

aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga 1860

tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc 1920

tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa 1980

cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc 2040

acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc 2100

atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 2160

gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg 2220

attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct 2280

tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg 2340

agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cgttaactaa acttgtttat tgcagcttat 2400

aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 2460

cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg actagtgact 2520

gactaggatc tggttaccac taaaccagcc tcaagaacac ccgaatggag tctctaagct 2580

acataatacc aacttacact ttacaaaatg ttgtccccca aaatgtagcc attcgtatct 2640

gctcctaata aaaagaaagt ttcttcacat tctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaggagacc ggcgccgc 2808

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

gctcgtatgt tgtgtggaat tg 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

gctgcaaggc gattaagttg 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

gctcgtatgt tgtgtggaat tg 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

gctgcaaggc gattaagttg 20

Claims

1.一种用于基因编辑NK细胞的mRNA模板的构建方法，包括以下步骤：(1)将mRNA的DNA模板构建到载体pCI-Neo中，提取质粒，得第一重组质粒；所述mRNA的DNA模板的结构自5’端至3’端，依次包括：ARCA帽子类似物、5’UTR、目的基因开放编码框、3’UTR和PolyA结构；

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述目的基因开放编码框包括FMC63和IL21，所述FMC63的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述IL21的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，包含FMC63的mRNA的DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；包含IL21的mRNA的DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，在步骤(2)连接入线性质粒pJAZZ-OK后，还包括将连接产物转化TSA感受态，挑取单菌落进行测序鉴定，将测序正确的重组子抽提质粒，得第二重组质粒。

5.利用权利要求1～4任一项所述构建方法构建得到的mRNA模板。

6.利用权利要求5所述mRNA模板体外一步转录mRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用所述mRNA模板配制反应体系，37℃反应4h，纯化得mRNA；

7.利用权利要求6所述方法制备得到的mRNA在编辑NK细胞中的应用。

8.一种在NK细胞上表达嵌合抗原受体结构或细胞因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求6所述方法制备得到的mRNA转染NK细胞。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述NK细胞包括NK92细胞。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述NK细胞数量与mRNA的比值为1×10⁷细胞：10～15μg。