CN111606996A

CN111606996A - 一种靶向4d5的鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111606996A
Application number: CN202010506038.1A
Authority: CN
Inventors: 焦顺昌; 陈静远; 袁翰; 李斯慧; 冯向辉
Original assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2040-06-05
Also published as: CN111606996B

Abstract

本发明提供了一种靶向4D5的鼠源单克隆抗体和应用，属于免疫检测技术领域。一种靶向4D5的鼠源单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。Western blot实验结果显示，采用体外重组表达的HRP标记的鼠源单克隆抗体与4D5形成明显条带，说明所述鼠源单克隆抗体具有靶向4D5的特性。靶向4D5的鼠源单克隆抗体或重组载体在制备检测4D5抗体或4D5的嵌合抗原受体阳性细胞的试剂盒中的应用。与其他检测方法相比，鼠源单克隆抗体5D1对4D5‑CAR结构结合能力最强，且检测灵敏性有较大幅度提高。

Description

一种靶向4D5的鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种靶向4D5的鼠源单克隆抗体和应用。

背景技术

随着肿瘤免疫治疗的发展，结合了抗体和免疫细胞优势的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞免疫治疗受到极大关注。CAR主要由细胞膜外抗原结合区和细胞内信号转导区通过铰链区及跨膜区构成。膜外抗原结合区具有特异性识别并结合靶细胞表面抗原的功能，其构成源于单克隆抗体的单链可变区结构域(SingleChain Variable Fragment，scFv)，由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成。细胞内信号转导区主要由共刺激信号和T细胞受体(TCR)的CD3zeta链组成。表达CAR的T细胞(CAR-T)通过scFv与靶细胞抗原结合后，胞内信号转导区将信号传入T细胞，从而激活T细胞，分泌穿孔素、颗粒酶及细胞因子等，发挥杀伤作用。

目前FDA批准上市了两款CAR-T细胞药物，分别是诺华制药(Novartis)的Kymriah，和吉利德公司(Gilead)的Yescarta。两款药物均针对CD19阳性B细胞肿瘤，采用了相同的抗原结合区，即来源于鼠单克隆抗体FMC63的scFv。

构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒或非病毒系统转染并整合到T细胞基因组上。当该基因正常表达，在细胞膜上形成跨膜的CAR结构时，CAR-T细胞才具有识别和杀伤靶细胞的活性。因此，准确检测表达CAR的阳性T细胞是CAR-T药物质量控制的关键步骤，也是临床上对病人治疗剂量控制、过程监控及伴随诊断的重要环节。

常见的对于CAR-T细胞进行检测的方法有两种类型：检测CAR基因阳性T细胞和检测CAR蛋白阳性T细胞。对于检测CAR基因阳性T细胞而言，定量实时聚合酶联反应(Qμantitative Real Time PCR,qPCR)是检测CAR基因阳性T细胞的主要方法。通过qPCR可以检测细胞基因组上整合的CAR基因，以及CAR基因的拷贝数。但该方法不能准确反映表达CAR的阳性T细胞，因为有一部分整合了CAR基因的T细胞没有正常表达CAR(Jennifer N.Brμdno,et al.,Joμrnal of Clinical Oncology,2016)，这些T细胞带来的假阳性降低了qPCR方法应用的准确性。此外，qPCR方法无法满足对T细胞多种表面标志物(CD3、CD4、CD8等等)同时检测的需求，这进一步限制了qPCR方法的应用。对于检测CAR蛋白阳性T细胞而言，现有检测试剂包括Protein L(Zhi li Zheng,et al.,Joμrnal ofTranslational Medicine,2012)、HER2抗原等。然而，现有的这些检测试剂仍具有一些缺点，检测效果难以令人满意。其中，抗Protein L检测HER2CAR的特异性较差，无法区分鼠源不同scFv构建的不同靶点CAR(例如CD19CAR、CD22CAR等)。抗原蛋白检测方法依赖于HER2蛋白与CAR上的4D5ScFv部分的结合，由于该scFv与HER2的亲和力显著低于完整抗体赫赛汀与HER2的亲和力，因此灵敏度也较低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向4D5的鼠源单克隆抗体和应用，所述鼠源单克隆抗体具有较高的检测灵敏度。

本发明提供了一种靶向4D5的鼠源单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，还包括用于连接所述重链可变区和轻链可变区的连接区；

所述连接区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

优选的，所述连接区的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

优选的，所述鼠源单克隆抗体的全长氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

优选的，所述鼠源单克隆抗体的全长核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明提供了一种包含所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体的重组载体，IL-2信号肽-鼠源单克隆抗体的表达序列克隆到pFUSE载体的NcoI/BglII酶多克隆位点处。

优选的，所述IL-2信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

本发明提供了所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体或所述重组载体在制备检测4D5抗体或4D5的嵌合抗原受体阳性细胞的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种4D5的嵌合抗原受体阳性细胞检测方法，包括以下步骤：

1)将待检测细胞用分选缓冲液洗涤后，与所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体混合，孵育，加入分选缓冲液，去除未结合的抗体，得到细胞-抗体复合物；

2)将所述细胞-抗体复合物和荧光素标记的羊抗鼠二抗混匀、孵育，加入分选缓冲液，去除未结合的荧光素标记的羊抗鼠二抗，得到细胞-抗体-二抗复合物；

3)将所述细胞-抗体-二抗复合物采用流式细胞仪检测。

本发明提供的靶向4D5的鼠源单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述鼠源单克隆抗体为独特型单链抗体，可以特异性与4D5结合。Westernblot实验结果显示，采用体外重组表达的HRP标记的鼠源单克隆抗体与4D5形成明显条带，说明所述鼠源单克隆抗体具有靶向4D5的特性。通过比较ProteinL、HER2抗原蛋白和鼠源单克隆抗体5D1对于CAR-NK细胞上4D5的ScFv结构的三种检测方法，结果表明：鼠源单克隆抗体5D1对4D5-CAR结构结合能力最强，与靶蛋白HER2结合方法和Protein L结合CAR结构这两种方法相比，检测灵敏性有较大幅度提高。

本发明提供的所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体或所述重组载体在制备检测4D5抗体或4D5的嵌合抗原受体阳性细胞的试剂盒中的应用。基于鼠源单克隆抗体对4D5的靶向性，可以利用所述鼠源单克隆抗体结合其他免疫检测试剂实现体外检测4D5抗体或4D5的嵌合抗原受体阳性细胞的目的。

本发明还提供了一种4D5的嵌合抗原受体阳性细胞检测方法，采用鼠源单克隆抗体检测HER2CAR，依赖于该单抗对HER2CAR上scFv的结合，是一种检测灵敏高、准确性高的CAR阳性细胞检测方法，以满足CAR-T药物质量控制、临床治疗和伴随诊断的需求。

附图说明

图1为293细胞中鼠源单克隆抗体蛋白的SDS-PAGE电泳结果图；

图2为本发明制备的HRP标记的5D1单抗的Westernblot结果图；

图3为基于三种检测方法获得的流式细胞仪检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种靶向4D5的鼠源单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示(QVQLEQSGAEFVRPGALVRLSCKASGFNIKDYYIHWVKQRPEQGLEWIGWIYPENDDTIYDPKFQGKASLTADTSSNTAYLQLSSLTSEDSAVYFCVRSGSDSSFDYWGQGTTLTVSS，加粗部分序列为CDR区)；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示(DIVMTQSTASLAVSLGQRATISCRASESVDSYDNSFMHWFQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPFTFGSGTKLEIKR，加粗部分序列为CDR区)。

在本发明中，所述重链可变区的核苷酸序列优选如SEQ ID No.3所示(CAAGTCCAACTTGAACAATCAGGAGCAGAATTTGTGAGACCTGGAGCACTTGTGAGACTTTCATGCAAAGCATCAGGATTTAACATCAAAGATTACTACATCCACTGGGTGAAACAAAGACCTGAACAAGGACTTGAATGGATCGGATGGATCTACCCTGAGAATGACGATACAATCTACGATCCTAAATTTCAAGGAAAGGCTTCGCTTACAGCAGATACATCATCAAACACAGCATACCTTCAACTTTCATCACTTACATCAGAAGATTCAGCAGTGTACTTCTGTGTAAGATCAGGATCAGATTCATCATTTGATTACTGGGGGCAGGGGACAACACTTACAGTGTCATCA，加粗部分序列为对应的CDR区的核苷酸序列)；所述轻链可变区的核苷酸序列优选如SEQ ID No.4所示(GATATCGTGATGACACAATCAACAGCATCACTTGCAGTGTCACTTGGACAAAGAGCAACAATCTCATGCAGAGCATCAGAATCAGTGGATTCATACGATAACTCATTTATGCACTGGTTTCAACAGAAGCCAGGTCAACCTCCTAAACTTCTTATCTACCTTGCATCAAACCTTGAATCAGGAGTGCCTGCAAGATTCAGTGGGTCGGGCTCCCGTACAGATTTCACTTTGACAATCGATCCTGTGGAAGCAGATGATGCAGCAACATACTACTGCCAACAAAACAACGAAGATCCTTTCACCTTCGGATCAGGAACAAAGCTCGAGATCAAGCGC，加粗部分序列为对应的CDR区的核苷酸序列)。

在本发明中，优选还包括用于连接所述重链可变区和轻链可变区的连接区。本发明对所述连接区的氨基酸序列没有特殊限制，采用本领域所熟知的Linker的序列即可。本发明实施例中为了举例说明体外重组表达鼠源单克隆抗体，本发明采用所述连接区的氨基酸序列优选如SEQ ID No.5所示，所述连接区的核苷酸序列优选如SEQ ID No.6所示。所述鼠源单克隆抗体的全长氨基酸序列优选如SEQ IDNo.7所示。所述鼠源单克隆抗体的全长核苷酸序列优选如SEQ ID No.8所示。所述重链可变区和轻链可变区的顺序没有特殊限制，按照重链可变区-连接区-轻链可变区或轻链可变区-连接区-重链可变区的顺序均可。

本发明提供了一种包含所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体的重组载体，IL-2信号肽-鼠源单克隆抗体的表达序列克隆到pFUSE载体的NcoI/BglII酶多克隆位点处。所述IL-2信号肽的核苷酸序列优选如SEQ ID No.9所示。

在本发明中，所述重组载体的制备方法，优选包括人工合成表达序列为IL-2信号肽-5D1单链抗体区的核苷酸序列，克隆至pFUSE-hIgG1e3-Fc质粒(美国InvivoGen)的NcoI和BglII的多克隆位点处，获得重组载体。

在本发明中，靶向4D5的鼠源单克隆抗体的制备方法，优选采用体外重组表达的方法获得。所述体外重组表达的方法优选采用上述重组载体经过转染至真核细胞中，实现瞬时表达。

在本发明中，所述4D5的嵌合抗原受体阳性细胞包括含4D5的嵌合抗原受体的自然杀伤性细胞、含4D5的嵌合抗原受体的T细胞以及表达了4D5嵌合抗原受体的其他免疫细胞。

在本发明中，检测4D5的嵌合抗原受体阳性细胞的试剂盒还包括分选缓冲液、荧光素标记的二抗试剂。检测4D5抗体的试剂盒还包括4D5-FC、PVDF膜(0.2μm，immobilon)、HRP标记鼠源单克隆抗体(165μg/ml，Y9制备保存)、亲和素(博奥龙生物)、10XTBST(索莱宝)和封闭液等试剂。

3)将所述细胞-抗体-二抗复合物采用流式细胞仪检测。

在本发明中，所述4D5的嵌合抗原受体阳性细胞包括含4D5的嵌合抗原受体的自然杀伤性细胞、含4D5的嵌合抗原受体的T细胞、以及表达了4D5嵌合抗原受体的其他免疫细胞等。为了举例说明检测方法，本发明实施例以含4D5的嵌合抗原受体的自然杀伤性细胞作为检测对象说明检测的具体过程。

在本发明中，所述孵育的温度优选为20～28℃，更优选为25℃。所述孵育的时间优选为20～35min，更优选为30min。所述去除上清的方法优选采用离心。所述离心的转速优选为400g，所述离心的时间优选为5min。

下面结合实施例对本发明提供的一种靶向4D5的鼠源单克隆抗体和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

靶向4D5抗体的独特型抗体杂交瘤细胞株的建立

一、试验材料

1.1动物与细胞

SPF级BALB/C小鼠(雌性6～8周龄)

SP2/0细胞

1.2主要试剂

1.3主要仪器与耗材

I×70倒置显微镜 Labofuge stratos离心机

381型CO₂培养箱超净工作台

纯水设备细胞培养板(96及24孔板)

1.4试剂配制

7.5％NaHCO₃溶液：称取分析纯NaHCO₃7.5g溶于10OmL三蒸水中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装小瓶，一20℃冻存备用。

细胞培养液：DMEM培养原液，具体配制方法按说明操作，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

(a)不完全培养液

DMEM培养液原液 99mL

双抗溶液 lmL

(b)完全培养液

不完全培养液 80mL

胎牛血清 20mL

HAT选择培养液

完全培养液 98mL

HAT(50×) 2mL

HT选择培养液

完全培养液 98mL

HT(50×) 2mL

融合剂(5O％PEG)

称取2g PEG1450，8磅灭菌30min后，加入预热的不完全培养基2mL，混匀，4℃存放。

二、试验方法

2.1动物免疫

取制备的4D5抗原，加等量弗氏佐剂，制成乳化剂，免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠4只，免疫方案见表1。

表1 BALB/c小服免疫方案

注：免疫间隔2周

2.2杂交瘤细胞株的建立

2.2.1骨髓瘤细胞的复苏

将细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，缓慢摇动冻存管，待冰冻的细胞悬液完全溶解后，放入己加10mL不完全培养液的离心管中，1000rpm离心l0min，弃上清液，用完全细胞培养液重新悬浮细胞，转移至细胞培养瓶中，补加适量细胞培养液。置于37℃、饱和湿度、含5％CO₂的培养箱中培养。

2.2.2骨髓瘤细胞的培养

骨髓瘤细胞培养在含10％～15％胎牛血清的完全培养液中，如细胞数低于10⁴个/mL时，细胞生长缓慢。一般在10⁴～10⁵个/mL时成对数生长，此时细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈半致密分布。当细胞处于对数生长的中期时，可按1:3～1:5的比例稀释传代。一般每3～4d传代一次或扩增培养，然后选取处于生长旺盛、形态良好的对数生长期细胞供融合用。

2.2.3饲养细胞的制备

(1)细胞融合的当日或前一日，将未经免疫的BALB/c小鼠(8～12周龄)眼球采血，颈椎脱臼处死，浸泡于75％酒精5min，置超净工作台蜡盘内，腹部向上固定；

(2)无菌将BALB/c小鼠皮肤用镊子提起，用眼科剪刀剪一个小口，切勿剪破腹膜，撕开皮肤，充分暴露腹膜；

(3)用2mL无菌注射器吸取不完全培养液注入腹腔，按摩腹部，待腹腔细胞与注入的营养液充分混合后，用剪刀在腹膜剪一小口，用弯吸管将腹腔内的液体吸出，注入离心管中，再用弯吸管吸取不完全培养液1～2mL，重复2～3次；

(4)所得液体1000rpm离心5min，弃上清。向沉淀中加入10mL不完全培养液，重新吹散细胞，取少量台盼蓝染色计数。再次1000rpm离心5min，弃上清，用含HAT的培养液悬浮细胞。调整细胞浓度为1～2×10⁵个/mL，加入96孔细胞培养板中(100μL/孔)，置于37℃、饱和湿度、含5％CO₂的培养箱中培养。

2.2.4免疫脾细胞悬液的制备

(1)三免后第10d，采血分离血清测其效价。其效价达融合标准后，小鼠于四免后第三天，摘除眼球放血，并分离血清作阳性对照。处死的小鼠浸泡于75％的酒精中5min，置超净工作台蜡盘内，腹部向上固定，无菌取出脾脏；

(2)将脾脏转入另一盛有5mL不完全培养液的平皿中，除去附着的结缔组织与脂肪，用剪刀剪碎脾脏，置于200目铜网上，用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内的不完全培养液冲洗铜网，使脾细胞全部通过网孔进入溶液中；

(3)将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加不完全培养液至30mL，混匀，1000rpm离心5min，弃上清；

(4)沉淀细胞再用不完全培养液同法离心一次，然后将细胞悬于10mL完全培养液中，混匀；

(5)细胞计数，保持活力达95％以上，备用。

2.2.5骨髓瘤细胞悬液的制备

(1)融合前48～36h将SP2/0细胞扩增培养；

(2)融合当天，选择形态良好、处于对数生长期的细胞，用弯吸管将细胞吹下，收集于50mL离心管中，1000rpm离心5min，然后用DMEM营养液重新悬浮，取少量台盼蓝染色计数，保证细胞成活率大于90％以上，用于细胞融合。

2.2.6细胞融合

(1)分别吸取含1×10⁸个脾细胞和含2×10⁷个SP2/0细胞的细胞悬液，合并置入50mL塑料离心管中，补加不完全培养液至35mL，1000rpm离心7mni，将上清尽量弃去；

(2)用手指轻弹管底，使沉淀松散均匀成糊状；

(3)将此融合管移入37℃水浴中，左手匀速转动离心管，右手持lmL移液管吸取预热至37℃的50％PEG(pH 8.0)溶液0.7mL，沿转动的管壁(尽量接近细胞处)缓缓滴入，并控制时间在60S内加完；然后将细胞悬液缓缓吸入移液管中，控制时间在30s内吸完，静置30s后，再将细胞悬液缓缓吹回到离心管中，时间控制在30s内；

(4)立即在5min内加入25mL DMEM不完全培养液，终止融合；

(5)加入速度为:第lmin内加入lmL，第2min内加入4mL，剩下的20mL在3min内加完。

加液时应轻轻匀速转动离心管，此时操作应轻柔；

(6)800rpm离心7min，弃上清液，加入30mL含HAT的完全培养液，轻轻吹吸使沉淀细胞悬浮。此时操作应轻柔，切勿用力吹打；

(7)将细胞悬液分别加入已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中0.lmL/孔，置于37℃、饱和度、含5％CO₂的培养箱中培养；

(8)每天观察并记录细胞生长情况。融合后第5天每孔用HAT培养液半量换液，10天后改用HT培养液，2周后改用含有20％胎牛血清的细胞生长培养液换液。

2.2.7观察细胞的生长情况

根据所使用的骨髓瘤细胞等条件的不同，融合后细胞生长的情况也会有所差异，用倒置显微镜观察，一次成功的融合试验其细胞生长情况大致如下；

(1)融合当天(第1天)：可见瘤细胞透亮，形态多样，相互之间有粘连、重叠、并可见到巨细胞或哑铃状细胞；

(2)融合后第2～3天：瘤细胞数锐减，有大量的破碎细胞，残留的瘤细胞折光性差，或呈暗黑、皱缩；可见少数形态良好，透亮的细胞，但不能判断它们是残留的瘤细胞还是早期的融合细胞；

(3)融合后第4～5天:瘤细胞几乎全部消失，在巨噬细胞周围聚集着许多大小不等的细胞碎片，可见形似骨髓瘤细脚，浑圆透亮，呈葡萄状分布的融合细胞小集落克隆，细胞数多少不等，而且细胞数增加很快；

(4)融合后第6～7天：细胞克隆继续长大，如检测方法敏感，这时即可采集部分克隆的培养上清液检测相应的特异性抗体；

(5)融合后第8～9天：细胞克隆继续长大，大者可达1/3～1/2培养孔的面积，此时即可对所有克隆生长孔的培养上清进行检测。

2.2.8杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法进行细胞克隆，具体步骤如下：

克隆化的前一天制备饲养细胞，方法见2.2.4。

(1)悬浮待克隆化阳性孔中的细胞，吸出悬浮液至己含有lmLHT培养液的无菌7ml试管中；

(2)取0.lmL细胞悬液计数，以HT培养液稀释细胞至100个/mL，每个克隆细胞做3个稀释度(100个/L，10个/mL，5个/mL)，加入96孔细胞板中，每孔0.lmL，即10个/孔，1个/孔，0.5个/孔；

(3)培养板置于37℃、饱和湿度、含5％CO₂的培养箱中培养7～10d，中间换液一次。换液前倒置显微镜下观察记录单一克隆生长孔，克隆细胞长至孔底面积的1/4～1/3时，对其上清液进行检测。取强阳性克隆扩大、冻存，同时按上法继续克隆至阳性率达100％。

(4)将强阳性单克隆细胞扩增培养至12孔板，长满后扩至10mL细胞瓶中，一部分准备冻存，一部分继续培养，以用于生产腹水，大量制备单克隆抗体。

2.2.9杂交瘤细胞的冻存

冻存前，观察细胞形态，当细胞处于对数生长期、活力大于90％时方可进行冻存。方法如下:

(1)将预备冻存的细胞从瓶壁吹下，移入离心管中，1000rpm离心5min；

(2)弃上清液，视沉淀细胞多少用细胞冻存液悬浮，分装于冻存管中，每管3～10×10⁶个细胞；

(3)将做好标记的冻存管置于4℃冰箱2h，-70℃冰箱中过夜，次日移入液氮罐中。

结果

筛选到了针对4D5-FC的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株表达代号为5D1抗体。

实施例2

抗4D5单链抗体5D1的制备和序列测定

以所述抗4D5单克隆抗体5D1的重链可变区序列、轻链可变区序列以及连接所述重链可变区序列和轻链可变区序列的连接序列组成抗4D5单链抗体5D1。

所述抗4D5单链抗体5D1的制备方法如下：

通过TRIZOL试剂(Thermo Fisher)，按照供应商操作说明书，提取5D1杂交瘤细胞的总RNA，具体如下：10⁶个细胞加入TRIZOL试剂匀浆化后加入氯仿在2～8℃的条件下以12,000×g的离心力离心10min，取上清液并加入0.5mL异丙醇；12,000×g的离心力高速冷冻离心10min。用75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次后干燥RNA沉淀，取无RNA酶的水溶解RNA。测浓度后送至金唯智公司进行杂交瘤细胞测序获得轻链可变区序列和重链可变区序列。

测得原始抗体核酸序列：重链序列如下：

CAAGTACAGCTGGAGCAGTCTGGGGCTGAGTTTGTGAGGCCGGGGGCCTTAGTCAGGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATTCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTTATCCTGAAAATGATGATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGTCTAACAGCAGACACATCTTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTTTTGTGTTAGATCAGGGTCCGATAGTAGTTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID No.3)。

轻链序列如下：

GATATTGTGATGACCCAATCTACAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGACAATAGTTTTATGCACTGGTTCCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAGATAAAACGG(SEQ ID No.4)

实施例3

重组载体的制备

整理表达序列为IL-2信号肽-5D1单链抗体区形式，克隆到pFUSE载体中，具体的，各片段序列如下：

IL-2信号肽的核苷酸序列：ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCG(SEQ ID No.9)。

重链可变区的氨基酸序列(加粗序列为CDR区)：

QVQLEQSGAEFVRPGALVRLSCKASGFNIKDYYIHWVKQRPEQGLEWIGWIYPENDDTIYDPKFQGKASLTADTSSNTAYLQLSSLTSEDSAVYFCVRSGSDSSFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID No.1)

重链可变区的核苷酸序列(加粗序列为CDR区的核苷酸序列)：

CAAGTCCAACTTGAACAATCAGGAGCAGAATTTGTGAGACCTGGAGCACTTGTGAGACTTTCATGCAAAGCATCAGGATTTAACATCAAAGATTACTACATCCACTGGGTGAAACAAAGACCTGAACAAGGACTTGAATGGATCGGATGGATCTACCCTGAGAATGACGATACAATCTACGATCCTAAATTTCAAGGAAAGGCTTCGCTTACAGCAGATACATCATCAAACACAGCATACCTTCAACTTTCATCACTTACATCAGAAGATTCAGCAGTGTACTTCTGTGTAAGATCAGGATCAGATTCATCATTTGATTACTGGGGGCAGGGGACAACACTTACAGTGTCATCA(SEQ ID No.3)。

轻链可变区的氨基酸序列(加粗序列为CDR区)

DIVMTQSTASLAVSLGQRATISCRASESVDSYDNSFMHWFQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPFTFGSGTKLEIKR(SEQ ID No.2)；

轻链可变区的核苷酸序列(加粗序列为CDR区的核苷酸序列)：

GATATCGTGATGACACAATCAACAGCATCACTTGCAGTGTCACTTGGACAAAGAGCAACAATCTCATGCAGAGCATCAGAATCAGTGGATTCATACGATAACTCATTTATGCACTGGTTTCAACAGAAGCCAGGTCAACCTCCTAAACTTCTTATCTACCTTGCATCAAACCTTGAATCAGGAGTGCCTGCAAGATTCAGTGGGTCGGGCTCCCGTACAGATTTCACTTTGACAATCGATCCTGTGGAAGCAGATGATGCAGCAACATACTACTGCCAACAAAACAACGAAGATCCTTTCACCTTCGGATCAGGAACAAAGCTCGAGATCAAGCGC(SEQ ID No.4)

连接区的氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID No.5)连接区的核苷酸序列：GGTTCCACCTCCGGGTCGGGCAAACCCGGTCAGGAGAAGGATCAACAAAGGGC(SEQ ID No.6)。

单链抗体可变区全长氨基酸序：DIVMTQSTASLAVSLGQRATISCRASESVDSYDNSFMHWFQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPFTFGSGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLEQSGAEFVRPGALVRLSCKASGFNIKDYYIHWVKQRPEQGLEWIGWIYPENDDTIYDPKFQGKASLTADTSSNTAYLQLSSLTSEDSAVYFCVRSGSDSSFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID No.7)。

单链抗体可变区全长核苷酸序列：GATATCGTGATGACACAATCAACAGCATCACTTGCAGTGTCACTTGGACAAAGAGCAACAATCTCATGCAGAGCATCAGAATCAGTGGATTCATACGATAACTCATTTATGCACTGGTTTCAACAGAAGCCAGGTCAACCTCCTAAACTTCTTATCTACCTTGCATCAAACCTTGAATCAGGAGTGCCTGCAAGATTCAGTGGGTCGGGCTCCCGTACAGATTTCACTTTGACAATCGATCCTGTGGAAGCAGATGATGCAGCAACATACTACTGCCAACAAAACAACGAAGATCCTTTCACCTTCGGATCAGGAACAAAGCTCGAGATCAAGCGCGGTTCCACCTCCGGGTCGGGCAAACCCGGGTCAGGAGAAGGATCAACAAAGGGCCAAGTCCAACTTGAACAATCAGGAGCAGAATTTGTGAGACCTGGAGCACTTGTGAGACTTTCATGCAAAGCATCAGGATTTAACATCAAAGATTACTACATCCACTGGGTGAAACAAAGACCTGAACAAGGACTTGAATGGATCGGATGGATCTACCCTGAGAATGACGATACAATCTACGATCCTAAATTTCAAGGAAAGGCTTCGCTTACAGCAGATACATCATCAAACACAGCATACCTTCAACTTTCATCACTTACATCAGAAGATTCAGCAGTGTACTTCTGTGTAAGATCAGGATCAGATTCATCATTTGATTACTGGGGGCAGGGGACAACACTTACAGTGTCATCA(SEQ ID No.8)。

将上述整合序列交由金唯智进行全序列合成，克隆至pFUSE-hIgG1e3-Fc质粒(美国InvivoGen)，委托金唯智公司通过上游NcoI酶切位点和下游BglII酶切位点构建，获得重组载体。

实施例4

5D1单链抗体的瞬时表达

1.常规方法分别将293TSG细胞置于HEK293CD Medium 2种培养基中135rpm、37℃，5％CO₂中培养。

2.当细胞密度达到1～3×10⁶个/ml时进行传代，传代后密度为3×10⁵个/ml计数，当对数生长期时细胞成活率在90％以上时方可用于转染实验，HEK293CD Medium培养的293F在转染前3h换成转染培养基(21501)。

3.转染

按如下方法配制A液和B液

A液：将6μg前述重组质粒加入

I中使总体积为100μl，轻轻混匀。

B液：将12μg PEI加入

I中使总体积为100μl，轻轻混匀。

将B液全部加入A液中，轻轻混匀后室温静置10min。

分别向细胞滴入步骤2中的混液。将转染后的细胞置于135rpm、37℃，5％CO₂中，继续培养4d。

4.取表达产物8000rpm离心5min，取1ml表达上清，加入50μl proteinA介质，室温亲和1h。

5.用1ml pH值7.5TBST清洗2次。

6.用100μlpH3.0Gly洗脱，向洗脱液中加入10μl 1M tris调pH值后进行SDS-PAGE鉴定。

结果

SDS-PAGE电泳结果图见图1。由图1可知，5D1单链抗体蛋白在293细胞上有明显表达。

实施例5

HRP标记5D1实验

1.实验材料：

1.1样品：5D1(anti-4D5-FC)浓度为1mg/ml

1.2试剂：辣根过氧化物酶(阿拉丁，K1928170)、0.2M NaAc、0.2M HAc、0.2M碳酸盐缓冲液、0.1M NaIO₄、2×PBS、NaBH₄、甘油。

2.实验过程

2.1 HRP标记抗体

2.1.1 HRP氧化：称取HRP3.1mg，加入到3.1ml纯水中，加入155μl 0.1M NaIO₄，混匀，在室温环境下避光搅拌20min，用1mM NaAc透析，1L每次，共透析3次。

2.1.2 IgG透析：将抗体用0.01M碳酸盐缓冲液透析，950ml/次，共透析3次。

2.1.3标记：用0.2M碳酸盐将HRP调至pH值至9.0～9.5，加入抗体中，室温过夜震荡。

3.1.4终止：称取4mgNaH₄，用1mL纯水溶解后，取77.5μl，加入到HRP-抗体中混匀，4℃静置2h。

3.1.5透析：将标记的复合物用1×PBS透析，1L每次，共透析3次。

3.1.6保存：加入等体积的甘油，混匀，保存在-20℃中。

结束标记5D1(anti-4D5-FC)，终浓度为165μg/ml，总体积9.4ml。

实施例6

HRP标记5D1的Westernblot检测

1.材料：

4D5-FC(Y9制备保存)、PVDF膜(0.2μm，immobilon)、HRP标记5D1(165μg/ml，Y9制备保存)、ECL(博奥龙生物)、10XTBST(索莱宝)、封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST)。

2.步骤：

2.1按本实验室配方配制分离胶为12％的SDS-PAGE凝胶。

2.2向加样孔中加入20μl处理过的4D5-FC，接通电源，以浓缩胶80V，分离胶120V的电压进行电泳，等溴酚蓝泳到胶下缘时切断电源进行转印。

2.3从玻璃板中取出凝胶，将其置于转移缓冲液中浸泡15min。剪取与胶同样大小的PVDF膜，甲醇醇浸泡10s后置于转移缓冲液中浸泡15min。剪取8层与PVDF膜同样大小的滤纸，置于转移缓冲液中浸泡15min。

2.4按从下到上四层滤纸、PVDF膜、凝胶、四层滤纸的顺序放到电转仪上，用干净的玻璃棒赶走夹层间的气泡。盖好上盖，接通电源，56mA恒流转印1.2h。

2.5把PVDF膜浸入封闭液中，置于4℃冰箱过夜

2.6将封闭后的PVDF膜置于60r/m摇床上，以TBST洗膜2min×5次。

2.7用封闭液1：1000稀释HRP标记的5D1单抗，将膜浸入其中后室温60r/m反应1h

2.8在60r/m摇床上，以TBST洗膜2min×4次；TBS洗膜，2min×1次，取出膜，滴入适量ECL显色，相机拍照和分析。

结果

对4D5-FC进行SDS-PAGE，并以HRP标记的5D1单抗(1:1000)为一抗进行Westernblot，结果见图2。由Westernblot结果显示，本发明制备的HRP标记的5D1单抗对4D5有明显的反应。

实施例7

取三种不同4D5表达量的CAR-NK细胞：NK92野生型细胞(不表达4D5ScFv)、NK92-4D5-Canada(4D5-C，表达高水平4D5ScFv)以及NK92-4D5-S2(4D5-S2，表达中等水平4D5ScFv)。每种细胞取1×10⁶个，400g 5min离心后，弃去培养基，加入1ml Sorting buffer(Biolengend品牌)，弃去上清，余约50μl体积，按表2加入相应试剂：

表2不同试剂的添加量

试剂	用量
		5D1抗体	2μg
生物素化的HER2	2μg
		生物素化的ProteinL	2μg

混匀后，室温孵育1h；加入1ml Sorting buffer，400g，5min，洗去未结合抗体。

2、二抗孵育：5D1抗体组加入1μg BV421-羊抗鼠二抗，混匀后，避光，室温孵育30min；加入1ml Sorting buffer，400g，5min，洗去未结合抗体。生物素化的HER2和生物素化的Protein L加入1μg BV421-Streptavidin，混匀后，避光，室温孵育30min；加入1mlSorting buffer，400g，5min，洗去未结合链霉亲和素(Streptavidin)。

3、检测：300μl Sorting buffer重悬细胞，流式细胞仪检测。

结果见图3。使用3种细胞系进行三组不同方法的检测对比实验，NK92细胞不表达4D5CAR结构(A1、B1和C1)，4D5—C(A2、B2和C2)和4D5—S2(A3、B3和C3)细胞表达不同量的4D5CAR结构。

A组实验，用5D1抗体以抗原—抗体的方式特异识别细胞上的4D5CAR结构，然后用连接有BV421荧光染料的抗鼠二抗识别已经结合在细胞上的5D1抗体，由此认为带有BV421荧光染料的细胞则为表达4D5CAR结构的阳性细胞。图中纵坐标为细胞FSC信号，表示是细胞的粒径信息，横坐标表示BV421的相对荧光强度，即细胞经过流式仪检测时由流式仪激发光照射到细胞，细胞进而产生的光信号被流式仪检测到而换算出的相对光强度，由于NK92细胞不表达4D5CAR结构，所以A1视为A组实验的阴性对照，为阴性细胞，但是细胞被流式仪检测到，产生了微弱的光强，所以阴性细胞的相对光强度很低，则以阴性细胞中最高相对光强度的位置设为阳性细胞门(命名为门M4)的下限，设定低于此相对荧光强度的细胞为阴性细胞，高于此相对荧光强度的细胞为阳性细胞。由A组图可见，4D5—C中(A2)，阳性细胞数在总细胞中占比最高，为60.17％。

B组实验，所用细胞与A组相同，使用传统Protein L识别CAR结构的方法检测表达4D5CAR的细胞。首先使用连接有biotin的Protein L结合4D5—CAR，再使用连接有BV421荧光染料的streptividin与biotin结合，由此认为带有BV421荧光染料的细胞则为表达4D5CAR结构的阳性细胞。由于NK92细胞不表达4D5CAR结构，所以B1视为B组实验的阴性对照，为阴性细胞，但是细胞被流式仪检测到，产生了微弱的光强，所以阴性细胞的相对光强度很低，则以阴性细胞中最高相对光强度的位置设为阳性细胞门(命名为门M4)的下限，设定低于此相对荧光强度的细胞为阴性细胞，高于此相对荧光强度的细胞为阳性细胞。由B组图可见，三组细胞中阳性细胞比例几乎无差异。

C组实验，所用细胞与A组相同，使用靶蛋白结合方法来检测表达4D5CAR的细胞。首先使用连接有biotin的Her2靶蛋白与4D5—CAR结合，再使用连接有BV421荧光染料的Streptividin与Biotin结合，由此认为带有BV421荧光染料的细胞则为表达4D5CAR结构的阳性细胞。由于NK92细胞不表达4D5CAR结构，所以C1视为C组实验的阴性对照，为阴性细胞，但是细胞被流式仪检测到，产生了微弱的光强，所以阴性细胞的相对光强度很低，则以阴性细胞中最高相对光强度的位置设为阳性细胞门(命名为门M4)的下限，设定低于此相对荧光强度的细胞为阴性细胞，高于此相对荧光强度的细胞为阳性细胞。由C组图可见，三组细胞中阳性细胞比例几乎无差异。

综合上述三种检测方法的结果，B、C两组的传统检测方法未检测出三株细胞4D5—CAR结构的表达差异，而A组实验，利用5D1抗体检测4D5—CAR的结果显示出，4D5—C细胞株中阳性占比明显高于其它两组细胞。由此可见，使用4D5—CAR的特异抗体5D1作为4D5—CAR结构的检测方法灵敏度要高于传统的B、C两种方法，展现了5D1作为4D5—CAR结构检测抗体的可行性与优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司

焦顺昌

<120> 一种靶向4D5的鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Leu Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asp Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Val Arg Ser Gly Ser Asp Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Asp Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 3

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagtccaac ttgaacaatc aggagcagaa tttgtgagac ctggagcact tgtgagactt 60

tcatgcaaag catcaggatt taacatcaaa gattactaca tccactgggt gaaacaaaga 120

cctgaacaag gacttgaatg gatcggatgg atctaccctg agaatgacga tacaatctac 180

gatcctaaat ttcaaggaaa ggcttcgctt acagcagata catcatcaaa cacagcatac 240

cttcaacttt catcacttac atcagaagat tcagcagtgt acttctgtgt aagatcagga 300

tcagattcat catttgatta ctgggggcag gggacaacac ttacagtgtc atca 354

<210> 4

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatatcgtga tgacacaatc aacagcatca cttgcagtgt cacttggaca aagagcaaca 60

atctcatgca gagcatcaga atcagtggat tcatacgata actcatttat gcactggttt 120

caacagaagc caggtcaacc tcctaaactt cttatctacc ttgcatcaaa ccttgaatca 180

ggagtgcctg caagattcag tgggtcgggc tcccgtacag atttcacttt gacaatcgat 240

cctgtggaag cagatgatgc agcaacatac tactgccaac aaaacaacga agatcctttc 300

accttcggat caggaacaaa gctcgagatc aagcgc 336

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggttccacct ccgggtcggg caaacccggt caggagaagg atcaacaaag ggc 53

<210> 7

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Asp Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Arg Pro

130 135 140

Gly Ala Leu Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

145 150 155 160

Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu

165 170 175

Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asp Thr Ile Tyr Asp Pro

180 185 190

Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr

195 200 205

Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

210 215 220

Phe Cys Val Arg Ser Gly Ser Asp Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

245

<210> 8

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatatcgtga tgacacaatc aacagcatca cttgcagtgt cacttggaca aagagcaaca 60

atctcatgca gagcatcaga atcagtggat tcatacgata actcatttat gcactggttt 120

caacagaagc caggtcaacc tcctaaactt cttatctacc ttgcatcaaa ccttgaatca 180

ggagtgcctg caagattcag tgggtcgggc tcccgtacag atttcacttt gacaatcgat 240

cctgtggaag cagatgatgc agcaacatac tactgccaac aaaacaacga agatcctttc 300

accttcggat caggaacaaa gctcgagatc aagcgcggtt ccacctccgg gtcgggcaaa 360

cccgggtcag gagaaggatc aacaaagggc caagtccaac ttgaacaatc aggagcagaa 420

tttgtgagac ctggagcact tgtgagactt tcatgcaaag catcaggatt taacatcaaa 480

gattactaca tccactgggt gaaacaaaga cctgaacaag gacttgaatg gatcggatgg 540

atctaccctg agaatgacga tacaatctac gatcctaaat ttcaaggaaa ggcttcgctt 600

acagcagata catcatcaaa cacagcatac cttcaacttt catcacttac atcagaagat 660

tcagcagtgt acttctgtgt aagatcagga tcagattcat catttgatta ctgggggcag 720

gggacaacac ttacagtgtc atca 744

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

Claims

1.一种靶向4D5的鼠源单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体，其特征在于，还包括用于连接所述重链可变区和轻链可变区的连接区；

所述连接区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.根据权利要求3所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体，其特征在于，所述连接区的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

5.根据权利要求1或3所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体，其特征在于，所述鼠源单克隆抗体的全长氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

6.根据权利要求2或4所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体，其特征在于，所述鼠源单克隆抗体的全长核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

7.一种包含权利要求1～6任意一项所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体的重组载体，其特征在于，IL-2信号肽-鼠源单克隆抗体的表达序列克隆到pFUSE载体的NcoI/BglII酶多克隆位点处。

8.根据权利要求7所述重组载体，其特征在于，所述IL-2信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示。

9.权利要求1～6任意一项所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体或权利要求7或8所述重组载体在制备检测4D5抗体或4D5的嵌合抗原受体阳性细胞的试剂盒中的应用。

10.一种4D5的嵌合抗原受体阳性细胞检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将待检测细胞用分选缓冲液洗涤后，与权利要求1～6任意一项所述靶向4D5的鼠源单克隆抗体混合，孵育，加入分选缓冲液，去除未结合的抗体，得到细胞-抗体复合物；

3)将所述细胞-抗体-二抗复合物采用流式细胞仪检测。