CN101560500B - 一种分泌肿瘤坏死因子受体诱导型抗体的细胞株LaDR5 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌肿瘤坏死因子受体诱导型抗体的细胞株LaDR5，上述抗体为识别TRAIL受体DR5并且在体外诱导DR5表达细胞凋亡的抗体LaDR5，本发明还公开了上述抗体的制备方法。本发明的细胞株分泌的LaDR5抗体通过接触靶细胞可以诱导靶细胞凋亡或抑制靶细胞增殖，可以用于制备表达DR5的细胞不当存活或者不当增殖相关疾病的诊断或治疗药物，具有广阔的市场前景。

Description

一种分泌肿瘤坏死因子受体诱导型抗体的细胞株LaDR5

技术领域

本发明涉及一种分泌肿瘤坏死因子受体诱导型抗体的细胞株，还涉及该细胞株的医疗用途。

背景技术

TRAIL和Fas配体，TNF-α同属于肿瘤坏死因子TNF基因超家族。这些蛋白都可以有效地诱导靶细胞凋亡。TRAIL已经发现的受体包括DR5(死亡受体5)、DR4(死亡受体4)、DcR1(诱骗受体1)、DcR2(诱骗受体2)和OPG(osteoprotegerin)。这些受体具有高度的同源序列，表现出与TRAIL相似的结合亲和性。死亡受体DR4以及DR5胞浆区都含有一个高度同源的死亡结构域(death domain，DD)，当TRAIL与他们结合后，可以通过该死亡结构域介导凋亡信号，诱导靶细胞凋亡。诱骗受体DcR2胞内区仅有一段不完整的死亡域(DD)，而DcR1没有胞内区，因此两者都不能向下传递TRAIL介导的凋亡信号。

DcR1和DcR2在正常组织细胞中表达较为丰富；而肿瘤细胞则高表达DR4和(或)DR5。因此TRAIL能特异性地引起肿瘤细胞的凋亡而对正常组织和细胞没有毒副作用。研究表明，TRAIL可以迅速诱导乳腺癌、直肠癌、肺癌、淋巴瘤以及前列腺癌等多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无杀伤作用。动物实验中也显示，TRAIL能有效低抑制肿瘤的形成和生长，甚至可以通过诱导肿瘤细胞的凋亡而导致肿瘤的缩小或消失。所有的这些研究都表明TRAIL作为抗肿瘤药物具有很好的开发前景。

重组表达的TRAIL在临床应用中也存在一些缺陷：由于DcR1、DcR2、OPG等三个诱骗受体的存在，TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的作用因诱骗受体的竞争结合而减弱，并且和其假受体的结合可能会产生副作用；作为小分子药物，TRAIL也存在着在体内半衰期短等应用方面的缺点；体内大量使用重组表达的TRAIL会产生免疫原性；另外，也有研究显示，体外重组表达的TRAIL由于融合形式以及空间结构的差异会诱导肝损伤。

抗体作用机制的深入研究提示抗体的特异性识别可以诱导配体信号，从而介导配体的生物学功能。因此，制备抗TRAIL受体的特异性抗体，替代TRAIL诱导特异性的肿瘤细胞凋亡信号成为研究的热点。

发明内容

为了提供一种新的肿瘤治疗手段，本发明公开了一种分泌肿瘤坏死因子受体诱导型抗体的细胞株LaDR5。该细胞株分泌可诱导肿瘤细胞凋亡的抗DR5单克隆抗体LaDR5。

本发明还公开了上述单克隆抗体LaDR5的制备方法，其具体过程如下：

1)制备抗原，用作免疫原；

2)采用所述抗原免疫动物，取所述动物外周血分析血清效价，确定何时取脾脏，制备抗体生成细胞；

3)准备骨髓瘤细胞；

4)将抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合；

5)选择生产所需抗体的克隆；

6)制备单细胞克隆；

7)培养所获得杂交瘤细胞，或者在动物体内接种所述杂交瘤细胞，以大规模地制备所述单克隆抗体；

8)测定如此制备的单克隆抗体的生物学活性。

下面参照上述步骤详细描述单克隆抗体的制备方法。制备本发明抗体的方法仅仅是说明制备方法，并非是限制性的。可以采用其他已知的方法，或者采用修改的方法。

1)抗原的制备

将DR5抗原胞外段全长基因，构建在PET30表达载体上，融合载体上的His标签在XL1-Blue大肠杆菌中进行表达；利用金属(Ni²⁺)螯合琼脂糖凝胶层析柱亲和纯化，获得的目的蛋白冻干备用。

2)动物免疫

用与佐剂(例如弗氏完全或不完全佐剂等)混合步骤1)中生产的免疫原免疫小鼠。其他合适的实验动物作为说明包括大鼠、兔子等。给药途径优先选择皮下注射和腹腔注射。免疫方法任选地通过一剂或以适当间隔(1-5周)的数次重复剂量进行。利用固相酶免疫测定(ELISA)等方法监测经过免疫的动物的血清抗体效价，具有足够高抗体效价的动物作为抗体生成细胞源。用于随后融合的抗体生成细胞从最后一次加强免疫后3-4天的动物中收获。

3)准备骨髓瘤细胞

得自已建立小鼠细胞系的细胞作骨髓瘤细胞来源，包括例如来自Balb/c的小鼠骨髓瘤株系NS-1、sp2/0等。将所选用的细胞系在含有10％FCS的1640培养基中培养至对数生长期。

4)细胞融合

在最后一次加强免疫后，从具有预定抗体效价的小鼠中取出含有抗体生成细胞的组织，作为说明包括脾、淋巴结、外周血或任何合适的组织，脾细胞是最常用的来源。

目前用于脾细胞与在步骤3)中制备的骨髓瘤细胞融合的合适技术是利用聚乙二醇。

所述融合技术包括用无血清培养基(例如RPMI-1640)或磷酸缓冲液(PBS)洗涤脾细胞和骨髓瘤细胞，使得脾细胞与骨髓瘤细胞的数目比率约为5∶1至10∶1，离心收集细胞。弃去上清液，轻弹离心管，使细胞充分松散。缓慢滴加1mL含有50％(w/v)聚乙二醇(m.w.1,000-4,000)的无血清培养基并且混合。随后缓慢加入10mL无血清培养基，然后离心。再次弃去上清，将沉淀的细胞悬浮于适量的HAT培养基中。然后将悬浮液加入到培养板中，在5％v/v CO₂存在下，于37℃培养约2周，可适当的添加HAT培养基。观察克隆的形成。

5)杂交瘤的筛选

采用的骨髓瘤细胞株存在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷，任何抗体生成细胞与骨髓瘤细胞杂交瘤外的融合体都不能长期存活。因此，在HAT培养基中连续培养可以导致仅选择所需的杂交瘤。

将所得杂交瘤培养为集落，然后将培养液换为缺乏氨基蝶呤的培养基(即HT培养基)。培养适当时间后，取出等份的培养上清液，通过ELISA、FACS等方法测定抗体效价。

6)克隆化

采用与步骤2)中测定抗体效价的方法确定产生特异性抗体的杂交瘤。将其以合适的方法进行克隆化。相应的方法包括：有限稀释法，将杂交瘤细胞稀释后接种96孔培养板，使得板中的每孔中含有一个细胞，进行培养，观察单克隆的形成；软琼脂法，采用显微操作来分离单细胞的方法以及通过流式细胞仪等细胞分选仪器分离单细胞等。

对于显示出一定抗体效价的克隆，将按照例如有限稀释法的克隆程序重复2～4次，选择具有稳定抗体效价的克隆作为抗体生产细胞。

7)大量制备单克隆抗体

将通过克隆化获得的杂交瘤培养在正常培养基中。用大培养瓶培养，或者通过滚瓶培养、转瓶培养等方式，进行大规模培养。收获上清，采用本领域人员所熟知的合适方法进行抗体纯化，例如凝胶过滤、亲和层析等，获得本发明抗体。

杂交瘤也可以在同源小鼠腹腔内生长，以获得含大量目的抗体的腹水。

通过如上两种方法获得的单克隆抗体对抗原均具有高度特异性。

8)单克隆抗体定量及亚型的测定

所述单克隆抗体的亚型和亚类的合适鉴定方法包括ELISA测定、双向免疫扩散以及相关试剂盒测定等。

抗体的定量可以通过Folin-Lowry法或者通过基于280nm吸光度的计算(免疫球蛋白(mg/mL)＝OD₂₈₀/1.4)。

本发明的抗体具有下述各种功能特性：

a)LaDR5与表达人DR5的细胞特异性结合

本发明的一个独特特征是结合细胞表面DR5的能力。这通过ELISA以及通过表达DR5的细胞的流式细胞术分析来证明。ELISA实验显示，获得单抗LaDR5可以与免疫抗原特异性结合。流式细胞术分析实验证明，LaDR5抗体可以特异性与表达DR5的人类恶性肿瘤细胞结合，显示这些细胞均表达一定水平的DR5抗原。

b)单独诱导人恶性肿瘤细胞凋亡

在细胞体外培养期间，用各种浓度的LaDR5抗体，通过细胞存活力测定(ATPlite)、³H掺入等方法，测定按照本发明产生的抗体识别DR5，并且直接诱导人恶性肿瘤细胞凋亡的能力。大多数肿瘤细胞对LaDR5诱导的细胞凋亡敏感。对于某些细胞，LaDR5显示出强细胞凋亡诱导活性，如LaDR5可以在低浓度诱导Jurkat细胞大量凋亡。重要的是，单用LaDR5即可以诱导恶性细胞凋亡。

本发明公开的抗体，可以用作细胞不当存活或者不当增殖相关疾病的预防剂或治疗剂，只要这些细胞表达或被制备成表达DR5，可用本发明获得的单克隆抗体诱导其凋亡。

本发明的细胞株LaDR5分泌单克隆抗体LaDR5。通过本领域所熟知的合适方法，可以获得其轻、重链可变区基因。利用这些基因，可获得多种小分子基因工程抗体，包含但不限于嵌合抗体、单链抗体、单域抗体、Fab抗体、F(ab’)2抗体、minibody、diabody、抗体融合蛋白等；基于上述抗体及其基因编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备诊断及治疗药物，具有非常广阔的应用前景。

本发明的杂交瘤细胞株LaDR5，保藏日期为2008年3月28日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，单位简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.2423。

附图说明

图1为SDS-PAGE和免疫印记方法对表达的DR5抗原的鉴定；其中泳道1，9为蛋白质分子量标志；泳道2为IPTG诱导的含pET30a-DR5质粒的BL21菌液样品；泳道3为镍柱纯化时的穿透样品；泳道4-8分别是由10，40，70，100，120mmol/L咪唑洗脱后的蛋白样品；泳道10为免疫印记鉴定DR5抗原。

图2免疫双扩方法检测LaDR5的抗体亚型

图3ELISA方法检测LaDR5与DR5抗原的结合

图4FACS方法检测LaDR5与细胞膜天然DR5的结合；1为阴性对照；2为50μg/mL LaDR5作用于Jurkat细胞的实验结果。

图5MTT法检测LaDR5对Jurkat细胞的杀伤作用

图6 Annexin V/PI染色检测LaDR5诱导细胞凋亡的作用；1为阴性对照；2表示1μg/mL LaDR5作用于Jurkat细胞的实验结果。

具体实施方式

                    实施例一DR5抗原的制备

一、材料：

TRIzol为GIBCO公司产品；cDNA合成试剂盒为Invitrogen公司产品；TIANgel Midi Purificaton Kit为TIANGEN公司产品；T-Easy克隆试剂盒为Promega公司产品；pET30a载体为Invitrogen公司产品；E.coli BL21、Jurkat细胞从ATCC引进，本实验室保存；Ni-NTA柱为本元正阳基因股份有限公司产品；低温冷冻干燥仪为CHRIST公司产品；胎牛血清为北京元亨圣马生物技术研究所产品；RPMI 1640为Gibco公司产品；抗DR5标准抗体为eBioscience公司产品；其余试剂均为市购。

二、方法结果：

1.DR5 cDNA的克隆

利用RT-PCR的方法，克隆编码人DR5蛋白的cDNA(gi：2465585)。

a)模板

采用TRIzol试剂，提取Jurkat细胞的总RNA。通过用第一条链cDNA合成试剂盒，按照试剂盒中提供的说明手册获得的cDNA，用于PCR反应的模板。

b)引物

合成用于PCR的下述寡核苷酸引物：

上游引物：5’-catgccatggctgatcacccaacaagacctagc-3’(下划线部分为Nco I酶切位点)，下游引物：5’-tccgctcgagggttatcatgattctttgtggacacattcg-3’(下划线部分为Xho I酶切位点)。引物设计后，由上海博亚生物工程公司合成部合成。合成后的引物在溶于蒸馏水后保存在-20℃。

c)PCR反应

PCR反应溶液的组成：

模板cDNA，总共30μL的反转录反应物中的2μL；

上游引物，10pmol；

下游引物，10pmol；

10×PCR缓冲液，10μL；

dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP各2.5mmol混合)4μL；

Taq聚合酶，5单位；

用无菌水将体积补齐为100μL；按如下步骤进行PCR反应：94℃2mins；此后进行94℃1min、55℃1min、72℃3mins循环，重复25次；结束后72℃加热10mins。如此获得的DNA片段在含有0.25μg/mL溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上分离，用刀片切下含有所需DNA片段的条带。根据相应的说明书操作，利用TIANgel Midi Purificaton Kit，从中回收所述DNA；用T-Easy克隆试剂盒克隆所述DNA片段。对获得的克隆载体中DR5基因测序，该基因匹配已公布的序列。将如此获得的质粒命名为质粒T-DR5。

2.DR5原核表达载体构建

将DR5基因克隆入原核表达载体pET30a中：

a)基因来源为T-DR5，利用Nco I和Xho I酶切下目的片段，按照实施案例1.1中所述方法进行回收；

b)原核表达载体pET30a利用Nco I和Xho I酶切下目的片段，按照实施案例1.1中所述方法进行回收；

c)将Nco I和Xho I酶切处理后的DR5基因片段与pET30a载体按如下体系连接：

pET30a载体(Nco I和Xho I酶切处理后)   0.1μg

DR5基因片段(Nco I和Xho I酶切处理后)  与载体等摩尔量

10×T4DNA ligase buffer              1μL

T4DNA ligase                         0.5μL

用无菌水将体积补齐为10μL，混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底，于16℃保温8-24小时。连接产物转化感受态细胞，碱裂解法纯化质粒，NcoI和Xho I双酶切鉴定，获得的阳性克隆命名为pET28a-DR5。

3.DR5表达纯化

将pET30a-DR5质粒转化入E.coli BL21(DE3)感受态细菌，挑取单菌落，培养至A₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，于30℃诱导表达4h。4℃，12,000r/min离心10min收集菌体；弃上清，用50mmol/L PBS重悬菌体，液氮中反复冻融3次，超声破碎菌体；4℃以12,000r/min离心10min，取上清，0.45μm滤膜过滤后，根据相应的说明书操作，以Ni-NTA柱纯化目的蛋白。

将洗脱的DR5蛋白对40倍样品体积的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4，PBS)4℃透析48h、其间更换透析液4次；最后一次对0.001mol/L的PBS透析。采用15％SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化蛋白的纯度(图1)，采用Lowry氏法定量蛋白质；透析样品用低温冷冻干燥仪冻干。

4.DR5功能鉴定

a)利用Western Blot技术，用抗DR5标准抗体鉴定纯化的DR5抗原可以被特异性抗体识别。

b)利用体外实验鉴定重组人DR5蛋白对TRAIL诱导细胞凋亡的阻断作用：收集Jurkat细胞，调整浓度为1×10⁶/mL，按每孔80μL接种于96孔板中；加入浓度为100ng/mL的TRAIL和各浓度的DR5各10μL。用含10％胎牛血清RPMI 1640为空白对照，设立裸细胞对照和TRAIL单独作用对照。将培养板放置于CO₂培养箱中孵育12h后，每孔加入5mg/mL浓度的MTT 10μL，4h后再向其中加入100μL体积的酸化SDS，继续于CO₂培养箱中培养12h，直至其颗粒全部被溶解；测定OD₅₇₀，验证重组人DR5蛋白对TRAIL诱导细胞凋亡的阻断作用。

                实施例二抗DR5抗体LaDR5的制备

一、材料：

福氏完全佐剂及不完全佐剂为Sigma公司产品；胎牛血清为北京元亨圣马生物技术研究所产品；HT、HAT为SIGMA公司产品；单克隆抗体同种型试剂盒为Pierce公司产品；无血清RPMI 1640为Gibco公司产品；NS-1细胞从ATCC引进；本实验室保存；Balb/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心；其余试剂均为市购。

二、方法结果：

1.动物免疫

用亲和纯化的重组人DR5蛋白免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠。初次免疫时，将重组蛋白(100μg)在弗氏完全佐剂中乳化。一个月后，将重组蛋白(100μg)在弗氏不完全佐剂中乳化后加强免疫。加强免疫后两周，通过尾静脉采血，测定血清效价。选取效价高的小鼠，以无佐剂给予的重组蛋白(100μg)进行加强。加强后第三天，将得自免疫小鼠局部淋巴器官的淋巴细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合。

2.细胞融合

制备滋养细胞：脱颈处死正常4-6周龄雌性Balb/c小鼠，75％酒精浸泡消毒皮肤，无菌剥离腹部皮肤，注射器抽取5mL HAT培养液注入小鼠腹腔，反复冲洗后吸出腹腔洗液(含有腹腔巨噬细胞)，计数，调整细胞浓度至2×10⁵/mL，接种于96孔板，100μL/孔。

在加强免疫后第三天，从小鼠取出局部淋巴器官(如脾脏)，置与10mL含有50单位/mL青霉素、50μg/mL链霉素和300μg/mL L-谷氨酸的无血清RPMI1640培养基中，然后用镊子和剪刀使得器官通过筛网破碎。将所得的细胞悬浮液离心，以沉淀细胞，然后用无血清RPMI培养基洗涤细胞2次。将获得的细胞重悬于无血清RPMI培养基中，记数。

收集培养至对数生长期的NS-1骨髓瘤细胞，破碎、洗涤、重悬浮并计数。将3×10⁷NS-1细胞与3×10⁸脾细胞混匀，离心，弃去上清，进行细胞融合。细胞融合过程中，含有所述细胞的管子要始终置于37℃温水中：将1mL 50％(w/v)聚乙二醇1500在1min缓慢加入所述管中，同时用移液管管尖轻柔地搅拌沉淀，静置40s。随后，将预热至37℃的1mL无血清RPMI培养基在1min内缓慢加入，同时用移液管管尖轻柔地搅拌沉淀；然后再加入7mL无血清RPMI培养基。将所得的混合物离心，弃去上清，加入10mL含有10％(v/v)FCS的HAT培养基，同时用移液管管尖轻柔地搅拌沉淀。再加入20mL含有10％(v/v)FCS的HAT培养基后，将细胞悬液以100μL/孔接种到含有滋养细胞的96孔细胞培养板中，在5％(v/v)CO₂环境下37℃培养。7天后，用100μL/孔新鲜HAT培养液置换孔中的培养液，观察克隆的形成。

3.通过有限稀释法克隆

如实施例2.2所述，用含10％(v/v)FCS的HT培养基制备滋养细胞。将实施例2.2所述获得的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，准确计数。取300个细胞悬浮于6mL含10％(v/v)FCS的HT培养基中(约5个细胞/100μL)，接种于含有滋养细胞的96孔培养板(100μL/孔)，共32孔；余下2.8mL，再加入3.2mL含10％(v/v)FCS的HT培养基，共6mL(约2.5个细胞/100μL)，接种于含有滋养细胞的96孔培养板(100μL/孔)，共32孔；最后剩余2.8mL，再加入3.2mL含10％(v/v)FCS的HT培养基，共6mL(约1.25个细胞/0.1mL)，接种于含有滋养细胞的96孔培养板(100μL/孔)，共32孔。将培养板置于5％CO₂，37℃孵箱中培养，5天左右在显微镜下观察到细胞克隆。确定单克隆细胞株，适时换液、检测，取阳性单克隆细胞株转入24孔板扩大培养。

4.阳性克隆筛选

用包有1μg/mL hDR5的板子，通过ELISA方法筛选得自杂交瘤克隆的培养上清液。用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠免疫球蛋白与作为底物的TMB，检测筛选具有结合活性的抗体。

5.克隆化

对于在以上实施案例2.4中选择得到的细胞，重复以上实施案例2.3和2.4的步骤5次，从而使得能够选择几个分别产生结合hDR5的单一抗体杂交瘤克隆。作为这种选择方法的结果，获得命名为LaDR5并且产生与hDR5结合的抗体的小鼠-小鼠杂交瘤。这株杂交瘤细胞株LaDR5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.2423。

在用单克隆抗体同种型试剂盒测定后，表明杂交瘤LaDR5分泌的抗体亚类为IgG1，κ(图2)。

6.LaDR5单克隆抗体的纯化

让杂交瘤LaDR5在500mL无血清培养基中于37℃、5％v/v CO₂下培养5天，生长至1×10⁶细胞/mL的细胞密度。然后将培养物离心(10000r/min，10mins)，并收集上清液，用G蛋白亲和柱子纯化抗体。

实施例三LaDR5单克隆抗体的鉴定及抗肿瘤作用

一、材料

TMB为Sigma公司产品；ATPlite为PE公司产品；³H-TDR为中国放射研究所产品；其他试剂均为市购。

二、方法结果：

1.LaDR5单克隆抗体的识别鉴定

表达抗原的ELISA识别鉴定：用包有1μg/mL hDR5的板子，通过ELISA方法筛选得自杂交瘤克隆的培养上清液。用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠免疫球蛋白与作为底物的TMB，检测筛选具有结合活性的抗体，提示LaDR5可以识别体外表达的DR5抗原，而且其识别活性与抗体浓度呈正比(图3)。

细胞表面DR5表达的流式细胞术分析：收集细胞(1×10⁶)与10μg/mL亲和纯化抗体LaDR5一起于室温下孵育30mins，然后用PE或者FITC偶联的抗小鼠IgG抗体再染色30mins。用流式细胞仪在相应波长下分析10,000个活细胞。结果表明在Jurkat等细胞表面可以检测到DR5的表达(图4)。

2.LaDR5诱导人恶性肿瘤细胞凋亡

在细胞体外培养期间，用各种浓度的LaDR5抗体，通过细胞存活力测定(ATPlite)、³H掺入等方法，测定LaDR5单克隆抗体直接诱导人恶性肿瘤细胞凋亡的能力。大多数肿瘤细胞对LaDR5诱导的细胞凋亡敏感。对于某些细胞，LaDR5显示出强细胞凋亡诱导活性，重要的是，单用LaDR5即可以诱导恶性细胞凋亡(图5、图6)。如LaDR5可以在低浓度诱导Jurkat细胞大量凋亡，图5结果显示，当浓度为100ng/ml时，抗体就表现出明显得杀伤效果，可以抑制约20％的细胞活性；随抗体得浓度升高，杀伤效果也明显提高，当浓度为10μg/ml时，其杀伤效果可以达到约90％。利用流式细胞术检测抗体作用后，Jurkat细胞凋亡情况，结果(图6)显示，1μg/ml的抗体作用后，可以诱导约59.76％的细胞凋亡。

Claims (2)

1.一种分泌肿瘤坏死因子受体诱导型抗体的杂交瘤细胞株LaDR5，保藏号为CGMCC NO.2423。

2.权利要求1所述细胞株分泌的抗体。

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