CN113461818A

CN113461818A - 靶向CD276的全人源抗体scFv、嵌合抗原受体、工程化免疫细胞及其制备方法

Info

Publication number: CN113461818A
Application number: CN202110739700.2A
Authority: CN
Inventors: 王刚; 郑骏年; 赵博; 李慧忠; 曹培育; 李新宇; 王蒙; 康晓彤; 王亚楠
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Jiangsu Jicui Juchuang Biotechnology Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN113461818B

Abstract

本发明提供了靶向CD276的全人源抗体scFv、嵌合抗原受体、工程化免疫细胞及其制备方法。本发明的嵌合抗原受体包含抗原结合区、跨膜结构域、共刺激结构域、胞内信号传导结构域。本发明还涉及包含本发明的新型嵌合抗原受体的工程化免疫细胞、免疫细胞群体和药物组合物，以及所述工程化免疫细胞/药物组合物在治疗肿瘤中的用途。

Description

靶向CD276的全人源抗体scFv、嵌合抗原受体、工程化免疫细胞及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，涉及一种靶向CD276的全人源抗体scFv、嵌合抗原受体、工程化免疫细胞及其制备方法。

背景技术

CD276又称B7H3，属于B7免疫检查点超家族，是一种I型跨膜蛋白，由包含两对相同免疫球蛋白可变区和恒定区的胞外区和较短的胞内区构成。其mRNA表达较为广泛，但蛋白表达非常局限。诸多研究揭示CD276在多种肿瘤中高表达，包括神经胶质瘤、肝癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌等，其表达水平与患者预后不良密切相关。因此，本发明人选用作为靶点，制备的CAR-T细胞靶向广谱实体肿瘤，可应用范围广。而靶向CD276的抗体药物、抗体-药物偶联物、放射材料标记抗体、CD3-CD276双特异性抗体等药物已开展多项针对腹膜癌、神经胶质瘤以及中枢神经肿瘤等肿瘤的I、II期临床试验，显示令人鼓舞的初步结果，未出现不良事件，表明靶向CD276的疗法是安全可靠的。

嵌合抗原修饰的T细胞(Chimeric Antigen Receptor modified T cell,CAR-T)是一种经过基因改造的T细胞，利用基因转导技术将含有肿瘤抗原特异性识别单链抗体(scFv)和T细胞激活基序的CAR导入患者T细胞，使得这些转导了CAR的T细胞能直接识别癌细胞表面抗原而活化，进而杀死癌细胞。正是因为CAR-T细胞杀伤癌细胞不需要借助抗原递呈，而大大提高癌细胞杀伤效率。2012年美国宾夕法尼亚大学Carl June教授使用靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T细胞治愈白血病患儿Emily Whitehead，2017年美国FDA又突破性批准两款CAR-T细胞药物用于B细胞白血病和淋巴瘤治疗，成为细胞治疗领域的一个里程碑。

与传统自体免疫细胞疗法相比CAR-T细胞有诸多优势：(一)靶向性：通过肿瘤抗原特异性单链抗体或配体识别，使CAR-T细胞可以特异性靶向肿瘤细胞；(二)杀伤效率高：2018年Nature报道个例中来源于1个TET2缺失的CAR-T细胞杀死全部肿瘤细胞，治愈白血病；(三)抗原识别范围广：CAR-T细胞能发现所有被抗体识别的肿瘤抗原，包括蛋白抗原、糖类抗原和脂类抗原等；(四)无MHC限制性：CAR-T细胞通过武装的scFv直接识别肿瘤细胞，可以克服肿瘤下调MHC-I分子而发生的免疫逃逸。

针对血液系统肿瘤，CAR-T细胞治疗已取得巨大成就，目前，美国FDA已经先后批准了诺华和吉利德公司的CAR-T细胞产品上市，用于治疗急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，定价分别为47.5万美元(约合300万人民币)和37.3万美元(约合250万人民币)。截至目前，在ClinicalTrials网站注册CAR-T细胞治疗肿瘤临床试验407项，其中针对血液系统肿瘤276项，针对实体瘤131项。在我国，国家药品监督管理局已经受理26项CAR-T细胞治疗肿瘤药物临床申请，仅有1种靶向实体瘤(GPC3)，目前，已有传奇生物、恒润达生、科济生物等公司8项获得药物临床试验批件，标示着国内CAR-T细胞治疗规范化时代已经来临。

目前，靶向CD19、CD22、BCMA的CAR-T细胞治疗血液系统肿瘤已取得长足进步，疗效显著，但针对实体肿瘤的CAR-T细胞治疗进展缓慢，缺乏安全有效的特异性肿瘤抗原靶点是重要的阻滞因素之一。

随着研究的不断深入，CAR-T疗法的副作用逐渐显现，如严重的细胞因子风暴(CRS)、疾病复发等问题。CRS发生后大部分患者经过对症治疗可逐渐恢复，也有报道通过降低CAR-T输注剂量或改变CAR跨膜结构域可降低CRS。疾病复发仍然是CAR-T疗法的主要难题，诺华报道的CTL019临床试验1年复发率41-45％；申请人完成的靶向CD19的鼠源CAR-T细胞治疗白血病复发率也达40％，且再次输注同一种鼠源CAR-T细胞完全不能扩增，我们对3例复发患者更换为人源化CD19 CAR-T细胞后中有2例细胞能有效扩增。究其原因与鼠源scFv具有较强的免疫原性，诱导机体产生人抗鼠抗体反应，导致鼠源CAR-T细胞在人体内存活短暂有关。虽然对鼠源scFv进行人源化改造一定程度上降低免疫原性，但全人源scFv将最大程度降低CAR免疫原性，减少机体免疫排斥，提高CAR-T细胞体内存活。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种靶向CD276的抗体。

本发明的目的之二是提供由上述抗体制备而成的嵌合抗原受体。

本发明的目的之三是提供包含上述嵌合抗原受体的免疫细胞。

本发明的目的之四是提供上述免疫细胞的制备方法及其应用。

具体而言，

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的抗体，其包含如SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区的CDR1-3以及如SEQ ID NO:4-6所示的轻链可变区的CDR1-3；

进一步，所述抗体包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区。

进一步，所述抗体包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。

本发明的抗体可以是本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗CD276结合部分可以是任何同种型的抗体，例如IgA，IgD，IgE，IgG(例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)，IgM等。抗体可以是单克隆或多克隆的。该抗体可以是天然存在的抗体，例如，从哺乳动物，例如小鼠，兔，山羊，马，鸡，仓鼠，人等中分离和/或纯化的抗体。或者该抗体可以是遗传-工程化抗体，例如人源化抗体、全人源抗体、嵌合抗体。抗体可以是单体形式或聚合形式。而且抗体可以对CD276具有任何水平的亲和力。

测试抗体结合CD276的能力的方法是本领域已知的，包括任何抗体-抗原结合测定，例如放射免疫测定(RIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，蛋白质印迹，免疫沉淀，竞争抑制测定法和竞争抑制测定法。

制备抗体的合适方法是本领域已知的。例如，标准杂交瘤方法。另外，其他方法也可以使用，例如噬菌体载体表达系统是本领域已知的。在非人动物中产生抗体的方法在例如美国专利No.5,545,806、5,569,825和5,714,352,以及美国专利申请公开号2002/0197266A1中找到。

进一步，所述抗体包含全长抗体、全长抗体的抗原结合片段。

更进一步，所述抗原结合片段包含IgG、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv、单结构域抗体；

在本发明的具体方案中，所述抗原结合片段是scFv。

优选地，所述scFv序列包括如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

可以使用以下方法生成单链可变区片段(scFv)抗体片段，该片段是截短的Fab片段，其中包括通过合成肽将抗体的轻链可变结构域连接至抗体重链可变结构域。利用常规重组DNA技术，可以通过重组DNA技术制备二硫键稳定的可变区片段(dsFv)(参见,例如Reiter等,蛋白质工程7:697-704(1994))。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，其包含前面所述的抗体。优选地，所述嵌合抗原受体包含前面所述的scFv。

进一步，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域、胞内信号传导结构域。

进一步，所述嵌合抗原受体还包含共刺激结构域。

进一步，所述跨膜结构域包括以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。

本发明的跨膜结构域包括铰链区和跨膜区。

优选地，所述铰链区和和跨膜区是CD8α的铰链区和和跨膜区。

优选地，CD8α的铰链区包含如SEQ ID NO:25所述的氨基酸序列。

优选地，CD8α的跨膜区包含如SEQ ID NO:27所述的氨基酸序列。

进一步，所述胞内信号传导结构域包括以下蛋白质的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

优选地，所述胞内信号转导结构域是CD3ζ胞内信号转导结构域，其包含如SEQIDNO:31所述的氨基酸序列。

进一步，所述共刺激结构域包含一个或多个以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18、CD27、CD28、CD30、CD40、ICAM、CD83、OX40、4-1BB、CD270、CD272、CD276、ICOS、CD357、DAP10、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70。

优选地，所述共刺激结构域是4-1BB的信号传导结构域，其包含如SEQ ID NO:29所述的氨基酸序列。

本发明的CAR可提供以下一种或多种功能：靶向和破坏表达CD276的癌细胞和/或肿瘤脉管系统，减少或消除癌细胞和/或肿瘤脉管系统，促进免疫细胞向肿瘤部位和/或肿瘤脉管系统的浸润，并增强/扩展抗癌和抗肿瘤脉管系统反应。

在一个实施方案中，CAR的抗原结合结构域包含前导序列。在本发明的一个实施方案中，CAR缺乏前导序列。

本发明的前导序列包括膜蛋白质的信号肽，所述信号肽的例子包括T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链等信号肽。作为信号肽的氨基酸序列的具体例，可以举出SEQ ID NO:23记载的氨基酸序列。

进一步，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列包含如SEQ IDNO:15或SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列。

本发明的范围包括本文所述的本发明的嵌合抗原受体的功能变体。

如本文所用,术语“功能变体”是指与亲本CAR具有实质或显著的序列同一性或相似性的CAR，该功能变体保留了亲本CAR的生物学活性。功能性变体以相似程度，相同程度或更高程度保留识别靶细胞的能力。相比亲本CAR，功能变体与亲本CAR在序列上具有约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多相同性。

功能性变体可以包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。备选地或另外地，功能性变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，优选非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物学活性。非保守氨基酸取代可增强功能变体的生物学活性从而与亲本CAR相比,功能变体的生物学活性增加。

本发明的CAR可以被糖基化，酰胺化，羧化，磷酸化，酯化，N-酰化，经由例如二硫键环化或转化成酸，加成盐和/或任选地二聚或聚合。

本发明的CAR(包括功能变体)可以通过本领域已知的方法获得。可以通过任何合适的多肽或蛋白质的制备方法来制备，例如从头合成多肽和蛋白质的合适方法。同样，可以使用标准重组方法使用本文所述的核酸重组产生多肽和蛋白质。此外，本发明的CAR可以从诸如植物，细菌，昆虫，哺乳动物的来源中分离和/或纯化。分离和纯化的方法是本领域众所周知的。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了编码前面所述的抗体或前面所述的嵌合抗原受体或其组成部分的核酸分子。

本文所用的“核酸”包括“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链，合成或获得的，其可以包含天然，非天然或改变的核苷酸，并且可以包含天然，非天然或改变的核苷酸间键合，例如氨基磷酸酯键合或硫代磷酸酯键合。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入，缺失，倒位和/或取代。然而，如本文所讨论的，在某些情况下，核酸包含一个或多个插入，缺失，倒位和/或取代可能是合适的。在一些实施方案中，核酸可以编码不影响多肽、蛋白质、CAR的功能并且在核酸表达后可以被宿主细胞翻译或可以不翻译的其他氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，核酸是互补DNA(cDNA)。在本发明的一个实施方案中，核酸包含密码子优化的核苷酸序列。

进一步，所述嵌合抗原受体的组成部分包括scFv、跨膜区、胞内信号传导结构域、铰链区、共刺激结构域、信号肽。

进一步，所述核酸分子还包含自裂解肽的编码序列；优选地，所述自裂解肽的编码序列是T2A的编码序列；优选地，所述T2A的编码序列是编码SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的编码序列；优选地，所述T2A的编码序列如SEQ ID NO:20所示。

进一步，所述核酸分子还包含标签分子的编码序列；所述标签分子用于表征嵌合抗原受体是否在细胞表面表达的分子；优选地，所述标签分子包括tEGFR；优选地，tEGFR的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；优选地，tEGFR的编码序列如SEQ ID NO:22所示。

进一步，编码前面所述的嵌合抗原受体或其组成部分的核酸分子包括SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:20所示的序列。

进一步，编码前面所述的抗体的核酸分子包括SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14所示的序列。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了含有前面所述的核酸分子的载体。进一步，所述载体包括克隆载体和表达载体。

本发明的载体可以是任何合适的载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或表达的载体，例如质粒和病毒。载体可以选自pUC系列，pBluescript系列，pET系列，pGEX系列、pEX系列。也可以使用噬菌体载体，例如λGT10，λGT11，λZapII(Stratagene)，λEMBL4和λNM1149。植物载体的实例包括pBI01，pBI101.2，pBI101.3，pBI121和pBIN19(Clontech)。动物载体的实例包括pEUK-C1，pMAM和pMAMneo(Clontech)。载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体。

本发明的载体也可以表示病毒颗粒，所述病毒颗粒可以包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞表达前面所述的抗体或前面所述的嵌合抗原受体。

进一步，所述工程化细胞含有前面所述的核酸分子或前面所述的载体。

对于表达前面所述的抗体而言，所述工程化细胞包含大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，或哺乳动物细胞。

对于表达前面所述的嵌合抗原受体而言，所述工程化细胞包含工程化免疫细胞；优选地，所述工程化免疫细胞包含T淋巴细胞、NK细胞，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NKT细胞。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种免疫细胞群体，其包含前面所述的工程化细胞。

进一步，免疫免疫细胞群体还包括未改造和/或未成功改造的免疫细胞。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的工程化细胞或免疫细胞群体的制备方法，所述制备方法包括：将含有前面所述的核酸分子或前面所述的载体导入细胞中获得工程化细胞或免疫细胞群体。

可以通过各种合适的方式将如上所述的核酸分子或载体引入细胞，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、电穿孔、TALEN方法、ZFN方法、非病毒载体介导的转染(例如脂质体)或病毒载体介导的转染(如慢病毒感染，逆转录病毒感染，腺病毒感染)，以及其他用于转移入细胞的物理、化学或生物学手段，如转座子技术，CRISPR-Cas9等技术。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种缀合物，其包含前面所述的抗体以及连接于所述抗体的修饰部分。

进一步，所述修饰部分包括可检测的标记、治疗剂。

优选地，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、生物素。

优选地，所述治疗剂包括具有抗肿瘤活性的药物或细胞毒剂。

一方面，所述治疗剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如可间接抑制肿瘤细胞生长、或通过激活机体免疫反应从而抑制或杀灭细胞，从而达到治疗肿瘤的化学物质、多肽、酶、细胞因子或其他具有生物活性的单一物质或混合物质，例如白介素类、肿瘤坏死因子、趋化因子、纳米颗粒。

另一方面，所述治疗剂是细胞毒剂。在本发明中，所述细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种药物组合物或试剂盒，所述药物组合物包括前面所述的抗体、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子、前面所述的载体、前面所述的工程化细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的缀合物；优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在此类实施方案中，所述缀合物包含本发明的抗体以及连接于所述抗体的治疗剂。

在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。

在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂包括但不限于另外的抗体、融合蛋白或药物(例如抗肿瘤药物，如用于放疗的药物或化疗药物)。在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂具有抗肿瘤活性。

在某些实施方案中，在所述药物组合物中，前面所述的抗体、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子、前面所述的载体、前面所述的工程化细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的缀合物与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，前面所述的抗体、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子、前面所述的载体、前面所述的工程化细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的缀合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的前面所述的抗体、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子、前面所述的载体、前面所述的工程化细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的缀合物、前面所述的药物组合物。

一种具体方法包括如下步骤：(1)提供所述受试者所需的免疫细胞；(2)将包含编码本发明的嵌合抗原受体的核酸分子或前面所述的载体导入步骤(1)所述的免疫细胞，以获得表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞；(3)将步骤(2)中获得的免疫细胞施用至所述受试者以进行治疗。

在某些实施方案中，所述方法通过剂量分次，例如一次，两次，三次或更多次分施用部分剂量，向所述受试者施用表达本发明的CAR的免疫细胞，例如在治疗的第一天施用总剂量的第一百分比，在随后的(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)治疗日施用总剂量的第二百分比，例如在随后的(例如第三，第四，第五，第六，第七，第八，第九，第十或更晚)治疗日施用总剂量的第三百分比(例如，剩余百分比)。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了用于诊断受试者是否患有表达CD276的肿瘤的方法，其包括使用前面所述的抗体或其抗原结合片段检测CD276在来自所述受试者的样品中的量。

优选地，所述方法还包括：将所述CD276在来自所述受试者的样品中的量与其在已知标准品或参照样品中的量进行比较，并确定来自所述受试者的样品的CD276水平是否落入与肿瘤相关的CD276水平内。

优选地，所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞、组织、组织学制备物。

本发明还提供了一种检测CD276蛋白或其抗原片段的方法，所述方法包括施用前面所述的抗体、前面所述的组合物或试剂盒。

进一步，所述方法包括如下步骤：

1)获取含有CD276蛋白或其抗原片段的样品；

2)将步骤1)收集的样品与前面所述的抗体或前面所述的组合物接触；

3)检测抗体-抗原复合物的存在。

优选地，所述样品包括生物样品，其可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞、组织、组织学制备物。

优选地，所述样品是体外表达、或合成的。例子包括体外表达的蛋白，或工业制备的疫苗等。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种应用，所述应用包括以下任一项：

1)前面所述的抗体、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子、前面所述的载体、前面所述的工程化细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的缀合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用；

2)前面所述的抗体、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子、前面所述的载体、前面所述的工程化细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的缀合物在制备前面所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

3)前面所述的抗体、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子、前面所述的载体、前面所述的工程化细胞在制备前面所述的免疫细胞群体中的应用；

4)前面所述的抗体、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子、前面所述的载体在制备前面所述的工程化细胞或前面所述的免疫细胞群体中的应用；

5)前面所述的抗体、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子在制备前面所述的载体中的应用；

6)前面所述的抗体、前面所述的嵌合抗原受体在制备前面所述的核酸分子或前面所述的载体中的应用；

7)前面所述的抗体在制备前面所述的缀合物中的应用；

8)前面所述的抗体在制备检测CD276蛋白或其抗原片段的试剂盒中的应用；

9)前面所述的抗体在制备诊断肿瘤的试剂盒中的应用；

优选地，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。

本发明的肿瘤的非限制性实例包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠道癌以及任何其他现在已知或以后发现的癌症(参见，例如Rosenberg(1996)《医学年鉴》47：481-491，其全部内容通过引用并入本文)。

本发明的有益效果：本发明的靶向CD276的CAR-T细胞对多种实体瘤细胞具有杀伤作用，杀伤活性高，并且安全有效，可用于肾癌、肺癌以及肝癌、神经胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌等的免疫细胞治疗。

附图说明

图1显示利用ELISA检测克隆CD276-01、CD276-03识别并结合CD276靶抗原的显色反应结果图；

图2显示利用ELISA检测纯化的scFv蛋白识别靶抗原能力的显色反应结果图；

图3显示scFv蛋白纯化结果图；

图4显示利用流式细胞仪分析scFv识别并结合靶抗原的能力结果图；

图5显示利用流式细胞仪检测CAR-T中CD276-CAR的表达的结果图，其中，A：对照；B：CD276-CAR；

图6显示CAR-T细胞生长曲线图；

图7显示本发明的CAR-T对SKOV3细胞的杀伤能力的结果图，其中，A：2:1；B：1:1；C：1:2；图纵坐标是标准化细胞指数，图横坐标是时间(h)；

图8显示本发明的CAR-T对A549细胞的杀伤能力的结果图，其中，A：2:1；B：1:1；C：1:2；图纵坐标是标准化细胞指数，图横坐标是时间(h)。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1靶向CD276的scFv的筛选

1、实验条件设置

实验组:CD276抗原+CD276-Phage

对照组1:其它无biotin抗原(PRPS1)+CD276-Phage

实验组2:无抗原+CD276-Phage

2、实验方法

经过四轮筛选富集特异性结合抗体序列，每一轮中改变投入噬菌体总量、加入抗原量、反应时间等条件。

最终结果通过计算实验组对照组每100μl中0.1M HCl(PH＝2.0)洗脱液中含有的具有感染能力的噬菌体个数，判断富集情况。

3、筛选结果分析

第三轮筛选出现富集，实验组洗脱下来的phage个数(抗原抗体特异性结合)与对照组(抗原抗体之间非特异性结合，或者无亲和力的)比值接近10倍；在第四轮改变实验条件后，实验组和对照组依然保持10倍差距，表明筛选得到的phage应该有与CD276目的蛋白具有亲和力的scFv。

4、scFv序列分析

挑取24个单克隆测序，其中13条完整表达scFv序列，富集不同序列

克隆01：VH:IGHV3-23*04、IGHJ4*02；VK:IGKV1-39*01/IGKV1D-39*01、IKJ1*01；

克隆03：VH:IGHV3-33*06、IGHJ6*03；VL:IGKV2-14*01、IGLJ2*01/IGLJ3*01；

经测序，克隆01的scFv序列如SEQ ID NO:13所示。

经测序，克隆03的scFv序列如SEQ ID NO:34所示。

实施例1靶向CD276的scFv结合靶抗原能力检测

一、实验1

1、检测条件设置

实验组：抗原+phage

阳性对照组：BCMA抗原及phage scFv-BCMA

阴性对照组1：其它无biotin抗原(PRPS1)+phage

阴性对照组2：无抗原+phage

2、实验方案

制备单克隆phage：CD276-01、CD276-03，通过ELISA实验显色反应和OD值初步判断其与靶抗原是否有亲和力。

3、实验步骤

每组实验孔及对照孔中加入等量抗原包被，其后加入等量phage，孵育之后，多次清洗去除未结合的phage，加入phage检测抗体和二抗后，进行TMB显色，酶标仪测OD_450nm读数。

4、结果分析

结果如图1、表1所示，通过ELISA显色反应和OD_450nm读值可以看出克隆CD276-01能识别并结合CD276靶抗原，而CD276-03不能识别靶抗原。

表1CD276-01、CD276-03统计结果

二、实验2

1、scFv抗体表达纯化

利用pET-22b构建CD276-scFv抗体表达载体，通过诱导表达和纯化，得到两种纯化的scFv蛋白，纯化结果图如图3所示。

CD276-01 scFv抗体：0.474μg/μl。

2、实验方案

每组实验孔及对照孔中加入等量抗原包被，其后加入纯化的scFv抗体，孵育之后，多次洗涤，加入His抗体和二抗后，进行TMB显色，酶标仪测OD_450nm读数。

3、ELISA结果分析

结果如图2和表2所示，当纯化的scFv抗体稀释1000倍时，CD276-01依然有一定的靶抗原结合能力。

表2亲和力统计结果

CD276抗原	scFv-01抗体	10x(10μl)	100x	1000x
					+	+	2.063	0.353	0.156
+	-	0.109	0.105	0.11
					-	+	0.767	0.378	0.112
-	-	0.111	0.107	0.113

三、实验3

1、实验方案

将CD276-01 scFv构建至含有GPI锚定序列的真核表达载体中，转染293T细胞，通过CD276-Fc(R&D systems,1027-B3-100)和PE-Anti-Human IgG Fc(Thermo,12-4998-82)进行流式检测表达在细胞膜表面的scFv是否能结合靶抗原。

2、结果分析

通过流式检测结果可见CD276-01 scFv可识别并结合CD276靶抗原(图4)。

实施例3全人源CD276 CAR-T细胞的制备

一、步骤

(1)准备PBMC细胞

取健康人外周血，离心后留自体血浆备用，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释，加入到淋巴细胞分离液的上层，离心，吸取中间白膜层细胞，加入生理盐水洗涤，离心弃上清，即得。

(2)构建含有CAR结构的穿梭质粒

a、合成靶向人CD276的CAR编码核苷酸序列，CAR编码核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，其中靶向人CD276的scFv的重链VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，G4S短肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

b、将逆转录病毒载体MSCV和步骤1)合成的靶向人CD276的CAR编码核苷酸序列经Nco I和Mlu I双酶切，进行片段回收，回收的目的片段用T4连接酶连接，然后转化Stbl3感受态细胞；

c、挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送测序确认，正确的质粒即为MSCV-M13B701。

(3)包装病毒

将含有CAR结构的穿梭质粒6μg、辅助质粒pCL-Ampho 4μg混合在300μl opti-MEM培养基中，在另一300μl opti-MEM培养基中逐滴加入30μl PEI试剂，震荡混匀，室温静置5分钟，将含有PEI试剂的混合物逐滴加入到质粒混合物中，震荡混匀，室温静置15分钟，然后将PEI与质粒混合物逐滴加入预先铺好的293T细胞培养皿中，轻摇混匀，48-72小时后，收集上清，经0.45μm针头滤器过滤，超低温冰箱保存备用。

(4)CAR-T细胞制备

a、PBMC细胞的分离

采集健康志愿者外周血，室温1300g离心10分钟后弃掉血浆部分，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释混匀；将血细胞悬液缓慢加入到淋巴细胞分离液上层，室温600g离心25分钟；吸取中间白膜层淋巴细胞，加入生理盐水洗涤，必要时作裂解红细胞处理，室温400g离心10分钟，弃上清，即得PBMC细胞。

b、PBMC细胞培养活化

首先用1μg/ml anti-human CD3(OKT3)和anti-human CD28(CD28.2)包被24孔板，4℃孵育过夜；然后将PBMC细胞用含有5％胎牛血清、200U/ml IL-2、10ng/ml IL-7和5ng/mlIL-15的X-Vivo培养基重悬至1×10⁶/ml，每孔接种1ml细胞悬液，进行培养活化。

c、采用CD276-CAR病毒感染活化后的PBMC细胞

将CD276-CAR病毒液加入10μM HEPES和6-8μg/ml polybrene，混匀，接着用该病毒液重悬活化的PBMC细胞，然后加入RetroNectin包被过的24孔板中，1500g、30℃离心2小时后去上清，补加含有5％胎牛血清、200U/ml IL-2、10ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的X-Vivo培养基，继续培养，即可。

(5)CAR-T细胞中感染效率检测

利用流式细胞仪检测CAR-T中CD276-CAR的表达，分析感染效率。

(6)CAR-T细胞增殖能力检测

测定培养不同天数的CAR-T细胞数绘制生长曲线。

二、结果

结果图5所示，本发明的CAR-T可有效表达靶向CD276的CAR，感染效率高。

结果图6所示，本发明的CAR-T细胞增殖速度快。

实施例3全人源CD276 CAR-T细胞的体外功能验证

一、步骤

向E-Plate检测板中加入50μl无细胞因子T细胞完全培养基(不加细胞因子)并测定背景阻抗值。向E-Plate检测板中加入1×10⁴个肿瘤细胞(肿瘤细胞/100μl)，观察待肿瘤细胞贴壁后向E-Plate检测板中按效靶比(E/T)2：1、1:1、1:2加入CAR-T细胞并用培养基配平体系200μl，放入检测台上(检测台预先放入培养箱中)，进行实时动态的细胞增殖检测。

二、结果

结果如图7和8所示，本发明的CAR-T细胞在体外可高效杀伤肿瘤细胞。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 靶向CD276的全人源抗体scFv、嵌合抗原受体、工程化免疫细胞及其制备方法

<141> 2021-06-30

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Gly Phe Ser Gly Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Lys Ala Leu Gly Ala Pro Val Tyr

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ala Ser

1

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Gly Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

35 40 45

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Ala Leu Gly Ala Pro Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 60

tgtgcagcct ctggattcgg ttttagtggc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 120

gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatc agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 180

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agctctggga 300

gcaccagtct actggggcca gggaacaatg gtcaccgtct cctca 345

<210> 10

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgtg gacgttcggc 300

caagggacca aagtggatat caaa 324

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatca 45

<210> 13

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Gly Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

35 40 45

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Ala Leu Gly Ala Pro Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

130 135 140

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

145 150 155 160

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

165 170 175

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

180 185 190

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr

210 215 220

Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

225 230 235

<210> 14

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 60

tgtgcagcct ctggattcgg ttttagtggc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 120

gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatc agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 180

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agctctggga 300

gcaccagtct actggggcca gggaacaatg gtcaccgtct cctcaggtgg cggtggctcg 360

ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatca gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc 420

ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc 480

agctatttaa attggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct 540

gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat 600

ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg caacttacta ctgtcaacag 660

agttacagta cccctccgtg gacgttcggc caagggacca aagtggatat caaa 714

<210> 15

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser

35 40 45

Gly Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

85 90 95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Lys Ala Leu Gly Ala Pro Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

145 150 155 160

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

165 170 175

Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

180 185 190

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

195 200 205

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

210 215 220

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

225 230 235 240

Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile

245 250 255

Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

260 265 270

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

275 280 285

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

290 295 300

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

305 310 315 320

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 16

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Gly Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

35 40 45

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Ala Leu Gly Ala Pro Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

130 135 140

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

145 150 155 160

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

165 170 175

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

180 185 190

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr

210 215 220

Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Thr Thr

225 230 235 240

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

245 250 255

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

260 265 270

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

275 280 285

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

290 295 300

Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

305 310 315 320

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

325 330 335

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

340 345 350

Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

355 360 365

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

370 375 380

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

385 390 395 400

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

405 410 415

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

420 425 430

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

435 440 445

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

450 455 460

Pro Pro Arg

465

<210> 17

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcgtg 60

cagctggtgg agtctggggg aggcttggta cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt 120

gcagcctctg gattcggttt tagtggctat gccatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180

aaggggctgg agtgggtctc agctatcagt ggtagtggtg gtagcacata ctacgcagac 240

tccgtgaagg gccggttcac catctccaga gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa 300

atgaacagcc tgagagccga ggacacggcc gtatattact gtgcgaaagc tctgggagca 360

ccagtctact ggggccaggg aacaatggtc accgtctcct caggtggcgg tggctcgggc 420

ggtggtgggt cgggtggcgg cggatcagac atcgtgatga cccagtctcc atcctccctg 480

tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagcagc 540

tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agctcctgat ctatgctgca 600

tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc 660

actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcaacagagt 720

tacagtaccc ctccgtggac gttcggccaa gggaccaaag tggatatcaa aacgcgtacc 780

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 840

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 900

ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 960

tcactggtta tcacccttta ctgcaggttc agtgtcgtga agagaggccg gaagaagctg 1020

ctgtacatct tcaagcagcc tttcatgagg cccgtgcaga ctacccagga ggaagatgga 1080

tgcagctgta gattccctga agaggaggaa ggaggctgtg agctgagaag agtgaagttc 1140

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440

cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1464

<210> 18

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 60

tgtgcagcct ctggattcgg ttttagtggc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 120

gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatc agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 180

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agctctggga 300

gcaccagtct actggggcca gggaacaatg gtcaccgtct cctcaggtgg cggtggctcg 360

ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatca gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc 420

ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc 480

agctatttaa attggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct 540

gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat 600

ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg caacttacta ctgtcaacag 660

agttacagta cccctccgtg gacgttcggc caagggacca aagtggatat caaaacgcgt 720

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 780

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 840

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 900

ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcagg ttcagtgtcg tgaagagagg ccggaagaag 960

ctgctgtaca tcttcaagca gcctttcatg aggcccgtgc agactaccca ggaggaagat 1020

ggatgcagct gtagattccc tgaagaggag gaaggaggct gtgagctgag aagagtgaag 1080

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1140

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1200

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1260

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1320

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1380

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1407

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 20

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gagggcagag gcagcctgct gacatgtggc gacgtggaag agaaccctgg cccc 54

<210> 21

<211> 352

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser

20 25 30

Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser

35 40 45

Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser

50 55 60

Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys

65 70 75 80

Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu

85 90 95

Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly

100 105 110

Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn

115 120 125

Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp

130 135 140

Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn

145 150 155 160

Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser

165 170 175

Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala

180 185 190

Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val

195 200 205

Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn

210 215 220

Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile

225 230 235 240

Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr

245 250 255

Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly

260 265 270

Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn

275 280 285

Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys

290 295 300

His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys

305 310 315 320

Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly

325 330 335

Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met

340 345 350

<210> 22

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tcgcaaagtg 60

tgtaacggaa taggtattgg tgaatttaaa gactcactct ccataaatgc tacgaatatt 120

aaacacttca aaaactgcac ctccatcagt ggcgatctcc acatcctgcc ggtggcattt 180

aggggtgact ccttcacaca tactcctcct ctggatccac aggaactgga tattctgaaa 240

accgtaaagg aaatcacagg gtttttgctg attcaggctt ggcctgaaaa caggacggac 300

ctccatgcct ttgagaacct agaaatcata cgcggcagga ccaagcaaca tggtcagttt 360

tctcttgcag tcgtcagcct gaacataaca tccttgggat tacgctccct caaggagata 420

agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac 480

tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa 540

aacagctgca aggccacagg ccaggtctgc catgccttgt gctcccccga gggctgctgg 600

ggcccggagc ccagggactg cgtctcttgc cggaatgtca gccgaggcag ggaatgcgtg 660

gacaagtgca accttctgga gggtgagcca agggagtttg tggagaactc tgagtgcata 720

cagtgccacc cagagtgcct gcctcaggcc atgaacatca cctgcacagg acggggacca 780

gacaactgta tccagtgtgc ccactacatt gacggccccc actgcgtcaa gacctgcccg 840

gcaggagtca tgggagaaaa caacaccctg gtctggaagt acgcagacgc cggccatgtg 900

tgccacctgt gccatccaaa ctgcacctac ggatgcactg ggccaggtct tgaaggctgt 960

ccaacgaatg ggcctaagat cccgtccatc gccactggga tggtgggggc cctcctcttg 1020

ctgctggtgg tggccctggg gatcggcctc ttcatgtaa 1059

<210> 23

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 24

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgc 57

<210> 25

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

35 40 45

<210> 26

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta c 141

<210> 27

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 28

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60

tactgc 66

<210> 29

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

1 5 10 15

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

35 40 45

<210> 30

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aggttcagtg tcgtgaagag aggccggaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcctttc 60

atgaggcccg tgcagactac ccaggaggaa gatggatgca gctgtagatt ccctgaagag 120

gaggaaggag gctgtgagct gaga 144

<210> 31

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 32

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 33

<211> 2592

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcgtg 60

cagctggtgg agtctggggg aggcttggta cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt 120

gcagcctctg gattcggttt tagtggctat gccatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180

aaggggctgg agtgggtctc agctatcagt ggtagtggtg gtagcacata ctacgcagac 240

tccgtgaagg gccggttcac catctccaga gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa 300

atgaacagcc tgagagccga ggacacggcc gtatattact gtgcgaaagc tctgggagca 360

ccagtctact ggggccaggg aacaatggtc accgtctcct caggtggcgg tggctcgggc 420

ggtggtgggt cgggtggcgg cggatcagac atcgtgatga cccagtctcc atcctccctg 480

tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagcagc 540

tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agctcctgat ctatgctgca 600

tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc 660

actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcaacagagt 720

tacagtaccc ctccgtggac gttcggccaa gggaccaaag tggatatcaa aacgcgtacc 780

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 840

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 900

ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 960

tcactggtta tcacccttta ctgcaggttc agtgtcgtga agagaggccg gaagaagctg 1020

ctgtacatct tcaagcagcc tttcatgagg cccgtgcaga ctacccagga ggaagatgga 1080

tgcagctgta gattccctga agaggaggaa ggaggctgtg agctgagaag agtgaagttc 1140

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440

cacatgcagg ccctgccccc tcgcgcatgc ggatctggag agggcagagg cagcctgctg 1500

acatgtggcg acgtggaaga gaaccctggc cccatgtggc tgcagagcct gctgctcttg 1560

ggcactgtgg cctgcagcat ctctcgcaaa gtgtgtaacg gaataggtat tggtgaattt 1620

aaagactcac tctccataaa tgctacgaat attaaacact tcaaaaactg cacctccatc 1680

agtggcgatc tccacatcct gccggtggca tttaggggtg actccttcac acatactcct 1740

cctctggatc cacaggaact ggatattctg aaaaccgtaa aggaaatcac agggtttttg 1800

ctgattcagg cttggcctga aaacaggacg gacctccatg cctttgagaa cctagaaatc 1860

atacgcggca ggaccaagca acatggtcag ttttctcttg cagtcgtcag cctgaacata 1920

acatccttgg gattacgctc cctcaaggag ataagtgatg gagatgtgat aatttcagga 1980

aacaaaaatt tgtgctatgc aaatacaata aactggaaaa aactgtttgg gacctccggt 2040

cagaaaacca aaattataag caacagaggt gaaaacagct gcaaggccac aggccaggtc 2100

tgccatgcct tgtgctcccc cgagggctgc tggggcccgg agcccaggga ctgcgtctct 2160

tgccggaatg tcagccgagg cagggaatgc gtggacaagt gcaaccttct ggagggtgag 2220

ccaagggagt ttgtggagaa ctctgagtgc atacagtgcc acccagagtg cctgcctcag 2280

gccatgaaca tcacctgcac aggacgggga ccagacaact gtatccagtg tgcccactac 2340

attgacggcc cccactgcgt caagacctgc ccggcaggag tcatgggaga aaacaacacc 2400

ctggtctgga agtacgcaga cgccggccat gtgtgccacc tgtgccatcc aaactgcacc 2460

tacggatgca ctgggccagg tcttgaaggc tgtccaacga atgggcctaa gatcccgtcc 2520

atcgccactg ggatggtggg ggccctcctc ttgctgctgg tggtggccct ggggatcggc 2580

ctcttcatgt aa 2592

<210> 34

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser His

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Gly Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Asp Arg Pro His Pro Met Gly Phe Tyr Tyr Tyr Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val

130 135 140

Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser

145 150 155 160

Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro

165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser

180 185 190

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Claims

1.一种分离的抗体，其包含如SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区的CDR1-3以及如SEQID NO:4-6所示的轻链可变区的CDR1-3。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区；所述抗体包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变区。

3.一种嵌合抗原受体，其包含权利要求1或2所述的抗体；所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域、胞内信号传导结构域；所述嵌合抗原受体包含或不包含共刺激结构域；所述嵌合抗原受体包含或不包含前导序列。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

5.编码权利要求1或2所述的抗体或权利要求3或4所述的嵌合抗原受体或其组成部分的核酸分子或包含所述核酸分子的载体。

6.根据权利要求5所述的核酸分子或包含所述核酸分子的载体，其特征在于，所述核酸分子包括SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:24所示的序列。

7.一种工程化细胞，所述工程化细胞表达权利要求1或2所述的抗体或权利要求3或4所述的嵌合抗原受体。

8.根据权利要求7所述的工程化细胞，其特征在于，所述述工程化细胞包含工程化免疫细胞；所述工程化免疫细胞包含T淋巴细胞、NK细胞，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NKT细胞。

9.权利要求7或8所述的工程化细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将含有权利要求5或6所述的核酸分子或包含所述核酸分子的载体导入细胞中。

10.一种缀合物，其包含权利要求1或2所述的抗体以及连接于所述抗体的修饰部分；所述修饰部分包括可检测的标记、治疗剂。

11.根据权利要求10所述的缀合物，其特征在于，所述可检测的标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、生物素；所述治疗剂包括具有抗肿瘤活性的药物或细胞毒剂。

12.一种药物组合物或试剂盒，其特征在于，所述药物组合物或试剂盒包括权利要求1或2所述的抗体、权利要求3或4所述的嵌合抗原受体、权利要求5或6所述的核酸分子或包含所述核酸分子的载体、权利要求7或8所述的工程化细胞、权利要求10或11所述的缀合物。

13.一种非诊断目的的检测CD276蛋白或其抗原片段的方法，所述方法包括如下步骤：

1)获取含有CD276蛋白或其抗原片段的样品；

2)将步骤1)收集的样品与权利要求1或2所述的抗体，或权利要求10或11所述的缀合物接触；

3)检测抗体-抗原复合物的存在。

14.一种应用，所述应用包括以下任一项：

1)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3或4所述的嵌合抗原受体、权利要求5或6所述的核酸分子或包含所述核酸分子的载体、权利要求7或8所述的工程化细胞、权利要求10或11所述的缀合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用；

2)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3或4所述的嵌合抗原受体、权利要求5或6所述的核酸分子或包含所述核酸分子的载体、权利要求7或8所述的工程化细胞、权利要求10或11所述的缀合物在制备权利要求12所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

3)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3或4所述的嵌合抗原受体、权利要求5或6所述的核酸分子或包含所述核酸分子的载体在制备权利要求7或8所述的工程化细胞中的应用；

4)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3或4所述的嵌合抗原受体、权利要求5或6所述的核酸分子在制备权利要求5或6所述的包含所述核酸分子的载体中的应用；

5)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3或4所述的嵌合抗原受体在制备权利要求5或6所述的核酸分子或包含所述核酸分子的载体中的应用；

6)权利要求1或2所述的抗体在制备权利要求10或11所述的缀合物中的应用；

7)权利要求1或2所述的抗体在制备检测CD276蛋白或其抗原片段的试剂盒中的应用；

8)权利要求1或2所述的抗体在制备诊断肿瘤的试剂盒中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠道癌以及任何其他现在已知或以后发现的癌症。