CN111875708A

CN111875708A - 一种嵌合抗原受体t淋巴细胞及其在制备治疗实体肿瘤的产品中的应用

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Publication number: CN111875708A
Application number: CN202010466592.1A
Authority: CN
Inventors: 朱建高; 杨文君
Original assignee: Zhejiang Compvss Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Compvss Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2040-05-28
Also published as: CN111875708B

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体T淋巴细胞及其在制备治疗实体肿瘤的产品中的应用。所述嵌合抗原受体T淋巴细胞中的嵌合抗原受体依次包括人CD8先导肽、抗Siglec‑15单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4‑1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、CSF2Ra信号肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人CD27。通过实验证明：本发明的嵌合抗原受体T淋巴细胞高表达IFNγ和CD107a，对Siglec‑15阳性的肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，在效靶比是1比1的情况下，杀伤效率超过80％。肿瘤移植模型实验表明：本发明的嵌合抗原受体T淋巴细胞在动物体内对Siglec‑15阳性的肿瘤细胞同样具有强烈的杀伤功能。

Description

一种嵌合抗原受体T淋巴细胞及其在制备治疗实体肿瘤的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体T淋巴细胞及其在制备治疗实体肿瘤的产品中的应用，特别涉及一种Siglec-15-CAR-CD27嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞及其在制备治疗实体肿瘤的产品中的应用。

背景技术

随着T淋巴细胞肿瘤免疫应答机制的研究日益受到重视，嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗正在成为肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略。由于T细胞对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(T Cell Receptor，TCR)，因此将针对肿瘤细胞相关抗原的单链抗体片段(scFv)与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，并将其通过如逆转录病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面，这种CAR-T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibility Complex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。

CAR-T细胞介导的免疫反应是其清除肿瘤细胞的主要手段。在正常的免疫反应中，抗原特异性T细胞需要至少两个信号的刺激才能进行增殖并对抗原产生免疫应答。第一信号，抗原结合的T细胞受体(TCR)和CD3胞内免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)转导信号(CD3ζ)；第二信号，协同刺激信号，由T细胞与抗原提呈细胞(APC)或其它细胞表面的共刺激分子对所介导，包括CD28、CD137、CD134和CD27等表面受体。CAR-T设计考虑到了T细胞激活的免疫学特性，CAR的结构包含胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8、CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ及共刺激信号分子CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。

胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CAR-T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CAR-T可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是缺少足够的第二信号刺激，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应。

随后发展的第二代CAR-T淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用能够引起T淋巴细胞的持续增殖，从而提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等。第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的急性淋巴细胞白血病(ALL)病人，其完全缓解率高达90％以上。

第三代CAR-T淋巴细胞，则是同时将两种不同的胞内信号域串联表达，使细胞因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力显著增强，进一步提高了CAR-T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果。例如，最典型的就是宾夕法尼亚大学的Carl June在CD28胞内共刺激信号域后面串联表达CD137(4-1BB)或CD134(OX40)的共刺激信号域。其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM。

第四代的CAR-T淋巴细胞则是在第二代的基础上加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可以产生IL-12，其能够调节免疫微环境-增加T细胞的激活，同时激活固有免疫细胞使其发挥作用来清除靶抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用。有些四代CAR-T在CAR基因末端连接截短型的EGFR基因片段(EGFRt)。该片段不包含EGFR的胞内激活结构域，仅保留其与配体结合的胞外位点。因此通过诱导剂(如西妥昔单抗)可以特异性结合EGFRt，借助抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)使CAR-T细胞发生凋亡，从而可以随时清除体内的CAR-T细胞。

在现有的技术水平下，CAR-T治疗实体瘤的有效性是业界非常关心的问题。现阶段已有的靶点，如Glypican 3(GPC-3)，Claudin18.2，EpCAM，Mesothelin(MSLN)等，虽然在临床前研究中取得一定成效，但是均没有在临床疗效方面更进一步。仅仅通过组学检测以及大数据分析的手段，虽然能筛选出一些在肿瘤细胞表面异常高表达的蛋白，但是当靶向这些蛋白抗原的免疫治疗产品(如抗体治疗，CAR-T治疗)在人体内工作时，往往被肿瘤细胞的免疫微环境隔绝，无法真正发挥抗肿瘤效应。原因之一在于，肿瘤细胞与免疫效应细胞(如T细胞，巨噬细胞等)相互作用的过程中，往往会激活免疫细胞自身的免疫检查点通路(如B7家族蛋白)，造成效应细胞活力下降，从而发生免疫逃逸。此外，CAR-T细胞在体内的持续增殖和存留时间不足，也限制了CAR-T疗法的应答率和增加了CAR-T疗法的复发率。更重要的是，某些实体瘤靶点如HER2，VEGFR等由于非特异性表达，易造成脱靶毒性，实际临床应用过程中安全性存疑。因此，寻找能特异、高效杀伤实体肿瘤细胞的靶点，以及对CAR的设计进一步优化，均是CAR-T细胞疗法应用于实体肿瘤治疗前亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种Siglec-15-CAR-CD27嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞及其在制备治疗实体肿瘤的产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种嵌合抗原受体。

本发明提供的嵌合抗原受体依次包括抗Siglec-15单链抗体(简称S15 scFv)、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人CD27。

进一步的，所述嵌合抗原受体依次包括人CD8先导肽、S15 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、CSF2Ra信号肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人CD27。

所述自切割肽可为本领域常见的任何一种自切割肽，包括E2A、F2A、P2A、T2A等。所述自切割肽是一种来源于病毒的“自裂解”小肽，其平均长度可为18-22个氨基酸。所述自切割肽作用机理如下：在翻译过程中会形成独特的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，但同时核糖体却能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”。基因工程中利用2A元件可以实现不同蛋白的串联表达。在本发明的一个具体实施例中，所述自切割肽为P2A肽。

所述人CD8先导肽为如下A1)或A2)中的任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第1-21位所示的多肽或蛋白质；

A2)将SEQ ID No.2第1-21位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。

所述S15 scFv为如下B1)或B2)中的任一种：

B1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第22-269位所示的蛋白质；

B2)将SEQ ID No.2第22-269位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人CD8铰链跨膜区为如下C1)或C2)中的任一种：

C1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第270-338位所示的蛋白质；

C2)将SEQ ID No.2第270-338位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人4-1BB胞内区为如下D1)或D2)中的任一种：

D1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第339-385位所示的蛋白质；

D2)将SEQ ID No.2第339-385位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人CD3ζ胞内区为如下E1)或E2)中的任一种：

E1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第386-497位所示的蛋白质；

E2)将SEQ ID No.2第386-497位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述P2A肽为如下F1)或F2)中的任一种：

F1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第498-523位或第881-906位所示的多肽或蛋白质；

F2)将SEQ ID No.2第498-523位或第881-906位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。

所述CSF2Ra信号肽为如下G1)或G2)中的任一种：

G1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第524-545位所示的多肽或蛋白质；

G2)将SEQ ID No.2第524-545位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。

所述EGFRt蛋白为如下H1)或H2)中的任一种：

H1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第546-880位所示的蛋白质；

H2)将SEQ ID No.2第546-880位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人CD27为如下I1)或I2)中的任一种：

I1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第907-1167位所示的蛋白质；

I2)将SEQ ID No.2第907-1167位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

更进一步的，所述嵌合抗原受体为如下(1)-(4)中的任一种：

(1)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

(2)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(3)将SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

(4)与(1)-(3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

上述任一所述蛋白质中，所述标签具体如表1所示。

表1、标签的序列

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述任一所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

为了实现上述目的，本发明又提供了与上述嵌合抗原受体相关的生物材料。

本发明提供的与上述嵌合抗原受体相关的生物材料为下述1)至8)中的任一种：

1)编码上述嵌合抗原受体的核酸分子；

2)含有1)所述核酸分子的表达盒；

3)含有1)所述核酸分子的重组载体；

4)含有2)所述表达盒的重组载体；

5)含有1)所述核酸分子的细胞系；

6)含有2)所述表达盒的细胞系；

7)含有3)所述重组载体的细胞系；

8)含有4)所述重组载体的细胞系。

上述1)中，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子依次包括S15 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、自切割肽的编码基因序列、EGFRt蛋白的编码基因序列、自切割肽的编码基因序列、人CD27的编码基因序列。

进一步的，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、S15 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、自切割肽的编码基因序列、CSF2Ra信号肽的编码基因序列、EGFRt蛋白的编码基因序列、自切割肽的编码基因序列、人CD27的编码基因序列。在本发明的一个具体实施例中，所述自切割肽的编码基因序列为P2A肽的编码基因序列。

所述人CD8先导肽的编码基因序列为如下a1)-a3)任一所示的基因：

a1)SEQ ID No.1第1-63位所示的DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD8先导肽的DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD8先导肽的DNA分子。

所述S15 scFv的编码基因序列为如下b1)-b3)任一所示的基因：

b1)SEQ ID No.1第64-807位所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述S15 scFv的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述S15 scFv的DNA分子。

所述人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为如下c1)-c3)任一所示的基因：

c1)SEQ ID No.1第808-1014位所示的DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD8铰链跨膜区的DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD8铰链跨膜区的DNA分子。

所述人4-1BB胞内区的编码基因序列为如下d1)-d3)任一所示的基因：

d1)SEQ ID No.1第1015-1155位所示的DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人4-1BB胞内区的DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人4-1BB胞内区的DNA分子。

所述人CD3ζ胞内区的编码基因序列为如下e1)-e3)任一所示的基因：

e1)SEQ ID No.1第1156-1491位所示的DNA分子；

e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD3ζ胞内区的DNA分子；

e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD3ζ胞内区的DNA分子。

所述P2A肽的编码基因序列为如下f1)-f3)任一所示的基因：

f1)SEQ ID No.1第1492-1569位或第2641-2718位所示的DNA分子；

f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述P2A肽的DNA分子；

f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述P2A肽的DNA分子。

所述CSF2Ra信号肽的编码基因序列为如下g1)-g3)任一所示的基因：

g1)SEQ ID No.1第1570-1635位所示的DNA分子；

g2)与g1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述CSF2Ra信号肽的DNA分子；

g3)在严格条件下与g1)或g2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述CSF2Ra信号肽的DNA分子。

所述EGFRt蛋白的编码基因序列为如下h1)-h3)任一所示的基因：

h1)SEQ ID No.1第1636-2640位所示的DNA分子；

h2)与h1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述EGFRt蛋白的DNA分子；

h3)在严格条件下与h1)或h2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述EGFRt蛋白的DNA分子。

所述人CD27的编码基因序列为如下i1)-i3)任一所示的基因：

i1)SEQ ID No.1第2719-3501位所示的DNA分子；

i2)与i1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD27的DNA分子；

i3)在严格条件下与i1)或i2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD27的DNA分子。

更进一步的，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子为如下Ⅰ)-Ⅲ)任一所示的基因：

Ⅰ)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

Ⅱ)与Ⅰ)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子；

Ⅲ)在严格条件下与Ⅰ)或Ⅱ)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述人CD8先导肽、S15 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、CSF2Ra信号肽、EGFRt蛋白、人CD27或嵌合抗原受体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述人CD8先导肽、S15 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、CSF2Ra信号肽、EGFRt蛋白、人CD27或嵌合抗原受体且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码上述人CD8先导肽、S15 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、CSF2Ra信号肽、人CD27或嵌合抗原受体的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗。

上述2)中，所述表达盒依次由启动子、编码上述嵌合抗原受体的核酸分子和终止子组成。

上述3)或4)中，所述载体可为病毒载体。进一步的，所述病毒载体可为逆转录病毒载体或慢病毒载体。更进一步的，所述逆转录病毒载体为逆转录病毒载体(MP71)。所述重组载体是将上述嵌合抗原受体的核酸分子插入病毒载体中，得到表达上述嵌合抗原受体的重组病毒载体。

上述5)或6)或7)或8)中，所述细胞系可为用于病毒包装的细胞系或用于病毒传代培养的细胞系。所述用于病毒包装的细胞系具体为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞，所述用于病毒传代培养的细胞系具体为PG13细胞。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种CAR-T细胞的制备方法。

本发明提供的CAR-T细胞的制备方法包括如下步骤：将上述嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。

进一步的，所述嵌合抗原受体的编码基因可通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中。

更进一步的，所述将上述嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达的方法为方法(一)或方法(二)：

所述方法(一)包括如下步骤：用逆转录病毒感染T细胞；所述逆转录病毒是将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组逆转录病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体中得到的。

所述方法(二)包括如下步骤：用慢病毒感染T细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述慢病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入慢病毒载体中得到的。

上述方法(一)中，所述将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后还包括如下步骤：收集细胞培养上清中的病毒液，将所述病毒液转染传代细胞，并进行克隆筛选和培养，得到病毒滴度最高的产毒细胞株。该病毒滴度最高的产毒细胞株培养上清中的病毒即为上述方法(一)中的逆转录病毒。

在本发明的一个具体实施例中，所述嵌合抗原受体的编码基因通过逆转录病毒表达系统导入T细胞中。所述逆转录病毒载体具体为逆转录病毒载体(MP71)。所述重组逆转录病毒载体具体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变得到的载体。所述逆转录病毒包装细胞具体为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞。所述传代细胞具体为PG13细胞。

上述方法制备得到的CAR-T细胞或上述方法中的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体也属于本发明的保护范围。

上述嵌合抗原受体或上述生物材料或上述方法中的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体在生产或制备CAR-T细胞中的应用也属于本发明的保护范围。

上述嵌合抗原受体或上述生物材料或上述CAR-T细胞或上述逆转录病毒或上述重组逆转录病毒载体或上述慢病毒或上述重组慢病毒载体在制备治疗或辅助治疗实体肿瘤的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种治疗或辅助治疗实体肿瘤的产品。

本发明提供的治疗或辅助治疗实体肿瘤的产品的活性成分为上述嵌合抗原受体或上述生物材料或上述CAR-T细胞或上述逆转录病毒或上述重组逆转录病毒载体或上述慢病毒或上述重组慢病毒载体。

上述任一所述应用或产品中，所述实体肿瘤为Siglec-15阳性的实体肿瘤；所述Siglec-15阳性的实体肿瘤包括脑胶质瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、肺癌、肾癌、直肠癌、子宫内膜癌和甲状腺癌。在本发明的具体实施例中，所述实体肿瘤为脑胶质瘤。

与现有技术对比，本发明的有益效果如下：

1)本发明首次以Siglec-15为靶点，开发了靶向Siglec-15的CAR-T治疗产品。Siglec-15作为一种新型的T细胞负性调节剂，不仅在包括膀胱癌、肝癌、肺癌、肾癌、直肠癌、子宫内膜癌以及甲状腺癌等众多类型的实体肿瘤细胞高表达，也在肿瘤微环境免疫抑制细胞-肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中高表达，本发明制备的靶向Siglec-15的CAR-T治疗产品可以特异地靶向并杀死实体肿瘤细胞，也可以通过靶向去除肿瘤相关巨噬细胞，解除肿瘤微环境中主要的免疫抑制细胞对T细胞介导的特异性免疫应答，从而提高机体的抗肿瘤免疫反应。

2)本发明首次将CD27作为CAR基因的共刺激信号，并且以非偶联的方式在CAR之外激活CD27信号通路。根据已有研究和过往经验，CAR设计对于共刺激受体的选择更倾向于使用CD28、4-1BB或是OX40的胞内信号结构域。仅使用共刺激受体的信号结构域而不使用全长序列的主要原因，一方面是受到CAR整体长度的限制，另一方面是将共刺激信号域与ITAM信号域串联表达更有利于第二信号的持续激活。然而，随后的研究表明，持续激活某些共刺激配体，例如CD28，更容易引起T细胞耗竭，影响CAR-T细胞治疗效果。事实上，T细胞接收共刺激信号的类型以及时间节点对于T细胞是否完全激活非常关键。例如，CD27和CD28都在原始T细胞中高表达，而终末分化的T细胞中表达较低，说明二者可能在T细胞反应的早期发挥重要功能。相反，其他共刺激受体，如CD137、CD134等在已激活的T细胞中高表达，它们对于抵抗凋亡引起的T细胞耗竭具有重要作用。强行激活其中任何一种共刺激信号都不能完全替代其他共刺激信号的功能。基于这样的理念，有研究将两种或以上的共刺激受体的胞内信号域串联使用，也就是第三代CAR的设计原理。但是，最近的研究结果显示，第三代CAR的抗肿瘤效果未能达到预期，甚至不如第二代CAR，其原因可能由于多个共刺激信号域的串联表达造成多种信号通路相互冲突，不能有效实现信号传递。

本发明申请人经过大量的前期研究发现，激活CAR-T细胞中的CD27通路，能显著促进抗原刺激后T细胞向效应T细胞和记忆T细胞的分化，对于CAR-T细胞在人体内的持续存活和二次应答至关重要。另外，在CAR设计中将两种共刺激信号解除偶联，使其在抗原存在的情况下分别激活，可以显著增强CAR-T细胞的应答水平。具体实现方式是在靶向Siglec-15的CAR的C末端增加基因优化的人全长CD27基因片段，并用P2A肽分隔；表达含有4-1BB共刺激结构域的CAR序列的同时表达全长CD27，在细胞内蛋白酶的作用下切割P2A肽，释放游离的CD27；游离的CD27被转运到细胞表面，在这里接触CD70等配体，实现CD27信号通路的激活。该设计的最大特色是实现4-1BB和CD27两种共刺激信号通路的非偶联式激活。动物体内的研究结果证明，与仅表达Siglec-15-CAR的CAR-T细胞相比，Siglec-15-CAR-CD27设计显著提高了CAR-T细胞对实体肿瘤的杀伤效率，增强了CAR-T细胞在Siglec-15介导的疾病中的应用效果，本发明表达Siglec-15-CAR-CD27的CAR-T细胞具有更强的肿瘤杀伤能力。

3)本发明用嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的转导方法是基于逆转录病毒转导方法，通过筛选稳定的产毒株，收集产毒株上清进行T细胞转导。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，批次稳定性高且可以缩短临床用转导T细胞用病毒的制备时间等优点。

本发明首先通过全基因合成嵌合抗原受体抗Siglec-15scFv-CD8铰链跨膜区-4-1BB-CD3ζ-oCD27的基因片段，并将其插入到逆转录病毒载体中，构建得到重组逆转录病毒载体；然后通过Phenix-ECO细胞对重组逆转录病毒载体进行包装，得到逆转录病毒；此病毒需要再感染PG13细胞，通过筛选获得单克隆高产量病毒株，再将产生的逆转录病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体，得到CAR-T细胞。通过用流式细胞术检测EGFRt表达水平以反映CAR蛋白的表达水平，计算出逆转录病毒感染的T淋巴细胞的比例和细胞表面CAR的表达情况。结果表明：本发明通过逆转录病毒转导T淋巴细胞，得到CAR阳性T淋巴细胞的比例高达80％。通过流式细胞术检测又发现CAR-T细胞高表达IFNγ和CD107a，说明逆转录病毒载体成功转导至T细胞并在细胞表面表达IFNγ和CD107a。通过CFSE染料标记法检测CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞的杀伤功能还发现CAR-T细胞对Siglec-15阳性的肿瘤细胞(例如人脑胶质瘤细胞U87-MG)具强烈的杀伤功能，在效靶比是1比1的情况下，杀伤效率超过80％。最后通过肿瘤移植模型检测CAR-T细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用发现在动物体内CAR-T细胞对Siglec-15阳性的肿瘤细胞同样具有强烈的杀伤功能。

附图说明

图1为CAR的结构示意图。上图为S15-CAR基因结构，下图为S15-CAR-CD27基因结构。

图2为流式细胞术分析逆转录病毒感染T细胞3天后CD4⁺亚群和CD8⁺亚群的CAR-T细胞中EGFR(CAR)的阳性率。

图3为流式细胞术分析逆转录病毒感染T细胞3天后CD4⁺亚群和CD8⁺亚群的CAR-T细胞中IFNγ的阳性率。

图4为流式细胞术分析逆转录病毒感染T细胞3天后CD4⁺亚群和CD8⁺亚群的CAR-T细胞中CD107a的阳性率。

图5为使用CAR-T细胞和靶细胞按照不同效靶比共培养后，用CFSE染料标记法检测靶细胞裂解率。

图6为小鼠肿瘤体积的统计结果。

图7为小鼠存活率的统计结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的逆转录病毒载体(MP71)记载于文献“Engels,B.,et al.,Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes.HumGene Ther,2003.14(12):p.1155-68.”中，公众可从浙江康佰裕生物科技有限公司获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、CAR-T细胞的制备

一、逆转录病毒载体的构建

1、野生型人CD27基因cDNA全长序列的优化

将野生型人CD27基因cDNA全长序列称为nCD27。为了使nCD27更适合在人类细胞中表达，在保证nCD27编码的氨基酸序列不变的情况下，将nCD27序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行了密码子优化，得到oCD27，oCD27的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2719-3501位所示。

2、S15-CAR-CD27基因序列的设计及合成

S15-CAR-CD27基因序列依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、S15 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽(记作P2A肽-1)的编码基因序列、CSF2Ra信号肽的编码基因序列、EGFRt蛋白的编码基因序列、P2A肽(记作P2A肽-2)的编码基因序列、oCD27的编码基因序列。S15-CAR-CD27基因序列如SEQ ID NO.1所示，其中，人CD8先导肽的编码基因序列为SEQ IDNO.1第1-63位，S15 scFv的编码基因序列为SEQ ID NO.1第64-807位、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第808-1014位、人4-1BB胞内区的编码基因序列为SEQ IDNO.1第1015-1155位、人CD3ζ胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1156-1491位、P2A肽-1的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1492-1569位、CSF2Ra信号肽的编码基因序列为SEQ IDNO.1第1570-1635位、EGFRt蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1636-2640位、P2A肽-2的编码基因序列为SEQ ID NO.1第2641-2718位、oCD27的编码基因序列为SEQ ID NO.1第2719-3501位。S15-CAR-CD27基因序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

S15-CAR基因序列依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、S15 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列、CSF2Ra信号肽的编码基因序列、EGFRt蛋白的编码基因序列。S15-CAR基因序列如SEQ ID NO.3所示，其中，人CD8先导肽的编码基因序列为SEQ IDNO.3第1-63位，S15 scFv的编码基因序列为SEQ ID NO.3第64-807位、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为SEQ ID NO.3第808-1014位、人4-1BB胞内区的编码基因序列为SEQ IDNO.3第1015-1155位、人CD3ζ胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.3第1156-1491位、P2A肽的编码基因序列为SEQ ID NO.3第1492-1569位、CSF2Ra信号肽的编码基因序列为SEQ IDNO.3第1590-1635位、EGFRt蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO.3第1636-2643位。

S15-CAR-CD27基因序列和S15-CAR基因序列中的主要元件结构示意图如图1所示。

委托擎科生物科技有限公司合成S15-CAR-CD27基因序列和S15-CAR基因序列。将合成的基因序列克隆在pUC57载体上进行测序鉴定。

3、逆转录病毒载体的构建

将SEQ ID NO.1所示的S15-CAR-CD27基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到重组逆转录病毒载体S15-CAR-CD27。

将SEQ ID NO.3所示的S15-CAR基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到重组逆转录病毒载体S15-CAR。

将SEQ ID NO.4所示的非靶向S15-CAR基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到对照逆转录病毒载体。

二、逆转录病毒包装和产毒株的建立

将步骤一中制备得到的重组逆转录病毒载体S15-CAR-CD27和S15-CAR及对照逆转录病毒载体，按照以下方法分别包装得到两种逆转录病毒及对照逆转录病毒：

1、包装细胞的培养

每10cm细胞培养皿中添加6×10⁶个Phoenix Ecotropic(ECO)细胞(ATCC，CRL-3214)(小于20代，不过分长满)和10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜。

2、包装细胞的转染

待ECO细胞融合度达到50-60％左右进行转染；在一个管中添加目的质粒12.5μg，1.25M CaCl₂ 250μl，H₂O 1ml，总体积为1.25ml；在另一个管里添加与质粒复合物等体积的2×HBS溶液，将质粒复合物加入2×HBS溶液中，边加质粒复合物边涡旋震荡20s，得到混合物。轻柔地将混合物沿着边加入到ECO细胞培养皿中，37℃培养6h，去除培养基，重新加入预热的新鲜培养基。

3、病毒液的获得

转染48h后收集上清并用0.45μm滤器过滤后，得到病毒液，分装保存于-80℃。将由重组逆转录病毒载体S15-CAR-CD27获得的逆转录病毒液记作S15-CAR-CD27病毒液。将由重组逆转录病毒载体S15-CAR获得的逆转录病毒液记作S15-CAR病毒液。将由对照逆转录病毒载体获得的逆转录病毒液记作对照逆转录病毒液。

4、产毒细胞株的建立

将步骤3获得的逆转录病毒液感染PG13细胞(ATCC，CRL-10686)，感染两天后，用EGFR抗体(Biolegend)和MACS Anti-APC/PE Micro beads(美天旎，货号为130-090-855)对CAR表达阳性的细胞进行富集，得到富集后的细胞。取一部分富集后的细胞用流式检测CAR的表达效率，另取一部分富集后的细胞稀释成单细胞，铺至96孔板，将在96孔板培养后第5天的上清作为逆转录病毒液，进一步通过感染HT1080细胞，流式测定病毒滴度。筛选出96孔板中病毒滴度最高的三个细胞株，接种至24孔板中继续培养，进行二次筛选。继续用培养后第5天的上清作为逆转录病毒液，感染HT1080细胞，流式测定病毒滴度，选择病毒滴度最高的细胞作为稳产株，在液氮中长期保存。利用此细胞株可以大规模制备病毒上清用于基因转导制备CAR-T细胞。

三、CAR-T细胞的制备

1、复苏冻存的健康人外周血单个核细胞(PBMC)，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为(1-2)×10⁶个/ml。

2、用Ficoll分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)收集PBMC，采用磁珠法从PBMC中分离获得较纯的CD3⁺T细胞，按磁珠:CD3⁺细胞体积比为3:1的比例加入临床级Dynabeads Human T Expander CD3/CD28磁珠(Invitrogen)活化T细胞。

3、T细胞活化后第二天，用浓度为15μg/ml的Retronectin溶液(Takara)包被含有CD3⁺T细胞的6孔板，6孔板每孔加入1.2ml Retronectin溶液，避光，4℃过夜备用。

4、T细胞活化培养两天后，取出包被Retronectin的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。

5、将步骤二制备的逆转录病毒液(病毒滴度最高的产毒细胞株培养上清)加入孔内，每孔加5-6ml，32℃、2000×g离心2h，弃未结合的病毒上清液，每孔加入3ml含hIL-2(上海华新生物高技术有限公司)(500U/ml)的新鲜RPMI-1640完全培养基的T细胞培养液，初始细胞密度大约为2×10⁶个/ml，继续培养1天。

6、细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含hIL-2(100U/ml)的新鲜RPMI-1640完全培养基的T细胞培养液，细胞密度控制在5×10⁵个/ml，便于细胞扩增。

收集感染病毒液72小时后的T细胞，得到感染逆转录病毒的CAR-T细胞。将感染S15-CAR-CD27病毒液的T细胞记作S15 CAR-CD27 T细胞。将感染S15-CAR病毒液的T细胞记作S15 CAR T细胞。

按照上述步骤，将逆转录病毒液替换为等体积PBS溶液或对照逆转录病毒液，分别得到NO CAR T细胞或CTR CAR T细胞。

四、流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及CAR基因的表达水平

由于CAR基因中带有EGFRt基因，通过检测EGFRt表达水平来反映CAR基因的表达水平。以步骤三获得的S15 CAR-CD27 T细胞、S15 CAR T细胞、CTR CAR T细胞及No CAR T细胞为供试细胞，采用FACS方法通过EGFR抗体检测EGFRt表达水平，具体步骤如下：用FACS缓冲液(含2％(体积分数)FBS的PBS溶液)将供试细胞洗涤1次后弃上清，加入FITC标记的EGFR抗体(Biolegend)避光30min后再用FACS缓冲液洗涤，重悬，得到重悬后的细胞。流式细胞仪检测重悬后的细胞FITC的荧光强度。

结果如图2所示。结果显示：使用步骤二制备得到的逆转录病毒感染T细胞3天后，CD4⁺T细胞中EGFR(CAR)的阳性率在50％-80％之间，CD8⁺T细胞中EGFR(CAR)的阳性率在30％-70％之间。

五、流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的功能指标

1、IFNγ表达水平的检测

IFNγ是反映T淋巴细胞功能的重要指标，细胞内IFNγ的含量越高，证明T细胞的活性程度越高。以步骤三获得的S15 CAR-CD27 T细胞、S15 CAR T细胞、CTR CAR T细胞为供试细胞，通过胞内细胞因子染色法检测细胞内IFNγ的表达水平，以检测T细胞的活化程度。

具体步骤如下：

将S15 CAR-CD27 T细胞、S15 CAR T细胞、CTR CAR T细胞分别与人脑胶质瘤细胞U87-MG(ATCC)按细胞个数比为1:1的比例在DMEM培养基中共同培养(每孔中含有2×10⁵个U87-MG)，向共培养体系中加入Golgi Plug试剂(BD购买)，6小时后收集细胞。将收集后的细胞先进行细胞表面染色，然后进行胞内染色和流式细胞仪检测。

结果如图3所示。结果显示：与CTR CAR T细胞相比，S15 CAR T细胞和S15 CAR-CD27 T细胞在与靶细胞共培养后，IFNγ的表达水平显著增强。尤其是CD8⁺T细胞亚群(细胞毒性T细胞)，IFNγ的阳性率超过50％。

2、CD107a表达水平的检测

溶酶体相关膜蛋白l(CD107a)是囊泡膜蛋白的主要成分。T细胞活化后，会分化成为细胞毒性T细胞(Cytotoxic T-lymphocyte，CTL细胞)，CTL细胞的重要特征是胞浆内含有高浓度以囊泡形式存在的细胞毒性颗粒。CTL细胞和NK细胞杀伤靶细胞时，毒性颗粒将到达细胞膜并与细胞膜融合(此时CD107a分子会被转运到细胞膜表面)，引起颗粒内容物释放，最终导致靶细胞的死亡。因此，CD107a分子是CTL细胞脱颗粒的一种敏感标志，与细胞毒活性直接相关，通过流式细胞仪检测CD107a的表达水平，以反映T细胞杀伤活性水平。具体步骤如下：

将S15 CAR-CD27 T细胞、S15 CAR T细胞、CTR CAR T细胞分别与人脑胶质瘤细胞U87-MG(ATCC)按细胞个数比为1:1的比例在DMEM培养基中共同培养(每孔中含有2×10⁵个U87-MG)，向共培养体系中加入APC标记的抗CD107a抗体(Biolegend)培养1小时后，再加入Golgi Stop试剂(BD)继续培养3小时，收集细胞。将收集后的细胞进行表面染色和流式细胞仪检测。

结果如图4所示。结果显示：与CTR CAR T细胞相比，S15 CAR T和S15 CAR-CD27 T细胞在与靶细胞共培养后，CD107a的表达水平显著增强。尤其是CD8⁺T细胞亚群(细胞毒性T细胞)，CD107a的阳性率达到80％-90％。

实施例2、CFSE标记法检测CAR-T细胞对肿瘤细胞特异性杀伤作用

CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。可以利用CFSE标记活细胞的原理对肿瘤细胞进行标记和定量，从而检测CAR-T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效率。具体方法为：靶细胞等量分成两个组，调整至相同的细胞密度。分别用低浓度和高浓度CFSE染色，其中高浓度染色的靶细胞与不染色的免疫细胞按照一定比例共培养。孵育一段时间后，将高浓度染色的靶细胞管(连同免疫细胞)与低浓度染色的靶细胞管等量混合。最后，通过比较CFSE低浓度标记组和CFSE高浓度标记组的靶细胞百分比，计算CAR T细胞对靶细胞的杀伤率。具体步骤如下：

1、将对数期的U87-MG细胞用胰酶消化，完全培养基中止。吹打细胞，并转移到15ml离心管中，用PBS洗2遍。

2、300-500g离心1-5min，去上清。用PBS重悬细胞，调整细胞密度至(1-2)×10⁷个/ml。

3、将细胞密度为(1-2)×10⁷个/ml的U87-MG细胞悬液等量分成两份，一份记作CFSE高标记细胞，另一份记作CFSE低标记细胞。CFSE低标记细胞用低浓度CFSE(0.5μM)染色，CFSE高标记细胞用高浓度CFSE(5μM)标记。染色方法具体如下：在管内按照既定浓度加入CFSE染料(Invitrogen)，避光37℃孵育10min。

4、加入至少2倍体积冷的完全培养基终止标记，300-500g离心5min。

5、去上清，收集细胞沉淀，用完全培养基洗2遍。

6、将染色的U87-MG接种至96孔板中，CFSE高标记组(CFSE高标记细胞+T细胞)：每个孔接种U87-MG细胞(5×10⁴个/100μl)，加入不同数量的CAR-T细胞(S15 CAR-CD27 T细胞、S15 CAR T细胞或CTR CAR T细胞)，使CAR-T细胞与U87-MG细胞的个数比分别为1:1、1:3、1:9、1:27；CFSE低标记组(只有CFSE低标记细胞)：每个孔接种U87-MG细胞(5×10⁴个/100μl)单独培养，并用完全培养基补足至相同体积。同时设置未与T细胞共培养的CFSE高标记细胞孔作为对照组。

7、37℃孵育6小时后，CFSE高标记组与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作实验组混合细胞。同时收集对照组(只有CFSE高标记细胞)与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作对照组混合细胞。

8、流式上机，检测各个组FITC单通道的荧光值(图2)。

9、靶细胞裂解率分析：流式上机后，应检测出两个FITC阳性峰，分别是CFSE高标记和低标记细胞峰，测得CFSE高标记组和标记组靶细胞比例。然后按照以下公式计算T细胞对靶细胞杀伤率(％)：

T细胞对靶细胞的杀伤率(％)＝100％-[(实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/实验组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)/(对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/对照组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)]×100％。

例如，测得实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比42.5％，CFSE低标记细胞占比57.5％；测得对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比49.5％，CFSE低标记细胞占比51.5％，那么特异性裂解率(％)＝100％-(42.5％/57.5％)/(49.5％/51.5％)×100％。

实验结果如图5和表1所示。结果显示：使用S15 CAR-CD27 T细胞和靶细胞U87-MG按照不同效靶比共培养后，在效靶比为1:1时，细胞裂解率达到80％以上；效靶比为1:27时，细胞裂解率仍有20％左右。

表2、CAR T细胞的细胞裂解率(％)

实施例3、肿瘤移植模型检测CAR-T细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用

实验材料：5-6周龄、体重为18-22g的B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠(百奥赛图基因生物技术有限公司)。

实验分组：将实验材料随机分为3个实验组，每组各5只小鼠。每组处理方法具体如下：

S15 CAR-CD27 T：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠尾静脉接种U87-MG肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含2×10⁶个肿瘤细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的S15 CAR-CD27 T细胞溶液(溶剂为PBS)，S15 CAR-CD27 T细胞注射量为0.2ml(含5×10⁶个S15 CAR-CD27 T细胞)。

S15 CAR T：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠尾静脉接种U87-MG肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含2×10⁶个肿瘤细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的S15 CAR T细胞溶液(溶剂为PBS)，S15 CAR T细胞注射量为0.2ml(含5×10⁶个S15 CAR T细胞)。

CTR CAR T：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠尾静脉接种U87-MG肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含2×10⁶个肿瘤细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的CTR CAR T细胞溶液(溶剂为PBS溶液)，CTR CAR T细胞注射量为0.2ml(含5×10⁶个CTR CAR T细胞)。

实验方法：在注射CAR-T细胞之后的42天之内，每三天测量一次小鼠肿瘤直径。统计各个时间点的肿瘤直径并作图。在注射CAR-T细胞之后的90天之内，统计小鼠的存活数量，绘制存活曲线。

结果如图6和图7所示。结果显示：与S15 CAR-T对照组相比，S15 CAR-CD27 T组小鼠体内的U87-MG细胞残留明显减少。说明S15 CAR-CD27 T细胞杀伤肿瘤的效果更好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江康佰裕生物科技有限公司

<120> 一种嵌合抗原受体T淋巴细胞及其在制备治疗实体肿瘤的产品中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3501

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacattg tgctgaccca gagccccgcc ctggctgtga gcctgggaca gagagccacc 120

atcagctgca gagcctccca gagcgtgacc atcagcggat acagctttat ccactggtat 180

cagcagaagc ccggccagca gcctagactg ctgatctaca gagctagcaa cctggcctcc 240

ggcatccccg ccagattctc aggaagcggc agcggcaccg actttaccct gactatcaac 300

cccgtgcagg ctgacgacat cgccacctac ttctgccagc agtcccgcaa aagcccctgg 360

accttcgccg gcggcaccaa actggagctg agaagaaccg gcggcggggg ttctggtggc 420

ggcggcagcg gcggtggagg atcagaggtg cagattctgg agaccggagg cggactggtg 480

aagccaggag gaagcctgag actgagctgt gccacaagcg gattcaactt taatgattac 540

tttatgaact gggtgaggca ggctcccgag aagggcctgg agtgggtggc ccagattaga 600

aacaagatct acacctacgc caccttctat gccgagagcc tggagggcag agtgaccatc 660

agcagagatg atagcgagtc aagcgtgtac ctgcaggtga gcagcctgag agccgaagac 720

accgccatct actactgcac caggagcctg accggaggcg actacttcga ttactgggga 780

cagggggtga tggtgaccgt gagtagcact acaactccag cacccagacc ccctacacct 840

gctccaacta tcgcaagtca gcccctgtca ctgcgccctg aagcctgtcg ccctgctgcc 900

gggggagctg tgcatactcg gggactggac tttgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960

ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaggttc 1020

agtgtcgtga agagaggccg gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc tttcatgagg 1080

cccgtgcaga ctacccagga ggaagatgga tgcagctgta gattccctga agaggaggaa 1140

ggaggctgtg agctgagagt gaagttctcc cgaagcgcag atgccccagc ctatcagcag 1200

ggacagaatc agctgtacaa cgagctgaac ctgggaagac gggaggaata cgatgtgctg 1260

gacaaaaggc ggggcagaga tcctgagatg ggcggcaaac caagacggaa gaacccccag 1320

gaaggtctgt ataatgagct gcagaaagac aagatggctg aggcctactc agaaatcggg 1380

atgaagggcg aaagaaggag aggaaaaggc cacgacggac tgtaccaggg gctgagtaca 1440

gcaacaaaag acacctatga cgctctgcac atgcaggctc tgccaccaag acgagctaaa 1500

cgaggctcag gcgcgacgaa ctttagtttg ctgaagcaag ctggggatgt agaggaaaat 1560

ccgggtccca tgttgctcct tgtgacgagc ctcctgctct gcgagctgcc ccatccagcc 1620

ttcctcctca tcccgcggaa ggtgtgcaat ggcataggca ttggcgagtt taaagattct 1680

ctgagcataa atgctacgaa tattaagcat ttcaagaatt gtacttctat tagtggcgac 1740

ctccatattc ttccggttgc cttcaggggt gactctttca cccacacacc tccattggat 1800

ccacaagaac ttgacatcct gaagacggtt aaagagatta caggcttcct ccttatccaa 1860

gcgtggcccg agaacagaac ggacttgcac gcctttgaga acctcgaaat aatacggggt 1920

cggacgaagc aacacggcca atttagcctt gcggttgtta gtctgaacat tacttctctc 1980

ggccttcgct ctttgaaaga aatcagcgac ggagatgtca tcattagtgg aaacaagaac 2040

ctgtgctacg cgaacacaat caactggaag aagctcttcg gtacttcagg ccaaaagaca 2100

aagattatta gtaacagagg agagaatagc tgtaaggcta ccggacaagt ttgtcacgcc 2160

ttgtgtagtc cagagggttg ctggggaccg gaaccaaggg attgcgtcag ttgccggaac 2220

gtgagtcgcg gacgcgagtg tgtggataag tgcaatcttc tggaagggga accgcgagag 2280

tttgtagaaa attccgaatg tatacagtgt catcccgagt gtcttccaca agcaatgaat 2340

atcacatgta cagggagggg tcctgataac tgtatccaat gtgcacacta catagatggt 2400

cctcactgtg taaagacgtg ccccgccgga gtaatgggtg aaaacaacac cctcgtgtgg 2460

aagtacgccg atgccgggca tgtctgtcat ttgtgtcatc ccaactgcac atatggctgt 2520

accggtcctg gattggaggg ctgtccaaca aacgggccga aaataccgag tatcgcaaca 2580

ggcatggtgg gagcactttt gcttctcctc gttgtcgccc tgggcatcgg cttgttcatg 2640

cgagctaaac gaggctcagg cgcgacgaac tttagtttgc tgaagcaagc tggggatgta 2700

gaggaaaatc cgggtcccat ggccagaccc cacccctggt ggctgtgcgt gctgggaacc 2760

ctggtgggcc tgtctgccac ccccgctcct aagagctgcc ccgagagaca ctactgggcc 2820

cagggcaagc tgtgctgcca gatgtgcgaa cccggcacct ttctggtgaa agattgcgat 2880

cagcatagaa aggccgccca gtgtgacccc tgcatccccg gagtgagctt cagcccagac 2940

catcacacca ggccccactg cgagagctgc agacactgca acagtggcct gctggtgaga 3000

aactgcacaa ttacagccaa cgctgagtgc gcctgcagaa atggatggca gtgcagagac 3060

aaggagtgca ccgaatgcga ccccctgccc aaccccagcc tgacagcccg aagcagccag 3120

gccctgagcc cccatcccca gcctacccac ctgccctacg tgagtgagat gctggaagcc 3180

agaaccgccg gccacatgca gaccctggcc gacttcagac agctgcccgc cagaaccctg 3240

agcacccact ggccccccca gagaagcctg tgcagcagcg actttatcag aatcctggtg 3300

atcttctctg gcatgttcct ggtgtttaca ctggccggcg ccctgtttct gcaccagaga 3360

cgcaagtacc gcagcaacaa gggagaaagc cccgtggagc ccgctgagcc ctgcagatac 3420

tcctgcccca gagaggagga gggcagcacc attcccatcc aggaggacta cagaaaaccc 3480

gagcccgcct gcagcccatg a 3501

<210> 2

<211> 1166

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Gln Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Asn Pro Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Arg Lys Ser Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Leu Arg Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Ile Leu Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val

145 150 155 160

Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn

165 170 175

Phe Asn Asp Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Ile Tyr Thr Tyr Ala Thr

195 200 205

Phe Tyr Ala Glu Ser Leu Glu Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asp

210 215 220

Ser Glu Ser Ser Val Tyr Leu Gln Val Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp

225 230 235 240

Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Leu Thr Gly Gly Asp Tyr Phe

245 250 255

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

275 280 285

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

290 295 300

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

305 310 315 320

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

325 330 335

Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

340 345 350

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

355 360 365

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

370 375 380

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

385 390 395 400

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

405 410 415

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

420 425 430

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

435 440 445

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

450 455 460

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

465 470 475 480

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

485 490 495

Arg Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys

500 505 510

Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val

515 520 525

Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile

530 535 540

Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser

545 550 555 560

Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser

565 570 575

Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser

580 585 590

Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys

595 600 605

Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu

610 615 620

Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly

625 630 635 640

Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn

645 650 655

Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp

660 665 670

Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn

675 680 685

Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser

690 695 700

Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala

705 710 715 720

Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val

725 730 735

Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn

740 745 750

Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile

755 760 765

Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr

770 775 780

Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly

785 790 795 800

Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn

805 810 815

Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys

820 825 830

His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys

835 840 845

Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly

850 855 860

Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met

865 870 875 880

Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln

885 890 895

Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Arg Pro His Pro

900 905 910

Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val Gly Leu Ser Ala Thr Pro

915 920 925

Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln Gly Lys Leu

930 935 940

Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys Asp Cys Asp

945 950 955 960

Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro Cys Ile Pro Gly Val Ser

965 970 975

Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His Cys Glu Ser Cys Arg His

980 985 990

Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys Thr Ile Thr Ala Asn Ala

995 1000 1005

Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys Arg Asp Lys Glu Cys

1010 1015 1020

Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu Thr Ala Arg Ser

1025 1030 1035

Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His Leu Pro Tyr

1040 1045 1050

Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr

1055 1060 1065

Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr His

1070 1075 1080

Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile

1085 1090 1095

Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly

1100 1105 1110

Ala Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly

1115 1120 1125

Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro

1130 1135 1140

Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg

1145 1150 1155

Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

1160 1165

<210> 3

<211> 2643

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacattg tgctgaccca gagccccgcc ctggctgtga gcctgggaca gagagccacc 120

atcagctgca gagcctccca gagcgtgacc atcagcggat acagctttat ccactggtat 180

cagcagaagc ccggccagca gcctagactg ctgatctaca gagctagcaa cctggcctcc 240

ggcatccccg ccagattctc aggaagcggc agcggcaccg actttaccct gactatcaac 300

cccgtgcagg ctgacgacat cgccacctac ttctgccagc agtcccgcaa aagcccctgg 360

accttcgccg gcggcaccaa actggagctg agaagaaccg gcggcggggg ttctggtggc 420

ggcggcagcg gcggtggagg atcagaggtg cagattctgg agaccggagg cggactggtg 480

aagccaggag gaagcctgag actgagctgt gccacaagcg gattcaactt taatgattac 540

tttatgaact gggtgaggca ggctcccgag aagggcctgg agtgggtggc ccagattaga 600

aacaagatct acacctacgc caccttctat gccgagagcc tggagggcag agtgaccatc 660

agcagagatg atagcgagtc aagcgtgtac ctgcaggtga gcagcctgag agccgaagac 720

accgccatct actactgcac caggagcctg accggaggcg actacttcga ttactgggga 780

cagggggtga tggtgaccgt gagtagcact acaactccag cacccagacc ccctacacct 840

gctccaacta tcgcaagtca gcccctgtca ctgcgccctg aagcctgtcg ccctgctgcc 900

gggggagctg tgcatactcg gggactggac tttgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960

ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaggttc 1020

agtgtcgtga agagaggccg gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc tttcatgagg 1080

cccgtgcaga ctacccagga ggaagatgga tgcagctgta gattccctga agaggaggaa 1140

ggaggctgtg agctgagagt gaagttctcc cgaagcgcag atgccccagc ctatcagcag 1200

ggacagaatc agctgtacaa cgagctgaac ctgggaagac gggaggaata cgatgtgctg 1260

gacaaaaggc ggggcagaga tcctgagatg ggcggcaaac caagacggaa gaacccccag 1320

gaaggtctgt ataatgagct gcagaaagac aagatggctg aggcctactc agaaatcggg 1380

atgaagggcg aaagaaggag aggaaaaggc cacgacggac tgtaccaggg gctgagtaca 1440

gcaacaaaag acacctatga cgctctgcac atgcaggctc tgccaccaag acgagctaaa 1500

cgaggctcag gcgcgacgaa ctttagtttg ctgaagcaag ctggggatgt agaggaaaat 1560

ccgggtccca tgttgctcct tgtgacgagc ctcctgctct gcgagctgcc ccatccagcc 1620

ttcctcctca tcccgcggaa ggtgtgcaat ggcataggca ttggcgagtt taaagattct 1680

ctgagcataa atgctacgaa tattaagcat ttcaagaatt gtacttctat tagtggcgac 1740

ctccatattc ttccggttgc cttcaggggt gactctttca cccacacacc tccattggat 1800

ccacaagaac ttgacatcct gaagacggtt aaagagatta caggcttcct ccttatccaa 1860

gcgtggcccg agaacagaac ggacttgcac gcctttgaga acctcgaaat aatacggggt 1920

cggacgaagc aacacggcca atttagcctt gcggttgtta gtctgaacat tacttctctc 1980

ggccttcgct ctttgaaaga aatcagcgac ggagatgtca tcattagtgg aaacaagaac 2040

ctgtgctacg cgaacacaat caactggaag aagctcttcg gtacttcagg ccaaaagaca 2100

aagattatta gtaacagagg agagaatagc tgtaaggcta ccggacaagt ttgtcacgcc 2160

ttgtgtagtc cagagggttg ctggggaccg gaaccaaggg attgcgtcag ttgccggaac 2220

gtgagtcgcg gacgcgagtg tgtggataag tgcaatcttc tggaagggga accgcgagag 2280

tttgtagaaa attccgaatg tatacagtgt catcccgagt gtcttccaca agcaatgaat 2340

atcacatgta cagggagggg tcctgataac tgtatccaat gtgcacacta catagatggt 2400

cctcactgtg taaagacgtg ccccgccgga gtaatgggtg aaaacaacac cctcgtgtgg 2460

aagtacgccg atgccgggca tgtctgtcat ttgtgtcatc ccaactgcac atatggctgt 2520

accggtcctg gattggaggg ctgtccaaca aacgggccga aaataccgag tatcgcaaca 2580

ggcatggtgg gagcactttt gcttctcctc gttgtcgccc tgggcatcgg cttgttcatg 2640

tga 2643

<210> 4

<211> 2634

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctagctacg tgctgaccca gcccccctcc gtgagcgtgg cacctggaaa aacagccaga 120

atctcctgcg gaggaaacaa catcggaacc aagaacgtgc actggtacca gcagaaaccc 180

ggacaggccc ccgtgctggt ggtgtacgcc gacagcgacc gccccagcgg aatcccagag 240

agattcagcg gcagcaacag cggaaacacc gccaccctga ccatcagcag agtggaagtg 300

ggagacgaag ccgactatta ttgccaggtg tgggactccg tgagctatca cgtggtgttc 360

ggcggaggaa caacactgac agtgctgggg ggcggcgggg gttctggtgg cggcggcagc 420

ggcggtggag gatcacaggt gcagctggtg gaaagtggcg gcggcgtggt gcagcccgga 480

ggaagcctga gactgagctg cgcccccagc ggcttcgtgt tcagatccta tggcatgcac 540

tgggtgagac agacacctgg caaagggctg gagtgggtga gtctgatttg gcacgacggc 600

agcaaccggt tctacgccga cagcgtgaag ggcagattca ccattagcag agacaacagc 660

aaaaacacac tgtatctgca gatgaacagc ctgagagccg aagacaccgc catgtatttc 720

tgcgctaggg agagactgat cgccgcccct gccgccttcg acctgtgggg acagggcacc 780

ctggtgaccg tgtccagcac tacaactcca gcacccagac cccctacacc tgctccaact 840

atcgcaagtc agcccctgtc actgcgccct gaagcctgtc gccctgctgc cgggggagct 900

gtgcatactc ggggactgga ctttgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960

acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaggtt cagtgtcgtg 1020

aagagaggcc ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ctttcatgag gcccgtgcag 1080

actacccagg aggaagatgg atgcagctgt agattccctg aagaggagga aggaggctgt 1140

gagctgagag tgaagttctc ccgaagcgca gatgccccag cctatcagca gggacagaat 1200

cagctgtaca acgagctgaa cctgggaaga cgggaggaat acgatgtgct ggacaaaagg 1260

cggggcagag atcctgagat gggcggcaaa ccaagacgga agaaccccca ggaaggtctg 1320

tataatgagc tgcagaaaga caagatggct gaggcctact cagaaatcgg gatgaagggc 1380

gaaagaagga gaggaaaagg ccacgacgga ctgtaccagg ggctgagtac agcaacaaaa 1440

gacacctatg acgctctgca catgcaggct ctgccaccaa gacgagctaa acgaggctca 1500

ggcgcgacga actttagttt gctgaagcaa gctggggatg tagaggaaaa tccgggtccc 1560

atgttgctcc ttgtgacgag cctcctgctc tgcgagctgc cccatccagc cttcctcctc 1620

atcccgcgga aggtgtgcaa tggcataggc attggcgagt ttaaagattc tctgagcata 1680

aatgctacga atattaagca tttcaagaat tgtacttcta ttagtggcga cctccatatt 1740

cttccggttg ccttcagggg tgactctttc acccacacac ctccattgga tccacaagaa 1800

cttgacatcc tgaagacggt taaagagatt acaggcttcc tccttatcca agcgtggccc 1860

gagaacagaa cggacttgca cgcctttgag aacctcgaaa taatacgggg tcggacgaag 1920

caacacggcc aatttagcct tgcggttgtt agtctgaaca ttacttctct cggccttcgc 1980

tctttgaaag aaatcagcga cggagatgtc atcattagtg gaaacaagaa cctgtgctac 2040

gcgaacacaa tcaactggaa gaagctcttc ggtacttcag gccaaaagac aaagattatt 2100

agtaacagag gagagaatag ctgtaaggct accggacaag tttgtcacgc cttgtgtagt 2160

ccagagggtt gctggggacc ggaaccaagg gattgcgtca gttgccggaa cgtgagtcgc 2220

ggacgcgagt gtgtggataa gtgcaatctt ctggaagggg aaccgcgaga gtttgtagaa 2280

aattccgaat gtatacagtg tcatcccgag tgtcttccac aagcaatgaa tatcacatgt 2340

acagggaggg gtcctgataa ctgtatccaa tgtgcacact acatagatgg tcctcactgt 2400

gtaaagacgt gccccgccgg agtaatgggt gaaaacaaca ccctcgtgtg gaagtacgcc 2460

gatgccgggc atgtctgtca tttgtgtcat cccaactgca catatggctg taccggtcct 2520

ggattggagg gctgtccaac aaacgggccg aaaataccga gtatcgcaac aggcatggtg 2580

ggagcacttt tgcttctcct cgttgtcgcc ctgggcatcg gcttgttcat gtga 2634

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其依次包括抗Siglec-15单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人CD27。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体依次包括人CD8先导肽、抗Siglec-15单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、CSF2Ra信号肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人CD27；

或，所述自切割肽为P2A肽；

或，所述嵌合抗原受体为如下A1)-A3)中的任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

3.与权利要求1或2所述的嵌合抗原受体相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系；

B6)含有B2)所述表达盒的细胞系；

B7)含有B3)所述重组载体的细胞系；

B8)含有B4)所述重组载体的细胞系。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下C1)-C3)任一所示的基因：

C1)其编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；

C2)与C1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的DNA分子；

C3)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的DNA分子。

5.一种CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述嵌合抗原受体的编码基因通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中；

或，将权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达的方法为方法(一)或方法(二)：

所述方法(一)包括如下步骤：用逆转录病毒感染T细胞；所述逆转录病毒是将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组逆转录病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体中得到的；

7.按照权利要求5或6所述的方法制备得到的CAR-T细胞；

或，权利要求6中所述的逆转录病毒；

或，权利要求6中所述的重组逆转录病毒载体；

或，权利要求6中所述的慢病毒；

或，权利要求6中所述的重组慢病毒载体。

8.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体或权利要求3或4所述的生物材料或权利要求7所述的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体在生产或制备CAR-T细胞中的应用；

或，权利要求1或2所述的嵌合抗原受体或权利要求3或4所述的生物材料或权利要求7所述的CAR-T细胞或逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体在制备治疗或辅助治疗实体肿瘤的产品中的应用。

9.一种治疗或辅助治疗实体肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1或2所述的嵌合抗原受体或权利要求3或4所述的生物材料或权利要求7所述的CAR-T细胞或逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体。

10.根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述实体肿瘤为Siglec-15阳性的实体肿瘤；

或，所述Siglec-15阳性的实体肿瘤包括脑胶质瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、肺癌、肾癌、直肠癌、子宫内膜癌和甲状腺癌。