CN112851826A - Upk2嵌合抗原受体及其尿道癌的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗癌症的组合物和方法，属于癌症治疗领域。所述的组合物包括修饰的细胞，修饰的细胞可以包括编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，其中所述的CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述的CAR结合氨基酸序列SEQ ID NO：5，并且其中细胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：8、9、14或15。

Description

UPK2嵌合抗原受体及其尿道癌的治疗

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，具体涉及一种UPK2嵌合抗原受体(CAR)及其应用。

背景技术

癌症涉及异常细胞生长，并有可能侵入或扩散到身体的其他部位。癌细胞脱落后，它们 就会通过血液和/或淋巴系统扩散到整个身体，从而威胁生命。尽管T细胞疗法对血液肿瘤具 有很强的抗肿瘤活性，但它在治疗实体瘤方面仍面临挑战。

发明内容

本公开涉及修饰的细胞含有编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，其中所述的CAR包 含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，所述的CAR结合氨基酸序列SEQ ID NO：5， 并且其中细胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12；其中，CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11， 或SEQ ID NO:13。

本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所 要求保护的主题的范围。

附图说明

参照附图描述具体实施方式，在不同附图中使用相同的参考数字表示类似或相同的项目。

图1显示了T细胞对Uroplakin-2(UPK2)CAR的表达。

图2显示了与UPK2阳性细胞共培养的UPK2 CAR T细胞的流式结果。

图3显示了与UPK2阳性细胞共培养的UPK2 CAR T细胞的增殖情况。

图4显示了与UPK2阳性细胞共培养的UPK2 CAR T细胞释放的细胞因子。

图5显示了UPK2抗原在293T细胞上的瞬时转导。

图6显示了表达UPK2抗原的细胞的流式结果。

图7显示了表达UPK2抗原的细胞的流式结果。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术 人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些 类似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本公开的目的，以下术 语定义如下。

本文使用冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个) 该冠词的语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。

所谓“约”是指数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，相差多达 20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如本文所用，术语“活化”是指已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞的状态。活 化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。术语“活化的T细胞”特别指 正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆 抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性 或功能。本公开中的抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab 和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的 其他实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体 片段形成的多特异性抗体。

术语“Fv”是指含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结 合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高 变环(每个来自H和L链的3个环)，其贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结 合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括对抗原特异的三个互补决定区(CDR)的 Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点(二聚体)。

术语“抗体重链”是指存在于所有抗体分子中的天然存在的构象中的两种类型的多肽链中 较大的一种。术语“抗体轻链”是指存在于所有抗体分子中的天然存在的构象中的两种类型的 多肽链中较小的一种。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。该术语 还包括通过合成编码抗体的DNA分子和表达DNA分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸 而产生的抗体。使用本领域可获得且众所周知的技术可获得合成DNA。

术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，其可以涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活 化或两者。抗原包括任何大分子，包括所有蛋白质或肽，或来源于重组或基因组DNA的分 子。例如，包含编码引起免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因 此编码如本文所用的术语“抗原”。抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。可以从包括 组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体的生物样品产生，合成或衍生。

术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、肿瘤细胞 增殖减少、肿瘤细胞存活减少、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加，或与癌症相关的各 种生理症状的改善有关的生物学作用。“抗肿瘤作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体 在预防肿瘤发生方面的能力来表现。

术语“自体抗原”指的是由免疫系统错误识别为外源的抗原。自体抗原包括细胞蛋白质、 磷蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“自体”用于描述源自受试者的材料，随后将其重新引入相同的受试者。

术语“同种异体”用于描述来源于相同物种的不同受试者的移植物。作为例子，供体受试 者可以是与受体受试者相关或不相关的，但供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标 记。

术语“异种”用于描述源自不同物种的受试者的移植物。例如，供体受试者来自与受体受 试者不同的物种，供体受试者和受体受试者可以在遗传上和免疫学上不相容。

术语“癌症”用于指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部 扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌、前列腺癌、 卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺 癌等。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为 暗示包括所述步骤或元件或步骤或元件的组，但不排除任何其他步骤或元素或步骤或元素的 组。

短语“由...组成”意味着包括并且限于在短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由... 组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其他元素。

短语“基本上由......组成”意味着包括在该短语之后列出的任何元素，并且可以包括不干扰 或不影响本公开中针对所列元素指定的活动或动作的其他元素。因此，短语“基本上由......组 成”表示所列出的元素是必需的或强制性的，但是其他元素是任选的，并且可以存在或不存在， 这取决于它们是否影响所列元素的活动或动作。

术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如， 序列“AGT”与序列“TCA”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基 配对规则匹配，或者在核酸之间可以存在“完全的”或“全部的”互补性。核酸链之间的互补程 度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。

术语“对应”或“对应于”是指(a)具有与参考肽或蛋白质中的多核苷酸序列的全部或一部 分基本上相同或互补或编码与氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(b) 具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号之外的信号，其介导T细胞应答，包括增殖、活化、分化 和其他中的至少一种细胞反应。共刺激配体可包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、 PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、 CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、 ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配 体。共刺激配体尤其还包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，例如 CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、 CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此 介导T细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子、BTLA和Toll样受体。

术语“共刺激信号”是指信号，其与主要信号(例如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。

术语“疾病”和“病症”可以互换使用，或者可以是不同的，因为特定的疾病或病症可能没 有已知的致病因子(因此病因尚未解决)，因此尚未被认识到作为一种疾病，但仅作为不良状 况或综合征，其中临床医生已经确定了或多或少特定的一组症状。术语“疾病”是受试者的健 康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则受试者的健康继续恶 化。相反，受试者中的“病症”是动物能够维持体内平衡的健康状态，但其中动物的健康状态 不如没有病症时的健康状态。如果不及时治疗，疾病并不一定会导致动物的健康状况进一步 下降。

术语“有效”是指足以实现期望的，预期的或预期的结果。例如，治疗中的“有效量”可以 是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因、cDNA或mRNA，用作生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，具有任何定义的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因 的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链， 其核苷酸序列与mRNA序列相同(除了“T”被“U”代替)并且通常在序列表中提供，并且非编 码链用作模板对于基因或cDNA的转录，可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

术语“外源性”是指在野生型细胞或生物中不天然存在但通常通过分子生物学技术引入细 胞的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体，质粒和/或人造核酸构建体。关 于多核苷酸和蛋白质，术语“内源性”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发 现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。而且，从第一生物体中分离并通过分子生物学技术 转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是关于第二生物体的“外源”多核苷酸或氨 基酸序列。在具体的实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有 这种多核苷酸序列的微生物中，例如以产生另外天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外 的拷贝，并且由此有助于过表达编码的多肽。

术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷 酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于 表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的 所有载体，如掺入重组多核苷酸的粘粒，质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例 如慢病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)。

病毒可用于在体外和体内(受试者中)将核酸递送到细胞中。可用于将核酸递送到细胞 中的病毒的例子包括：逆转录病毒，腺病毒，单纯疱疹病毒，牛痘病毒和腺伴随病毒。

还存在用于将核酸递送到细胞中的非病毒方法，例如电穿孔，基因枪，声穿孔，磁转染， 以及使用寡核苷酸，脂复合物，树状聚合物和无机纳米颗粒。

术语“同源的”是指两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，当两 个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个多肽中的每一 个中的位置。DNA分子被腺嘌呤占据，然后分子在该位置同源。两个序列之间的同源性百分 比是两个序列共有的匹配或同源位置数除以相比的位置数×100的函数。例如，如果两个序列 中10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么这两个序列是60％同源的。举例来说，DNA 序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。当两个序列比对以产生最大同源性时进行比 较。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指一类起抗体作用的蛋白质。包括在这类蛋白质中的五个成员 是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于体内分泌物中的一级抗体，例如唾液、泪液、 母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是 大多数受试者在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白，它是凝集、补体结合和其他抗体反 应中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面是重要的。IgD是没有已知的抗体功 能但可以作为抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过在暴露于过敏原时从肥大细胞和嗜碱性粒 细胞释放介质而介导即时超敏反应的免疫球蛋白。

术语“分离的”是指基本上或基本上不含通常伴随其天然状态的组分的材料。该材料可以 是细胞或大分子，如蛋白质或核酸。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”是指已经从天然 存在状态的侧翼序列中纯化的多核苷酸，例如已经从通常是正常序列中去除的DNA片段与 片段相邻。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞 环境的体外分离和/或纯化，以及与其他组分细胞。

术语“基本上纯化的”是指基本上不含通常与其天然状态相关的组分的物质。例如，基本 上纯化的细胞是指已经与其通常以其天然存在或天然状态相关联的其他细胞类型分离的细胞。 在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同源的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与 天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在某些实施方案中，细胞在体外培养。在某些实施 方案中，细胞不在体外培养。

在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的 是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，以及“U”指的是尿苷。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并版本并且编码相同的 氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，在一 定程度上编码蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含(一个或多个)内含子。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在能够感染非分裂细胞的逆转录病毒 中是独特的；它们可以将大量的遗传信息输送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送 载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。来自慢病毒的载体提供了实 现显著水平的体内基因转移的手段。

术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的受试者中的反应水平相比，调节受试者中反应 水平的可检测增加或减少，和/或与在其他方面相同但未经处理的主题中的回应。该术语包括 扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导受试者，优选人的有益治疗反应。

当核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，它是“可操作地连接”的。例如，如果将前 序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连 接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体 结合位置被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。

术语“在转录控制下”是指与多核苷酸有效连接并处于正确位置和方向的启动子，以控制 RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

术语“过表达”的肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示肿瘤抗原在来自疾病区域的细 胞中的异常表达水平，所述疾病区域例如患者相关的特定组织或器官内的实体肿瘤到来自该 组织或器官的正常细胞中的表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有肿瘤抗原 过表达的以实体瘤或血液恶性肿瘤为特征的患者。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同 类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤(如肉瘤和癌) 的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮 瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌 症、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、 肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱 癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤))、胶质母 细胞瘤(又称多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母 细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶 质瘤、血管瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤。

组合物的术语“肠胃外施用”包括例如皮下(sc)、静脉内(iv)、肌内(im)、胸骨内注射 或输注技术。

术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适用于本文所述方法 的任何人、动物或生物体。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。 在实施方案中，术语“受试者”旨在包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。 受试者的实例包括人和动物，如狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

需要治疗或有此需要的受试者包括患有需要治疗的疾病、病症或病状的受试者。有此需 要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病症或病状的受试者。

术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通 常是指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示出实质序列同一性的多核 苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加、缺 失或取代至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和 “变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸置换的多核苷酸。就这一 点而言，本领域众所周知的是，可以对参照多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代的某 些改变，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能或活性或具有与参考多核苷酸 的关系(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与参考多核苷酸序列具有至少50％(以及至少 51％至至少99％以及所有整数百分比之间，例如90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸 本文所述的术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直向同源物。

术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合 物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸 残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存 在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化(即增加各种化学反应的速率)的 酶促多肽或“酶”。

术语“多肽变体”是指通过添加、缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分 的多肽。在某些实施方案中，通过一个或多个取代将多肽变体与参考多肽区分开来，所述取 代可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变体包含保守取代，并且就此而言， 本领域中熟知可以将一些氨基酸改变为具有广泛相似性质的氨基酸，而不改变多肽活性的性 质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或被不同氨基酸残基置换的多肽。

术语“启动子”是指由启动多核苷酸序列特异性转录所需的细胞合成机器或引入的合成机 器识别的DNA序列。术语“表达控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列 所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子，任选的操纵子序列和 核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

术语“结合”，或“与...相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中的第二分子但基本上不 识别或粘附于样品中的其他结构上不相关的分子的分子。如本文关于抗体所用的术语“特异性 结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合 来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨物种反应 性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以 结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异 性。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化 学物质的相互作用，以表示相互作用取决于化学物质的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)， 例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性， 则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在 将减少与抗体结合的标记A的量。

“统计上显著”意味着结果不可能偶然发生。统计显著性可通过本领域已知的任何方法确 定。常用的重要度量包括p值，即如果零假设为真，观察事件将发生的频率或概率。如果获 得的p值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单的情况下，显著性水平定义为p值为0.5 或更小。“降低”或“减少”量通常是“统计学上显著的”或生理学上显著的量，并且可以包括减 少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括所有整数和介于1和 大于1之间的小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的本文所述的数量或水平。

术语“刺激”是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级 应答，由此介导信号转导事件，例如经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组。

术语“刺激分子”是指特异性结合存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体的T细胞上的分 子。例如，源自刺激分子的功能性信号传导结构域是与T细胞受体复合物相关的ζ链。

术语“刺激性配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上时，可以与细胞(例如T细胞)上的同源结合配偶体(在本文中称为作为“刺激分子”)特异 性结合的配体，从而介导T细胞的主要反应，包括活化、启动免疫应答、增殖和类似过程。 刺激性配体在本领域中是公知的，并且尤其包括装载有肽、抗CD3抗体、超级激动剂抗CD28 抗体和超级激动剂抗CD2抗体的MHC I类分子。

术语“治疗”是指治疗和/或预防。治疗效果通过抑制、缓解或根除疾病状态或减轻疾病状 态症状而获得。

术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或另一临床医生正在寻求的组织、 系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预 防所治疗的病症或疾病的一种或多种症状或症状的发展或在一定程度上减轻所述病症或疾病 的一种或多种症状或症状的量的化合物。治疗有效量将取决于待治疗的受试者的化合物、疾 病及其严重程度和年龄、体重等而变化。

术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重 程度。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染 的细胞”或“转化的细胞”或“转导的细胞”是已经用外源核酸转染，转化或转导的细胞。细胞包 括主要受试细胞及其后代。

术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。 本领域已知许多载体，包括线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病 毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还包括促进核酸转移到细胞中的 非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括腺病毒载体、 腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转 录病毒基因gag、pol和env之外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本 领域熟知的。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒 SIV。通过多次减毒HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef 被删除，使得载体在生物学上是安全的。

范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式给出。应当理解，范围格式 的描述仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本公开的范围的硬性限制。因此，范围 的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如， 范围的描述诸如从1至6应被认为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、 从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点都是适用的。

“嵌合抗原受体(CAR)”分子是重组多肽，其至少包括细胞外结构域、跨膜结构域和细 胞质结构域或细胞内结构域。在实施方案中，CAR的结构域位于相同的多肽链上，例如嵌合 融合蛋白。在实施方案中，CAR的结构域位于不同的多肽链上，例如结构域不是连续的。

CAR分子的细胞外结构域包括抗原结合结构域。抗原结合结构域用于扩增和/或维持修饰 的细胞，例如CAR T细胞；或用于杀死肿瘤细胞，例如实体瘤。在实施方案中，用于扩增和 /或维持修饰的细胞的抗原结合结构域结合WBC表面上的抗原，例如细胞表面分子或标志物。 在实施方案中，WBC是GMP(粒细胞巨噬细胞前体)，MDP(单核细胞巨噬细胞/树突细胞 前体)，cMoP(普通单核细胞前体)，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞，SatM(含 七叶形核的非典型单核细胞)，巨噬细胞，单核细胞，CDP(常规树突状细胞前体)，cDC(常 规DC)，pDC(浆细胞样DC)，CLP(常规淋巴细胞前体)，B细胞，ILC(先天淋巴细胞)， NK细胞，巨核细胞，成肌细胞，原-骨髓细胞，骨髓细胞，元–骨髓细胞，带状细胞，淋巴母 细胞，原淋巴细胞，单核细胞，巨核细胞，原核细胞，巨核细胞，血小板或MSDC(髓样来 源的抑制细胞)其中一种或组合。在实施方案中，WBC是粒细胞，单核细胞和/或淋巴细胞。 在实施方案中，WBC是淋巴细胞，例如B细胞。在实施方案中，WBC是B细胞。在实施方 案中，B细胞的细胞表面分子包括CD19，CD22，CD20，BCMA，CD5，CD7，CD2，CD16， CD56，CD30，CD14，CD68，CD11b，CD18，CD169，CD1c，CD33，CD38，CD138，或 CD13。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19，CD20，CD22或BCMA。在实施方 案中，B细胞的细胞表面分子是CD19。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD79A。

本文所述的细胞，包括修饰的细胞，例如CAR细胞和修饰的T细胞，可以源自干细胞。 干细胞可以是成体干细胞，胚胎干细胞，更特别地是非人类干细胞，脐带血干细胞，祖细胞， 骨髓干细胞，诱导性多能干细胞，全能干细胞或造血干细胞。修饰的细胞还可以是树状细胞， NK细胞，B细胞，或选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅 助性T淋巴细胞的T细胞。在实施方案中，修饰的细胞可以源自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在扩增和遗传修饰本发明的细胞之前，可以通过多种非限制性方法从受 试者获得细胞来源。T细胞可从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞，骨髓，淋巴 结组织，脐带血，胸腺组织，感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾脏组织和肿瘤。在本发明的实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的T细胞系。在实施方案中，修饰的细胞可以源自健康的供体，诊断为癌症的患者或诊断为感染的患者。在实施方案中，修饰的细胞是表现出不同表型特征的混合细胞群的一部分。

细胞群体是指两个或多个细胞组成的组。群体的细胞可以是相同的，从而群体是同质的 细胞群体。群体的细胞可以是不同的，以使得该群体是细胞的混合群体或异质群体。例如， 混合的细胞群体可以包括包含第一CAR的修饰细胞和包含第二CAR的修饰细胞，其中第一 CAR和第二CAR结合不同的抗原。

术语“干细胞”是指某些具有自我更新能力和分化成其他类型细胞的细胞。例如，干细胞 可产生两个子干细胞(如体外培养的胚胎干细胞)或一个干细胞和经历分化的细胞(如例如 造血干细胞上升到血细胞)。可以基于干细胞的来源和/或它们分化为其他类型细胞的能力范 围来区分不同类别的干细胞。例如，干细胞可以包括胚胎干(ES)细胞(即多能干细胞)， 体细胞干细胞，诱导性多能干细胞和任何其他类型的干细胞。

多能胚胎干细胞存在于胚泡的内部细胞团中，具有先天的分化能力。例如，多能胚胎干 细胞有可能在体内形成任何类型的细胞。当长时间在体外生长时，ES细胞保持多能性，因为 子代细胞保留了多谱系分化的潜力。

体干细胞可以包括胎儿干细胞(来自胎儿)和成年干细胞(存在于各种组织中，例如骨 髓)。这些细胞被认为具有比多能ES细胞低的分化能力(胎儿干细胞的能力大于成年干细胞)。 体干细胞显然分化为有限数量的细胞类型，并被描述为多能干细胞。“组织特异性”干细胞通 常只产生一种细胞。例如，胚胎干细胞可以分化为血液干细胞(例如，造血干细胞(HSC))， 其可以进一步分化为各种血细胞(例如，红细胞，血小板，白细胞等)。

诱导性多能干细胞(即，iPS细胞或iPSC)可以包括通过诱导特定基因的表达而人工衍 生自非多能细胞(例如，成年体细胞)的一种多能干细胞。诱导的多能干细胞在许多方面类 似于天然多能干细胞，例如胚胎干(ES)细胞，例如某些干细胞基因和蛋白质的表达，染色 质甲基化模式，倍增时间，胚状体形成，畸胎瘤形成，可行的嵌合体形成以及效价和可分化 性。诱导的多能细胞可以从成年的胃，肝，皮肤和血细胞中获得。

在实施方案中，用于杀死肿瘤的抗原结合结构域结合肿瘤表面上的抗原，例如肿瘤抗原 或肿瘤标记物。肿瘤抗原是由引起免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质，特别是T细胞介导的 免疫应答。肿瘤抗原是本领域公知的，包括例如肿瘤相关MUC1(tMUC1)，神经胶质瘤相关 抗原，癌胚抗原(CEA)，β-人绒毛膜促性腺激素，甲胎蛋白(AFP)，凝集素反应性AFP，甲状腺球蛋白，RAGE-1，MN-CA IX，人端粒酶逆转录酶，RU1，RU2(AS)，肠道羧基酯 酶，muthsp70-2，M-CSF，前列腺素酶，前列腺特异性抗原(PSA)，PAP，NY-ESO-1，LAGE-1a， p53，prostein，PSMA，Her2/neu，存活蛋白，端粒酶，前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)， MAGE，ELF2M，中性粒细胞弹性蛋白酶，ephrinB2，CD22，胰岛素生长因子(IGF)-I，IGF-II， IGF-I受体，CD19和间皮素。例如，当肿瘤抗原是CD19时，其CAR可以称为CD19CAR， 其是包含结合CD19的抗原结合结构域的CAR分子。

在实施方案中，CAR的细胞外抗原结合结构域包括至少一种scFv或至少单结构域抗体。 例如，CAR上可以有两个scFv。scFv包括通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻 链可变区(VL)和重链可变区(VH)。可以通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制 备单链可变区片段(Bird等，Science 242：423-426，1988)。连接肽的例子是具有氨基酸序 列(GGGGS)₃的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接 约3.5nm。已经设计和使用了其他序列的接头(Bird等，1988，同上)。通常，接头可以是短 的柔性多肽，并且优选包含约20个或更少的氨基酸残基。单链变体可以重组或合成产生。对 于scFv的合成生产，可以使用自动合成器。为了重组产生scFv，可以将含有编码scFv的多 核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞，所述宿主细胞是真核的，例如酵母、植物、昆虫或 哺乳动物细胞；或原核的，例如大肠杆菌。编码目的scFv的多核苷酸可以通过常规操作例如 多核苷酸的连接来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。

本文描述的CAR分子的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个信号 传导结构域。共刺激和信号传导结构域用于响应抗原结合而传递信号并激活分子，例如T细 胞。一个或多个共刺激结构域衍生自刺激分子和/或共刺激分子，并且信号传导结构域衍生自 主要信号传导结构域，例如CD3-ζ结构域。在实施方案中，信号传导结构域还包括衍生自共 刺激分子的一个或多个功能信号传导结构域。在实施方案中，共刺激分子是激活对抗原的细 胞应答所需的细胞表面分子(抗原受体或其配体除外)。

在实施方案中，共刺激结构域包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83 特异性结合的配体的细胞内结构域中任一种或其任何组合。在实施方案中，信号传导结构域 包括衍生自T细胞受体的CD3-ζ结构域。

在实施方案中，CAR的细胞质结构域仅包括一个或多个刺激结构域而没有信号传导结构 域。

CAR分子还包括跨膜结构域。在CAR分子中掺入跨膜结构域使分子稳定。在实施方案 中，CAR分子的跨膜结构域是CD28或4-1BB分子的跨膜结构域。

在细胞外结构域和CAR的跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间 隔结构域”通常是指用于将跨膜结构域连接至多肽链上的细胞外结构域或细胞质结构域的任 何寡肽或多肽。间隔结构域可包括至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25 至50个氨基酸。

本公开内容描述了包含NFAT启动子，编码治疗剂的核苷酸序列和编码缺氧诱导因子1-α (HIF1α)的VHL-相互作用结构域的核苷酸序列的多核苷酸。

本公开内容描述了一种多核苷酸，其包含对应于HIF1α，NFAT，FOXP3或NFkB的启动子，编码治疗剂的核苷酸序列和编码氧敏感性多肽结构域的核苷酸序列。“NFAT启动子”是指 与T细胞表达的任何基因的最小启动子连接的一个或多个NFAT响应元件。在实施方案中， 由T细胞表达的基因的最小启动子是最小人源IL-2启动子。NFAT响应元件可以包括例如 NFAT1，NFAT2，NFAT3和/或NFAT4响应元件。NFAT启动子(或其功能部分或功能变体) 可包含任何数目的结合基序，例如至少两个，至少三个，至少四个，至少五个或至少六个， 至少七个，至少一个八个，至少九个，至少十个，至少十一个或多达十二个绑定主题。在实 施方案中，NFAT启动子包含六个NFAT结合基序。

NFAT启动子(或其功能部分或功能变体)与编码治疗剂(或其功能部分或功能变体) 的核苷酸序列可操作地连接。“有效结合”是指当NFAT蛋白结合至NFAT启动子序列(或其 功能部分或功能变体)时，编码治疗剂(或其功能部分或功能变体)的核苷酸序列被转录为 治疗剂mRNA。不受特定理论的束缚，据信NFAT受钙信号传导途径调节。特别地，认为TCR刺激(例如通过抗原)和/或细胞的钙信号传导途径的刺激(例如通过PMA/伊诺霉素)增加细胞内钙浓度并激活钙通道。NFAT蛋白随后被钙调蛋白脱磷酸化并转移至细胞核，在此与NFAT启动子序列(或其功能部分或功能变体)结合并激活下游基因表达。通过提供与编码治疗剂，例如细胞因子，的核苷酸序列可操作地结合的NFAT启动子(或其功能部分或功能变体)，本发明的核酸有利地，仅当包括核酸的宿主细胞被例如PMA/伊诺霉素和/或抗原刺激时，才有可能表达治疗剂(或其功能部分或功能变体)。可以在美国专利号：8,556,882中找到更多信息，该专利以引用方式并入。

在实施方案中，氧敏感性多肽结构域是HIF1α，HIF3α或包含具有分别与HIF VHL-相 互作用结构域，HIF氨基酸的序列同一性超过80％，90％或95％的氨基酸序列的多肽344-417， 或HIF氨基酸380-603。在实施方案中，氧敏感性多肽结构域包含HIF VHL结合结构域。

在实施方案中，治疗剂包含或为细胞因子。在实施方案中，治疗剂包括或为IL-1P，IL-2， IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ， MIP-ln，MIP-IP，MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任何组合。在实施 方案中，细胞因子包括促炎细胞因子，例如IFN-γ，IL-15，IL-4，IL-10，TNFα，IL-8，IL-5， IL-6，GM-CSF和/或MIP-1α。

本公开内容描述了一种试剂盒，其包含有效量的不含载体的核酸，所述核酸包含任何前 述实施方案的多核苷酸，以提供针对在受试者细胞表面上表达的肿瘤抗原特异性的免疫细胞 群。

本公开内容描述了多核苷酸的方法或用途，该方法包括提供包含载体基因组的病毒颗粒 (例如，AAV，慢病毒或其变体)，所述载体基因组包含所述多核苷酸和编码抗原结合分子的 多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至赋予多核苷酸转录的表达控制元件；向受试者施用 一定量的病毒颗粒，以使多核苷酸在受试者中表达，其中一种或多种分子在癌细胞中过表达， 与免疫细胞的募集有关，和/或与自身免疫有关。在实施方案中，AAV制剂可以包括AAV载 体颗粒，空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供了基本上不含AAV空衣壳的AAV产物。

本公开内容描述了包含多核苷酸的修饰的细胞。在实施方案中，修饰的细胞包含抗原结 合分子，抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞 内信号传导结构域。在实施方案中，与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域选自TSHR，CD19， CD123，CD22，CD30，CD171，CS-1，CLL-1，CD33，EGFRvIII，GD2，GD3，BCMA， Tn Ag，PSMA，ROR1，FLT3，FAP，TAG72，CD38，CD44v6，CEA，EPCAM，B7H3，KIT， IL-13Ra2，间皮素，IL-11Ra，PSCA，PRSS21，VEGFR2，LewisY，CD24，PDGFR-beta， SSEA-4，CD20，叶酸受体α，ERBB2(Her2/neu)，MUC1，EGFR，NCAM，蛋白酶，PAP， ELF2M，Ephrin B2，IGF-1受体，CAIX，LMP2，gp100，bcr-abl，酪氨酸酶，EphA2，岩藻 糖基GM1，sLe，GM3，TGS5，HMWMAA，邻乙酰基GD2，叶酸受体β，TEM1/CD248， TEM7R，CLDN6，GPRC5D，CXORF61，CD97，CD179a，ALK，聚唾液酸，PLAC1，GloboH， NY-BR-1，UPK2，HAVCR1，ADRB3，PANX3，GPR20，LY6K，OR51E2，TARP，WT1， NY-ESO-1，LAGE-1a，MAGE-A1，legumain，HPV E6，E7，MAGE A1，ETV6-AML，精子 蛋白17，XAGE1，Tie 2，MAD-CT-1，MAD-CT-2，Fos相关抗原1，p53，p53突变体，脯氨 酸，存活蛋白和端粒酶，PCTA-1/Galectin 8，MelanA/MART1，Ras突变体，hTERT，SAR 昏迷易位断点，ML-IAP，ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)，NA17，PAX3，雄激素受体，细 胞周期蛋白B1，MYCN，RhoC，TRP-2，CYP1B1，BORIS，SART3，PAX5，OY-TES1，LCK， AKAP-4，SSX2，RAGE-1，人类端粒酶逆转录酶，RU1，RU2，肠羧基酯酶，mut hsp70-2， CD79a，CD79b，CD72，LAIR1，FCAR，LILRA2，CD300LF，CLEC12A，BST2，EMR2， LY75，GPC3，FCRL5和IGLL1。在实施方案中，细胞内信号传导域包含共刺激信号传导域， 或初级信号传导域和共刺激信号传导域，其中所述共刺激信号传导域包括选自CD27，CD28、 4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)， CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，与CD83特异性结合的配体，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，CD4，CD8alpha， CD8beta，IL2Rbeta，IL2Rγ，IL7R alpha，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D， ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM， CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE /RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(触觉)，CEACAM1， CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6 (NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BL AME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)， LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46和NKG2D的蛋白质的 功能性信号传导域。

在实施方案中，修饰的细胞包含抗原结合分子，抗原结合分子是修饰的TCR。在实施方 案中，TCR衍生自患者中自发发生的肿瘤特异性T细胞。在实施方案中，TCR结合肿瘤抗原。 在实施方案中，肿瘤抗原包含CEA，gp100，MART-1，p53，MAGE-A3或NY-ESO-1。在实 施方案中，TCR包含TCRγ和TCRδ链，或TCRα和TCRβ链，或其组合。

在实施方案中，细胞是免疫细胞(例如，免疫效应细胞的群体)。在实施方案中，免疫细 胞是T细胞或NK细胞。在实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在实施方案中，T细胞是CD4+T细胞，CD8+T细胞或其组合。在实施方案中，细胞是人的细胞。

在实施方案中，修饰的细胞包含编码结合分子和抑制性免疫检查点分子或其受体的显性 失活的核酸序列。在实施方案中，抑制性免疫检查点分子选自程序性死亡1(PD-1)，细胞毒 性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)，B和T淋巴细胞减毒剂(BTLA)，T细胞免疫球蛋白mucin-3 (TIM-3)，淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)，具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)， 白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)，自然杀伤细胞受体2B4。在实施方案中，抑制 性免疫检查点分子是修饰的PD-1。在实施方案中，修饰的PD-1缺乏用于PD-1信号转导的功 能性PD-1胞内结构域，干扰人细胞的人T细胞的PD-1与某些细胞的PD-L1之间的途径，包 括或为PD-1细胞外结构域或PD-1跨膜结构域或其组合，或与野生型PD-1细胞内结构域相 比包含取代或缺失的修饰的PD-1细胞内结构域，或包含与特定细胞的PD-L1结合的PD-1细 胞外结构域的可溶性受体。

在实施方案中，修饰的细胞具有减少的内源性T细胞受体α(TRAC)基因的表达。

在实施方案中，修饰的细胞包含结合白细胞抗原的第一CAR和结合实体瘤抗原的第二 CAR。在实施方案中，修饰的细胞包含结合白细胞抗原和实体瘤抗原的双特异性CAR。

本公开内容描述了一种药物组合物，其包含修饰的细胞群和另外其它修饰的细胞群，其 中修饰的细胞结合第一抗原，并且另外的修饰的细胞结合不同于第一抗原的第二抗原。在实 施方案中，第一抗原是白细胞抗原，第二抗原是实体瘤抗原。在实施方案中，第二抗原是白 细胞抗原，并且第一抗原是实体瘤抗原。在实施方案中，白细胞抗原是CD19，CD22，CD20， BCMA，CD5，CD7，CD2，CD16，CD56，CD30，CD14，CD68，CD11b，CD18，CD169， CD1c，CD33，CD38，CD138或CD13。

在实施方案中，第一抗原是CD205，CD19，CD20，CD22或BCMA。在实施方案中， 第二抗原是实体瘤抗原。实体肿瘤抗原的实例是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C， GPR35，CR1L，MUC 17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1， SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC，KISS1R，CLDN18.2，QRFPR， GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP， CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α， ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，B7-H3或EGFR。

在实施方案中，实体瘤抗原包含肿瘤相关的MUC1，ACPP，TSHR，GUCY2C，UPK2，CLDN18.2，PSMA，DPEP3，CXCR5，B7-H3，MUC16，SIGLEC-15，CLDN6，Muc17，PRLR 和FZD10。

本公开内容描述了引发或增强T细胞应答，治疗有需要的受试者或增强其癌症治疗的方 法，该方法包括给予有效量的本文的药物组合物。在实施方案中，实体瘤抗原是ACPP，癌 症是前列腺癌。

在实施方案中，结合分子和/或治疗剂与自杀基因相关。在实施方案中，多核苷酸包含自 杀基因。在实施方案中，自杀基因是RQR8。“自杀基因”是编码产物的核酸，其中产物本身 或在其他化合物的存在下引起细胞死亡。这种治疗性核酸(自杀基因)的代表性例子是编码 单纯疱疹病毒(HSV-TK)或RQR8的胸苷激酶的核酸。另外的例子是水痘带状疱疹病毒的胸 苷激酶和细菌基因胞嘧啶脱氨酶，它们可以将5-氟胞嘧啶转化为剧毒化合物5-氟尿嘧啶。实 施方案包括用于T细胞的136个氨基酸标记/自杀基因。逆转录病毒转导后，翻译的蛋白质在 细胞表面稳定表达。它以相等的亲和力将QBEND10与全长CD34结合。此外，该构建体结 合利妥昔单抗，并且双重表位设计引起高效的补体介导的杀伤。由于构建体的体积小，可以 轻松地与典型的T细胞工程转基因(例如T细胞受体或嵌合抗原受体等)共表达，从而可轻 松检测，选择细胞以及删除细胞中的细胞。具有现成临床级试剂/药物的不可接受的毒性。关 于RQR8和自杀基因的更多信息可以在EPO专利公开号：EP2836511中找到，其通过引用并 入本文。

本公开内容描述了包含混合细胞群体的组合物。混合细胞群体包含第一细胞群体和第二 细胞群体，所述第一细胞群体包含结合第一抗原的第一CAR，所述第二细胞群体包含结合第 二抗原的第二CAR，所述第一抗原包含CD205，所述第二抗原包含实体瘤抗原。

本公开内容描述了一种增强受试者中细胞的扩增的方法，该方法包括：对具有表达肿瘤 抗原的癌症形式的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包含第一细胞群体，所述第 一细胞群体包含第一CAR结合第一抗原，第二细胞群体包含第二CAR结合第二抗原，第一 抗原包含CD205，第二抗原包含实体瘤抗原；以及允许第一和第二细胞群扩增，其中与施用 包含第二细胞群体而不包含第一细胞群的组合物的受试者相比，受试者中第二细胞群体的扩 增得到增强。

CD205也称为DEC-205或淋巴细胞抗原75(LY75)，是由LY75基因编码的蛋白质。CD205是通常在各种APC和一些白细胞亚群上表达的I型C型凝集素受体，其特征在于对胞吞作用和内在化至关重要的含胞质域的蛋白质基序。CD205是一种表面多凝素受体，具有细胞质结构域的蛋白质基序，对连接后的内吞作用和内在化至关重要。已知CD205充当凋亡和坏死细胞的表面受体，导致抗原摄取和加工。CD205主要通过抗原呈递细胞(APC)在造血 细胞中表达，但也在包括实体瘤在内的其他组织中表达。就肿瘤组织和健康组织之间的差异表达而言，CD205具有快速的内在化速率和良好的特性，并且是

技术的良好靶 标。可在Gaudio等人的doi.org/10.3324/haematol.2019.227215中找到有关CD205及其在癌症 治疗中用途的更多信息。

在实施方案中，第一细胞群是T细胞，NK细胞或树突细胞，并且其中第二细胞群是T细胞，NK细胞或树突细胞。

在实施方案中，实体肿瘤抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35， CR1L，MUC 17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3， SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6， UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2， FAP，GPC3，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD FR-α，ErbB2，EpCAM， EGFRvIII，B7-H3，MAGE A4或EGFR。

在实施方案中，第一CAR和第二CAR包含抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激结构域和CD3ζ结构域。在实施方案中，共刺激结构域包含CD27，CD28、4-1BB，OX40，CD30， CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C， B7-H3，与CD83结合的配体或其组合。在实施方案中，第一CAR包含scFv结合CD19、4-1BB 或CD28的细胞内结构域和CD3ζ结构域，并且第二CAR包含scFv结合tMUC1、4-1BB或 CD28的细胞内结构域，和CD3ζ域。

在实施方案中，该方法进一步包括治疗患有实体瘤癌症的受试者。在实施方案中，实体 瘤癌症是胆管癌，胰腺癌，乳腺癌，结肠直肠癌，甲状腺癌或前列腺癌。在实施方案中，实 体瘤抗原是tMUC1。在实施方案中，实体瘤抗原是GUCY2C。在实施方案中，实体瘤抗原是TSHR。在实施方案中，实体瘤是CLND18.2。在实施方案中，实体瘤抗原是ACPP。在实施 方案中，实体瘤抗原是MAGE A4。在实施方案中，第一细胞群体是T细胞。在实施方案中， 第一细胞群体是T细胞或NK细胞。关于CAR T细胞的更多信息可以在美国申请号16/ 439,901中找到，其通过引用整体并入本文。

示范性实施方式

以下是示例性实施例：

1.一种有效用于在患者中扩增和/或维持修饰细胞的修饰细胞群体，其中所述修饰细胞群 体包含至少两种不同的修饰细胞：第一修饰细胞，其包含用于扩增和/或维持的抗原结合结构 域修饰的细胞；第二修饰细胞，其包含用于杀死靶细胞例如肿瘤细胞的抗原结合结构域。在 实施方案中，修饰的细胞是修饰的T细胞。在实施方案中，至少两个不同的修饰的细胞包括 两个不同的修饰的T细胞，两个不同的修饰的免疫细胞或其组合。在实施方案中，修饰的免 疫细胞包括修饰的T细胞，DC细胞和/或巨噬细胞。

2.实施方案1的修饰细胞群体，其中所述抗原结合结构域结合不同的抗原。

3.实施方案1的修饰细胞群体，其中修饰细胞群还包含表达至少两个不同抗原结合结构 域的第三修饰细胞，其包含用于扩展和/或维持修饰细胞的第一抗原结合域和用于杀死靶细胞 的第二抗原结合域，其中两个不同的抗原结合域在同一细胞上表达。

4.实施方案1的修饰细胞群体，其中所述修饰细胞群包括表达用于杀死靶细胞的抗原结 合域的修饰细胞和表达至少两个抗原结合域的修饰细胞，第一抗原结合域用于扩增和/或维持 修饰的细胞和第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞的，其中两个不同的抗原结合结构域在同 一修饰的细胞上表达。

5.实施方案1的修饰细胞群体，其中所述修饰细胞群包括表达用于扩展和/或维持修饰细 胞的抗原结合域的修饰细胞和表达至少两个抗原结合域的修饰细胞，第一抗原用于扩展和/或 维持修饰的细胞的结合结构域和第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞的，其中两个不同的抗 原结合结构域在同一修饰的细胞上表达。

6.实施方案1-5中任一项的修饰的细胞群体，其中所述修饰的细胞是修饰的T细胞，修 饰的NK细胞，修饰的巨噬细胞或修饰的树突状细胞。

7.实施方案1-6中任一项的修饰的细胞群体，其中用于扩增/或维持修饰的细胞的抗原结 合结构域结合WBC的表面抗原，并且用于杀死靶细胞的抗原结合结构域结合肿瘤抗原。

8.实施方案7的修饰的细胞群体，其中所述WBC是B细胞。

9.实施方案7的修饰的细胞群体，其中WBC的细胞表面抗原是CD19，CD22，CD20，BCMA，CD5，CD7，CD2，CD16，CD56，CD30，CD14，CD68，CD11b，CD18，CD169， CD1c，CD33，CD38，CD138或CD13。

10.实施方案1-9中任一项的修饰的细胞群，其中所述肿瘤是实体瘤，所述的肿瘤抗原是 实体瘤抗原，抗原包括tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC 17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1， GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2， ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP， GPC3，ILA13，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM， EGFRvIII，B7-H3，EGFR，CLDN18.2或PSCA的一种。

11.实施方案7的修饰的细胞群体，其中所述WBC的细胞表面抗原是CD19，CD20，CD22 或BCMA。

12.实施方案8的修饰的细胞群体，其中B细胞的细胞表面抗原是CD19，并且肿瘤抗原 是tMUC1，TSHR，GUCY2C，ACPP，CLDN18.2(18.2)，PSMA或UPK2。

13.一种组合物，其包含第一细胞群和第二细胞群，所述第一细胞群包含结合第一抗原的 第一CAR，所述第二细胞群包含结合第二抗原的第二CAR，其中所述第二抗原是肿瘤抗原， 并且所述第一抗原和第二抗原是不同的抗原。

14.实施方案13的组合物，其中第一细胞群不包含第二CAR，和/或第二细胞群不包含第 一CAR。

15.实施方案14的组合物，其中所述组合物还包含第三细胞群，所述第三细胞群包含第 一CAR和第二CAR。

16.实施方案13的组合物，其中第二细胞群进一步包含第一CAR，并且第一细胞群不包 含第二CAR，或者第一细胞群进一步包含第二CAR。

17.实施方案13的组合物，其中第二细胞群不包含第一CAR，并且第一细胞群包含第二 CAR。

18.一种增强第二细胞群的扩增的方法，其中所述第二细胞群是靶向实体瘤的细胞，该方 法包括将有效量的实施方案13-17中任一项的组合物给予具有以下形式的受试者：与肿瘤抗 原有关或表达肿瘤抗原的癌症。

19.一种增强受试者的T细胞应答或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向患有与 肿瘤抗原相关或表达该肿瘤抗原的癌症形式的受试者施用有效量的实施方案13-17中任一项 的组合物。

20.一种在受试者中增强细胞扩增的方法，该方法包括：使细胞与包含编码第一CAR的 第一核酸序列的第一载体和包含编码第二CAR的第二核酸序列的第二载体接触，以得到实施 方案13-17中的任一项细胞的组合物；并且向患有与肿瘤抗原相关或表达该肿瘤抗原的癌症 形式的受试者施用有效量的组合物。

21.一种在需要其的受试者中增强T细胞应答或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包 括：使细胞与包含编码第一CAR的第一核酸序列的第一载体和包含编码第二CAR的第二核 酸序列的第二载体接触。以获得实施方案13-17中任一项的组合物；将有效量的组合物施用 于患有与肿瘤抗原有关或表达肿瘤抗原的癌症形式的受试者。

22.一种增强受试者中细胞扩增的方法，所述方法包括：施用有效量的实施方案13-17中 任一项的组合物的第一细胞群，以及施用有效量的第二细胞群。

23.实施方案20-22中任一项的方法，其中所述第一载体和第二载体包括慢病毒载体。

24.实施方案13-23中任一项的组合物或方法，其中第一抗原是或包含白细胞(WBC)的 表面分子；和/或第二抗原是或包含肿瘤抗原或实体瘤抗原。

25.实施方案13-24中任一项的组合物或方法，其中所述细胞是修饰的T细胞，修饰的 NK细胞，修饰的巨噬细胞或修饰的树突状细胞。

26.实施方案24的组合物或方法，其中所述WBC是粒细胞，单核细胞或淋巴细胞。

27.实施方案26的组合物或方法，其中所述WBC是B细胞。

28.实施方案26的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19，CD22，CD20， BCMA，CD5，CD7，CD2，CD16，CD56，CD30，CD14，CD68，CD11b，CD18，CD169， CD1c，CD33，CD38，CD138或CD13。

29.实施方案26的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19，CD20，CD22或BCMA。

30.实施方案26的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19。

31.实施方案24的组合物或方法，其中所述肿瘤抗原是实体肿瘤抗原。

32.实施方案31的组合物或方法，其中所述实体肿瘤抗原包括tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC 17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207， SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R， QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12， ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC3，ILA13，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II， GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，B7-H3，EGFR，CLDN18.2或PSCA。

33.实施方案31的组合物或方法，其中所述实体瘤抗原是或包含tMUC1。

34.实施方案13-33中任一项的组合物或方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域，跨膜 结构域，共刺激结构域和CD3ζ结构域。

35.实施方案34的组合物或方法，其中所述共刺激结构域包含CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT， NKG2C，B7-H3与CD83特异性结合的配体中一种或其组合。

36.实施方案34的组合物或方法，其中第二CAR的共刺激结构域包含或为4-1BB的细胞 内结构域，并且第二CAR的抗原结合结构域结合tMUC1；和/或第一CAR的抗原结合结构域结合CD19，而第二CAR的共刺激结构域包含或为CD28的细胞内结构域。

37.实施方案13-36中任一项的组合物或方法，其中第一细胞群体和/或第二细胞群体进一 步包含显性失活的PD-1。

38.实施方案37的组合物或方法，其中第一细胞群体包含编码第一CAR和PD-1的显性 失活形式的载体。

39.实施方案13-38中任一项的组合物或方法，其中第一CAR包含scFv结合tMUC1、4-1BB 或CD28的细胞内结构域和CD3ζ结构域，并且第二CAR包含scFv结合CD19、4-1BB或CD28的胞内结构域和CD3ζ结构域。

40.实施方案13-39中任一项的组合物或方法，第一CAR包含SEQIDNO：18，第二CAR包含SEQIDNO：16或17。

41.实施方案13-40中任一项的组合物或方法，其中所述第二细胞群体包含编码所述第一 CAR和治疗剂的慢病毒载体，并且所述第一细胞群体包含编码所述第二CAR和显性失活的 慢病毒载体PD-1形式。

42.实施方案13-41中任一项的组合物或方法，其中第一细胞群体包含第一CAR和治疗剂， 第二细胞群体包含第二CAR和PD-1的显性失活形式。

43.实施方案41或42的组合物或方法，其中所述治疗剂包含细胞因子或为细胞因子。

44.实施方案43的组合物或方法，其中所述细胞因子是IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6， IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP， MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任何组合。

45.一种方法，其包括向受试者施用有效量的第一T细胞群，所述第一T细胞群包括包含 scFv结合CD19、4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3ζ结构域的CAR，从而增强所述第一T细胞的扩增受试者中T细胞的数量；向患者施用有效量的第二T细胞群，所述第二T细 胞群包含含有scFv结合tMUC1、4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3ζ结构域的CAR。

46.实施方案45的方法，其中第一细胞群还包含另外的CAR，其包含scFv结合tMUC1、 4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3ζ结构域。

47.实施方案45的方法，其中第二细胞群不包含scFv结合CD19。

48.实施方案45的方法，其中第一细胞群不包含scFv结合tMUC1。

49.一种增强对癌症受试者的治疗的方法，所述方法包括：

对受试者施用靶向WBC抗原的CAR T细胞；和

对受试者施用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。

50.一种在患有癌症的受试者中扩增TIL的方法，该方法包括：

对受试者施用靶向WBC抗原的CAR T细胞；和

对受试者施用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。

51.实施方案49或50的方法，其中所述TIL通过以下方法制备：

(i)从该受试者切除的肿瘤中获得第一TIL群体；

(ii)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，以产生第二 TIL群体；

(iii)通过向第二TIL群体的细胞培养基补充额外的IL-2，OKT-3和抗原呈递细胞(APC) 进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中第三群体的TIL数量比第二个TIL群体大至少 100倍，并且其中第二次扩增至少进行14天以获得第三个TIL群体，其中第三个TIL群体是 治疗群体，相对于第二类TIL，其包含效应T细胞和/或中央记忆T细胞的亚群的增加；和

(iv)对受试者施用治疗有效剂量的第三类TIL。

52.实施方案51的方法，其中该方法进一步包括在步骤(iv)之前，通过向第三TIL群体 的细胞培养基中补充额外的IL-2，额外的OKT-3，进行额外的第二次扩增的步骤，以及另外 的APC，其中，与步骤(iii)相比，进行额外的第二次扩增至少14天以获得更大的TIL治疗 群体，其中，更大的TIL治疗群体包括效应T细胞和/或相对于第三类TIL的中央记忆T细胞。

53.实施方案51的方法，其中在步骤(ii)之后，在实施方案51的第二次扩增之前，将 细胞从细胞培养基中移出并冷冻保存在存储介质中。

54.实施方案53的方法，其中在实施方案51的第二次扩增之前将细胞融化。

55.实施方案51的方法，其中将步骤(iii)重复1-4次，以便在治疗性TIL群体中获得对 于治疗有效剂量的TIL而言足够的TIL。

56.实施方案49至55中任一项的方法，其中所述APC是外周血单核细胞(PBMC)。

57.实施方案49至55中任一项的方法，其中所述效应T细胞和/或中央记忆T细胞显示 出一种或多种以下的特征：CD27的表达，CD28的表达，端粒更长，CD57的表达增加相对于第三细胞群体中的效应T细胞和/或中央记忆T细胞，CD56的表达降低。

58.实施方案49至55中任一项的方法，其中相对于第三群体中的效应T细胞和/或中央记 忆T细胞，效应T细胞和/或中央记忆T细胞表现出增加的CD57表达和降低的CD56表达。

59.实施方案49至55中任一项的方法，其中所述癌症选自黑素瘤，子宫颈癌，头颈癌， 成胶质细胞瘤，卵巢癌，肉瘤，胰腺癌，膀胱癌，乳腺癌，三联癌-阴性乳腺癌和非小细胞肺 癌。

60.实施方案49-59中任一项的方法，其中所述CAR结合CD19，CD20，CD22或BCMA。

61.实施方案49-60中任一项的方法，其中在受试者中注入CAR T细胞和TIL两者的TIL 的数目大于在受试者中注入TIL的数目。

62.实施方案49-60中任一项的方法，其中所述CAR T细胞包含本文所述的修饰的细胞。

63.一种在需要其的受试者中增强细胞扩增或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：

向具有表达肿瘤抗原的癌症形式的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含第一细 胞群和第二细胞群，所述细胞群包含结合第一抗原的第一CAR，第二细胞群包含结合第二抗 原的第二CAR抗原，其中第二抗原是肿瘤抗原并且不同于第一抗原。

64.实施方案63的方法，其中所述细胞是T细胞，NK细胞或树突细胞。

65.实施方案63的方法，其中第一抗原包括白细胞(WBC)的细胞表面分子，肿瘤抗原 或实体瘤抗原。

66.实施方案65的方法，其中所述WBC是粒细胞，单核细胞或淋巴细胞。

67.实施方案66的方法，其中淋巴细胞是B细胞。

68.实施方案65的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19，CD22，CD20，BCMA，CD5，CD7，CD2，CD16，CD56，CD30，CD14，CD68，CD11b，CD18，CD169，CD1c， CD33，CD38，CD138或CD13。

69.实施方案65的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19，CD20，CD22或BCMA。

70.实施方案65的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19。

71.实施方案63的方法，其中所述肿瘤抗原是实体肿瘤抗原。

72.实施方案71的方法，其中所述实体瘤抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C， GPR35，CR1L，MUC 17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR，GPR119， CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP，CEA， EphA2，FAP，GPC3，ILA13，IL13-Rα2，间皮素，PSMA，ROR1，VEGFR-II，GD2，FR-α， ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，B7-H3，EGFR，CLDN18.2或PSCA。

73.实施方案71的方法，其中所述实体肿瘤抗原包含tMUC1。

74.实施方案63的方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激结构 域和CD3ζ结构域。

75.实施方案74的方法，其中所述共刺激结构域包含CD27，CD28、4-1BB，OX40，CD30， CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C， B7-H3，结合CD83的配体的细胞内结构域中一种或其组合。

76.实施方案63的方法，其中第一CAR包含scFv结合CD19、4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3ζ结构域，并且第二CAR包含scFv结合tMUC1、4-1BB或CD28细胞内结构 域和CD3ζ域。

77.实施方案63的方法，其中所述第一CAR的抗原结合结构域包含SEQIDNO：18，并且所述第二CAR的抗原结合结构域包含SEQIDNO：16或17。

78.实施方案63的方法，其中第二细胞群包含编码第二CAR和PD-1的显性失活形式的 慢病毒载体。

79.实施方案63的方法，其中第一细胞群体包含编码第一CAR和治疗剂的慢病毒载体。

80.实施方案79的方法，其中所述治疗剂包括细胞因子。

81.实施方案80的方法，其中所述细胞因子包括IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8， IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP，MCP-1， TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN， EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L或铁蛋白。

82.实施方案80的方法，其中所述细胞因子包括IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8， IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP，MCP-1， TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，依他辛，EGF， HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白中的至少一种及其任何组合。

83.一种用于体外细胞制备的方法，该方法包括：使细胞与(1)包含编码结合第一抗原 的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体和(2)包含编码结合第二抗原的第二抗原结合分 子的多核苷酸的第二载体接触，以获得修饰的细胞的混合群体，其中第一抗原不同于第二抗 原。

84.一种用于在患有癌症的受试者中增强细胞扩增的方法，该方法包括：从受试者或健康 供体获得细胞；使细胞与(1)包含编码结合第一抗原的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一 载体和(2)包含编码结合第二抗原的第二抗原结合分子的多核苷酸的第二载体接触以获得经 修饰的细胞混合群体，并向受试者施用有效量的经修饰的细胞的混合群体；其中：所述第一 抗原不同于所述第二抗原，并且所述受试者中的细胞扩增水平高于施用了有效量的已经与所 述抗原接触的修饰细胞群的受试者中的细胞扩增水平。

85.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：从受试者或健康供体获得细胞；使 细胞与(1)包含编码结合第一抗原的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体和(2)包含 编码结合第二抗原的第二抗原结合分子的多核苷酸的第二载体接触以获得经修饰的细胞混合 群体，并向受试者施用有效量的经修饰的细胞的混合群体；其中：第一抗原不同于第二抗原。

86.一种增强对患有癌症的受试者的治疗的方法，所述方法包括：从受试者或健康供体获 得细胞；使细胞与(1)包含编码结合第一抗原的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体和 (2)包含编码结合第二抗原的第二抗原结合分子的多核苷酸的第二载体接触以获得经修饰的 细胞混合群体，并向受试者施用有效量的经修饰的细胞的混合群体；其中：所述第一抗原不 同于所述第二抗原，并且所述受试者中肿瘤生长的抑制水平高于施用了有效量的已修饰细胞 群的受试者中肿瘤生长的抑制水平。

87.一种用于体外细胞制备的方法，所述方法包括：将包含编码与第一抗原结合的第一抗 原结合分子的多核苷酸的第一载体引入第一细胞群，以及将包含编码与第二抗原结合的第二 抗原结合分子的多核苷酸的第二载体引入第二细胞群中，并分别培养第一和第二细胞群；其 中：第一抗原不同于第二抗原。

88.一种在患有癌症的受试者中增强细胞扩增的方法，所述方法包括：将包含编码与第一 抗原结合的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体引入第一细胞群体，以获得第一修饰细 胞群体；将包含编码与第二抗原结合的第二抗原结合分子的多核苷酸的第二载体引入到第二 细胞群中，以获得第二修饰细胞群，并向受试者施用有效量的第一和第二修饰细胞群；其中： 所述第一抗原不同于所述第二抗原，并且所述受试者中的细胞扩增水平高于施用有效量的所 述第二群体的修饰细胞而不是所述第一群体的受试者中的细胞扩增水平。修饰的细胞。在实 施方案中，同时或顺序施用第一组修饰的细胞和第二组修饰的细胞。

89.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：将包含编码与第一抗原结合的 第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体引入第一细胞群体，以获得第一修饰细胞群体；和 将包含编码与第二抗原结合的第二抗原结合分子的多核苷酸的第二载体引入到第二细胞群 中，，以获得第二修饰细胞群，并向受试者施用有效量的第一和第二修饰细胞群；其中第一抗 原不同于第二抗原。在实施方案中，同时或顺序施用第一组修饰的细胞和第二组修饰的细胞。

90.一种用于增强对患有癌症的受试者的治疗的方法，所述方法包括：将包含编码与第一 抗原结合的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体引入第一细胞群体，以获得第一修饰细 胞群体；和将包含编码与第二抗原结合的第二抗原结合分子的多核苷酸的第二载体引入到第 二细胞群中，以获得第二修饰细胞群；向受试者施用有效量的第一和第二修饰细胞群，其中： 所述第一抗原不同于所述第二抗原，并且所述受试者中肿瘤生长的抑制水平高于所述肿瘤的 抑制水平。在不存在第一批修饰细胞的情况下，在施用有效量的第二批修饰细胞的受试者中， 其生长速度较高。在实施方案中，同时或顺序施用第一组修饰的细胞和第二组修饰的细胞。

91.一种增强T细胞应答的方法，所述方法包括：引入第一载体到第一细胞群中，所述第 一载体包含编码结合第一抗原的第一抗原结合分子的多核苷酸；引入第二载体到第二细胞群 中，该第二载体包含编码结合第二抗原的第二抗原结合分子的多核苷酸；使表达第二抗原的 细胞与第一细胞群和第二细胞群接触，并测量T细胞应答水平，其中接触细胞中的T细胞应 答水平高于T细胞应答水平在没有第一细胞群的情况下，与第二细胞群接触的细胞中的B细 胞。

在实施方案中，至少第一修饰细胞群体来自健康供体。例如，修饰的细胞具有减少的内 源TRAC基因表达。在这些情况下，可能大量产生了第一批修饰细胞并用于注入多个受试者。 因为第一批修饰的细胞来源于健康的供体，所以这些细胞将被具有注入了混合细胞的癌的受 试者的免疫系统去除。在实施方案中，混合细胞包括源自健康供体的第一群体修饰的细胞和 源自患有癌症的受试者的修饰细胞的第二群体，使得修饰的第一群体将在引起或引起癌细胞 的细胞扩增后被逐渐去除。第二批修饰的细胞，而第二批修饰的细胞可以继续抑制肿瘤细胞。

92.一种增强T细胞应答的方法，所述方法包括：使细胞群体与包含编码结合第一抗原的 第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体和包含编码结合第种抗原的第二抗原结合分子的多 核苷酸的第二载体接触，以获得混合的修饰细胞群体；使表达第二抗原的细胞与修饰细胞的 混合群体接触；和测量T细胞应答的水平，其中在接触的细胞中的T细胞应答的水平比在与 没有第一载体的第二载体接触的细胞群接触的细胞中的T细胞应答的水平高。

93.实施方案83-92中任一项的方法，其中所述细胞是T细胞，NK细胞或树突细胞。在 实施方案中，细胞是T细胞。

94.实施方案83-93中任一项的方法，其中第一抗原结合分子结合WBC的细胞表面分子。

95.实施方案94的方法，其中所述WBC是粒细胞，单核细胞或淋巴细胞。

96.实施方案94的方法，其中该WBC是B细胞。

97.实施方案94的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19，CD22，CD20，BCMA，CD5，CD7，CD2，CD16，CD56，CD30，CD14，CD68，CD11b，CD18，CD169，CD1c， CD33，CD38，CD138或CD13。

98.实施方案94的方法，其中该WBC的细胞表面分子是CD19，CD20，CD22或BCMA。

99.实施方案94的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19。

100.实施方案83-99中任一项的方法，其中第二抗原结合分子结合实体瘤抗原。

101.实施方案100的方法，其中所述实体瘤抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1，MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC 17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8， CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R，QRFPR， GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21，MUC16，MS4A12，ALPP， CEA，EphA2，FAP，GPC3，IL13-Rα1，间皮素，VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM， EGFRvIII，CLDN18.2或EGFR。

102.实施方案83-101中任一项的方法，其中所述第一和第二结合分子是CAR。

103.实施方案102的方法，其中所述CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构 域，并且所述细胞外结构域结合肿瘤抗原。

104.实施方案103的方法，其中所述细胞内结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构 域包含选自CD27，CD28、4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关 抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3的共刺激分子的细胞内结构域或其 组合。

105.实施方案105的方法，其中所述细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域。

106.实施方案83-101中任一项的方法，其中所述第一结合分子是CAR，并且所述第二结 合分子是TCR。

107.实施方案106的方法，其中所述T细胞包含修饰的T细胞受体(TCR)。

108.实施方案106的方法，其中所述TCR衍生自患者中自发发生的肿瘤特异性T细胞。

109.实施方案106的方法，其中TCR结合肿瘤抗原。

110.实施方案109的方法，其中所述肿瘤抗原包括CEA，gp100，MART-1，p53，MAGE-A3 或NY-ESO-1。

111.根据实施例106所述的方法，其中所述TCR包括TCRγ和TCRδ链，TCRα和TCRβ链或其组合。

112.实施方案106的方法，其中第二细胞群体衍生自TIL。

113.实施方案83-112中任一项的方法，其中修饰的细胞群包括包含第一结合分子的细胞 和包含第二结合分子的细胞。

114.实施方案83-112中任一项的方法，其中修饰的细胞群包括包含第一结合分子的细胞， 包含第二结合分子的细胞和同时包含第一结合分子和第二结合分子的细胞。

115.实施方案83-112中任一项的方法，其中所述T细胞应答通过CAR的拷贝数和/或释 放的细胞因子的量来测量。在实施方案中，释放的细胞因子是IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6， IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP， MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任何组合。

116.实施方案83-112中任一项的方法，其中所述T细胞应答包括细胞因子释放，细胞扩 增和/或活化水平。

117.实施方案83-112中任一项的方法，其中第一载体进一步包含编码IL-1P，IL-2，IL-4， IL-5，IL-6，IL-8，IL-10的多核苷酸，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ， IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP，MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因 子，VEGF，RANTES，依他辛，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任何组合。

118.实施方案117中任一项的方法，其中所述多核苷酸包含编码NFAT和/或VHL的多核 苷酸。

119.实施方案83-118中任一项的方法，其中修饰的细胞群包括表达第一结合分子的细胞 和IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R， IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP，MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任 意组合，表达第二结合分子的细胞，表达第一结合分子的细胞和第二分子，和/或表达第一结 合分子和IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13的细胞，IL-15，IL-17， IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP，MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9， CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L， 铁蛋白及其任何组合。

120.实施方案83-119中任一项的方法，其中修饰的细胞群包括表达第二结合分子和IL-1P， IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8的细胞，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R， IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP，MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任 意组合，表达第二结合分子的细胞，表达第一结合分子的细胞和第二分子，和/或表达第一结 合分子的细胞和IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17， IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP，MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9， CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L， 铁蛋白及其任何组合。

121.实施方案83-120中任一项的方法，其中修饰的细胞群包含表达第二结合分子的细胞 和IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R， IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP，MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10， CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白 及其任意组合，表达第二结合分子的细胞，表达第一结合分子的细胞和第二分子，和/或表达 第二结合分子的细胞和IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15， IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP，MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF， CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40， CD40L，铁蛋白及其任何组合。

122.实施方案83-121中任一项的方法，其中所述修饰细胞群包含表达显性失活PD-1的 细胞。

123.双特异性嵌合抗原受体，其包含：第一抗原结合结构域，第二抗原结合结构域，胞 质结构域和跨膜结构域，其中所述第一抗原结合结构域识别第一抗原，并且所述第二抗原结 合结构域识别第二抗原，并且第一抗原不同于第二抗原。

124.实施方案123的双特异性嵌合抗原受体，其中第一抗原和第二抗原不在同一细胞上 表达。

125.实施方案123或124的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一抗原是血液成分的抗 原，并且所述第二抗原是实体瘤的抗原。

126.实施方案123-125中任一项的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一抗原是CD19， 并且所述第二抗原是肿瘤相关的MUC1。

127.实施方案123-126中任一项的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一抗原结合结构域 包含氨基酸序列SEQ IDNO：18。

128.实施方案123-127中任一项的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第二抗原结合结构域 包含氨基酸序列SEQ IDNO：16或17。

129.实施方案123的双特异性嵌合抗原受体，其中所述CAR包括任何tanCAR的氨基酸 序列。

130.实施方案123的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一结合结构域结合非必需组织 的抗原，并且所述第二结合结构域结合肿瘤组织的抗原。在实施方案中，第一结合结构域结 合TSHR或GUCY2C。在实施方案中，第二结合结构域结合tMUC1，MAGE-E1或上皮肿瘤 抗原(ETA)。

131.实施方案123的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一结合结构域结合组织特异性 抗原，并且所述第二结合结构域结合在一个以上组织上表达的抗原。在实施方案中，第一结 合结构域结合TSHR或PRLR。在实施方案中，第二结合结构域结合tMUC1，MAG-E1或ETA。

132.实施方案123的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一结合结构域结合正常组织的 抗原，并且所述第二结合结构域结合在肿瘤组织上表达的抗原。在实施方案中，第一结合结 构域结合ACPP，TSHR，GUCY2C，UPK2，CLDN18.2，PSMA，DPEP3，CXCR5，B7-H3，MUC16，SIGLEC-15，CLDN6，Muc17，PRLR或FZD10。在实施方案中，第二结合结构域 结合tMUC1，MAG-E1或ETA。

133.实施方案123中任一项的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一结合结构域结合在 非恶性细胞上表达的抗原，并且所述第二结合结构域结合在肿瘤细胞而非相应的恶性细胞上 表达的抗原。

134.一种细胞，其包含实施方案123-133中任一项的双特异性CAR。

135.一种核酸，其编码实施方案123-133中任一项的双特异性CAR。

136.一种增强T细胞应答，增强癌症治疗，治疗受试者癌症，治疗患有肿瘤的受试者或 抑制肿瘤生长的方法，该方法包括：施用有效量的实施方案134的细胞。

137.实施方案1-134中任一项的细胞，双特异性CAR，修饰的细胞群，组合物或方法在 治疗需要其的受试者中的用途。

138.实施方案137的细胞，双特异性CAR，修饰的细胞群体，组合物或方法的用途，其 中所述受试者患有癌症。

139.前述实施方案中任一项的治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述第一修饰细胞群 是包含靶向WBC抗原(例如CD19)的CAR的T细胞，和/或所述第二修饰细胞群是T细胞。 包含靶向实体瘤抗原的CAR。

140.实施方案139的方法，其中所述第一修饰细胞群体包含自杀基因(例如，RQR8)。

141.实施方案140的方法，该方法进一步包括：在细胞输注之后或响应于受试者的反应， 在预定的时间激活自杀基因以减少第一批修饰细胞的数量。

142.一种多核苷酸，其包含NFAT启动子，编码治疗剂的核苷酸序列和/或编码HIF1α的 VHL相互作用结构域的核苷酸序列，其中所述治疗剂包含IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6， IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-In，MIP-IP， MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN， EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白以及其任何组合。

143.一种多核苷酸，其包含对应于HIF1α，NFAT，FOXP3或NFkB的启动子，编码治疗剂的核苷酸序列和编码氧敏感性多肽结构域的核苷酸序列。

144.实施方案143的多核苷酸，其中所述氧敏感性多肽结构域是HIF1α，HIF3α或包含氨 基酸序列与HIF VHL-分别具有超过80％，90％或95％的氨基酸序列的多肽相互作用域，HIF 氨基酸344-417或HIF氨基酸380-603。

145.实施方案143的多核苷酸，其中所述氧敏感性多肽结构域包含HIF VHL结合结构域。

146.实施方案143-145中任一项的多核苷酸，其中所述治疗剂包含细胞因子或为细胞因子。

147.实施方案143-146中任一项的多核苷酸，其中所述治疗剂包含IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5， IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln， MIP-IP，MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任何组合。在实施方案中，细 胞因子包括促炎细胞因子，例如IFN-γ，IL-15，IL-4，IL-10，TNFα，IL-8，IL-5，IL-6，GM-CSF， CCL19和/或MIP-1α。

148.一种试剂盒，其包含有效量的不含载体的核酸，所述核酸包含任何前述实施方案的 多核苷酸，以提供针对在受试者细胞表面上表达的肿瘤抗原特异的免疫细胞群。

149.一种多核苷酸的方法或用途，该方法包括

提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV，慢病毒或其变体)，所述载体基因组包含 所述多核苷酸和编码抗原结合分子的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至赋予所述多核 苷酸转录的表达控制元件；和

向受试者施用一定量的病毒颗粒，以使多核苷酸在受试者中表达，其中一种或多种分子 在癌细胞中过表达，与免疫细胞的募集有关，和/或与自身免疫有关。

150.实施方案149的方法，其中所述AAV制备物可以包含AAV载体颗粒，空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供基本上不含AAV空衣壳的AAV产物。

151.一种修饰的细胞，其包含实施方案141-147中任一项的多核苷酸。

152.前述实施方案中任一项的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞包含抗原结合分子，所 述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号 结构域。

153.实施方案152的修饰的细胞，其中与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域选自：TSHR， CD19，CD123，CD22，CD30，CD171，CS-1，CLL-1，CD33，EGFRvIII，GD2，GD3，BCMA， TnAg，PSMA，ROR1，FLT3，FAP，TAG72，CD38，CD44v6，CEA，EPCAM，B7H3，KIT， IL-13Ra2，间皮素，IL-11Ra，PSCA，PRSS21，VEGFR2，LewisY，CD24，PDGFR-beta， SSEA-4，CD20，叶酸受体α，ERBB2(Her2/neu)，MUC1，EGFR，NCAM，蛋白酶，PAP，ELF2M，Ephrin B2，IGF-1受体，CAIX，LMP2，gp100，bcr-abl，酪氨酸酶，EphA2，岩藻 糖基GM1，sLe，GM3，TGS5，HMWMAA，邻乙酰基GD2，叶酸受体β，TEM1/CD248， TEM7R，CLDN6，GPRC5D，CXORF61，CD97，CD179a，ALK，聚唾液酸，PLAC1，GloboH， NY-BR-1，UPK2，HAVCR1，ADRB3，PANX3，GPR20，LY6K，OR51E2，TARP，WT1，NY-ESO-1，LAGE-1a，MAGE-A1，legumain，HPV E6，E7，MAGE A1，ETV6-AML，精子 蛋白17，XAGE1，Tie 2，MAD-CT-1，MAD-CT-2，Fos相关抗原1，p53，p53突变体，脯氨 酸，存活蛋白和端粒酶，PCTA-1/Galectin 8，MelanA/MART1，Ras突变体，hTERT，SAR 昏迷易位断点，ML-IAP，ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)，NA17，PAX3，雄激素受体，细 胞周期蛋白B1，MYCN，RhoC，TRP-2，CYP1B1，BORIS，SART3，PAX5，OY-TES1，LCK， AKAP-4，SSX2，RAGE-1，人类端粒酶逆转录酶，RU1，RU2，肠羧基酯酶，mut hsp70-2， CD79a，CD79b，CD72，LAIR1，FCAR，LILRA2，CD300LF，CLEC12A，BST2，EMR2， LY75，GPC3，FCRL5和IGLL1。。

154.实施方案152和153中任一项的修饰的细胞，其中所述细胞内信号传导域包含共刺 激信号传导域，或主要信号传导域和共刺激信号传导域，其中所述共刺激信号传导域包括功 能性选自CD27，CD28、4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞 功能相关抗原1(LFA-1)，CD2，CD7的蛋白质的信号传导域，LIGHT，NKG2C，B7-H3， 与CD83，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)， CD160，CD19，CD4，CD8alpha，CD8beta，IL2R特异性结合的配体beta，IL2Rγ，IL7R alpha， ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d， ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1， CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)， SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(触觉)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1， CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELLPG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76， PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，和NKG2D。

155.前述实施方案中任一项的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞包含抗原结合分子，并 且所述抗原结合分子是修饰的TCR。

156.实施方案155的修饰的细胞，其中所述TCR衍生自患者中自发发生的肿瘤特异性T 细胞。

157.实施方案156的修饰的细胞，其中所述TCR结合肿瘤抗原。

158.实施方案157的修饰的细胞，其中所述肿瘤抗原包含CEA，gp100，MART-1，p53，MAGE-A3或NY-ESO-1。

159.实施方案157的修饰的细胞，其中所述TCR包含TCRγ和TCRδ链，或TCRα和TCRβ链，或其组合。

160.前述实施方案中任一项的修饰的细胞，其中所述细胞是免疫细胞(例如，免疫效应 细胞群)，和/或所述免疫细胞是T细胞或NK细胞。

161.实施方案160的修饰的细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞。

162.实施方案161的修饰的细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞，CD8+T细胞或其组合。

163.前述实施方案中任一项的修饰的细胞，其中所述细胞是人细胞。

164.根据任何前述实施方案所述的修饰细胞，其中所述修饰细胞包含编码结合分子和抑 制性免疫检查点分子或其受体的显性失活的核酸序列。

165.实施方案164的修饰的细胞，其中所述抑制性免疫检查点分子选自程序性死亡1 (PD-1)，细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)，B-和T-淋巴细胞减毒剂(BTLA)，T细胞 免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)，淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)，具有Ig和ITIM结构域的T 细胞免疫受体(TIGIT)，白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)，自然杀伤细胞受体2B4 (2B4)和CD 160。

166.修饰的细胞实施方案164，其中抑制性免疫检查点分子是修饰的PD-1。

167.实施方案166的修饰的细胞，其中所述修饰的PD-1缺乏用于PD-1信号转导的功能 性PD-1胞内结构域，干扰所述人细胞的人T细胞的PD-1和PD-之间的途径。某个细胞的L1 包含或为PD-1细胞外结构域或PD-1跨膜结构域或其组合，或与野生型PD-相比包含取代或 缺失的修饰的PD-1细胞内结构域1细胞内结构域，或包含或为包含与特定细胞的PD-L1结 合的PD-1细胞外结构域的可溶性受体。

168.根据任何前述实施方案所述的修饰细胞，其中所述修饰细胞经工程改造以表达和分 泌治疗剂，例如细胞因子，和/或所述治疗剂为或包含IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8， IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-在1n中，MIP-IP， MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任何组合。

169.实施方案168的修饰的细胞，其中所述治疗剂为或包含IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6， IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP， MCP-1，TNFα，GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF，HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任意组合，所述小蛋白或治疗剂为或包含 重组或天然细胞因子，和/或蛋白是或包括IL-1P，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12， IL-13，IL-15，IL-17，IL-1Ra，IL-2R，IFN-γ，IFN-γ，MIP-ln，MIP-IP，MCP-1，TNFα， GM-CSF，GCSF，CXCL9，CXCL10，CXCR因子，VEGF，RANTES，EOTAXIN，EGF， HGF，FGF-P，CD40，CD40L，铁蛋白及其任何组合。

170.任何进行中的实施方案的修饰细胞，其中所述修饰细胞衍生自健康供体或患有癌症 的受试者。

171.实施方案170的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞具有降低的内源TRAC基因表达。

172.根据任何前述实施方案的修饰细胞，其中所述修饰细胞包含结合白细胞抗原的第一 CAR和结合实体瘤抗原的第二CAR。

173.任何进行实施方案的修饰细胞，其中所述修饰细胞包含结合白细胞抗原和实体瘤抗 原的双特异性CAR。

174.一种药物组合物，其包含实施方案141-173的修饰的细胞群和另外的修饰的细胞群， 其中所述修饰的细胞结合第一抗原，并且所述另外的修饰的细胞结合不同于第一抗原的第二 抗原。

175.实施方案174的药物组合物，其中所述第一抗原是白细胞抗原，并且所述第二抗原 是实体瘤抗原。

176.实施方案174的药物组合物，其中所述第二抗原是白细胞抗原，并且所述第一抗原 是实体瘤抗原。

177.如实施方式175或176所述的药物组合物，其中所述白细胞抗原是CD19，CD22，CD20，BCMA，CD5，CD7，CD2，CD16，CD56，CD30，CD14，CD68，CD11b，CD18， CD169，CD1c，CD33，CD38，CD138或CD13。

178.实施方案175或176的药物组合物，其中是CD19，CD20，CD22或BCMA。

179.实施方案175或176的药物组合物，其中所述实体肿瘤抗原是tMUC1，PRLR，CLCA1， MUC12，GUCY2C，GPR35，CR1L，MUC 17，TMPRSS11B，MUC21，TMPRSS11E，CD207，SLC30A8，CFC1，SLC12A3，SSTR1，GPR27，FZD10，TSHR，SIGLEC15，SLC6A3，KISS1R， CLDN18.2，QRFPR，GPR119，CLDN6，UPK2，ADAM12，SLC45A3，ACPP，MUC21， MUC16，MS4A12，ALPP，CEA，EphA2，FAP，GPC2，IL13α，间皮素，PSMA，ROR1， VEGFR-II，GD2，FR-α，ErbB2，EpCAM，EGFRvIII，B7-H3或EGFR。

180.实施方案175或176的药物组合物，其中所述实体肿瘤抗原包含肿瘤相关的MUC1， ACPP，TSHR，GUCY2C，UPK2，CLDN18.2，PSMA，DPEP3，CXCR5，B7-H3，MUC16，SIGLEC-15，CLDN6，Muc17，PRLR和FZD10。

181.一种引发或增强T细胞应答，治疗有此需要的受试者或增强其癌症治疗的方法，该 方法包括给予有效量的实施方案174-180中任一项的药物组合物。

182.任何进行的实施方案的修饰的细胞或方法，其中所述实体瘤抗原是ACPP，并且所述 癌症是前列腺。

183.任何进行实施方案的修饰细胞或方法，其中治疗剂是IL-7或CCL19或其组合。

184.实施方案183的修饰的细胞或方法，其中所述修饰的细胞包含相应的氨基酸序列。

185.任意进行实施方案的结合分子和/或治疗剂，其中所述结合分子和/或治疗剂与自杀基 因相关。

186.任何进行实施方案的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含自杀基因。

187.实施方案186的多核苷酸，其中所述自杀基因是RQR8。

188.一种用于治疗患有淋巴瘤的受试者，增强其治疗，增强该受试者的抗肿瘤活性或增 强该受试者的T细胞应答的方法，该方法包括：向受试者施用有效量的任何前述合适实施方 案的修饰的细胞，其中修饰的细胞包含多核苷酸，其包含NFAT启动子，编码治疗剂的核苷 酸序列和/或编码HIF1α的VHL相互作用域的核苷酸序列，其中治疗剂包含IL-12，其中的至 少一种修饰的细胞包含结合CD19，CD20，CD205和/或CD22的CAR或TCR。

189.一种嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞 内结构域，并且其中所述细胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、8、10或12。

190.实施方案189的CAR，其中所述CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：7、9、11或13。

191.实施方案189的CAR，其中所述细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域，和/或所 述CAR结合氨基酸序列SEQ ID NO：5。

192.实施方式191的CAR，其中所述细胞内结构域还包含共刺激信号传导区域，所述共 刺激信号传导区域包含选自CD27，CD28、4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋 巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其任何组合。

193.一种组合物，其包含实施方案189的CAR和载体。

194.药物组合物，其包含实施方案189的CAR和药学上可接受的载体。

195.一种核酸，其编码实施方式189的CAR。

196.一种载体，包含实施方案195的核酸。

197.一种细胞，其包含实施方式195的核酸。

198.一种细胞群体，包含实施方案195的核酸。

199.实施方案198的细胞群体，其中所述细胞群体包含T细胞。

200.一种药物组合物，其包含实施方案199的T细胞群。

201.一种在有需要的受试者中刺激抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者 施用有效量的实施方案200的药物组合物，从而刺激抗肿瘤免疫应答。

202.实施方案201的方法，其中所述受试者被诊断患有尿道癌。

203.一种在表达UPK2的细胞群体中刺激免疫应答的方法，该方法包括使细胞群体与有 效量的实施方案200的药物组合物接触。

204.实施方案203的方法，其中所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。

205.实施方案203的方法，其中所述细胞群体在受试者中。

206.实施方案203的方法，其中所述免疫应答是抗肿瘤免疫应答。

207.一种核酸，其编码实施方案190的CAR。

208.一种核酸，其编码实施方案191的CAR。

209.一种核酸，其编码实施方案192的CAR。

210.一种载体，其包含实施方案207的核酸。

211.一种载体，其包含实施方案208的核酸。

212.一种载体，其包含实施方案209的核酸。

213.一种细胞，其包含实施方案207的核酸。

214.一种细胞，其包含实施方案208的核酸。

215.一种细胞，其包含实施方案209的核酸。

216.一种细胞群体，其包含实施方案207的核酸。

217.一种细胞群体，其包含实施方案208的核酸。

218.一种细胞群体，其包含实施方案209的核酸。

219.一种药物组合物，其包含实施方案216的细胞群体。

220.一种药物组合物，其包含实施方案217的细胞群体。

221.一种药物组合物，其包含实施方案218的细胞群体。

实施例

使用大肠杆菌表达系统制备了重组UPK2细胞外结构域(UPK2-His)。

取6-8周大的BALB/c小鼠，并在免疫前对小鼠进行尾静脉采血以留下背景血清。

首次向小鼠提供UPK2-His重组抗原，并用完全的弗氏佐剂乳化，每只小鼠腹膜内注射 50μg重组抗原。

初次免疫后，两周后加强剂量的不完全佐剂乳化的重组UPK2-His抗原，每只小鼠腹膜 内注射50μg重组抗原，进行三次加强免疫。在第三次加强免疫之前进行尾静脉采血，以分析 血清UPK2抗体滴度。结果表明，四只小鼠中三只的血清中UPK2的抗体滴度达到106或更 高，表明免疫成功。

改变第五次免疫以使免疫失效，并且使用无佐剂的UPK2-His重组抗原作为免疫原，给 每只小鼠腹膜内注射50μg重组抗原，并在免疫3天后处死小鼠。

使用小鼠淋巴细胞分离液(Dakko，CAT#DKW33-R0100)分离小鼠脾淋巴细胞，并使用总RNA提取试剂盒(Tiangen，CAT#DP430)对分离的淋巴细胞进行总RNA提取。以提 取的总RNA为模板，使用第一链cDNA合成试剂盒(Thermo science，CAT#K1621)分别 合成重链可变区和轻链可变区。逆转录引物是基因特异性引物，并进行了引物配对。这些区 域分别位于抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区。立即将合成的cDNA保存在-70℃进行保存。 然后，通过反转录获得cDNA并将其用作模板以获得引物(Journal of Immunological Methods， 201(1997)，35-55)，并且通过PCR分别扩增鼠抗体VH和VL。使用重叠延伸PCR技术来 构建单链抗体(scFv)。最后，将制备的小鼠单链抗体基因克隆到载体pADSCFV-S中以构建 ScFv文库。该抗体文库的文库容量达到1.6X10⁸，正确率为41.5％。

使用重组UPK2-his作为抗原，参照经典固相筛选策略筛选小鼠单链抗体文库，并通过结 合，洗脱，中和，感染等方式进行三轮筛选。并在第二轮扩增。在第三轮筛选之后，通过噬 菌体ELISA鉴定了大约700个单克隆。选择六十个具有高阳性ELISA信号的克隆进行序列 分析，以获得八种具有与UPK2-His结合的不同序列的菌株。这八种抗体是：克隆S2B7，S2E2， S3A4，S3C10，S3D10，S7F9，S7F11和S7G7。

将上述八个scFv的重链和轻链可变区基因分别克隆到真核表达载体pTSEG1n和pTSEK 中，并使用该公司的HEK293细胞瞬时表达系统制备了八种鼠类人嵌合抗体(鼠类抗体可变 区、人抗体恒定区)。通过蛋白A亲和层析柱纯化整个重组抗体，并显示SDS-PAGE。这八 种抗体正常表达，其纯度达到蛋白质鉴定的水平。

使用经典的ELISA方法分析了完整重组抗体结合抗原UPK2-His的能力。所有8种抗体 都可以结合抗原UPK2-His。同时，通过类似的ELISA方法分析了制备的单克隆抗体的特异 性。八种重组抗体可以特异性识别重组UPK2-His，并且各种无关抗原之间没有明显的非特异 性结合。

使用GE的BIAcore X-100分析了八种单克隆抗体的亲和力。使用常规程序进行亲和力分 析，方法是先用包被在芯片上的抗人抗体捕获人单克隆抗体，然后使用不同浓度的重组 UPK2-His作为流动相进行亲和力分析。如表1所示，这些重组抗体的亲和力(KD)大多在 0.1nM至10nM之间。其中，S7F11/S7G7的结合和解离很慢，而S3D10的结合太慢。当使 用BIAcore X-100分析这三种单克隆抗体进行亲和力分析时，KD的自动拟合很差，该数据仅供参考。

表1通过BIAcore测定的重组抗UPK2单克隆抗体亲和力参数

单克隆抗体	Kon	Koff	KD	Remarks
					S2B7	1.493x10<sup>5</sup>	3.495x10<sup>-3</sup>	2.34x10<sup>-8</sup>
S3A4	1.125x10<sup>5</sup>	3.05x10<sup>-3</sup>	2.712x10<sup>-8</sup>
					S7F9	1.4x10<sup>5</sup>	2.344x10<sup>-3</sup>	1.674x10<sup>-8</sup>
S2E2	1.381x10<sup>6</sup>	3.894x10<sup>-3</sup>	2.82x10<sup>-9</sup>
					S3C10	1.226x10<sup>6</sup>	1.117x10<sup>-3</sup>	9.109x10<sup>-10</sup>
S7F11	3.504x10<sup>3</sup>	8.126x10<sup>-6</sup>	2.319x10<sup>-9</sup>	Kd overrun
					S7G7	5.049x10<sup>4</sup>	1.202x10<sup>-6</sup>	2.381x10<sup>-11</sup>	Kd overrun
S3D10	6.431x10<sup>2</sup>	2.614x10<sup>-3</sup>	4.064x10<sup>-6</sup>	U-value＝15

在这项研究中，重组UPK2细胞外域(UPK2-His)用于完成小鼠的免疫，小鼠免疫文库 的构建、筛选和单克隆鉴定。获得了八种鼠类单克隆抗体(S2B7，S2E2，S3A4，S3C10，S3D10， S7F9，S7F11和S7G7)，它们具有不同的序列并能够重组结合UPK2。初步的特异性分析表 明，这些单克隆抗体与重组UPK2-his特异性结合。基于BIAcore的亲和力分析表明，这些重 组抗-UPK2抗体的亲和力大多在0.1nM至10nM之间。

用6600(Lenti-UPK2抗原质粒)瞬时转染293T细胞。将106个细胞与2ug质粒混合。用6600个质粒转染后，使用了八种UPK2抗体对293T细胞进行流式染色。山羊抗人FITC 用作二抗。S2E2，S3C10和S3A4抗体显示信号。重复该实验，使用浓度梯度进行。用6600 (Lenti-UPK2抗原质粒)瞬时转染293T细胞。用6600个质粒转染后，分别使用1ug，0.3ug 和0.1ug的8种抗体对293T细胞进行流式染色。山羊抗人FITC用作二抗。S2E2，S3C10， S3A4抗体显示信号。

在第0天采集健康志愿者的外周血，并用pan T试剂盒对CD3+T细胞进行分选。T细胞被CD3/CD28Dynabeads以1：1的比例刺激。在第1天分别用编码S2E2 UPK2 CAR(MOI ＝30)的慢病毒和编码S3C10 UPK2 CAR(MOI＝38.7)的慢病毒感染106个T细胞。使用 106个T细胞作为NT。在第2天更换培养基，除去慢病毒和Dynabeadads，并将T细胞重悬 在新鲜培养基中。在第6天通过流式细胞术检测CAR比率和细胞表型。UPK2 CAR是鼠抗体， 并且通过鼠CAR抗体检测。如图1所示，显示了T细胞的CAR表达。S2E2 UPK2 CAR的 mCAR表达占87.14％，S3C10 UPK2 CAR的mCAR表达80.6％。

基于以下步骤进行进一步的实验。将细胞共培养24小时，并用CAR+进行流染色，并收 集上清液用于细胞计数微珠阵列(CBA)的检测。观察到CFES染色的T细胞的增殖。

如图2显示，流式细胞术结果表明，共培养24小时后，用UPK2靶细胞刺激293T细胞可以上调被S3C10 UPK2 CAR感染的T细胞的CD137和CD40L的表达。这些结果表明，S3C10UPK2 CAR可以识别UPK2靶细胞。CD137的上调对应于T细胞的激活，而CD40L的表达 对应于CD40+的其他免疫细胞，例如DC细胞的激活。

图3显示了与UPK2阳性细胞共培养后，UPK2 CAR T细胞的增殖。图4显示了在与UPK2 阳性细胞共培养之后，UPK 2CAR T细胞的细胞因子释放。相对于对照组，具有UPK2靶标 的293T细胞能够刺激S3C10 UPK2 CAR-T细胞增殖并释放IFN-γ和TNFα。

图5显示使用6600(Lenti-UPK2抗原质粒)瞬时转导293T细胞，并且S2E2，S3C10，S3A4抗体显示信号。图6和7显示了使用6600质粒(Lenti-UPK2抗原表达质粒)包装病毒 的流式细胞术结果，病毒感染了293T细胞，并使用UPK2-S3C10抗体检测其表达，UKP2抗 原表达正常。

上文中涉及的序列如表2中所示。

表2氨基酸序列

本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入本文，如同每个单 独的出版物，专利或专利申请被具体和单独地指示为通过引用并入。虽然已经根据各种实施 例描述了前述内容，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离其精神的情况下可以进行各种 修改，替换，省略和改变。

序列表

<110> 上海斯丹赛生物技术有限公司

<120> UPK2嵌合抗原受体及其尿道癌的治疗

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

20 25 30

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

50 55 60

Ser Leu Val Ile Thr

65

<210> 3

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 5

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Pro Leu Leu Pro Ile Arg Thr Leu Pro Leu Ile Leu Ile Leu

1 5 10 15

Leu Ala Leu Leu Ser Pro Gly Ala Ala Asp Phe Asn Ile Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Gly Leu Leu Ser Pro Ala Leu Thr Glu Ser Leu Leu Val Ala Leu

35 40 45

Pro Pro Cys His Leu Thr Gly Gly Asn Ala Thr Leu Met Val Arg Arg

50 55 60

Ala Asn Asp Ser Lys Val Val Thr Ser Ser Phe Val Val Pro Pro Cys

65 70 75 80

Arg Gly Arg Arg Glu Leu Val Ser Val Val Asp Ser Gly Ala Gly Phe

85 90 95

Thr Val Thr Arg Leu Ser Ala Tyr Gln Val Thr Asn Leu Val Pro Gly

100 105 110

Thr Lys Phe Tyr Ile Ser Tyr Leu Val Lys Lys Gly Thr Ala Thr Glu

115 120 125

Ser Ser Arg Glu Ile Pro Met Ser Thr Leu Pro Arg Arg Asn Met Glu

130 135 140

Ser Ile Gly Leu Gly Met Ala Arg Thr Gly Gly Met Val Val Ile Thr

145 150 155 160

Val Leu Leu Ser Val Ala Met Phe Leu Leu Val Leu Gly Phe Ile Ile

165 170 175

Ala Leu Ala Leu Gly Ser Arg Lys

180

<210> 6

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Leu Gly Gly Thr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr Leu

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asn Thr Met Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala His Thr Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asn Thr Met Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala His Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln

115 120 125

Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys

130 135 140

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Val Lys

145 150 155 160

Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser

165 170 175

Asn Ser Asp Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu

180 185 190

Asn Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Gly Gly Thr Glu

210 215 220

Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Thr Leu Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 9

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Leu Gly Gly Thr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro

130 135 140

Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp

145 150 155 160

Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu

165 170 175

Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asn Thr Met Glu

195 200 205

Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala His Thr Tyr Pro

210 215 220

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 10

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg

65 70 75 80

Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Gly Gly Thr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Ala Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser

165 170 175

Gln Ser Ile Gly Asp Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Ser His Glu

180 185 190

Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile

195 200 205

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ile

210 215 220

Ile Asn Thr Met Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

225 230 235 240

Ala His Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

245 250 255

Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

260 265 270

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

275 280 285

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

290 295 300

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

305 310 315 320

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

325 330 335

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

340 345 350

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

355 360 365

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

370 375 380

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

385 390 395 400

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

405 410 415

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

420 425 430

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

435 440 445

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

450 455 460

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475 480

<210> 11

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg

65 70 75 80

Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Gly Gly Thr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Ala Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser

165 170 175

Gln Ser Ile Gly Asp Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Ser His Glu

180 185 190

Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile

195 200 205

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ile

210 215 220

Ile Asn Thr Met Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

225 230 235 240

Ala His Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

245 250 255

Lys Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn

260 265 270

Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys

275 280 285

Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val

290 295 300

Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala

305 310 315 320

Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser

325 330 335

Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His

340 345 350

Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg

355 360 365

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

370 375 380

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

385 390 395 400

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

405 410 415

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

420 425 430

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

435 440 445

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

450 455 460

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475

<210> 12

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Ser Glu Phe Pro Phe Pro Ser His

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met

50 55 60

Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Leu Pro Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 13

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln

1 5 10 15

Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp

20 25 30

Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Thr Thr

85 90 95

His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Thr

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

115 120 125

Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Ser

130 135 140

Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Ser Glu Phe Pro Phe Pro Ser His Asp

145 150 155 160

Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala

165 170 175

Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Glu

180 185 190

Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Ser Leu Pro Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ala

<210> 15

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Ser Glu Phe Pro Phe Pro Ser His

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met

50 55 60

Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Leu Pro Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr

130 135 140

Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu

145 150 155 160

Tyr Ser Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val

210 215 220

Gln Thr Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Met Lys

<210> 16

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Ser Glu Phe

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Tyr Pro Asp Thr Met Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr

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115 120 125

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130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu

145 150 155 160

Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser

165 170 175

Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Leu

180 185 190

Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser

195 200 205

Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly

225 230 235 240

Val Tyr Tyr Cys Val Gln Thr Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

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305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

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Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

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370 375 380

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

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420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

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Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 17

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu

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Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Ser Glu Phe

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Pro Phe Pro Ser His Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys

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Arg Leu Glu Leu Val Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Pro Asp Thr Met Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr

85 90 95

Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

100 105 110

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu

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Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser

165 170 175

Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Leu

180 185 190

Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser

195 200 205

Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly

225 230 235 240

Val Tyr Tyr Cys Val Gln Thr Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro

260 265 270

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275 280 285

Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys

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Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

305 310 315 320

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

325 330 335

Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

340 345 350

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

355 360 365

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Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

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Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

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Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

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Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 18

<211> 483

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

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180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

210 215 220

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

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Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

340 345 350

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Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

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405 410 415

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

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Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

435 440 445

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

450 455 460

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

465 470 475 480

Pro Pro Arg

Claims (12)

1.一种CAR，包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其特征在于，所述CAR结合氨基酸序列SEQ ID NO：5。

2.根据权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。

3.根据权利要求2所述的CAR，其特征在于，所述的CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15。

4.根据权利要求1-3任一所述的CAR，其特征在于，所述CAR的胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域，和/或所述CAR的细胞内结构域还包含共刺激信号传导区域，所述共刺激信号传导区域包含选自CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其任何组合。

5.根据权利要求4所述的CAR，其特征在于，所述的CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17。

6.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-5中任一项所述的CAR。

7.一种载体，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸。

8.一种细胞，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸。

9.一种细胞群，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸。

10.根据权利要求9所述的一种细胞群，其特征在于，所述细胞群包含T细胞。

11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求9的细胞群和/或权利要求10的T细胞群。

12.权利要求11所述的药物组合物的用途，其特征在于，包括向所述受试者施用有效量的权利要求11的药物组合物，从而刺激抗肿瘤免疫应答。

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