CN111218448B - 工程化免疫细胞的制备及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种CD52基因被敲除的工程化免疫细胞的制备及其用途；特别地，本发明筛选了一种sgRNA分子，可以高特异性地靶向CD52基因，从而提高基因编辑的效率，有利于制备通用型CAR细胞。

Description

工程化免疫细胞的制备及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域。更具体地，涉及一种CD52基因被敲除的工程化免疫细胞的制备及其用途。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)细胞，尤其是CART细胞是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一，其基本原理主要是提取患者自身的T细胞，并通过基因和细胞工程手段使其表达能够识别并结合肿瘤细胞表面抗原的特异性嵌合抗原受体，从而靶向杀伤肿瘤细胞。CART已经在白血病和淋巴瘤治疗中取得显著的疗效。2017年8月30日，美国FDA批准了CART细胞疗法Kymriah正式上市，用于治疗复发性或难治性儿童、青少年B-细胞急性淋巴细胞白血病（rALL）。急性淋巴细胞白血病在15岁以下儿童癌症确诊病例中约占25%，是美国最常见的儿童癌。在我国，急性淋巴细胞白血病占儿童急性白血病的80%，发病率为十万分之一。另一款批准上市的CART细胞疗法是Yescarta，用于治疗成年特定类型大B细胞淋巴瘤患者。
Kymriah和Yescarta 都属于自体CART，即从患者身体分离T细胞并进行改造后，再输入该患者。自体CAT作为主流技术有着效果好、免疫不排斥等优点，但其“个性化”的制备使得过程复杂，价格昂贵。通用型CART则可以解决上述问题，因为用采集的健康人的 T 细胞制备的产品可以用于任何患者输注，但这种同种异体的细胞转移必须避免发生移植物抗宿主病（GvHD）。
一般认为GvHD主要是由T细胞表面受体（TCR）的表达引起。然而，单独敲除TCR并不能达到通用型CART细胞的需求，因为CART细胞表面仍然有HLA分子的表达，存在被受体免疫系统T细胞识别后清除的风险。
在临床治疗中，通常使用阿伦单抗清除患者体内的T细胞以防止发生排斥反应，但这也导致回输的CART细胞同样面临被清除的风险。而敲除CD52分子的T细胞对阿伦单抗具有抗性，不会被清除，从而达到治疗的目的。
CD52是一种糖基磷脂酰肌醇（Glycosyl-phosphati-dylinositol，GPI）锚定糖蛋白，由12个氨基酸残基通过GPI连接于细胞膜表面。它是一种分布比较广泛的抗原，在造血系统中的淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞上都有表达，在很多淋巴系细胞恶性肿瘤和某些急性髓系白血病细胞上也有不同程度的表达。
因此，需要一种能有效敲除免疫细胞中CD52基因从而制备通用型CAR细胞的方法，以实现免疫细胞的异体回输。
发明内容
目前，CRISPR技术作为一种新的基因组工程化工具，由于其操作简单，靶向精确，已被广泛应用于细胞的基因组编辑和免疫疗法的开发中。最常用的包括II型、V型、VI型等CRISPR系统。以II型CRISPR系统为例，在外源DNA入侵时，来自CRISPR重复阵列的转录物被Cas9和RNase III核酸酶加工为成熟的crRNA，随后与tracrRNA和Cas9组成复合体。通过识别PAM，crRNA将该复合体引导至靶标DNA，并通过crRNA包含的间隔区序列与靶DNA的结合，解开DNA双链，再由Cas9中的HNH结构域剪切crRNA的互补DNA链，RuvC结构域剪切非互补链，最终在靶标DNA处引入双链断裂。人们还发现，引导Cas9结合并切割特定的DNA序列不需要RNA复合物。通过使用设计的嵌合单向导RNA（sgRNA）可以简单地实现该过程。
术语“单向导RNA”或“sgRNA”是指通过将crRNA和tracrRNA分子融合成“单个向导RNA”的人工工程化RNA，当与Cas9蛋白结合时，其能够识别并切割向导RNA特异性的DNA靶标。sgRNA中负责与靶标DNA互补的是其包含的间隔区序列。
sgRNA的设计需要考虑很多因素，例如长度、碱基组成、靶基因的结合位置、与非靶标位点的结合率、是否包含SNP、二级结构等等。目前已经可以通过各种在线工具来设计sgRNA。然而，由于Cas酶可以切割任何邻近PAM位点的靶序列，针对特定的靶基因而言，在线工具设计的大量sgRNA的编辑效率都不尽相同，甚至差异很大，例如，PAM位点是5'-NGG-3'的编辑效率通常就比5'-NGA-3'或5'-NAG-3'的高。因此，筛选特异性高的sgRNA对于CRISPR系统编辑效率的提高至关重要。
因此，在第一个方面，本发明提供了一种sgRNA分子，其包含的间隔区序列如SEQID NO：13所示。
在第二个方面，本发明还提供表达本发明所述的sgRNA的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。在第三个方面，本发明提供了一种在体外敲除免疫细胞中的CD52基因的方法，包括将该细胞与Cas9酶和sgRNA接触，其中所述sgRNA包含如SEQ ID NO：13所示的间隔区序列。
在一个实施方案中，所述Cas9酶是蛋白或编码核酸的形式，所述sgRNA是RNA分子、其编码核酸或载体的形式。例如，可以将免疫细胞与Cas9蛋白和sgRNA直接接触，或者将免疫细胞与Cas9蛋白的编码核酸和sgRNA接触，或者将免疫细胞与Cas9蛋白和sgRNA的编码核酸直接接触。
在一个实施方案中，所述免疫细胞是例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞等。优选地，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞或NKT细胞，所述T细胞优选CD4+CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞。优选地，所述方法进一步包括向所述免疫细胞中引入编码嵌合抗原受体或T细胞受体或两者的核酸。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。“配体结合结构域”是指可以与配体结合的任何结构或其功能性变体。配体结合结构域可以是抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其功能性片段。例如，配体结合结构域包括但不限于Fab、Fab'、Fv片段、F(ab')2、单链抗体（Single Chain AntibodyFragment, scFv）、单结构域抗体（Single Domain Antibody, sdAb）、纳米抗体（Nanobody，Nb）、抗原结合配体、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN等，优选选自Fab、scFv、sdAb和纳米抗体。在本发明中，配体结合结构域可以是单价或二价，且可以是单特异性、双特异性或多特异性的抗体。在另一个实施方案中，配体结合结构域也可以是特定蛋白的特异性结合多肽或受体结构，所述特定蛋白是例如PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL和NKG2D。
配体结合结构域的选择取决于待识别的与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记，例如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。因此，在一个实施方案中，本发明的配体结合结构域与选自以下的一个或多个靶标结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII 、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、Folate 受体α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自CD19、CD20、CD22、BAFF-R、CD33、EGFRvIII、BCMA、GPRC5D、PSMA、ROR1、FAP、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、CAIX、WT1、NY-ESO-1、CD79a、CD79b、GPC3、Claudin18.2、NKG2D和它们的任意组合。本领域技术人员可以根据待治疗的病症确定需要靶向的抗原，从而设计相应的嵌合抗原受体。例如，可以设计包含CD19抗体的嵌合抗原受体，用于治疗。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体靶向CD19、CD22或其组合。在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含（1）抗CD19抗体，其包含与SEQ ID NO：26第1-107位或SEQ ID NO：28第1-107位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列和与SEQ ID NO：26第123-242位或SEQ ID NO：28第123-238位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列，和/或（2）抗CD22抗体，其包含与SEQ ID NO：30第1-124位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO：30第143-249位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列。
如本文所用，术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞（例如淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞）表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能性片段。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自CD8α链，其与SEQ ID NO: 34所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，或所述CD8α跨膜结构域的编码序列与SEQ ID NO: 33所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含位于配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。如本文所用，术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至配体结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为配体结合结构域提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自CD8、CD4或CD28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链区包含CD8α链、FcγRIIIα受体、IgG4或IgG1的铰链区部分，更优选CD8α铰链，其与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，或者CD8α铰链的编码序列与SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分。胞内信号传导结构域负责在配体结合结构域结合抗原以后的细胞内初级信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达CAR的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的胞内信号传导结构域可以是T细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发初级信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞内信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor Tyrosine-basedActivation Motifs, ITAM）。本发明的胞内信号传导结构域的非限制性实例包括但不限于源自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的胞内信号传导结构域。在优选的实施方式中，本发明CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域与SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ IDNO：37所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能片段。“共刺激分子”是指在T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应（例如增殖）的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于1类MHC分子、BTLA和Toll配体受体。本发明的共刺激结构域的非限制性实例包括但不限于源自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18（LFA-1）、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1) 、CD276（B7-H3）、CD278(ICOS)、CD357（GITR）、DAP10、LAT、NKG2C、SLP76、PD1、LIGHT、TRIM以及ZAP70。优选地，本发明CAR的共刺激结构域来自4-1BB、CD28或4-1BB+CD28。在一个实施方案中，本发明的CAR包含的共刺激结构域与SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，或该共刺激结构域的编码序列与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含信号肽，使得当其在细胞例如T细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自CD8α、IgG1、GM-CSFRα等的信号肽。在一个实施方案中，可用于本发明的信号肽与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，或该信号肽的编码序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含开关结构，以调控CAR的表达。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外结合结构域，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构域分别连接结合结构域和信号传导结构域，仅当开关结构域互相结合（例如在诱导化合物的存在下）时，结合结构域和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外结合结构域，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外结合结构域，使其成为一个“普通”的CAR结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。
在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时（例如产生严重的毒副作用时）清除CAR细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如CD20表位、RQR8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除CAR细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK），该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是iCaspase-9，可以通过化学诱导药物如AP1903、AP20187等诱导iCaspase-9发生二聚化，从而激活下游的Caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。
在一个实施方案中，所述T细胞受体为靶向HBV、HPV E6、NYESO、mNY-ESO、WT1、MART-1、MAGE-A3、MAGE-A4、P53、Thyroglobulin或Tyrosinase的T细胞受体。
在一个实施方案中，嵌合抗原受体或T细胞受体可以通过载体引入宿主细胞。具体地，所述载体选自质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV)、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)、噬菌体、噬菌粒、粘粒或人工染色体。在一些实施方案中，该载体还包含在宿主细胞中自主复制的起始、选择标记、限制酶切割位点、启动子、多聚腺苷酸尾（polyA）、3’UTR、5’UTR、增强子、终止子 、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是质粒、慢病毒载体、AAV载体、腺病毒载体或逆转病毒载体。
在一个优选的实施方案中，本发明的免疫细胞还包含至少一种失活的选自以下的基因：GR、TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247ζ、HLA-I、HLA-II、B2M、免疫检查点基因如PD1、CTLA4、LAG3和TIM3。更特别地，免疫细胞中的至少TCR组分（包括TCRα、TCRβ基因）或CD3组分（包括CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247ζ）被失活。更优选地，本发明的免疫细胞中的CD52和TCRα被敲除。这种失活使得TCR-CD3复合物在细胞中没有功能。该策略对于避免移植物抗宿主病（GvHD）特别有用。使基因失活的方法是本领域已知的，例如通过大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALE核酸酶或CRISPR系统中的Cas酶介导DNA断裂，从而使该基因失活。
在第四个方面，本发明还提供根据本发明的方法获得的免疫细胞，包含所述免疫细胞的组合物，以及所述免疫细胞或组合物在制备用于治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。
在一个优选的实施方案中，可以用本发明的免疫细胞或组合物治疗的癌症包括但不限于急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、急性髓细胞白血病（AML）、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、转移性腺癌、肝转移瘤、肉瘤、骨肉瘤、食管癌、眼癌、头颈癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤、恶性胶质瘤、肝癌、非小细胞肺癌（NSCLC）、神经节细胞瘤、脑癌、肾癌和前列腺癌。可以用本发明的免疫细胞或组合物治疗的传染病包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。可以用本发明的免疫细胞或组合物治疗的自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。
在一个实施方案中，本发明的免疫细胞或组合物还可以与一种或多种额外的化疗剂、生物制剂、药物或治疗联用。在该实施方案中，化疗剂、生物制剂、药物或治疗选自放射疗法、手术、抗体试剂和/或小分子和它们的任意组合。
本发明的优点在于，筛选到的sgRNA可以高效敲除CD52基因，从而使获得的免疫细胞对阿伦单抗产生抗性，可以用于制备通用型CAR细胞。
下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
附图说明
图1示出了本发明的UCART中TCRα和CD52基因编辑的效率。
图2示出了Mock CART和UCART中CAR的表达水平。
图3示出了Mock CART和UCART细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
图4示出了Mock CART和UCART细胞的IL2和IFN-γ释放水平。
具体实施方式
实施例1. 制备sgRNA
设计针对CD52基因外显子的sgRNA，其在基因上的靶序列是唯一的。将合成的sgRNA寡聚核苷酸正反向序列等比例混合，在PNK酶的作用下37℃反应30分钟，然后在95℃反应5分钟使PNK酶失活，并慢慢退火至室温，获得sgRNA的双链DNA产物。
将上述获得的DNA产物克隆至T7U2载体，并通过测序确认目标序列的正确插入。
然后，用EcoRI酶对上述表达载体进行酶切，纯化回收后获得线性化载体。然后，根据制造商的建议，以该线性化载体为模板，用MEGAscript® T7 High YieldTranscription Kit试剂盒（Invitrogen，货号AM1334）制备sgRNA，并用Fastpure cell/Tissue total RNA isolation kit试剂盒（Vazyme，货号RC101-01）进行纯化，获得纯化的sgRNA。
实施例2. 敲除T细胞中的CD52基因
本发明实施例中使用的T细胞是通过Ficoll-PaqueTM PREMIUM(GE Healthcare)采用白细胞分离术从健康供体分离的原代人T细胞。
用DynaBeads CD3/CD28 CTSTM（Gibco,货号40203D）刺激T细胞，并在37℃和5％CO2下培养3天。然后，使用BTX Agile Pulse Max电穿孔仪（Harvard Apparatus BTX），以400V、0.7ms将10ug Cas9蛋白和10ug sgRNA电转染进激活的T细胞内，获得CD52敲除的T细胞。电转染之后，立即将T细胞放入1mL预热的培养基中，并在IL-2（300IU/mL）存在下，在37℃和5％CO2下培养。3天后，使用PE Mouse Anti-Human CD52（BD Pharmingen，货号562945）抗体，通过流式细胞仪检测CD52的表达，从而获得CD52的敲除效率。未转染Cas9蛋白和sgRNA的T细胞用作对照。敲除效率的结果如表1所示。
表1 不同sgRNA对CD52基因的敲除效率
编号 SEQ ID NO 序列 敲除效率
sgRNA-1 1 GCUATTCCAGGAGGCAGCUU 0
sgRNA-2 2 GGCAGCUUUGGUAGCAUCCC 0
sgRNA-3 3 GUAGCAUCCCAGGUGCCCAG 0
sgRNA-4 4 CACCAUCAGCCUCCUGGUUA 7%
sgRNA-5 5 CAGCCUCCUGGUUAUGGUAC 0
sgRNA-6 6 GGAGGCUGAUGGUGAGUAGG 37%
sgRNA-7 7 UGAUGGUGAGUAGGAGGAAG 6%
sgRNA-8 8 GGACAGGUAAGAGCAACGCC 0
sgRNA-9 9 GGAUCCAGCAACAUAAGCGG 0
sgRNA-10 10 GGCCAGUUUGUAUCUGUAGG 0
sgRNA-11 11 GGGCAUUGGCCACGAAGAAA 0
sgRNA-12 12 UUACCUGUACCAUAACCAGG 90%
sgRNA-13 13 GGACCUGUACCAUAACCAGG 90%
sgRNA-14 14 GUACAGGUAAGAGCAACGCC 0
sgRNA-15 15 UGGCAUUGGCCACGAAGAAA 0
sgRNA-16 16 GGGCAUUGGCCACGAAGAAA 0
sgRNA-17 17 UCAGCAUCCAGCAACAUAAG 40%
sgRNA-18 18 GGAGCAUCCAGCAACAUAAG 40%
sgRNA-19 19 UUAUGUUGCUGGAUGCUGAG 69%
sgRNA-20 20 GGAUGUUGCUGGAUGCUGAG 69%
sgRNA-21 21 GAAGAGGUGGAUUAUGGCAU 7%
sgRNA-22 22 GGAGGCUGAUGGUGAGUAGG 46%
sgRNA-23 23 GGGGGCUGAUGGUGAGUAGG 17%
从以上结果可以看出，不同的sgRNA对CD52基因的敲除效率不同。在筛选的23个sgRNA序列中，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的sgRNA敲除效率最高，达到90%，显著高于其他筛选的sgRNA。
根据实施例1所述的方法制备SEQ ID NO：12、13、17、18、19、20所示的sgRNA，并用Fastpure cell/Tissue total RNA isolation kit试剂盒（Vazyme，货号RC101-01）进行纯化，然后用NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific）定量sgRNA。结果如表2所示。
表2 不同sgRNA体外转录的产量
编号 SEQ ID NO 序列 产量
sgRNA-12 12 UUACCUGUACCAUAACCAGG 8-10ug
sgRNA-13 13 GGACCUGUACCAUAACCAGG 50-70ug
sgRNA-17 17 UCAGCAUCCAGCAACAUAAG 8-10ug
sgRNA-18 18 GGAGCAUCCAGCAACAUAAG 50-70ug
sgRNA-19 19 UUAUGUUGCUGGAUGCUGAG 8-10ug
sgRNA-20 20 GGAUGUUGCUGGAUGCUGAG 50-70ug
从表2可以看出，SEQ ID NO：13、18、20在同等条件下的体外转录产量分别高于SEQID NO：12、17、19，大约高出7倍。
因此，与筛选的其他sgRNA相比，SEQ ID NO：13不仅敲除效率最高，而且体外转录的产量也很高，具有显著效果。
实施例3. 制备敲除TCRα和CD52的UCART细胞
1.制备CD19-22 CART细胞
合成以下编码序列，并将其克隆至pGEM-T Easy载体（Promega，货号A1360）：CD8α信号肽（SEQ ID NO：31）、抗CD19 scFv（SEQ ID NO：25）、抗CD22 scFv（SEQ ID NO：29）、CD8α铰链区（SEQ ID NO：39）、CD8α跨膜区（SEQ ID NO：33）、4-1BB共刺激结构域（SEQ ID NO：35）、CD3ζ胞内信号传导结构域（SEQ ID NO：38），并通过测序确认目标序列的正确插入。
在无菌管中加入3mL Opti-MEM（Gibco，货号31985-070）稀释上述质粒后，再根据质粒:病毒包装载体:病毒包膜载体=4:2:1的比例加入包装载体psPAX2（Addgene，货号12260）和包膜载体pMD2.G（Addgene，货号12259）。然后，加入120uL X-treme GENE HP DNA转染试剂（Roche，货号06366236001），立即混匀，于室温下孵育15分钟，然后将质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到293T细胞的培养瓶中。在24小时和48小时收集病毒，将其合并后，超速离心（25000g，4℃，2.5小时）获得浓缩的慢病毒。
用DynaBeads CD3/CD28 CTSTM（Gibco,货号40203D）激活T细胞，并在37℃和5％CO2下培养1天。然后，加入浓缩的慢病毒，持续培养3天后，获得CD19-22 CART细胞。
2.敲除TCRα和CD52
使用BTX Agile Pulse Max电穿孔仪（Harvard Apparatus BTX），在400V、0.7ms条件下，将10μg Cas9蛋白、5μg CD52 sgRNA（SEQ ID NO：13）和5μg TRCα sgRNA（SEQ ID NO：24）电转染进激活的CD19-22 CART细胞内，获得TCRα/CD52双敲除的CD19-22 CART 细胞（UCART）。未敲除TCRα和CD52的CD19-22 CART细胞用作阳性对照（Mock CART）。未转染CAR的野生型T细胞用作阴性对照（NT）。
3.编辑效率和CAR水平检测
将Mock CART和UCART细胞在37℃和5％CO2下培养11天之后，使用APC-anti humanCD3（BD Pharmingen，货号）和PE-anti human CD52（biolegend，货号）抗体，通过流式细胞仪检测TCRα和CD52的基因编辑效率，结果如图1所示。
可以看出，UCART中TCRα/CD52的双敲除效率可达到约85%，表明本发明选择的sgRNA可以有效敲除TCRα和CD52。
此外，将Mock CART和UCART细胞在37℃和5％CO2下培养11天之后，使用Biotin-SP(long spacer) AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, F(ab')2 Fragment Specific(min XHu, Bov, Hrs Sr Prot)（jackson immunoresearch，货号115-065-072）作为一抗，APCStreptavidin（BD Pharmingen，货号554067）或PE Streptavidin（BD Pharmingen，货号554061）作为二抗，通过流式细胞仪检测CART细胞上的CAR的表达水平，结果如图2所示。
可以看出，UCART中的CAR表达水平与Mock CART相当，表明TCRα/CD52的敲除不影响CAR的表面表达。
实施例4. UCART细胞的杀伤效果和细胞因子分泌水平
1. 对靶细胞的杀伤效果
当T细胞对靶细胞有杀伤时，靶细胞的数量就会减少。将T细胞和带有可表达荧光素酶的靶细胞共培养后，靶细胞数量减少的同时，分泌的荧光素酶也会随之减少。荧光素酶可以催化荧光素转化为氧化性荧光素，而在此氧化过程中，会产生生物发光，并且这种发光的强度将取决于靶细胞表达的荧光素酶的水平。因此，检测的荧光强度能够反应T细胞对靶细胞的杀伤能力。
为了检测UCART细胞对靶细胞的杀伤能力，首先以1×104/孔的浓度将携带荧光素基因的Raji靶细胞铺入96孔板中，然后以32:1、16:1、8:1、4:1、2:1或1:1的效靶比（即效应T细胞与靶细胞之比）将UCART、未转染T细胞（阴性对照）和Mock CART细胞（阳性对照）铺入到96孔板进行共培养，16-18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：（靶细胞荧光均值-样品荧光均值）/靶细胞荧光均值×100%，计算得到杀伤效率，结果如图3所示。
可以看出，与NT相比，UCART和Mock CART组细胞都能够有效杀伤靶细胞，且两组杀伤效果无显著性差异。
2. 细胞因子的分泌水平T细胞杀伤靶细胞时，靶细胞数量减少的同时也会释放细胞因子IL2和IFN-γ等。根据以下步骤，使用酶联免疫吸附法（ELISA）来测定UCART细胞杀伤靶细胞时细胞因子IL2和IFN-γ的释放水平。
（1）收集细胞共培养上清液
以1×105/孔的浓度将靶细胞（Raji）和非靶细胞（293F）分别铺于96孔板中，然后以1:1的比例将UCART、NT细胞（阴性对照）和Mock CART细胞（阳性对照）分别与靶细胞或非靶细胞共培养，18-24小时后收集细胞共培养上清液。
（2）ELISA检测上清中IL2和IFN-γ的分泌量
用ELISA测定上清液中细胞因子IL2、IFN-γ分泌量。使用捕获抗体 Purifiedanti-human IL-2 Antibody（Biolegend，货号500302）和Purified anti-human IFN-γAntibody（Biolegend，货号506502）分别包被96孔板4℃孵育过夜，然后移除抗体溶液，加入250μL含有2% BSA（sigma，货号V900933-1kg）的PBST（含0.1%吐温的1×PBS）溶液，37℃孵育2小时。然后每孔加入50μL细胞共培养上清液或标准品，并在37℃孵育1小时。用250μL PBST（含0.1%吐温的1×PBS）清洗板之后，向各孔分别加入50μL检测抗体 Biotin anti-humanIL-2 Antibody（Biolegend，货号517605）和 Anti-Interferon gamma抗体[MD-1](Biotin) (abcam，货号ab25017) ，在37℃孵育1小时。再加入HRP Streptavidin（Biolegend，货号405210），在37℃孵育30分钟后，弃上清液，用250μL PBST（含0.1%吐温的1×PBS）清洗。向各孔加入50μL TMB底物溶液。使反应在室温下于暗处发生30分钟，之后向各孔中加入50μL 1mol/L H2SO4以停止反应。在停止反应的30分钟内，使用酶标仪检测450nm处吸光度，并根据标准曲线（根据标准品的读值和浓度绘制）计算细胞因子的含量，结果如图4所示。
可以看出，在非靶细胞293F中均没有检测到细胞因子的释放，而仅在靶细胞Raji中检测到细胞因子释放，表明UCART细胞和Mock CART细胞的杀伤都是特异性的。并且，在杀伤靶细胞时，UCART细胞和Mock CART细胞的IL2和IFN-γ的分泌水平相当，且远远高于NT细胞。这表明TCRα和CD52的敲除也不会影响细胞因子的分泌水平。
需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京北恒生物科技有限公司
<120> 工程化免疫细胞的制备及其用途
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcuattccag gaggcagcuu 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcagcuuug guagcauccc 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
guagcauccc aggugcccag 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccaucagc cuccugguua 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagccuccug guuaugguac 20
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaggcugau ggugaguagg 20
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ugauggugag uaggaggaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggacagguaa gagcaacgcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggauccagca acauaagcgg 20
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggccaguuug uaucuguagg 20
<210> 11
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggcauuggc cacgaagaaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
uuaccuguac cauaaccagg 20
<210> 13
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggaccuguac cauaaccagg 20
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<212> RNA
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guacagguaa gagcaacgcc 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uggcauuggc cacgaagaaa 20
<210> 16
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggcauuggc cacgaagaaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcagcaucca gcaacauaag 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggagcaucca gcaacauaag 20
<210> 19
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
uuauguugcu ggaugcugag 20
<210> 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggauguugcu ggaugcugag 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaagaggugg auuauggcau 20
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggaggcugau ggugaguagg 20
<210> 23
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gggggcugau ggugaguagg 20
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agagucucuc agcugguaca 20
<210> 25
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720
tcctca 726
<210> 26
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 27
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gacatccaga tgacccagag ccctgccagc ctgtctacca gcctgggcga gacagtgacc 60
atccagtgtc aggccagcga ggacatctac tctggcctgg cttggtatca gcagaagccc 120
ggcaagagcc ctcagctgct gatctacggc gccagcgacc tgcaggacgg cgtgcctagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggaacccag tacagcctga agatcaccag catgcagacc 240
gaggacgagg gcgtgtactt ctgccagcaa ggcctgacct accctagaac cttcggagga 300
ggcaccaagc tggaactgaa gggcggaggc ggaagtggag gcggaggatc tggcggcgga 360
ggctctgaag tgcagctgca gcagtctggc gctgaactgg tccggcctgg cactagcgtg 420
aagctgtcct gcaaggtgtc cggcgacacc atcaccttct actacatgca cttcgtgaag 480
cagaggccag gacagggcct ggaatggatc ggcagaatcg accctgagga cgagagcacc 540
aagtacagcg agaagttcaa gaacaaggcc accctgaccg ccgacaccag cagcaacacc 600
gcctacctga agctgtctag cctgacctcc gaggacaccg ccacctactt ttgcatctac 660
ggcggctact acttcgacta ctggggccag ggcgtgatgg tcaccgtgtc cagc 714
<210> 28
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Gln Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Met Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Leu Thr Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Lys Val Ser Gly Asp Thr Ile Thr Phe Tyr Tyr Met His Phe Val Lys
145 150 155 160
Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Glu
165 170 175
Asp Glu Ser Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Lys Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ile Tyr Gly Gly Tyr Tyr
210 215 220
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
225 230 235
<210> 29
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
caggtgcagc tgcagcagtc tggacccggc ctcgtgaagc ctagccagac cctgtctctg 60
acctgcgcca tcagcggcga tagcgtgtcc agcaatagcg ccgcctggaa ctggatccgg 120
cagagccctt ctagaggcct ggaatggctg ggccggacct actaccggtc caagtggtac 180
aacgactacg ccgtgtccgt gaagtcccgg atcaccatca accccgacac cagcaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa cagcgtgacc cccgaggata ccgccgtgta ctactgcgcc 300
agagaagtga ccggcgacct ggaagatgcc ttcgacatct ggggccaggg cacaatggtc 360
accgtgtcta gcggcagtgg aaagggctca acgtcacccg gttccgggga ggggtcaact 420
aagggcgata ttcagatgac acagagcccc tccagcctgt ccgcctctgt gggagacaga 480
gtgacaatca cctgtcgggc ctcccagacc atctggtcct atctgaattg gtatcagcag 540
cggcctggca aggcccccaa cctgctgatc tatgccgcca gctctctgca gtccggcgtg 600
ccatctagat tcagcggcag aggcagcggc accgatttca ccctgacaat tagcagtctg 660
caggccgagg acttcgccac ctactattgc cagcagagct acagcatccc ccagaccttc 720
ggccagggaa caaaactgga aatcaaa 747
<210> 30
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly Lys
115 120 125
Gly Ser Thr Ser Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile
130 135 140
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 31
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 32
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 33
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gcaaa 75
<210> 34
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
20 25
<210> 35
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120
<210> 36
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
1 5 10 15
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
35 40
<210> 37
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 38
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 39
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 40
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45

Claims (12)

1.一种sgRNA分子，其包含的间隔区序列如SEQ ID NO：13所示。
2.一种核酸分子，其编码根据权利要求1所述的sgRNA分子。
3.一种载体，其包含根据权利要求2所述的核酸分子。
4.一种制备工程化免疫细胞的方法，包括将免疫细胞与Cas9酶和根据权利要求1所述的sgRNA接触从而敲除CD52基因，其中所述免疫细胞是T细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述Cas9酶是蛋白或编码核酸的形式，所述sgRNA是RNA分子、其编码核酸或载体的形式。
6.根据权利要求5所述的方法，进一步包括向所述免疫细胞引入编码嵌合抗原受体的核酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述配体结合结构域是靶向CD19、CD22或两者的抗体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述配体结合结构域包含：（1）抗CD19抗体，其包含如SEQ ID NO：26第1-107位或SEQ ID NO：28第1-107位所示的轻链可变区序列和如SEQ IDNO：26第123-242位或SEQ ID NO：28第123-238位所示的重链可变区序列，和/或
（2）抗CD22抗体，其包含如SEQ ID NO：30第1-124位所示的重链可变区序列和如SEQ IDNO：30第143-249位所示的轻链可变区序列。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述跨膜结构域是CD8α的跨膜结构域。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述共刺激结构域是CD137的共刺激信号传导结构域。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述胞内信号传导结构域是CD3ζ的信号传导结构域。
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