CN111849913A

CN111849913A - 工程化免疫细胞及其用途

Info

Publication number: CN111849913A
Application number: CN202010639706.8A
Authority: CN
Inventors: 邢芸; 闫忠辉; 熊瑛; 浦容容; 任江涛; 贺小宏; 王延宾; 韩露
Original assignee: Nanjing Bioheng Biotech Co Ltd
Current assignee: Nanjing Bioheng Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: CN111849913B

Abstract

本发明涉及一种工程化免疫细胞，其表达嵌合抗原受体、外源性的Flt3L基因和DLL1基因，以及任选的XCL1和/或XCL2基因。本发明还提供了该工程化免疫细胞在治疗癌症、感染或自身免疫性疾病中的用途。与传统的CAR细胞相比，本发明的工程化免疫细胞具有显著提高的肿瘤杀伤活性。

Description

工程化免疫细胞及其用途

技术领域

本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及一种工程化免疫细胞，其表达嵌合抗原受体、外源性的Flt3L基因和DLL1基因，以及任选的XCL1和/或XCL2基因。

背景技术

肿瘤免疫治疗主要是通过调节人体免疫系统和肿瘤微环境，最终依靠自身免疫来清除肿瘤细胞。免疫系统是一个统一的整体，固有免疫在肿瘤免疫中也起到十分重要的作用。

一些抗原递呈细胞，如树突状细胞及巨噬细胞是固有免疫和获得性免疫的连接桥梁。抗原递呈细胞可以对肿瘤抗原进行识别并递呈给获得性免疫系统，激活肿瘤特异性T细胞，进而对肿瘤进行清除。因而通过增强抗原递呈过程来增加免疫系统杀伤肿瘤的效果是肿瘤免疫的重要研究方向。

传统1型树突状细胞（conventional DC1，cDC1）是树突状细胞的一类亚群。研究结果显示cDC1可以有效递呈肿瘤相关抗原，尤其是死细胞相关抗原，有效诱导抗原特异性CD8+T细胞应答，在体内肿瘤杀伤过程中发挥极其重要的作用。在小鼠及人的研究中均显示，cDC1在肿瘤微环境中的分布与抗肿瘤免疫应答呈正相关，是一个重要的肿瘤相关免疫评分的评价参数。cDC1在小鼠及人体内分布较少，在肿瘤免疫应答率低的小鼠及人肿瘤微环境中几乎不可见。优化cDC1在肿瘤治疗中的作用是提高肿瘤免疫治疗的一个重要研究方向。

CAR细胞治疗是重要的肿瘤细胞免疫疗法。CAR细胞成功控制肿瘤一般而言需要经过以下几个过程：免疫系统激活、CAR细胞的活化和扩增、活化的CAR细胞浸润肿瘤组织并杀死肿瘤细胞。然而，目前CAR细胞疗法普遍存在一个问题，即肿瘤微环境对CAR细胞有抑制作用，使得CAR细胞无法浸润肿瘤组织。因此，如何降低肿瘤微环境对CAR细胞的抑制作用，对于提高CAR细胞的治疗效果非常重要。

因此，需要一种新的免疫治疗手段，促进树突状细胞在肿瘤治疗中的效果，降低肿瘤微环境对免疫细胞的抑制作用，从而提高细胞治疗的疗效。

发明简述

在第一个方面，本发明提供一种新的工程化免疫细胞，其表达嵌合抗原受体、外源性的Flt3L基因和DLL1基因。

在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞进一步表达外源性的XCL1和/或XCL2基因。

在一个实施方案中，所述免疫细胞是选自T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。优选地，所述T细胞是CD4+/CD8+ T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞或αβ-T细胞。

在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。其中，配体结合结构域可以选自scFv、Fab、单结构域抗体、纳米抗体、抗原结合配体、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN。优选地，所述配体结合结构域选自scFv、Fab、单结构域抗体和纳米抗体。

在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体与选自以下的靶标结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII 、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、TnAg、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、 VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、AFP、Folate 受体α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、CS1、CD138、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、MUC1、AFP、Folate 受体α、CEA、PSCA、PSMA、Her2、EGFR、IL13Ra2、GD2、NKG2D、EGFRvIII、CS1、BCMA、间皮素和它们的任意组合。

在一个实施方案中，所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。优选地，跨膜结构域选自CD8α、CD4、CD28和CD278的跨膜结构域。

在一个实施方案中，所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。优选地，所述胞内信号传导结构域是包含CD3ζ的信号传导结构域。

在一个实施方案中，所述共刺激结构域是一个或多个选自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18（LFA-1）、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD276（B7-H3）、CD278(ICOS)、CD357（GITR）、DAP10、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。优选地，所述共刺激结构域是CD27、CD28、CD134、CD137或CD278的共刺激信号传导结构域或它们的组合。

在第二个方面，本发明提供一种核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的核酸序列、编码Flt3L的核酸序列和编码DLL1的核酸序列。优选地，本发明的核酸分子进一步包含编码XCL1和/或XCL2的核酸序列。优选地，所述核酸是DNA或RNA。

本发明还提供包含上述核酸分子的载体。具体地，所述载体选自质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV)、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，该载体还包含在免疫细胞中自主复制的起点、选择标记、限制酶切割位点、启动子、多聚腺苷酸尾（polyA）、3’UTR、5’UTR、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。

在一个实施方案中，本发明还提供一种试剂盒，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体。

在一个实施方案中，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体，和一种多种药学上可接受的赋型剂。

在第三个方面，本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞或药物组合物。

在一个实施方案中，本发明还提供根据本发明的工程化免疫细胞、核酸分子、载体、试剂盒或药物组合物在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。

在一个实施方案中，所述癌症选自：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小型非裂化细胞性NHL、大肿块病NHL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤等)、白血病（包括急性白血病，例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病诸如急性粒细胞白血病（包括未分化型和部分分化型）、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、红白血病、急性巨核细胞白血病；慢性白血病，例如慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病；和其他特殊类型的白血病例如毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、浆细胞白血病、成人T细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病等）、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、恶性淋巴组织增生疾病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)。

在一个实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。

在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。

本发明的工程化免疫细胞的优势之处在于，共表达的Flt3L和DLL1以及任选的XCL1和/或XCL2能够有效促进DC细胞的分化，增加DC细胞数量，一方面降低肿瘤微环境对CAR细胞的抑制作用，提高CAR细胞的肿瘤杀伤能力，另一方面增加的DC细胞能够激活并加强自身固有的免疫系统，与CAR细胞形成协同效应，最终增强对肿瘤的抑制。

附图说明

图1：Panc02-mCD19细胞的CD19表达率。

图2：通过流式细胞术测定的CAR-T细胞的CAR表达水平。

图3：通过流式细胞术测定的CAR-T细胞的DLL1表达水平。

图4：通过ELISA测定的CAR-T细胞的Flt3L表达水平。

图5：CAR-T细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养后的IFN-γ释放水平。

图6：高剂量（A）和低剂量（B）的CAR-T细胞在小鼠胰腺癌模型中对肿瘤生长的抑制效果。ns，差异不显著；****，P<0.0001。

图7：用低剂量CAR-T细胞治疗小鼠胰腺癌后，小鼠的体重变化曲线。

图8：用低剂量CAR-T细胞治疗小鼠胰腺癌后，小鼠的肿瘤生长曲线。

图9：用低剂量CAR-T细胞治疗小鼠胰腺癌后，小鼠的存活曲线。

发明详述

除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。

嵌合抗原受体

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括配体结合结构域（例如抗体的抗原结合部分）、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，各个结构域之间通过接头连接。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。非MHC限制性的抗原识别给予表达CAR的T细胞与抗原处理无关的识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞内表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)的α链和β链二聚化。

如本文所用，“配体结合结构域”是指可以与配体结合的任何结构或其功能性变体。配体结合结构域可以是抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其功能性片段。例如，配体结合结构域包括但不限于Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、单链抗体（Single Chain Antibody Fragment, scFv）、单结构域抗体（Single Domain Antibody, sdAb）、纳米抗体（Nanobody，Nb）、抗原结合配体、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN等，优选选自Fab、scFv、sdAb和纳米抗体。在本发明中，配体结合结构域可以是单价或二价，且可以是单特异性、双特异性或多特异性的抗体。在另一个实施方案中，配体结合结构域也可以是特定蛋白的特异性结合多肽或受体结构，所述特定蛋白是例如PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL和NKG2D。

“Fab”是指免疫球蛋白分子被木瓜蛋白酶裂解后产生的两个相同片段中的任一个，由通过二硫键连接的完整轻链和重链N端部分组成，其中重链N端部分包括重链可变区和CH1。与完整的IgG相比，Fab没有Fc片段，流动性和组织穿透能力较高，并且无需介导抗体效应即可单价结合抗原。

“单链抗体”或“scFv”是由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过接头连接而成的抗体。可以选择接头的最佳长度和/或氨基酸组成。接头的长度会明显影响scFv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的接头(例如在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。关于接头的大小和组成的选择，参见例如，Hollinger等人,1993ProcNatl Acad .Sci .U .S .A .90:6444-6448；美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公布号WO2006/020258和WO2007/024715，其全文通过引用并入本文。scFv可以包含以任何顺序连接的VH和VL，例如VH-接头-VL或VL-接头-VH。

“单结构域抗体”或“sdAb”是指一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区，也称为“重链抗体”。

“纳米抗体”或“Nb”是指单独克隆并表达出来的VHH结构，其具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。

术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰优选是保守型修饰。

如本文所用，术语“保守性修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变而引入本发明的嵌合抗原受体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。

因此，“功能性变体”或“功能性片段”与亲本氨基酸序列具有至少75%，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且保留亲本氨基酸的生物活性，例如结合活性。

如本文所用，术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如Blast (Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol .147：195-197)和ClustalW。

配体结合结构域的选择取决于待识别的与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记，例如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。因此，在一个实施方案中，本发明的配体结合结构域与选自以下的一个或多个靶标结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、 VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、Folate 受体α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自：CD19、CD20、CD22、BAFF-R、CD33、EGFRvIII、BCMA、GPRC5D、PSMA、ROR1、FAP、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、CAIX、WT1、NY-ESO-1、CD79a、CD79b、GPC3、Claudin18.2、NKG2D和它们的任意组合。根据待靶向的抗原，本发明的CAR可以被设计为包括对该抗原具有特异性的配体结合结构域。例如，如果CD19是待靶向的抗原，则CD19抗体可用作本发明的配体结合结构域。在优选的实施方式中，本发明CAR包含CD19 scFv，其与SEQ ID NO: 2或14所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或者CD19 scFv的编码序列与SEQ ID NO: 1或13所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

如本文所用，术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞（例如淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞）表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能性片段。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自CD8α链或CD28，其与SEQ ID NO:4、16或42所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:3、15或43所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含位于配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。如本文所用，术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至配体结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为配体结合结构域提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自CD8、CD4、FcγRIIIα受体、IgG4或IgG1或CD28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链区包含CD8α链、FcγRIIIα受体、IgG4或IgG1的铰链区部分，更优选来自CD8α、CD28或IgG4的铰链，其与SEQ ID NO:12、22、48或50所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或者其编码序列与SEQ ID NO:11、21、49或51所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分。胞内信号传导结构域负责在配体结合结构域结合抗原以后的细胞内初级信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达CAR的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的胞内信号传导结构域可以是T细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发初级信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞内信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor Tyrosine-basedActivation Motifs, ITAM）。本发明的胞内信号传导结构域的非限制性施例包括但不限于源自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在优选的实施方式中，本发明CAR的信号转导结构域可以包含CD3ζ信号传导结构域，该信号传导结构域与SEQ ID NO:8或20所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:7或19所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能片段。“共刺激分子”是指在T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应（例如增殖）的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于1类MHC分子、BTLA和Toll配体受体。本发明的共刺激结构域的非限制性施例包括但不限于源自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18（LFA-1）、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD276（B7-H3）、CD278(ICOS)、CD357（GITR）、DAP10、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM以及ZAP70。优选地，本发明CAR的共刺激结构域来自4-1BB、CD28或4-1BB+CD28。在一个实施方案中，4-1BB共刺激结构域与SEQ ID NO:6或18所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:5或17所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一个实施方案中，CD28共刺激结构域与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含信号肽，使得当其在细胞例如T细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自B2M、CD8α、IgG1、GM-CSFRα等的信号肽。在一个实施方案中，可用于本发明的来自B2M或CD8α的信号肽与SEQ ID NO:10、34或46所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:9、33或47所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含开关结构，以调控CAR的表达时间。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外结合结构域，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构域分别连接结合结构域和信号传导结构域，仅当开关结构域互相结合（例如在诱导化合物的存在下）时，结合结构域和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外结合结构域，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外结合结构域，使其成为一个“普通”的CAR结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时（例如产生严重的毒副作用时）清除CAR细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如CD20表位、RQR8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除CAR细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK），该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是iCaspase-9，可以通过化学诱导药物如AP1903、AP20187等诱导iCaspase-9发生二聚化，从而激活下游的Caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。

在一个实施方案中，本发明的CAR包含配体结合结构域、CD28或CD8的跨膜区、CD28共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR包含配体结合结构域、CD28或CD8的跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR包含配体结合结构域、CD28或CD8的跨膜区、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。

基因

酪氨酸激酶受体3配体（Fms-like tyrosine kinase 3 ligand, Flt3L）是一种细胞因子，其可以与fms样酪氨酸激酶受体3（fms-like tyrosine kinase 3 receptor, Flt3R）特异性结合，从而促进DC细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞等的增殖、分化和成熟。Flt3L广泛存在于任和鼠的组织和器官中。Flt3L在人的外周血的单核细胞中表达最高，其次是在心脏、胎盘、肺、脾脏、胸腺、卵巢、小肠、肝脏、肾脏和胰腺中，在脑组织中表达最低。

研究表明，Flt3L可以与细胞因子，如IL-6、IL-7、IL-13等促进T细胞增殖。此外，Flt3L对B细胞的早期分化、NK细胞、DC等血源性前体细胞的分化具有重要影响。特别地，由于只有不成熟的DC才能表达Flt3R，因此Flt3L可以选择性地扩增DC前体细胞，促进DC的分化。已有研究表明，向小鼠皮下注射Flt3L可以显著增加其淋巴和非淋巴组织中的DC数量。据报道，携带Flt3L的重组腺病毒载体和化疗药物5-氟尿嘧啶联合应用在肝癌或直肠癌的小鼠模型中取得显著的抗肿瘤效果。具体地，Flt3L通过刺激骨髓免疫细胞的增殖和分化，有效保护了化疗药物引起的骨髓损伤，而肿瘤局部增殖的DC则有效地呈递了被5-氟尿嘧啶和NK细胞杀伤的肿瘤细胞的碎片，从而激起特异性抗肿瘤免疫反应。

在一个实施方案中，本发明使用的Flt3L与SEQ ID NO：24或28所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或Flt3L的编码序列与SEQ ID NO：23或27所示的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

基因

DLL1作为重要的Notch配体，是一种单次跨膜蛋白。它的胞外区具有数量不等的表皮生长因子样重复序列, 并且在保守的N端具有Notch受体结合和活化所必需的DSL基序。

Notch信号通路是细胞间通信的重要途径，并且高度保守，通过调控细胞的分化、增殖、凋亡的命运选择，在胚胎正常发育、机体稳态调控以及成体干细胞的维持中发挥重要作用。因此，Notch信号通路的缺陷涉及许多疾病，包括T-ALL (t细胞急性淋巴细胞白血病)、CADASIL(伴有皮层下梗死和白质脑病的脑常染色体显性动脉病变)、多发性硬化(MS)、法洛四联症、Alagille综合征等许多疾病等。已有研究表明，在乳腺癌和肺癌的小鼠模型中过表达DLL1能够促进CD8+T细胞的肿瘤浸润和IFNγ的分泌,从而诱导肿瘤血管正常化，抑制肿瘤生长。此外，据报道，在小鼠黑色素瘤模型中，DLL1的表达上调会显著抑制肿瘤血管的形成，从而抑制肿瘤的生长。

在一个实施方案中，本发明使用的DLL1与SEQ ID NO：26或30所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或DLL1的编码序列与SEQ ID NO：25或29所示的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

和XCL2基因

C型趋化因子家族又称淋巴趋化因子，包括两个成员XCL1和XCL2，主要由CD8+T细胞和自然杀伤细胞产生。XCL1具有两种可相互转换的蛋白空间构象,使得XCL1有别于其他趋化因子并发挥独特的功能。XCL1特异性受体XCR1是G蛋白偶联受体家族成员，二者相互作用不仅在胸腺的阴性选择和建立自身免疫耐受中发挥重要作用，而且能启动交叉抗原呈递并介导细胞毒性免疫反应。XCL1不仅能调节免疫系统平衡，维持肠道免疫稳态，而且与多种疾病相关，如自身免疫病、肾炎、结核和人类免疫缺陷病毒感染等。XCL2与XCL1的核酸序列具有97%同一性，导致其氨基酸序列中仅第7位和第8位两个氨基酸残基不同：XCL1中为Asp和Lys，XCL2中为His和Arg。研究发现，XCL2与XCL1在表达谱、结构和功能上均非常相似，例如与XCL1一样，XCL2也具有单体型和二聚体型两种可相互转换的蛋白空间构象，其中单体型构象结合并激活XCR1，二聚体型构象对葡糖氨基聚糖类（Glycosaminoglycan，GAG）中的发夹结构具有更高的亲和力。XCL1和XCL2的受体XCR1选择性地表达在具有抗原呈递能力的DC（cDC1）细胞上，有研究发现引入XCL1可有效提高抗肿瘤免疫治疗和靶向疫苗的疗效。

在一个实施方案中，本发明使用的XCL1与SEQ ID NO：36或38所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或XCL1的编码序列与SEQ ID NO：35或37所示的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明使用的XCL2与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或XCL2的编码序列与SEQ ID NO：39所示的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

核酸

本发明还提供一种核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的核酸序列、编码Flt3L的核酸序列和编码DLL1的核酸序列。优选地，本发明的核酸分子还包含编码XCL1和/或XCL2的核酸序列。

如本文所用，术语 “核酸分子”包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的RNA或DNA，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括DNA (比如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA(比如dsRNA、ssRNA、mRNA、ivtRNA)，它们的组合或衍生物(比如PNA)。优选地，所述核酸是DNA或RNA，更优选mRNA。

核酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，比如在肽核酸(PNA)中发现的)。本发明的核酸还可含有一种或多种经修饰的碱基，比如，例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基(比如肌苷)。也可以想到其它修饰，包括化学、酶促或代谢修饰，只要本发明的多链CAR可以从多核苷酸表达即可。核酸可以以分离的形式提供。在一个实施方案中，核酸也可以包括调节序列，比如转录控制元件(包括启动子、增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号)、核糖体结合位点、内含子等。

可以对本发明的核酸序列进行密码子优化以在所需的宿主细胞(如，免疫细胞)中进行最佳表达；或者用于在细菌、酵母菌或昆虫细胞中表达。密码子优化是指将目标序列中存在的在给定物种的高度表达的基因中一般罕见的密码子替换为在这类物种的高度表达的基因中一般常见的密码子，而替换前后的密码子编码相同的氨基酸。因此，最佳密码子的选择取决于宿主基因组的密码子使用偏好。

载体

本发明还提供一种载体，包含如本发明所述的核酸。其中，编码嵌合抗原受体的核酸序列、编码Flt3L的核酸序列和编码DLL1的核酸序列、以及任选的编码XCL1和/或XCL2的核酸序列可以位于一个或多个载体中。

如本文所用，术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。

载体一般包括靶向载体和表达载体。“靶向载体”是通过例如同源重组或使用特异性靶向位点处序列的杂合重组酶将分离的核酸递送至细胞内部的介质。“表达载体”是用于异源核酸序列(例如编码本发明的嵌合抗原受体多肽的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mRNA的翻译的载体。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一个实施方案中，本发明的载体包括但不限于质粒、病毒（例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)等)、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括BAC和YAC)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的DNA序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常还包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，MCS)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾（polyA）、3’ UTR、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。

工程化免疫细胞及其制备方法

本发明还提供一种工程化免疫细胞，其包含本发明的核酸或载体。换言之，本发明的工程化免疫细胞表达嵌合抗原受体、外源性的Flt3L基因和DLL1基因。优选地，本发明的工程化免疫细胞进一步表达外源性的XCL1和/或XCL2基因。

如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导ADCC和/或CDC)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞。优选地，免疫细胞是T细胞。T细胞可以是任何T细胞，如体外培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自体外培养的T细胞系例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自受试者的T细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。T细胞也可以被浓缩或纯化。T细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+ T细胞、CD4+辅助T细胞（例如Th1和Th2细胞）、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是人T细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如Ficoll分离从受试者的血液获得T细胞。在本发明中，免疫细胞被工程化以表达嵌合抗原受体以及外源性的Flt3L基因和DLL1基因。

采用本领域已知的常规方法(如通过转导、转染、转化等)可以将编码嵌合抗原受体多肽的核酸序列以及Flt3L基因和DLL1基因引入免疫细胞。“转染”是将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。一个例子是RNA转染，即将RNA(比如体外转录的RNA，ivtRNA)引入宿主细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时的孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、显微注射和电穿孔。术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中、也向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其通过细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传材料(核酸分子)而产生。转化可以通过人工手段实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态的状态。对于原核转化，技术可包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。

因此，本发明还提供一种制备工程化免疫细胞的方法，包括将以下引入所述免疫细胞：（a）编码嵌合抗原受体的第一核酸序列或其编码的嵌合抗原受体；（b）编码Flt3L的第二核酸序列或其编码的Flt3L蛋白；和（c）编码DLL1的第三核酸序列或其编码的DLL1蛋白。

在一个实施方案中，可以将上述组分（a）、（b）和（c）以任何顺序先后依次引入免疫细胞。在另一个实施方案中，可以将上述组分（a）、（b）和（c）同时引入免疫细胞，例如将（a）、（b）和（c）克隆在一个或多个载体中。

在一个实施方案中，在本发明的制备工程化免疫细胞的方法中，还进一步包括：（d）将编码XCL1和/或XCL2的第四核酸序列或其编码的XCL1和/或XCL2蛋白引入所述免疫细胞。组分（d）可与组分（a）、（b）和（c）以任何顺序先后依次引入免疫细胞，或同时引入细胞。

将核酸或载体引入免疫细胞后，本领域技术人员可以通过常规技术对所得免疫细胞进行扩增和活化。

在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞还可以包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：CD52、GR、dCK、TCR/CD3基因（例如TRAC、TRBC、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ）、MHC相关基因（HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M、HLA-DPA、HLA-DQ、HLA-DRA、TAP1、TAP2、LMP2、LMP7、RFX5、RFXAP、RFXANK、CIITA）和免疫检查点基因，如PD1、LAG3、TIM3、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。

抑制基因表达或使基因沉默的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以使用反义RNA、RNA诱饵、RNA适体、siRNA、shRNA/miRNA、反式显性阴性蛋白(TNP)、嵌合/融合蛋白、趋化因子配体、抗感染性细胞蛋白、细胞内抗体(sFv)、核苷类似物(NRTI)、非核苷类似物(NNRTI)、整合酶抑制剂(寡核苷酸、二核苷酸和化学剂)和蛋白酶抑制剂来抑制基因的表达。另外，也可以通过例如大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALE核酸酶或CRISPR系统中的Cas酶介导DNA断裂，从而使基因沉默。

试剂盒和药物组合物

本发明该提供一种试剂盒，其包含本发明的工程化免疫细胞、核酸分子或载体。

在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含说明书。

本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体作为活性剂，和一种多种药学上可接受的赋型剂。因此，本发明还涵盖所述核酸分子、载体或工程化免疫细胞在制备药物组合物或药物中的用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的赋型剂” 是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容（即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用）的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。

根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。

根据本发明的药物组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊、糖浆、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的免疫细胞的药物组合物通常以溶液形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。

根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂组合施用。适用于组合的药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimersodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate) 、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如IL-2、IL-15，趋化因子比如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗CD3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。此外，本发明的药物组合物也可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。

治疗应用

本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞或药物组合物。因此，本发明还涵盖根据本发明的工程化免疫细胞、核酸分子、载体、试剂盒或药物组合物在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。

在一个实施方案中，直接向受试者施用有效量的本发明的免疫细胞和/或药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明的治疗方法是离体治疗。具体地，该方法包括以下步骤：（a）提供受试者的样品，所述样品包含免疫细胞；(b)在体外将本发明的嵌合抗原受体和编码外源性DLL1和Flt3L基因的核酸序列（以及任选的编码XCL1和/或XCL2的核酸序列）引入所述免疫细胞，获得经修饰的免疫细胞，(c)向有此需要的受试者施用所述经修饰的免疫细胞。优选地，步骤(a)中提供的免疫细胞选自巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、T细胞、NK细胞和/或NKT细胞；并且所述免疫细胞可以通过本领域已知的常规方法从受试者的样品(特别是血液样品)中获得。然而，也可以使用能够表达本发明的嵌合抗原受体并发挥如本文所述的所需生物效应功能的其它免疫细胞。此外，通常选择的免疫细胞与受试者的免疫系统相容，即优选所述免疫细胞不引发免疫原性响应。例如，可以使用“通用接受体细胞”，即发挥所需生物效应功能的普遍相容的可在体外生长和扩增的淋巴细胞。使用此类细胞将不需要获得和/或提供受试者自身淋巴细胞。步骤(c)的离体引入可以通过经由电穿孔将本文所述的核酸或载体引入免疫细胞或通过用病毒载体感染免疫细胞来实施，所述病毒载体为如前所述的慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。其它可想到的方法包括使用转染试剂(比如脂质体)或瞬时RNA转染。

在一个实施方案中，所述免疫细胞是自体或同种异体的细胞，优选T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞，更优选T细胞、NK细胞或NKT细胞。

如本文所用，术语“自体”是指来源于个体的任何材料稍后将被再引入该相同个体中。

如本文所用，术语“同种异体”是指任何材料来源于与引入该材料的个体相同物种的不同动物或不同患者。当在一个或多个基因座处的基因不同时，认为两个或更多个体彼此为同种异体的。在一些情况下，来自同一物种的各个体的同种异体材料在基因上的不同可能足以发生抗原相互作用。

如本文所用，术语“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。优选地，所述受试者是人。

在一个实施方案中，所述癌症是与配体结合结构域结合的靶标表达有关的癌症。例如，所述癌症包括但不限于：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小型非裂化细胞性NHL、大肿块病NHL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤等)、白血病（包括急性白血病，例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病诸如急性粒细胞白血病（包括未分化型和部分分化型）、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、红白血病、急性巨核细胞白血病；慢性白血病，例如慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病；和其他特殊类型的白血病例如毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、浆细胞白血病、成人T细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病等）、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、恶性淋巴组织增生疾病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)；以及其他与靶标表达有关的疾病。优选地，可以用本发明的工程化免疫细胞或药物组合物治疗的疾病选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、脑神经胶质瘤、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、肉瘤、胃癌等。

在一个实施方案中，所述方法还进一步包括向所述受试者施用一种或多种额外的化疗剂、生物制剂、药物或治疗。在该实施方案中，化疗剂、生物制剂、药物或治疗选自放射疗法、手术、抗体试剂和/或小分子和它们的任意组合。

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

具体实施方式

实施例1 构建小鼠胰腺癌细胞系Panc02-mCD19

1.制备pLV-mCD19质粒

以小鼠脾脏总mRNA为模板，通过反转录PCR得到小鼠脾脏总cDNA序列后，再通过PCR获得mCD19的核酸序列（SEQ ID NO：41）。然后，将mCD19序列克隆至pGEM-T Easy载体（Promega，货号A1360）中，得到pLV-mCD19质粒。

2．慢病毒包装

在T175培养瓶中，以30×10⁶个细胞/瓶的密度将293T细胞接种于30ml含有10% 胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜。

在无菌管中加入3ml Opti-MEM（Gibco，货号31985-070）、34 μg pLV-mCD19质粒、8.5 μg pMD2.G载体（Addgene，货号12259）和17 μg psPAX2载体（Addgene，货号12260）。然后加入120μl X-treme GENE HP DNA转染试剂（Roche，货号06366236001），立即混匀，室温孵育15 min。然后将该质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到预先准备好的293T细胞的培养瓶中，于37℃，5% CO2条件下培养过夜。在转染后24小时和48小时收集培养物，合并后超速离心（25000g，4℃，2.5小时），获得浓缩的pLV-mCD19慢病毒，将其保存于-80℃。

3. 筛选Panc02-mCD19细胞系

在6孔细胞培养板的每个孔中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（Gibco，货号C12430500BT）、1×10⁶个小鼠胰腺癌细胞Panc02（来自中国药科大学实验室馈赠）和200 μlpLV-mCD19慢病毒，于37℃、5% CO2条件下孵育48 h。然后用0.25%胰酶将细胞消化成单细胞悬液，并将细胞稀释后转移至96孔板中继续培养，直至出现单克隆细胞。挑选单克隆细胞，再次用0.25%胰酶消化成单细胞，并用200μl opti-MEM培养基重悬细胞。用APC anti-mouseCD19抗体（Biolegend，货号115512），通过流式细胞术检测感染效率，并筛选出CD19阳性克隆。将阳性克隆传代3-4次后，再用流式细胞术检测CD19表达水平。未经病毒感染的Panc02细胞用作对照。

结果如图1所示。最后筛选的Panc02-mCD19细胞系中，CD19表达率为100%。

实施例2. 制备CAR-T细胞

1. 构建逆转录病毒质粒

人工合成DLL1基因片段（SEQ ID NO：29），经Gibson重组至MSCV载体中，获得MSCV-DLL1质粒。

人工合成依次连接的mCD19-scFv（SEQ ID NO：13）、CD8α铰链区（SEQ ID NO：21）、CD8α跨膜区（SEQ ID NO：15）、4-BB共刺激结构域（SEQ ID NO：17）和CD3ζ胞内域（SEQ IDNO：19）的编码序列片段，并在两端加入XhoI/EcoRI酶切位点。将片段克隆入MSCV载体，获得MSCV-mCD19-CAR质粒。

人工合成依次连接的mCD19-scFv（SEQ ID NO：13）、CD8a铰链区（SEQ ID NO：21）、CD8α跨膜区（SEQ ID NO：15）、4-BB共刺激结构域（SEQ ID NO：17）、CD3ζ胞内域（SEQ ID NO：19）、T2A（SEQ ID NO：31）和Flt3L（SEQ ID NO：27）的编码序列片段，并在两端加入XhoI/EcoRI酶切位点。将片段克隆入MSCV载体，获得MSCV-mCD19-CAR-Flt3L质粒。

人工合成XCL1基因片段（SEQ ID NO：37），经Gibson重组至MSCV载体中，获得MSCV-XCL1质粒。

2. 制备逆转录病毒

在T175培养瓶中，以30×10⁶个细胞/瓶的密度将293T细胞接种于30ml含有10% 胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜，用于病毒包装。

在无菌管中加入3ml Opti-MEM（Gibco，货号31985-070）、45μg 逆转录病毒质粒（MSCV-mCD19-CAR质粒、MSCV- mCD19-CAR-Flt3L质粒、MSCV-XCL1质粒或MSCV-DLL1质粒）和15 μg包装载体pCL-Eco（上海禾午生物科技有限公司，货号P3029）。然后加入120μl X-treme GENE HP DNA转染试剂（Roche，货号06366236001），立即混匀，室温孵育15 min。然后将该质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到预先准备好的293T细胞的培养瓶中，于37℃，5% CO2条件下培养过夜。在转染后72小时收集培养物，离心（2000g，4℃，10分钟），获得逆转录病毒上清液。

3. 制备CAR-T细胞

从小鼠脾脏分离T淋巴细胞，并用DynaBeads CD3/CD28 CTS^TM（Gibco,货号40203D）激活T细胞，然后在37℃和5％CO2下培养1天。

以每孔3×10⁶个细胞/mL的密度将激活的T细胞接种至预先用RetroNectin包被过夜的24孔板中，然后分别加入500 μL完全培养基（NT，对照）、MSCV-mCD19-CAR病毒、MSCV-mCD19-CAR-Flt3L病毒、MSCV-mCD19-CAR病毒+ MSCV-DLL1病毒、MSCV-mCD19-CAR-Flt3L病毒+ MSCV-DLL1病毒、或MSCV-mCD19-CAR-Flt3L病毒+ MSCV-DLL1病毒+MSCV-XCL1病毒，并补充完全培养基至2mL。

将24孔板放于离心机进行离心感染，于32℃，2000 g离心2 h。然后，立刻将24孔板放置于37℃、CO2培养箱静置培养。第二天更换新鲜培养基，并调整细胞密度为1×10⁶个细胞/mL。感染三天后，收集细胞用于后续分析。收集的细胞即为NT细胞、mCD19-CAR 细胞、mCD19-CAR+Flt3L细胞、mCD19-CAR+DLL1细胞、mCD19-CAR+Flt3L+DLL1细胞和mCD19-CAR+Flt3L+DLL1+XCL1细胞。

实施例3. 检测CAR-T细胞的表达

1.细胞表面CAR的表达水平

取出实施例2制备的2×10⁵个CAR-T细胞，用Goat Anti-Rat IgG （H&L）Biotin（BioVision, 货号6910-250）作为一抗，APC Streptavidin（BD Pharmingen，货号554067）作为二抗，通过流式细胞术检测CAR-T细胞上的CAR的表达水平，结果如图2所示。

可以看出，与对照NT细胞相比，mCD19-CAR、mCD19-CAR+Flt3L 、mCD19-CAR+DLL1、mCD19-CAR+Flt3L+DLL1和mCD19-CAR+Flt3L+DLL1+XCL1细胞中的CAR阳性效率均大于50%，表明这些细胞均可有效表达CAR。

2.DLL1的表达水平

取出实施例2制备的2×10⁵个CAR-T细胞，用PE Anti-DLL1抗体（Biolegend，货号128307），通过流式细胞术检测CAR-T细胞中的DLL1的表达水平，结果如图3所示。

可以看出，在mCD19-CAR+DLL1、mCD19-CAR+Flt3L+DLL1和mCD19-CAR+Flt3L+DLL1+XCL1细胞中，DLL1的表达水平均高于60%，而其他未转染MSCV-DLL1病毒的细胞则不表达DLL1。

3.Flt3L的分泌水平

收集实施例2制备的CAR-T细胞的上清液，根据制造商的建议，用Mouse Flt-3 LigandDuoSet ELISA kit试剂盒（R&D Systems, 货号 DY427）检测细胞中的Flt3L分泌水平，结果如图4所示。

可以看出，转染了MSCV-mCD19-CAR-Flt3L病毒的三种CAR-T细胞均可有效分泌Flt3L。

实施例4. 检测CAR-T细胞的IFN-γ分泌水平

在96孔圆底板中以1×10⁵个细胞/100 μl的浓度分别加入NT细胞、mCD19-CAR细胞、mCD19-CAR+Flt3L细胞、mCD19-CAR+DLL1细胞、mCD19-CAR+Flt3L+DLL1细胞或mCD19-CAR+Flt3L+DLL1+XCL1细胞。然后在各孔中以1×10⁴个细胞/100 μl的浓度分别加入靶标Panc02-mCD19细胞或非靶标Panc02细胞。在37℃培养24 h后，收集培养物上清液。根据制造商的建议，用Mouse IFN-gamma DuoSet ELISA试剂盒（R&D，货号DY485）检测培养物上清液中IFN-γ的表达水平。

检测结果如图5所示。可以看出，在非靶细胞Panc02中几乎没有检测到IFN-γ的释放，而仅在靶细胞Panc02-mCD19中检测到细胞因子IFN-γ的释放，这表明本实施例中的CAR-T细胞的杀伤都是特异性的。并且，在杀伤靶细胞时，额外表达外源性Flt3L、DLL1、或Flt3L+DLL1+XCL1的CAR-T细胞释放的抗原特异性的IFN-γ水平与对照mCD19-CAR T细胞的水平相当，而表达外源性Flt3L+DLL1的CAR-T细胞释放的IFN-γ水平则显著高于其他CAR-T细胞。

实施例5. CAR-T 细胞的肿瘤抑制效果验证

在健康C57BL/6小鼠的左前肢腋下部位，经皮下接种5×10⁵个实施例1制备的Panc02-mCD19胰腺癌细胞。

将接种了胰腺癌细胞的小鼠随机分为6组，每组7只。待肿瘤体积生长至100 mm³时，向各组小鼠经尾静脉注射5×10⁶个（高剂量）或1×10⁶个（低剂量）的NT细胞、mCD19-CAR细胞或mCD19-CAR+Flt3L细胞。监测小鼠的肿瘤体积变化，结果如图6所示。

可以看出，高剂量的mCD19-CAR细胞和mCD19-CAR+Flt3L细胞在小鼠胰腺癌模型中均可有效抑制肿瘤生长，并且后者对小鼠胰腺癌的抑制效果显著优于前者（参见图6A）。然而，发明人出乎意料地发现，在低剂量条件下，与未经CAR-T处理的NT组小鼠相比，mCD19-CAR+Flt3L细胞和mCD19-CAR细胞对小鼠胰腺癌的生长并没有显著的抑制效果（参见图6B）。这表明，当使用传统CAR-T细胞或者表达单独的外源性Flt3L的CAR-T细胞时，需要较高剂量才能实现对肿瘤的治疗效果。

然而，在本发明中，发明人首次发现，低剂量的mCD19-CAR+Flt3L+DLL1或mCD19-CAR+Flt3L+DLL1+XCL1能够展现显著优于mCD19-CAR的肿瘤抑制效果。具体的实验方法如下。

将接种了胰腺癌细胞的小鼠随机分为6组，每组6只。待肿瘤体积生长至100 mm³时，向每各组小鼠经尾静脉注射1×10⁶个（低剂量）的NT细胞、mCD19-CAR细胞、mCD19-CAR+Flt3L细胞、mCD19-CAR+DLL1细胞、mCD19-CAR+Flt3L+DLL1细胞或mCD19-CAR+Flt3L+DLL1+XCL1细胞。监测小鼠的体重和肿瘤体积变化，直至实验结束。

小鼠的体重变化如图7所示。可以看出，施用CAR-T细胞后，各组小鼠的体重与对照组相比没有显著差异，且在观察周期中，当小鼠肿瘤未超过1500mm³时，小鼠行动活泼，毛色正常。这表明，施用CAR-T细胞不会对小鼠有明显的毒副反应。

小鼠的肿瘤体积变化如图8所示。可以看出，与mCD19-CAR T细胞相比，额外表达外源性Flt3L+DLL1和Flt3L+DLL1+XCL1组合的CAR-T细胞能显著增强对小鼠胰腺癌的抑制效果，而单独表达Flt3L或DLL1则不能增强mCD19-CAR T细胞对小鼠胰腺癌的抑制。

小鼠的存活曲线如图9所示。可以看出，相较于其它实验组，Flt3L+DLL1和Flt3L+DLL1+XCL1的组合可以明显延长小鼠的生存期，且后者的抑制效果最好。其中，截至实验结束（D60），Flt3L+DLL1组中有2只小鼠达到治愈的效果，Flt3L+DLL1+XCL1组中有4只小鼠达到治愈的效果，一直保持无瘤生存，其他组的小鼠均患瘤死亡。

以上结果表明，在低剂量的情况下，Flt3L和DLL1的共表达可以促进CAR-T细胞对胰腺癌细胞的抑制效果，显著提高存活率，而进一步额外表达XCL1则可以增加这种促进效果。相比之下，仅表达外源性Flt3L或DLL1则不能增强CAR-T细胞的治疗效果。因此，本发明的表达外源性Flt3L和DLL1，以及任选的XCL1的工程化免疫细胞与传统CAR-T细胞相比，不仅能够增强对靶标癌细胞的抑制效果，并且能够在较低剂量下实现这种效果，这意味着更高的安全性。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明的范围。本领域的技术人员知晓，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京北恒生物科技有限公司

<120> 工程化免疫细胞及其用途

<160> 51

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctca 726

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gcaaa 75

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

20 25

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60

actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

1 5 10 15

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

20 25 30

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

35 40

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

1 5 10 15

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

20 25 30

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

35 40 45

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 11

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 12

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 13

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gacatccaga tgacccagag ccctgccagc ctgtctacca gcctgggcga gacagtgacc 60

atccagtgtc aggccagcga ggacatctac tctggcctgg cttggtatca gcagaagccc 120

ggcaagagcc ctcagctgct gatctacggc gccagcgacc tgcaggacgg cgtgcctagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggaacccag tacagcctga agatcaccag catgcagacc 240

gaggacgagg gcgtgtactt ctgccagcaa ggcctgacct accctagaac cttcggagga 300

ggcaccaagc tggaactgaa gggcggaggc ggaagtggag gcggaggatc tggcggcgga 360

ggctctgaag tgcagctgca gcagtctggc gctgaactgg tccggcctgg cactagcgtg 420

aagctgtcct gcaaggtgtc cggcgacacc atcaccttct actacatgca cttcgtgaag 480

cagaggccag gacagggcct ggaatggatc ggcagaatcg accctgagga cgagagcacc 540

aagtacagcg agaagttcaa gaacaaggcc accctgaccg ccgacaccag cagcaacacc 600

gcctacctga agctgtctag cctgacctcc gaggacaccg ccacctactt ttgcatctac 660

ggcggctact acttcgacta ctggggccag ggcgtgatgg tcaccgtgtc cagc 714

<210> 14

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Gln Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Met Gln Thr

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Leu Thr Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln

115 120 125

Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys

130 135 140

Lys Val Ser Gly Asp Thr Ile Thr Phe Tyr Tyr Met His Phe Val Lys

145 150 155 160

Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Glu

165 170 175

Asp Glu Ser Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu

180 185 190

Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Lys Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ile Tyr Gly Gly Tyr Tyr

210 215 220

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 15

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atctgggcac ccttggccgg aatctgcgtg gcccttctgc tgtccttgat catcactctc 60

atc 63

<210> 16

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Ile Ile Thr Leu Ile

20

<210> 17

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aggaaaaaat tcccccacat attcaagcaa ccatttaaga agaccactgg agcagctcaa 60

gaggaagatg cttgtagctg ccgatgtcca caggaagaag aaggaggagg aggaggctat 120

gagctg 126

<210> 18

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu

20 25 30

Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu

35 40

<210> 19

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agcaggagtg cagagactgc tgccaacctg caggacccca accagctcta caatgagctc 60

aatctagggc gaagagagga atatgacgtc ttggagaaga agcgggctcg ggatccagag 120

atgggaggca aacagcagag gaggaggaac ccccaggaag gcgtatacaa tgcactgcag 180

aaagacaaga tggcagaagc ctacagtgag atcggcacaa aaggcgagag gcggagaggc 240

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agcactgcca ccaaggacac ctatgatgcc 300

ctgcatatgc agaccctggc ccctcgc 327

<210> 20

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu

1 5 10 15

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu

20 25 30

Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg

35 40 45

Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met

50 55 60

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

65 70 75 80

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

85 90 95

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg

100 105

<210> 21

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

actactacca agccagtgct gcgaactccc tcacctgtgc accctaccgg gacatctcag 60

ccccagagac cagaagattg tcggccccgt ggctcagtga aggggaccgg attggacttc 120

gcctgtgata tttac 135

<210> 22

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro Thr

1 5 10 15

Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser

20 25 30

Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

35 40 45

<210> 23

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60

agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac 120

ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg 180

gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag 240

cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc 300

gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt 360

cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg 420

ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc 480

gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca 540

gccccgcagc cccctctgct cctcctactg ctgctgcccg tgggcctcct gctgctggcc 600

gctgcctggt gcctgcactg gcagaggacg cggcggagga caccccgccc tggggagcag 660

gtgccccccg tccccagtcc ccaggacctg ctgcttgtgg agcactga 708

<210> 24

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe

20 25 30

Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu

35 40 45

Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu

50 55 60

Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln

65 70 75 80

Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly

85 90 95

Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala

100 105 110

Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser

115 120 125

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp

130 135 140

Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro

145 150 155 160

Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

180 185 190

Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Trp Cys Leu His Trp Gln

195 200 205

Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly Glu Gln Val Pro Pro Val

210 215 220

Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu Val Glu His

225 230 235

<210> 25

<211> 2172

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgggcagtc ggtgcgcgct ggccctggcg gtgctctcgg ccttgctgtg tcaggtctgg 60

agctctgggg tgttcgaact gaagctgcag gagttcgtca acaagaaggg gctgctgggg 120

aaccgcaact gctgccgcgg gggcgcgggg ccaccgccgt gcgcctgccg gaccttcttc 180

cgcgtgtgcc tcaagcacta ccaggccagc gtgtcccccg agccgccctg cacctacggc 240

agcgccgtca cccccgtgct gggcgtcgac tccttcagtc tgcccgacgg cgggggcgcc 300

gactccgcgt tcagcaaccc catccgcttc cccttcggct tcacctggcc gggcaccttc 360

tctctgatta ttgaagctct ccacacagat tctcctgatg acctcgcaac agaaaaccca 420

gaaagactca tcagccgcct ggccacccag aggcacctga cggtgggcga ggagtggtcc 480

caggacctgc acagcagcgg ccgcacggac ctcaagtact cctaccgctt cgtgtgtgac 540

gaacactact acggagaggg ctgctccgtt ttctgccgtc cccgggacga tgccttcggc 600

cacttcacct gtggggagcg tggggagaaa gtgtgcaacc ctggctggaa agggccctac 660

tgcacagagc cgatctgcct gcctggatgt gatgagcagc atggattttg tgacaaacca 720

ggggaatgca agtgcagagt gggctggcag ggccggtact gtgacgagtg tatccgctat 780

ccaggctgtc tccatggcac ctgccagcag ccctggcagt gcaactgcca ggaaggctgg 840

gggggccttt tctgcaacca ggacctgaac tactgcacac accataagcc ctgcaagaat 900

ggagccacct gcaccaacac gggccagggg agctacactt gctcttgccg gcctgggtac 960

acaggtgcca cctgcgagct ggggattgac gagtgtgacc ccagcccttg taagaacgga 1020

gggagctgca cggatctcga gaacagctac tcctgtacct gcccacccgg cttctacggc 1080

aaaatctgtg aattgagtgc catgacctgt gcggacggcc cttgctttaa cgggggtcgg 1140

tgctcagaca gccccgatgg agggtacagc tgccgctgcc ccgtgggcta ctccggcttc 1200

aactgtgaga agaaaattga ctactgcagc tcttcaccct gttctaatgg tgccaagtgt 1260

gtggacctcg gtgatgccta cctgtgccgc tgccaggccg gcttctcggg gaggcactgt 1320

gacgacaacg tggacgactg cgcctcctcc ccgtgcgcca acgggggcac ctgccgggat 1380

ggcgtgaacg acttctcctg cacctgcccg cctggctaca cgggcaggaa ctgcagtgcc 1440

cccgtcagca ggtgcgagca cgcaccctgc cacaatgggg ccacctgcca ccagaggggc 1500

cacggctatg tgtgcgaatg tgcccgaagc tacgggggtc ccaactgcca gttcctgctc 1560

cccgagctgc ccccgggccc agcggtggtg gacctcactg agaagctaga gggccagggc 1620

gggccattcc cctgggtggc cgtgtgcgcc ggggtcatcc ttgtcctcat gctgctgctg 1680

ggctgtgccg ctgtggtggt ctgcgtccgg ctgaggctgc agaagcaccg gcccccagcc 1740

gacccctgcc ggggggagac ggagaccatg aacaacctgg ccaactgcca gcgtgagaag 1800

gacatctcag tcagcatcat cggggccacg cagatcaaga acaccaacaa gaaggcggac 1860

ttccacgggg accacagcgc cgacaagaat ggcttcaagg cccgctaccc agcggtggac 1920

tataacctcg tgcaggacct caagggtgac gacaccgccg tcagggacgc gcacagcaag 1980

cgtgacacca agtgccagcc ccagggctcc tcaggggagg agaaggggac cccgaccaca 2040

ctcaggggtg gagaagcatc tgaaagaaaa aggccggact cgggctgttc aacttcaaaa 2100

gacaccaagt accagtcggt gtacgtcata tccgaggaga aggatgagtg cgtcatagca 2160

actgaggtgt aa 2172

<210> 26

<211> 723

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Met Gly Ser Arg Cys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Leu Leu

1 5 10 15

Cys Gln Val Trp Ser Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe

20 25 30

Val Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly

35 40 45

Ala Gly Pro Pro Pro Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu

50 55 60

Lys His Tyr Gln Ala Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly

65 70 75 80

Ser Ala Val Thr Pro Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp

85 90 95

Gly Gly Gly Ala Asp Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe

100 105 110

Gly Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His

115 120 125

Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile

130 135 140

Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser

145 150 155 160

Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg

165 170 175

Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys

180 185 190

Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly

195 200 205

Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro

210 215 220

Ile Cys Leu Pro Gly Cys Asp Glu Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro

225 230 235 240

Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu

245 250 255

Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp

260 265 270

Gln Cys Asn Cys Gln Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp

275 280 285

Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys

290 295 300

Thr Asn Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr

305 310 315 320

Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro

325 330 335

Cys Lys Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys

340 345 350

Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met

355 360 365

Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser

370 375 380

Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Cys Arg Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe

385 390 395 400

Asn Cys Glu Lys Lys Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn

405 410 415

Gly Ala Lys Cys Val Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln

420 425 430

Ala Gly Phe Ser Gly Arg His Cys Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala

435 440 445

Ser Ser Pro Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp

450 455 460

Phe Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala

465 470 475 480

Pro Val Ser Arg Cys Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys

485 490 495

His Gln Arg Gly His Gly Tyr Val Cys Glu Cys Ala Arg Ser Tyr Gly

500 505 510

Gly Pro Asn Cys Gln Phe Leu Leu Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala

515 520 525

Val Val Asp Leu Thr Glu Lys Leu Glu Gly Gln Gly Gly Pro Phe Pro

530 535 540

Trp Val Ala Val Cys Ala Gly Val Ile Leu Val Leu Met Leu Leu Leu

545 550 555 560

Gly Cys Ala Ala Val Val Val Cys Val Arg Leu Arg Leu Gln Lys His

565 570 575

Arg Pro Pro Ala Asp Pro Cys Arg Gly Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn

580 585 590

Leu Ala Asn Cys Gln Arg Glu Lys Asp Ile Ser Val Ser Ile Ile Gly

595 600 605

Ala Thr Gln Ile Lys Asn Thr Asn Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp

610 615 620

His Ser Ala Asp Lys Asn Gly Phe Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Val Asp

625 630 635 640

Tyr Asn Leu Val Gln Asp Leu Lys Gly Asp Asp Thr Ala Val Arg Asp

645 650 655

Ala His Ser Lys Arg Asp Thr Lys Cys Gln Pro Gln Gly Ser Ser Gly

660 665 670

Glu Glu Lys Gly Thr Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Glu Ala Ser Glu

675 680 685

Arg Lys Arg Pro Asp Ser Gly Cys Ser Thr Ser Lys Asp Thr Lys Tyr

690 695 700

Gln Ser Val Tyr Val Ile Ser Glu Glu Lys Asp Glu Cys Val Ile Ala

705 710 715 720

Thr Glu Val

<210> 27

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca aattcctccc tgttgctgct gttgctgctg 60

ctgagtcctt gcctgcgggg gacacctgac tgttacttca gccacagtcc catctcctcc 120

aacttcaaag tgaagtttag agagttgact gaccacctgc ttaaagatta cccagtcact 180

gtggccgtca atcttcagga cgagaagcac tgcaaggcct tgtggagcct cttcctagcc 240

cagcgctgga tagagcaact gaagactgtg gcagggtcta agatgcaaac gcttctggag 300

gacgtcaaca ccgagataca ttttgtcacc tcatgtacct tccagcccct accagaatgt 360

ctgcgattcg tccagaccaa catctcccac ctcctgaagg acacctgcac acagctgctt 420

gctctgaagc cctgtatcgg gaaggcctgc cagaatttct ctcggtgcct ggaggtgcag 480

tgccagccgg actcctccac cctgctgccc ccaaggagtc ccatagccct agaagccacg 540

gagctcccag agcctcggcc caggcagctg ttgctcctgc tgctgctgct gctgcctctc 600

acactggtgc tgctggcagc cgcctggggc cttcgctggc aaagggcaag aaggaggggg 660

gagctccacc ctggggtgcc cctcccctcc catccctag 699

<210> 28

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Asn Ser Ser Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr

20 25 30

Phe Ser His Ser Pro Ile Ser Ser Asn Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu

35 40 45

Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val Asn

50 55 60

Leu Gln Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Phe Leu Ala

65 70 75 80

Gln Arg Trp Ile Glu Gln Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln

85 90 95

Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys

100 105 110

Thr Phe Gln Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile

115 120 125

Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gln Leu Leu Ala Leu Lys Pro

130 135 140

Cys Ile Gly Lys Ala Cys Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val Gln

145 150 155 160

Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Ala

165 170 175

Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gln Leu Leu Leu

180 185 190

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala

195 200 205

Trp Gly Leu Arg Trp Gln Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro

210 215 220

Gly Val Pro Leu Pro Ser His Pro

225 230

<210> 29

<211> 2169

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atgggccgtc ggagcgcgct agcccttgcc gtggtctctg ccctgctgtg ccaggtctgg 60

agctccggcg tatttgagct gaagctgcag gagttcgtca acaagaaggg gctgctgggg 120

aaccgcaact gctgccgcgg gggctctggc ccgccttgcg cctgcaggac cttctttcgc 180

gtatgcctca agcactacca ggccagcgtg tcaccggagc caccctgcac ctacggcagt 240

gctgtcacgc cagtgctggg tgtcgactcc ttcagcctgc ctgatggcgc aggcatcgac 300

cccgccttca gcaaccccat ccgattcccc ttcggcttca cctggccagg taccttctct 360

ctgatcattg aagccctcca tacagactct cccgatgacc tcgcaacaga aaacccagaa 420

agactcatca gccgcctgac cacacagagg cacctcactg tgggagaaga atggtctcag 480

gaccttcaca gtagcggccg cacagacctc cggtactctt accggtttgt gtgtgacgag 540

cactactacg gagaaggttg ctctgtgttc tgccgacctc gggatgacgc ctttggccac 600

ttcacctgcg gggacagagg ggagaagatg tgcgaccctg gctggaaagg ccagtactgc 660

actgacccaa tctgtctgcc agggtgtgat gaccaacatg gatactgtga caaaccaggg 720

gagtgcaagt gcagagttgg ctggcagggc cgctactgcg atgagtgcat ccgataccca 780

ggttgtctcc atggcacctg ccagcaaccc tggcagtgta actgccagga aggctggggg 840

ggccttttct gcaaccaaga cctgaactac tgtactcacc ataagccgtg caggaatgga 900

gccacctgca ccaacacggg ccaggggagc tacacatgtt cctgccgacc tgggtataca 960

ggtgccaact gtgagctgga agtagatgag tgtgctccta gcccctgcaa gaacggagcg 1020

agctgcacgg accttgagga cagcttctct tgcacctgcc ctcccggctt ctatggcaag 1080

gtctgtgagc tgagcgccat gacctgtgca gatggccctt gcttcaatgg aggacgatgt 1140

tcagataacc ctgacggagg ctacacctgc cattgcccct tgggcttctc tggcttcaac 1200

tgtgagaaga agatggatct ctgcggctct tccccttgtt ctaacggtgc caagtgtgtg 1260

gacctcggca actcttacct gtgccggtgc caggctggct tctccgggag gtactgcgag 1320

gacaatgtgg atgactgtgc ctcctccccg tgtgcaaatg ggggcacctg ccgggacagt 1380

gtgaacgact tctcctgtac ctgcccacct ggctacacgg gcaagaactg cagcgcccct 1440

gtcagcaggt gtgagcatgc accctgccat aatggggcca cctgccacca gaggggccag 1500

cgctacatgt gtgagtgcgc ccagggctat ggcggcccca actgccagtt tctgctccct 1560

gagccaccac cagggcccat ggtggtggac ctcagtgaga ggcatatgga gagccagggc 1620

gggcccttcc cctgggtggc cgtgtgtgcc ggggtggtgc ttgtcctcct gctgctgctg 1680

ggctgtgctg ctgtggtggt ctgcgtccgg ctgaagctac agaaacacca gcctccacct 1740

gaaccctgtg ggggagagac agaaaccatg aacaacctag ccaattgcca gcgcgagaag 1800

gacgtttctg ttagcatcat tggggctacc cagatcaaga acaccaacaa gaaggcggac 1860

tttcacgggg accatggagc cgagaagagc agctttaagg tccgataccc cactgtggac 1920

tataacctcg ttcgagacct caagggagat gaagccacgg tcagggatac acacagcaaa 1980

cgtgacacca agtgccagtc acagagctct gcaggagaag agaagatcgc cccaacactt 2040

aggggtgggg agattcctga cagaaaaagg ccagagtctg tctactctac ttcaaaggac 2100

accaagtacc agtcggtgta tgttctgtct gcagaaaagg atgagtgtgt tatagcgact 2160

gaggtgtaa 2169

<210> 30

<211> 722

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Met Gly Arg Arg Ser Ala Leu Ala Leu Ala Val Val Ser Ala Leu Leu

1 5 10 15

Cys Gln Val Trp Ser Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe

20 25 30

Val Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly

35 40 45

Ser Gly Pro Pro Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys

50 55 60

His Tyr Gln Ala Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly Ser

65 70 75 80

Ala Val Thr Pro Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp Gly

85 90 95

Ala Gly Ile Asp Pro Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe Gly

100 105 110

Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His Thr

115 120 125

Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile Ser

130 135 140

Arg Leu Thr Thr Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gln

145 150 155 160

Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr Asp Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Phe

165 170 175

Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg

180 185 190

Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Asp Arg Gly Glu

195 200 205

Lys Met Cys Asp Pro Gly Trp Lys Gly Gln Tyr Cys Thr Asp Pro Ile

210 215 220

Cys Leu Pro Gly Cys Asp Asp Gln His Gly Tyr Cys Asp Lys Pro Gly

225 230 235 240

Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu Cys

245 250 255

Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp Gln

260 265 270

Cys Asn Cys Gln Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp Leu

275 280 285

Asn Tyr Cys Thr His His Lys Pro Cys Arg Asn Gly Ala Thr Cys Thr

290 295 300

Asn Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr Thr

305 310 315 320

Gly Ala Asn Cys Glu Leu Glu Val Asp Glu Cys Ala Pro Ser Pro Cys

325 330 335

Lys Asn Gly Ala Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asp Ser Phe Ser Cys Thr

340 345 350

Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly Lys Val Cys Glu Leu Ser Ala Met Thr

355 360 365

Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Asn Pro

370 375 380

Asp Gly Gly Tyr Thr Cys His Cys Pro Leu Gly Phe Ser Gly Phe Asn

385 390 395 400

Cys Glu Lys Lys Met Asp Leu Cys Gly Ser Ser Pro Cys Ser Asn Gly

405 410 415

Ala Lys Cys Val Asp Leu Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Arg Cys Gln Ala

420 425 430

Gly Phe Ser Gly Arg Tyr Cys Glu Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala Ser

435 440 445

Ser Pro Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Ser Val Asn Asp Phe

450 455 460

Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Ser Ala Pro

465 470 475 480

Val Ser Arg Cys Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys His

485 490 495

Gln Arg Gly Gln Arg Tyr Met Cys Glu Cys Ala Gln Gly Tyr Gly Gly

500 505 510

Pro Asn Cys Gln Phe Leu Leu Pro Glu Pro Pro Pro Gly Pro Met Val

515 520 525

Val Asp Leu Ser Glu Arg His Met Glu Ser Gln Gly Gly Pro Phe Pro

530 535 540

Trp Val Ala Val Cys Ala Gly Val Val Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu

545 550 555 560

Gly Cys Ala Ala Val Val Val Cys Val Arg Leu Lys Leu Gln Lys His

565 570 575

Gln Pro Pro Pro Glu Pro Cys Gly Gly Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn

580 585 590

Leu Ala Asn Cys Gln Arg Glu Lys Asp Val Ser Val Ser Ile Ile Gly

595 600 605

Ala Thr Gln Ile Lys Asn Thr Asn Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp

610 615 620

His Gly Ala Glu Lys Ser Ser Phe Lys Val Arg Tyr Pro Thr Val Asp

625 630 635 640

Tyr Asn Leu Val Arg Asp Leu Lys Gly Asp Glu Ala Thr Val Arg Asp

645 650 655

Thr His Ser Lys Arg Asp Thr Lys Cys Gln Ser Gln Ser Ser Ala Gly

660 665 670

Glu Glu Lys Ile Ala Pro Thr Leu Arg Gly Gly Glu Ile Pro Asp Arg

675 680 685

Lys Arg Pro Glu Ser Val Tyr Ser Thr Ser Lys Asp Thr Lys Tyr Gln

690 695 700

Ser Val Tyr Val Leu Ser Ala Glu Lys Asp Glu Cys Val Ile Ala Thr

705 710 715 720

Glu Val

<210> 31

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54

<210> 32

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 33

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60

atcctgggga gt 72

<210> 34

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser

20

<210> 35

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

atgagacttc tcatcctggc cctccttggc atctgctctc tcactgcata cattgtggaa 60

ggtgtaggga gtgaagtctc agataagagg acctgtgtga gcctcactac ccagcgactg 120

ccggttagca gaatcaagac ctacaccatc acggaaggct ccttgagagc agtaattttt 180

attaccaaac gtggcctaaa agtctgtgct gatccacaag ccacgtgggt gagagacgtg 240

gtcaggagca tggacaggaa atccaacacc agaaataaca tgatccagac caagccaaca 300

ggaacccagc aatcgaccaa tacagctgtg accctgactg gctag 345

<210> 36

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala

1 5 10 15

Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys

20 25 30

Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr

35 40 45

Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg

50 55 60

Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val

65 70 75 80

Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln

85 90 95

Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu

100 105 110

Thr Gly

<210> 37

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

atgagacttc tcctcctgac tttcctggga gtctgctgcc tcaccccatg ggttgtggaa 60

ggtgtgggga ctgaagtcct agaagagagt agctgtgtga acttacaaac ccagcggctg 120

ccagttcaaa aaatcaagac ctatatcatc tgggaggggg ccatgagagc tgtaattttt 180

gtcaccaaac gaggactaaa aatttgtgct gatccagaag ccaaatgggt gaaagcagcg 240

atcaagactg tggatggcag ggccagtacc agaaagaaca tggctgaaac tgttcccaca 300

ggagcccaga ggtccaccag cacagcagta accctgactg ggtaa 345

<210> 38

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Met Arg Leu Leu Leu Leu Thr Phe Leu Gly Val Cys Cys Leu Thr Pro

1 5 10 15

Trp Val Val Glu Gly Val Gly Thr Glu Val Leu Glu Glu Ser Ser Cys

20 25 30

Val Asn Leu Gln Thr Gln Arg Leu Pro Val Gln Lys Ile Lys Thr Tyr

35 40 45

Ile Ile Trp Glu Gly Ala Met Arg Ala Val Ile Phe Val Thr Lys Arg

50 55 60

Gly Leu Lys Ile Cys Ala Asp Pro Glu Ala Lys Trp Val Lys Ala Ala

65 70 75 80

Ile Lys Thr Val Asp Gly Arg Ala Ser Thr Arg Lys Asn Met Ala Glu

85 90 95

Thr Val Pro Thr Gly Ala Gln Arg Ser Thr Ser Thr Ala Val Thr Leu

100 105 110

Thr Gly

<210> 39

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

atgagacttc tcatcctggc cctccttggc atctgctctc tcactgcata cattgtggaa 60

ggtgtaggga gtgaagtctc acataggagg acctgtgtga gcctcactac ccagcgactg 120

ccagttagca gaatcaagac ctacaccatc acggaaggct ccttgagagc agtaattttt 180

attaccaaac gtggcctaaa agtctgtgct gatccacaag ccacgtgggt gagagacgtg 240

gtcaggagca tggacaggaa atccaacacc agaaataaca tgatccagac caagccaaca 300

ggaacccagc aatcgaccaa tacagctgtg accctgactg gctag 345

<210> 40

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala

1 5 10 15

Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser His Arg Arg Thr Cys

20 25 30

Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr

35 40 45

Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg

50 55 60

Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val

65 70 75 80

Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln

85 90 95

Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu

100 105 110

Thr Gly

<210> 41

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

atgccatctc ctctccctgt ctccttcctc ctctttctta ccttagtagg aggcaggccc 60

cagaagtcct tactggtgga ggtagaagag ggaggcaatg ttgtgctgcc atgcctcccg 120

gactcctcac ctgtctcttc tgagaagctg gcttggtatc gaggtaacca gtcaacaccc 180

ttcctggagc tgagccccgg gtcccctggc ctgggattgc acgtggggtc cctgggcatc 240

ttgctagtga ttgtcaatgt ctcagaccat atggggggct tctacctgtg ccagaagagg 300

ccccctttca aggacatctg gcagcctgcc tggacagtga acgtggagga tagtggggag 360

atgttccggt ggaatgcttc agacgtcagg gacctggact gtgacctaag gaacaggtcc 420

tctgggagcc acaggtccac ttctggttcc cagctgtatg tgtgggctaa agaccatcct 480

aaggtctggg gaacaaagcc tgtatgtgcc cctcggggga gcagtttgaa tcagagtcta 540

atcaaccaag atctcactgt ggcacccggc tccacacttt ggctgtcctg tggggtaccc 600

cctgtcccag tggccaaagg ctccatctcc tggacccatg tgcatcctag gagacctaat 660

gtttcactac tgagcctaag ccttggggga gagcacccgg tcagagagat gtgggtttgg 720

gggtctcttc tgcttctgcc ccaagccaca gctttagatg aaggcaccta ttattgtctc 780

cgaggaaacc tgaccatcga gaggcacgtg aaggtcattg caaggtcagc agtgtggctc 840

tggctgttga gaactggtgg atggatagtc ccagtggtga ctttagtata tgtcatcttc 900

tgtatggttt ctctggtggc ttttctctat tgtcaaagag cctttatcct gagaaggaaa 960

aggaagcgaa tgactgaccc cgccaggaga ttcttcaaag tgacgcctcc ctcgggaaac 1020

gggacccaga accagtacgg gaatgtgctc tcccttccta catctacctc tggccaggcc 1080

catgctcagc gttgggctgc tggcctaggg agtgtccctg ggtcctatgg aaatccacgc 1140

attcaagtcc aggatactgg agctcagagc catgaaacag gactggaaga agaaggggag 1200

gcctatgaag agccagacag tgaggagggg tccgaattct atgagaacga ctccaacctt 1260

gggcaggacc aggtttccca ggatgggagt ggctatgaga accccgagga tgagcccatg 1320

ggtccagagg aagaagactc cttctccaat gctgagtctt atgaaaatgc agatgaggag 1380

ctggcccaac cagttggcag gatgatggac ttcctgagcc cccatgggtc tgcgtgggac 1440

cccagccggg aagcatcctc gcttgggtcc cagtcctatg aagatatgag agggatcctc 1500

tatgcagctc ctcagctcca ctcaattcag tccggtccca gtcatgaaga agatgcagac 1560

tcttatgaaa acatggataa gtctgacgac ctagaaccag catgggaagg agagggccac 1620

atggggactt ggggaaccac gtga 1644

<210> 42

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 43

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ttttgggtcc tcgtcgtagt tggaggggta cttgcctgtt atagcctcct ggttaccgta 60

gcatttatta tattctgggt g 81

<210> 44

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 45

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 46

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala

20

<210> 47

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

atgtcccgct ctgttgcttt ggctgtgctg gcccttttgt cccttagcgg actggaggcc 60

<210> 48

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 49

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117

<210> 50

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 51

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gaaagcaaat acgggccgcc gtgtccaccc tgtccg 36

Claims

1.一种工程化免疫细胞，其表达嵌合抗原受体、外源性的Flt3L基因和DLL1基因。

2.权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述Flt3L基因与SEQ ID NO：23或27所示的核酸序列具有至少90%同一性，或者所述Flt3L基因编码的多肽与SEQ ID NO：24或28所示的氨基酸序列具有至少90%同一性。

3.权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述DLL1基因与SEQ ID NO：25或29所示的核酸序列具有至少90%同一性，或者所述DLL1基因编码的多肽与SEQ ID NO：26或30所示的氨基酸序列具有至少90%同一性。

4.权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞进一步表达外源性的XCL1和/或XCL2基因。

5.权利要求4所述的工程化免疫细胞，其中所述XCL1基因与SEQ ID NO：35或37所示的核酸序列具有至少90%同一性，或者所述XCL1基因编码的多肽与SEQ ID NO：36或38所示的氨基酸序列具有至少90%同一性，所述XCL2基因与SEQ ID NO：39所示的核酸序列具有至少90%同一性，或者所述XCL2基因编码的多肽与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有至少90%同一性。

6.权利要求1-5任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞选自T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。

7.权利要求6所述的工程化免疫细胞，其中所述T细胞是CD4+/CD8+ T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞或αβ-T细胞。

8.权利要求1-7任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。

9.权利要求8所述的工程化免疫细胞，其中所述配体结合结构域可以选自scFv、Fab、单结构域抗体、纳米抗体、抗原结合配体、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN。

10.权利要求8或9所述的工程化免疫细胞，其中所述配体结合结构域与选自以下的靶标结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII 、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、 VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、AFP、Folate 受体α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、CS1、CD138、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。

11.权利要求8-10任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。

12.权利要求8-11任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

13.权利要求8-12任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域是一个或多个选自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18（LFA-1）、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD276（B7-H3）、CD278(ICOS)、CD357（GITR）、DAP10、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。

14.一种核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的核酸序列、编码Flt3L的核酸序列和编码DLL1的核酸序列。

15.权利要求14所述的核酸分子，其进一步包含编码XCL1和/或XCL2的核酸序列。

16.一种载体，其包含权利要求14或15所述的核酸分子。

17.权利要求16所述的载体，其中所述载体选自质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV)、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)。

18.一种试剂盒，其包含权利要求1-13任一项所述的工程化免疫细胞、权利要求14或15所述的核酸分子或权利要求16-17任一项所述的载体。

19.一种药物组合物，其包含权利要求1-13任一项所述的工程化免疫细胞、权利要求14或15所述的核酸分子或权利要求16-17任一项所述的载体，和一种多种药学上可接受的赋型剂。

20.权利要求1-13任一项所述的工程化免疫细胞、权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16-17任一项所述的载体、权利要求18所述的试剂盒或权利要求19所述的药物组合物在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。