CN115216449A - 工程化免疫细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种工程化免疫细胞，其表达(i)特异性识别抗原的细胞表面分子，和(ii)外源性的XCL2和/或XCL1。本发明还提供了该工程化免疫细胞在治疗癌症、感染或自身免疫性疾病中的用途。与传统的工程化免疫细胞细胞相比，本发明的工程化免疫细胞具有显著提高的肿瘤杀伤活性。

Description

工程化免疫细胞及其用途

技术领域

本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及一种工程化免疫细胞，其表达(i)特异性识别抗原的细胞表面分子，和(ii)外源性的XCL2和/或XCL1基因。更优选地，所述特异性识别抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体。

背景技术

肿瘤免疫治疗主要是通过调节人体免疫系统和肿瘤微环境，最终依靠自身免疫来清除肿瘤细胞。免疫系统是一个统一的整体，固有免疫在肿瘤免疫中也起到十分重要的作用。

一些抗原递呈细胞，如树突状细胞及巨噬细胞是固有免疫和获得性免疫的连接桥梁。抗原递呈细胞可以对肿瘤抗原进行识别并递呈给获得性免疫系统，激活肿瘤特异性T细胞，进而对肿瘤进行清除。因而通过增强抗原递呈过程来增加免疫系统杀伤肿瘤的效果是肿瘤免疫的重要研究方向。

CAR细胞治疗是重要的肿瘤细胞免疫疗法。CAR细胞成功控制肿瘤一般而言需要经过以下几个过程：免疫系统激活、CAR细胞的活化和扩增、活化的CAR细胞浸润肿瘤组织并杀死肿瘤细胞。然而，目前CAR细胞疗法普遍存在一个问题，即肿瘤微环境对CAR细胞有抑制作用，使得CAR细胞无法浸润肿瘤组织。因此，如何降低肿瘤微环境对CAR细胞的抑制作用，提高CAR细胞的存活时间，或者招募其他免疫细胞与CAR细胞协同作用，对于提高CAR细胞的治疗效果非常重要。

传统1型树突状细胞(conventional DC1，cDC1)是树突状细胞的一类亚群，为提呈肿瘤抗原的主要免疫细胞。研究结果显示cDC1可以有效递呈肿瘤相关抗原，尤其是坏死细胞相关抗原，有效诱导抗原特异性CD8+T细胞应答，在体内肿瘤杀伤过程中发挥极其重要的作用。在小鼠及人的研究中均显示，cDC1在肿瘤微环境中的分布与抗肿瘤免疫应答呈正相关，是一个重要的肿瘤相关免疫评分的评价参数。cDC1在小鼠及人体内分布较少，在肿瘤免疫应答率低的小鼠及人肿瘤微环境中几乎不可见。优化cDC1在肿瘤治疗中的作用是提高肿瘤免疫治疗效果的一个重要研究方向。

因此，需要一种新的免疫治疗手段，可以有效分化或招募cDC1树突状细胞，以提高肿瘤抗原提呈效率，诱导机体过继性免疫反应，解决肿瘤的异质性问题，从而提高CAR细胞治疗的疗效。

发明内容

在第一个方面，本发明提供一种新的工程化免疫细胞，其表达(i)特异性识别抗原的细胞表面分子，和(ii)外源性的XCL2和/或XCL1基因。

在一个实施方案重，所述特异性识别抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体或T细胞受体，优选是嵌合抗原受体。

在一个实施方案中，所述XCL2或XCL1基因编码的蛋白是可以抵抗蛋白酶水解的融合蛋白或者突变体。

在一个实施方案中，所述免疫细胞是选自T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。优选地，所述T细胞是CD4+/CD8+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、CD4-CD8-T细胞、调节性T细胞、γδ-T细胞或αβ-T细胞。

在一个实施方案中，所述特异性识别抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体，其包含抗原结合区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。其中，抗原抗原结合区可以选自IgG、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd′、Fv、scFv、sdFv、线性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、双体、anticalin和DARPIN。优选地，所述抗原抗原结合区选自scFv、Fab、单结构域抗体和纳米抗体。

在一个实施方案中，所述特异性识别抗原的细胞表面分子与选自以下的靶标结合：CD7、CD2、CD5、CD3、CD73、CD47、VEGF、GUCY2C、EGP40、EGP-2、CD133、IFNAR1、DLL3、kappa轻链、TIM3、CD70、TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、Tn抗原、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、AFP、Folate受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、CS1、CD138、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、TMPRSS2 ETS融合基因、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、MUC1、AFP、Folate受体α、CEA、PSCA、PSMA、Her2、EGFR、IL13Ra2、GD2、NKG2D、EGFRvIII、CS1、BCMA、间皮素和它们的任意组合。

在一个实施方案中，所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。优选地，跨膜结构域选自CD8α、CD4、CD28和CD278的跨膜结构域。

在一个实施方案中，所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的胞内区：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。优选地，所述胞内信号传导结构域包含CD3ζ胞内区。

在一个实施方案中，所述共刺激结构域是一个或多个选自以下蛋白质的胞内区：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。优选地，所述共刺激结构域选自CD27、CD28、CD134、CD137、DAP10、DAP12或CD278的胞内区或它们的组合。

在一个实施方案中，外源性的XCL2和/或XCL1的表达或活性是组成型表达。在另一个实施方案中，外源性的XCL2和/或XCL1的表达或活性是条件型表达。例如，通过将外源性基因与诱导型或组织特异性启动子可操作连接从而实现条件型表达。

在一个实施方案中，XCL2和/或XCL1可以与定位结构域可操作连接，所述定位结构域可以将本发明的外源性基因定位在特定的细胞位置上表达，例如细胞膜。定位结构域包括但不限于核定位信号、引导肽、跨膜结构域等。在一个实施方案中，本发明的外源性基因例如XCL2和/或XCL1与跨膜结构域可操作连接，从而锚定在工程化免疫细胞的表面表达。

在第二个方面，本发明提供一种核酸分子，(i)编码特异性识别抗原的细胞表面分子的核酸序列，和(ii)编码XCL2和/或XCL1的核酸序列。优选地，所述特异性识别抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体或T细胞受体，更优选嵌合抗原受体。优选地，所述核酸是DNA或RNA。

本发明还提供包含上述核酸分子的载体。具体地，所述载体选自质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV)、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，该载体还包含在免疫细胞中自主复制的起点、选择标记、限制酶切割位点、启动子、多聚腺苷酸尾(polyA)、3’UTR、5’UTR、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。

在一个实施方案中，本发明还提供一种试剂盒，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体。

在一个实施方案中，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体，和一种多种药学上可接受的赋型剂。

抗原抗原抗原在第三个方面，本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞、核酸分子、载体或药物组合物。

在一个实施方案中，所述癌症是实体瘤或血液肿瘤。更具体地，所述癌症选自：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌以及其它癌和肉瘤、以及B细胞淋巴瘤、B淋巴母细胞淋巴瘤(B-LBL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、以及Waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、毛细胞白血病、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、浆母细胞性淋巴瘤、白血病前期、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)。

在一个实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。

在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。

在一个实施方案中，所述受试者在接受本发明的工程化免疫细胞之前，接受一种或多种化疗剂预处理以清除淋巴细胞。在一个实施方案中，所述化疗剂选自环磷酰胺、氟达拉滨、苯达莫司汀、紫杉烷类化合物或其组合，优选环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。

本发明的工程化免疫细胞的优势之处在于，共表达的XCL2和/或XCL1能够有效促进DC细胞在肿瘤部位的分化或募集，增加DC细胞数量，增加工程化免疫细胞的增殖及存活时间，从而一方面降低肿瘤微环境对工程化免疫细胞的抑制作用，提高工程化免疫细胞的肿瘤杀伤能力，另一方面增加的DC细胞能够激活机体自身T细胞的过继性免疫识别，与工程化免疫细胞形成协同效应，最终增强对肿瘤的抑制。

附图说明

图1：环磷酰胺处理后的小鼠外周血T细胞及B细胞计数。

图2：通过流式细胞术测定的CAR-T细胞的CAR表达水平。

图3：通过ELISA测定的CAR-T细胞的XCL1表达水平。

图4：CAR-T细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养后的IFN-γ释放水平。

图5：用CAR-T细胞治疗小鼠胰腺癌后，小鼠的体重变化曲线。

图6：用CAR-T细胞治疗小鼠胰腺癌后，小鼠的肿瘤生长曲线。

图7：靶向Claudin18.2的CAR-T细胞的CAR表达水平。

图8：靶向Claudin18.2的CAR-T细胞的体外杀伤活性。

图9：靶向Claudin18.2的CAR-T细胞在小鼠模型中的体内抑瘤效果。

发明详述

除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。

特异性识别抗原的细胞表面分子

如本文所用，术语“特异性识别抗原的细胞表面分子”是指在细胞表面表达的能够与靶分子(例如抗原)特异性结合的分子。此类表面分子一般包含能够与抗原特异性结合的抗原结合区、将表面分子锚定在细胞表面的跨膜结构域，以及负责信号传递的胞内结构域。常见的此类表面分子的实例包括例如T细胞受体或嵌合抗原受体。

如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指响应于抗原呈递并参与T细胞活化的膜蛋白复合体。TCR的刺激由抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体分子(MHC)触发，所述抗原呈递细胞将抗原肽呈递至T细胞并且结合至TCR复合体以诱发一系列胞内信号传导。TCR由分别形成异二聚体的六条肽链组成，其一般分为αβ型和γδ型。每条肽链包括恒定区和可变区，其中可变区负责结合特异性的特定的抗原和MHC分子。TCR的可变区可以包含抗原结合区或与抗原结合区可操作连接，其中抗原结合区的定义如下所述。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括抗原结合区(例如抗体的抗原结合部分)、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，各个结构域之间通过接头连接。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。非MHC限制性的抗原识别给予CAR细胞与抗原处理无关的识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞内表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)的α链和β链二聚化。

如本文所用，“抗原结合区”是指可以与抗原结合的任何结构或其功能性变体。抗原结合区可以是抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其功能性片段。例如，抗原结合区包括但不限于IgG、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd′、Fv、scFv、sdFv、线性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、双体、anticalin、DARPIN等，优选选自Fab、scFv、sdAb和纳米抗体。在本发明中，抗原结合区可以是单价或二价，且可以是单特异性、双特异性或多特异性的抗体。在另一个实施方案中，抗原结合区也可以是特定蛋白的特异性结合多肽或受体结构，所述特定蛋白是例如PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL和NKG2D。

“Fab”是指免疫球蛋白分子被木瓜蛋白酶裂解后产生的两个相同片段中的任一个，由通过二硫键连接的完整轻链和重链N端部分组成，其中重链N端部分包括重链可变区和CH1。与完整的IgG相比，Fab没有Fc片段，流动性和组织穿透能力较高，并且无需介导抗体效应即可单价结合抗原。

“单链抗体”或“scFv”是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过接头连接而成的抗体。可以选择接头的最佳长度和/或氨基酸组成。接头的长度会明显影响scFv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的接头(例如在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。关于接头的大小和组成的选择，参见例如，Hollinger等人,1993ProcNatl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448；美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公布号WO2006/020258和WO2007/024715，其全文通过引用并入本文。scFv可以包含以任何顺序连接的VH和VL，例如VH-接头-VL或VL-接头-VH。

“单结构域抗体”或“sdAb”是指一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，也称为“重链抗体”。

“纳米抗体”或“Nb”是指单独克隆并表达出来的VHH结构，其具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。

术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰优选是保守型修饰。

如本文所用，术语“保守性修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变而引入本发明的嵌合抗原受体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。

因此，“功能性变体”或“功能性片段”与亲本氨基酸序列具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且保留亲本氨基酸的生物活性，例如结合活性。

如本文所用，术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)和ClustalW。

抗原结合区的选择取决于待识别的与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记，例如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。因此，在一个实施方案中，本发明的抗原结合区与选自以下的一个或多个靶标结合：CD7、CD2、CD5、CD3、CD73、CD47、VEGF、GUCY2C、EGP40、EGP-2、CD133、IFNAR1、DLL3、kappa轻链、TIM3、CD70、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn抗原、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、Folate受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、FucosylGMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPVE6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、TMPRSS2 ETS融合基因、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自：CD19、CD20、CD22、BAFF-R、CD33、EGFRvIII、BCMA、GPRC5D、PSMA、ROR1、FAP、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、CAIX、WT1、NY-ESO-1、CD79a、CD79b、GPC3、Claudin18.2、NKG2D和它们的任意组合，更优选是CD19或Claudin18.2。根据待靶向的抗原，本发明的CAR可以被设计为包括对该抗原具有特异性的抗原结合区。例如，如果CD19是待靶向的抗原，则CD19抗体可用作本发明的抗原结合区。在一个实施方案中，所述抗CD19抗体包含与SEQ ID NO：2或14所示的抗体相同的CDR，优选与SEQ ID NO：2或14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性。在另一个实施方案中，本发明的抗原结合区是靶向Claudin18.2的抗体，例如scFv、纳米抗体、Fab等，更优选是scFv或纳米抗体。在一个实施方案中，所述靶向Claudin18.2的抗体是包含分别如SEQ ID NO：34、35、36所示的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的纳米抗体，更优选地，所述抗体与SEQ ID NO：33具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性。

如本文所用，术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞(例如淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞)表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能性片段。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自CD8α，其与SEQ ID NO:4或16所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或所述CD8α跨膜结构域的编码序列与SEQ ID NO:3或15所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含位于抗原结合区和跨膜结构域之间的铰链区。如本文所用，术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至抗原结合区的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为抗原结合区提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自CD8、CD4或CD28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链区包含CD8α链、FcγRIIIα受体、IgG4或IgG1的铰链区部分，更优选CD8α铰链，其与SEQ ID NO:12或22所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或者CD8α铰链的编码序列与SEQ ID NO:11或21所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分。胞内信号传导结构域负责在抗原结合区结合抗原以后的细胞内初级信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达CAR的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的胞内信号传导结构域可以是T细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发初级信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞内信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor Tyrosine-basedActivation Motifs,ITAM)。本发明的胞内信号传导结构域的非限制性施例包括但不限于源自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在优选的实施方式中，本发明CAR的信号传导结构域可以包含CD3ζ胞内区，该信号传导结构域与SEQ IDNO:8或20所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:7或19所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能片段。“共刺激分子”是指在T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应(例如增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于1类MHC分子、BTLA和Toll配体受体。本发明的共刺激结构域的非限制性施例包括但不限于源自以下蛋白质的胞内区：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM以及ZAP70。优选地，本发明CAR的共刺激结构域来自4-1BB、CD28、CD27、OX40、ICOS、DAP10、DAP12或其组合。在一个实施方案中，本发明的CAR包含的共刺激结构域与SEQ ID NO:6或18所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或该共刺激结构域的编码序列与SEQ ID NO:5或17所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含信号肽，使得当其在细胞例如T细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自CD8α、IgG1、GM-CSFRα等的信号肽。在一个实施方案中，可用于本发明的信号肽与SEQ ID NO:10或30所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或该信号肽的编码序列与SEQ ID NO:9或29所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含开关结构，以调控CAR的表达时间。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外结合结构域，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构域分别连接结合结构域和信号传导结构域，仅当开关结构域互相结合(例如在诱导化合物的存在下)时，结合结构域和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外结合结构域，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外结合结构域，使其成为一个“普通”的CAR结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时(例如产生严重的毒副作用时)清除CAR细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如CD20表位、RQR8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除CAR细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是iCaspase-9，可以通过化学诱导药物如AP1903、AP20187等诱导iCaspase-9发生二聚化，从而激活下游的Caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。

XCL1和XCL2基因

C型趋化因子家族又称淋巴趋化因子，包括两个成员XCL1和XCL2，主要由CD8+T细胞和自然杀伤细胞产生。XCL1具有独特的序列特征以及两种可相互转换的蛋白空间构象,使得XCL1有别于其他趋化因子并发挥独特的功能。XCL1特异性受体XCR1是G蛋白偶联受体家族成员，二者相互作用不仅在胸腺的阴性选择和建立自身免疫耐受中发挥重要作用，而且能启动交叉抗原呈递并介导细胞毒性免疫反应。XCL1不仅能调节免疫系统平衡，维持肠道免疫稳态，而且与多种疾病相关，如自身免疫病、肾炎、结核和人类免疫缺陷病毒感染等。XCL2与XCL1的核酸序列具有97％同一性，这导致第7位和第8位两个氨基酸残基的不同：XCL1中为Asp和Lys，XCL2中为His和Arg。研究发现，XCL2与XCL1在表达谱、结构和功能上均非常相似，例如与XCL1一样，XCL2也具有单体型和二聚体型两种可相互转换的蛋白空间构象，其中单体型构象结合并激活XCR1，二聚体型构象对葡糖氨基聚糖类(Glycosaminoglycan，GAG)中的发夹结构具有更高的亲和力。XCL1和XCL2的受体XCR1选择性地表达在具有抗原呈递能力的DC(cDC1)细胞上，有研究发现引入XCL1可有效提高抗肿瘤免疫治疗和靶向疫苗的疗效。

在一个实施方案中，本发明使用的XCL1与SEQ ID NO：24或26所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或XCL1的编码序列与SEQ ID NO：23或25所示的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明使用的XCL2与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或XCL2的编码序列与SEQ ID NO：31所示的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

外源基因的表达

本发明中的外源性基因，例如XCL2和/或XCL1的表达可以是组成型表达或条件型表达。

在一个实施方案中，外源性XCL2和/或XCL1的表达是条件型表达。例如，根据需要，可以将本发明的外源基因与诱导型或组织特异性启动子可操作连接，从而在特定的时间或特定的组织、细胞类型内调控引入的外源基因的表达水平。在一个实施方案中中，启动子是诱导型启动子，即，仅在特定环境条件、发育条件或诱导物存在下启动转录的启动子。此类环境条件包括例如肿瘤酸性微环境、肿瘤低氧微环境等。此类诱导物包括例如西环素、四环素或其类似物，四环素的类似物包括例如金霉素、土霉素、去甲基氯四环素、甲烯土霉素、多西环素和米诺环素。诱导型启动子包括例如Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列等。在一个实施方案中，XCL2和/或XCL1可以与定位结构域可操作连接，所述定位结构域可以将本发明的外源性基因定位在特定的细胞位置上表达，例如细胞膜等。定位结构域包括但不限于核定位信号、引导肽、跨膜结构域等。在一个实施方案中，本发明的外源性基因XCL2和/或XCL1与跨膜结构域可操作连接，从而锚定在工程化免疫细胞的表面表达。

在一个实施方案中，本发明中的外源性基因，例如XCL2或XCL1蛋白可以是野生型或具有特定性能(例如抵抗蛋白酶水解)的融合蛋白或者突变体。

核酸

本发明还提供一种核酸分子，其包含(i)编码特异性识别抗原的细胞表面分子的核酸序列，和(ii)XCL2和/或XCL1的核酸序列。

在一个实施方案重，所述特异性识别抗原的细胞表面分子是T细胞受体或嵌合抗原受体，优选嵌合抗原受体。嵌合抗原受体的定义如上所述。

如本文所用，术语“核酸分子”包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的RNA或DNA，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括DNA(比如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA(比如dsRNA、ssRNA、mRNA、ivtRNA)，它们的组合或衍生物(比如PNA)。优选地，所述核酸是DNA或RNA，更优选mRNA。

核酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，比如在肽核酸(PNA)中发现的)。本发明的核酸还可含有一种或多种经修饰的碱基，比如，例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基(比如肌苷)。也可以想到其它修饰，包括化学、酶促或代谢修饰，只要本发明的多链CAR可以从多核苷酸表达即可。核酸可以以分离的形式提供。在一个实施方案中，核酸也可以包括调节序列，比如转录控制元件(包括启动子、增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号)、核糖体结合位点、内含子等。

可以对本发明的核酸序列进行密码子优化以在所需的宿主细胞(如，免疫细胞)中进行最佳表达；或者用于在细菌、酵母菌或昆虫细胞中表达。密码子优化是指将目标序列中存在的在给定物种的高度表达的基因中一般罕见的密码子替换为在这类物种的高度表达的基因中一般常见的密码子，而替换前后的密码子编码相同的氨基酸。因此，最佳密码子的选择取决于宿主基因组的密码子使用偏好。

载体

本发明还提供一种载体，包含如本发明所述的核酸。其中，编码特异性识别抗原的细胞表面分子的核酸序列、和编码XCL1或XCL2的核酸可以位于一个或多个载体中。

如本文所用，术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。

载体一般包括靶向载体和表达载体。“靶向载体”是通过例如同源重组或使用特异性靶向位点处序列的杂合重组酶将分离的核酸递送至细胞内部的介质。“表达载体”是用于异源核酸序列(例如编码本发明的嵌合抗原受体多肽的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mRNA的翻译的载体。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一个实施方案中，本发明的载体包括但不限于质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)等)、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括BAC和YAC)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的DNA序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常还包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，MCS)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾(polyA)、3’UTR、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。

工程化免疫细胞

本发明还提供一种工程化免疫细胞，其包含本发明的核酸或载体。换言之，本发明的工程化免疫细胞表达特异性识别抗原的细胞表面分子、以及外源性XCL1和/或XCL2基因。

如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导ADCC和/或CDC)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞，或者是从细胞脐带血等干细胞来源获得的免疫细胞。优选地，免疫细胞是T细胞。T细胞可以是任何T细胞，如体外培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自体外培养的T细胞系例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自受试者的T细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。T细胞也可以被浓缩或纯化。T细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、CD4-CD8-T细胞、调节性T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是人T细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如Ficoll分离从受试者的血液获得T细胞。在本发明中，免疫细胞被工程化以表达嵌合抗原受体以及外源性的XCL1和/或XCL2基因。

采用本领域已知的常规方法(如通过转导、转染、转化等)可以将编码嵌合抗原受体多肽的核酸序列以及XCL1和/或XCL2基因引入免疫细胞。“转染”是将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。一个例子是RNA转染，即将RNA(比如体外转录的RNA，ivtRNA)引入宿主细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时的孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙

/DNA共沉淀)、显微注射和电穿孔。术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中、也向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其通过细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传材料(核酸分子)而产生。转化可以通过人工手段实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态的状态。对于原核转化，技术可包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。

还在一个实施方案中，本发明的免疫细胞还包含至少一种失活基因，其选自以下：CD52、GR、TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247ζ、HLA-I、HLA-II、B2M、免疫检查点基因如PD1、CTLA-4、LAG3和TIM3。更特别地，免疫细胞中的至少TCR组分(包括TCRα、TCRβ基因)或CD3组分(包括CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247ζ)被失活。这种失活使得TCR-CD3复合物在细胞中没有功能。该策略对于避免移植物抗宿主病(GvHD)特别有用。使基因失活的方法是本领域已知的，例如通过大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALE核酸酶或CRISPR系统中的Cas酶介导DNA断裂，从而使该基因失活。

药物组合物

本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体作为活性剂，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。因此，本发明还涵盖所述核酸分子、载体或工程化免疫细胞在制备药物组合物或药物中的用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的赋型剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容(即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用)的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。

根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。

根据本发明的药物组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊、糖浆、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的免疫细胞的药物组合物通常以溶液形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。

根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂组合施用。适用于组合的药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimersodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗CD3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。此外，本发明的药物组合物也可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。

治疗应用

本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞或药物组合物。因此，本发明还涵盖所述工程化免疫细胞在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。

在一个实施方案中，所述治疗方法包括向受试者施用有效量的本发明的免疫细胞和/或药物组合物。

在一个实施方案中，所述免疫细胞是自体或同种异体的细胞，优选T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞，更优选T细胞、NK细胞或NKT细胞。

如本文所用，术语“自体”是指来源于个体的任何材料稍后将被再引入该相同个体中。

如本文所用，术语“同种异体”是指任何材料来源于与引入该材料的个体相同物种的不同动物或不同患者。当在一个或多个基因座处的基因不同时，认为两个或更多个体彼此为同种异体的。在一些情况下，来自同一物种的各个体的同种异体材料在基因上的不同可能足以发生抗原相互作用。

如本文所用，术语“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。优选地，所述受试者是人。

在一个实施方案中，所述受试者在接受本发明的工程化免疫细胞或包含其的药物组合物之前，接受一种或多种化疗剂预处理以清除淋巴细胞。因此，在一个实施方案中，本发明还提供一种组合，其包含工程化免疫细胞和一种或多种化疗剂。

在一些实施方案中，本文所述的化疗剂是指化学治疗使用的药物，是指对微生物感染、寄生虫病及恶性肿瘤有防治作用的化学药物。化疗剂包括但不限于合成抗菌药、杭生素、抗寄生虫药、抗真菌药、抗病毒药、烷化剂、抗代谢物、抗结核药及抗肿瘤药。例如，二萜生物碱类化合物(如紫杉烷类化合物)、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、美法仑、苯达莫司汀、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、羟基脲、甲氨蝶呤、利妥昔单抗、长春碱，和/或长春新碱等。在一些实施方式中，所述抗代谢物包括但不限于卡莫氟、替加氟、喷司他丁、去氧氟尿苷、曲美沙特、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、fosteabine钠水合物、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋林(tiazofurin)、诺拉曲塞、培美曲塞、奈拉滨(nelzarabine)、2’-脱氧-2’-亚甲基胞苷、2’-氟亚甲基-2’-脱氧胞苷、N-[5-(2,3-二氢-苯并呋喃基)磺酰基]-N’-(3,4-二氯苯基)脲、N6-[4-脱氧-4-[N2-[2(E),4(E)-十四碳二烯酰基]甘氨酰基氨基]-L-甘油-B-L-甘露糖-吡喃庚糖基]腺嘌呤、aplidine、海鞘素、4-[2-氨基-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-嘧啶并[5,4-b]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2,5-噻吩酰基(thienoyl)-L-谷氨酸、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨基甲酰氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1,11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)-十四碳-2,4,6-三烯-9-基醋酸酯、苦马豆碱、洛美曲索、右雷佐生、蛋氨酸酶、2’-氰基-2’-脱氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿糖呋喃糖基(arabinofuranosyl)胞嘧啶和3-氨基吡啶-2-醛缩氨基硫脲等。在一些实施方式中，所述烷化剂例如包括但不限于达卡巴嗪、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、替莫唑胺、苯丁酸氮芥、白消安、氮芥和亚硝基脲等。在一个优选的实施方案中，化疗剂选自环磷酰胺、氟达拉滨、苯达莫司汀、紫杉烷类化合物或其组合，更优选环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。

化疗剂的剂量可以由负责施用化疗剂的专业人员(例如医生)根据受试者的具体情况确定，包括但不限于受试者的年龄、性别、体重、整体健康情况、疾病严重程度、接受的先前疗法、毒性反应程度、并发症、癌症转移情况等。

在一个实施方案中，所述受试者在接受本发明的工程化免疫细胞或包含其的药物组合物之前，接受环磷酰胺、氟达拉滨或其组合的预处理。在该实施方案中，环磷酰胺的剂量为约100-700mg/m²/天、150-650mg/m²/天、200-600mg/m²/天、250-550mg/m²/天、或300-500mg/m²/天，例如为约100mg/m²/天、150mg/m²/天、200mg/m²/天、250mg/m²/天、300mg/m²/天、325mg/m²/天、350mg/m²/天、375mg/m²/天、400mg/m²/天、425mg/m²/天、450mg/m²/天、475mg/m²/天、500mg/m²/天、550mg/m²/天、600mg/m²/天、650mg/m²/天、或700mg/m²/天；氟达拉滨的剂量为约10-60mg/m²/天、10-50mg/m²/天、15-40mg/m²/天、或15-35mg/m²/天，例如为约10mg/m²/天、15mg/m²/天、20mg/m²/天、25mg/m²/天、30mg/m²/天、35mg/m²/天、40mg/m²/天、45mg/m²/天、50mg/m²/天55mg/m²/天、或65mg/m²/天。

在一个实施方案中，所述癌症是与抗原结合区结合的靶标表达有关的癌症。例如，所述癌症包括但不限于：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌以及其它癌和肉瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小型非裂化细胞性NHL、大肿块病NHL)、B淋巴母细胞淋巴瘤(B-LBL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、以及Waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、毛细胞白血病、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、浆母细胞性淋巴瘤、白血病前期、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)；以及其他与靶标表达有关的疾病。优选地，可以用本发明的工程化免疫细胞或药物组合物治疗的疾病选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌等。

在一个实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。

在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。

在一个实施方案中，所述方法还进一步包括向所述受试者施用一种或多种额外的化疗剂、生物制剂、药物或治疗。在该实施方案中，化疗剂、生物制剂、药物或治疗选自放射疗法、手术、抗体试剂和/或小分子和它们的任意组合。

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

具体实施方式

实施例1小鼠预处理

1.药物注射

以2mg/20g体重、3mg/20g体重、4mg/20g体重或5mg/20g体重的剂量，经小鼠腹腔注射环磷酰胺。3天后采集外周血，经流式细胞术检测小鼠体内淋巴细胞清除效果。

2.流式细胞术检测小鼠体内清淋效果

每鼠采集约100ul抗凝血，在抗凝血中加入抗小鼠CD19-APC(Biolegend，货号115512)及CD3-FITC(Biolegend，货号100204)抗体，室温染色15min。15min后，取50ul血样至含有绝对计数微球的Absolute Counting Tubes(BD Trucount^TM，货号340334)中，加入450ul红细胞裂解液(BD Pham Lyse^TM，货号555899)，室温裂解15min。待红细胞裂解完全后，经流式细胞术检测T细胞及B细胞比例，根据绝对已知计数微球的数量与比例计算出50ul外周血中T细胞与B细胞的数量。

结果如图1所示。以未经环磷酰胺处理的小鼠外周血为对照，经环磷酰胺处理3天后，小鼠T细胞和B细胞数量均呈剂量依赖性显著下降。

实施例2.制备CAR-T细胞

1.构建逆转录病毒质粒

人工合成依次连接的mCD19-scFv(SEQ ID NO：14)、mCD8a铰链区及跨膜区(SEQ IDNO：22和16)、鼠4-1BB胞内域(SEQ ID NO：18)和鼠CD3ζ胞内域(SEQ ID NO：20)的编码序列片段，并将其克隆入MSCV载体，获得MSCV-mCD19-CAR质粒。

人工合成依次连接的T2A和鼠XCL1(SEQ ID NO：25)的编码序列片段，并将其克隆入MSCV-mCD19-CAR载体，获得MSCV-mCD19-CAR-XCL1质粒。

2.制备逆转录病毒

在T175培养瓶中，以30×10⁶个细胞/瓶的密度将293T细胞接种于30ml含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜，用于病毒包装。

在无菌管中加入3ml Opti-MEM(Gibco，货号31985-070)、45μg制备的逆转录病毒质粒和15μg包装载体pCL-Eco(上海禾午生物科技有限公司，货号P3029)。然后加入120μlX-treme GENE HP DNA转染试剂(Roche，货号06366236001)，立即混匀，室温孵育15min。然后将该质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到预先准备好的293T细胞的培养瓶中，于37℃，5％CO₂条件下培养过夜。在转染后72小时收集培养物，离心(2000g，4℃，10分钟)，获得逆转录病毒上清液。

3.制备CAR-T细胞

从小鼠脾脏分离T淋巴细胞，并用DynaBeads CD3/CD28 CTS^TM(Gibco,货号40203D)激活T细胞，然后在37℃和5％CO₂下培养1天。

以每孔3×10⁶个细胞/mL的密度将激活的T细胞接种至预先用RetroNectin包被过夜的24孔板中，然后分别加入500μL完全培养基(NT，对照)、MSCV-mCD19-CAR病毒或MSCV-mCD19-CAR-XCL1病毒，并补充完全培养基至2mL。

将24孔板放于离心机进行离心感染，于32℃，2000g离心2h。然后，立刻将24孔板放置于37℃、CO2培养箱静置培养。第二天更换新鲜培养基，并调整细胞密度为1×10⁶个细胞/mL。感染三天后，收集细胞用于后续分析。收集的细胞即为NT细胞、mCD19-CAR细胞和mCD19-CAR-XCL1细胞。

实施例3.检测CAR-T细胞的表达

1.细胞表面CAR的表达水平

取出实施例2制备的2×10⁵个CAR-T细胞，用Goat Anti-Rat IgG(H&L)Biotin(BioVision,货号6910-250)作为一抗，APC Streptavidin(BD Pharmingen，货号554067)作为二抗，通过流式细胞术检测CAR T细胞上的CAR的表达水平，结果如图2所示。

可以看出，与对照相比，mCD19-CAR、mCD19-CAR-XCL1细胞中的CAR阳性效率均大于50％，表明这些细胞均可有效表达CAR。

2.XCL1的表达水平

收集实施例2制备的CAR-T细胞的上清液，根据制造商的建议，用MouseXCL1DuoSet ELISA kit试剂盒(R&D Systems,货号DY486)检测细胞中的XCL1的分泌水平，结果如图3所示。

可以看出，包含mCD19-CAR-XCL1的CAR T细胞可分泌XCL1。

实施例4.检测CAR-T细胞的IFN-γ分泌水平

在96孔圆底板中以2×10⁵个细胞/100μl的浓度分别加入野生型T细胞(即，NT细胞)、mCD19-CAR细胞、mCD19-CAR-XCL1细胞。然后在各孔中以1×10⁴个细胞/100μl的浓度分别加入靶标Panc02-mCD19细胞(表达mCD19的Panc02细胞)或非靶标Panc02细胞。在37℃培养24h后，收集培养物上清液。根据制造商的建议，用Mouse IFN-gamma DuoSet ELISA试剂盒(R&D，货号DY485)检测培养物上清液中IFN-γ的表达水平。

检测结果如图4所示。可以看出，在非靶细胞Panc02中均没有检测到IFN-γ的释放，而仅在与靶细胞Panc02-CD19共培养后检测到显著升高的IFN-γ水平，且NT细胞不表达IFN-γ，这表明本实施例中的CAR T细胞的杀伤都是特异性的。

实施例5.CAR-T细胞的肿瘤抑制效果验证

在健康C57BL/6小鼠的左前肢腋下部位，经皮下接种5×10⁵个Panc02-mCD19胰腺癌细胞。

将接种了胰腺癌细胞的小鼠随机分为5组，每组6只。待肿瘤体积生长至100mm³时，向其中4组小鼠经腹腔注射5mg/20g体重的环磷酰胺，1组小鼠不注射环磷酰胺(Untreated)。

在注射环磷酰胺3天后，向其中3组小鼠经尾静脉注射5×10⁶个NT细胞(CPA+NT)、mCD19-CAR细胞(CPA+mCD19-CAR)或mCD19-CAR-XCL1细胞(CPA+mCD19-CAR-XCL1)，1组小鼠不注射任何细胞(即，CPA组)。

监测小鼠的体重和肿瘤体积变化，直至实验结束。

小鼠的体重变化如图5所示。可以看出，施用CAR-T细胞后，各组小鼠的体重与对照组相比没有显著差异，且在观察周期中，当小鼠肿瘤未超过1500mm³时，小鼠行动活泼，毛色正常，这表明，施用CAR-T细胞不会对小鼠有明显的毒副反应。

小鼠的肿瘤体积变化如图6所示。可以看出，与NT细胞和常规CAR-T细胞相比，额外表达XCL1可增强CAR-T细胞的抗肿瘤效果。

实施例6.制备靶向Claudin18.2的CAR-T细胞并验证其功能

合成编码以下蛋白的序列，并将其克隆至pLVX载体(Public Protein/PlasmidLibrary(PPL)，货号:PPL00157-4a)：CD8α信号肽(SEQ ID NO：10)、claudin18.2纳米抗体(SEQ ID NO：33)、CD8α铰链区(SEQ ID NO：12)、CD8α跨膜区(SEQ ID NO：4)、4-1BB胞内区(SEQ ID NO：6)、CD3ζ胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：8)，获得18.2-CAR质粒。在18.2-CAR质粒中进一步包含用T2A肽连接的XCL1(SEQ ID NO：24)，获得18.2-CAR-XCL1质粒。

在无菌管中加入3ml Opti-MEM(Gibco，货号31985-070)稀释上述质粒后，再根据质粒:病毒包装载体：病毒包膜载体＝4:2:1的比例加入包装载体psPAX2(Addgene，货号12260)和包膜载体pMD2.G(Addgene，货号12259)。然后，加入120ul X-treme GENE HP DNA转染试剂(Roche，货号06366236001)，立即混匀，于室温下孵育15min，然后将质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到293T细胞的培养瓶中。在24小时和48小时收集病毒，将其合并后，超速离心(25000g，4℃，2.5小时)获得浓缩的慢病毒。

用DynaBeads CD3/CD28 CTSTM(Gibco,货号40203D)激活T细胞，并在37℃和5％CO2下继续培养1天。然后，加入浓缩的慢病毒，持续培养3天后，获得表达18.2-CAR和18.2-CAR-XCL1的CAR T细胞。未经修饰的野生型T细胞用作阴性对照(NT)。

使用Biotin-SP(long spacer)AffiniPure Goat Anti-human IgG,F(ab')2Fragment Specific(min X Hu,Bov,Hrs Sr Prot)(jackson immunoresearch，货号109-065-097)作为一抗，APC Streptavidin(BD Pharmingen，货号554067)或PE Streptavidin(BD Pharmingen，货号554061)作为二抗，CAR T细胞上的VHH的表达水平，结果如图7所示。可以看出，本发明制备的CAR T细胞中的claudin18.2人源化纳米抗体均可以有效表达。

为了检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力，首先以1x10⁴/孔将携带荧光素基因的NUGC4-18.2靶细胞铺入96孔板中，然后以不同效靶比将CAR T细胞和NT细胞铺入到96孔板进行共培养，16-18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：(靶细胞荧光均值-样品荧光均值)/靶细胞荧光均值×100％，计算得到杀伤效率，结果如图8所示。可以看出，与NT相比，18.2-CAR和18.2-CAR-XCL1细胞对靶细胞均有显著的特异性杀伤。

根据以下方法检测CAR-T细胞的体内抑瘤效果：首先在NCG小鼠的左前肢腋下部位，在D0经皮下接种5×10⁶个NUGC4-18.2胃癌细胞。然后在D3，向每只小鼠经尾静脉注射5×10⁶个PBMC细胞，获得具有人源化免疫系统的胃癌NCG小鼠模型。待肿瘤生长至D10，分别向每只小鼠经尾静脉注射5×10⁵个NT细胞、18.2-CAR T细胞或18.2-CAR-XCL1 T细胞。监测小鼠的肿瘤体积变化，直至实验结束，结果如图9所示。可以看出，在每只鼠5×10⁵个细胞的低剂量下，与NT细胞相比，18.2-CAR T细胞没有展现出显著的抑瘤效果。出乎意料地，18.2-CAR-XCL1 T细胞则从D30起就将肿瘤体积控制在较低水平且一直维持至实验结束没有复发，展现出了显著的肿瘤抑制效果。可见，额外表达的XCL1能够显著增强CAR-T细胞的肿瘤抑制效果。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京北恒生物科技有限公司

<120> 工程化免疫细胞及其用途

<130> BHCN36V1

<150> 2021104104669

<151> 2021-04-16

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD19 scFv

<400> 1

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctca 726

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD19 scFv

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8α跨膜结构域

<400> 3

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gcaaa 75

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8α跨膜结构域

<400> 4

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

20 25

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4-1BB共刺激结构域

<400> 5

cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60

actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4-1BB共刺激结构域

<400> 6

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

1 5 10 15

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

20 25 30

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

35 40

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD3ζ信号传导结构域

<400> 7

ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD3ζ信号传导结构域

<400> 8

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

1 5 10 15

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

20 25 30

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

35 40 45

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8α信号肽

<400> 9

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8α信号肽

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 11

<211> 135

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8α铰链区

<400> 11

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 12

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8α铰链区

<400> 12

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 13

<211> 714

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCD19 scFv

<400> 13

gacatccaga tgacccagag ccctgccagc ctgtctacca gcctgggcga gacagtgacc 60

atccagtgtc aggccagcga ggacatctac tctggcctgg cttggtatca gcagaagccc 120

ggcaagagcc ctcagctgct gatctacggc gccagcgacc tgcaggacgg cgtgcctagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggaacccag tacagcctga agatcaccag catgcagacc 240

gaggacgagg gcgtgtactt ctgccagcaa ggcctgacct accctagaac cttcggagga 300

ggcaccaagc tggaactgaa gggcggaggc ggaagtggag gcggaggatc tggcggcgga 360

ggctctgaag tgcagctgca gcagtctggc gctgaactgg tccggcctgg cactagcgtg 420

aagctgtcct gcaaggtgtc cggcgacacc atcaccttct actacatgca cttcgtgaag 480

cagaggccag gacagggcct ggaatggatc ggcagaatcg accctgagga cgagagcacc 540

aagtacagcg agaagttcaa gaacaaggcc accctgaccg ccgacaccag cagcaacacc 600

gcctacctga agctgtctag cctgacctcc gaggacaccg ccacctactt ttgcatctac 660

ggcggctact acttcgacta ctggggccag ggcgtgatgg tcaccgtgtc cagc 714

<210> 14

<211> 238

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCD19 scFv

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Gln Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Met Gln Thr

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Leu Thr Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln

115 120 125

Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys

130 135 140

Lys Val Ser Gly Asp Thr Ile Thr Phe Tyr Tyr Met His Phe Val Lys

145 150 155 160

Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Glu

165 170 175

Asp Glu Ser Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu

180 185 190

Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Lys Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ile Tyr Gly Gly Tyr Tyr

210 215 220

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 15

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCD8α跨膜结构域

<400> 15

atctgggcac ccttggccgg aatctgcgtg gcccttctgc tgtccttgat catcactctc 60

atc 63

<210> 16

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCD8α跨膜结构域

<400> 16

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Ile Ile Thr Leu Ile

20

<210> 17

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> m4-1BB共刺激结构域

<400> 17

aggaaaaaat tcccccacat attcaagcaa ccatttaaga agaccactgg agcagctcaa 60

gaggaagatg cttgtagctg ccgatgtcca caggaagaag aaggaggagg aggaggctat 120

gagctg 126

<210> 18

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> m4-1BB共刺激结构域

<400> 18

Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu

20 25 30

Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu

35 40

<210> 19

<211> 327

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCD3ζ胞内信号传导结构域

<400> 19

agcaggagtg cagagactgc tgccaacctg caggacccca accagctcta caatgagctc 60

aatctagggc gaagagagga atatgacgtc ttggagaaga agcgggctcg ggatccagag 120

atgggaggca aacagcagag gaggaggaac ccccaggaag gcgtatacaa tgcactgcag 180

aaagacaaga tggcagaagc ctacagtgag atcggcacaa aaggcgagag gcggagaggc 240

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agcactgcca ccaaggacac ctatgatgcc 300

ctgcatatgc agaccctggc ccctcgc 327

<210> 20

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCD3ζ胞内信号传导结构域

<400> 20

Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu

1 5 10 15

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu

20 25 30

Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg

35 40 45

Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met

50 55 60

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

65 70 75 80

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

85 90 95

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg

100 105

<210> 21

<211> 135

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCD8α铰链区

<400> 21

actactacca agccagtgct gcgaactccc tcacctgtgc accctaccgg gacatctcag 60

ccccagagac cagaagattg tcggccccgt ggctcagtga aggggaccgg attggacttc 120

gcctgtgata tttac 135

<210> 22

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCD8α铰链区

<400> 22

Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro Thr

1 5 10 15

Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser

20 25 30

Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

35 40 45

<210> 23

<211> 345

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> hXCL-1

<400> 23

atgagacttc tcatcctggc cctccttggc atctgctctc tcactgcata cattgtggaa 60

ggtgtaggga gtgaagtctc agataagagg acctgtgtga gcctcactac ccagcgactg 120

ccggttagca gaatcaagac ctacaccatc acggaaggct ccttgagagc agtaattttt 180

attaccaaac gtggcctaaa agtctgtgct gatccacaag ccacgtgggt gagagacgtg 240

gtcaggagca tggacaggaa atccaacacc agaaataaca tgatccagac caagccaaca 300

ggaacccagc aatcgaccaa tacagctgtg accctgactg gctag 345

<210> 24

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> hXCL-1

<400> 24

Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala

1 5 10 15

Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys

20 25 30

Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr

35 40 45

Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg

50 55 60

Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val

65 70 75 80

Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln

85 90 95

Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu

100 105 110

Thr Gly

<210> 25

<211> 345

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mXCL-1

<400> 25

atgagacttc tcctcctgac tttcctggga gtctgctgcc tcaccccatg ggttgtggaa 60

ggtgtgggga ctgaagtcct agaagagagt agctgtgtga acttacaaac ccagcggctg 120

ccagttcaaa aaatcaagac ctatatcatc tgggaggggg ccatgagagc tgtaattttt 180

gtcaccaaac gaggactaaa aatttgtgct gatccagaag ccaaatgggt gaaagcagcg 240

atcaagactg tggatggcag ggccagtacc agaaagaaca tggctgaaac tgttcccaca 300

ggagcccaga ggtccaccag cacagcagta accctgactg ggtaa 345

<210> 26

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mXCL-1

<400> 26

Met Arg Leu Leu Leu Leu Thr Phe Leu Gly Val Cys Cys Leu Thr Pro

1 5 10 15

Trp Val Val Glu Gly Val Gly Thr Glu Val Leu Glu Glu Ser Ser Cys

20 25 30

Val Asn Leu Gln Thr Gln Arg Leu Pro Val Gln Lys Ile Lys Thr Tyr

35 40 45

Ile Ile Trp Glu Gly Ala Met Arg Ala Val Ile Phe Val Thr Lys Arg

50 55 60

Gly Leu Lys Ile Cys Ala Asp Pro Glu Ala Lys Trp Val Lys Ala Ala

65 70 75 80

Ile Lys Thr Val Asp Gly Arg Ala Ser Thr Arg Lys Asn Met Ala Glu

85 90 95

Thr Val Pro Thr Gly Ala Gln Arg Ser Thr Ser Thr Ala Val Thr Leu

100 105 110

Thr Gly

<210> 27

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> T2A

<400> 27

gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54

<210> 28

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> T2A

<400> 28

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 29

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCD8α信号肽

<400> 29

atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60

atcctgggga gt 72

<210> 30

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCD8α信号肽

<400> 30

Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser

20

<210> 31

<211> 345

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> hXCL2

<400> 31

atgagacttc tcatcctggc cctccttggc atctgctctc tcactgcata cattgtggaa 60

ggtgtaggga gtgaagtctc acataggagg acctgtgtga gcctcactac ccagcgactg 120

ccagttagca gaatcaagac ctacaccatc acggaaggct ccttgagagc agtaattttt 180

attaccaaac gtggcctaaa agtctgtgct gatccacaag ccacgtgggt gagagacgtg 240

gtcaggagca tggacaggaa atccaacacc agaaataaca tgatccagac caagccaaca 300

ggaacccagc aatcgaccaa tacagctgtg accctgactg gctag 345

<210> 32

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> hXCL2

<400> 32

Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala

1 5 10 15

Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser His Arg Arg Thr Cys

20 25 30

Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr

35 40 45

Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg

50 55 60

Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val

65 70 75 80

Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln

85 90 95

Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu

100 105 110

Thr Gly

<210> 33

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> Claudin18.2 sdAb

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Leu Ile Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Thr Arg Gly Gly Ser Ala Asn Tyr Thr Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Asp Leu Asn Leu Arg Ser Asp Pro Phe Lys Trp Tyr Thr Phe Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CLDN18.2 sdAb CDR1

<400> 34

Gly Ser Ile Phe Leu Ile Asn

1 5

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CLDN18.2 sdAb CDR2

<400> 35

Thr Arg Gly Gly Ser

1 5

<210> 36

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)

<220>

<223> CLDN18.2 sdAb CDR3

<400> 36

Asp Leu Asn Leu Arg Ser Asp Pro Phe Lys Trp Tyr Thr Phe

1 5 10

Claims (22)

1.一种工程化免疫细胞，其表达(i)特异性识别抗原的细胞表面分子，和(ii)外源性的XCL2和/或XCL1基因。

2.权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述特异性识别抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体或T细胞受体。

3.权利要求2所述的工程化免疫细胞，其中所述特异性识别抗原的细胞表面分子是包含以下的嵌合抗原受体：抗原结合区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。

4.权利要求1-3任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述XCL1基因与SEQ ID NO：23或25所示的核酸序列具有至少90％同一性，或者所述XCL1基因编码的多肽与SEQ ID NO：24或26所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，其中所述XCL2基因与SEQ ID NO：31所示的核酸序列具有至少90％同一性，或者所述XCL2基因编码的多肽与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。

5.权利要求1-4任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞选自T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞、或NKT细胞。

6.权利要求5所述的工程化免疫细胞，其中所述T细胞是CD4+/CD8+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、CD4-CD8-T细胞、调节性T细胞、γδ-T细胞或αβ-T细胞。

7.权利要求3-6任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合区选自IgG、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd′、Fv、scFv、sdFv、线性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、双体、anticalin和DARPIN抗原。

8.权利要求3所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原抗原结合区与选自以下的靶标结合：CD7、CD2、CD5、CD3、CD73、CD47、VEGF、GUCY2C、EGP40、EGP-2、CD133、IFNAR1、DLL3、kappa轻链、TIM3、CD70、TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、Tn抗原、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、AFP、Folate受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、CS1、CD138、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、TMPRSS2 ETS融合基因、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。

9.权利要求8所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原抗原结合区与CD19或

Claudin18.2结合。

10.权利要求3-8任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。

11.权利要求3-9任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

12.权利要求3-10任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域是一个或多个选自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。

13.权利要求1-11任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞还包含至少一种失活基因，其选自以下：CD52、GR、TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247ζ、HLA-I、HLA-II、B2M、PD1、CTLA-4、LAG3和TIM3。

14.权利要求1-12任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述XCL2和/或XCL1基因的表达是条件型表达。

15.权利要求13所述的工程化免疫细胞，其中所述XCL2和/或XCL1基因与诱导型或组织特异性启动子可操作连接从而被条件型表达。

16.权利要求1-14任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述XCL2和/或XCL1基因与定位结构域可操作连接。

17.一种核酸分子，其包含：(i)编码特异性识别抗原的细胞表面分子的核酸序列，和(ii)编码XCL2和/或XCL1的核酸序列。

18.权利要求16所述的核酸分子，其中所述特异性识别抗原的细胞表面分子是嵌合抗原受体。

19.一种载体，其包含权利要求16-17任一项所述的核酸分子。

20.权利要求18所述的载体，其中所述载体选自质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV)、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)。

21.一种药物组合物，其包含权利要求1-15任一项所述的工程化免疫细胞、权利要求16-17任一项所述的核酸分子或权利要求18-19任一项所述的载体，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。

22.一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用权利要求1-15任一项所述的工程化免疫细胞或权利要求20所述的药物组合物。

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