CN111729084B

CN111729084B - Sting激动剂与工程化免疫细胞的组合疗法

Info

Publication number: CN111729084B
Application number: CN202010362696.8A
Authority: CN
Inventors: 邢芸; 闫忠辉; 任江涛; 贺小宏; 王延宾; 韩露
Original assignee: Nanjing Bioheng Biotech Co Ltd
Current assignee: Nanjing Bioheng Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2040-04-30
Also published as: CN111729084A

Abstract

本发明涉及表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞与STING激动剂的组合在治疗疾病，例如癌症、感染或自身免疫疾病中的用途。与单独使用表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞相比，加入STING激动剂能增强所述免疫细胞的肿瘤杀伤活性，而不会对其增殖效率产生任何不利影响。

Description

STING激动剂与工程化免疫细胞的组合疗法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及STING激动剂与工程化免疫细胞的组合在治疗疾病中的用途。

背景技术

传统的肿瘤治疗方法包括手术治疗、放疗以及化疗。细胞免疫疗法是一种新兴的肿瘤治疗方法，其中重组嵌合抗原受体细胞疗法目前已经应用于临床并取得明显治疗效果。

重组嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）细胞疗法一般包括以下步骤：从患者自身提取免疫系统的淋巴细胞，例如T细胞，然后经过体外培养和改造，给这些T细胞装备上胞外肿瘤特异性抗原识别结构域以及胞内信号传导结构域，使它们能识别并攻击特定的癌细胞，再把改造后的T细胞回输给患者，从而消灭癌细胞。随着基因编辑技术的进步，也可以通过改造健康供体的T细胞来制备可供普通患者使用的通用型嵌合抗原受体T细胞。CAR-T细胞的特点是可以主动识别和攻击表达相应抗原的癌细胞，但对整体免疫平衡的调控能力相对薄弱。由于肿瘤微环境的复杂性，部分血液瘤患者和实体瘤患者对CAR-T治疗的响应率不高，这限制了CAR-T细胞疗法的有效性与持久性。

为了进一步增强CAR-T细胞的功能，我们希望寻找一些免疫刺激分子，在与CAR-T细胞联用时能提高CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。

发明内容

在第一个方面，本发明提供一种组合物，包括表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞和STING激动剂。

本发明还提供一种包含STING激动剂的组合物，其与包含表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞的组合物组合使用以增强所述工程化免疫细胞的功效。

在一个实施方案中，所述免疫细胞是选自T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。优选地，所述T细胞是CD4+/CD8+ T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞或αβ-T细胞。

在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。其中，配体结合结构域可以选自scFv、Fab、单结构域抗体、纳米抗体、抗原结合配体、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN。优选地，所述配体结合结构域选自scFv、Fab、单结构域抗体和纳米抗体。

在一个实施方案中，所述配体结合结构域与选自以下的靶标结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII 、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、TnAg、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、 VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、AFP、Folate 受体α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、CS1、CD138、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、MUC1、AFP、Folate 受体α、CEA、PSCA、PSMA、Her2、EGFR、IL13Ra2、GD2、NKG2D、EGFRvIII、CS1、BCMA、间皮素和它们的任意组合。

在一个实施方案中，所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。优选地，跨膜结构域选自CD8α、CD4、CD28和CD278的跨膜结构域。

在一个实施方案中，所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。优选地，所述胞内信号传导结构域包含CD3ζ的信号传导结构域。

在一个实施方案中，所述共刺激结构域是一个或多个选自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18（LFA-1）、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD276（B7-H3）、CD278(ICOS)、CD357（GITR）、DAP10、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。优选地，所述共刺激结构域是CD27、CD28、CD134、CD137或CD278的共刺激信号传导结构域或它们的组合。

在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体包含：(a)4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，(b)CD27共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，(c)CD28共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，(d)OX40共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，(e)CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，(f)OX40共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，或(g)CD28共刺激结构域、OX40共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。

在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞还表达其他外源性基因，包括但不限于：Flt3L、干扰素、白细胞介素（例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-33、IL-36等）、PD1抑制剂、PDL1抑制剂等。

在一个实施方案中，所述工程化细胞还包含至少一种表达下调或失活的基因，其选自以下：CD52、GR、TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247ζ、HLA-I、HLA-II、B2M、dCK、免疫检查点基因如PD1、CTLA-4、LAG3和TIM3等。

在一个实施方案中，STING激动剂选自c-AMP-GMP、 c-di-GMP、c-di-AMP、c-di-IMP、c-AMP-IMP、c-GMP-IMP、以及它们的硫取代衍生物或任何组合。特别优选地，STING激动剂是c-di-GMP、c-di-AMP或它们的组合。

在第二个方面，本发明提供一种治疗癌症、感染或自身免疫疾病的方法，包括向所述受试者施用STING激动剂和表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞。

本发明还提供STING激动剂和表嵌合抗原受体的工程化免疫细胞在制备治疗癌症、感染或自身免疫疾病的药物中的用途。

在一个实施方案中，向受试者顺序施用所述工程化免疫细胞和STING激动剂。在另一个实施方案中，向受试者同时施用所述工程化免疫细胞和STING激动剂。因此，STING激动剂和表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞可以存在于同一组合物中，也可以存在于不同的组合物中。

在一个实施方案中，所述癌症选自：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌以及其它癌和肉瘤、以及B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、以及Waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、毛细胞白血病、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、浆母细胞性淋巴瘤、白血病前期、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)。

在一个实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。

在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。

本发明的优势之处在于，发明人首次发现，STING激动剂能够增强CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力并提高细胞因子的释放水平，同时对其增殖效率并没有不利影响。换言之，STING激动剂能够与CAR-T细胞产生协同作用，从而增强CAR-T细胞的功效。\

发明详述

除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。

嵌合抗原受体

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括配体结合结构域（例如抗体的抗原结合部分）、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，各个结构域之间通过接头连接。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。非MHC限制性的抗原识别给予表达CAR的T细胞与抗原处理无关的识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞内表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)的α链和β链二聚化。

如本文所用，“配体结合结构域”是指可以与配体结合的任何结构或其功能性变体。配体结合结构域可以是抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其功能性片段。例如，配体结合结构域包括但不限于Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、单链抗体（Single Chain Antibody Fragment, scFv）、单结构域抗体（Single Domain Antibody, sdAb）、纳米抗体（Nanobody，Nb）、抗原结合配体、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN等，优选选自Fab、scFv、sdAb和纳米抗体。在本发明中，配体结合结构域可以是单价或二价，且可以是单特异性、双特异性或多特异性的抗体。在另一个实施方案中，配体结合结构域也可以是特定蛋白的特异性结合多肽或受体结构，所述特定蛋白是例如PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL和NKG2D。

“Fab”是指免疫球蛋白分子被木瓜蛋白酶裂解后产生的两个相同片段中的任一个，由通过二硫键连接的完整轻链和重链N端部分组成，其中重链N端部分包括重链可变区和CH1。与完整的IgG相比，Fab没有Fc片段，流动性和组织穿透能力较高，并且无需介导抗体效应即可单价结合抗原。

“单链抗体”或“scFv”是由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过接头连接而成的抗体。可以选择接头的最佳长度和/或氨基酸组成。接头的长度会明显影响scFv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的接头(例如在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。关于接头的大小和组成的选择，参见例如，Hollinger等人,1993ProcNatl Acad .Sci .U .S .A .90:6444-6448；美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公布号WO2006/020258和WO2007/024715，其全文通过引用并入本文。scFv可以包含以任何顺序连接的VH和VL，例如VH-接头-VL或VL-接头-VH。

“单结构域抗体”或“sdAb”是指一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区，也称为“重链抗体”。

“纳米抗体”或“Nb”是指单独克隆并表达出来的VHH结构，其具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。

术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰优选是保守型修饰。

如本文所用，术语“保守性修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变而引入本发明的嵌合抗原受体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。

因此，“功能性变体”或“功能性片段”与亲本氨基酸序列具有至少75%，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且保留亲本氨基酸的生物活性，例如结合活性。

如本文所用，术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如Blast (Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol .147：195-197)和ClustalW。

配体结合结构域的选择取决于待识别的与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记，例如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。因此，在一个实施方案中，本发明的配体结合结构域与选自以下的一个或多个靶标结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、 VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、Folate 受体α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自：CD19、CD20、CD22、BAFF-R、CD33、EGFRvIII、BCMA、GPRC5D、PSMA、ROR1、FAP、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、CAIX、WT1、NY-ESO-1、CD79a、CD79b、GPC3、Claudin18.2、NKG2D和它们的任意组合。根据待靶向的抗原，本发明的CAR可以被设计为包括对该抗原具有特异性的配体结合结构域。例如，如果CD19是待靶向的抗原，则CD19抗体可用作本发明的配体结合结构域。在优选的实施方式中，本发明CAR包含CD19 scFv，其与SEQ ID NO: 2或14所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或者CD19 scFv的编码序列与SEQ ID NO: 1或13所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

如本文所用，术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞（例如淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞）表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能性片段。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自CD8α链，其与SEQ ID NO:4或16所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或所述CD8α跨膜结构域的编码序列与SEQ ID NO:3或15所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含位于配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。如本文所用，术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至配体结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为配体结合结构域提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自CD8、CD4或CD28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链区包含CD8α链、FcγRIIIα受体、IgG4或IgG1的铰链区部分，更优选CD8α铰链，其与SEQ ID NO:12或22所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或者CD8α铰链的编码序列与SEQ ID NO:11或21所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分。胞内信号传导结构域负责在配体结合结构域结合抗原以后的细胞内初级信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达CAR的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的胞内信号传导结构域可以是T细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发初级信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞内信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor Tyrosine-basedActivation Motifs, ITAM）。本发明的胞内信号传导结构域的非限制性施例包括但不限于源自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在优选的实施方式中，本发明CAR的信号传导结构域可以包含CD3ζ信号传导结构域，该信号传导结构域与SEQ ID NO:8或20所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:7或19所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能片段。“共刺激分子”是指在T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应（例如增殖）的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于1类MHC分子、BTLA和Toll配体受体。本发明的共刺激结构域的非限制性施例包括但不限于源自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18（LFA-1）、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD276（B7-H3）、CD278(ICOS)、CD357（GITR）、DAP10、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM以及ZAP70。优选地，本发明CAR的共刺激结构域来自4-1BB、CD28或4-1BB+CD28。在一个实施方案中，本发明的CAR包含的共刺激结构域与SEQ ID NO:6或18所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或该共刺激结构域的编码序列与SEQ ID NO:5或17所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含信号肽，使得当其在细胞例如T细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自CD8α、IgG1、GM-CSFRα等的信号肽。在一个实施方案中，可用于本发明的信号肽与SEQ ID NO:10或24所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或该信号肽的编码序列与SEQ ID NO:9或23所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含开关结构，以调控CAR的表达时间。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外结合结构域，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构域分别连接结合结构域和信号传导结构域，仅当开关结构域互相结合（例如在诱导化合物的存在下）时，结合结构域和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外结合结构域，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外结合结构域，使其成为一个“普通”的CAR结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时（例如产生严重的毒副作用时）清除CAR细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如CD20表位、RQR8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除CAR细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK），该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是iCaspase-9，可以通过化学诱导药物如AP1903、AP20187等诱导iCaspase-9发生二聚化，从而激活下游的Caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。

激动剂

干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）也被称为TMEM173、MITA、MPYS和ERIS，是位于细胞内质网上的跨膜受体和胞质核酸的关键感应受体。当受到部分配体（比如CDN）的刺激后，STING的分子构型发生变化并被激活，招募细胞质中的TANK结合激酶1（TANK-bindingkinase 1，TBK1），介导TBK1对IRF3的磷酸化，形成能够进入细胞核的IRF3同源二聚体，进而转录并产生I型干扰素（主要是IFNα和IFNβ）。TBK1还经由致癌转录因子NF-κB促进促炎性细胞因子，例如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α等的产生。此外，STING还通过活化STAT6来诱导、增加或降低某些细胞因子（包括趋化因子）的产生。

STING途径的激活能够触发免疫应答，导致产生特异性的杀伤T细胞，控制肿瘤并提供持久免疫力。此外，激活STING途径也有助于抵抗病毒，增强先天性和适应性的免疫应答，最终产生针对病毒的持久免疫力。

激动剂是指能与细胞上受体或信号转导途径的蛋白分子相结合，并产生天然物质的典型生理效能的化学品或药物。cGAMP是在哺乳动物细胞中产生的STING高亲和力配体，是激活STING途径的内源第二信使。cGAMP具有独特的2’-3’环状二核苷酸结构，其在外源双链DNA(例如，由入侵的细菌、病毒或原生动物释放)或哺乳动物中自身-DNA的存在下由cGAMP合成酶（cGAS）产生。

在一个实施方案中，STING激动剂选自c-AMP-GMP（cGAMP）、 c-di-GMP、c-di-AMP、c-di-IMP、c-AMP-IMP、c-GMP-IMP、以及它们的硫取代衍生物或任何组合。特别优选地，STING激动剂是c-di-GMP、c-di-AMP或它们的组合。

在另一个实施方案中，STING激动剂是类黄酮。合适的类黄酮包括但不限于10-(羧甲基)-9(10H)吖啶酮(CMA)、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)、异氧黄酮(methoxyvone)、6,4’-二甲氧基黄酮、4’-甲氧基黄酮、3’,6’-二羟基黄酮、7’,2’-二羟基黄酮、大豆黄素、芒柄花黄素、氧杂蒽酮或其任何组合。

工程化免疫细胞及其制备方法

如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导ADCC和/或CDC)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞。优选地，免疫细胞是T细胞。T细胞可以是任何T细胞，如体外培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自体外培养的T细胞系例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自受试者的T细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。T细胞也可以被浓缩或纯化。T细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+ T细胞、CD4+辅助T细胞（例如Th1和Th2细胞）、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是人T细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如Ficoll分离从受试者的血液获得T细胞。

采用本领域已知的常规方法(如通过转导、转染、转化等)可以将编码嵌合抗原受体的核酸序列引入免疫细胞。“转染”是将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。一个例子是RNA转染，即将RNA(比如体外转录的RNA，ivtRNA)引入宿主细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时的孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、显微注射和电穿孔。术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中、也向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其通过细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传材料(核酸分子)而产生。转化可以通过人工手段实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态的状态。对于原核转化，技术可包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。

将核酸引入免疫细胞后，本领域技术人员可以通过常规技术对所得免疫细胞进行扩增和活化。

还在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞还包含至少一种表达下调或失活的基因，其选自以下：CD52、GR、TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247ζ、HLA-I、HLA-II、B2M、dCK、免疫检查点基因如PD1、CTLA-4、LAG3和TIM3。更特别地，免疫细胞中的至少TCR组分（包括TCRα、TCRβ基因）或CD3组分（包括CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247ζ）的表达下调或失活。这使得TCR-CD3复合物在细胞中没有功能。该策略对于避免移植物抗宿主病(GvHD)特别有用。使基因失活的方法是本领域已知的，例如通过大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALE核酸酶或CRISPR系统中的Cas酶介导DNA断裂，从而使该基因失活。

还在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞还表达其他外源性基因，包括但不限于：Flt3L、干扰素、白细胞介素（例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-33、IL-36等）、PD1抑制剂、PDL1抑制剂等。

治疗应用

本发明还提供一种治疗癌症、感染或自身免疫疾病的方法，包括向所述受试者施用STING激动剂和表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞。本发明还提供STING激动剂和表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞的组合在制备治疗癌症、感染或自身免疫疾病的药物中的用途。

在一个实施方案中，向受试者顺序施用所述工程化免疫细胞和STING激动剂。在另一个实施方案中，向受试者同时施用所述工程化免疫细胞和STING激动剂。

STING激动剂和表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞可以存在于同一组合物中，也可以存在于不同的组合物中。例如，本发明提供一种包含STING激动剂的组合物，其与包含表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞的组合物组合使用以增强所述工程化免疫细胞的功效。

所述包含STING激动剂的组合物以及包含表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞的组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的赋型剂。如本文所用，术语“药学上可接受的赋型剂” 是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容（即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用）的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。

根据本发明的组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。

根据本发明的组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊、糖浆、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。本文所述的组合物通常以溶液形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。

此外，本发明的治疗癌症、感染或自身免疫疾病的方法还包括进一步向受试者施用一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂。或者，本发明的SING激动剂和钱和抗原受体的组合还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂联用。此类药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate) 、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如IL-2、IL-15，趋化因子比如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗CD3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。此外，本发明的药物组合物也可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。

在一个实施方案中，可用本发明的STING激动剂和表达CAR的工程化免疫细胞的组合治疗的癌症选自：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌以及其它癌和肉瘤、以及B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、以及Waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、毛细胞白血病、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、浆母细胞性淋巴瘤、白血病前期、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)。

在一个实施方案中，可用本发明的STING激动剂和表达CAR的工程化免疫细胞的组合治疗的感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。

在一个实施方案中，可用本发明的STING激动剂和表达CAR的工程化免疫细胞的组合治疗的自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

附图说明

图1：示出了NT细胞及CAR-T细胞中的CAR表达水平。

图2：示出了SING激动剂对CAR-T细胞的CD107a表达水平的影响。

图3：示出了SING激动剂对CAR-T细胞的细胞因子释放水平的影响。

图4：示出了SING激动剂对CAR-T细胞的体外毒性的影响。

图5：示出了SING激动剂对CAR-T细胞体外扩增的影响。

具体实施方式

实施例1. 制备CAR-T细胞

本实施例中使用的T细胞是通过Ficoll-Paque^TM PREMIUM（GE Healthcare，货号17-5442-02）采用白细胞分离术从健康供体分离原代人CD4+及CD8+ T细胞

合成以下编码序列，并将其依次克隆至pGEM-T Easy载体（Promega，货号A1360）：CD8α信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域，获得CAR质粒，并通过测序确认目标序列的正确插入。

在无菌管中加入3ml Opti-MEM（Gibco，货号31985-070）稀释上述质粒后，再根据质粒: 病毒包装载体：病毒包膜载体=4:2:1的比例加入包装载体psPAX2（Addgene，货号12260）和包膜载体pMD2.G（Addgene，货号12259）。然后，加入120μl X-treme GENE HP DNA转染试剂（Roche，货号06366236001），立即混匀，于室温下孵育15min，然后将质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到293T细胞的培养瓶中。在24小时和48小时收集病毒，将其合并后，超速离心（25000g，4℃，2.5小时）获得浓缩的慢病毒。

用DynaBeads CD3/CD28 CTS^TM（Gibco,货号40203D）激活T细胞，并在37℃和5％CO2下培养1天。然后，加入浓缩的慢病毒，持续培养3天后，获得CD19 CAR-T细胞。

将CD19 CAR-T细胞在37℃和5％CO2下培养11天之后，使用Biotin-SP (longspacer) AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, F(ab')₂ Fragment Specific(min X Hu,Bov, Hrs Sr Prot)（jackson immunoresearch，货号115-065-072）作为一抗，APCStreptavidin（BD Pharmingen，货号554067）作为二抗，通过流式细胞仪检测CAR-T细胞中CAR的表达水平，结果如图1所示。

可以看出，未感染病毒的NT细胞不表达CAR，CD19 CAR-T细胞中CAR的表达水平为93.2%。即，本实施例制备的CD19 CAR-T细胞可以有效表达CAR。

实施例2. SING激动剂对CAR-T细胞的CD107a表达水平的影响

本发明中所用的靶细胞K562-CD19是用表达CD19的慢病毒感染携带荧光素酶的K562细胞后，用流式细胞术筛选出的CD19阳性单克隆细胞。

T细胞按照表面分化抗原可分为CD4+亚群和CD8+亚群，其中CD8+亚群T细胞是机体发挥细胞毒性作用的主要效应细胞。当T细胞对肿瘤细胞进行杀伤时会分泌CD107a（即，溶酶体相关膜蛋白），从而释放穿孔素颗粒酶对肿瘤细胞进行杀伤。因此，使用与CD107a结合的抗体，通过流式细胞术检测CD8+亚群T细胞中的CD107a表达水平，可以反映CAR-T细胞的杀伤能力。

在96孔板中，向每孔加入100μl包含10μl CD107a抗体（BD pharmingen，Cat#555801）和1×10⁵个CD19 CAR-T细胞的CMX培养液（45% RPMI 1640 + 45% X-VIVO15 + 10%FBS）、80μl包含1×10⁴个K562细胞或K562-CD19细胞的CMX培养液，以及20μl浓度分别为4 μg/mL、1.3 μg/mL、0.44 μg/mL、0.15 μg/mL、0.05 μg/mL、0.016 μg/mL、0.005 μg/mL、0.000μg/mL 的STING激动剂c-di-AMP（Invivogen，Cat# tlrl-nacda）或c-di-GMP（Invivogen，Cat# tlrl-nacdg）。将96孔板在37℃孵育1小时后，加入10μl含有Golgi stop（BD，Cat#554724）的CMX培养液，于37℃继续孵育2.5小时。向每孔加入5μl 抗CD8抗体（BDpharmingen，Cat# 555369），于37℃继续孵育30分钟。然后取出96孔板，离心后，用FACS缓冲液（DPBS+1% FBS）洗涤，并用流式细胞术检测CD107a的表达水平，结果如图2所示。

可以看出，在非靶细胞K562中均检测不到CD107a，仅在靶细胞K562-CD19中检测到CD107a的表达，表明CD19 CAR-T对靶细胞的杀伤是特异性的。此外，在各种浓度的c-di-AMP或c-di-GMP的存在下，CD8+T细胞表达的CD107a水平与没有STING激动剂相比均显著增加。这表明，STING激动剂可以显著增加CD8+T细胞中CD107a的表达水平，增强CAR-T细胞的杀伤能力。

实施例3. SING激动剂对CAR-T细胞的细胞因子释放水平的影响

在96孔板中，向每孔加入100μl包含1×10⁶个CD19 CAR-T细胞的CMX培养液、80μl包含1×10⁴个K562细胞或K562-CD19细胞的CMX培养液、10μl浓度分别为4 μg/mL、1.3 μg/mL、0.44 μg/mL、0.15 μg/mL、0.05 μg/mL、0.016 μg/mL、0.005 μg/mL、0 μg/mL 的STING激动剂c-di-AMP（Invivogen，Cat# tlrl-nacda）或c-di-GMP（Invivogen，Cat# tlrl-nacdg），以及10μl包含BrefeldinA（Biolegend，Cat# 420601）溶液的CMX培养液。将96孔板在37℃孵育过夜，然后离心，用FACS缓冲液洗涤后，每孔加入100μl破膜固定液（Invitrogen，Cat#88882400），于4℃孵育30分钟。孵育结束后，用FACS缓冲液洗涤，并向每孔加入100μl包含1μL CD4抗体（BD pharmingen，Cat# 555347）、1 μL CD8抗体（BD pharmingen，Cat# 555369）以及1 μL IFN-γ抗体（Biolegend，Cat# 502532）的FACS缓冲液，于4℃孵育30分钟。孵育结束后，取出96孔板，离心后用FACS缓冲液洗涤，并用流式细胞术检测CD4+CD8+亚群T细胞中的细胞因子IFN-γ的释放水平，结果如图3所示。

可以看出，在非靶细胞K562中均检测不到IFN-γ的释放，仅在靶细胞K562-CD19中检测到IFN-γ的释放，表明CD19 CAR-T对靶细胞的杀伤是特异性的。此外，在各种浓度的c-di-AMP或c-di-GMP的存在下，CAR-T细胞释放的IFN-γ水平与没有STING激动剂相比均显著增加（P<0.0001）。这表明，STING激动剂可以显著增加IFN-γ释放水平，从而增强CAR-T细胞的杀伤能力。

实施例4. SING激动剂对CAR-T细胞的体外毒性的影响

在96孔板中，向每孔加入100μl包含1×10⁶个CD19 CAR-T细胞的CMX培养液、80μl包含1×10⁴个K562-CD19细胞的CMX培养液，以及20μl浓度为0.5 μg/mL的STING激动剂c-di-AMP（Invivogen，Cat# tlrl-nacda）或c-di-GMP（Invivogen，Cat# tlrl-nacdg）。将96孔板在37℃孵育过夜，然后每孔加入50μl 50×的D-Luciferin溶液（XenoLight，Cat#12279），并立即利用酶标仪测定荧光值。没有添加STING激动剂的CD19 CAR-T细胞和K562-CD19细胞的共培养作为对照。根据计算公式：（靶细胞荧光均值-样品荧光均值）/靶细胞荧光均值×100%，计算得到杀伤效率，结果如图4所示。

可以看出，与没有STING激动剂相比，c-di-AMP和c-di-GMP单独均能显著增加CAR-T细胞杀伤靶细胞的能力。

实施例4. SING激动剂对CAR-T细胞体外扩增的影响

为了进一步验证STING激动剂对CAR-T细胞本身的细胞毒性，在24孔细胞培养板中，向每孔加入1ml包含1×10⁶个CD19 CAR-T细胞和1×10⁵个K562-CD19细胞的CMX培养液，以及1μg/mL的c-di-AMP或c-di-GMP，于37℃进行共同培养。此后，每2天更换培养液，并补充STING激动剂至终浓度为1μg/mL。没有添加STING激动剂的CD19 CAR-T细胞和K562-CD19细胞的共培养作为对照。

通过细胞计数器记录细胞的数量，并计算相较于第一天的扩增倍数。结果如图5所示。

可以看出，无论是否存在STING激动剂，CAR-T细胞均在共同培养至第9天时持续保持扩增状态，此后扩增倍数逐渐下降。这表明，STING激动剂的添加对CAR-T细胞的增殖速率并不会产生不利影响。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京北恒生物科技有限公司

<120> STING激动剂与工程化免疫细胞的组合疗法

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctca 726

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gcaaa 75

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

20 25

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60

actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

1 5 10 15

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

20 25 30

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

35 40

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

1 5 10 15

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

20 25 30

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

35 40 45

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 11

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 12

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 13

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gacatccaga tgacccagag ccctgccagc ctgtctacca gcctgggcga gacagtgacc 60

atccagtgtc aggccagcga ggacatctac tctggcctgg cttggtatca gcagaagccc 120

ggcaagagcc ctcagctgct gatctacggc gccagcgacc tgcaggacgg cgtgcctagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggaacccag tacagcctga agatcaccag catgcagacc 240

gaggacgagg gcgtgtactt ctgccagcaa ggcctgacct accctagaac cttcggagga 300

ggcaccaagc tggaactgaa gggcggaggc ggaagtggag gcggaggatc tggcggcgga 360

ggctctgaag tgcagctgca gcagtctggc gctgaactgg tccggcctgg cactagcgtg 420

aagctgtcct gcaaggtgtc cggcgacacc atcaccttct actacatgca cttcgtgaag 480

cagaggccag gacagggcct ggaatggatc ggcagaatcg accctgagga cgagagcacc 540

aagtacagcg agaagttcaa gaacaaggcc accctgaccg ccgacaccag cagcaacacc 600

gcctacctga agctgtctag cctgacctcc gaggacaccg ccacctactt ttgcatctac 660

ggcggctact acttcgacta ctggggccag ggcgtgatgg tcaccgtgtc cagc 714

<210> 14

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Gln Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Met Gln Thr

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Leu Thr Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln

115 120 125

Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys

130 135 140

Lys Val Ser Gly Asp Thr Ile Thr Phe Tyr Tyr Met His Phe Val Lys

145 150 155 160

Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Glu

165 170 175

Asp Glu Ser Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu

180 185 190

Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Lys Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ile Tyr Gly Gly Tyr Tyr

210 215 220

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 15

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atctgggcac ccttggccgg aatctgcgtg gcccttctgc tgtccttgat catcactctc 60

atc 63

<210> 16

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Ile Ile Thr Leu Ile

20

<210> 17

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aggaaaaaat tcccccacat attcaagcaa ccatttaaga agaccactgg agcagctcaa 60

gaggaagatg cttgtagctg ccgatgtcca caggaagaag aaggaggagg aggaggctat 120

gagctg 126

<210> 18

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu

20 25 30

Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu

35 40

<210> 19

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agcaggagtg cagagactgc tgccaacctg caggacccca accagctcta caatgagctc 60

aatctagggc gaagagagga atatgacgtc ttggagaaga agcgggctcg ggatccagag 120

atgggaggca aacagcagag gaggaggaac ccccaggaag gcgtatacaa tgcactgcag 180

aaagacaaga tggcagaagc ctacagtgag atcggcacaa aaggcgagag gcggagaggc 240

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agcactgcca ccaaggacac ctatgatgcc 300

ctgcatatgc agaccctggc ccctcgc 327

<210> 20

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu

1 5 10 15

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu

20 25 30

Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg

35 40 45

Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met

50 55 60

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

65 70 75 80

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

85 90 95

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg

100 105

<210> 21

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

actactacca agccagtgct gcgaactccc tcacctgtgc accctaccgg gacatctcag 60

ccccagagac cagaagattg tcggccccgt ggctcagtga aggggaccgg attggacttc 120

gcctgtgata tttac 135

<210> 22

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro Thr

1 5 10 15

Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser

20 25 30

Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

35 40 45

<210> 23

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60

atcctgggga gt 72

<210> 24

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser

20

Claims

1.一种组合物，包括表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞和STING激动剂，其中所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述配体结合结构域结合CD19，所述STING激动剂选自c-AMP-GMP、 c-di-GMP、c-di-AMP、c-di-IMP、c-AMP-IMP、c-GMP-IMP、以及它们的硫取代衍生物或任何组合。

2.一种包含STING激动剂的组合物与包含表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞的组合物的组合，其中所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述配体结合结构域结合CD19，所述STING激动剂选自c-AMP-GMP、 c-di-GMP、c-di-AMP、c-di-IMP、c-AMP-IMP、c-GMP-IMP、以及它们的硫取代衍生物或任何组合。

3.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的组合，其中所述免疫细胞是T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。

4.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的组合，其中所述免疫细胞是CD4+/CD8+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞或αβ-T细胞。

5.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的组合，其中所述配体结合结构域选自scFv、Fab、单结构域抗体、纳米抗体、抗原结合配体、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN。

6.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的组合，其中所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。

7.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的组合，其中所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

8.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的组合，其中所述共刺激结构域是一个或多个选自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18（LFA-1）、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD276（B7-H3）、CD278(ICOS)、CD357（GITR）、DAP10、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。

9.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的组合，其中所述嵌合抗原受体包含：(a)4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，(b)CD27共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，(c)CD28共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，(d)OX40共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，(e)CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，(f)OX40共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，或(g)CD28共刺激结构域、OX40共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。

10.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的组合，其中所述工程化细胞还包含至少一种表达下调或失活的基因，其选自以下：CD52、GR、TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247ζ、HLA-I、HLA-II、B2M、dCK、PD1、CTLA-4、LAG3和TIM3。

11.STING激动剂和表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞在制备治疗癌症、感染或自身免疫疾病的药物中的用途，其中所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述配体结合结构域结合CD19，所述STING激动剂选自c-AMP-GMP、 c-di-GMP、c-di-AMP、c-di-IMP、c-AMP-IMP、c-GMP-IMP、以及它们的硫取代衍生物或任何组合。

12.权利要求11所述的用途，其中所述STING激动剂和所述表达嵌合抗原受体的工程化免疫细胞存在于相同或不同组合物中。