CN110691844A - 从多能干细胞产生模拟的先天免疫细胞的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

人多能干细胞(hPSC)，特别是诱导的多能干细胞(iPSC)提供有希望的起始材料以产生模拟的先天免疫细胞如自然杀伤(NK)细胞和γδT‑细胞用于癌症免疫疗法。为了促进持续的大规模生产，设计并证实了从hPSC制备模拟的先天免疫细胞的总体制备方案。特别地，建立了通过在M‑CSF表达缺陷的基质细胞系上造血分化和在M‑CSF表达缺陷且异位表达DLL1的基质细胞系上淋巴定型而不采用CD34+细胞富集和旋转拟胚体形成的使hPSC分化为NK细胞或γδT‑细胞的稳定方案。利用这种两阶段方案，证实从hPSC(包括hESC、外周血细胞衍生的iPSC(PBC‑iPSC)、非T细胞衍生的iPSC或γδT‑细胞衍生的iPSC)产生功能性模拟的NK细胞和功能性模拟的γδNKT‑细胞，以及这些模拟的先天免疫细胞在杀死癌细胞中的用途。

Description

从多能干细胞产生模拟的先天免疫细胞的方法和试剂盒
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月7日提交的新加坡申请第10201700937P号和2017年7月6日提交的新加坡申请第10201705582S号的优先权，其内容援引加入本文。
发明领域
本发明涉及产生先天免疫细胞，优选自然杀伤细胞或γδ T-细胞，的方法和试剂盒，在治疗中使用所述先天免疫细胞的方法以及产生诱导的多能干细胞的方法。
背景技术
在2015年，约9050万人患有癌症，并且每年有约1410万新病例发生(GBD 2015,Lancet.388(10053)1545-1602)。常用放射疗法、手术、化疗和/或靶向疗法的一些组合治疗癌症。虽然有许多治疗可用，但是每年有880万人死于癌症，并且对新的治疗有持续的需要。
利用先天免疫细胞的癌症免疫疗法是癌症治疗的新希望(Woo et al.Annualreview of immunology 33,445-474(2015))。包括自然杀伤(NK)细胞和γδ T细胞在内的这些先天免疫细胞可以通过主要组织相容性复合物(MHC)依赖性机制识别广泛的癌细胞(Scheper,et al.Leukemia 28,1181-1190(2014)。这个独特特征允许使用先天免疫细胞治疗许多受体中的癌症，没有常规的基于αβ T细胞策略的MHC-限制。目前，健康供体来源的血液细胞是产生大量的先天免疫细胞的常用的细胞来源(Kondo,et al.Cytotherapy 10,842-856(2008))。但是，由于使用可变和有限的起始材料以及复杂的物流，这些供体血液细胞依赖性平台对于集中化、标准化和大规模生产具有挑战性。
γδ T-细胞(γδ T细胞)是通过主要组织相容性复合物依赖性机制识别癌细胞的先天免疫细胞。这个特征允许使用供体来源的γδ T细胞治疗不同患者中的癌症。γδ T细胞占外周血淋巴细胞的1-10％。在这些循环γδ T细胞中，Vγ9Vδ2 T是主要子集，其通过它们的Vγ9Vδ2 T-细胞受体(TCR)与含磷抗原(phosphoantigen)反应，从而识别感染细胞或恶性细胞。在体内发育期间，TCRG和TCRD基因的体细胞重组是γδ T细胞获得它们的TCRγ链和δ链的早期关键步骤。为了从iPSC产生γδ T细胞，合乎逻辑的策略是在体外分化期间准确重述TCRG和TCRD基因的体细胞重组的这个过程以产生功能性γδ TCR。但是这样的策略对于目前的技术来说仍然非常困难。
自然杀伤细胞(NK细胞)是能够杀死广谱的恶性细胞和病毒感染细胞的先天免疫系统的淋巴细胞(Domogala,et al.Frontiers in immunology 6,264(2015))。NK细胞的靶标识别和激活取决于一系列激活受体和抑制受体，这不同于αβT细胞的MHC限制性αβ T-细胞受体(TCR)依赖性机制(Moretta,etal.Frontiers in immunology 5,87(2014))。因此，可以使用同种异体NK细胞治疗癌症，有较少机会引起移植物抗宿主疾病(GVHD)(Leung.Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research 20,3390-3400(2014).)。NK细胞独特的靶标识别机制显著扩展自体NK细胞以外的可以用于癌症的过继免疫疗法的潜在细胞来源。
在目前的临床试验中，需要5x106-5x107/kg体重的大剂量NK细胞(Lapteva etal.Critical reviews in oncogenesis 19,121-132(2014))。获得这样大量的同种异体NK细胞的一个典型方法是从大体积的供体外周血富集NK细胞。从供体来源的白细胞去除术产物开始，已建立不同方案以通过T细胞和B细胞的免疫磁性消耗以及CD56+细胞的选择来制备NK细胞(Koehl,et al.Frontiers in oncology 3,118(2013))。这类产物的纯度对于同种异体环境中的临床应用特别重要，其中残余的T细胞可以引起GVHD并阻止高剂量的输注。目前高纯度NK细胞产物的产生需要延长的过程，其不仅损害NK细胞的回收，而且还影响他们的活力和效力。回收率低，难以从单一白细胞去除术产物获得足够的NK细胞。产生NK细胞疗法的另一流行方法是NK细胞扩增，利用饲养细胞，如用膜结合分子如白介素(IL)-15和4-1BB配体(K562-mb15-41BBL)修饰的K562细胞(Fujisaki,et al.Cancer research 69,4010-4017(2009))。这些饲养细胞可以从外周血单个核细胞(PBMC)快速扩增NK细胞21.6-倍(Fujisaki,et al.)，或者从冻存的分离产物快速扩增NK细胞70-倍(Lapteva et al.)。这类NK细胞产物的纯度是约70％，此外，消耗伴随CD3+ T细胞的耗时的方法对于同种异体使用是必需的(Lapteva et al.)。上述两种方法对于从供体细胞产生NK细胞治疗物是可行的，但是像任何其他供体细胞依赖性制备方法一样，由于可变的起始材料，从各种供体的原代细胞产生NK细胞产物难以标准化。它需要特殊的技能和设施、复杂的物流以及高操作成本，因此不适合批量生产。
目前，健康供体来源的血液细胞是常用的细胞来源以产生大量的先天免疫细胞。但是，由于使用可变和有限的起始材料以及复杂的物流，这些供体血液细胞依赖性平台对于集中化、标准化和大规模生产具有挑战性。目前NK细胞生产策略面临的另一障碍是NK细胞表达称作杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的克隆分布的抑制性受体(Parham,2005Nat.Rev.Immunol.5,201–214)。每种单独的KIR识别称作KIR配体的特异性人白细胞抗原(HLA)I类分子，例如，KIR2DL1结合HLA-C2，KIR2DL2和KIR2DL3结合HLA-C1，KIR3DL1结合HLABw4，以及KIR3DL2结合HLA-A3和HLA-A11(Thielens et al.,2012Curr.Opin.Immunol.24,239–245.)。KIR配体结合至抑制性KIR抑制NK细胞的细胞毒性。为了减轻这种对NK细胞的抑制，从而增强它们对患者癌细胞的细胞毒性，为该特定患者精心选择NK细胞供体以在抗癌方向获得KIR-HLA不匹配是至关重要的(Thielens et al.,2012)。这个选择是基于供体KIR分型和受体HLA分型。如果供体中存在抑制性KIR但受体中不存在KIR配体，则供体是合适的(Leung,2014Clin.Cancer Res.20,3390–3400)。人免疫系统中包括两个高度多样化的基因家族KIR和HLA决定了目前供体细胞依赖性制备平台仅可以产生“定制的”NK细胞产物用于有限的患者，而不是“成品的”NK细胞产物用于广泛的患者。因此，探索规避上述这些问题的供选择的制备策略势在必行。
在多能性的阶段，人多能干细胞(hPSC)，特别是诱导的多能干细胞(iPSC)已成为可靠和可标准化的起始材料以产生免疫细胞样树突细胞(Zeng,et al.Journal ofimmunology 188,4297-4304(2012))以及NK细胞(Woll,et al.Blood 113,6094-6101(2009))。虽然已开发几个方案以从hPSC产生NK细胞，但是需要富集CD34+细胞(Woll,etal.Blood 113,6094-6101(2009))或旋转拟胚体(embryoid body，EB)形成(Knorr,D.A.etal.Stem cells translational medicine 2,274-283(2013))决定了这些现有方案是非常复杂和耗时的，因此更适合实验室使用而不是工业制备。此外，利用这些当前的方法，所得NK细胞表达高水平KIR(Knorr et al.,2013)，这限制它们应用于某些HLA分型的受体。到目前为止，尚未建立从各种hPSC来源持续产生NK细胞的稳定(robust)方案。
诱导hPSC的造血分化是从hPSC产生NK细胞的关键第一步。一种方法是将hPSC与骨髓基质细胞如S17和M2-10B4共培养以获得CD34+造血前体细胞(Woll,et al.Blood 113,6094-6101(2009))。但是，这种方法需要长达21天的漫长共培养以及随后在它们进一步分化为NK细胞之前分选CD34+细胞。这个分选步骤不仅使方案复杂化，而且还由于排除许多其他也具有NK细胞分化潜能的造血前体细胞而影响NK细胞产量。产生造血细胞的另一方法是形成EB(Tabatabaei-Zavareh,et al.PloS one 2,e232(2007))和最近地，旋转(spin)EB(Knorr,D.A.et al.Stem cells translational medicine 2,274-283(2013))。但是，这种随机分化方法是高度hPSC系依赖性的，因此对于各种hPSC来源来说不够稳定。此外，旋转EB形成需要先前耗时的hPSC适应TrypLE消化至少10代，这可能不适用于每个hPSC系。然后将这些TrypLE适应的hPSC以3,000个细胞/孔的密度接种于96-孔板中并离心下来用于旋转EB形成。这之后收获并以6个旋转EB/孔的密度将旋转EB接种于24-孔板中用于进一步的NK细胞分化。显然，这种劳动密集型和技能要求的旋转EB方法在商业生产中难以扩大规模。
与基质细胞共培养以促进造血祖细胞的进一步分化是从hPSC产生NK细胞的第二步。几种基质细胞系已用于共培养。虽然已证实基质细胞系如MS-5和AFT024支持NK细胞发育，但是所得细胞是包含CD56+和CD56-细胞的异质群体(Woll,et al.Blood 113,6094-6101(2009))。已显示基质细胞系EL08-1D2更好地支持NK细胞发育(McCullar,V.etal.Experimental hematology 36,598-608(2008))；但是，仅用分选的CD34+细胞或旋转EB证实了其效力(Woll,et al.Blood 113,6094-6101(2009))。
发明目的
本发明的一个目的是改善上述困难中的一些，优选通过利用可靠、无限制和可标准化的起始细胞来源的人多能干细胞如诱导的多能干细胞(iPSC)以产生模拟的(mimetic)先天免疫细胞用于免疫疗法治疗。
因此，本发明的第一方面包括一种产生模拟的先天免疫细胞的方法，所述方法包括：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞的祖细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将先天免疫细胞的祖细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代3-5周。
本发明的另一方面包括模拟的先天免疫细胞，其包含表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAILNKG2A/CD94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。
本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞用于治疗。
本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞用于治疗癌症。
本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞在制备治疗癌症的药物中的用途。
本发明的另一方面包括一种用于产生模拟的先天免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)人多能干细胞系；
(b)巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系；
(c)巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系；
(d)用于共培养人多能干细胞与M-CSF表达缺陷的基质细胞系的第一简单培养基；以及
(e)包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的第二培养基。
本发明的另一方面包括一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用模拟的先天免疫细胞，所述模拟的先天免疫细胞表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAILNKG2A/CD94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR，通过以下产生：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞的祖细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将先天免疫细胞的祖细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代3-5周。
本发明的另一方面包括一种从外周血细胞的非T细胞产生诱导的多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括：
(a)将重新编程转录因子并入非T细胞；
(b)使并入重新编程转录因子的非T细胞生长成为多能干细胞。
本发明的另一方面包括一种从γδ T细胞(γδ T细胞)产生诱导的多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括：
(a)将重新编程转录因子并入γδ T细胞；
(b)使并入重新编程转录因子的γδ T细胞生长成为多能干细胞。
本发明的另一方面包括诱导的多能干细胞(iPSC)，其包含以TCRG基因构型排列的TCR基因或以TCRD基因构型排列的TCR基因。
本发明的另一方面包括一种产生模拟的NK细胞的方法，所述方法包括：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生始发态的(primed)先天免疫细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将所述始发态的先天免疫细胞与M-CSF表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。
本发明的另一方面包括一种产生模拟的γδ T细胞的方法，所述方法包括：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生始发态的先天免疫细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将始发态的先天免疫细胞与M-CSF表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。
本发明的另一方面包括模拟NK细胞，其包含表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合的细胞，没有CD3表达且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR。
本发明的另一方面包括模拟γδ T细胞，其包含表达(a)CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合；(b)γδ TCR；以及(c)低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR的细胞。
当回顾本发明的具体实施方案的以下描述连同附图时，本发明的其他方面和特征对本领域技术人员会变得清楚。
附图说明
在仅通过实例的方式说明本发明的实施方案的图中：
图1：从hPSC产生NK细胞。(a):从hPSC衍生NK细胞的两阶段方案的示意图。(b-i):H1细胞分化为NK细胞期间的形态变化。相差图像显示：(b):未分化的H1细胞；(c):H1和OP9共培养第12天；(d):第一分化细胞和OP9-DLL1共培养第7天(第19天)；(e):第二分化细胞和OP9-DLL1共培养第7天(第26天)；(f-g):第三分化细胞和OP9-DLL1共培养第7天(第33天)；(h-i):第四分化细胞和OP9-DLL1共培养第7天(第40天)。(j-l):H1细胞分化为NK细胞期间的表型变化。流式细胞术分析显示(j):来自H1和OP9共培养第12天的CD34+细胞；(k-l):来自OP9-DLL1上的第三(d33)和第四(d40)共培养的CD56+CD45+细胞。
图2：从PBC衍生的iPSC产生NK细胞。(a)从PBC产生iPSC。PBC衍生的iPSC(PBC-iPSC)集落和扩增的iPSC的典型形态学和表型。相差图像显示第20天和第25天的PBC-iPSC集落以及第1代和第2代扩增的iPSC系。荧光图像显示PBC-iPSC系中SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和碱性磷酸酶的免疫染色。(b-e)从PBC-iPSC产生NK细胞。示出PBC-iPSC系PBC-iPSC#9分化为NK细胞期间的表型变化。流式细胞术分析显示分化过程中不存在TCRαβ表达。
图3：从GDT-iPSC产生γδ T细胞。利用图1a中建立的方案分化γδ T细胞衍生的iPSC系GDTA/NF-iPSC#1。(a-l):通过流式细胞术分析的在第33天和第47天来自GDTA/NF-iPSC#1系的分化的细胞的表型。(m):在第47天来自GDTA/NF-iPSC#1系的分化的细胞的形态学。分化非T细胞衍生的iPSC系GDTA/NF-iPSC#3作为对照。(n-q):通过流式细胞术分析的在第47天来自GDTA/NF-iPSC#3系的分化的细胞的表型。
图4：PBC-iPSC衍生的NK细胞的形态学和表型。(a-b):衍生自PBC-iPSC#9的NK细胞的形态学(a)和表型(b)。
图5：iPSC-γδ T细胞、PB-γδ T细胞和PB-NK细胞上激活分子和死亡诱导配体的表达。利用图1a中建立的方案从GDTA/NF-iPSC#1系产生iPSC-γδ T细胞。PB-γδ T细胞和PB-NK细胞扩增自健康供体的PBMC。通过流式细胞术分析iPSC-γδ T细胞(a)、扩增的PB-γδ T细胞(b)和扩增的PB-NK细胞(c)的表型。
图6：iPSC-γδ T细胞、PB-γδ T细胞和PB-NK细胞上抑制受体和KIR的表达。利用图1a中建立的方案从GDTA/NF-iPSC#1系产生iPSC-γδ T细胞。PB-γδ T细胞和PB-NK T细胞扩增自健康供体的PBMC。通过流式细胞术检测iPSC-γδ T细胞(a)、扩增的PB-γδ T细胞(b)和扩增的PB-NK细胞(c)上抑制受体和KIR的表达。
图7：PBC-iPSC衍生的NK细胞的功能。(a-b):通过ELISPOT测定检测的K562和Raji细胞刺激之后衍生自PBC-iPSC#9的NK细胞的IFN-γ分泌。示出ELISPOT图像(a)和斑点计数(b)。(c-d):通过ELISPOT测定检测的K562细胞刺激之后来自PBC-iPSC#9的NK细胞的GrB分泌。示出ELISPOT图像(c)和斑点计数(d)。(e-f):通过流式细胞术测量的衍生自PBC-iPSC#9的NK细胞对K562和Raji细胞的细胞毒性。示出代表性流式细胞术分析(e)和结果总结(f)。(g-h):通过流式细胞术测量的在抗CD20人源化抗体存在下NK细胞对Raji细胞的ADCC。示出代表性流式细胞术分析(g)和结果总结(h)。
图8：iPSC衍生的γδ NKT细胞对癌细胞的细胞毒性。γδ NKT细胞产生自GDTA/NF-iPSC#1系并用于对各种癌细胞系的细胞毒性试验：MCF7、SW480、BT474和SK-OV-3。
图9：外周血γδ T细胞的扩增。用Zometa和IL-2培养PBMC。(a):第1天和第7天PBMC培养物的形态学；(b):第7天PBMC培养物的表型。
图10：GDT-iPSC的产生。利用Sendai病毒载体或核转染将PBMC重新编程为iPSC。(a-f):培养的PBMC重新编程为iPSC期间的形态学变化。相差图像显示(a):通过Sendai病毒载体转导之后第6天存活的培养的PBMC；(b):接种转导细胞之后第17天在mEF上出现iPSC集落；(c):从mEF平板转移之后粘附至Matrigel包被平板的iPSC集落；(d-f):建立通过核转染产生的3个iPSC系。(g):TCRG基因克隆性测定以鉴定γδ T细胞衍生的iPSC系。箭头表示检测GDTA/NF-iPSC#1系中的重排TCRG基因。(h):通过流式细胞术检测3个建立的iPSC系中的CD3和γδ TCR表达。
图11：新鲜和冻存的PBC-iPSC衍生的NK细胞的扩增。(a-b):用不同NK细胞数量开始通过G-Rex10中的K562-mb15-41BBL扩增新鲜的衍生自PBC-iPSC#9的NK细胞。示出14-天扩增期间NK细胞的绝对数量(a)和倍数变化(b)。(c-d):通过流式细胞术测量的14-天扩增之后新鲜NK细胞的表型(c)和对K562的细胞毒性(d)。(e):冻/融过程之后扩增的NK细胞的生存力。(f):冻存NK细胞的扩增。(g):扩增之后冻存NK细胞对K562的细胞毒性。
发明详述
尚未建立从各种hPSC来源持续产生先天免疫细胞的稳定方案。在这方面，已设计大规模生产功能性NK细胞的制备方案，并且证实不仅来自经典hPSC来源，人胚胎干细胞(hESC)，而且还来自方便的hPSC来源，外周血细胞(PBC)衍生的iPSC(PBC-iPSC)，不采用CD34+细胞富集或旋转EB形成。
人多能干细胞(hPSC)，特别是诱导的多能干细胞(iPSC)提供有希望的起始材料以产生模拟的先天免疫细胞如模拟的自然杀伤(NK)细胞和模拟的γδT-细胞用于癌症免疫疗法。为了促进持续的大规模生产，设计并证实了从人多能干细胞(hPSC)制备模拟的先天免疫细胞的总体制备方案。特别地，通过OP9细胞上的顺序造血分化和OP9-DLL1细胞上的淋巴定型(lymphoidcommitment)而不采用CD34+细胞富集和旋转拟胚体形成使hPSC分化为模拟的NK细胞或具有NK特性的模拟的γδ T-细胞的稳定方案。
因此，本发明的第一方面包括一种产生模拟的先天免疫细胞的方法，所述方法包括：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷的基质细胞系共培养以产生始发态的先天免疫细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将始发态的先天免疫细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。
在利用这个方案的各种实施方案中，产生功能性模拟的NK细胞和具有NK特性的模拟的γδ T-细胞。
如本文所用，术语“模拟的先天免疫细胞”是指衍生自多能干细胞且具有一些与它们模拟的先天免疫细胞相似的特征和一些与它们模拟的先天免疫细胞不同的特征的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞称作iPSC衍生的NK细胞。例如，在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞如PBC-iPSC衍生的NK细胞或iPSC衍生的γδ NKT细胞具有NK细胞的特征如表达NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL和/或NKG2A/CD94，但是还有天然存在的NK细胞或γδ T细胞中不存在的新特征如没有或低表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞如PBC-iPSC衍生的NK细胞具有NK细胞的特征，如表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合。这些特征具有识别广谱癌细胞的优点。在这个实施方案中，所述细胞还具有新特征，如没有或低表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。在各种其他实施方案中，除了具有PBC-iPSC衍生的NK细胞中存在的上述特征中的任一种，模拟的先天免疫细胞如iPSC衍生的γδ NKT细胞表达可以识别含磷抗原的γδ TCR。在各种实施方案中，低KIR是指少于20％表达的KIR；或者少于10％表达的KIR；或者少于5％表达的KIR。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞具有5％或更少表达的KIR2DL1。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞具有13％或更少表达的KIR3DL1。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞具有7％或更少表达的KIR3DL1。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞具有18％或更少表达的KIR2DL2。KIR-阴性或KIR-低表达的模拟的先天免疫细胞具有优点，其可以服务广泛的受体而不管他们的HLA基因型。有趣的是，用自体PBC-iPSC系开始，可能产生自体KIR-阴性或KIR-低表达模拟的先天免疫细胞来源在自体环境下使用而不用担心自身HLA分子抑制。免疫排斥的风险减少，这些模拟的先天免疫细胞如自体PBC-iPSC-NK细胞可以存活更长，因此提供延长的抗肿瘤活性。
在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞如iPSC衍生的γδ NKT细胞具有NK细胞的特征如表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合，以及新特征如没有或低表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，还有γδ T细胞的特征如CD3+和/或γδ T细胞受体如Vγ9Vδ2(Vγ9Vδ2)。
巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系可以具有不表达或表达非功能性突变体的缺陷基因或者可以利用任何已知方法如反义、siRNA、shRNA或本领域已知敲减蛋白表达的任何其他方法将其敲减。在各种实施方案中，M-CSF表达缺陷的基质细胞系可以是间充质干细胞如骨髓间充质干细胞。在各种实施方案中，M-CSF表达缺陷的基质细胞系可以是OP9细胞。在各种实施方案中，M-CSF功能性cDNA由核酸序列SEQ IDNO.2表示，而功能性M-CSF蛋白由氨基酸序列SEQ ID NO.3表示。导致功能失调的M-CSF的这些序列的任何突变将会是足够的。
在开发工业相容的分化方案的各种实施方案中，已证实通过与经典的M-CSF缺陷的基质细胞系OP9共培养，一贯可以在12天中实现hESC和PBC-iPSC的高效造血分化，这显著短于使用其他基质细胞系。收获的造血细胞可以直接用于NK细胞生成而不用分选CD34+细胞。因此，利用OP9诱导造血分化可以通过避免CD34+细胞分选和EB形成显著简化制备过程。在各种实施方案中，先天免疫细胞的祖细胞包含造血细胞。
巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系可以是如上文讨论的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系，其工程化以外源或异常表达DLL1。本领域已知在M-CSF表达缺陷的基质细胞系中人工引起DLL1表达的任何方法会是合适的。在各种实施方案中，异位表达DLL1的M-CSF表达缺陷的基质细胞系可以是用DLL1转导的间充质干细胞如骨髓间充质干细胞。在各种实施方案中，异位表达DLL1的M-CSF表达缺陷的基质细胞系可以是OP9DLL1细胞。在各种实施方案中，DLL1cDNA由核酸序列SEQ ID NO.4表示，而Dll1蛋白由氨基酸序列SEQ ID NO.5表示。导致功能性DLL1的序列的功能性变异是足够的。
在为NK细胞发育提供稳定环境的各种实施方案中，使用以DLL1和NK细胞促进细胞因子组合修饰的OP9细胞系，所述组合包括SCF、FLT3L、IL-7和IL-15。利用这样的方法，收获自hPSC/OP9共培养物的异质造血细胞可以直接用于NK细胞产生，并且终产物是具有超过99％CD56+CD45+NK细胞的均质淋巴群体。这种方法的稳定性(robustness)可能是由于Notch信号传导途径的激活，其在先天淋巴样细胞的发育中起重要作用。这种分化方法不需要细胞分选、EB形成、旋转EB形成、T或B细胞去除或者NK细胞富集。
不受任何理论限制，假设步骤(a)中巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的缺陷使细胞继续分化为造血细胞，步骤(b)中巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的缺陷和培养基中DLL1表达的组合刺激淋巴定型，并且一个接一个使用的两种不同类型基质细胞的此两个阶段流程组合导致具有独特特征的模拟的先天免疫细胞。在各种实施方案中，所述流程促进NK细胞特征的表达如CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL NKG2A/CD94或其组合的表达以及NK细胞不常见的其他特征如没有或低表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。
在各种实施方案中，步骤(b)中使用的培养基也起到重要作用，并且在各种实施方案中，所述培养基包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)。在各种实施方案中，所述培养基包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素15(IL15)。在各种其他实施方案中，所述培养基包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和白介素15(IL15)。同时全部3种组合均能够产生具有独特特征的模拟的先天免疫细胞。令人惊讶的是，单独使用白介素15(IL15)或与白介素7(IL7)组合显著增加产生的模拟的先天免疫细胞百分比，虽然单独使用白介素7(IL7)仍成功产生具有独特特征的模拟的先天免疫细胞。本领域已知的其他淋巴细胞培养基也可以用作基础培养基。
如本文所用，术语“传代(passage)”、“传代(passaging)”或“传代(passaged)”是指将一些或全部细胞传代培养至新鲜培养基中。这可以包括本领域通常知道或使用的任何方法。在各种实施方案中，共培养每7天之后将分化的模拟的先天免疫细胞传代，传代3次，并且在21天之后，优选至33天收获最终模拟的先天免疫细胞。在各种实施方案中，共培养每7天之后将分化的模拟的先天免疫细胞传代，传代4次，并且在28天之后，优选至40天收获最终模拟的先天免疫细胞。在各种实施方案中，共培养每7天之后将分化的模拟的先天免疫细胞传代，传代5次，并且在35天之后，优选至47天收获最终模拟的先天免疫细胞。
在各种实施方案中，将步骤(a)中的人多能干细胞与M-CSF表达缺陷的基质细胞系共培养12天。在各种实施方案中，将步骤(a)中的人多能干细胞在包含α最小必需培养基(αMEM)和胎牛血清(FBS)的简单培养基中共培养，并且每3-4天更换一半简单培养基对共培养物进行补料。还可以使用本领域已知的其他干细胞分化培养基。
在各种实施方案中，步骤(b)中使用的培养基进一步包含胎牛血清(FBS)；α最小必需培养基(αMEM)；或者其组合。
在各种实施方案中，人多能干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。hESC在安全方面是个好选择，但是hESC的衍生通常在伦理上是有争议的，并且hESC衍生物的应用仅限于同种异体环境。
在各种实施方案中，人多能干细胞诱导自外周血细胞(PBC(iPSC))。使用iPSC的优点是，它们可以产生自可靠、无限制和可标准化的起始细胞来源如分离自供体或患者的外周血单个核细胞(PBMC)，允许iPSC衍生物用于自体和同种异体应用，并且其还没有任何使用hESC的伦理问题。
目前，大部分iPSC是通过重新编程成年体细胞产生的。起始体细胞的选择不仅会影响重新编程的效率和动力学，而且还会影响产生GMP-级iPSC的实用性。虽然成纤维细胞是最常用的体细胞，但是它们不是非常符合GMP。通过钻取活组织检查采集皮肤样品是侵入性的，并且从皮肤活组织检查样品生长成纤维细胞是耗时的(长达3周)。在GMP下成纤维细胞的衍生本身已经是一项艰巨的任务。相比之下，利用PBC产生iPSC是更实际的选择，因为外周血采集方便，并且从外周血样品分离单个核细胞只需15分钟。在样品采集、运输和加工中容易实现GMP使得PBC成为吸引人的iPSC衍生的起始材料。更重要的是，利用两阶段分化方案，第一次证实从PBC衍生的iPSC产生高纯度、功能性和可扩增的模拟的先天免疫细胞如NK细胞。
在各种实施方案中，将重新编程转录因子并入外周血细胞并生长以产生诱导的多能干细胞(iPSC)。
在各种实施方案中，重新编程转录因子包括传统的Yamanaka转录因子Oct 4、Sox2、Klf4和c-myc。在各种其他实施方案中，重新编程转录因子可以是Oct 3/4和Sox家族的成员，包括Sox 1、Sox 2、Sox 3或Sox 15中的任一种。或者，在各种其他实施方案中，重新编程转录因子可以是Oct 3/4；转录因子的Sox家族的成员，包括Sox 1、Sox 2、Sox 3或Sox15中的任一种；NANOG和LIN28。或者，在各种其他实施方案中，重新编程转录因子可以是Oct3/4；转录因子的Sox家族的成员，包括Sox 1、Sox 2、Sox3或Sox 15中的任一种；转录因子的Klf家族的成员，包括Klf1、Klf 2、Klf4或Klf5，以及转录因子的Myc家族的成员，包括c-myc、L-myc或N-myc。或者，在各种其他实施方案中，重新编程转录因子可以是Oct 3/4；转录因子的Sox家族的成员，包括Sox 1、Sox 2、Sox 3或Sox 15中的任一种；转录因子的Klf家族的成员，包括Klf1、Klf 2、Klf4或Klf5，以及Glis1，或者本领域已知从分化的成年细胞开始有效产生表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA-3和SSEA-4)和/或TRA-1-60、TRA-1-81抗体识别的表位的多能细胞的任何重新编程转录因子。
在各种实施方案中，可以通过逆转录病毒转导将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过慢病毒表达系统将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以利用单盒重新编程载体将重新编程转录因子并入外周血，在所述载体中每个重新编程因子通过自我切割肽信号如STEMCCA分开。在各种实施方案中，可以通过腺病毒表达系统将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过仙台病毒表达系统将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过蛋白扩散入细胞将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过mRNA转染将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过miRNA感染或转染将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过利用转座子系统的PiggyBac系统将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过仅含有真核启动子和待表达的cDNA的小环载体将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过游离型质粒中重现编程因子的瞬时表达或本领域已知将重新编程转录因子递送至外周血细胞中的任何其他方法将重新编程转录因子并入外周血细胞，以便高效产生诱导的多能干细胞(iPSC)。
在各种实施方案中，所述方法进一步包括在将重新编程转录因子并入外周血细胞以产生诱导的多能干细胞(iPSC)之前在氨基-双膦酸(amino-bisphosphonate)和白介素2(IL2)的存在下扩增外周血细胞。
在各种实施方案中，氨基-双膦酸和白介素2(IL2)一般用来诱导γδ T细胞的扩增，所述γδ T细胞被发现表达Vγ9Vδ2 T细胞。不受任何理论限制，假设因为Vγ9Vδ2 T细胞与含磷抗原反应，所以氨基-双膦酸刺激这类Vγ9Vδ2 T细胞的形成。
在各种实施方案中，氨基-双膦酸是唑来膦酸(zoledronate)或唑来膦酸(zoledronic acid)或其商业上称为Zometa的盐。优选地，因为唑来膦酸在商业上可容易获得，但是任何氨基-双膦酸会是合适的。唑来膦酸(zoledronate)如下式。
Figure BDA0002220454290000151
在各种实施方案中，iPSC包含以TCRG基因构型排列的TCR基因。在各种实施方案中，TCRG基因构型包含TCR体细胞重组为TCRG，并且还可以包括TCRD基因构型，所述TCRD基因构型包含TCR体细胞重组为TCRD。在各种实施方案中，TCRG基因构型由核酸序列SEQ IDNO.1表示，还会包括导致表达功能性TCRγ的序列的功能性变异。在各种实施方案中，iPSC包含以TCRD基因构型排列的TCR基因。在各种实施方案中，TCRD基因构型包含TCR体细胞重组为TCRD，导致表达功能性TCRδ的任何已知TCRD序列会是合适的。
如本文所用，以TCRG基因构型排列的TCR基因包含核酸分子，所述分子通常编码γTCR多肽、等位变体或类似物，包括它们的片段。具体提供用于筛选TCRG基因构型的DNA分子和用于保证γTCR多肽表达的DNA分子，选自：(a)SEQ ID NO:1中示出的DNA分子，或其片段；(b)与(a)中定义的DNA分子杂交的DNA分子或其可杂交片段；以及(c)编码任何前述DNA分子编码的氨基酸序列表达的DNA分子。
如果在其天然状态下或通过本领域技术人员公知的方法操纵时，其可以转录和/或翻译以产生mRNA和/或多肽或其片段，则说多核苷酸“编码”多肽。反义链是这样的核酸的互补体，并且编码序列可以由其推断。
“TCRG基因序列”、“TCRG基因”、“TCRG核酸”或“TCRG多核苷酸”每个是指可能在正常T-细胞中表达的多核苷酸，包括能够表达功能性γTCR多肽的TCRG基因序列的突变。
TCRG基因序列意在包括编码序列、间隔序列以及控制转录和/或翻译的调节元件。TCRG基因序列意在包括能够表达γTCR多肽的DNA序列的所有等位变异。
如果在与其他核酸(或其互补链)最佳比对(有适当核苷酸插入或缺失)时，在核苷酸碱基的至少约60％，通常至少约70％，更通常至少约80％，优选至少约90％，并且更优选核苷酸碱基的至少约95-98％有核苷酸序列相同性，则核酸或其片段与另一核酸或其片段“基本上同源”(“或基本上相似”)。
其他优选多核苷酸包含与编码γTCR的氨基酸的SEQ ID NO:1的序列具有大于40、50、60或70％相同性，更优选大于80、90、95或97％相同性的连续序列。
TCRG基因构型的检测可以按照本领域已知的方法进行，包括诸如Southern印迹杂交、聚合酶链反应的技术，或者可以使用其他合适的方法。
在各种实施方案中，本发明具有第一次证实利用γδ T细胞衍生的iPSC产生γδ T细胞的优点。得到了从γδ T细胞衍生iPSC并利用这些iPSC产生γδ T细胞和新免疫细胞类型γδ自然杀伤细胞T细胞的工业相容性生产方案和方法。
在各种实施方案中，所述方法进一步包括在包含干细胞因子(SCF)；胎牛血清(FBS)；Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素15(IL15)和白介素7(IL7)的培养基中在饲养细胞的存在下扩增模拟的先天免疫细胞。
在各种实施方案中，所述饲养细胞是能够扩增NK细胞的经辐照的细胞系。在各种实施方案中，所述饲养细胞是经γ辐照的K562-mbIL15-41BBL。
在各种实施方案中，利用饲养细胞系，PBC-iPSC衍生的模拟的NK细胞可以在9天中扩增74-倍，以及在冻存之后扩增38.5-倍。如增加的对K562细胞的细胞毒性所示，这些扩增的模拟NK细胞在功能上变得更有效。从新鲜和冷冻PBC产生iPSC的可能性为GMP生产提供更大的灵活性。为此，在这个研究中证实从冷冻PBC衍生iPSC的可行性。
本发明的另一方面包括模拟的先天免疫细胞，其包含表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。任选地，这些模拟的先天免疫细胞是有或无γδ TCR表达的细胞。
在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达CD56且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达CD16且如上文所述低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达NKp30且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达NKp44且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达NKp46且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达NKG2D且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达DNAM-1且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达FASL且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达TRAIL且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达NKG2A/CD94且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中任2种、或任3种、或任4种、或任5种、或任6种、或任7种、或任8种、或任9种、或全部的组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。
在各种实施方案中，可以通过本领域已知用于测量蛋白表达的任何方法确定细胞表达谱。例如色谱法如HPLC、LCMS，或者聚丙烯酰胺凝胶电泳。或者抗体法，其中将杂交至蛋白的抗体标记用于检测，如ELISA、流式细胞术、蛋白免疫沉淀、免疫-电泳或蛋白印迹。在各种实施方案中，具有缀合标签如颜色标签、磁性标签、荧光标签、放射性标签、有已知特性的蛋白标签的抗体能够杂交至以下蛋白序列中任一种的部分：氨基酸序列SEQ ID NO:6表示的CD56、氨基酸序列SEQ ID NO:7表示的CD16、氨基酸序列SEQ ID NO:8表示的NKp30、氨基酸序列SEQ ID NO:9表示的NKp44、氨基酸序列SEQ ID NO:10表示的NKp46、氨基酸序列SEQID NO:11表示的NKG2D、氨基酸序列SEQ ID NO:12表示的DNAM-1、氨基酸序列SEQ ID NO:13表示的FASL、氨基酸序列SEQ ID NO:14表示的TRAIL或氨基酸序列SEQ ID NO:15表示的NKG2A/CD94。
在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞是有或无γδ TCR表达的细胞。
在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞如本文所述。
在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞进一步包含CD3+表达，一些T-细胞的特征。
在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞进一步包含γδ TCR表达，γ/δT-细胞的特征。
在各种实施方案中，γδ TCR包含Vγ9Vδ2(Vγ9Vδ2)。
在各种实施方案中，该技术已证实从iPSC产生γδ T细胞和新免疫细胞类型–γδ自然杀伤T细胞的最好方法。
在开发γδ T细胞成为无限的“常备”产品的各种实施方案中，第一次证实从诱导的多能干细胞(iPSC)产生γδ T细胞。用γδ T细胞富集的血细胞培养物开始，产生iPSC系并鉴定为衍生自γδ T细胞的那些。在利用这些γδ T细胞衍生的iPSC(GDT-iPSC)的各种实施方案中，产生γδ T细胞，其是γδ TCR+CD3+和Vγ9Vδ2+。此外，通过用本文公开的从iPSC产生NK细胞的方案分化GDT-iPSC，产生的γδ T细胞，产生的γδ T细胞进一步装备有NK细胞的许多“抗癌”分子，其包括激活受体、天然细胞毒性受体和死亡诱导分子。因此，配备γδT细胞和NK细胞的抗癌特征，这些新的iPSC衍生的“γδ自然杀伤T细胞”具有很强的治疗活性以靶向广泛的癌细胞。
本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞用于治疗。
在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞可以适合治疗病毒感染、细菌感染、真菌感染、任何其他感染或癌症。
本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞用于治疗癌症。
在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞可以适合治疗癌症，包括肉瘤、癌(carcinoma)和淋巴瘤、白血病、乳腺癌、结肠直肠癌或卵巢癌。
在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞可以适合治疗实体瘤癌症。在各种实施方案中，实体瘤包括肉瘤、癌或淋巴瘤。
在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞可以适合治疗乳腺腺癌、结肠直肠腺癌、乳腺导管癌、卵巢腺癌、乳腺导管癌、卵巢腺癌或白血病。
在各种实施方案中，白血病包括慢性髓性白血病或伯基特淋巴瘤。
在各种实施方案中，显示模拟的先天免疫细胞对癌细胞有毒性，如人髓性白血病细胞、乳腺腺癌细胞、结肠直肠腺癌细胞、乳腺导管癌细胞和卵巢腺癌细胞。
本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞在制备治疗癌症的药物中的用途。
在各种实施方案中，所述癌症是实体瘤癌症或白血病。
在各种实施方案中，实体瘤癌症包括乳腺腺癌、结肠直肠腺癌、乳腺导管癌或卵巢腺癌。在各种实施方案中，白血病包括急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病或慢性髓性白血病。
在各种实施方案中，癌症包括肉瘤、癌、淋巴瘤、白血病、乳腺癌、结肠直肠癌或卵巢癌。
显示模拟的先天免疫细胞对癌细胞有毒性，如人髓性白血病细胞、乳腺腺癌细胞、结肠直肠腺癌细胞、乳腺导管癌细胞和卵巢腺癌细胞。
本发明的另一方面包括一种用于产生模拟的先天免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)人多能干细胞系；
(b)巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系；
(c)巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系；
(d)用于共培养人多能干细胞与M-CSF表达缺陷的基质细胞系的第一简单培养基；以及
(e)包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的第二培养基。
在各种实施方案中，人多能干细胞系可以包括人胚胎干细胞(hESC)。在各种其他实施方案中，人多能干细胞系可以包括外周血细胞衍生的iPSC系，其可以是非T细胞衍生的iPSC系或γδ T细胞衍生的iPSC系。
巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系以及巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达Notch配体δ1(DLL1)的基质细胞系如上文所述。
在各种实施方案中，第一简单培养基包含α最小必需培养基(αMEM)或其他干细胞分化培养基以及胎牛血清(FBS)。
在各种实施方案中，第二培养基包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)。在各种实施方案中，所述培养基包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素15(IL15)。在各种其他实施方案中，所述培养基包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和白介素15(IL15)。同时全部3种组合均能够产生具有独特特征的模拟的先天免疫细胞。令人惊讶的是，单独使用白介素15(IL15)或与白介素7(IL7)组合显著增加产生的模拟的先天免疫细胞百分比和/或量，虽然单独使用白介素7(IL7)仍成功产生具有独特特征的模拟的先天免疫细胞。
在各种实施方案中，第二培养基进一步包含胎牛血清(FBS)；α最小必需培养基(αMEM)或其他淋巴细胞培养基；或者其组合。
在各种实施方案中，所述试剂盒进一步包含氨基-双膦酸和白介素2(IL2)。在各种实施方案中，氨基-双膦酸是唑来膦酸或其盐。
本发明的另一方面包括一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：给所述患者施用模拟的先天免疫细胞，所述模拟的先天免疫细胞表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAILNKG2A/CD94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR，所述模拟的先天免疫细胞通过以下产生：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞的祖细胞；
(b)在包含Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将先天免疫细胞的祖细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。
在各种实施方案中，所述癌症是如本文所述的实体瘤癌症。在各种实施方案中，所述癌症是如本文所述的白血病。
在各种实施方案中，实体瘤癌症包括乳腺腺癌、结肠直肠腺癌、乳腺导管癌或卵巢腺癌。在各种实施方案中，白血病包括急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病或慢性髓性白血病。
本发明的另一方面包括一种从外周血单个核细胞产生诱导的多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括：
(a)将重新编程转录因子并入外周血单个核细胞；
(b)使并入重新编程转录因子的外周血单个核细胞生长为多能干细胞。
在各种实施方案中，单个核外周血细胞是γδ T细胞。这是从γδ T-细胞产生iPSC的第一证明。在各种其他实施方案中，单个核外周血细胞是外周血细胞的非T细胞。
在各种实施方案中，所述方法进一步包括在将重新编程转录因子并入γδ T-细胞之前在氨基-双膦酸和白介素2(IL2)的存在下扩增外周血细胞。
在各种实施方案中，氨基-双膦酸是唑来膦酸或其盐。
在各种实施方案中，iPSC包含以TCRG基因构型排列的TCR基因或以TCRD基因构型排列的TCR基因。在各种实施方案中，TCRG基因构型由核酸序列SEQ ID NO.1表示。导致表达功能性TCRγ的序列的功能性变异也是足够的。在各种实施方案中，TCRD基因构型包含TCR体细胞重组为TCRD，导致表达功能性TCRδ的任何已知TCRD序列会是合适的。
本发明的另一方面包括诱导的多能干细胞(iPSC)，其包含以TCRG基因构型排列的TCR基因或以TCRD基因构型排列的TCR基因。
在各种实施方案中，重排的TCRG基因由核酸序列SEQ ID NO.1表示。导致表达功能性TCRγ的序列的功能性变异是足够的。在各种实施方案中，TCRD基因构型包含TCR体细胞重组为TCRD，导致表达功能性TCRδ的任何已知TCRD序列会是合适的。
本发明的另一方面包括一种产生模拟的NK细胞的方法，所述方法包括：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞的祖细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将先天免疫细胞的祖细胞与M-CSF表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。
本发明的另一方面包括一种产生模拟的γδ T细胞的方法，所述方法包括：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生始发态的先天免疫细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将始发态的先天免疫细胞与M-CSF表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。
本发明的另一方面包括模拟的NK细胞，其包含表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR的细胞。
在各种实施方案中，模拟的NK细胞包含不表达CD3或不表达γδ TCR的细胞。
本发明的另一方面包括模拟的γδ T-细胞，其包含表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR的细胞。
在各种实施方案中，模拟的γδ T-细胞是有γδ TCR表达或CD3表达的细胞。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本文主题所属的技术人员通常理解的相同的含义。如本文所用，提供以下定义以促进本发明的理解。
在整个文件中，除非另有与此相反的陈述，否则术语“包含”、“由...组成”、“具有”等应当理解为非穷举的，或者换句话说，表示“包括但不限于”。
此外，在整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括(include)”或变化如“包括(includes)”或“包括(including)”理解为表示包括所述整数或整数的组但不排除任何其他整数或整数的组。
除非上下文另有明确指定，如说明书和所附权利要求书所用，单数形式“一个”和“所述”包括复数指代。
实施例
描述的是从hPSC大规模生产先天免疫细胞的总体方案。与现有方案相比，所述方法更符合工业要求，并且提供生产NK细胞治疗剂所需的便利：(1)起始材料PBC-iPSC是方便、高度易用和GMP相容的hPSC来源；(2)通过排除细胞分选、EB形成和旋转EB形成简化分化过程；(3)产生的PBC-iPSC衍生的细胞已是高纯度和功能性群体，避免需要T-细胞和B-细胞消耗或者先天免疫细胞富集；(4)新鲜和冻存的NK细胞可以在短时间内扩增，这简化了NK细胞治疗剂的运输和制备物流；(5)扩增之后可以实现进一步功能成熟；(6)大部分PBC-iPSC衍生的先天免疫细胞是KIR-阴性的，这意味着这些先天免疫细胞可以用作通用的细胞来源用于各种受体而不担心可能减少细胞毒性的抑制性信号传导。因此，利用PBC-iPSC衍生先天免疫细胞是适合大规模生产先天免疫细胞治疗剂的平台。
模拟的先天免疫细胞的产生
尚未建立从各种hPSC来源持续产生先天免疫细胞的稳定方案。在这方面，已设计大规模生产功能性NK细胞的制备方案，并且证实不仅来自经典hPSC来源，人胚胎干细胞(hESC)，而且还来自方便的hPSC来源，外周血细胞(PBC)衍生的iPSC(PBC-iPSC)，不采用CD34+细胞富集或旋转EB形成。
从hESC产生NK细胞。
细胞培养.在Matrigel(BD Biosciences,San Diego,CA,http://www.bdbiosciences.com)包被的6-孔板上用mTeSR1(StemCell Technologies,Vancouver,BC,Canada,http://www.stemcell.com)培养hPSC系H1(WiCell Research Institute,Madison,WI,http://www.wicell.org)。用补充了20％胎牛血清(FBS)(HyClone,Logan,UT,http://www.hyclone.com)的α-MEM(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,http://corporate.thermofisher.com)培养OP9细胞(American Type Culture Collection[ATTC],Manassas,VA,http://www.atcc.org)和OP9/G-DLL1细胞(Riken BRC Cell Bank,Ibaraki,Japan,http://cell.brc.riken.jp/en/)。
两阶段方案.在第一阶段，将OP9细胞接种在0.1％明胶(StemCell Technologies)包被的T75瓶上。当长满(confluence)时，通过更换一半培养基对OP9细胞培养物进行补料并过度生长(overgrown)4-6天。然后在补充了10％FBS的α-MEM中于过度生长的OP9细胞上接种1-1.5x106个hESC并分化12天。每4天通过更换一半培养基对hESC/OP9共培养物进行补料。在第二阶段，利用1mg/ml胶原酶IV(StemCell Technologies)和TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific)从hESC/OP9共培养物收获分化的细胞。通过塑料粘附45分钟去除OP9细胞，并且通过100μm细胞过滤器(BD Biosciences)进一步去除细胞丛。然后利用包含10％FBS、10ng/ml SCF(PeproTech,Rocky Hill,NJ,http://www.peprotech.com)、5ng/ml FLT3L(PeproTech)以及5ng/ml IL-7(PeproTech)和/或10ng/ml IL-15(PeproTech)的α-MEM，将剩余的非粘附细胞与T75瓶上生长的OP9-DLL1共培养7天。此后，每周利用Versene(Thermo Fisher Scientific)收获分化的细胞并且在6-孔板上生长的新的OP9-DLL1上共培养，进行额外的3-4周。
为了建立从hPSC衍生NK细胞的稳定的两阶段方案(图1a)，使用广泛使用的hESC系H1(图1b)。在第一阶段，为了诱导造血分化，将H1细胞与过度生长的OP9细胞(骨髓基质细胞系)共培养。在共培养的第12天，始终观察到许多分化的集落(图1c)和CD34+细胞的小群体(图1j)。在第二阶段，为了诱导淋巴定型，每周收获这些分化的细胞并且在干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)和IL-7的存在下与Notch配体δ样-1(DLL1)修饰的OP9细胞系OP9-DLL1共培养。与OP9-DLL1第一次共培养之后7天(第19天)，大部分分化的细胞仍作为粘附细胞生长(图1d)；第二次共培养之后(第26天)，一些明亮的圆形且半粘附的细胞开始出现(pop out)(图1e)；第三次共培养之后(第33天)，这些细胞脱离并在孔的中央聚集(图1f,g)；第四次共培养之后(第40天)，更多悬浮细胞出现(图1h,i)。形态上，这些悬浮细胞是小的、圆形和明亮的淋巴样细胞(图1g,i)；表型上，它们是散点图上的定义群体(图1k,l)；它们中的大部分是CD45+CD56+，但是CD3-TCRαβ-CD4-CD8-(图1k,l)，这是NK细胞典型的。因此，通过经历造血分化和淋巴定型，NK细胞可以衍生自hESC而不用富集CD34+细胞或形成旋转EB。
从iPSC产生NK细胞。
细胞培养.用补充了20％胎牛血清(FBS)(HyClone,Logan,UT,http://www.hyclone.com)的α-MEM(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,http://corporate.thermofisher.com)培养OP9细胞(American Type Culture Collection[ATTC],Manassas,VA,http://www.atcc.org)和OP9/G-DLL1细胞(Riken BRC Cell Bank,Ibaraki,Japan,http://cell.brc.riken.jp/en/)。
两阶段方案.在第一阶段，将OP9细胞接种在0.1％明胶(StemCell Technologies)包被的T75瓶上。当长满时，通过更换一半培养基对OP9细胞培养物进行补料并过度生长4-6天。然后在补充了10％FBS的α-MEM中于过度生长的OP9细胞上接种1-1.5x106个hESC并分化12天。每4天通过更换一半培养基对hESC/OP9共培养物进行补料。在第二阶段，利用1mg/ml胶原酶IV(StemCell Technologies)和TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific)从hESC/OP9共培养物收获分化的细胞。通过塑料粘附45分钟去除OP9细胞，并且通过100μm细胞过滤器(BD Biosciences)进一步去除细胞丛。然后利用包含10％FBS、10ng/ml SCF(PeproTech,Rocky Hill,NJ,http://www.peprotech.com)、5ng/ml FLT3L(PeproTech)连同5ng/ml IL-7(PeproTech)和/或10ng/ml IL-15(PeproTech)的α-MEM，将剩余的非粘附细胞与T75瓶上生长的OP9-DLL1共培养7天。此后，每周利用Versene(Thermo FisherScientific)收获分化的细胞并且在6-孔板上生长的新OP9-DLL1上共培养，进行额外的3-4周。
从PBC-iPSC产生NK细胞.为了进一步促进在良好生产规范(GMP)下从hPSC产生NK细胞，重要的是用GMP相容的方便的hPSC来源。虽然hESC和产生自成纤维细胞或脐带血CD34+细胞的iPSC已用来衍生NK细胞，但是产生自外周血细胞的iPSC(PBC-iPSC)是一种新的、从制备角度来看更易接近和可行的选择。为了证实PBC-iPSC用于NK细胞产生的可行性，首先利用携带重新编程因子的Sendai病毒载体从PBC产生iPSC系(图2a)，并在下文进行描述。这些获得的PBC-iPSC表现出典型的hPSC形态学和表型(图2a)。
然后，检查NK细胞产生的两阶段方案以确定所述方法是否仍适用于这些PBC-iPSC。利用PBC-iPSC#9系(图2b)，与OP9共培养12-天之后衍生包含显著CD34+群体的分化的细胞(图2c)。不分选CD34+细胞，收获这些分化细胞并直接与OP9-DLL1共培养。第二次共培养之后(第26天)出现小CD45+CD56+群体；这个群体在第五次共培养之后(第47天)变得更明显，其包含61％的淋巴样细胞(图2e)。在整个分化过程中未观察到TCRαβ或CD3表达：在多能干细胞(图2b)、造血细胞(图2c)或淋巴样细胞(图2d,e)中均未观察到。此外，在淋巴样细胞中没有明显的CD4或CD8表达，证实两阶段方案也可以用于从PBC-iPSC产生NK细胞。
提高衍生自PBC-iPSC的NK细胞的纯度和产量.除了GMP相容的起始hPSC来源，进一步提高衍生自PBC-iPSC的NK细胞的纯度和产量会促进这种新NK细胞来源的生产和平移使用。为此，测试不同细胞因子以增强NK细胞定型(图2f)。结果(表1)显示在淋巴定型期间使用IL-7连同SCF和FLT3L在分化的第40天带来61％的纯度，而产量为0.21x106个CD56+CD45+细胞(来自5 3x106个PBC-iPSC)；使用IL-15增加纯度至99％，并且增加产量至0.75x106；而联合使用IL-7和IL-15在第40天给出99％的纯度和7.93x106的产量，在第47天这进一步增加至15x106。
表1：细胞因子提高PBC-iPSC衍生的NK细胞的纯度和产量
Figure BDA0002220454290000271
从iPSC产生γδ NKT细胞。
细胞培养.在Matrigel(BD Biosciences,San Diego,CA,http://www.bdbiosciences.com)包被的6-孔板上用mTeSR1(StemCell Technologies,Vancouver,BC,Canada,http://www.stemcell.com)培养产生的iPSC系。细胞系：如ATCC推荐地培养OP9(美国典型培养物保藏中心[ATTC],Manassas,VA,http://www.atcc.org)。在补充了20％胎牛血清(FBS)(HyClone,Logan,UT,http://www.hyclone.com)的α-MEM(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,http://corporate.thermofisher.com)中培养细胞系OP9-DLL1(Riken BRC Cell Bank,Ibaraki,Japan,http://cell.brc.riken.jp/en/)。
从GDT-iPSC产生γδ T细胞.为了从GDT-iPSC产生γδ T细胞，使用先前建立的两阶段方案(上文描述用于从iPSC产生NK细胞)。在第一阶段，在补充了20％FBS的α-MEM中于过度生长的OP9或OP9-DLL1细胞上接种1-1.5×106个iPSC并分化12天。每4天通过更换一半培养基对共培养物进行补料。在第二阶段，利用1mg/ml胶原酶IV(StemCell Technologies)和TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific)从共培养物收获分化的细胞。通过塑料粘附45分钟去除OP9或OP9-DLL1细胞，并且通过100μm细胞过滤器(BD Biosciences)进一步去除细胞丛。然后利用包含20％FBS、10ng/ml SCF(PeproTech,Rocky Hill,NJ,http://www.peprotech.com)、5ng/ml FLT3L(PeproTech)连同5ng/ml IL-7(PeproTech)和/或10ng/ml IL-15(PeproTech)的α-MEM将剩余的非粘附细胞与T75瓶上生长的OP9-DLL1细胞共培养7天。此后，每周利用Versene(Thermo Fisher Scientific)收获分化的细胞并且与在6-孔板上生长的新OP9-DLL1细胞共培养，进行额外的3-4周。
为了产生γδ T细胞，先前描述的以上方案用于从iPSC产生NK细胞以分化下文描述的γδ T细胞衍生的GDTA/NF-iPSC#1系。在分化的第33天，观察到同质淋巴群体(图3a)，其中53％是γδ TCR+CD3+(图3b)。这些γδTCR+CD3+细胞中的大多数还是Vγ9Vδ2+(图3c)和CD56+(图3d)，表明这些iPSC衍生的γδ T细胞仅仅(exclusively)是可能具有NK细胞样表型的Vγ9Vδ2子集。这个结果与53％的淋巴群体是CD3+CD56+而45％是CD3-CD56+(图3e)且54％是Vδ2+(图3f)的发现非常符合。在第47天，淋巴群体变得更明显(图3g,m)。更多γδTCR+CD3+细胞出现(图3h)，其保留Vγ9Vδ2+(图3i)和CD56+(图3j)。通过CD3+CD56+群体和Vδ2+群体的增加以及CD3-CD56+群体的减少(图3k,l)进一步证实这种变化。同样地，当利用非T细胞衍生的GDTA/NF-iPSC#3用于分化时，在第47天仍观察到明显的淋巴群体(图3n)；但是，这个群体是CD3-CD56+(图3p)，并且没有观察到γδ TCR+CD3+细胞(图3o)或Vδ2+细胞(图3q)。这些发现强烈表明发生了从γδ T细胞衍生的iPSC系产生CD56+Vγ9Vδ2 T细胞。
模拟的先天免疫细胞的表征
模拟的NK细胞
流式细胞术.为了研究hPSC分化期间表型的变化，收获细胞，利用抗CD34、CD43、CD45、CD56、TCRαβ、CD3、CD4、CD8、NKp44、NKp46、NKG2D、CD16、NKG2A、CD94、CD158e1/e2、Cd158i、CD158a,h抗体(BDBiosciences and Beckman Coulter,https://www.beckmancoulter.com)染色并用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)分析。
ELISPOT测定.为了检测IFN-γ分泌，使用人IFN-γELISpotPro试剂盒(MABTECH,Nacka Strand,Sweden,https://www.mabtech.com)。简单地说，将0-10x104个PBC-iPSC衍生的NK细胞和5x104个K562或Raji细胞在IFN-γELISPOT平板上共温育过夜。根据制造商的使用手册染色IFN-γ斑点。为了测量GrB分泌，使用人颗粒酶B ELISpot试剂盒(R&DSystems,Minneapolis,MN,https://www.rndsystems.com)。简单地说，将0-1.2x104个PBC-iPSC衍生的NK细胞在人GrB微孔板上用或不用5x104个K562细胞温育4小时。然后如制造商的使用手册所述染色GrB斑点。利用ImmunoSpot分析仪(CTL,Shaker Heights,OH,http://www.immunospot.com)计数IFN-γ和GrB斑点。
利用IL7和IL15细胞因子组合产生的NK细胞.利用优化的细胞因子组合，从PBC-iPSC#9衍生了高纯度淋巴样细胞(图4)。这些细胞表现出典型的NK细胞形态学(图4a)。如细胞图像(图4a)和散点图(图4b)所示，它们是同质群体。它们中大多数是CD56+CD45+CD3-，典型的NK细胞表型(图4b)。这些细胞还表达激活受体如NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D以及抑制受体如CD94:NKG2A(图4b)。它们还是CD16+(图4b)，这对于NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是重要的。在杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)方面，它们显示没有或低表达KIR2DL1、KIR2DL4、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4和KIR3DS1。仅一小部分细胞被CD158b(18％)或CD158e/k(13％)抗体染色，提示大多数NK细胞是KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2阴性的(图4b)。这种抑制性KIR-阴性表型可能有利于这些NK细胞的细胞毒性。因此，利用优化的两阶段方案可以持续从PBC-iPSC产生大量高纯度NK细胞。
模拟的γδ NK T细胞
流式细胞术.为了研究iPSC分化期间的表型变化，收获细胞，利用抗CD3、CD56、γδTCR、Vδ2 TCR、Vγ9 TCR、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、NKG2A、CD94、CD16、FasL、TRAIL、DNAM-1、CD158a,h(KIR2DL1/S1)、CD158b(KIR2DL2/L3/S2)、CD158f(KIR2DL5)、CD158i(KIR2DS4)、CD158e1/e2(KIR3DL1/S1)和CD158e/k(KIR3DL1/L2)抗体(BDBiosciences；BeckmanCoulter,https://www.beckmancoulter.com；MiltenyiBiotec,http://www.miltenyibiotec.com)染色并用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)分析。
供体衍生的PB-NK细胞的扩增.为了衍生PB-NK细胞，利用垂直位置的T75瓶将2×106个来自健康供体的PBMC与4×106个经γ-辐照(100Gy)的K562-mbIL15-41BBL细胞在补充了10％FBS和50IU/mL IL-2的CellGroSCGM不含血清的培养基中共培养。每2-3天用新鲜培养基更换一半培养基并补充新鲜IL-2直至第7天。此后，将2×106个细胞每周用2×106个K562-mbIL15-41BBL细胞重新刺激另外两周。在第21天收获细胞用于实验。
CD56是NK细胞的典型表面标记。为了查明这样产生的iPSC衍生的模拟的γδ T细胞(iPSC-γδ T细胞)是否还表达NK细胞的其他表面分子，进行详细的表型分型(图5a)。流式细胞术分析显示大多数iPSC-γδ T细胞高表达激活受体：NKG2D和DNAM-1；天然细胞毒性受体(NCR)：NKp30、NKp44和NKp46；以及死亡诱导配体：TRAIL(图5a)。此外，41％表达CD16，介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的表面分子；5％表达FasL，另一死亡诱导配体(图5a)。iPSC-γδ T细胞的这种表面分子表达谱非常像扩增的外周血NK(PB-NK)细胞(图5c)，其具有低水平TRAIL表达。相比之下，虽然扩增的外周血γδ T(PB-γδ T)细胞还表达NKG2D和DNAM-1，但是它们不表达NCR、死亡诱导配体和CD16(图5b)。在抑制受体和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)方面，iPSC-γδ T细胞像PB-NK细胞和PB-γδ T细胞一样表达CD94/NKG2A受体；但是，与PB-NK细胞和PB-γδ T细胞不同，iPSC-γδ T细胞不表达KIR(图6a-c)，这使得它们不受受体HLA表型限制。因此，iPSC-γδ T细胞装备有PB-γδ T细胞和PB-NK细胞中观察到的两组“抗癌”分子，并且这类新的GDT-iPSC衍生的“γδ NKT细胞”可以对抗广谱的癌细胞。
利用模拟的先天免疫细胞的癌症免疫疗法
用模拟的NK细胞治疗
细胞培养.用补充了10％FBS的RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific)培养K562细胞(ATCC)、K562-mb15-41BBL细胞(由Prof.Dario Campana,Department ofPaediatrics,National University of Singapore,Singapore友好提供)和Raji细胞(ATCC)。
细胞毒性和ADCC测定.为了检测PBC-iPSC衍生的NK细胞对靶细胞的直接细胞毒性，使用流式细胞术方法。简单地说，将0-0.5x106个NK细胞与2x104个羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE；Thermo Fisher Scientific)标记的K562或Raji细胞共培养4-6小时。然后将样品用7-氨基-放线菌素D(7-AAD,BD Biosciences)在冰上染色10分钟。洗涤之后，通过FACSCalibur流式细胞仪基于CFSE阳性群体中7-AAD染色细胞的百分比评价靶细胞死亡。为了评价PBC-iPSC衍生的NK细胞的ADCC功能，在各种浓度的人IgG1(Sigma-Aldrich)、抗CD20-mIgG1(InvivoGen,San Diego,CA,http://www.invivogen.com)或抗CD20-hIgG1(InvivoGen)的存在下建立NK细胞和CFSE标记的Raji细胞的共培养物，如上文所述通过流式细胞仪测量靶细胞死亡。
PBC-iPSC衍生的NK细胞的功能.在激活时分泌细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)是NK细胞的重要功能特征。为了研究IFN-γ分泌，将PBC-iPSC衍生的NK细胞与刺激细胞共培养，然后酶联免疫斑点(ELISPOT)测定用来检测分泌IFN-γ的NK细胞。如图7a和7b所示，NK细胞敏感细胞系K562有效刺激衍生自PBC-iPSC#9的NK细胞的IFN-γ分泌；相反，NK细胞抗性细胞系Raji显示效率低得多，表明这些PBC-iPSC衍生的NK细胞能够应答刺激分泌细胞因子。
细胞毒性是NK细胞的另一标志性特征，其取决于细胞毒性分子如颗粒酶B(GrB)的分泌。ELISPOT结果显示高频率的PBC-iPSC衍生的NK细胞在通过K562刺激时分泌GrB(图7c,d)，这进一步证实这些iPSC衍生的NK细胞的功能性能力。更重要的是，这些iPSC衍生的NK细胞表现出与原代NK细胞相似的直接杀死谱。如图7e和7f中证实的，它们能够直接杀死NK敏感的白血病细胞K562，但不能杀死NK不敏感的淋巴瘤细胞Raji。有趣的是，通过利用这些iPSC衍生的NK细胞的ADCC功能，仍能够杀死Raji细胞(图7g,h)。如图7g和7h所示，单独的NK细胞不能杀死Raji细胞；添加人IgG1或抗CD20-mIgG1也不能；但是，在抗CD20-hIgG1的存在下，观察到明显的对Raji细胞的细胞毒性。因此，这些PBC-iPSC衍生的NK细胞的ADCC功能可以显著扩大它们的恶性细胞杀死谱。
用模拟的γδ NK T细胞治疗
细胞培养.如ATCC推荐地培养细胞系：SK-OV-3、SW480、MCF-7和BT474(AmericanType Culture Collection[ATTC],Manassas,VA,http://www.atcc.org)。
细胞毒性测定.为了检测iPSC衍生的γδ NK T细胞对靶细胞的细胞毒性，使用基于流式细胞术的方法。简单地说，将0-0.5×106个γδ NK T细胞与2×104个羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE；Thermo Fisher Scientific)标记的癌细胞以各种效应子比靶标(E:T)比例共培养4-6小时。然后将样品用7-氨基-放线菌素D(7-AAD,BD Biosciences)在冰上染色10分钟。洗涤之后，用流式细胞仪通过CFSE阳性群体中7-AAD染色细胞的百分比评价靶细胞死亡。
为了测试γδ NKT细胞的细胞毒性，将4种不同的实体瘤细胞系用作靶细胞：MCF7(乳腺癌)、SW480(结肠直肠腺癌)、BT474(乳腺导管癌)和SK-OV-3(卵巢腺癌)。结果显示γδNKT细胞能够杀死这些癌细胞系(图8)。在某些情况下，甚至在非常低的E:T比例下观察到细胞毒性(图8)，表明γδNKT细胞的高效力。
从外周血细胞产生iPSC
从PBC产生iPSC.为了从PBC产生iPSC，将来自健康供体的冷冻外周血单个核细胞(PBMC)(StemCell Technologies)解冻并在完全RPMI 1640培养基中用5μg/ml植物凝集素(PHA；Sigma-Aldrich,St Louis,MO,http://www.sigmaaldrich.com)培养2天，完全RPMI1640培养基由RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific)、10％热灭活的人血清AB(GeminiBio-Products,West Sacramento,CA,http://www.gembio.com)、2mM L-谷氨酰胺(ThermoFisher Scientific)、0.1mM非必需氨基酸(Thermo Fisher Scientific)和0.1mM2-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific)组成。然后将培养的血细胞在包含10ng/ml的IL-2、IL-7和IL-15的完全RPMI 1640培养基中用来自CytoTune iPS2.0Sendai重新编程试剂盒(ThermoFisher Scientific)的Sendai重新编程载体以5:5:3的MOI(KOS,hc-Myc,hKlf4)转导过夜。然后将转导的细胞洗涤并培养5天，之后接种至丝裂霉素C(Sigma-Aldrich)处理的小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)生长的6-孔板。用iPSC培养基接种之后第1-3天更换一半培养基，iPSC培养基由DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific)、20％敲除血清替代物(Thermo FisherScientific)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、0.1mM 2-巯基乙醇和5ng/ml基本成纤维细胞生长因子(PeproTech)组成。接种之后3-4周，将所得iPSC首先在iPSC培养基中的mEF上扩增，然后在Matrigel包被的平板上于mTeSR1中扩增。
免疫染色.为了检测多能性标记，将PBC-iPSC在4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich)中于室温下固定15min，然后用5％牛血清白蛋白封闭1小时。然后将细胞用抗SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81的一抗(Thermo Fisher Scientific)在室温下温育1小时。洗涤之后，将细胞用Alexa Fluor 594缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Thermo Fisher Scientific)在室温下温育1小时以在荧光显微镜下可视化。为了检测碱性磷酸酶(AP)，根据制造商的方案使用碱性磷酸酶活性染色(Thermo Fisher Scientific)。为了证实PBC-iPSC用于NK细胞产生的可行性，首先产生利用携带重新编程因子的Sendai病毒载体的来自PBC的iPSC系(图2a)。这些所得PBC-iPSC表现出典型的hPSC形态学和表型(图2a)。
γδ T细胞的扩增.为了扩增γδ T细胞用于iPSC产生，将来自健康供体的冷冻PBMC(StemCell Technologies)解冻并在包含5μM Zometa(Novartis)的PBMC培养基[补充了10％热灭活的人AB血清(Gemini Bio-Products,West Sacramento,CA,http://www.gembio.com)和10ng/ml IL-2(Thermo Fisher Scientific)的OpTmizer CTS T-CellExpansion SFM(Thermo Fisher Scientific)]中培养。每2-3天用没有Zometa的新鲜PBMC培养基更换一半培养基。
GDT-iPSC的产生.为了从扩增的γδ T细胞产生iPSC，在第7天将培养的PBMC用来自CytoTune iPS 2.0Sendai重新编程试剂盒(Thermo Fisher Scientific)的Sendai重新编程载体以5:5:3的MOI(KOS,hc-Myc,hKlf4)转导过夜。然后将转导的细胞洗涤并培养5天，之后接种至丝裂霉素C(Sigma-Aldrich)处理的mEF生长的6-孔板。用iPSC培养基接种之后第1-3天更换一半培养基，iPSC培养基由DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific)、20％敲除血清替代物(Thermo Fisher Scientific)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、0.1mM 2-巯基乙醇和5ng/ml基本成纤维细胞生长因子(PeproTech)组成。接种之后3-4周，挑出所得iPSC集落并在Matrigel包被的板上于mTeSR1中扩增。
为了利用非病毒方法从γδ T细胞产生iPSC，如上文所述用Zometa和IL-2培养PBMC并在第7天或第13天使用。在第0天，利用Amaxa Nucleofector 2b(Lonza,http://www.lonza.com)通过核转染(nucleofection)将来自Epi5游离型iPSC重新编程试剂盒(Thermo Fisher Scientific)的游离型重新编程载体递送至培养的PBMC中。然后将核转染的细胞接种在丝裂霉素C灭活的mEF上。在第2天，使细胞适应PBMC培养基:iPSC培养基的1:1混合物。从第3天开始，将细胞在iPSC培养基中培养，每隔一天更换iPSC培养基。接种之后2-4周，挑出iPSC集落并在Matrigel包被的板上于mTeSR1中扩增。
TCRB和TCRG基因克隆性测定.利用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen,https://www.qiagen.com)根据制造商的说明书从iPSC分离基因组DNA。为了检测基因组DNA中的TCRβ和TCRγ基因重排，用TCRB和TCRG基因克隆性测定试剂盒(Invivoscribe Technologies,San Diego,CA,http://www.invivoscribe.com)中提供的预混液和AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)利用以下程序进行PCR：95℃持续7分钟；35个扩增循环(95℃持续45秒，60℃持续45秒，72℃持续90秒)；以及72℃持续10分钟的最终延伸，然后保持在15℃。在2％MetaPhor琼脂糖(Lonza,http://www.lonza.com)凝胶中通过电泳分离PCR产物。
为了激活和扩增γδ T细胞用于iPSC产生，利用Zometa和IL-2培养来自健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC培养物中的总细胞数量和细胞丛随时间增加(图9a)，表明γδ T细胞成功扩增。流式细胞术分析进一步证实在7-天培养物中多达61％的淋巴细胞是γδ T细胞(图9b)。然后将这种富含γδ T细胞的PBMC培养物用于iPSC产生。
为了从γδ T细胞衍生iPSC系，使用两种重新编程方案。在一个方案中，最初使用携带重新编程因子基因的无整合的Sendai病毒载体以转导培养的PBMC。如转导之后第6天观察到的，大多数转导的细胞存活(图10a)。然后将这些细胞接种在丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)上。iPSC集落(图10b)最早在接种之后9天开始出现。可以在接种之后3周挑出这些集落并直接在Matrigel包被的平板上于mTeSR1培养基中扩增(图10c)。
在另一方案中，核转染用来递送游离型重新编程载体至培养的PBMC中并建立3个iPSC系：GDTA/NF-iPSC#1、GDTA/NF-iPSC#2和GDTA/NF-iPSC#3(图10d-f)。为了鉴定衍生自γδ T细胞的iPSC系，进行TCRG基因克隆性测定(图10g)和TCRB基因克隆性测定。由于存在重排的TCRG基因，证实两个iPSC系GDTA/NF-iPSC#1和GDTA/NF-iPSC#2衍生自γδT细胞，而一个iPSC系GDTA/NF-iPSC#3来自非T细胞，因为不存在重排的TCRB和TCRG基因。如非T细胞衍生的GDTA/NF-iPSC#3，γδ T细胞衍生的GDTA/NF-iPSC#1和GDTA/NF-iPSC#2不表达γδTCR和CD3(图9h)，表明γδ T细胞的完全重新编程。
第一次证实从γδ T细胞衍生iPSC以及利用这类γδ T细胞衍生的iPSC(GDT-iPSC)产生γδ T细胞。此外，通过组合这些新GDT-iPSC系与上文描述的从iPSC产生NK细胞的分化方案，产生了高表达NK细胞的“抗癌”分子的γδ T细胞并将这种独特的细胞类型命名为“γδ自然杀伤T(NKT)细胞”。
模拟的先天免疫细胞的扩增
新鲜和冻存的PBC-iPSC衍生的NK细胞的扩增.产生足够的功能性细胞是将这些iPSC衍生的NK细胞转化为临床应用的前提。从iPSC获得治疗规模的NK细胞的一种可能方式是扩大规模的分化培养，但是，这是不划算的。更实用的方式是利用饲养细胞扩增iPSC衍生的NK细胞。为了研究这种可能性，将各种数量的产生自PBC-iPSC#9的NK细胞与辐照的K562-mb15-41BBL细胞以1:10的NK细胞:饲养细胞比例在透气的G-Rex10瓶中共培养。结果显示这些iPSC衍生的NK细胞在14-天共培养期间快速扩增(图11a,b)。用106的起始NK细胞数量，在第9天观察到74-倍扩增，虽然通过延长共培养至14天未实现进一步扩增(图11a)。有趣的是，虽然表型没有明显变化，除了CD16表达的下调(图11c)，但是这些扩增的NK细胞在杀死K562细胞中变得更有力(图11d)，可能是由于它们在扩增期间的进一步功能成熟。这些数据表明通过用饲养细胞扩增产生临床规模的功能性iPSC衍生的NK细胞是可行的。
从集中的制备地点运输细胞治疗剂至临床地点用于注射而不影响产品质量对于活细胞产品的临床效力至关重要。运输冻存形式的常规NK细胞产品可以显著降低NK细胞的生存力和效力。这对于PBC-iPSC衍生的NK细胞也是事实(图11e,g)。冻/融过程显著影响扩增的PBC-iPSC衍生的NK细胞的生存力(图11e)，虽然这些扩增的NK细胞的效力在冻/融过程之后在一定程度上保存下来(图11g)。为了克服冻存引起的这些生存力和效力问题，建议一种可能的解决方法：在集中的制备地点在扩增之前首先将PBC-iPSC衍生的NK细胞冻存并以冻存形式运输至临床地点；然后将这些冻存的NK细胞解冻，扩增并在临床地点注射。这种解决方法的可行性取决于扩增冻存的NK细胞的能力。如图11f所示，冻存的NK细胞保持高度可扩增性；从106个冻存的NK细胞开始，在第9天仍可以达到38.5-倍扩增。更重要的是，这些扩增的冻存NK细胞表现出与扩增自非冻存的新鲜NK细胞的那些可比的细胞毒性效力(图11g)。这些结果表明运输扩增前的NK细胞是PBC-iPSC衍生的NK细胞治疗剂的物流的实用解决方法。
产量高达15x106个NK细胞每3x106个PBC-iPSC，具有99％纯度。利用饲养细胞系，这些PBC-iPSC衍生的NK细胞可以在9天中扩增74-倍，以及在冻存之后扩增38.5-倍。如增加的对K562细胞的细胞毒性所示，这些扩增的NK细胞在功能上变得更有效。因此，证实了利用工业相容性生产方案从PBC-iPSC产生NK细胞治疗剂的可行性。
本领域技术人员应当进一步理解上述特征的变化和组合，不是可选物或替代物，可以组合形成本发明的预定范围内的进一步的实施方案。
序列表
<110> 新加坡科技研究局
曾洁铭
王朔
<120> 从多能干细胞产生模拟的先天免疫细胞的方法和试剂盒
<130> 2018.P00972
<150> SG 10201700937P
<151> 2017-02-07
<150> SG 10201705582S
<151> 2017-07-06
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 128032
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgcggtggg ccctagcggt gcttctagct ttcctgtctc ctggtgagtg cgctgcctac 60
agagaggatc acgggttttg ttttgttttg ttattttctt cttttgcaag gagcgacata 120
ctaagaaatg cctcattata ttttgtgttg ttcccattgc agccagtcag atatcttcca 180
acttggaagg gagaacgaag tcagtcacca ggctgactgg gtcatctgct gaaatcacct 240
gtgatcttcc tggagcaagt accttataca tccactggta cctgcaccag gaggggaagg 300
ccccacagtg tcttctgtac tatgaaccct actactccag ggttgtgctg gaatcaggaa 360
tcactccagg aaagtatgac actggaagca caaggagcaa ttggaatttg agactgcaaa 420
atctaattaa aaatgattct gggttctatt actgtgccac ctgggacagg cacagtgatt 480
cagacactga aaatctgcct gtggttgctt ctggtacaca agatagacca gccaactctc 540
atttcctgcc ctgaatttac tgtattctgt acaaagagaa acacagctta actcctgatc 600
tcccctgcaa tatcacactc ccctggcagc agctgcaccc tgttccccac cctcccccag 660
gactttcctg aagaccaagc tgccacctcc aagcctcagc taagcagcct ggctgagagc 720
aagtttctct cagctctcct agaacatggg gaaggcccac tcactctgct tcctaggaca 780
gacaggtaca gctagggtcc agctgtgaag caagacattt tggacaaaaa tgggaagggt 840
attcatactg aatcatacat ccaataatgg tccagagatc gcagctgaga gtggtgctta 900
ttccttatgt ctataacaat ataagcaata ctataatgac cactaaaaca ctaggccaat 960
atatgcagtt gaacattctc tctctctgcc ctccctttta ttctcgctct cctttcttac 1020
ttccatgctt gcttttatca ttttctctcc ctccctccct tcctcctttc cttccatcac 1080
cccaccctcc ttcctttctt tccttccttc cttccttgct tttctctctt tctctccttt 1140
ttgtgtacat aatcacaata ctttttccac aaaatcattt gaaatagttt ttctctattt 1200
gttcatgcca acattgatat agctgcttta attgttcagt ttcattttta tattttggaa 1260
atttgtgtat tattttgttt tgtttcatat ttgttttgta tacgtaaaac atttagttgg 1320
aactgaagtc aaaattataa aagatgacac atttgaagat tttagcttcc attgtagact 1380
tctcattcct cttttctccc tgacactata ggtaacaata tttttatccg ttttcttgaa 1440
ctttttcact ctgtcatagc gcagtatgta tcaattctat ttcaatgcca tatttatatt 1500
tttgttccta tatttggttt ttatacattt taatcaatct tatattttcc cgtgtctgga 1560
ttgtgtgtct tacttctaaa ggtgcacata cttcataagt atgcataaag acgtccatat 1620
catttatttg aatgttttta tgtgttgatt atttaatgat ggcatcattg atctatcagg 1680
aatttttata caataattac tgtattagta ataataatac tggccaggcc cggtggctca 1740
tgcctgtaat cccagcattt gagtagtaca gtcgttagga atacttaggc cgggagattg 1800
cgaccagctt agccaacatg gtgaaaccct gtctctacta aaaatacaaa aaattagctg 1860
gctgtggcgg tgcacacatg taatcccagc tacttggatg ctgaagcagg agaatctctt 1920
gagcctagaa ggtggagttt tcagtgagct aatatcacac tactgcagtc cagtttgggc 1980
aacacagtga gactctgtct caaaaagact aataataata ataatattga tggtaaatat 2040
gggtactgac attctggtag ttaatgtact aagcacattg catgcatatt gtatttaatc 2100
tacacagaaa cttcattaag gatttaaagt actgttgaat gtaacattag aaattggggg 2160
gttaattaac attccctaag tcatatactt taatttgata atgattgcaa tccaagctct 2220
gtggttcaga aaatgagatt tgttaattcg gtttgcattc ccccatcgta ggagtactag 2280
catcatttta caactttaca gttcatttat atttcttctt ttgagaattg ccttgtacac 2340
tcttttccta ttcttctatt ggaggattag ttttttctta ttggttcgta agaattaata 2400
tacaccattt tagagatact gaccctttat ccaatgtgtt gaagatattt ctcctcattt 2460
gttattattt acatttggca ccttttggag aattgaactt tgaaaaaaac aaaatctatc 2520
aatttttcta tggtgtctac tttgatgtca ggtttagaaa ggccaatctc acctagaatt 2580
tctatgcaat tcatcatcat ttaagtctaa tgattttctt tttattacaa ctaaatcact 2640
atttgtaact ggtaaggtag aaatgcagca atatttgttt ccatatggta agtcaatatc 2700
caaaagagaa cttatgaaat aattgactat ttccttgtgg atattaacat atcactttat 2760
cacatgataa aatattacat acatgcagct ttctttctgg attttccact gtgttccatg 2820
aatcttgtca ttctagtgcc agtattgcct tctcttcagc actgtagctt tatagttctt 2880
ttcacattct gatgaagttt ctctcattat ctttttgttt taagaatttt ctgtgcatgc 2940
tagtgtgatc tcaatcctct cccttcccat ttttaaaccg tgagacttct gtccagcaag 3000
actttttcac gctccaaggc aggcaagctt ccctccttca caaggacctg agaattcagc 3060
tttcagagct gttcctgtgg aagcctcatg tcctgcacat atggtccaga ggcagaggga 3120
gaccaaccgg agccccctcc ctttctcatt cccagctgtg atgacagcaa aaactgaact 3180
ctgtgagcta ggccaacaac acaattaaga gagacattgt tctacatctc attatgcatc 3240
tttcaaacat gtgtctctat atacttctga cacaggtggt ggtaatctgt gtatgcctta 3300
ctgaattttc acaattatat tactgtacta cttttgtccc ctatatttcc atctgtgaat 3360
ccaggtgtac tgcagatctc agtccccttt ctgagggtag ggctgacaaa taaaatatac 3420
aataccaaac aatttggaag ttcagataaa caacaagttt ttagtttaag tatgttccaa 3480
atattgcatg acatggcacc ctgaactact tagaaaaaaa aaacaaaaaa acctcacact 3540
cctacttcag tgaacaaaaa tcctctaata aagagatcac acccacagga tcacacacac 3600
acaaacacac acacacacac acaccccaca tacacccatt tatcttagag cagagtccaa 3660
gacccaccaa cacacatgat cctcagtcct ttcattttta ttatttattt atttatttat 3720
atttattata ctttaagtgc tagggtacat atgcacaacg tgcaggtttg ttacatatgt 3780
atacatgtgc catgttggtt tgttgcaccc atcaacttgt catctacatt aggtatatct 3840
cttaatgcta tccctccccc ctccccccac cccactacag gccccagtgt gtgatgttcc 3900
cccactctgt gtccaagtgt tctccttgtt caattcccac ctacgagtga gaacatgcac 3960
tgtttggatt tctgtccttg gaatagtttg ctcggaatga tggtttccag cttcatccat 4020
gtccttacaa aggacatgaa cgcatccctt tttatggccg catagtattc catggtgtat 4080
atgtgccaca ttttcttaat ccagtctatc attgatggac atttgggttg gttccaagtc 4140
tctgctatcg tgaatagtgc cacaataaac atatgctttg cgtggtgcct ccaagtgtcc 4200
tcgcagatgc caaaaggaag gtggttcagt tccctaatca gagacttcct ggcaggacaa 4260
ggtcctggca tcagcattag ctgctgcaac tctgaagggc agggtgtgag cctgctgtgg 4320
gactgccccc tcctagggct gggcctgctg actccagggt ctgcttcccc cacctctgca 4380
ctccctctgc tgcaggcctg agctctcctt gcccctggct ctcttctgca gagggcctgc 4440
tctcagctgc cacaagaggg cgccggagaa cggacctgag cagagaggca ggggctcctc 4500
tgcaggtcct cccaggcacc aacccttctg ggagggagga aggcttggga gtcctcttag 4560
acagatcctc agtcacttcc ctctgcttgt gtctcaggaa gaccacctcc tcctactgtc 4620
ttctgtgcta gggatcactt ccttgttgag tggaacctga gttttaagag gatcttctgc 4680
tcctcttcat ctggtccctt tccttccaag gccccagaga ggaaggcatg cagtgggccc 4740
tagcggtgct tctagctttc ctgtctcctg gtgagtgcgc tgcctacaga gaggatcacg 4800
ggttttgttt tattttcttc ttttgcaagg agtaccatac taaggaattc ctcattatat 4860
tttgtgttgt tcccattgca gccagtcaga aatcttccaa cttggaaggg agaacgaagt 4920
cagtcatcag gcagactggg tcatctgctg aaatcacttg tgatcttgct gaaggaagta 4980
acggctacat ccactggtac ctacaccagg aggggaaggc cccacagcgt cttcagtact 5040
atgactccta caactccaag gttgtgttgg aatcaggagt cagtccaggg aagtattata 5100
cttacgcaag cacaaggaac aacttgagat tgatactgcg aaatctaatt gaaaatgact 5160
ttggggtcta ttactgtgcc acctgggacg ggcacagtga ttcagatccg ccctacacca 5220
cactgaaaat ctgccttgtg gctgcttctg gtacacaaga tagagccgcc ccctctcatt 5280
tcctgccacc aaatttaccg tgtgctgaac aagagaaaca ttgcttaact cctgatctcc 5340
cctgcaatat tacactcccc tggcagcagc tgcaccctgt tccccaccct cccccaggac 5400
tttcctgaag accaagccgc catctcagct aagcctcaga gaagcagcct ggctgagagc 5460
aaggttctct tagctctcct aggacatggg ggaggcccac tcactctgct tcctaggaca 5520
aatgggtacc cctagggtcc agctgtaaag caagatattt tggacaacaa atgggaaggg 5580
aatttatact aaattgtgta tcccatcatg atccagaaac cgcagctgag actggtgctt 5640
attccttatg tctataacaa tataagcaat actataatga ccactgaaac accaggccta 5700
ggtatgcagt tgaacattct ctccctctgc cctccctttt attctctctc tcttttttct 5760
taattctttg cttgctttta ttatttttct ctctcccttc ctccctcgct ccatcgctcc 5820
ctccgtcctt ccctccctct ctccctctct ccttccctcc cttcctctct tctttccttc 5880
catccattct ccttcgtttt ccttccttcc ttctttgctt ttctcttgct ttcctttttg 5940
ggtacataat cagaatactt tttccacaaa atcatttgaa ataatttttc tctatgtgtt 6000
catgtcaaca ttgatatagc tactttaatt gttcagtttt cttttttaca ttttggaaat 6060
ttgttgtatt actttgtttt gtttcatatc tgttttgtat atataaaaca tttacatgga 6120
agtgaagtca aaattataaa agatgatgca tttgaagatt ttagcttcca ttgtagactt 6180
ctcattcttc ttttctccct gacactatag gtaacaatat ttttggcagt tcacttgagt 6240
tttttcactg tttgtcatag cggagtatgt attgtttcta tttcaatgcc atatttatat 6300
tttctttctg atattcagtt tctatatatt ttaatcaatc ttatattttc ctgtgtctgg 6360
actgtgtgtc ttacttctaa aggtgcacat acttcataag tatgcataaa gacgtccata 6420
tcatttattt gaatgttttt atgcattcat tatttaatga tggcatcatt gatctatcag 6480
gaatttttat acaataatta ctgtattagt aataataata ctggccaggc ccggtggttc 6540
atgcctgtaa tcccagcatt tgggcagtcc agtcgttagg atcacttagg ccgggagatt 6600
gcgaccagct tagccaacat ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa aaaattagct 6660
ggctatagtg gcgcacacat gtaatcccag ctacttgaat gctgaagcag gagaatctgt 6720
agagcctggt aggtggagtt ttcagtgagc taatatcaca ctactgcagt ccagtttggg 6780
caacagagtg agactctgtc tcaaaaaaat gaataacgat aataataata ttgatgctac 6840
atatgggtac tgacattctg gtagttaatg tactaagcac attacatgca tattttattt 6900
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gggggttaat taacattccc tgagtcatat actttaactt gataatgatt gcaatccaag 7020
ctctgtgatt ctgaaaacga gatttgtaaa ttcagtttgc attccctcat ctttgggagt 7080
actaacatta tttcacaact ttataggtca tttatagttc ttcttttgtg aattgccttg 7140
tcatactctt tgcctattcc tctcttggag gattaatttt ttcttattag tttgtaagag 7200
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tcatttgttg ttatttacat ttggcatctt ttggtgaatt gaactttgaa aaaaaaagca 7320
ttaaaatcta tcagtttttc tagggtgtct agtttgatgt caagcttaga aaggccaatc 7380
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aactaaatca ctatctatat ctggtaagaa cgaaatgcaa taatatttgt ttccatatgg 7500
taagtcaata cccaaaacag aacttataaa ataattgact atttccttgt gggtattaac 7560
atatcacttt atcacatgat aaaatattac atacgtgtgg ctctctttct ggattttcca 7620
ctgtgttcca tgaatcttct cattctagtg ccagtattgc cctctcttca gcactgtagc 7680
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ttctgtgcat tctagtgtga tctcaatcct ctcccttccc atttttaaac catgagactt 7800
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gaggcagagg gagaccaacc agagccccct ccctttctca ttcccagctg tgatgacagc 7980
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tcattatgca tatttcaaac atgtgtctct atatacttct tacagaggtg gtgataatct 8100
gtgaatgcct tactgaattt tcacaataat attactgtac ttgatttgtc cccttatttt 8160
catctgtgaa gccaggtgca ctgcagatat tagtctgctt tctgagggta gggatgacaa 8220
ataaaatata caataccggg ggaattggaa gttcagataa ataacaagtt tttagtttaa 8280
gtatgttcca aatattgcat gacatggcac ccagttctac tttaaaaaca aacaagcaaa 8340
caaacaaatt cacactccta ctttaatgaa caaaaatctt ctaataagga ggtcacacac 8400
acaggattac aggcacaacc cccacacaca aacacacaca cacatttacc ttagagcaga 8460
gtccaggaca caccaacaca catgatcctc agtcctttta atttaaagca cgttcaaccc 8520
ttctcagagt ggccttgagt ggttgcctcc atgagtctgc agatgcgaaa aggaagttgg 8580
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ctgttaattc cagggtcagc ttacccaaca tctgcagtcc ctcagctgga ggcctgagct 8760
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tctgggagga aggcttggga gtcccctaag acacatcttc agtcacttct ctctgcctgt 8940
gtctcaggaa accagctcct cctactgtct tctgtgctag ggatcacttc cttgttgagt 9000
ggggcctgag ttttaagagg atcttctgct cctcttcatc tggtccgttt ccttccaagg 9060
cccccgagag gaaggcatgc ggtgggccct actggtgctt ctagctttcc tgtctcctgg 9120
tgagtacgct gcctacagag aggctcacag gttgggtttt gttttgtttt cttcttgaaa 9180
ggggtgccat acaaaggaat acctcattgt attttgtgtt gttcccattg cagccagtca 9240
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ggaggggaag gccccacagc gtcttctgta ctatgacgtc tccaccgcaa gggatgtgtt 9420
ggaatcagga ctcagtccag gaaagtatta tactcataca cccaggaggt ggagctggat 9480
attgagactg caaaatctaa ttgaaaatga ttctggggtc tattactgtg ccacctggga 9540
caggcacagt gattcagacc tgtcctacac cacactgaaa atctgccttg tggctgcctc 9600
tggtacacaa gatagagccg ccccctctca tttcctgcca ccaaatttcc tgtattctga 9660
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cgagatattt tggacagcaa atgggaaggg tatttatact gaatcatgta tccactcatg 9960
gtccagagat cacagctgag agtggtgctt attccttatg tctataacaa cataagcaat 10020
actataatga ccactaaaac actaggccca ggtatgcagt tgaacatggt ctccctctgc 10080
cctccctttt attctctctc tcttttctta cttctttgct tgtttttatt tttctctccc 10140
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attctccttc cttgttttcc ttccttcctt ccttgctttt ctctctcttt ctttcctttt 10260
tgggtacata atcagaatac tttttccaca aaatcatttg atataatttt tctctatatg 10320
ttcatgccaa cattcataca gctagtttaa ttgttcagtt ctctttttca cattttggaa 10380
ttttgttgta ttactttgtt ttgcttcata tctgttttgt atatataaaa catttacatg 10440
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tatcatttat ttgaatgttt ttatgcgttg attatttaat gatggcatca tcgatctatc 10800
aggaattttt atacaataat tactgtatta gtaataataa tacttgccag gcccggtggc 10860
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gggggttaat taacattccc taagtcatat actttatctt gataatgatt gcaatgcaag 11340
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catactcttt tcctattctt tttttggaag attagttttt tcttattagt tcgtaagaat 11520
taatatacac cattttagag atactgaccc tttatccaat gtgttgaaga tatttctcct 11580
catttgttat tatttacatt tggcaccttt tggtgaattc aactttgaaa aaaaaacaat 11640
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ctaaatcact atttgtaact agtaaggtag aaatgcaaca atatttgttt ccatgtggta 11820
agtcaatacc aaaaagagaa cttatttaat aactgactat ttccttgtgg gtattaacat 11880
atcactttat cacatgataa aatattacat acatgcagct ctctttctgg attttccact 11940
gtgttccatg aatcttgtca ttctagtgcc agtattgccc tctcttcagc actgtagctt 12000
tatagttctt ttcacattct gatgaagttt ctctcattat ttttttgttt taagaatttt 12060
ctgtgcattc tagtgtgatc tcaatcctct cccttcccat ttttaaaccg tgagacttct 12120
gtccagcaag actttttcac gctccaaggc aggcaagctt ccctccttca caaggacccg 12180
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ggcagaggga gaccaaccgg agccccctcc ctttctcatt cccacctgtc attcccagct 12300
gtgaagacag cagaaaccga actctgtgag ctaggccaat accacaactg agaggaatat 12360
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ggtgataatc tgtgtatgcc ttactgaatt ttcacaatta tattactgta cttcctttgt 12480
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tagggctgac aaataaaata tacaatacca aacaatttgg aagttcaggt aaacaacaag 12600
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ggggaaggcc ccacagcgtc ttctgtacta tgactcctac acctccagcg ttgtgttgga 14220
atcaggaatc agcccaggga agtatgatac ttacggaagc acaaggaaga acttgagaat 14280
gatactgcga aatcttattg aaaatgactc tggagtctat tactgtgcca cctgggatgg 14340
gcacagtgat tcagatccgc cctacaccac actgaaaacc tgccttgtgg ctgcttctgg 14400
tacacaagat agagccgccc cctctcattt cctgccacca aatttaccgt gtgctgaaca 14460
agagaaacat tgcttaactc ctgatctccc ctgcaatatc acactcccct ggcagcagct 14520
gcaccctgtt ccccaccctc ccccaggact tccctgaaga ccaagccacc atctcagcta 14580
aacctcagag aagcagcctg gctgagagca aggttctctt agctctccta ggacatggcg 14640
gaagcccact cactctgctt cctaggacaa atgggtacct ctagggtcca gctgtgaagc 14700
aagatatttt ggacaacaaa tgagaagggt atttatacta aattgtgtat cccatcatga 14760
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ctccctttta ttctctctct ctttttttaa ttctttgctt gcttttatta tttttctctc 14940
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tcatttgaaa taatttttct ctatgtgttc atgtcaacat tgatatagct actttaattg 15180
ttcagttttc ttttttacat tttggaaatt tgttgtatta ctttgttttg tttcatatct 15240
gttttgcata tataaaacat ttacatggaa gtgaagtcaa aatcataaaa gatgatgcat 15300
ttgaagattt tagcttccat tgtagacttc tcattcttct tttctccctg acactatagg 15360
taacaatatt tttggcagtt cacttgagct gtttcactct gtttttcata gcggagtatg 15420
tattctttct atttgaatgc catatttata ttttctttct gatattcagt ttctatatat 15480
tttaatcaat cttatatttt cctgtgtctg gactgtgtgt cttacttcta aaggtgcaca 15540
tacttcataa gcatgcataa agatgtccat atcatttatt tgaatgtttt tatgcattga 15600
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gtactaagca cattacatgc atattttatt taatctacac agaaacttca ttaaggttta 16080
aagtactgtt gaatgtaaca ttagaaattg ggcggttaat taacattccc taagtcatat 16140
gctttaattt gataatgatt gcaatccaag ctctgtggtt ccgaaaatga gatttgtaaa 16200
ttcagtttgc attcccccat ctttgggagt actagtatta tttcacaact ttataggtta 16260
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gattaatttt ttcttattat ttcgtaagag ttaagataca ctattttaaa gatactgacc 16380
ctttatcgaa tgtgttgaag atatttcccc tcatttgtta ttatttacat ttggcacctt 16440
ttggtgaatt gaactttgaa aaaaaaagca ttaaaatcta tcaatttttc tagggtgtct 16500
agtttgatgt caagcttaga aaggccaatc tcacctagaa tttctatgca attcatcatt 16560
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cgaaatgcaa taatatttgt ttccatatgg taagtcaata cccaaaagag aacttataaa 16680
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ctcccttccc atttttaaac catgagactt ctgtccagca agactttttc atgctccaag 16980
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ctagtttaat tgttcagttt tcatttttac attttggaaa tgtgttgtat tactttgttt 19560
tgcttcatat ctgttttgta tatataaaac gtttacatga aactgaagcc aaaattataa 19620
aagatgatgc atttgaagat tttagcttcc attgtagatt tttcgttcct cttttctccc 19680
tgacactata ggtaacaata tttttggcag ttcacatgag ctttttcact gtttgtcata 19740
gtgccgtatg tattgtttct atttcaatgc catatttata ttttcattct gatattcggt 19800
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aaggtgcaca tacttcataa gtatgcataa agacgtccat atcatttatt tgaatgtctt 19920
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actgtattag taataataat actggccagg cccggtggct catgcctgta atcccagcat 20040
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gctatgatct tgccgctgca ttccaacctg gacgacagag caagccccag tctcaacaac 117840
aacaacaaaa attttgacat tgattcatat gggaaataag ataaataaca agataaatat 117900
ggtgcatcgc agaatcagtt aaatgaagag tggaagtaca cgaaattgca gaacatgaga 117960
atgtgtcata tttggccaaa gaacataagt tacaaaggat ggaaaaggga agtgagaaaa 118020
ggaccaaaga gtctcatctg tagagagatc attaaggttt tctgaccttc cactttcccc 118080
tgccatccac cttgaaaacc tgcttcactg tgatgaaaca aaagagattt aaaaataaaa 118140
taaatatgct catgaacttt ggaagccctg gtaggaggca gttaaaaatc acactcatca 118200
cagcatgtgc agaataaaca aaggccaggt tttcgtccag catctgacac ttgagagctg 118260
tgacttttgg caagttattt aatgtcttga ttctcttttc aacatctgta aaataagcac 118320
aataataagt actgtgcagc ctatcctgga tgaaaggccg cggtggacac cagctcaatg 118380
gcatcttctc tttttatggt tatgtactag gccactccaa accgtgcaat gtgtgtgttt 118440
ctctaatgat tcttttaaac tcatatttca tttctcccca tagataaaca acttgatgca 118500
gatgtttccc ccaagcccac tatttttctt ccttcgattg ctgaaacaaa actccagaag 118560
gctggaacat acctttgtct tcttgagaaa tttttcccag atattattaa gatacattgg 118620
caagaaaaga agagcaacac gattctggga tcccaggagg ggaacaccat gaagactaac 118680
gacacataca tgaaatttag ctggttaacg gtgccagaag agtcactgga caaagaacac 118740
agatgtatcg tcagacatga gaataataaa aacggaattg atcaagaaat tatctttcct 118800
ccaataaaga caggtatgtg tttacacata tcatctgtca gaacacttct ttgaaagtga 118860
atgctgcatt ttttcctttc agtattaatg aaaaacataa atctttctta aaaattgtta 118920
catttaatgg tagcgtaaat gccctgctac ttttctatag aattaaaatg gtataggttt 118980
tggagaaaac aaaattgaaa aagttgctga aggtttgtca gcctcagctc cattatccaa 119040
aataagaaag tcacgtgctg gtttttaggg ttgttagatg gattaaagaa acaacataca 119100
cagaagcatc tagcaacgtg acacgtggta aacgctcaaa aagtgttctc ccttcttttg 119160
atgactttac ttgatcagga aataacatat atatgtcttt caggaatgtt ctgcccaagc 119220
aggagagtca ctcacctcaa tcttgctacc cacaaagttt aacctaaaaa caacgggttc 119280
attgttgaca aaataatgtt tatctgaaga taactgtaga tcatatttat ctgtagataa 119340
tgtttatctg tggagtgtgg ctctacaaaa catagaatag tcttggtcac tgcagtttta 119400
tagaggcctt gggtttttca gagtttcatt ttatatatca ccataaagta acatttcata 119460
attacaggtt ggtaaggctt acatgtacaa acattcttcc attttccata ataaatgcat 119520
ttcctgccat tggtgaatgc agctcaataa acatttattg tacaattatg acacgccagg 119580
cttagtggaa atgtggatga acagacaagg atgagttact gtcctaagga tgatgcatga 119640
cagtgcagag aatatactct cttcctgatc actcagggtc actcatgatt catgcgcgag 119700
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tgaatgtgct ctggcccagt ggtccagtct gtcactatat gtcaacatcc tgaatatgaa 119820
cataacagtc caacatctca agagtgggca tgaaaaggac tcattttgtg ctttttcctg 119880
tggttaacaa gtccttttta gcctggggga acaagcatta acaaaatgtt tgaagatctt 119940
tgccacgtac cattccaaat ttctagggta agtctttagc ttttcagatc ctgagtttct 120000
gcaatgatca aatgtgattt ggacagttgc gttgactttc tcctggggct ataatggagt 120060
gcaaaggaaa caatggcagg gaaaatgctt gctttcaaaa tggtagcatg gatgtgttca 120120
ttcgtgtagt tactgtatta ggtatagcct ttcctgaaac taactgaagt ggggttataa 120180
aaacagtccc aattttctat ttcctttgct gagacacaaa gaggagacaa aagagcaaag 120240
cttgagggta gttttaccac tgtgcttaag tgttctgatt tttccagtga tcagggtgaa 120300
ataaaaagca tagtaagttc cagggcagtg aataccatac aggagacaag ttacagtttt 120360
ataatgtgtt ttactttaca ctaaattcta aaagtaaaat gtcttttttt ttttccgaga 120420
cagagtttca ctcttgtagc ccaggcagga gtgctatggt gtgatctcgg ctcacagcaa 120480
cctccacctc ccagtttcaa gcgattcttc tgcctcagcc tcccgagaag ttgaaattac 120540
aggtgcctgg caccatatct cgctaattat tctattttta gtagagatcg ggttttacca 120600
tgttggccag gctggtctcg aactcctgac ttcaagtgat ccacccgcct cagcctccca 120660
aagtgctggg attacaggtg tgagtcactg tgccggacct aacagtaaaa tgtctttcat 120720
gtgcttctca aggcaactac attaaggagg acacatctct taatgtcatt ctacagtaga 120780
tttctaatgc tctttcttgg aagtttgttt ttctgagaag agctaaaaat ataataacat 120840
ggaagtgatc atattatata atcaatgaag tgctttcaaa ggagataaaa ctaacctggt 120900
ctgcatttgc aaccagcctt gattgagaga gagagaactc aggatacact tagagatttt 120960
attatgggga atagttactt tattcatttt acctcaatca atgcatggaa ataagtgaca 121020
gtcattttca tttatctttt aataaataaa gtcaccatga ggaaaatgaa aacccattaa 121080
agtcagtcct taaagatatt tggacatgca gacatgataa ctaacatttc cattcgtgag 121140
acttacccaa aacctatacc tcaagtccat ttcttagaat acatgaaata aagatctcag 121200
tgagtgtata aaactgcaca ccagaatcat atccgtatag acaagaatac atctactaga 121260
aaaatataaa ccaaaacacc aaggtgactc tgtttttttc tgttttaaaa tatgttgtct 121320
ttgtatgcat gtttgcttct tccttttttt ttttaaacat cgcagataaa ttcaactctc 121380
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tctttataaa ttattttcta tctatttctg tggattattt ctacaaagca cttttcatat 121620
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gtctctacaa aaaatacaaa cattagctgg tcatgggagt gagtgcctgt actcccagct 122220
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ctacactcca gttgtgataa aaaagaaaaa agtattcttc acaaacttca acattttgat 122580
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tctagatgtc accacagtgg atcccaaata caattattca aaggatgcaa atggtaagtt 122880
tttgtgtttt ttatttcctc ctgatcattt taagttttga acttctctgg cttgaaaaat 122940
cagggaatgg attttgctag gttggatgct gcagaatgga cctaatcata ttttaaatta 123000
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ctgtaaattg aagggtacag tgatatgctt tcagttattt caaaaaacag actttactca 123120
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gtcactgtgc ccggcctaac agtaaaatgt ctttcatgcg cttctcaagg caactacgtt 123480
aaggaggaca cttctcttaa tgtcattcta cagtagattt ctaatgctct ttcttggaag 123540
tttgtttttc tgagaaaagc taaaaatata acatggaagt gatcatattg tataatcaat 123600
gaagtgcttt tcaaggagat aaaactaatc tggtccacgt ttgcaaccaa ccttgattga 123660
gagagagaga gaactcagga tacacttgga gattttatta tggggaatag ttactttatt 123720
cttttttcct caatcaattc atggaaataa gtgatagtca tattcattta tcttttaata 123780
aatgaagtca ccatgaggaa aataaaaaga cattgaaaac ccattaaagt tagcccttaa 123840
agatatttgg acatgcagac ttgataacta acgtttgcat tcttgagact tacccaaaac 123900
ccatacctca agtccatgtt tttagaattc atgaaataaa gatctcagtg agtgcataaa 123960
attgcgcacc agaatcatat ccgtatagac aagaacacat ctactagaaa aataataaac 124020
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tattgagaga actgtcaatg tgacttggcc tctgtctttc tagtcccaga aagaatcgca 124200
ctgaaatgct gagctcctgt aataaaaatg accatttgct gagagtaatt aacatactga 124260
aagagatttt cttagagtac acaatggtga cattatattg tctctttata aataactttc 124320
tatctatttc tgtggattat tcctacaaag tacttttcat atgtccagtt tcttttcttc 124380
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atgtcatcac aatggatccc aaagacaatt ggtcaaaaga tgcaaatggt aagcttttgt 125640
gtttttcctt tcctcctgat cattttaagt tttgaacttc tctggcttga aaaatcaggg 125700
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ctaaaaatac aaaaaattag ccgggcttag tggcgggcgc ctgtagtccc agctacttgg 125880
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aaaaaaaaaa aaaaagaaaa atcagggaat ggattttgct aggttggatg ctgcagaatg 126060
gacctagtga tattttaaat tagtccctct ttttctagga gttgtattaa caaacctaac 126120
tactgcttcg ggtatgagat gactgtaaat tagagggtac agtgatatgc tttcagttat 126180
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gagacggagg agtctcactc tatcacccag gctggagtgc agtggcgcga tctcggctca 126300
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tgttctgcat tttctagttt aatcatctta atactcctat aaagtagtac aatatatttt 126720
ctcccatttt acagtccctt taaagtaaat aactataaaa atcccttata catgtcacac 126780
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ctctattttt tctacaatag aaaaaatagc aagaattaca gatagcaaga cattacaagg 126900
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gtggtgctgg tagcagtaga tgtttacttt taggttttgg tggtggtgga atatcacttc 127800
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gtaaaaagaa catgtgcaat ttctcttaga tacactactg ctgcagctca caaacacctc 127920
tgcatattac acgtacctcc tcctgctcct caagagtgtg gtctattttg ccatcatcac 127980
ctgctgtctg cttagaagaa cggctttctg ctgcaatgga gagaaatcat aa 128032
<210> 2
<211> 4249
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
agtgcagcgc agaagacaga gggtgactag gaagacgcgc gagcggggct ggccggccgg 60
cgggtggggg aggggaggcg ggggaaggcg gctgagtggg cctctggagt gtgtgtgtct 120
gtgtcagtgt gtgtgtgtgt gtgtgtatgt gtgtgtctgg cgcctggcca gggtgatttc 180
ccataaacca catgcccccc agtcctctct taaaaggctg tgccgagggc tggccagtga 240
ggctcggccc ggggaaagtg aaagtttgcc tgggtcctct cggcgccaga gccgctctcc 300
gcatcccagg acagcggtgc ggccctcggc cggggcgccc actccgcagc agccagcgag 360
cgagcgagcg agcgagggcg gccgacgcgc ccggccggga cccagctgcc cgtatgaccg 420
cgccgggcgc cgccgggcgc tgccctccca cgacatggct gggctccctg ctgttgttgg 480
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ttgggagtgg acacctgcag tctctgcagc ggctgattga cagtcagatg gagacctcgt 600
gccaaattac atttgagttt gtagaccagg aacagttgaa agatccagtg tgctacctta 660
agaaggcatt tctcctggta caagacataa tggaggacac catgcgcttc agagataaca 720
cccccaatgc catcgccatt gtgcagctgc aggaactctc tttgaggctg aagagctgct 780
tcaccaagga ttatgaagag catgacaagg cctgcgtccg aactttctat gagacacctc 840
tccagttgct ggagaaggtc aagaatgtct ttaatgaaac aaagaatctc cttgacaagg 900
actggaatat tttcagcaag aactgcaaca acagctttgc tgaatgctcc agccaagatg 960
tggtgaccaa gcctgattgc aactgcctgt accccaaagc catccctagc agtgacccgg 1020
cctctgtctc ccctcatcag cccctcgccc cctccatggc ccctgtggct ggcttgacct 1080
gggaggactc tgagggaact gagggcagct ccctcttgcc tggtgagcag cccctgcaca 1140
cagtggatcc aggcagtgcc aagcagcggc cacccaggag cacctgccag agctttgagc 1200
cgccagagac cccagttgtc aaggacagca ccatcggtgg ctcaccacag cctcgcccct 1260
ctgtcggggc cttcaacccc gggatggagg atattcttga ctctgcaatg ggcactaatt 1320
gggtcccaga agaagcctct ggagaggcca gtgagattcc cgtaccccaa gggacagagc 1380
tttccccctc caggccagga gggggcagca tgcagacaga gcccgccaga cccagcaact 1440
tcctctcagc atcttctcca ctccctgcat cagcaaaggg ccaacagccg gcagatgtaa 1500
ctggtaccgc cttgcccagg gtgggccccg tgaggcccac tggccaggac tggaatcaca 1560
ccccccagaa gacagaccat ccatctgccc tgctcagaga ccccccggag ccaggctctc 1620
ccaggatctc atcactgcgc ccccagggcc tcagcaaccc ctccaccctc tctgctcagc 1680
cacagctttc cagaagccac tcctcgggca gcgtgctgcc ccttggggag ctggagggca 1740
ggaggagcac cagggatcgg aggagccccg cagagccaga aggaggacca gcaagtgaag 1800
gggcagccag gcccctgccc cgttttaact ccgttccttt gactgacaca ggccatgaga 1860
ggcagtccga gggatcctcc agcccgcagc tccaggagtc tgtcttccac ctgctggtgc 1920
ccagtgtcat cctggtcttg ctggccgtcg gaggcctctt gttctacagg tggaggcggc 1980
ggagccatca agagcctcag agagcggatt ctcccttgga gcaaccagag ggcagccccc 2040
tgactcagga tgacagacag gtggaactgc cagtgtagag ggaattctaa gctggacgca 2100
cagaacagtc tctccgtggg aggagacatt atggggcgtc caccaccacc cctccctggc 2160
catcctcctg gaatgtggtc tgccctccac cagagctcct gcctgccagg actggaccag 2220
agcagccagg ctggggcccc tctgtctcaa cccgcagacc cttgactgaa tgagagaggc 2280
cagaggatgc tccccatgct gccactattt attgtgagcc ctggaggctc ccatgtgctt 2340
gaggaaggct ggtgagcccg gctcaggacc ctcttccctc aggggctgca ccctcctctc 2400
actcccttcc atgccggaac ccaggccagg gacccaccgg cctgtggttt gtgggaaagc 2460
agggtggacg ctgaggagtg aaagaaccct gcacccagag ggcctgcctg gtgccaaggt 2520
atcccagcct ggacaggcat ggacctgtct ccagagagag gagcctgaag ttcgtggggc 2580
gggacagcgt cggcctgatt tcccgtaaag gtgtgcagcc tgagagacgg gaagaggagg 2640
cctctggacc tgctggtctg cactgacagc ctgaagggtc tacaccctcg gctcacctaa 2700
gtgccctgtg ctggttgcca ggcgcagagg ggaggccagc cctgccctca ggacctgcct 2760
gacctgccag tgatgccaag agggggatca agcactggcc tctgcccctc ctccttccag 2820
cacctgccag agcttctcca ggaggccaag cagaggctcc cctcatgaag gaagccattg 2880
cactgtgaac actgtacctg cctgctgaac agcctgcccc cgtccatcca tgagccagca 2940
tccgtccgtc ctccactctc cagcctctcc ccagcctcct gcactgagct ggcctcacca 3000
gtcgactgag ggagcccctc agccctgacc ttctcctgac ctggcctttg actccccgga 3060
gtggagtggg gtgggagaac ctcctgggcc gccagccaga gccggtcttt aggctgtgtt 3120
gttcgcccag gtttctgcat cttgcacttt gacattccca agagggaagg gactagtggg 3180
agagagcaag ggaggggagg gcacagacag agaggctaca gggcgagctc tgactgaaga 3240
tgggcctttg aaatataggt atgcacctga ggttggggga gggtctgcac tcccaaaccc 3300
cagcgcagtg tcctttccct gctgccgaca ggaacctggg gctgaacagg ttatccctgt 3360
caggagccct ggactgggct gcatctcagc cccacctgca tggtatccag ctcccatcca 3420
cttctcaccc ttctttcctc ctgaccttgg tcagcagtga tgacctccaa ctctcaccca 3480
ccccctctac catcacctct aaccaggcaa gccagggtgg gagagcaatc aggagagcca 3540
ggcctcagct tccaatgcct ggagggcctc cactttgtgg ccagcctgtg gtggtggctc 3600
tgaggcctag gcaacgagcg acagggctgc cagttgcccc tgggttcctt tgtgctgctg 3660
tgtgcctcct ctcctgccgc cctttgtcct ccgctaagag accctgccct acctggccgc 3720
tgggccccgt gactttccct tcctgcccag gaaagtgagg gtcggctggc cccaccttcc 3780
ctgtcctgat gccgacagct tagggaaggg cagtgaactt gcatatgggg cttagccttc 3840
tagtcacagc ctctatattt gatgctagaa aacacatatt tttaaatgga agaaaaataa 3900
aaaggcattc ccccttcatc cccctacctt aaacatataa tattttaaag gtcaaaaaag 3960
caatccaacc cactgcagaa gctctttttg agcacttggt ggcatcagag caggaggagc 4020
cccagagcca cctctggtgt ccccccaggc tacctgctca ggaacccctt ctgttctctg 4080
agaagtcaag agaggacatt ggctcacgca ctgtgagatt ttgtttttat acttggaagt 4140
ggtgaattat tttatataaa gtcatttaaa tatctattta aaagatagga agctgcttat 4200
atatttaata ataaaagaag tgcacaagct gccaaaaaaa aaaaaaaaa 4249
<210> 3
<211> 554
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr
20 25 30
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35 40 45
Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln
50 55 60
Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr
85 90 95
Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala
165 170 175
Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu
180 185 190
Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His
195 200 205
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210 215 220
Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro
225 230 235 240
Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser
245 250 255
Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser
260 265 270
Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn
275 280 285
Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val
290 295 300
Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly
305 310 315 320
Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu
325 330 335
Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala
340 345 350
Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro
355 360 365
Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro
370 375 380
Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro
385 390 395 400
Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro
405 410 415
Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly
420 425 430
Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp
435 440 445
Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala
450 455 460
Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly
465 470 475 480
His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser
485 490 495
Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val
500 505 510
Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro
515 520 525
Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr
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545 550
<210> 4
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
cgtgggattt ccagaccgcg gctttctaat cggctcggga ggaagctctg cagctctctt 60
gggaattaag ctcaatctct ggactctctc tctttctctt tctccccctc cctctcctgc 120
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aaggaggaaa acgaaagtcg ccgccgccgc gctgtccccc gagagctgcc tttcctcggg 240
catccctggg gctgccgcgg gacctcgcag ggcggatata aagaaccgcg gccttgggaa 300
gaggcggaga ccggctttta aagaaagaag tcctgggtcc tgcggtctgg ggcgaggcaa 360
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ggtgcgcgct ggccctggcg gtgctctcgg ccttgctgtg tcaggtctgg agctctgggg 540
tgttcgaact gaagctgcag gagttcgtca acaagaaggg gctgctgggg aaccgcaact 600
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tgaatgacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360
aaaaaa 3366
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<211> 723
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
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1 5 10 15
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Val Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly
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Ser Ala Val Thr Pro Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp
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Gly Gly Gly Ala Asp Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe
100 105 110
Gly Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His
115 120 125
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130 135 140
Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser
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Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg
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195 200 205
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Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu
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Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp
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275 280 285
Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys
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Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro
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Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met
355 360 365
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370 375 380
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Asn Cys Glu Lys Lys Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn
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450 455 460
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500 505 510
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Val Val Asp Leu Thr Glu Lys Leu Glu Gly Gln Gly Gly Pro Phe Pro
530 535 540
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Gly Cys Ala Ala Val Val Val Cys Val Arg Leu Arg Leu Gln Lys His
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<213> Homo sapiens
<400> 6
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Thr Ile Lys Lys Val Asp Lys Asn Asp Glu Ala Glu Tyr Ile Cys Ile
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Lys Thr Leu Asp Gly His Met Val Val Arg Ser His Ala Arg Val Ser
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435 440 445
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Glu Val Thr Pro Asp Ser Glu Asn Asp Phe Gly Asn Tyr Asn Cys Thr
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Ala Val Asn Arg Ile Gly Gln Glu Ser Leu Glu Phe Ile Leu Val Gln
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Ala Asp Thr Pro Ser Ser Pro Ser Ile Asp Gln Val Glu Pro Tyr Ser
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Ser Thr Ala Gln Val Gln Phe Asp Glu Pro Glu Ala Thr Gly Gly Val
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Val Thr Ile Val Gly Leu Lys Pro Glu Thr Thr Tyr Ala Val Arg Leu
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Ala Ala Leu Asn Gly Lys Gly Leu Gly Glu Ile Ser Ala Ala Ser Glu
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<213> Homo sapiens
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Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
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Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Ala Trp Met Leu Leu Leu Ile Leu Ile Met Val His Pro Gly Ser
1 5 10 15
Cys Ala Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Ala Trp Arg Ala Leu His Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1 5 10 15
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195 200 205
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210 215 220
Val Trp Trp Val Leu Arg Asn Arg His Met Gln His Gln Gly Arg Ser
225 230 235 240
Leu Leu His Pro Ala Gln Pro Arg Pro Gln Ala His Arg His Phe Pro
245 250 255
Leu Ser His Arg Ala Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Gly Lys Pro
260 265 270
<210> 10
<211> 303
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Ser Ser Thr Leu Pro Ala Leu Leu Cys Val Gly Leu Cys Leu Ser
1 5 10 15
Gln Arg Ile Ser Ala Gln Gln Gln Thr Leu Pro Lys Pro Phe Ile Trp
20 25 30
Ala Glu Pro His Phe Met Val Pro Lys Glu Lys Gln Val Thr Ile Cys
35 40 45
Cys Gln Gly Asn Tyr Gly Ala Val Glu Tyr Gln Leu His Phe Glu Gly
50 55 60
Ser Leu Phe Ala Val Asp Arg Pro Lys Pro Pro Glu Arg Ile Asn Lys
65 70 75 80
Val Gln Phe Tyr Ile Pro Asp Met Asn Ser Arg Met Ala Gly Gln Tyr
85 90 95
Ser Cys Ile Tyr Arg Val Gly Glu Leu Trp Ser Glu Pro Ser Asn Leu
100 105 110
Leu Asp Leu Val Val Thr Glu Met Tyr Asp Thr Pro Thr Leu Ser Val
115 120 125
His Pro Gly Pro Glu Val Ile Ser Gly Glu Lys Val Thr Phe Tyr Cys
130 135 140
Arg Leu Asp Thr Ala Thr Ser Met Phe Leu Leu Leu Lys Glu Gly Arg
145 150 155 160
Ser Ser His Val Gln Arg Gly Tyr Gly Lys Val Gln Ala Glu Phe Pro
165 170 175
Leu Gly Pro Val Thr Thr Ala His Arg Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Gly
180 185 190
Ser Tyr Asn Asn His Ala Trp Ser Phe Pro Ser Glu Pro Val Lys Leu
195 200 205
Leu Val Thr Gly Asp Ile Glu Asn Thr Ser Leu Ala Pro Glu Asp Pro
210 215 220
Thr Phe Pro Asp Thr Trp Gly Thr Tyr Leu Leu Thr Thr Glu Thr Gly
225 230 235 240
Leu Gln Lys Asp His Ala Leu Trp Asp His Thr Ala Gln Asn Leu Leu
245 250 255
Arg Met Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe Leu
260 265 270
Val Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser Arg
275 280 285
Ala Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu
290 295 300
<210> 11
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser
1 5 10 15
Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr
20 25 30
Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu
35 40 45
Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly
50 55 60
Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Thr Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn
65 70 75 80
Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys
85 90 95
Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln
100 105 110
Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met
115 120 125
Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp
130 135 140
Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile
145 150 155 160
Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro
165 170 175
Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr
180 185 190
Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr
195 200 205
Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
210 215
<210> 12
<211> 336
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu His Val Tyr Arg Ala
1 5 10 15
Leu Cys Glu Glu Val Leu Trp His Thr Ser Val Pro Phe Ala Glu Asn
20 25 30
Met Ser Leu Glu Cys Val Tyr Pro Ser Met Gly Ile Leu Thr Gln Val
35 40 45
Glu Trp Phe Lys Ile Gly Thr Gln Gln Asp Ser Ile Ala Ile Phe Ser
50 55 60
Pro Thr His Gly Met Val Ile Arg Lys Pro Tyr Ala Glu Arg Val Tyr
65 70 75 80
Phe Leu Asn Ser Thr Met Ala Ser Asn Asn Met Thr Leu Phe Phe Arg
85 90 95
Asn Ala Ser Glu Asp Asp Val Gly Tyr Tyr Ser Cys Ser Leu Tyr Thr
100 105 110
Tyr Pro Gln Gly Thr Trp Gln Lys Val Ile Gln Val Val Gln Ser Asp
115 120 125
Ser Phe Glu Ala Ala Val Pro Ser Asn Ser His Ile Val Ser Glu Pro
130 135 140
Gly Lys Asn Val Thr Leu Thr Cys Gln Pro Gln Met Thr Trp Pro Val
145 150 155 160
Gln Ala Val Arg Trp Glu Lys Ile Gln Pro Arg Gln Ile Asp Leu Leu
165 170 175
Thr Tyr Cys Asn Leu Val His Gly Arg Asn Phe Thr Ser Lys Phe Pro
180 185 190
Arg Gln Ile Val Ser Asn Cys Ser His Gly Arg Trp Ser Val Ile Val
195 200 205
Ile Pro Asp Val Thr Val Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Tyr Leu
210 215 220
Gln Ala Ser Ala Gly Glu Asn Glu Thr Phe Val Met Arg Leu Thr Val
225 230 235 240
Ala Glu Gly Lys Thr Asp Asn Gln Tyr Thr Leu Phe Val Ala Gly Gly
245 250 255
Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr Ile Ile Val
260 265 270
Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr
275 280 285
Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile
290 295 300
Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp
305 310 315 320
Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val
325 330 335
<210> 13
<211> 281
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
50 55 60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
65 70 75 80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
100 105 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
115 120 125
Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg
130 135 140
Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu
145 150 155 160
Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr
165 170 175
Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr
180 185 190
Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
195 200 205
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210 215 220
Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala
225 230 235 240
Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
245 250 255
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
260 265 270
Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
275 280
<210> 14
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
1 5 10 15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Thr Pro Arg Met Lys Arg
85 90 95
Leu Trp Ala Ala Lys
100
<210> 15
<211> 233
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn
1 5 10 15
Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Asn Ser Ile Leu
20 25 30
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50 55 60
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys
195 200 205
Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser
210 215 220
Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu
225 230

Claims (38)

1.一种产生模拟的先天免疫细胞的方法，所述方法包括：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞祖细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将所述先天免疫细胞祖细胞与M-CSF表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将所述分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，进行3-5周。
2.权利要求1的方法，其中将(a)中的人多能干细胞与M-CSF表达缺陷的基质细胞系共培养12天。
3.权利要求1或2的方法，其中所述培养基进一步包含胎牛血清(FBS)；α最小必需培养基(αMEM)或其他干细胞分化培养基；或者其组合。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述人多能干细胞是人胚胎干细胞。
5.权利要求1-3任一项的方法，其中所述人多能干细胞诱导自外周血细胞。
6.权利要求5的方法，其中将重新编程转录因子并入外周血细胞并生长以产生诱导的多能干细胞(iPSC)。
7.权利要求5或6的方法，其中所述方法进一步包括在将重新编程转录因子并入外周血细胞以产生诱导的多能干细胞(iPSC)之前，在氨基-双膦酸和白介素2(IL2)的存在下扩增外周血细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述氨基-双膦酸是唑来膦酸或其盐。
9.权利要求7或8的方法，其中所述iPSC包含以TCRG基因构型排列的TCR基因或以TCRD基因构型排列的TCR基因。
10.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在包含干细胞因子(SCF)；胎牛血清(FBS)；Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素15(IL15)和白介素7(IL7)的培养基中在饲养细胞的存在下扩增模拟的先天免疫细胞。
11.模拟的先天免疫细胞，其包含表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞。
12.权利要求11的模拟的先天免疫细胞，其进一步包含表达CD3的细胞。
13.权利要求11或12的模拟的先天免疫细胞，其进一步包含表达γδ TCR的细胞。
14.权利要求13的模拟的先天免疫细胞，其中所述γδ TCR包含Vγ9Vδ2(Vγ9Vδ2)。
15.权利要求11-14中任一项的模拟的先天免疫细胞，其用于治疗。
16.权利要求11-14中任一项的模拟的先天免疫细胞，其用于治疗癌症。
17.权利要求16的用于治疗癌症的模拟的先天免疫细胞，其中所述癌症是实体瘤癌症或白血病。
18.权利要求17的用于治疗癌症的模拟的先天免疫细胞，其中所述实体瘤癌症包括乳腺腺癌、结肠直肠腺癌、乳腺导管癌、卵巢腺癌或白血病。
19.权利要求11-14中任一项的模拟的先天免疫细胞在制备治疗癌症的药物中的用途。
20.权利要求19的用途，其中所述癌症是实体瘤癌症或白血病。
21.权利要求20的用途，其中所述实体瘤癌症包括乳腺腺癌、结肠直肠腺癌、乳腺导管癌或卵巢腺癌或者白血病。
22.一种产生模拟的先天免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)人多能干细胞系；
(b)巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系；
(c)巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系；
(d)用于共培养人多能干细胞与表达M-CSF缺陷的基质细胞系的第一简单培养基；以及
(e)包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的第二培养基。
23.权利要求22的试剂盒，其中所述培养基进一步包含胎牛血清(FBS)；α最小必需培养基(αMEM)或干细胞分化培养基或淋巴细胞培养基；或者其组合。
24.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：给所述患者施用模拟的先天免疫细胞，所述模拟的先天免疫细胞表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR，所述模拟的先天免疫细胞通过以下产生：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞祖细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将所述先天免疫细胞祖细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。
25.权利要求24的方法，其中所述癌症是实体瘤癌症或白血病。
26.权利要求25的方法，其中所述实体瘤癌症包含乳腺腺癌、结肠直肠腺癌、乳腺导管癌、卵巢腺癌或者白血病。
27.一种从外周血单个核细胞产生诱导的多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括：
(a)将重新编程转录因子并入外周血单个核细胞；
(b)使并入重新编程转录因子的外周血单个核细胞生长为多能干细胞。
28.权利要求27的方法，其中所述外周血单个核细胞是γδ T-细胞。
29.权利要求27或28的方法，其中所述方法进一步包括在将重新编程转录因子并入γδT-细胞之前，在氨基-双膦酸和白介素2(IL2)的存在下扩增外周血细胞。
30.权利要求29的方法，其中所述氨基-双膦酸是唑来膦酸或其盐。
31.权利要求28-30中任一项的方法，其中所述iPSC包含以TCRG基因构型排列的TCR基因或以TCRD基因构型排列的TCR基因。
32.一种诱导的多能干细胞(iPSC)，其包含以TCRG基因构型排列的TCR基因或以TCRD基因构型排列的TCR基因。
33.一种产生模拟的NK细胞的方法，所述方法包括：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞祖细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将所述先天免疫细胞祖细胞与M-CSF表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。
34.一种产生模拟的γδ T-细胞的方法，所述方法包括：
(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞祖细胞；
(b)在包含干细胞因子(SCF)、Fms-相关的酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、白介素7(IL7)和/或白介素15(IL15)的培养基中将所述先天免疫细胞祖细胞与M-CSF表达缺陷且异位表达Notch配体δ样1(DLL1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；
(c)将所述分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。
35.模拟的NK细胞，其包含表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合，并且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR的细胞。
36.权利要求35的模拟的NK细胞，其中所述细胞不表达CD3。
37.模拟的γδ T-细胞，其包含表达CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、FASL、TRAIL、NKG2A/CD94中的至少一种或其组合，并且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR的细胞。
38.权利要求37的模拟的γδ T-细胞，其中所述模拟的γδ T-细胞包含γδTCR表达。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235105A (zh) * 2020-03-06 2020-06-05 安徽中盛溯源生物科技有限公司 一种从人多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法及应用
CN111849913A (zh) * 2020-07-31 2020-10-30 南京北恒生物科技有限公司 工程化免疫细胞及其用途
CN112513256A (zh) * 2018-07-13 2021-03-16 国立大学法人京都大学 γδT细胞的制造方法
CN112662627A (zh) * 2021-01-19 2021-04-16 上海爱萨尔生物科技有限公司 多能干细胞分化为自然杀伤细胞的培养液及分化方法
CN116042527A (zh) * 2022-09-07 2023-05-02 广州瑞臻再生医学科技有限公司 一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3580332A4 (en) * 2017-02-07 2020-11-25 Agency for Science, Technology And Research METHODS AND KITS FOR GENERATING MIMETIC INBORN IMMUNE CELLS FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
JP2020534822A (ja) 2017-09-15 2020-12-03 キングス・カレッジ・ロンドン 腸管内のガンマデルタｔ細胞を増強するための組成物及び方法
CN109321531A (zh) * 2018-11-03 2019-02-12 上海中溢精准医疗科技有限公司 一种将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法
CN110272871B (zh) * 2019-05-16 2021-08-27 安徽瑞达健康产业有限公司 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用
TW202214844A (zh) * 2020-06-17 2022-04-16 美商健生生物科技公司 用於製造多能幹細胞之材料及方法
CN113440606A (zh) * 2021-06-02 2021-09-28 深圳市罗湖区人民医院 特异性多能干细胞肿瘤疫苗及其制备方法与应用
JPWO2023053994A1 (zh) * 2021-09-29 2023-04-06
CN115261318B (zh) * 2021-09-29 2024-05-28 苏州艾凯利元生物科技有限公司 产生自然杀伤细胞的方法
KR20230105166A (ko) * 2022-01-03 2023-07-11 주식회사 이뮤노맥스 감마-델타 t 세포의 증식 배양 방법

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003111595A (ja) * 2001-06-25 2003-04-15 Kyogo Ito 腫瘍抗原
CN1791433A (zh) * 2003-03-24 2006-06-21 斯克里普斯研究学院 抗肿瘤生长的dna疫苗及其使用方法
US7749760B2 (en) * 2008-07-10 2010-07-06 Hyogo College Of Medicine Vγ9Vδ2 T cell proliferation agent, method for producing activated Vγ9Vδ2 T cells, and uses thereof
US20130078226A1 (en) * 2010-02-03 2013-03-28 The University Of Tokyo Method for reconstructing immune function using pluripotent stem cells
CN103087991A (zh) * 2009-06-05 2013-05-08 细胞动力国际有限公司 重编程t细胞和造血细胞的方法
US20130287751A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-31 Dan S. Kaufman Method for developing natural killer cells from stem cells
WO2016123100A1 (en) * 2015-01-26 2016-08-04 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
CN108473961A (zh) * 2015-11-04 2018-08-31 菲特治疗公司 用于诱导造血细胞分化的方法和组合物
JP7092281B2 (ja) * 2017-02-07 2022-06-28 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 多能性幹細胞から模倣自然免疫細胞を生成する方法及びキット

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2006006720A1 (ja) 2004-07-13 2008-05-01 株式会社メディネット γδＴ細胞の培養方法、γδＴ細胞及び治療・予防剤
US8945922B2 (en) * 2008-09-08 2015-02-03 Riken Generating a mature NKT cell from a reprogrammed somatic cell with a T-cell antigen receptor α-chain region rearranged to uniform Va-Ja in a NKT-cell specific way
WO2010051634A1 (en) * 2008-11-07 2010-05-14 Sunnybrook Health Sciences Centre Human progenitor t-cells
US8518397B2 (en) * 2009-08-14 2013-08-27 Case Western Reserve University Notch induced natural killer cell generation and therapeutic uses
GB201013767D0 (en) * 2010-08-17 2010-09-29 Isis Innovation Identification of ligands and their use
EP2853590B1 (en) 2012-05-22 2018-11-07 The University of Tokyo Method for producing antigen-specific t cells
WO2016205680A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 The Uab Research Foundation Crispr/cas9 complex for introducing a functional polypeptide into cells of blood cell lineage
US20180362927A1 (en) * 2015-12-08 2018-12-20 Bryce R. BKAZAR Human t cell derived from t cell-derived induced pluripotent stem cell and methods of making and using
US20200017837A1 (en) 2017-02-03 2020-01-16 National University Corporation Kobe University Method For Producing Induced Pluripotent Stem Cells

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003111595A (ja) * 2001-06-25 2003-04-15 Kyogo Ito 腫瘍抗原
CN1791433A (zh) * 2003-03-24 2006-06-21 斯克里普斯研究学院 抗肿瘤生长的dna疫苗及其使用方法
US7749760B2 (en) * 2008-07-10 2010-07-06 Hyogo College Of Medicine Vγ9Vδ2 T cell proliferation agent, method for producing activated Vγ9Vδ2 T cells, and uses thereof
CN103087991A (zh) * 2009-06-05 2013-05-08 细胞动力国际有限公司 重编程t细胞和造血细胞的方法
US20130078226A1 (en) * 2010-02-03 2013-03-28 The University Of Tokyo Method for reconstructing immune function using pluripotent stem cells
US20130287751A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-31 Dan S. Kaufman Method for developing natural killer cells from stem cells
WO2016123100A1 (en) * 2015-01-26 2016-08-04 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
CN108473961A (zh) * 2015-11-04 2018-08-31 菲特治疗公司 用于诱导造血细胞分化的方法和组合物
JP7092281B2 (ja) * 2017-02-07 2022-06-28 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 多能性幹細胞から模倣自然免疫細胞を生成する方法及びキット

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRANK TIMMERMANS等: "Generation of T Cells from Human Embryonic Stem Cell-Derived Hematopoietic Zones", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *
FRANK TIMMERMANS等: "Generation of T Cells from Human Embryonic Stem Cell-Derived Hematopoietic Zones", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》, vol. 182, no. 11, 1 June 2009 (2009-06-01), pages 6879 - 6888 *
RAUL VIZCARDO等: "Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells", 《CELL STEM CELL》 *
RAUL VIZCARDO等: "Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells", 《CELL STEM CELL》, vol. 12, no. 1, 3 January 2013 (2013-01-03), pages 31 - 36, XP055240588, DOI: 10.1016/j.stem.2012.12.006 *
ROSE C. BECK等: "The Notch ligands Jagged2, Delta1,and Delta4 induce differentiation and expansion of functional human NK cells from CD34+ cord blood hematopoietic progenitor cells", 《BIOL BLOOD MARROW TRANSPLANT》 *
ROSE C. BECK等: "The Notch ligands Jagged2, Delta1,and Delta4 induce differentiation and expansion of functional human NK cells from CD34+ cord blood hematopoietic progenitor cells", 《BIOL BLOOD MARROW TRANSPLANT》, vol. 15, no. 9, 30 September 2009 (2009-09-30), pages 1026 - 1037, XP055534933, DOI: 10.1016/j.bbmt.2009.06.002 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112513256A (zh) * 2018-07-13 2021-03-16 国立大学法人京都大学 γδT细胞的制造方法
CN111235105A (zh) * 2020-03-06 2020-06-05 安徽中盛溯源生物科技有限公司 一种从人多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法及应用
CN111849913A (zh) * 2020-07-31 2020-10-30 南京北恒生物科技有限公司 工程化免疫细胞及其用途
CN111849913B (zh) * 2020-07-31 2021-05-25 南京北恒生物科技有限公司 工程化免疫细胞及其用途
CN112662627A (zh) * 2021-01-19 2021-04-16 上海爱萨尔生物科技有限公司 多能干细胞分化为自然杀伤细胞的培养液及分化方法
CN116042527A (zh) * 2022-09-07 2023-05-02 广州瑞臻再生医学科技有限公司 一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用
CN116042527B (zh) * 2022-09-07 2023-08-22 广州瑞臻再生医学科技有限公司 一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用

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