CN116042527B - 一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用，属于细胞技术领域。本发明提供一种促进NK细胞分化的方法，利用基因编辑技术在人类iPS细胞CD45基因座的特定位置敲入有利于向NK细胞分化的组合基因。这个组合基因伴随CD45的表达而表达，并发挥功能，例如膜结合型超级白细胞介素15(mbIL15s)基因。本发明通过构建造血祖细胞阶段特定表达增强mbIL15s的iPS细胞系，从而达到更好的维持基因修饰后的iPSC性能，减少NK分化早期iPSC‑EB阶段IL15干扰，同时提供mbIL15s促进造血祖细胞开始的NK分化与成熟的三重目标。

Description

一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞在癌症治疗中的作用已被广泛证明。研究表明，供体自身NK细胞可以抑制异体基因造血干细胞移植后白血病治疗的复发，更重要的是同种异体NK细胞的输注已被证明能诱导和/或维持急性髓系白血病(AML)的缓解。与T细胞相反，同种异体NK细胞不会发生移植物抗宿主病，这个特点结合NK细胞的广谱抗癌活性，使NK细胞疗法成为一种新兴的免疫细胞肿瘤治疗选择。然而该疗法的一大瓶颈是如何获得足够治疗的均一性高的NK细胞。在人体中，NK细胞占循环淋巴细胞的8-20％，含量较低(相比T细胞60％以上的比例)，分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。考虑到个体成熟NK细胞之间还存在亚型差异，依靠人体外周血提取NK细胞很难满足临床治疗对免疫细胞生产的稳定性与均一性要求。
2006年日本科学家山中伸弥在世界著名学术期刊《细胞》上率先发表了关于成功制备诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，简称iPS细胞)的技术方法，并在2012年凭借此技术获得了诺贝尔生理医学奖。具体来说，iPSC技术利用特定的转录因子，可以将终末分化的体细胞(如外周血细胞、尿液细胞、皮肤细胞等)逆转为具有亚全能性的干细胞，即诱导性多能干细胞，这一逆转的过程即为细胞的重编程(Cell reprogramming)。由于iPS细胞具有与胚胎干细胞类似的亚全能性，具有在体外无限增殖的能力，并且可以分化为人体多种组织和器官细胞，如神经元、胶质细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、免疫细胞等，从而解决了细胞来源的问题，理论上可以在体外大量扩增并向特定组织细胞定向分化、获取足够数量和具有特定功能的细胞。十多年来科学家改进了体外分化的方法，开发了大量制备难以获取、难以扩增的特殊类型细胞的技术，同时为研究相关疾病的机制提供了全新平台。从iPS细胞体外分化为有功能的NK细胞(iNK)，为iNK细胞治疗多种疾病提供了可能的技术方法，并在将来进行临床转化用于肿瘤的治疗。
NK细胞的发育，存活和增殖需要细胞因子的刺激作用。其中细胞因子白细胞介素15(IL-15)在造血干细胞分化为NK细胞过程中对NK细胞的成熟至关重要。目前由iPSC分化制备NK细胞的方法中激活IL15通路信号主要有两种方法：1.分化过程中人为添加细胞因子IL15以促进NK细胞的成熟；2.通过基因修饰将IL15敲入iPSC中，通过细胞自身表达的IL15来提供NK细胞成熟过程所需的IL15刺激信号。但是，人为添加细胞因子IL15的方法大大增加了分化制备NK细胞的成本，并且人工生产的IL15因子不同厂商，不同批次以及运输使用过程等的差异和变动容易导致分化制备NK细胞的质量浮动，不利于工业化临床生产的稳定性保障。现有技术中的IL15敲入iPSC的技术是通过病毒转染(随机插入IL15基因)或者基因编辑将IL5敲入至人类基因组的特定位置来实现的。而病毒转染的方法中IL15是随机插入基因组，可能会带来其他基因位点由于插入造成基因激活或沉默，引发安全性风险，不利于临床应用；在AAVS1等安全基因座编辑敲入的IL15是从iPSC阶段就持续表达IL15因子，而IL15在iPSC和分化早期阶段会影响细胞的存活和分化能力。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用。本发明构建造血祖细胞阶段特定表达增强mbIL15s的iPS细胞系(HSC-state-specific mbIL15-iPSC)，能够更好的维持基因修饰后的iPSC性能，减少NK分化早期iPSC-EB阶段IL15干扰，同时提供mbIL15s促进造血祖细胞开始的NK分化与成熟的三重目标。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种促进NK细胞分化的方法，CD45基因座的特定位置敲入促进NK细胞分化的组合基因；所述组合基因包括膜结合型超级白细胞介素15。
本发明选择造血祖细胞的特异性标志物CD45，通过基因编辑技术将组合基因敲入CD45基因的特定位置，使得组合基因的表达受到CD45调控区的影响，在iPSC到拟胚体EB阶段不表达IL15，避免其对iPSC本身活力和分化潜能的影响，只从造血祖细胞开始到NK成熟整个阶段高度表达mbIL15促进NK细胞的成熟。需要说明的是，iPS细胞技术由于不涉及胚胎细胞或卵细胞的使用，因此不存在伦理问题。
作为本发明所述的促进NK细胞分化的方法的优选实施方式，基因敲入区域为CD45基因座的3’UTR区。
作为本发明所述的促进NK细胞分化的方法的优选实施方式，所述敲入为对CD45基因座的特定位置的特定DNA序列进行剪切，产生DNA缺口，iPS细胞启动同源和非同源基因重组DNA修复过程；所述基因编辑技术包括但不限于CRISPR-CAS技术、TALEN技术和ZFN技术。
作为本发明所述的促进NK细胞分化的方法的优选实施方式，所述重组DNA的同源臂为CD45终止密码子“TAG”前700nt和后700nt的DNA序列。
作为本发明所述的促进NK细胞分化的方法的优选实施方式，所述膜结合型超级IL15包括CD8A信号肽、膜结合型IL15、CD8A的铰链区和跨膜区；所述膜结合型超级白细胞介素15与CD45基因之间通过P2A连接。
本发明在iPS细胞中基因编辑敲入时空特异性表达的膜结合增强型IL15，膜结合型mbIL15由CD8A信号肽、膜结合型IL15(N72D)(超级IL15)、CD8A的铰链区(Hinge)和跨膜区(TM)组成。在CD45-3’UTR区敲入此mbIL15功能基因，使得此增强型mbIL15只在造血干细胞阶段随着CD45的表达开始表达，而在iPSC阶段和分化早期EB拟胚体阶段不表达，达到时空特异得表达膜结合增强型IL15的目的。这种时空特异性表达方法即避免了mbIL15对iPSC本身存活能力和其早期分化潜能的影响，又促进了iPSC来源的造血干细胞向自然杀伤细胞NK的分化成熟。N72D突变的超级IL15和其受体IL15Rα的结合能力增强其激活IL15信号通路能力更高，进一步加强对NK细胞成熟的作用。
作为本发明所述的促进NK细胞分化的方法的优选实施方式，所述膜结合型IL15为含有N72D突变的增强型IL15片段。
现有技术中在AAVS1等安全基因座编辑敲入的IL15片段有几种策略：(1)野生型IL15是分泌型细胞因子，被分泌到培养基中。由于IL15对NK细胞的促分化作用需要它和NK细胞上的IL15受体结合形成IL-15Rα–IL-15复合体起作用，因此分泌型IL15促分化作用受限。(2)膜融合mbIL15，在IL15肽段前后加上膜蛋白CD8的信号肽和铰链与跨膜区肽段，从而使得敲入基因表达的IL15定位在细胞膜上。本发明设计敲入的IL15片段是包含膜蛋白CD8的信号肽和铰链与跨膜区肽段的膜融合IL15。另外本发明采用了一个IL15特异突变N72D(asushi domain to increase transpresentation)设计出增强型IL15片段，IL-15N72D特异的增强其与受体IL15Rβγ链的结合能力而不广泛影响IL15的其他功能。因此本发明提供了一个定位于细胞膜的加强型IL15(mbIL15s)，可以为NK细胞的分化成熟提供更强的IL15刺激信号。
作为本发明所述的促进NK细胞分化的方法的优选实施方式，所述膜结合型超级IL15编码序列mbIL15s的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
作为本发明所述的促进NK细胞分化的方法的优选实施方式，所述的CRISPR-CAS技术包括靶向人类CD45基因特定位置的短核苷酸序列；所述短核苷酸序列如SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:12任意一条序列所示。
本发明还提供一种细胞或其群体，采用所述促进NK细胞分化的方法制备得到；所述细胞包括诱导性多能细胞或由其衍生NK细胞，并且与所述细胞的从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的天然对应细胞相比具有以下(a)～(b)中的至少一种特性：
(a)降低iPSC分化制备免疫细胞过程中外源IL15的添加量；
(b)提高分化得到的免疫细胞的持久性和/或存活率。
本发明还提供所述的细胞或其群体在制备NK细胞中的应用。
本发明的有益效果为：本发明提供一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用。本发明构建造血祖细胞阶段特定表达增强mbIL15的iPS细胞系(HSC-state-specific mbIL15-iPSC)，从而达到更好的维持基因修饰后的iPSC性能，减少NK分化早期iPSC-EB阶段IL15的干扰，同时提供mbIL15促进造血祖细胞开始的NK分化与成熟的三重目标；本发明选择造血祖细胞的特异性标志物CD45，通过CRISPR-CAS9技术将mbIL15敲入CD45基因的特定位置，使得mbIL15的表达受到CD45调控区的影响，在iPSC到拟胚体EB阶段不表达IL15避免其对iPSC本身活力和分化潜能的影响，只从造血祖细胞开始到NK成熟整个阶段高度表达mbIL15促进NK细胞的成熟；本发明敲入的IL15是包含跨膜区和NK特异胞内激活片段，以及N72D突变的增强型IL15片段，这个组合的IL15基因片段表达后会强化IL15对NK细胞成熟的促进作用；IL15N72D和其受体IL15Rβγ链的结合能力增强其激活IL15信号通路能力更高，进一步加强对NK细胞成熟的作用。
附图说明
图1为实施例1的促进NK细胞分化的iPS细胞系的构建流程图；
图2为供体质粒PUC57-CD45-mbIL15s的结构示意图；
图3为gRNA表达载体PX586-CD45-CAS9的结构示意图；
图4为CD45-mbIL15s iPSC的克隆形态图；
图5为野生型细胞和CD45-mbIL15s iPSC分化为成熟NK细胞的过程中不同时间段细胞上IL15的表达流式图；
图6为野生型细胞和CD45-mbIL15s iPSC分化为成熟NK细胞的过程中NK成熟标志物表达流式图。
图7为AAVS1-mbIL15s iPSC和CD45-mbIL15s iPSC分化为CD34阳性造血干细胞的比率。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例提供了一种促进NK细胞分化的iPS细胞系的构建方法，其构建流程图如图1所示，具体步骤如下：
1、供体质粒PUC57-CD45-mbIL15s的构建
1)构建并合成mbIL15s基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
2)将步骤1)的mbIL15s基因构建到供体质粒载体PUC57上，此CD45供体载体含有人CD45的基因座3’-UTR上选取5’同源臂(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)和3’CD45同源臂(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)以及自剪切多肽P2A的编码序列(其核苷酸序列如SEQID NO:4所示)，得到携带mbIL15s基因的供体质粒PUC57-CD45-mbIL15s，其结构示意图如图2所示。
2、gRNA表达载体PX586-CD45-CAS9的构建
1)gRNA表达载体PX586-CD45-CAS9包含CAS9酶和CD45的sgRNA序列，设计如下8条均能用以完成在CD45终止密码子之后进行剪切的目的sgRNA，具体序列见表1。
表1
编号 对应序列编号 序列
sgRNA1 SEQ ID NO:5 5’-ATAGGAAAAGACATAAATGAGG-3’
sgRNA2 SEQ ID NO:6 5’-AGCTTTAAATCAAGGTTCATAGG-3’
sgRNA3 SEQ ID NO:7 5’-TAGAAATAACAGCTAACAGGAGG-3’
sgRNA4 SEQ ID NO:8 5’-CATAGGAAAAGACATAAATGAGG-3’
sgRNA5 SEQ ID NO:9 5’-ATAACAGCTAACAGGAGGTTTGG-3’
sgRNA6 SEQ ID NO:10 5’-TAGAAATAACAGCTAACAGGAGG-3’
sgRNA7 SEQ ID NO:11 5’-AAATAGAAATAACAGCTAACAGG-3’
sgRNA8 SEQ ID NO:12 5’-ATTTCTATTTTTGTAGAAGTAGG-3’
2)本实施例选取sgRNA1和sgRNA2与启动子U6和gRNA scaffold组合构建到CAS9酶质粒载体PX586上，得所述gRNA表达载体PX586-CD45-CAS9，其结构示意图如图3所示，此载体含有Blasticidi序列，后续用于转染细胞阳性克隆的挑选。
3、培养人多能干细胞达到90％左右汇合度后，用Accutase酶将iPS细胞消化成单细胞，利用脂质体转染的方法将上述的供体质粒PUC57-CD45-mbIL15s和gRNA表达载体PX586-CD45-CAS9混合转染人多能干细胞；转染后用Puromycin(嘌呤霉素)进行初步筛选，再将细胞消化下来，以有限稀释法将细胞种于96孔细胞培养板中，待细胞长成克隆后，用PCR后电泳的方法筛选出正确插入mbIL15的细胞克隆，然后将PCR阳性的克隆PCR产物进行Sanger测序，验证插入的mbIL15序列及其插入位点两端的CD45基因组序列。最终将PCR电泳和Sanger测序都正确的阳性克隆扩增并冻存。
其中采用PCR进行筛选的引物为：RG0198F:5-atgcttgctatgtgctcttgct-3；RG0201R:5-ATTACATTCACCCAGTTGGCTTC-3，RG0198F在5端同源臂外，RG0201R在mbIL15s上，扩增长度986bp。
构建的CD45-mbIL15s iPSC的克隆形态图如图4所示。
Sanger测序得到的序列如SEQ ID NO:13所示。
实施例2
1、本实施例将实施例1制备得到的iPS细胞分化制备成熟的NK细胞，并检测分化过程的不同时间段CD45-mbIL15s细胞上IL15的表达情况，其中分化的第14天为CD45低表达阶段；分化的第22天为CD45高表达阶段。具体实验方法如下：
(1)诱导培养人多能干细胞分化形成拟胚体(EB)，使所述拟胚体分化为造血前体细胞，从所述造血前体细胞中分离CD34+造血前体细胞；
(2)添加多种细胞因子(包括IL15)诱导CD34+造血前体细胞向NK细胞定向分化，分化成NK细胞。
细胞流式实验结果如图5所示。由图5可以看出，野生型细胞两阶段均没有IL15的表达；基因修饰的CD45-mbIL15s细胞在早期14天阶段没有检出的IL15，而只在NK分化的晚期22天阶段才检出有IL15的表达。由此说明构建的CD45-mbIL15s iPS细胞在其分化为NK细胞过程中，早期iPSC阶段与EB阶段没有IL15的表达，在进入造血干细胞之后的分化晚期才有IL15的表达，该基因修饰iPSC达到的控制IL15时间表达的目标。
实施例3
本实施例采用实施例2的分化方法将野生型wildtype iPSC和实施例1制备的CD45-mbIL15s iPSC分化为成熟NK细胞，其中wildtype iPSC按照标准NK分化方法添加全部细胞因子，而CD45-mbIL15s iPSC在分化过程中不添加细胞因子IL15。采用流式细胞检测两种细胞的分化情况。
实验结果如图6所示。由图6可知，未人工添加IL15细胞因子的CD45-mbIL15s iPSC可以发育为成熟的NK细胞，其中NK细胞关键标志物CD56阳性的细胞达到80％以上，NK细胞成熟标志物NKG2D，KIR的阳性率高于80％，水平与野生型iSPC在有人工添加IL15作用下的分化效率相近；NK成熟标志物CD16，CD2，CD94和NKp46的阳性率在10％-20％左右，这些结果共同说明CD45-mbIL15s iPSC在NK分化过程中不人为添加IL15也能发育为成熟的NK细胞。
本实施例最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例4
本实施例采用实施例2中的分化方法，将全细胞周期表达mbIL15s的AAVS1-mbIL15s-iPSC和实施例1制备的只在造血祖细胞阶段之后才开始表达mbIL15s的CD45-mbIL15s-iPSC分化制备NK细胞。检测两种iPS细胞在分化形成拟胚体(EB)阶段时发育产生的造血前体细胞的CD34阳性率，以比较iPSC阶段表达mbIL15s对iPS细胞分化为NK细胞能力的影响。
实验结果如图7所示。由图7可知，iPSC阶段就开始表达mbIL15s的AAVS1-mbIL15s-iPSC其分化造血前体细胞的CD34阳性率只有20％左右，而在iPSC阶段不表达mbIL15s的CD45-mbIL15s-iPSC其分化造血前体细胞的CD34阳性率超过60％，差异巨大。该结果说明虽然IL15作为促分化因子在iPSC发育为NK细胞过程不可或缺，但是在分化早期阶段(造血祖细胞产生之前)IL15会影响iPSC的分化潜力，减少CD34阳性造血前提细胞的产生。因此，在CD45基因座上敲入mbIL15s，控制IL15因子在造血祖细胞阶段才开始表达，避免IL15对iPSC分化早期的影响，将显著提高iPSC分化为成熟NK细胞的效率。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种促进NK细胞分化的方法，其特征在于，利用基因编辑技术在人类iPS细胞CD45基因座的3’UTR区敲入促进NK细胞分化的组合基因；所述组合基因包括膜结合型超级白细胞介素15；所述膜结合型超级白细胞介素15包括CD8A信号肽、膜结合型IL15、CD8A的铰链区和跨膜区；所述膜结合型超级白细胞介素15与CD45基因之间通过P2A连接；所述膜结合型IL15为含有N72D突变的增强型IL15片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述敲入为对CD45基因座的特定DNA序列进行剪切，产生DNA缺口，iPS细胞启动同源和非同源基因重组DNA修复过程；所述基因编辑技术包括但不限于CRISPR-CAS技术、TALEN技术和ZFN技术。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组DNA修复过程的同源臂序列来源于CD45终止密码子“TAG”前700nt和后700nt的DNA序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜结合型超级IL15编码序列mbIL15s的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的CRISPR-CAS技术包括靶向人类CD45基因特定位置的短核苷酸序列；所述短核苷酸序列如SEQ ID NO:5~SEQ ID NO:12任意一条序列所示。
6.一种细胞或其群体，其特征在于，采用权利要求1~5任一项所述的方法制备得到；所述细胞包括诱导性多能细胞或由其衍生NK细胞，并且与所述细胞的从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的天然对应细胞相比具有以下（a）~（b）中的至少一种特性：
（a）降低iPSC分化制备免疫细胞过程中外源IL15的添加量；
（b）提高分化得到的免疫细胞的持久性和/或存活率。
7.权利要求6所述的细胞或其群体在制备NK细胞中的应用。
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