CN117603975A - 一种永生化细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种永生化细胞系及其构建方法和应用，具体是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对猪肌肉干细胞进行CDKN2A基因敲除，经过单克隆筛选及基因型鉴定得到CDKN2A单敲成功的细胞株，随后在已成功敲除CDKN2A基因的永生化细胞株上再次敲除MSTN基因，经单克隆筛选及基因型鉴定得到双敲成功的细胞株。经验证表明CDKN2A单敲除及CDKN2A联合MSTN双敲除的猪肌肉干细胞系可在体外长时间传代培养且能够维持良好的分化特性。本发明创制了可食用动物来源的永生化肌肉干细胞系，为培养肉生产以及工艺参数研究提供优良的细胞资源。

Description

一种永生化细胞系及其构建方法和应用
技术领域
本申请属于干细胞及细胞培养肉技术领域，具体涉及一种永生化细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
肌肉干细胞又称为卫星细胞(Satellite cells，SCs)，具有自我更新和分化为成熟肌肉细胞的能力，是肌肉再生的具体执行者。肌肉干细胞通常保持静息状态，而当肌肉受到损伤等外界刺激时，肌肉干细胞能够迅速响应环境改变进入激活状态，并分化为有功能的肌肉细胞，进而修复损伤部位。培养肉就是依据这种修复机制，在体外培养肌肉干细胞从而获得的肉类。培养肉，又称细胞培养肉、清洁肉、人造肉等，是根据肌肉组织的生长发育特点及损伤修复机理，在体外分离、培养并诱导分化种子细胞以获得肌纤维、胶原蛋白和/或脂肪等，再经食品加工、塑性等过程制备而成的可以食用的肉制品。与传统养殖方式相比，细胞培养肉的生产过程不涉及大批量养殖和屠宰，生产方式也更加安全，因此在动物福利、食品安全和环境保护方面有独特优势。
种子细胞是培养肉生产的关键材料，合适的种子细胞需要具备高效的增殖能力及分化能力，但一般细胞在长期培养过程中其增殖能力会逐渐减弱，主要原因是染色体端粒随着DNA的复制而缩短，反复缩短使端粒受到损伤，从而使细胞进入衰老状态。原代细胞经历有限数量的分裂即到达衰老阶段，只能短暂的用于培养肉生产，这使得培养肉的工业化规模生产变得困难。因此，进行原代细胞永生化的研究变得尤为重要。
细胞永生化，是指在体外培养的细胞自发或者受到外界因素影响后逃离衰老等因素导致的增殖抑制，从而能够无限增殖。永生化细胞比原代细胞生长更加强劲、更易于培养，而且其稳定均一、性状一致。目前报道的针对肌肉干细胞的永生化主要集中在使其在体外获得长期传代的能力，但其分化能力是否提高鲜有报道。然而，细胞增殖能力和分化潜能是种子细胞应用在培养肉上非常重要的两个方面。
p14ARF和p16 INK4A(p16)是一种重要的周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKIs)，在哺乳动物中由CDKN2A基因编码。细胞周期从一个阶段到另一个阶段的进展主要由细胞周期蛋白控制。细胞周期蛋白是细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)的辅因子，细胞周期蛋白与CDKs结合并激活它们，从而增强细胞周期进程。而p16通过抑制CDKs进而抑制和调节细胞周期进程。作为一种细胞周期抑制基因抑制因子，研究表明p16缺失会促进细胞增殖，诱导细胞永生化。例如，使CDKN2A位点失活并同时异位表达hTERT可建立永生化的前列腺上皮细胞系。此外，通过HPV-16E7灭活p16 INK4a/pRb通路或下调p16 INK4A表达并激活端粒酶可使细胞永生化。但是这种永生化的方法往往需要结合其他外源基因的表达或者病毒基因的引入，存在基因安全风险。特别的，虽然已有研究证明通过CDKN2A基因敲除可实现细胞的永生化，但是CDKN2A基因敲除后往往会导致细胞分化潜能的丧失。因此通过p16敲除的方式构建猪肌肉干细胞永生化细胞系，在能够维持较好增殖的情况下是否能够同时维持较好的细胞分化特性仍未可知。
肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)又称生长分化因子-8(GDF-8)，是TGF-β超家族的成员。MSTN是肌肉生长的负调控因子，通过调控细胞周期抑制肌肉生长。MSTN在G1期的表达量最高，可下调CDK2的表达水平，降低Cyclin E和CDK2复合物的形成。也可以上调CKIs活性和水平，阻碍MyoD丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化，使其不能释放G1期向S期的基本转录因子，抑制成肌细胞增殖，阻碍肌肉生成。此外通过受体介导的方式也可以抑制肌肉生长，如激活SMAD信号通路、激活MAPKs通路、抑制Akt通路等。
发明内容
1.发明目的
本申请的目的是提供一种永生化细胞系及其构建方法和应用，尤其是猪肌肉干细胞永生化细胞系，包括利用CRISPR-Cas9敲除技术构建CDKN2A基因单敲除及CDKN2A联合MSTN基因双敲除的细胞系，并筛选出具有持续增殖能力的同时具有良好分化性能的优良细胞系，获得高增殖速率且维持细胞干性的永生化猪肌肉干细胞系，解决原代肌肉干细胞体外扩增过程中增殖能力下降和分化能力丧失或CDKN2A基因敲除导致细胞丧失分化潜能的问题，为培养肉产业化和工艺优化提供优质种子细胞资源。
2.技术方案
为了解决上述问题，本申请所采用的技术方案如下：
本申请提供了包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列的gRNA：
CDKN2A gRNA-3 F1：5-CACCGTCGTGTACCGGTCGGGTGA-3(SEQ ID NO.7)；
CDKN2A gRNA-3 R1：5-AAACTCACCCGACCGGTACACGAC-3(SEQ ID NO.8)。
本申请还提供了上述gRNA在利用CRISPR-Cas9系统敲低或敲除细胞中CDKN2A基因中的应用。
本申请还提供了包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列的gRNA：
MSTN gRNA-3 F3：5-CACCGTAGGACTACTTACACTCTGT-3(SEQ ID NO.25)；
MSTN gRNA-3 R3：5-AAACACAGAGTGTAAGTAGTCCTAC-3(SEQ ID NO.26)。
本申请还提供了上述gRNA在利用CRISPR-Cas9系统敲低或敲除细胞中MSTN基因中的应用。
本申请还提供了一种永生化细胞系的构建方法，包括降低或者消除原代细胞中p16蛋白的表达，获得的永生化细胞系提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。
进一步地，上述一种永生化细胞系的构建方法，还包括同时降低或者消除细胞中MSTN蛋白的表达，获得的永生化细胞系提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。
进一步地，上述降低或者消除原代细胞中p16蛋白的表达包括敲低或敲除CDKN2A基因。
进一步地，CDKN2A基因如Gene ID:396553所示。
进一步地，上述降低或者消除细胞中MSTN蛋白的表达包括敲低或敲除MSTN基因。
进一步地，MSTN基因如Gene ID:399534所示。
进一步地，上述敲低或敲除包括利用CRISPR/Cas系统敲低或敲除CDKN2A基因和/或MSTN基因。
进一步地，上述利用CRISPR/Cas系统敲低或敲除CDKN2A基因和/或MSTN基因包括设计靶向CDKN2A基因或MSTN基因的gRNA，该gRNA能够与CDKN2A基因和/或MSTN基因中靶序列互补。
进一步地，上述CDKN2A基因中的靶序列为CDKN2A基因的外显子2中的片段。更进一步地，上述CDKN2A基因中的靶序列为GTCGTGTACCGGTCGGGTGA(SEQ ID NO.1)。
进一步地，上述MSTN基因中的靶序列为MSTN基因的外显子1中的片段。更进一步地，上述MSTN基因中的靶序列为TAGGACTACTTACACTCTGTAGG(SEQ ID NO.2)。
进一步地，上述CRISPR系统包括CRISPR-Cas9系统或CRISPR-Cas13系统。
进一步地，上述CRISPR系统包括CRISPR-Cas9系统。
进一步地，上述利用CRISPR-Cas9系统敲低或敲除CDKN2A基因中的gRNA包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列：
CDKN2A gRNA-3 F1：5-CACCGTCGTGTACCGGTCGGGTGA-3(SEQ ID NO.7)；
CDKN2A gRNA-3 R1：5-AAACTCACCCGACCGGTACACGAC-3(SEQ ID NO.8)。
进一步地，上述利用CRISPR-Cas9系统敲低或敲除MSTN基因中的gRNA包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列：
MSTN gRNA-3 F3：5-CACCGTAGGACTACTTACACTCTGT-3(SEQ ID NO.25)；
MSTN gRNA-3 R3：5-AAACACAGAGTGTAAGTAGTCCTAC-3(SEQ ID NO.26)。
进一步地，上述原代细胞包括肌肉干细胞、脂肪间充质干细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及经过修饰的肌肉干细胞、脂肪间充质干细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等细胞。
进一步地，上述原代细胞包括肌肉干细胞。
进一步地，上述肌肉干细胞包括来源于猪、牛、羊、鱼或其他家禽的肌肉干细胞。更进一步地，上述肌肉干细胞来源于猪，即猪肌肉干细胞。
本申请还提供了上述一种永生化细胞系的构建方法构建的永生化细胞系，该永生化细胞系提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。
本申请还提供了一种永生化细胞系，该永生化细胞系中p16蛋白降低或者消除表达，提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。
进一步地，上述一种永生化细胞系，还包括MSTN蛋白降低或者消除表达。
进一步地，上述一种永生化细胞系，包括被破坏的CDKN2A基因和/或被破坏的MSTN基因。
进一步地，上述被破坏的CDKN2A基因包括内源性CDKN2A基因的敲低或敲除。
进一步地，上述被破坏的MSTN基因为内源性MSTN基因的敲低或敲除。
进一步地，上述一种永生化细胞系包括肌肉干细胞永生化细胞系。
进一步地，上述肌肉干细胞包括来源于猪、牛、羊、鱼或其他家禽的肌肉干细胞。更进一步地，上述肌肉干细胞来源于猪，即猪肌肉干细胞。
本申请还提供了一种猪肌肉干细胞永生化细胞系，命名为幼猪肌肉干细胞株SCCDKN2A KO-15，于2022年12月7日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2022371。
本申请还提供了一种猪肌肉干细胞永生化细胞系，命名为幼猪肌肉干细胞株SCCDKN2A-MSTN dKO Clone1，于2023年2月26日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C202347。
本申请还提供了上述一种猪肌肉干细胞永生化细胞系在制备膳食消费品中的应用。
进一步地，上述膳食消费品包括细胞培养肉。
进一步地，上述应用包括在体外培养基中培养上述永生化细胞系，增殖、诱导分化后制备成细胞培养肉。
进一步地，上述应用中，体外培养基包括无血清培养基。
本申请还提供了一种细胞培养肉产品，包括上述永生化细胞系。
3.有益效果
本申请与现有技术相比，其有益效果在于：
(1)本申请提供的gRNA，能够针对性的与CDKN2A基因或MSTN基因中靶序列互补，用于CRISPR-Cas9系统敲低或敲除细胞中CDKN2A基因或MSTN基因，用于构建高增殖速率和/或维持细胞干性的永生化细胞系。
(2)本申请提供的永生化细胞系的构建方法，首次使用CRISPR-Cas系统在猪原代肌肉干细胞中敲除CDKN2A基因建立了永生化细胞系，并在已敲除CDKN2A基因的猪肌肉干细胞永生化细胞系上成功敲除了MSTN基因，建立了CDKN2A联合MSTN双敲除猪肌肉干细胞永生化细胞系，该方法操作简便，无外源基因插入，构建的细胞系在维持细胞高效增殖的同时也提高了分化潜能。
(3)本申请提供的猪肌肉干细胞永生化细胞系，无外源基因插入，在维持细胞高效增殖的同时也提高了分化潜能。除此之外，该细胞系在无血清增殖培养基和无血清分化培养基中能够维持较好的增殖及分化能力，可以利用完整的无血清培养基系统完成增殖和分化，克服了现有技术中在增殖和分化阶段需要至少一个含血清培养基的技术问题。该细胞系能够为培养肉生产的各种工艺参数研究提供工程化细胞，也能为培养肉生产贡献优良的细胞资源。
附图说明
图1是用于构建CDKN2A基因敲除的质粒lentiCRISPR v2载体的图谱。
图2是SCs生长至75～85％汇合状态。
图3是SCs单敲CDKN2A基因后群体细胞进行T7内切酶验证结果图。
图4是药筛完成后SCs单敲CDKN2A基因后群体细胞。
图5是SCs单敲CDKN2A基因后单克隆基因型鉴定结果图。
图6是SCs单敲CDKN2A基因后不同单克隆细胞成肌因子表达情况。
图7是SCs单敲CDKN2A基因后单克隆细胞使用不同增殖培养基培养后成肌因子表达情况。
图8是SCs单敲CDKN2A基因后不同单克隆细胞增殖倍数。
图9是SCs单敲CDKN2A基因后单克隆细胞使用不同增殖培养基培养后增殖倍数。
图10是SCs单敲CDKN2A基因后不同单克隆细胞使用含血清分化培养基诱导分化情况。
图11是SCs单敲CDKN2A基因后单克隆细胞使用低血清分化培养基和无血清分化培养基诱导分化情况。
图12是用于构建MSTN敲除质粒pSpCas9(BB)-2A-Pμro(PX459)图谱。
图13是SCs双敲CDKN2A-MSTN基因后群体细胞转染D7荧光效率图。
图14是SCs双敲CDKN2A-MSTN基因后单克隆基因型鉴定结果图。
图15是SCs双敲CDKN2A-MSTN基因后不同单克隆细胞在含血清增殖培养基中成肌因子表达情况。
图16是SCs双敲CDKN2A-MSTN基因后不同单克隆细胞在含血清增殖培养基中的增殖倍数。
图17是SCs双敲CDKN2A-MSTN基因后不同单克隆细胞在无血清增殖培养基中成肌因子表达情况。
图18是SCs双敲CDKN2A-MSTN基因后不同单克隆细胞在无血清增殖培养基中的增殖倍数。
图19是SCs双敲CDKN2A-MSTN基因后不同单克隆细胞在含血清分化培养基中诱导分化情况(qPCR检测)。
图20是SCs双敲CDKN2A-MSTN基因后不同单克隆细胞在含血清分化培养基中诱导分化情况(免疫荧光检测)。
图21是SCs双敲CDKN2A-MSTN基因后不同单克隆细胞在无血清成肌分化培养基中诱导分化情况(免疫荧光检测)。
图22是SCs双敲CDKN2A-MSTN基因后不同单克隆细胞在无血清成肌分化培养基中肌管融合率统计。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请进一步进行描述。
需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本申请可实施的范畴。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
本申请所述“SCs”是指猪肌肉干细胞，“永生化猪SCs细胞系”是指永生化猪肌肉干细胞系。
实施例1
本实施例提供一种永生化细胞系的构建方法及其构建的永生化细胞系，包括降低或者消除原代细胞中p16蛋白的表达，利用CRISPR/Cas9系统敲低或敲除CDKN2A基因，获得的永生化细胞系提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。
一种永生化细胞系的构建方法，具体包括如下步骤：
重组载体lentiCRISPR v2-gRNA-CDKN2A的构建：
(1)lentiCRISPR v2载体(addgene52961，图1)，用限制性内切酶BbsI在37℃条件下过夜酶切，使之线性化；酶切体系包括：BbsI 1μl、10×bμffer 4μl、lentiCRISPR v2 5μg，补足ddH2O至40μl。
(2)设计4对靶向敲除猪肌肉干细胞CDKN2A基因的gRNA，序列如下所示：
CDKN2A gRNA-1 F1：5-CACCGGTACACGACGCCGCCAGGG-3(SEQ ID NO.3)，
CDKN2A gRNA-1 R1：5-AAACCCCTGGCGGCGTCGTGTACC-3(SEQ ID NO.4)；
CDKN2A gRNA-2 F1：5-CACCGTGGCGGCGTCGTGTACCGGT-3(SEQ ID NO.5)，
CDKN2A gRNA-2 R1：5-AAACACCGGTACACGACGCCGCCAC-3(SEQ ID NO.6)；
CDKN2A gRNA-3 F1：5-CACCGTCGTGTACCGGTCGGGTGA-3(SEQ ID NO.7)，
CDKN2A gRNA-3 R1：5-AAACTCACCCGACCGGTACACGAC-3(SEQ ID NO.8)；
CDKN2A gRNA-4 F1：5-CACCGCGGCGCAGACCCCAACTGCG-3(SEQ ID NO.9)，
CDKN2A gRNA-4 R1：5-AAACCGCAGTTGGGGTCTGCGCCGC-3(SEQ ID NO.10)。
(3)连接：将设计合成的每对sgRNA-oligo-F，sgRNA-oligo-R引物粉末简短离心后，加ddH2O稀释至100μM；每组sgRNA-oligo-F，sgRNA-oligo-R各取5μl混匀(即ds Oligo浓度50μM)；PCR仪运行退火程序(95℃30s、72℃2min、37℃2min、25℃2min、4℃Hold)；将dsOligo稀释100倍至0.5μM。配制连接体系：线性化PX459载体0.5μl、稀释退火的ds Oligo(0.5μM)3μl、5×T4 DNA ligase buffer 1μl、T4 DNA ligase 0.5μl，16℃过夜连接。
质粒提取及利用脂质体转染方法转染SCs：
(1)将连接好的CDKN2A基因敲除载体，荧光阳性质粒：pLenti CMV GFP Neo，阴性质粒：lentiCRISPR v，四组实验组lentiCRISPR v2+gRNA，分别转化DH5α大肠杆菌，接种于氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃培养过夜；挑菌检测，然后送公司测序。
(2)测序结果与分别质粒图谱序列比对正确后接种在200ml氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养过夜。用去内毒素质粒提取试剂盒提取高浓度质粒，并用0.45μm过滤器过滤后，测定浓度，用于转染的质粒浓度不低于450ng/ml。
(3)待SCs(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022256，保藏日期为2022年8月6日，分类命名为猪肌肉干细胞YP-S4-SC)生长至75～85％汇合状态(图2)后转染，以6孔板为例，转染前30min，换上含15％胎牛血清的DMEM/F12基础培养基(不含双抗)，30min后，PBS漂洗1次后，用0.25％胰蛋白酶(约1ml)37℃消化1～3min，用含有15％胎牛血清的DMEM/F12培养基(不含双抗)终止消化后，330g离心5min，用1ml含有15％胎牛血清的DMEM/F12培养基(不含双抗)重悬细胞。
(4)脂质体转染：预混两个体系，体积各为250μl，管1：外源表达质粒(阳性对照：pLenti CMV GFP Neo，阴性对照：lentiCRISPR v，四组实验组lentiCRISPR v2+gRNA)2μg，P3000 4μl，Opti-MEM补充到250μl；管2：Lipo3000 4μl，Opti-MEM补充到250μl，将两管体系分别用枪轻轻混匀之后，室温静置5min。将管1加入到管2中，轻轻混合均匀，室温静置20min。将SCs接种到6孔板(6×104/孔)中，每孔加入1.5ml换上含15％胎牛血清的DMEM/F12基础培养基(不含双抗)，将混合的体系一滴一滴均匀加到6孔中，轻轻前后左右混匀。
(5)转染约6～8h后，更换含有15％胎牛血清及添加了5ng/ml终浓度重组人成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)的DMEM/F12完全培养基(含双抗)，放置培养箱中继续培养，时常观察细胞状态。
(6)转染24±2小时后，更换完全培养基，让细胞恢复。直至显微镜下观察细胞状态较好，培养基中死细胞较少的时候，更换含有1μg/ml puro的DMEM/F12完全培养基(含双抗)进行药筛，药筛24±8h。
(7)药筛完成后，得到四组转入gRNA的猪SCs群体细胞。
验证及筛选：
(1)对转入4种gRNA的SCs群体细胞中进行T7内切酶实验
转染SCs药筛完成后，将细胞扩大培养；
细胞传代时收取约1×105个细胞，提取SCs基因组DNA；
高保真酶进行PCR扩增。扩增引物如下：
16DNA 1F:TTGCTGTCTGTGACTCTAAC(SEQ ID NO.11)，
16DNA 1R:AACACGCGGAAGTCTATCTT(SEQ ID NO.12)；
PCR结束后使用，电泳检测产物，产物大小正确且单一，纯化PCR产物；
将纯化后的产物进行T7 EndonucleaseI酶切反应，将酶切后的产物使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，最终筛选出gRNA3的酶切效果较好(图3)。结果显示，药筛后的转染gRNA3的SCs群体细胞(图4)中存在碱基突变位点。
(2)从转染gRNA3的SCs群体细胞中进行单克隆筛选
转染gRNA3的SCs药筛完成后，将细胞进行单克隆铺板。
细胞生长至汇合度为80％左右，进行消化终止，对离心重悬后的细胞悬液进行计数，如计数结果为1×105cells/ml，则对细胞悬液进行两次10倍连续稀释：另取2个1.5ml离心(标注管1和管2)，每管加900μl完全培养基，取100μl细胞悬液加入到管1中，混合均匀后取100μl至管2中，则管2中的细胞数为1000cells。
取适当体积的细胞(80cells/plate)至加样槽中，按照20ml/plate培养基加入完全培养基，混匀。
使用8通道移液枪吸取200μl细胞悬液加入之96孔板中。
每隔一天换一次液。培养5～7d左右，在镜下观察，挑取单细胞群落的孔进行标记。待群落长至孔板底面积的1/3大小，进行消化扩大到24孔板培养，将增殖较快的单克隆提取基因组DNA，PCR扩增，胶回收纯化送公司测序，基因型鉴定(图5)，筛选出成功敲除的细胞系，命名为clone9(KO-9)和clone15(KO-15)。
单克隆细胞性能评估：
(1)单克隆长期传代
将获得的SCs单克隆(KO-9和KO-15)，和未经转染的SCs，分别按照2.2×104cell/孔接种在6孔板中，分别使用DMEM/F12完全培养基(含双抗)培养，每两天换液，三天传代。此外，SCs和KO-15使用无血清培养15代后又使用公开号为CN114574433A的中国发明专利中公开的化学成分明确的用于肌源性细胞体外增殖的培养基(无血清增殖培养基)培养，每两天换液、三天传代。
以上细胞生长三天后收取细胞检测成肌因子基因表达，包括PAX7、MYOD、MYOG，检测引物序列如下：
PAX7的特异性qPCR引物为(5’-3’)：
PAX7-F:GTGCCCTCAGTGAGTTCGATT(SEQ ID NO.13)，
PAX7-R:TCCAGACGGTTCCCTTTGTC(SEQ ID NO.14)；
MYOD的特异性qPCR引物为(5’-3’)：
MYOD-F:GCTCCGCGACGTAGATTTGA(SEQ ID NO.15)，
MYOD-R:GGAGTCGAAACACGGGTCAT(SEQ ID NO.16)；
MYOG的特异性qPCR引物为(5’-3’)：
MYOG-F:AACCCCACTTCTATGACGGG(SEQ ID NO.17)，
MYOG-R:TTATCTTCCAGGGGCACTCG(SEQ ID NO.18)；
GAPDH的特异性qPCR引物为(5’-3’)：
GAPDH-F:GTCGGAGTGAACGGATTTGGC(SEQ ID NO.19)，
GAPDH-R:CTTGCCGTGGGTGGAATCAT(SEQ ID NO.20)。
结果如图6和图7所示：敲除CDKN2A基因后，无论是含血清培养还是无血清培养，在增殖阶段，CDKN2A基因敲除的单克隆9和克隆15(KO-9和KO-15)的干性维持基因PAX7和MOYD与原代肌肉干细胞相比表达量明显上调，这表明CDKN2A敲除的单克隆(KO-9和KO-15)作为肌肉干细胞，维持了较好的细胞干性特征；
通过长期传代后，KO-9和KO-15后代细胞在含血清培养基均能够维持较好的细胞增殖，并且与原代肌肉干细胞相比细胞增殖活性更好(图8)，其中KO-15后代细胞能够在无血清培养基中维持较好的细胞增殖，而原代肌肉干细胞在无血清培养基中不能维持长期增殖(P<3)(图9)，这表明敲除CDKN2A基因以后，实现了猪肌肉干细胞的永生化，并获得了具有良好细胞干性特征的永生化猪肌肉干细胞系。
(2)SCs诱导分化实验
基质胶铺板：配制基质胶：PBS＝1:50(Val)的溶液，以1mL/板的量加入3.5cm培养皿中，置于CO2培养箱中孵育1h左右，取出后吸干液体，用PBS清洗2次后吸干。
接种：猪SCs永生化单克隆(KO-9和KO-15)以及未经转染的SCs，按6×104～1.2×105cell/板的密度接种于用基质胶铺板后的3.5cm培养皿中，用DMEM/F12完全培养基(含双抗)培养两天进行换液。
诱导分化：待细胞增殖分裂至铺满整个培养皿后(扩增至90％以上的密度)，吸去增殖培养基。SCs，KO-9，KO-15分别用低血清分化培养基(2％马血清+DMEM)进行分化；此外SCs、KO-15分别用低血清分化培养基(2％马血清+DMEM)及公开号为CN112708591A的中国专利公开的无血清分化培养基清洗2遍细胞，以2ml/孔的体积加入对应的分化培养基进行诱导分化，每2天进行一次换液，第5天观察分化形成肌纤维的分化效果。
收样：吸去培养基，用PBS清洗1遍，加入质量体积百分比4％多聚甲醛在4℃过夜固定。
MYHC蛋白与DAPI免疫荧光染色：吸掉4％多聚甲醛，PBS清洗3次，加1ml左右0.5％Triton，室温通透20min，再用PBS清洗3次。加1ml左右5％ BSA溶液室温封闭约30min，加入MYHC一抗(1:800)，4℃孵育16h。PBS洗3次，加入二抗(1:500)，避光静置孵育1h，用PBS清洗3次，加入DAPI封片剂，盖上盖玻片，上镜拍照。
结果显示：SCs单克隆与原代肌肉干细胞相比，在低血清分化培养基中分化后具有明显MYHC表达，而相应代次未经转染的SCs无明显MYHC表达，这表明敲除CDKN2A基因后，后代肌肉干细胞能有效维持细胞分化能力，而相应代次未经转染的SCs几乎丧失分化能力(图10)。此外，SCs群体细胞在无血清分化培养基中具有更好的分化能力(图11)，这进一步表明了永生化猪肌肉干细胞系不但具有较好的增殖能力和干性特征，还能够维持较好的分化能力。
本实施例中的KO-15命名为幼猪肌肉干细胞株SC CDKN2A KO-15，于2022年12月7日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2022371。
实施例2
本实施例提供一种永生化细胞系的构建方法及其构建的永生化细胞系，包括降低或者消除原代细胞中p16蛋白和MSTN蛋白的表达，利用CRISPR/Cas9系统敲低或敲除实施例1中KO-15的MSTN基因，获得的永生化细胞系提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。
参考实施例1，一种永生化细胞系的构建方法，包括如下步骤：
重组载体构建(PX459-MSTN)的构建：
(1)PX459载体(addgene48139；图12)，用限制性内切酶BbsI在37℃条件下过夜酶切，使之线性化；酶切体系包括：BbsI 1μl、10X bμffer 4μl、PX330 5μg，补足ddH2O至40μl。
(2)设计3对靶向敲除猪MSTN基因的gRNA，如序列表所示：
MSTN gRNA-1 F1：5-CACCGTGATGATTATCACGCTACGA-3(SEQ ID NO.21)，
MSTN gRNA-1 R1：5-AAACTCGTAGCGTGATAATCATCAC-3(SEQ ID NO.22)；
MSTN gRNA-2 F2：5-CACCGCTGATTGTTGCTGGTCCCG-3(SEQ ID NO.23)，
MSTN gRNA-2 R2：5-AAACCGGGACCAGCAACAATCAGC-3(SEQ ID NO.24)；
MSTN gRNA-3 F3：5-CACCGTAGGACTACTTACACTCTGT-3(SEQ ID NO.25)，
MSTN gRNA-3 R3：5-AAACACAGAGTGTAAGTAGTCCTAC-3(SEQ ID NO.26)。
(3)连接：将设计合成的每对sgRNA-oligo-F，sgRNA-oligo-R引物粉末简短离心后，加ddH2O稀释至100μM；每组gRNA-oligo-F，sgRNA-oligo-R各取5μl混匀(即ds Oligo浓度50μM)；PCR仪运行退火程序(95℃30s、72℃2min、37℃2min、25℃2min、4℃Hold)；将dsOligo稀释100倍至0.5μM。配制连接体系：线性化PX459载体0.5μl、稀释退火的ds Oligo(0.5μM)3μl、5×T4 DNA ligase buffer 1μl、T4 DNA ligase 0.5μl，16℃过夜连接。
质粒提取及利用脂质体转染方法转染SCs：参考实施例1，待转染细胞为实施例1中构建的幼猪肌肉干细胞株SC CDKN2A KO-15。实验组为pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)+gRNA。转染8h后，更换DMEM/F12完全培养基(含双抗)，放置培养箱中扩大培养，观察细胞生长状态(不进行药筛)。转染3～7天后，在荧光下观察阳性对照的转染效率(图13)。
验证及筛选：
(1)对转入3种gRNA的SCs群体细胞中进行T7内切酶实验
参考实施例1，最终筛选出gRNA3的酶切效果较好。
(2)从转染gRNA3的SCs群体细胞中进行单克隆筛选
参考实施例1。筛选出敲除成功的细胞系(本次实验中挑选出两株成功敲除的单克隆，分别命名为SC CDKN2A-MSTNdKO Clone1和SC CDKN2A-MSTNdKO Clone7；以下简称为双敲Clone1和双敲Clone7)，基因型鉴定结果如图14所示。
单克隆细胞性能评估：
(1)单克隆长期传代
将获得的单克隆(双敲Clone1和双敲Clone7)以及对照细胞原代SCs和单敲KO-15扩大培养。培养及qPCR检测方法参考实施例1。
结果显示：在增殖阶段的含血清培养基中，联合敲除CDKN2A和MSTN基因后，与原代细胞SCs及CDKN2A基因敲除的单克隆KO-15相比，干性维持基因PAX7和MOYD的表达都显著上调(图15)。这表明双敲的Clone1和Clone7作为肌肉干细胞，维持了较好的细胞干性特征。通过长期传代发现，双敲的两株细胞均能够实现较好的增殖(图16)。在无血清增殖培养基(公开号为CN114574433A的中国发明专利中公开的化学成分明确的用于肌源性细胞体外增殖的培养基)中，与单敲KO-15(无血清)相比，双敲Clone1和Clone7(无血清)在MOYD的表达上均显著提高(图17)，无血清长期传代结果显示双敲的Clone7可以实现稳定增殖(图18)。这表明，联合敲除CDKN2A和MSTN基因可以实现猪肌肉干细胞的永生化，并获得了具有优良特性的永生化猪肌肉干细胞系。
(2)SCs诱导分化实验
qPCR检测：
将原代SC、单敲KO-15以及双敲的Clone1和Clone7按照6×104接种于3.5cm的培养皿中(每种细胞各准备两组)，用DMEM/F12完全培养基培养(含双抗)，期间每两天更换一次培养基，直到培养皿底部长满细胞，将一组细胞收样，记为分化D0。同时将另一组细胞用PBS清洗一遍，更换为低血清分化培养基(DMEM F12+2％马血清)培养进行分化培养，每两天换液，收取分化D4的样品。将分化D0和D4的样品进行成肌因子qPCR检测，包括MYOD、MYOG和MYHC。检测引物序列如下：
MYHC的特异性qPCR引物为(5’-3’)：
MYHC-F:AGGACCAAGTACGAGACGGA(SEQ ID NO.27)，
MYHC-R:AGCTTCCACGTGTTCCTCAG(SEQ ID NO.28SEQ ID NO.8)。
结果显示：与原代SC细胞相比，在MYOG、MYOD和MYHC的表达上，双敲的Clone1和Clone7表达量均显著性上调；与单敲的KO-15相比，在MYHC的表达上，Clone1表达量显著上调；在MYOD的表达上，Clone1和Clone7表达量均显著性上调；而在MYOG的表达上，Clone1的表达量显著上调(图19)。这表明联合敲除CDKN2A和MSTN基因后，后代肌肉干细胞可以维持良好的分化性能，其中双敲Clone1的分化特性最强。
免疫荧光检测：
将原代SCs、单敲KO-15以及双敲的Clone1和Clone7细胞分别用低血清分化培养基和无血清成肌分化培养基进行诱导分化。诱导及免疫荧光检测方法参考实施例1。
结果显示：在低血清的分化培养基中，未经转染的SCs细胞未出现MYHC表达；单敲KO-15和双敲Clone7出现少量MYHC表达，双敲Clone1表达量最高(图20)。在无血清成肌分化培养基中，原代SC细胞仍未出现MYHC表达，而单敲的KO-15和双敲的Clone1、Clone7均出现大量MYHC的表达(图21)，肌管融合率计算结果显示，双敲Clone1的肌管融合效果显著高于单敲KO-15和双敲Clone7(图22)。这表明联合敲除CDKN2A和MSTN基因后，后代肌肉干细胞可以较好地维持细胞分化能力，且在无血清成肌分化培养基中分化能力更强，而原代SC细胞几乎丧失分化性能，进一步说明了本次构建的永生化猪肌肉干细胞系不但具有较好的增殖能力，还能很好地维持分化性能。
本实施例中的双敲Clone1命名为幼猪肌肉干细胞株SC CDKN2A-MSTN dKOClone1，于2023年2月26日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C202347。

Claims (17)

1.一种包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列的gRNA：
CDKN2A gRNA-3F1：5-CACCGTCGTGTACCGGTCGGGTGA-3(SEQ ID NO.7)；
CDKN2A gRNA-3R1：5-AAACTCACCCGACCGGTACACGAC-3(SEQ ID NO.8)。
2.权利要求1所述的gRNA在利用CRISPR-Cas9系统敲低或敲除细胞中CDKN2A基因中的应用。
3.一种包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列的gRNA：
MSTN gRNA-3F3：5-CACCGTAGGACTACTTACACTCTGT-3(SEQ ID NO.25)；
MSTN gRNA-3R3：5-AAACACAGAGTGTAAGTAGTCCTAC-3(SEQ ID NO.26)。
4.权利要求3所述的gRNA在利用CRISPR-Cas9系统敲低或敲除细胞中MSTN基因中的应用。
5.一种永生化细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括降低或者消除细胞中P16蛋白表达；或所述方法包括降低或者消除细胞中的P16蛋白和MSTN蛋白表达。
6.根据权利要求5所述的一种永生化细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括利用CRISPR/Cas系统敲低或敲除CDKN2A基因；或同时敲低或敲除CDKN2A基因和MSTN基因。
7.根据权利要求6所述的一种永生化细胞系的构建方法，其特征在于，所述CRISPR系统包括CRISPR-Cas9系统或者CRISPR-Cas13系统；
所述利用CRISPR-Cas9系统敲低或敲除CDKN2A基因中的gRNA包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列：
CDKN2A gRNA-3F1：5-CACCGTCGTGTACCGGTCGGGTGA-3(SEQ ID NO.7)；
CDKN2A gRNA-3R1：5-AAACTCACCCGACCGGTACACGAC-3(SEQ ID NO.8)；
和/或所述利用CRISPR-Cas9系统敲低或敲除MSTN基因中的gRNA包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列：
MSTN gRNA-3F3：5-CACCGTAGGACTACTTACACTCTGT-3(SEQ ID NO.25)；
MSTN gRNA-3R3：5-AAACACAGAGTGTAAGTAGTCCTAC-3(SEQ ID NO.26)。
8.根据权利要求5-7任一所述的一种永生化细胞系的构建方法，其特征在于，所述细胞包括肌肉干细胞；所述肌肉干细胞来源于猪、牛、羊、鱼或其他家禽。
9.权利要求5-8任一所述的一种永生化细胞系的构建方法构建的永生化细胞系，所述永生化细胞系提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。
10.一种永生化细胞系，所述永生化细胞系中p16蛋白降低或者消除表达，或所述永生化细胞系中p16蛋白和MSTN蛋白降低或者消除表达。
11.根据权利要求10所述的一种永生化细胞系，包括来源于猪、牛、羊、鱼或其他家禽的肌肉干细胞永生化细胞系。
12.一种猪肌肉干细胞永生化细胞系，命名为幼猪肌肉干细胞株SC CDKN2A KO-15，于2022年12月7日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2022371。
13.一种猪肌肉干细胞永生化细胞系，命名为幼猪肌肉干细胞株SC CDKN2A-MSTN dKOClone1，于2023年2月26日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C202347。
14.权利要求10-13任一所述一种猪肌肉干细胞永生化细胞系在制备膳食消费品中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，包括在体外培养基中培养上述永生化细胞系，增殖、诱导分化后制备成细胞培养肉。
16.根据权利要求15所述的应用，所述体外培养基包括无血清培养基。
17.一种细胞培养肉产品，包括权利要求10-13任一所述一种猪肌肉干细胞永生化细胞系。
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