CN110511277A - 一种抗hsp90单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗hsp90单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种抗HSP90单克隆抗体及其应用。本发明利用HSP90蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，采用细胞融合技术将免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，筛选出能够稳定分泌抗HSP90单克隆抗体的杂交瘤细胞株，大量生产抗HSP90单克隆抗体。本发明得到的抗HSP90单克隆抗体具有高效价、高特异性、可大量生产的特点，抗HSP90单克隆抗体能够特异性的结合HSP90蛋白，减少了可能的交叉反应，试验结果可信度更大，可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，在制备以HSP90为靶点的生物学检测试剂中具有重要的意义。

Description

一种抗HSP90单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种抗HSP90单克隆抗体及其应用。
背景技术
热休克蛋白（Heat-shockprotein，HSP）又称分子伴侣蛋白，是一种在热应激环境下合成并被激活的一组特殊蛋白质。热休克蛋白的发现揭示了热休克反应（也称为细胞应激反应）。这种反应作为一个常见的生理过程存在于几乎所有生物体中，与细胞的生长、发育、分化、基因转录等密切相关，在应激状态下，HSP能够与一些功能蛋白形成复合体，保护细胞生命活动必需的蛋白质，从而维持细胞的生存和生长，HSP通过与靶蛋白结合或解离，从而实现对靶蛋白功能活性的调控，包括蛋白质的折叠、重构、转运及信号转导等，参与细胞内的物质的运输及降解。HSP在生物体中是普遍存在的，是一个具有多成员的庞大的糖蛋白超基因家族。
哺乳动物的热休克蛋白90（Heatshockprotein90，HSP90）是一个在生物体中普遍存在的高度保守的分子簇，分子量约为90KDa，存在于除古生菌之外的所有生物体中，在非应激条件下，HSP90蛋白量约占哺乳动物细胞蛋白总量的1~2%，在发生应激反应时，其表达量可增加至原来的10倍多，能够促进新合成的或错误折叠的蛋白质折叠，从而维持蛋白质的稳态。HSP90在细胞内环境平衡中起到至关重要的作用，可调控细胞的稳定性、参与蛋白质的活化和成熟，与数百种受体蛋白的重构密切相关，同时还参与多种细胞功能，如蛋白质转运、信号转导和受体成熟等，包括受体酪氨酸在内的200多种蛋白激酶，转录因子，信号蛋白和细胞周期调节蛋白。正常的哺乳动物细胞具有明确的分子机制，HSP90能够调节它们的增殖、生长、分化和死亡，癌细胞的特点是持续不受控制的异常增殖，缺乏调控细胞增殖和稳态的天然调控机制，一些癌症相关蛋白质的折叠与成熟同样依赖于HSP90的调控机制，例如：信号激酶、类固醇激素受体和转录因子是癌症发生发展过程中密切相关的蛋白分子，而这些蛋白高度依赖HSP90作为分子伴侣蛋白的参与，因此，几乎在所有类型的癌症中都能够检测到HSP90的显著高表达。现有研究表明，HSP90的异常表达现象存在肺癌、胃癌、乳腺癌、食管癌及其他肿瘤组织中，并与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、分期和分级有显著相关性，但是，高效价、高特异性的抗HSP90蛋白单克隆抗体目前尚未见到报道。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种高效价、高特异性的抗HSP90蛋白单克隆抗体及其应用。
本发明利用HSP90蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，采用细胞融合技术将免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，筛选能够稳定分泌抗HSP90单克隆抗体的杂交瘤细胞株，大量生产抗HSP90单克隆抗体，纯化后获得高纯度的抗HSP90单克隆抗体效价高、特异性好，可直接应用于基础医学研究，或制成多种体外诊断试剂盒用于检测HSP90抗原的免疫检测工具中，进一步应用于肿瘤细胞的鉴定及诊断。可用于制备以HSP90为靶点的生物诊断试剂的研究与开发。
本发明所述抗HSP90蛋白单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
在某一具体实施方式中，本发明还具体公开了所述抗HSP90蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下工艺步骤：
（1）重组HSP90蛋白的表达与纯化；
（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测；
（3）杂交瘤细胞的融合、筛选；
（4）抗HSP90单克隆抗体的生产及纯化。
本发明还提供了一种能产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明还提供所述的抗HSP90蛋白单克隆抗体在制备以HSP90为靶点的生物学检测试剂中的用途。
本发明还提供所述的抗HSP90蛋白单克隆抗体在制备用于检测HSP90抗原的试剂中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用HSP90蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术将免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，筛选出能够稳定分泌抗HSP90单克隆抗体的杂交瘤细胞株，大量生产抗HSP90单克隆抗体，经纯化后获得高纯度的抗HSP90单克隆抗体具有高效价、高特异性、可大量生产的特点，所得抗体的效价均达到1×105以上。本发明所得到的抗HSP90单克隆抗体能够特异性的结合HSP90蛋白，减少了可能的交叉反应，试验结果可信度更大，用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，在制备以HSP90为靶点的生物诊断试剂中具有重要的临床意义。
附图说明
图1为重组蛋白HSP90组分收集的 SDS-PAGE电泳图；
图2为纯化后的抗HSP90单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图；
图3为不同稀释度的HSP90单克隆抗体免疫效价检测结果图；
图4为抗HSP90单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果；
图5是抗HSP90单克隆抗体对人胚胎肾上皮细胞HEK293T与人结肠癌细胞RKO中HSP90蛋白进行Western blot实验结果图；
图6是抗HSP90单克隆抗体对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞PC12中HSP90蛋白免疫荧光染色实验结果图；
图7是HSP90单克隆抗体的特异性鉴定结果。
具体实施方式
本发明公开了一种抗HSP90蛋白单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。
实施例1：HSP90单克隆抗体的制备
（1）重组HSP90蛋白的表达与纯化
a. 转化大肠杆菌BL21表达目标重组蛋白
重组质粒pET-30a-HSP90（购自Invitrogen公司），采用42℃热激90 s的方法将重组质粒转化进大肠杆菌BL21，挑取卡那霉素抗性的菌斑，在200 mL LB培养基中培养至当菌液的OD为0.6~0.8时，加入0.5 mM IPTG诱导目标蛋白的表达，25℃恒温培养12 h后，收集菌体，超声破菌，离心收集上清。
b. 重组蛋白纯化
将菌体裂解液上清加入镍柱层析柱中（购自Novagen），4℃结合过夜，弃去上清，用WashBuffer缓冲液洗去层析柱中未结合的蛋白，然后用10倍柱体积的500 mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达，图1是重组蛋白HSP90组分收集的 SDS-PAGE电泳图；如图1所示，HSP90蛋白经2次洗脱即能获得较高的纯度。本试验收集并合并第2次洗脱后的蛋白，冻干后进行后续动物免疫。
（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测
本实施例所用BALB/c小鼠购自南京大学动物模式研究所。
a. 首次免疫：
取重组HSP90蛋白100 μg，添加PBS到200 μL，加入200 μL的弗氏完全佐剂，充分乳化成黏稠的乳剂，腹腔注射，完成首次免疫。
b. 第二次免疫：
首次免疫间隔三周后，取同样的重组HSP90蛋白100 μg，添加PBS到200 μL，加入200 μL弗氏不完全佐剂，充分乳化成黏稠的乳剂，腹腔注射，完成第二次免疫。
c. 利用间接ELISA法检测第二次免疫后小鼠血清效价：
取出HSP90重组蛋白，用pH 9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将HSP90蛋白稀释为1 μg/mL后加入96孔酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000 g离心15 min分离血清，用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100 μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1 h后，经TBS-T缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），37℃孵育30 min。取出酶标板，经TBS-T缓冲液洗涤5次后，每孔加入100 μL TMB底物显示液，37℃避光显色10~15min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。选取血清效价达到1：105以上小鼠，进行第三次免疫；
d. 第三次免疫：
第二次免疫间隔三周后，对血清效价达到1：105以上小鼠进行第三次免疫，具体方法与第二次免疫一致；
e. 强化免疫/冲击免疫：
在第三次免疫间隔三周后，进行最后一次强化免疫/冲击免疫，取HSP90重组蛋白200 μg，添加PBS稀释到200 μL，腹部皮下多点注射，完成强化免疫/冲击免疫，免疫结束后3~4天后取小鼠脾脏细胞进行细胞融合。
（3）杂交瘤细胞的融合、筛选
a. 饲养层细胞的制备：
取成年未免疫BALB/c小鼠，引颈处死，75％酒精中浸泡5 min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上；用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，用镊子撕开，暴露出腹部肌肉；用5 mL注射器吸取5 mL生理盐水，注射入小鼠腹腔，待腹腔胀大后，用棉签对其腹部进行3~5 min按摩，使得生理盐水充分分布腹腔各处后，小心吸出生理盐水，250 g离心5~10 min，弃上清，用含20％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬后铺96孔板，每孔100 μL，放入37℃ 5％CO2培养箱中培养，待用。
b. 准备SP2/0骨髓瘤细胞：
复苏一支8AG筛选过的SP2/0骨髓瘤细胞（购自中科院昆明细胞库）于15 cm培养皿中，用10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，当细胞铺满培养皿的50~60％时进行传代并扩大培养。细胞融合时，取约3~4碟SP2/0骨髓瘤细胞弃去培养基，用10 mL预先37℃温育的RPMI1640培养基将细胞吹打下来，放入离心管中，再加入10 mL RPMI 1640培养基，吹打均匀放入50 mL离心管，250 g，离心5 min，弃去上清，待用。
c. 免疫后的小鼠脾脏细胞的制备：
取冲击免疫结束后3天的BALB/c小鼠，引颈处死，75％酒精中浸泡5 min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上；用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，然后用镊子撕开，暴露出腹部肌肉，然后打开腹腔，取出小鼠脾脏，经80目网筛充分研磨后，加入5 mL RPMI 1640培养基重悬，吸出细胞悬液于50mL离心管里，250 g，离心5 min，弃上清，待用。
d. 细胞融合：
通过细胞计数，将脾脏淋巴细胞按5:1的比例与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，吹打均匀，250 g，离心5 min，弃去上清，用手指轻轻击打离心管底部，使细胞分布均匀、蓬松；取出37℃预热的1 mL PEG1500，混匀后吸出，将PEG1500逐滴加入混合好的细胞中，加入过程中要轻轻晃动离心管，控制滴速，时间控制在90 s左右；取出37℃预热RPMI 1640培养基，于第1min逐滴加入1 mL，均匀滴入，边滴加边缓慢旋转混匀，第2 min加入3 mL，第3 min加入10mL速度逐步加快，终止细胞融合，共加入14 mL培养基，注意此过程先慢后快。轻轻混匀，37℃静置5 min后，250 g，离心5 min，弃去上清。
e. 铺板：
利用HAT特殊培养基重悬上述融合细胞，轻轻吹打混匀，将细胞培养液加入提前准备的含饲养层细胞的96孔培养板中，100 μL/孔，37℃ 5％CO2培养箱培养。经HAT筛选后，未融合的骨髓瘤细胞将无法生长，而有效融合的杂交瘤细胞将在培养孔内生长、增殖、并分泌抗体。
f. 利用间接ELISA法筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞：
取出HSP90重组蛋白，用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将HSP90重组蛋白稀释为1μg/mL加入96孔酶标板，100 μL/孔，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。
细胞融合后第4~5天可以在显微镜下看到10~15颗细胞聚集在一起的细胞集落，此时可进行第一次换液，吸出原有培养基，重新加入HAT培养基，第8~10天进行第二次换液，此时细胞集落约铺满1/10孔，可用HT培养基代替HAT培养基，在二次换液后48 h，从每个孔里取出50 μL培养基上清，加入预先包被的酶标板中，37℃，孵育1 h后，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson ImmunoResearch公司），37℃孵育30 min后，经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100 μL加入TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。显色反应明显且吸光度值较高（OD450数值大于2.0以上）的孔即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
g. 第一次亚克隆筛选：
采用有限稀释法对阳性的孔进行第一次亚克隆筛选。稀释杂交瘤细胞：将阳性孔的杂交瘤细胞吹打均匀，进行细胞计数，根据细胞密度，将细胞稀释到10个/mL，加入96孔板中，每孔100 μL，即1个细胞/孔，放入37℃ 5％CO2培养箱中培养，3~5天后，通过显微镜观察，选取有且仅有一个由4~5颗细胞聚集在一起的细胞集落为目标孔，利用间接ELISA法筛选出阳性的单克隆细胞株，方法同上。
h. 第二次亚克隆筛选：
待第一次亚克隆筛选出的阳性孔中的细胞集落铺满1/10孔时，进行第二次亚克隆筛选，方法同上，最终选取抗体分泌性最好的杂交瘤细胞株编号命名为： 43-2-9-G9。
（4）抗HSP90单克隆抗体的生产及纯化。
a. 小鼠单克隆抗体腹水的制备：
取6~8周龄的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射500 μL液体石蜡致敏，4~7天后，将得到的43-2-9-G9杂交瘤细胞株按5×105个/只，注射入已致敏的小鼠腹腔，7~14天后观察小鼠腹水生产情况，如腹部明显膨大，即可抽取腹水，腹水采集后5000 g离心10~15 min去除油脂和沉淀，收集上清，即为腹水抗HSP90单克隆抗体，本发明中由43-2-9-G9杂交瘤细胞株生产的单克隆抗体以细胞株编号区分。
b. 小鼠单克隆抗体腹水的纯化：
利用正辛酸-蛋白G法对腹水抗HSP90单克隆抗体进行纯化，抗体纯度经SDS-PAGE电泳验证，图2为纯化后的HSP90单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图；如图2所示，纯化后的抗体经具有较高的纯度，抗HSP90单克隆抗体IgG(H+L)分子量约为160 KD，其中IgG重链约为55 KD， IgG轻链约为25KD。
纯化抗体具体方法如下：
腹水抗体与醋酸盐缓冲液按体积比1：3充分混匀，逐滴加入正辛酸，混匀后，4℃静置1h，3000g离心30 min，取上清，弃沉淀；
加入0.1倍体积的10×PBS，调节pH至7.4 ，溶液经0.45 μm滤膜过滤；
将过滤后的液体装入已平衡的蛋白G-层析柱中；
利用20倍体积PBS洗涤非特异性结合的蛋白；
利用10倍体积pH2~3的0.1 mol/L的甘氨酸缓冲液洗脱抗体并收集液体；
将洗脱液加入10 KD超滤管，5000 g 4℃离心10~15 min进一步浓缩抗体，加入50%甘油，-20℃保存。
实施例2：抗HSP90单克隆抗体效价测定及特异性
（1）单克隆抗体的效价测定：
用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将HSP90重组蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，100 μL/孔，4℃过夜；用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）分别将以上单克隆抗体按1:103、1:104、1:105、1:106、1:107稀释，100 μL/孔，37℃孵育1 h取出酶标板，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），37℃孵育30 min；经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100μL加入TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。图3是为不同稀释度的HSP90单克隆抗体免疫效价检测结果对比图；如图3所示，纯化后的单克隆抗体的效价达到1×105。
（2）单克隆抗体特异性识别及交叉反应鉴定：
用碳酸盐缓冲液分别将HB-EGF、EGFR、TNF-α、IL-1β、HGF蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，并设置空白对照，空白对照组为1 μg/mL BSA蛋白，用HSP90单克隆抗体进行间接法ELISA检测。图4为 HSP90单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果图；如图4所示，HSP90单克隆抗体与HB-EGF、EGFR、TNF-α、IL-1β、HGF蛋白之间均无交叉反应，表明该抗体的特异性较好。
实施例3：HSP90单克隆抗体的应用
（1）Western blot实验：
收集常规培养的人胚胎肾上皮细胞HEK293T（购自中科院昆明细胞库）与人结肠癌细胞RKO（购自中科院昆明细胞库），用RIPA裂解液将细胞裂解，5000 g 4℃离心20 min，收集上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度；细胞裂解液经10％ SDS-PAGE电泳分离，随后将PAGE胶置于PVDF膜上，120 mA转膜240 min；将PVDF膜放入5％的脱脂牛奶中室温封闭1 h，然后分别用1:5000本发明中HSP90单克隆抗体作为一抗4℃孵育过夜；取出PVDF膜，PBS-T漂洗3次，每次5min，置于1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗中室温孵育1 h后，弃二抗，PBS-T洗涤5次，每次5min；将PVDF膜加入显色液中避光显影，拍照记录实验结果。图5是HSP90单克隆抗体对人胚胎肾上皮细胞HEK293T与人结肠癌细胞RKO中HSP90蛋白进行Western blot实验结果图；如图5所示，本发明的HSP90单克隆抗体能够特异性识别HEK293T与RKO细胞中的HSP90蛋白，说明本发明中的生产的HSP90抗体具有较高的特异性。
（2）免疫荧光实验：
利用免疫荧光实验检测单克隆抗体结合大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞PC12（购自中科院昆明细胞库）中HSP90的能力，与单克隆抗体孵育进行免疫荧光染色实验，具体实验方法如下：
PC12细胞贴壁生长后，采用4％多聚甲醛进行固定；
细胞固定后，利用PBS洗涤3次，加入0.5% TritonX-100，室温静置5 min，利用PBS洗涤3次后，加入5％BSA-PBS，37℃封闭1 h；
细胞封闭后加入-HSP90单克隆抗体（1 μg/ml），37℃孵育1 h；
PBS洗涤3次后，加入FITC标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），室温孵育45 min；
PBS洗涤3次后，加入DAPI荧光染料室温避光孵育10 min；
PBS洗涤3次后，荧光显微镜分别在405 nm和488 nm处观察，拍照。图6是HSP90单克隆抗体对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞PC12中HSP90蛋白免疫荧光染色实验结果图；如图6所示：PC12细胞胞质中的HSP90蛋白能够被HSP90单克隆抗体特异性的识别，呈现出较强的绿色荧光，说明制备的HSP90单克隆抗体能特异地识别PC12细胞中的HSP90蛋白，且具有较好的结合能力。
实施例4：HSP90单克隆抗体重轻链可变区的测序及鉴定
（1）HSP90单克隆抗体重轻链可变区的扩增及序列测定
单克隆细胞长期保存，可能由于多次传代后不稳定及污染问题导致阳性克隆丢失，为解决上述问题，在本发明过程中，利用分子生物学技术，对阳性单克隆细胞株进行重链可变区（mVH）和轻链可变区（mVL）基因扩增，并进行序列测定。
具体方法如下：收集生长状态良好的杂交瘤细胞，利用Thermo公司的Trizol提取杂交瘤细胞总RNA，按南京诺唯赞公司的HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNAwiper)说明书的操作方案将mRNA逆转录为cDNA，-20°C冻存备用。逆转录反应体系为5 μLRNA（2500 ng），10 μL 4×gDNA，10 μL 5×supermixⅡ，加ddH2O补足至50 μL，总反应体积为50 μL。以cDNA为模板，通过NCBI数据库查找鼠源重链FR1区及铰链区基因序列（NC000078.6），根据序列设计重链PCR引物，重链可变区上游引物如SEQ.ID.NO.3所示，即：GAGGTTCDSCTGCAACAGTY，重链可变区下游引物如SEQ.ID.NO.4所示，即：CGCAGAGACAGTGACCAGAG；同样通过NCBI数据库查找鼠源轻链FR1区及恒定区基因序列（NC000072.6），设计轻链PCR引物，轻链可变区上游引物如SEQ.ID.NO.5所示，即：GATRTCCAGATGAMCCAGTC，轻链可变区下游引物如SEQ.ID.NO.6所示，即：CTTTGGGGTAGAAGTTGTTCAAG，分别PCR获得抗体的轻链和重链片段。按南京诺唯赞公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase说明书的操作方案进行PCR，PCR反应体系为：25 μL 2×Phanta，1 μL dNTP，4 μL 10 μM引物对，4 μL杂交瘤细胞cDNA，1 μLDNApolymerase，15 μL dd H2O，总反应体积为50 μL。扩增条件为：预变性94℃，3 min；变性94℃，30s；退火64℃，30s；延伸72℃，5 min。按照OMEGA公司OMEGA Gel Extraction Kit说明书对PCR产物进行胶回收，进行测序分析，获得杂交瘤细胞的重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，即：QVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTNEMTWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYAASVEDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRDASSRYGGAMAYWGQGTTVTVSS；其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，即：DILVTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSQVSYQHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKR。
（2）HSP90单克隆抗体重轻链可变区序列鉴定
将重链可变区序列克隆入pFUSEss-CHIg-mG2b-TDS（购自Invitrogen公司）载体，轻链可变区序列克隆入pFUSE2ss-CLIg-mk-TDS（购自Invitrogen公司）载体，分别挑取博来霉素与杀稻瘟菌素抗性的菌斑，扩大培养后进行质粒抽提，并进行测序分析，选取测序结果正确的质粒共同转染入人胚胎肾上皮细胞HEK293A、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞（购自中科院昆明细胞库），收集48 h后的细胞上清液，4000 g离心30 min，去除上清中细胞等杂质，并用0.45 μm滤器过滤除菌后进行间接ELISA实验，检测上清液中是否存在相应的HSP90抗体。图7是HSP90单克隆抗体的特异性鉴定结果。如图7所示， HEK293A及CHO细胞上清均能够检测到HSP90抗体，表明筛选的HSP90单克隆抗体的重、轻链可变区具有较好的特异性且能够通过转染适当的受体细胞如HEK293、CHO细胞等表达出HSP90抗体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏莱森生物科技研究院有限公司
<120> 一种抗HSP90单克隆抗体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Asn
20 25 30
Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Glu Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Asp Ala Ser Ser Arg Tyr Gly Gly Ala Met Ala Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Asp Ile Leu Val Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gln Val Ser Tyr Gln
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65 70 75 80
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggttcdsc tgcaacagty 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcagagaca gtgaccagag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatrtccaga tgamccagtc 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctttggggta gaagttgttc aag 23
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<120> 一种抗HSP90单克隆抗体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (5)

1.一种抗HSP90蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
2.一种能产生权利要求1所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备以HSP90为靶点的生物学检测试剂中的用途。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测HSP90抗原的试剂中的用途。
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