CN109680004A - 联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体及其构建方法和在卵巢癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药生物领域，具体涉及联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体及其构建方法和在卵巢癌中的应用。所述的双靶点CAR载体通过联合EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体，CAR的具体组成结构为CD8leader‑EpCAM scFv‑(G4S)5‑MSLN scFv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ。以病毒感染方式获得含有该治疗载体的CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，可靶向识别和杀伤高表达EpCAM和MSLN两种肿瘤相关抗原的卵巢癌细胞。

Description

联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体及其构建方法和 在卵巢癌中的应用
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体及其构建方法和在卵巢癌中的应用。
背景技术
卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，其死亡率占女性恶性肿瘤的第一位，是女性癌症病人死亡的首要死因。目前卵巢癌的治疗方法有手术治疗、化疗、中医治疗、免疫治疗等。近年来，随着基础科学研究的不断发展，免疫治疗越来越受到人们的重视。
LAK细胞、DC、CIK细胞都曾作为肿瘤的免疫治疗手段，但是以上各种治疗方法均缺乏特异性识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)和杀伤特定肿瘤靶细胞的能力；而肿瘤免疫编辑的过程又会使靶细胞表面的主要组织相容性复合物(mainhistocompatibility complex，MHC)在肿瘤细胞表面表达下降，形成免疫逃逸，使肿瘤细胞可成功躲避T细胞攻击。
嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为过表达能识别特定的肿瘤表面抗原的单链抗体可变区基因片段，从而使T细胞识别特定抗原、杀伤表达该抗原的靶细胞。同时，由于CAR-T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受MHC的限制。
上皮特异性粘附分子(EpCAM,Epithelial cell adhesion molecule)是一种上皮细胞跨膜糖蛋白，参与Wnt信号转导通路，调控靶基因转录，与细胞的粘附、迁移、增殖、分化等有关。最初是以一种肿瘤相关抗原而被发现的，由于EpCAM在多种肿瘤组织如卵巢癌、胃癌、结直肠腺癌、乳腺癌等中的表达升高而备受关注。研究发现，EpCAM的表达与卵巢肿瘤的进展及预后相关，可作为卵巢癌靶向治疗的靶点。
间皮素(mesothelin，MSLN)是一种存在于细胞表面的锚定糖蛋白，因其在正常组织中不表达或间皮组织中低表达，但在30％的肿瘤中高表达，如卵巢癌、胃癌、结肠癌等实体瘤，而成为备受关注的肿瘤细胞特异性靶向抗原。
脱靶效应是CAR-T细胞疗法副作用的主要来源，脱靶效应是指未能达到预先设定的目标，有所偏移的现象。CAR-T细胞胞外识别结构域绝大多数为肿瘤相关抗原(Tumorassociated antigen，TAA)，而肿瘤相关抗原并非肿瘤细胞所特有，其在健康组织上也存在不同程度的表达。这种CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞的同时也会攻击正常组织，这种毒性即非肿瘤靶向毒性，该毒性机制造成的毒性效应称为脱靶效应。
因此，如何有效的避免降低脱靶效应的发生，增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗卵巢癌的效果，成为CAR-T治疗的一个技术难题。
目前，尚未见有关能靶向EpCAM和MSLN的双靶点的治疗方案，以降低脱靶效应发生的CAR载体的报道。
发明内容
本发明目的是为了解决上述问题，本发明提供了能靶向EpCAM和MSLN并减少脱靶效应发生的CAR载体。本发明所采用的针对EpCAM和MSLN的CAR-T技术，降低CAR-T细胞疗法的脱靶效应的发生，增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗卵巢癌的效果。此外，还包括联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的构建方法及其应用。
本发明提供的联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体具体技术方案如下：
联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体，包括嵌合抗原受体和载体，所述嵌合抗原受体连接在所述载体上，所述嵌合抗原受体包括两种特异性结构分别为：EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体，所述EpCAM单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，
所述嵌合抗原受体的结构组成为CD8leader-EpCAM scFv-(G4S)5-MSLN scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ。
在某些实施方式中，其特征在于，所述CD8leader可表达引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的引导肽，所述CD8leader的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，所述EpCAM scFv表示EpCAM单链抗体，所述(G4S)5为单链抗体间铰链Inner-Linker，且核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体通过所述(G4S)5进行连接，所述MSLN scFv表示MSLN单链抗体，所述CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，且核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CD28-CD137为共刺激结构域，所述CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CD3ζ为信号转导域，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在某些实施方式中，所述载体包括PUC19质粒、慢病毒载体。
在某些实施方式中，所述慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。
本发明还提供了联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的构建方法，包括步骤如下：
(1)将所述嵌合抗原受体保存在所述PUC19质粒上；
(2)将含有步骤(1)中PUC19质粒和所述慢病毒载体进行双酶切，将酶切产物分别经过琼脂糖凝胶电泳分离，获得双酶切后的含有所述嵌合抗原受体结构的目的片段和双酶切后慢病毒载体，
(3)将步骤(2)中的含有所述嵌合抗原受体结构的目的片段和步骤(2)中的慢病毒载体进行连接，将连接产物进行转化，提取质粒，获得含有嵌合抗原受体结构的重组质粒，所述重组质粒为联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体。
在某些实施方式中，所述步骤(2)中的双酶切的位点为EcoRI和NotI，所述(3)中含有所述嵌合抗原受体结构的目的片段和慢病毒载体连接的摩尔比为5:1。
本发明还提供了联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的应用，联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体进行慢病毒包装，经离心浓缩后获得高滴度的慢病毒悬液，所述慢病毒悬液感染用于T细胞，获得CAR-T细胞，所述CAR-T细胞通过识别特异性蛋白EpCAM和MSLN靶向杀伤卵巢癌细胞。
在某些实施方式中，其特征在于，所述慢病毒包装采用三质粒包装系统，所述三质粒包装系统包括PSPAX2质粒、pMD2G质粒和所述联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体，所述PSPAX2质粒、所述pMD2G质粒、所述联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的比例为27:3:20，所述慢病毒包装采用293T细胞作为慢病毒的包装细胞。
本发明具有以下有益效果：本发明针对治疗载体的CAR结构包括EpCAM单链抗体、MSLN单链抗体两个特异性结构；EpCAM单链抗体、MSLN单链抗体是根据多种卵巢癌细胞表面会表达肿瘤相关抗原EpCAM、MSLN确定的特异性结构，该结构表达的Anti-EpCAM、Anti-MSLN两种特异性抗体负责识别TAA，一方面可靶向性杀伤肿瘤细胞；另一方面，赋予T细胞新的抗原特异性，可有效避免肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制。另外，双靶点的设计可以有效减少CAR-T治疗过程中产生的脱靶效应，使CAR-T细胞可以更好的识别双阳性靶点的卵巢癌细胞，提高杀伤效率的同时，减少CAR-T治疗中带来的风险。当T细胞通过病毒感染方式获得该载体并表达该CAR结构后，T细胞即可靶向性识别并杀伤卵巢癌细胞。
附图说明
图1是本发明的慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro结构示意图；
图2是本发明的CAR结构示意图；
图3是本发明的慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro EcoRI与NotI双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；
图4是本发明的联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体EcoRI与NotI双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；
图5是本发明的CAR-T细胞的流式细胞检测图；
图6是本发明的RTCA检测CAR-T细胞对SK-OV-3的杀伤效率曲线图；
图7是本发明的CAR-T细胞对SK-OV-3杀伤24h后IFNgamma因子的ELISA检测柱状图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明提供了联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体，具体方案如下：包括嵌合抗原受体和载体，嵌合抗原受体连接在载体上，所述嵌合抗原受体包括两种特异性结构分别为：EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体，EpCAM单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。嵌合抗原受体的结构组成为CD8leader-EpCAM scFv-(G4S)5-MSLN scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ。
嵌合抗原受体的结构组成为CD8leader-EpCAM scFv-(G4S)5-MSLN scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ(如图2所示)。CD8leader可表达引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的引导肽，CD8leader的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，EpCAM scFv表示EpCAM单链抗体，(G4S)5为单链抗体间铰链Inner-Linker，且核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体通过(G4S)5进行连接，MSLN scFv表示MSLN单链抗体，CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，且核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CD28-CD137为共刺激结构域，CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，CD3ζ为信号转导域，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。表达针对卵巢癌细胞表面的肿瘤相关抗原EpCAM、MSLN的抗体Anti-EpCAM、Anti-MSLN，使得其能够更精准的识别并杀伤同时表达上述两种肿瘤相关抗原的卵巢癌细胞，大大增加了CAR-T细胞的靶向性，降低脱靶效应。本发明中提到的CAR结构赋予了T细胞更强的增殖性，持久的生命力，使其表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。
载体包括PUC19质粒、慢病毒载体。慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。通过Snap Gene软件分析该载体并查找相关文献可知，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro用EcoRI与NotI双酶切插入片段。该表达载体包括：CMV启动子-是哺乳动物细胞特异性启动子，驱动能力较强；多克隆位点(MCS)-包含多个限制性酶切位点(restriction site)，是外源基因插入的位置；WPRE元件-可提高mRNA的polyA加尾效率，改进转移基因的表达效率；SV40polyA序列-能有效终止转录以及为转录的mRNA添加PolyA尾；杂交型RSV/5’LTR-含有启动子和增强子等调控元件，使其在293T细胞中高水平的表达全长病毒转录物；遗传要素(cPPT，gag，env，LTRs)-用于包装、转导和稳定地将病毒表达结构整合到宿主的基因组DNA中；SV40 origin-使质粒在包装细胞中稳定增殖。
该慢病毒表达载体可作为使目的基因在几乎所有哺乳动物细胞包括非分裂细胞和分裂细胞中表达的最有效载体，其可容载外源基因片段大，转染效率较高，对T细胞也能达到满意的转染效果。
一、实验材料
1.慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，慢病毒包装质粒pMD2G，载体质粒PSPAX2购自SBI；慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro结构如图1所示；
2.CAR结构序列由上海美丽人生医疗科技有限公司设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以PUC19质粒形式保存；
3.限制性核酸内切酶EcoRI、NotI购自NEB；
4.T4 DNA ligase、Free H2O购自宝生物；
5.感受态细胞购自Trans；
6.胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；
7.293T细胞、SK-OV-3细胞购自中科院细胞库；
8.FBS，DMEM、1640培养基，PBS，Opti-MEM，lipofectamine 2000购自Gibco；
8.FBS、DMEM、1640培养基，PBS，Opti-MEM，lipofectamine 2000购自Gibco；
9.CD3单抗、CD28单抗、CH38蛋白、IL-2购自于上海近岸蛋白质科技有限公司；
10.Multiskan GO酶标仪+uDrop超微量板、流式细胞仪购自ThermoFisher；
11.HE120水平电泳槽、Tanon凝胶成像仪购自Tanon；
12.隔水式恒温培养箱、恒温培养摇床购自上海一恒科技有限公司；
13.Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell小型电泳系统购自Bio-Rad；
14.奥林巴斯显微镜购自奥林巴斯；
15.接种环、涂布棒购自洁特生物过滤股份有限公司；
16.注射器，0.45μm滤膜、各规格的培养皿，培养瓶，多孔培养板，各种规格离心管购自Corning。
二、联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的构建方法
(一)质粒提取
LB液体培养基的配制方法：电子天平称取5g液体培养基干粉于500mL锥形瓶，加100mL超纯水，锡箔纸封口后，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，冷却至40℃-50℃时，以1000:1加入0.2％氨苄青霉素(AMP)，小心混匀后，转入到干净的500mL试剂瓶中备用，储存条件为4℃。
LB固体培养基的配制方法：电子天平称取5g固体培养基干粉于500mL锥形瓶，加100mL超纯水，锡箔纸封口后，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，冷却至40℃-50℃时，以1000:1加入0.2％氨苄青霉素，小心混匀后，倒板，凝固后，贴封口膜储存于4℃。
从-80℃冰箱分别取出含有慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和PUC19质粒的甘油菌，分别取5μL接种于5mL LB液体培养基(AMP抗性)中，于恒温摇床振荡培养12-16h，条件为37℃，250rmp。
按照购自天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒(货号：DP103-03)的说明书进行质粒提取，获得慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和含有双靶点(EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体)CAR结构的PUC19质粒。
将已提取的慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro、和含有双靶点(E EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体)CAR结构的PUC19质粒同时进行EcoRI、NotI双酶切，将酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察并记录结果，检测结果见附图3。
用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号：DP209-02)说明书进行目的条带回收，将回收片段按CAR结构：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro＝5:1的摩尔比进行连接，并进行转化至感受态细胞，将转化后的感受态细胞滴于预热的固体培养基上，做好标记，在3 7℃孵箱过夜。
(三)提质粒、酶切验证、测序
挑取部分菌落于5mL LB液体培养基(AMP抗性)中，于恒温摇床进行增菌培养并进行质粒抽提，质粒抽提之前取出500μL于1.5mL Ep管中，用作菌种保存，储存于-80℃；将抽提产物采用EcoRI、NotI双酶切验证，取条带正确的质粒1μg送生工生物工程(上海)有限公司进行测序(如图4所示，图中目的片段为含有CAR结构的PUC19质料)，条带异常的质粒以及留存的菌液均丢弃。将测序结果正确的质粒进行抽提，测序结果错误的质粒及其菌液均丢弃。
三、联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的应用
(一)浓缩病毒液的制备
采用三质粒包装系统进行慢病毒包装。三质粒分别为含有CAR结构的慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，慢病毒包装质粒pMD2G，载体质粒PSPAX2。细胞为293T细胞。
具体实施步骤如下：
(1)转染前24h内进行铺板：一般选择传代次数在3代以内的细胞，根据细胞生长密度和状态调整细胞密度，生长密度达到80％的293T细胞进行铺板；
(2)待生长密度达60-90％，细胞状态良好，即可进行病毒包装；
(3)按照PSPAX2质粒、pMD2G质粒、所述联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体(重组质粒)的比例为27:3:20进行病毒包装，以6cm皿为例，所需的三质粒混合液配比如下：按照各质粒浓度确定质粒加入量。
重组质粒 3μg
pMD2G 0.5μg
PSPAX2 4μg
(4)转染试剂选择lipofectamine 2000(4℃保存)，加入量为2μL/μg质粒；
(5)将(3)中质粒混合物与(4)中转染试剂混合物混于一管中，室温静止20min后，加入换液细胞中，继续培养；
(6)分别收集48h、72h后培养上清，通过0.45μm滤膜过滤；
(7)将收集的病毒液采用PEG8000浓缩法进行浓缩，并测定病毒滴度，储存于﹣80℃备用。
(二)病毒液感染T细胞
1、PBMC分离
1)用含有肝素的真空采血管收集约6mL人外周新鲜血液；
2)稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀；
3)加样：取50mL离心管，吸取6mL Ficoll(淋巴细胞分离液)于离心管中(Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1)，离心管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面；
4)离心：18-20℃，2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层；
5)回收：将移液管直接插入云雾层(或者先吸去上层的血浆)，轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中；
6)洗涤：加入至少于PBMC(外周血单个核细胞)体积3倍的PBS，18-20℃，2000rpm，10min，两次；
7)细胞计数：弃上清，加1mL淋巴细胞培养基，吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。采用血细胞计数板计数：取一滴PBMC悬液与一滴2％台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。细胞数/mL＝4个大方格细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
2、T细胞的激活与慢病毒感染
(1)实验前准备：
1)Anti-CD3单抗液配制：CD3单抗50μg溶于5mLPBS溶液中，配制成浓度为10μg/mL的溶液，溶解后按照每EP管400μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存。(此浓度下每24孔板内加入175μL抗体溶液)；
2)Anti-CD28单抗液配制：CD28单抗50μg溶于5mLPBS溶液中，配制成浓度为10μg/mL的溶液，溶解后按照每EP管400μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存。(此浓度下每24孔板内加入175μL抗体溶液)；
3)CH-38蛋白液配制：CH38蛋白500μg溶于10mL PBS溶液中，配制成50μg/mL溶液，溶解后按照每EP管400μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存。(此浓度下每24孔板内加入175μL抗体溶液)；
4)IL-2因子配制：IL-2蛋白固体按1×107U/mg进行配制，每50μg IL-2蛋白加入500μL的PBS溶液，配制成103U/μL的浓度，配制后按照每EP中加入32μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存；
5)淋巴细胞培养基配制：Takara-551h3淋巴细胞培养基每50mL加入30μL已分装的IL-2溶液，0.5mL双抗，250μL自体血清。
(2)实验流程：
Day﹣1：24孔板包被：取Corning 24孔板，以2孔为例，在2孔中各加入CD3单抗液175μL，CD28单抗液175μL，CH-38蛋白液175μL。加入后轻震荡混匀后，用封口膜将孔板封闭，放入4℃冰箱内过夜。细胞复苏：取液氮中的PBMC细胞，复苏；
Day0：清洗包被板：取出昨日包被的24孔板，弃去上清，PBS清洗2次后，加入PBS待用；
PBMC铺板：收集PBMC细胞，计数并将浓度最终调整到0.7×106cells/mL，每孔中加入400μL细胞悬液，即每孔中加入2.8×105个cells；
病毒感染：以MOI＝30进行感染，配制1mL病毒培养基悬液，加入24孔板中，1000g离心30min，将离心机温度调节至32℃；
Day1-Day2：观察细胞状态；
Day3：将24孔板中的所有细胞转移至加入10mL培养基的25cm2培养瓶中，观察细胞状态；
Day4-Day7：观察细胞状态以及细胞数量，若细胞开始明显扩增，并局部区域细胞密度较多，加入10mL培养基；
Day8：此时25cm2培养瓶中的细胞已经长满，转移到加入20mL培养基的75cm2培养瓶中继续培养；
Day9-Day10：观察细胞状态，当细胞在75cm2培养瓶中处于充满状态时，停止继续生长，富集细胞并计算扩增比例，流式检测检测细胞分型，进行细胞杀伤检测或细胞冻存等后续实验。
四、CAR-T细胞的鉴定与检测
(一)流式细胞术检测CAR结构阳性表达率
1、检测细胞CD3、CD4、CD8阳性率
1)将取得的NC组细胞(未进行病毒感染)和样本组细胞(已进行病毒感染)使用PBS+2％BSA温和洗涤2次，离心条件为1500rpm、3min；
2)NC管中加入1000μLPBS+2％BSA，分装成5管，分别为NC、NC-CD3、NC-CD4、NC-CD8、NC-CD3/4/8，样本管中加入200μLPBS，标记为样本-CD3/4/8，分别加入CD3/4/8抗体5μL/20μL/20μL，温和混匀；
3)室温避光孵育30min后，1500rpm，3min，弃去废液；
4)加入200μLPBS+2％BSA，温和混匀重悬，1500rpm/3min，弃去废液；
5)加入100μLPBS+2％BSA，温和混匀重悬后即可上机检测；
如图5所示，CD3+细胞占所检测细胞总量的98.18％，CD4-CD8+细胞占CD3+细胞总量的60.40％，CD4+CD8-细胞占CD3+细胞总量的32.56％，符合T细胞的表型。
2、检测CAR结构阳性表达率
1)将取得的NC组细胞(未进行病毒感染)和样本组细胞(已进行病毒感染)，使用PBS+2％BSA温和洗涤2次，1500rpm/6min，弃去废液；
2)NC管中加入200μLPBS，重悬；样本管中加入100μLPBS，重悬，再加入100μL一抗工作液(3μg/mL)，混匀；
3)室温孵育1h，1500rpm/3min，弃去废液；
4)加入200μLPBS，温和混匀重悬，1500rpm/3min，弃去废液；
5)NC管中加入200μLPBS，重悬；样本管中加入200μLPBS，重悬，再加入5μL二抗工作液，混匀；
6)室温避光孵育1h后，1500rpm/3min，弃去废液，使用PBS+2％BSA温和洗涤3次，离心条件为1500rpm、3min，弃去废液；
7)加入100μLPBS，温和混匀重悬后上机检测；
如图5所示，CAR-T细胞占T细胞总量的49.58％
(二)RTCA实时细胞杀伤检测
1)以卵巢癌细胞SK-OV-3为例，消化后制备成细胞悬液，吹打混匀后进行细胞计数；
2)将细胞悬液稀释成5×104cells/mL浓度，放置在冰上备用；
3)将RTCA检测板取出，加入50μL培养基；
4)在RTCA检测仪程序中编选本次试验的试验程序；
5)将RTCA检测板置入检测仪中，观测程序中Messege项是否正常，待正常后启动实验程序；
6)程序1运行完毕后取出检测板，在对应孔中加入肿瘤细胞悬液100μL，加入之前混匀每管细胞悬液；
7)细胞悬液加入后，将检测板置入培养箱中静置30min，使细胞自然沉降；
8)30min后，将检测板放入检测仪中，运行程序2；
9)24h后观察细胞生长曲线，待细胞处于对数生长期时，准备加入效应T细胞；
10)培养瓶中取出效应T细胞，离心，清洗，计数，按不同效靶比配制效应组细胞浓度；
11)暂停程序，取出检测板，对应位置加入效应细胞50μL，放回检测仪中，继续程序，每天观察。
图6为RTCA检测双靶点(EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体)CAR-T细胞对SK-OV-3细胞的杀伤效率，图中5:1表示：效应细胞：靶细胞＝5:1；2.5:1表示：效应细胞：靶细胞＝2.5:1；1.25:1表示：效应细胞：靶细胞＝1.25:1；NCT5:1表示：效应细胞为未感染的T细胞，效应细胞：靶细胞＝5:1；NCT2.5:1表示：效应细胞为未感染的T细胞，效应细胞：靶细胞＝2.5:1；NCT1.25:1表示：效应细胞为未感染的T细胞，效应细胞：靶细胞＝1.25:1。如图所示，CAR-T细胞的杀伤效果明显强于未感染的T细胞，且其杀伤效果具有浓度依赖性，效应细胞比例越高，杀伤效果越好。
(三)ELISA检测细胞因子分泌
1)用ddH2O稀释10×包被液buffer，按比例配制250×包被蛋白，例如2mL包被液buffer中加入8μL 250×包被蛋白；
2)向Corning 9018 Elisa高亲和96孔板中加入100μL/孔1)中配制完成的包被液，密封放入4℃冰箱中，过夜；
3)使用PBST(0.05％Tween 20)对已包被的96孔板进行清洗，3次；
4)用ddH2O配制5×封闭液，200μL/孔加入，室温下封闭1h；
5)按瓶装标准品要求加入1×封闭液进行配制，进行7次倍比稀释，同时对样品(取RTCA检测实验中的CAR-T细胞对SK-OV-3杀伤24h后的上清液)进行5倍稀释；
6)PBST清洗封闭后的板子5次，加入标准品和稀释后的样品液，室温孵育2h或4℃过夜；
7)PBST清洗4次；
8)使用1×封闭液稀释250×检测抗体，100μL/孔中加入，室温孵育1h；
9)PBST清洗4次，使用1×封闭液稀释250×HRP，100μL/孔中加入，室温孵育30min；
10)PBST清洗5次，每孔中加入1×TMB试剂100μL，室温孵育15min；
11)加入50μL/孔终止液终止显色；
12)酶标仪450nm检测OD值。
图7为CAR-T细胞对SK-OV-3杀伤24h后IFNgamma因子的ELISA检测，图中5:1表示：效应细胞：靶细胞＝5:1；2.5:1表示：效应细胞：靶细胞＝2.5:1；1.25:1表示：效应细胞：靶细胞＝1.25:1。CAR-T细胞与SK-OV-3细胞共培养24h后，有明显的细胞因子IFNgamma释放，效应细胞：靶细胞为5:1时，细胞因子IFNgamma释放最多。
综上所述，本发明提供的联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体应用于感染T细胞，获得CAR-T细胞可同时表达针对卵巢癌细胞表面的肿瘤相关抗原EpCAM、MSLN的抗体Anti-EpCAM、Anti-MSLN，使得其能够更精准的识别并杀伤同时表达上述两种肿瘤相关抗原的卵巢癌细胞，大大增加了CAR-T细胞的靶向性，降低脱靶效应；另外，本发明中提到的CAR结构赋予了T细胞更强的增殖性，持久的生命力，使其表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。
上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体，其特征在于，包括嵌合抗原受体和载体，所述嵌合抗原受体连接在所述载体上，
所述嵌合抗原受体包括EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体两种特异性结构，所述EpCAM单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，
所述嵌合抗原受体的结构组成为CD8leader-EpCAM scFv-(G4S)5-MSLNscFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ。
2.根据权利要求1所述的联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体，其特征在于，所述CD8leader可表达引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的引导肽，所述CD8leader的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，
所述EpCAM scFv表示EpCAM单链抗体，
所述(G4S)5为单链抗体间铰链Inner-Linker，且核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EpCAM单链抗体和MSLN单链抗体通过所述(G4S)5进行连接，
所述MSLN scFv表示MSLN单链抗体，
所述CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，且核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，
所述CD28-CD137为共刺激结构域，所述CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，
所述CD3ζ为为信号转导域，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1所述的联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体，其特征在于，所述载体包括PUC19质粒、慢病毒载体。
4.根据权利要求4所述的联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。
5.联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的构建方法，用于构建如权利要求1-4任一项所述的联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体，其特征在于，所述构建方法的步骤如下：
(1)将所述嵌合抗原受体保存在所述PUC19质粒上；
(2)将含有步骤(1)中PUC19质粒和所述慢病毒载体进行双酶切，将酶切产物分别经过琼脂糖凝胶电泳分离，获得双酶切后的含有所述嵌合抗原受体结构的目的片段和双酶切后慢病毒载体，
(3)将步骤(2)中的目的片段和步骤(2)中的慢病毒载体进行连接，将连接产物进行转化，提取质粒，获得含有嵌合抗原受体结构的重组质粒，所述重组质粒为联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体。
6.根据权利要求5所述的联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中的双酶切位点为EcoRI和NotI，所述(3)的含有所述嵌合抗原受体结构的目的片段和慢病毒载体连接的摩尔比为5:1。
7.联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的应用，基于权利要求1-4任一项所述的联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体，其特征在于，联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体进行慢病毒包装，经离心浓缩后获得高滴度的慢病毒悬液，所述慢病毒悬液用于感染T细胞，获得CAR-T细胞，所述CAR-T细胞通过识别特异性蛋白EpCAM和MSLN靶向杀伤卵巢癌细胞。
8.根据权利要求7所述的联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的应用，其特征在于，所述慢病毒包装采用三质粒包装系统，所述三质粒包装系统包括PSPAX2质粒、pMD2G质粒和所述联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体，所述PSPAX2质粒、所述pMD2G质粒、所述联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体的比例为27:3:20，所述慢病毒包装采用293T细胞作为慢病毒的包装细胞。
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