CN109628492A - 联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用 - Google Patents

联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109628492A
CN109628492A CN201910019774.1A CN201910019774A CN109628492A CN 109628492 A CN109628492 A CN 109628492A CN 201910019774 A CN201910019774 A CN 201910019774A CN 109628492 A CN109628492 A CN 109628492A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
1mab
chain antibody
stomach cancer
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201910019774.1A
Other languages
English (en)
Inventor
田晓丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Yi Hao Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Yi Hao Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Yi Hao Biotechnology Co Ltd filed Critical Shanghai Yi Hao Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201910019774.1A priority Critical patent/CN109628492A/zh
Publication of CN109628492A publication Critical patent/CN109628492A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于医药生物领域，具体涉及联合MSLN单链抗体和PD‑1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用。该CAR载体包括MSLN单链抗体和PD‑1mAb，CAR结构为CD8leader‑MSLN scfv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ‑IRES‑PD‑1mAb，以病毒感染方式获得CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，靶向识别和杀伤MSLN阳性表达的胃癌细胞。PD‑1mAb与T细胞表面的PD‑1结合，阻断PD‑1和PD‑L1的结合，从而上调T细胞的生长和增殖，使CAR‑T细胞表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。

Description

联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构 建方法和应用
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用。
背景技术
胃癌是我国目前临床比较常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和高死亡率的特点，在我国，胃癌的发病率和死亡率占恶性肿瘤的第三位。目前，胃癌的治疗方式主要有手术治疗、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗。手术是唯一可能治愈胃癌的方式，但进展期胃癌的单纯手术治疗可能会存在肉眼或镜下残留灶，使复发转移率大大增加；放化疗毒副作用大，疗效也不能达到满意效果；因此新的治疗方法亟待提出。
LAK细胞、DC、CIK细胞都曾作为肿瘤的免疫治疗手段，但是以上各种治疗方法均缺乏特异性识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)和杀伤特定肿瘤靶细胞的能力；而肿瘤免疫编辑的过程又会使靶细胞表面的主要组织相容性复合物(mainhistocompatibility complex，MHC)在肿瘤细胞表面表达下降，形成免疫逃逸，使肿瘤细胞可成功躲避T细胞攻击。
嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为过表达能识别特定的肿瘤表面抗原的单链抗体可变区基因片段，从而使T细胞识别特定抗原、杀伤表达该抗原的靶细胞。同时，由于CAR-T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受MHC的限制。
间皮素(MSLN)是一种存在于细胞表面的锚定糖蛋白，因其在正常组织中不表达或间皮组织中低表达，但在30％的肿瘤中高表达，如卵巢癌、胃癌、结肠癌等实体瘤，而成为备受关注的肿瘤细胞特异性靶向抗原。
PD-1(Programmed cell death protein 1)程序性细胞死亡受体1，是属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，在T细胞和前B细胞上表达。通过下调免疫系统并促进自身耐受在调节免疫系统对人体细胞的应答方面起作用，预防自身免疫性疾病。PD-L1(programmed death ligand 1)是PD-1的配体，与T细胞上的PD-1结合后，可抑制T细胞增殖和活化，使T细胞处于失活状态。研究发现，多种肿瘤细胞中PD-L1均有上调表达，因此促进了肿瘤免疫逃逸。PD-1单克隆抗体(PD-1mAb)可与T细胞表面的PD-1结合，阻断PD-1和PD-L1的结合，从而上调T细胞的生长和增殖，增强T细胞对肿瘤细胞的识别，激活其攻击和杀伤功能，通过调动人体自身的免疫功能实现抗肿瘤作用。
发明内容
本发明目的是为了解决上述问题，本发明提供了能靶向MSLN并联合PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体。本发明针对胃癌细胞特异性蛋白MSLN，有效避免肿瘤免疫逃逸；通过PD-1mAb阻断PD-1和PD-L1的结合，从而提高CAR-T免疫疗法抗胃癌的效果。此外，还包括联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的构建方法及其应用。
本发明提供的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体具体技术方案如下：
联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，包括嵌合抗原受体和载体，所述嵌合抗原受体连接在所述载体上，所述嵌合抗原受体包括两种特异性结构分别为：MSLN单链抗体和PD-1mAb，所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述PD-1mAb的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的结构组成为CD8leader-MSLNscFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-IRES-PD-1mAb。
在某些实施方式中，所述CD8leader可表达引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的引导肽，所述CD8leader的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，
所述MSLN scFv表示MSLN单链抗体，
所述CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，且核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，
所述CD28-CD137为共刺激结构域，所述CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，
所述CD3ζ为信号转导域，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述IRES为核糖体识别位点，是实现同一载体高效共表达两个基因的元件，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在某些实施方式中，所述载体包括PUC19质粒和慢病毒载体，所述慢病毒载体插入所述PUC19质粒上。
在某些实施方式中，所述慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。
本发明还提供了构建上述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的方法，步骤如下：
(1)将所述嵌合抗原受体保存在所述PUC19质粒上；
(2)将含有步骤(1)中PUC19质粒和所述慢病毒载体进行双酶切，将酶切产物分别经过琼脂糖凝胶电泳分离，获得双酶切后的含有所述嵌合抗原受体的目的片段和双酶切后慢病毒载体，
(3)将步骤(2)中的含有所述嵌合抗原受体的目的片段和步骤(2)中的慢病毒载体进行连接，将连接产物进行转化，提取质粒，获得含有嵌合抗原受体结构的重组质粒，所述重组质粒为联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体。
在某些实施方式中，所述步骤(2)中的双酶切为EcoRI和NotI，所述(3)中含有所述嵌合抗原受体的目的片段和慢病毒载体连接的摩尔比为5:1。
本发明还提供了联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的应用，将所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体进行慢病毒包装，经离心浓缩后获得高滴度的慢病毒悬液，所述慢病毒悬液用于感染T细胞，获得CAR-T细胞，所述CAR-T细胞通过识别特异性蛋白MSLN和PD-1靶向杀伤胃癌细胞。
在某些实施方式中，所述慢病毒包装采用三质粒包装系统，所述三质粒包装系统包括PSPAX2质粒、pMD2G质粒和所述联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，所述PSPAX2质粒、所述pMD2G质粒、所述联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的比例为27:3:20，所述慢病毒包装采用293T细胞作为慢病毒的包装细胞。
本发明具有以下有益效果：本发明针对治疗载体的CAR结构包括MSLN单链抗体、PD-1mAb两个特异性结构；MSLN单链抗体是根据多种胃癌细胞表面会表达肿瘤相关抗原MSLN确定的特异性结构，该结构表达的Anti-MSLN特异性蛋白负责识别TAA，一方面可靶向性杀伤肿瘤细胞；另一方面，抗体Anti-PD-1可与T细胞表面的PD-1结合，阻断PD-1和PD-L1的结合，从而下调了PD-1对T细胞的影响，增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，同时，增强人体自身的免疫功能实现抗肿瘤作用。当T细胞通过病毒感染方式获得该载体并表达该CAR结构后，T细胞即可靶向性识别并杀伤胃癌细胞。
附图说明
图1是本发明的慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro结构示意图；
图2是本发明的CAR结构示意图；
图3是本发明的慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro EcoRI与NotI双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；
图4是本发明的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体EcoRI与NotI双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；
图5是本发明的CAR-T细胞的流式细胞检测图；
图6是本发明的RTCA检测CAR-T细胞对AGS的杀伤效率曲线图；
图7是本发明的CAR-T细胞对AGS杀伤24h后IFNgamma因子的ELISA检测柱状图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明提供了联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，具体方案如下：包括嵌合抗原受体和载体，嵌合抗原受体连接在载体上，嵌合抗原受体包括两种特异性结构分别为：MSLN单链抗体和PD-1mAb，MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，PD-1mAb的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。本发明提供的载体的CAR结构包括MSLN单链抗体，MSLN单链抗体是根据MSLN在胃癌组织中高表达而确定的特异性结构，该结构表达的抗体Anti-MSLN负责识别胃癌组织中高表达的MSLN，通过MSLN可靶向性结合胃癌细胞，可有效避免肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制。PD-1mAb可与T细胞表面的PD-1结合，阻断PD-1和PD-L1的结合，从而下调了PD-1对T细胞的影响，增强T细胞对胃癌细胞的杀伤作用，同时，增强人体自身的免疫功能实现抗肿瘤作用。
嵌合抗原受体的结构组成为CD8leader-MSLNscFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-IRES-PD-1mAb(如图2所示)。CD8leader为CD8蛋白的引导肽部分，可以将蛋白定位于细胞外，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；MSLN scfv是根据胃癌组织高表达MSLN设计的特异性抗原结合域；CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，能将CAR结构锚定于T细胞膜上，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；CD28-CD137为共刺激结构域，转导增殖信号并诱导细胞因子的产生，刺激T细胞活化，CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，CD137核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；CD3ζ为信号转导域，当胞外区和目标抗原结合时，就会向胞内传导TCR样信号，激活T细胞，发挥靶向性杀伤肿瘤细胞的作用，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，IRES为核糖体识别位点，能招募核糖体对mRNA进行翻译，当IRES与外源cDNA融合时，IRES能独立地起始翻译，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；PD-1mAb与T细胞表面的PD-1结合，阻断PD-1和PD-L1的结合，从而上调T细胞的生长和增殖，增强T细胞对肿瘤细胞的识别，激活其攻击和杀伤功能，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。本发明中提到的CAR结构赋予了T细胞更强的增殖性，持久的生命力，使其表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。
载体包括PUC19质粒、慢病毒载体。慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。通过Snap Gene软件分析该载体并查找相关文献可知，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro用EcoRI与NotI双酶切插入片段。该表达载体包括：CMV启动子-是哺乳动物细胞特异性启动子，驱动能力较强；多克隆位点(MCS)-包含多个限制性酶切位点(restriction site)，是外源基因插入的位置；WPRE元件-可提高mRNA的polyA加尾效率，改进转移基因的表达效率；SV40polyA序列-能有效终止转录以及为转录的mRNA添加PolyA尾；杂交型RSV/5’LTR-含有启动子和增强子等调控元件，使其在293T细胞中高水平的表达全长病毒转录物；遗传要素(cPPT，gag，env，LTRs)-用于包装、转导和稳定地将病毒表达结构整合到宿主的基因组DNA中；SV40 origin-使质粒在包装细胞中稳定增殖。
该慢病毒表达载体可作为使目的基因在几乎所有哺乳动物细胞包括非分裂细胞和分裂细胞中表达的最有效载体，其可容载外源基因片段大，转染效率较高，对T细胞也能达到满意的转染效果。
一、实验材料
1.慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，慢病毒包装质粒pMD2G，载体质粒PSPAX2购自SBI；慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro结构如图1所示；
2.CAR结构序列由上海怡豪生物科技有限公司设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以PUC19质粒形式保存；
3.限制性核酸内切酶EcoRI、NotI购自NEB；
4.T4 DNA ligase、Free H2O购自宝生物；
5.感受态细胞购自Trans；
6.胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；
7.293T细胞、AGS细胞购自中科院细胞库；
8.FBS、DMEM、1640培养基，PBS，Opti-MEM，lipofectamine 2000购自Gibco；
9.CD3单抗、CD28单抗、CH38蛋白、IL-2购自于上海近岸蛋白质科技有限公司；
10.Multiskan GO酶标仪+uDrop超微量板、流式细胞仪购自ThermoFisher；
11.HE120水平电泳槽、Tanon凝胶成像仪购自Tanon；
12.隔水式恒温培养箱、恒温培养摇床购自上海一恒科技有限公司；
13.Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell小型电泳系统购自Bio-Rad；
14.奥林巴斯显微镜购自奥林巴斯；
15.接种环、涂布棒购自洁特生物过滤股份有限公司；
16.注射器，0.45μm滤膜、各规格的培养皿，培养瓶，多孔培养板，各种规格离心管购自Corning。
二、联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的构建方法
(一)质粒提取
LB液体培养基的配制方法：电子天平称取5g液体培养基干粉于500mL锥形瓶，加100mL超纯水，锡箔纸封口后，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，冷却至40℃～50℃时，以1000:1加入0.2％氨苄青霉素(AMP)，小心混匀后，转入到干净的500mL试剂瓶中备用，储存条件为4℃。
LB固体培养基的配制方法：电子天平称取5g固体培养基干粉于500mL锥形瓶，加100mL超纯水，锡箔纸封口后，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，冷却至40℃-50℃时，以1000:1加入0.2％氨苄青霉素，小心混匀后，倒板，凝固后，贴封口膜储存于4℃。
从-80℃冰箱分别取出含有慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和PUC19质粒的甘油菌，分别取5μL接种于5mL LB液体培养基(AMP抗性)中，于恒温摇床振荡培养12-16h，条件为37℃，250rmp。
按照购自天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒(货号：DP103-03)的说明书进行质粒提取，获得慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和含有MSLN单链抗体和PD-1mAb的CAR结构的PUC19质粒。
(二)酶切、连接、转化
将已提取的慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和含有MSLN单链抗体和PD-1mAb的CAR结构的PUC19质粒同时进行EcoRI、NotI双酶切，将酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察并记录结果，检测结果见附图3。
用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号：DP209-02)说明书进行目的条带回收，将回收片段按CAR结构：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro＝5:1的摩尔比进行连接，并进行转化至感受态细胞，将转化后的感受态细胞滴于预热的固体培养基上，做好标记，在37℃孵箱过夜。
(三)提质粒、酶切验证、测序
挑取部分菌落于5mL LB液体培养基(AMP抗性)中，于恒温摇床进行增菌培养并进行质粒抽提，质粒抽提之前取出500μL于1.5mL Ep管中，用作菌种保存，储存于-80℃；将抽提产物采用EcoRI、NotI双酶切验证，取条带正确的质粒1μg送生工生物工程(上海)有限公司进行测序(如图4所示，图中目的片段为含有CAR结构的PUC19质料)，条带异常的质粒以及留存的菌液均丢弃。将测序结果正确的质粒进行抽提，测序结果错误的质粒及其菌液均丢弃。
三、联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的应用
(一)浓缩病毒液的制备
采用三质粒包装系统进行慢病毒包装。三质粒分别为含有CAR结构的慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，慢病毒包装质粒pMD2G，载体质粒PSPAX2。细胞为293T细胞。
具体实施步骤如下：
(1)转染前24h内进行铺板：一般选择传代次数在3代以内的细胞，根据细胞生长密度和状态调整细胞密度，生长密度达到80％的293T细胞进行铺板；
(2)待生长密度达60-90％，细胞状态良好，即可进行病毒包装；
(3)按照PSPAX2质粒、pMD2G质粒、联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体(重组质粒)的比例为27:3:20进行病毒包装，以6cm皿为例，所需的三质粒混合液配比如下：按照各质粒浓度确定质粒加入量。
重组质粒 3μg
pMD2G 0.5μg
PSPAX2 4μg
(4)转染试剂选择lipofectamine 2000(4℃保存)，加入量为2μL/μg质粒；
(5)将(3)中质粒混合物与(4)中转染试剂混合物混于一管中，室温静止20min后，加入换液细胞中，继续培养；
(6)分别收集48h、72h后培养上清，通过0.45μm滤膜过滤；
(7)将收集的病毒液采用PEG8000浓缩法进行浓缩，并测定病毒滴度，储存于﹣80℃备用。
(二)病毒液感染T细胞
1、PBMC分离
1)用含有肝素的真空采血管收集约6mL人外周新鲜血液；
2)稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀；
3)加样：取50mL离心管，吸取6mL Ficoll(淋巴细胞分离液)于离心管中(Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1)，离心管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面；
4)离心：18-20℃，2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层；
5)回收：将移液管直接插入云雾层(或者先吸去上层的血浆)，轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中；
6)洗涤：加入至少于PBMC(外周血单个核细胞)体积3倍的PBS，18-20℃，2000rpm，10min，两次；
7)细胞计数：弃上清，加1mL淋巴细胞培养基，吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。采用血细胞计数板计数：取一滴PBMC悬液与一滴2％台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。细胞数/mL＝4个大方格细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
2、T细胞的激活与慢病毒感染
(1)实验前准备：
1)Anti-CD3单抗液配制：CD3单抗50μg溶于5mLPBS溶液中，配制成浓度为10μg/mL的溶液，溶解后按照每EP管400μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存。(此浓度下每24孔板内加入175μL抗体溶液)；
2)Anti-CD28单抗液配制：CD28单抗50μg溶于5mLPBS溶液中，配制成浓度为10μg/mL的溶液，溶解后按照每EP管400μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存。(此浓度下每24孔板内加入175μL抗体溶液)；
3)CH-38蛋白液配制：CH38蛋白500μg溶于10mL PBS溶液中，配制成50μg/mL溶液，溶解后按照每EP管400μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存。(此浓度下每24孔板内加入175μL抗体溶液)；
4)IL-2因子配制：IL-2蛋白固体按1×107U/mg进行配制，每50μg IL-2蛋白加入500μL的PBS溶液，配制成103U/μL的浓度，配制后按照每EP中加入32μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存；
5)淋巴细胞培养基配制：Takara-551h3淋巴细胞培养基每50mL加入30μL已分装的IL-2溶液，0.5mL双抗，250μL自体血清。
(2)实验流程：
Day﹣1：24孔板包被：取Corning 24孔板，以2孔为例，在2孔中各加入CD3单抗液175μL，CD28单抗液175μL，CH-38蛋白液175μL。加入后轻震荡混匀后，用封口膜将孔板封闭，放入4℃冰箱内过夜。细胞复苏：取液氮中的PBMC细胞，复苏；
Day0：清洗包被板：取出昨日包被的24孔板，弃去上清，PBS清洗2次后，加入PBS待用；
PBMC铺板：收集PBMC细胞，计数并将浓度最终调整到0.7×106cells/mL，每孔中加入400μL细胞悬液，即每孔中加入2.8×105个cells；
病毒感染：以MOI＝30进行感染，配制1mL病毒培养基悬液，加入24孔板中，1000g离心30min，将离心机温度调节至32℃；
Day1-Day2：观察细胞状态；
Day3：将24孔板中的所有细胞转移至加入10mL培养基的25cm2培养瓶中，观察细胞状态；
Day4-Day7：观察细胞状态以及细胞数量，若细胞开始明显扩增，并局部区域细胞密度较多，加入10mL培养基；
Day8：此时25cm2培养瓶中的细胞已经长满，转移到加入20mL培养基的75cm2培养瓶中继续培养；
Day9-Day10：观察细胞状态，当细胞在75cm2培养瓶中处于充满状态时，停止继续生长，富集细胞并计算扩增比例，流式检测检测细胞分型，进行细胞杀伤检测或细胞冻存等后续实验。
四、CAR-T细胞的鉴定与检测
(一)流式细胞术检测CAR结构阳性表达率
1、检测细胞CD3、CD4、CD8阳性率
1)将取得的NC组细胞(未进行病毒感染)和样本组细胞(已进行病毒感染)使用PBS+2％BSA温和洗涤2次，离心条件为1500rpm、3min；
2)NC管中加入1000μLPBS+2％BSA，分装成5管，分别为NC、NC-CD3、NC-CD4、NC-CD8、NC-CD3/4/8，样本管中加入200μLPBS，标记为样本-CD3/4/8，分别加入CD3/4/8抗体5μL/20μL/20μL，温和混匀；
3)室温避光孵育30min后，1500rpm，3min，弃去废液；
4)加入200μLPBS+2％BSA，温和混匀重悬，1500rpm/3min，弃去废液；
5)加入100μLPBS+2％BSA，温和混匀重悬后即可上机检测。
如图5所示，CD3+细胞占所检测细胞总量的98.39％，CD4-CD8+细胞占CD3+细胞总量的80.23％，CD4+CD8-细胞占CD3+细胞总量的14.22％，符合T细胞的表型。
2、检测CAR结构阳性表达率
1)将取得的NC组细胞(未进行病毒感染)和样本组细胞(已进行病毒感染)，使用PBS+2％BSA温和洗涤2次，1500rpm/6min，弃去废液；
2)NC管中加入200μLPBS，重悬；样本管中加入100μLPBS，重悬，再加入100μL一抗工作液(3μg/mL)，混匀；
3)室温孵育1h，1500rpm/3min，弃去废液；
4)加入200μLPBS，温和混匀重悬，1500rpm/3min，弃去废液；
5)NC管中加入200μLPBS，重悬；样本管中加入200μLPBS，重悬，再加入5μL二抗工作液，混匀；
6)室温避光孵育1h后，1500rpm/3min，弃去废液，使用PBS+2％BSA温和洗涤3次，离心条件为1500rpm、3min，弃去废液；
7)加入100μLPBS，温和混匀重悬后上机检测。
如图5所示，CAR-T细胞占T细胞总量的59.53％。
(二)RTCA实时细胞杀伤检测
1)以胃癌细胞AGS为例，消化后制备成细胞悬液，吹打混匀后进行细胞计数；
2)将细胞悬液稀释成5×104cells/mL浓度，放置在冰上备用；
3)将RTCA检测板取出，加入50μL培养基；
4)在RTCA检测仪程序中编选本次试验的试验程序；
5)将RTCA检测板置入检测仪中，观测程序中Messege项是否正常，待正常后启动实验程序；
6)程序1运行完毕后取出检测板，在对应孔中加入肿瘤细胞悬液100μL，加入之前混匀每管细胞悬液；
7)细胞悬液加入后，将检测板置入培养箱中静置30min，使细胞自然沉降；
8)30min后，将检测板放入检测仪中，运行程序2；
9)24h后观察细胞生长曲线，待细胞处于对数生长期时，准备加入效应T细胞；
10)培养瓶中取出效应T细胞，离心，清洗，计数，按不同效靶比配制效应组细胞浓度；
11)暂停程序，取出检测板，对应位置加入效应细胞50μL，放回检测仪中，继续程序，每天观察。
图6为RTCA检测MSLN单链抗体和PD-1mAb的CAR-T细胞对AGS细胞的杀伤效率，图中5:1表示：效应细胞：靶细胞＝5:1；2.5:1表示：效应细胞：靶细胞＝2.5:1；1.25:1表示：效应细胞：靶细胞＝1.25:1；NC表示：未加效应细胞，仅有靶细胞；NCT表示：效应细胞为未感染的T细胞，效应细胞：靶细胞＝1.25:1；NC表示未加效应细胞，仅有肿瘤细胞。如图所示，CAR-T细胞的杀伤效果明显强于未感染的T细胞，且其杀伤效果具有浓度依赖性，效应细胞比例越高，杀伤效果越好。
(三)ELISA检测细胞因子分泌
1)用ddH2O稀释10×包被液buffer，按比例配制250×包被蛋白，例如2mL包被液buffer中加入8μL 250×包被蛋白；
2)向Corning 9018Elisa高亲和96孔板中加入100μL/孔1)中配制完成的包被液，密封放入4℃冰箱中，过夜；
3)使用PBST(0.05％Tween 20)对已包被的96孔板进行清洗，3次；
4)用ddH2O配制5×封闭液，200μL/孔加入，室温下封闭1h；
5)按瓶装标准品要求加入1×封闭液进行配制，进行7次倍比稀释，同时对样品(取RTCA检测实验中的CAR-T细胞对AGS杀伤24h后的上清液)进行5倍稀释；
6)PBST清洗封闭后的板子5次，加入标准品和稀释后的样品液，室温孵育2h或4℃过夜；
7)PBST清洗4次；
8)使用1×封闭液稀释250×检测抗体，100μL/孔中加入，室温孵育1h；
9)PBST清洗4次，使用1×封闭液稀释250×HRP，100μL/孔中加入，室温孵育30min；
10)PBST清洗5次，每孔中加入1×TMB试剂100μL，室温孵育15min；
11)加入50μL/孔终止液终止显色；
12)酶标仪450nm检测OD值。
图7为CAR-T细胞对AGS杀伤24h后IFNgamma因子的ELISA检测，图中5:1表示：效应细胞：靶细胞＝5:1；2.5:1表示：效应细胞：靶细胞＝2.5:1；1.25:1表示：效应细胞：靶细胞＝1.25:1。CAR-T细胞与AGS细胞共培养24h后，有明显的细胞因子IFNgamma释放，效应细胞：靶细胞为5:1时，细胞因子IFNgamma释放最多。
综上所述，本发明提供的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体应用于感染T细胞，获得CAR-T细胞可表达针对胃癌细胞表面的肿瘤相关抗原MSLN的抗体Anti-MSLN，使得其能够靶向性结合胃癌细胞，更精准的识别并杀伤表达MSLN肿瘤相关抗原的胃癌细胞；同时，PD-1mAb与T细胞表面的PD-1结合，阻断PD-1和PD-L1的结合，从而下调了PD-1对T细胞的影响，增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，增强人体自身的免疫功能实现抗肿瘤作用。另外，本发明中提到的CAR结构赋予了T细胞更强的增殖性，持久的生命力，使其表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。
上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，包括嵌合抗原受体和载体，所述嵌合抗原受体连接在所述载体上，
所述嵌合抗原受体包括两种特异性结构分别为：MSLN单链抗体和PD-1mAb，所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述PD-1mAb的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构组成为CD8leader-MSLN scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-IRES-PD-1mAb。
3.根据权利要求2所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述CD8leader可表达引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的引导肽，所述CD8leader的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，
所述MSLN scFv表示MSLN单链抗体，
所述CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，且核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，
所述CD28-CD137为共刺激结构域，所述CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，
所述CD3ζ为信号转导域，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述IRES为核糖体识别位点，是实现同一载体高效共表达两个基因的元件，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求1所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述载体包括PUC19质粒、慢病毒载体。
5.根据权利要求4所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。
6.联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的构建方法，用于构建如权利1-5任一项所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述构建方法的步骤如下：
(1)将所述嵌合抗原受体保存在所述PUC19质粒上；
(2)将含有步骤(1)中PUC19质粒和所述慢病毒载体进行双酶切，将酶切产物分别经过琼脂糖凝胶电泳分离，获得双酶切后的含有所述嵌合抗原受体的目的片段和双酶切后慢病毒载体，
(3)将步骤(2)中的含有所述嵌合抗原受体的目的片段和步骤(2)中的慢病毒载体进行连接，将连接产物进行转化，提取质粒，获得含有嵌合抗原受体结构的重组质粒，所述重组质粒为联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体。
7.根据权利要求6所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中的双酶切为EcoRI和NotI，所述(3)中含有所述嵌合抗原受体的目的片段和慢病毒载体连接的摩尔比为5:1。
8.联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的应用，基于权利要求1-5任一项联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，将所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体进行慢病毒包装，经离心浓缩后获得高滴度的慢病毒悬液，所述慢病毒悬液用于感染T细胞，获得CAR-T细胞，所述CAR-T细胞通过识别特异性蛋白MSLN和PD-1靶向杀伤胃癌细胞。
9.根据权利要求8所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的应用，其特征在于，所述慢病毒包装采用三质粒包装系统，所述三质粒包装系统包括PSPAX2质粒、pMD2G质粒和所述联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，所述PSPAX2质粒、所述pMD2G质粒、所述联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的比例为27:3:20，所述慢病毒包装采用293T细胞作为慢病毒的包装细胞。
CN201910019774.1A 2019-01-09 2019-01-09 联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用 Withdrawn CN109628492A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910019774.1A CN109628492A (zh) 2019-01-09 2019-01-09 联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910019774.1A CN109628492A (zh) 2019-01-09 2019-01-09 联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109628492A true CN109628492A (zh) 2019-04-16

Family

ID=66061628

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910019774.1A Withdrawn CN109628492A (zh) 2019-01-09 2019-01-09 联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109628492A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022140388A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 Allogene Therapeutics, Inc. Protease-activating cd45-gate car
WO2022165233A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Allogene Therapeutics, Inc. KNOCKDOWN OR KNOCKOUT OF ONE OR MORE OF TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP AND RFXANK TO MITIGATE T CELL RECOGNITION OF ALLOGENEIC CELL PRODUCTS
WO2024026445A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Allogene Therapeutics Inc. Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022140388A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 Allogene Therapeutics, Inc. Protease-activating cd45-gate car
WO2022165233A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Allogene Therapeutics, Inc. KNOCKDOWN OR KNOCKOUT OF ONE OR MORE OF TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP AND RFXANK TO MITIGATE T CELL RECOGNITION OF ALLOGENEIC CELL PRODUCTS
WO2024026445A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Allogene Therapeutics Inc. Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109593786A (zh) 联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体及其构建方法和在乳腺癌应用
CN105602992B (zh) 一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105777911B (zh) 抗bcma嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN105296431B (zh) 肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞及其抑癌用途
CN105949317B (zh) 抗cd20嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN109485721A (zh) 一种获得肿瘤特异性t细胞受体的方法
CN105950664B (zh) 一种靶向cd123的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105949316B (zh) 抗EGFRvIII嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN105820255B (zh) 抗cd33嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN109628492A (zh) 联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用
CN109553686A (zh) 一种新型可调控的双嵌合抗原受体t细胞及其构建方法和应用
CN106279432B (zh) 一种vc-car分子及在清除hiv-1感染细胞中的应用
CN107384870A (zh) 一种靶向pd‑l1嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN106317228A (zh) 一种嵌合抗原受体分子及其应用
CN108641000A (zh) 肝癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN105950663B (zh) 一种靶向cd30的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN109680002A (zh) 联合msln单链抗体和ccl19杀伤胃癌细胞的car载体及其构建方法和应用
CN109890952A (zh) 灌注生物反应器袋装配
KR20200095487A (ko) 폐쇄-시스템 극저온 용기
CN110423767A (zh) 表达可溶性pd-1的嵌合抗原受体car基因及应用
CN105950662B (zh) 一种靶向cd22的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105384826A (zh) 表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞及其应用
CN114957484A (zh) 靶向实体肿瘤细胞b7-h3蛋白的car载体、car-t细胞及其构建方法和应用
CN109680003A (zh) 靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白fshr的car载体及其构建方法和应用
CN113604507A (zh) 靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白msln的car载体及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20190416