CN116082519A - 一种靶向bcma的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向bcma的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用，所述嵌合抗原受体T细胞为表达BCMA特异性嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包含能够靶向BCMA的抗体、铰链区和跨膜区、共刺激信号结构域和胞内信号传导结构域，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，本发明公开的嵌合抗原受体T细胞特异性靶向BCMA阳性细胞，可以用于治疗BCMA阳性B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤和浆细胞白血病等疾病。

Description

一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞，具体而言，涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)是一种表达在浆细胞、浆母细胞和骨髓浆细胞的抗原，其不在B细胞或者造血干细胞上表达。BCMA的表达与许多癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病相关。BCMA高表达的相关癌症包括一些血液癌症，例如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和胶质母细胞瘤等。这种有限的表达细胞类型，使得BCMA成为治疗血液系统肿瘤的有效靶点，并用于开发单克隆抗体、抗体偶联药物、双特异性抗体、嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimeric antigen receptor，CAR-T)等疗法。当前还没有靶向BCMA的药物上市，但是有少数通过抗体偶联药物、CAR-T疗法等来通过靶向BCMA以治疗多发性骨髓瘤的疗法在进行临床试验，CAR-T技术在多发性骨髓瘤领域的应用取得了一定的效果。
CAR-T治疗是利用基因工程技术，借助逆转录病毒或者逆转病毒载体或者mRNA转导，使得T细胞获得可以识别肿瘤表面抗原，杀伤肿瘤的嵌合抗原受体。CAR-T治疗相比于传统的治疗方法展现出巨大的优势，具体体现在杀伤肿瘤精准性高，CAR-T细胞治疗采用抗原抗体特异性结合的技术，只有表面表达特定抗原的肿瘤细胞被杀伤，对正常细胞的伤害小；杀伤肿瘤范围广泛，只要表达肿瘤相关抗原，CAR-T细胞就能清除，对于转移性肿瘤、复发性肿瘤均有效；对于患者而言避免了放化疗的痛苦，恢复健康迅速。因此，开发一种含有靶向BCMA的单克隆抗体的嵌合抗原受体对高效特异的治疗BCMA阳性血液系统肿瘤具有十分重要的意义。
发明内容
基于现有技术中存在的技术缺陷，本发明提供了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体。
进一步，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域为靶向BCMA蛋白的抗体；
优选地，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区HCDR：氨基酸序列如SEQID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；
优选地，所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区LCDR：氨基酸序列如SEQID NO:4所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
更优选地，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
更优选地，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
最优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括铰链区和跨膜区、共刺激信号结构域、胞内信号传导结构域；
更优选地，所述铰链区和跨膜区包括下列分子的铰链区和跨膜区：CD8、4-1BB、IgG1、IgG4、PD-1、CD28、CD34、OX40、CD3ε；
最优选地，所述铰链区和跨膜区为CD8铰链区和跨膜区；
最优选地，所述CD8铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：HVEM、CD27、CD19、CD28、ICOS、CD4、CD8α、CD8β、CD40、4-1BB、OX40、DR3、CD2、GITR、CD30、TIM1、CD226、CD278；
最优选地，所述共刺激信号结构域为HVEM共刺激信号结构域；
最优选地，所述HVEM共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；
更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD278、CD21、CD22、FcεRI、FcRγ、FcRβ、CD4、CD5、CD8、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12、CD66d；
最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；
最优选地，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
最优选地，所述嵌合抗原受体由所述抗体、CD8铰链区和跨膜区、HVEM共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域依次连接得到；
最优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
在本发明的具体实施方案中，所述嵌合抗原受体由EF1α启动子、hCD8信号肽(SP)、C-myc标签、本发明制备得到的抗BCMA抗体、CD8铰链区和跨膜区、HVEM共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域依次连接得到，其中，所述抗BCMA抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示，所述CD8铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述HVEM共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述hCD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述C-myc标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
需要说明的是，在其他的实施方案中，本领域技术人员可以根据实际情况或需要改变信号肽、铰链区和跨膜区、共刺激信号结构域和胞内信号传导结构域的组合类别和序列，无论基于何种形式的改变，只要该嵌合抗原受体具有本发明上述抗体的重链可变区的CDR序列或重链可变区序列，和/或上述抗体的轻链可变区的CDR序列或轻链可变区序列，其均属于本发明的保护范围。
进一步，本发明提供的嵌合抗原受体可靶向BCMA蛋白，表达该嵌合抗原受体的免疫细胞可特异性地杀伤BCMA阳性的靶细胞，在本发明的具体实施方案中，所述表达该嵌合抗原受体的免疫细胞为表达该嵌合抗原受体的T细胞。
本发明的第二方面提供了一种编码本发明第一方面所述嵌合抗原受体的核酸分子。
进一步，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
本发明的第三方面提供了一种包含本发明第二方面所述核酸分子的载体。
进一步，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、转座子系统；
优选地，所述载体为慢病毒载体。
本发明的第四方面提供了一种基因工程化的免疫细胞。
进一步，所述基因工程化的免疫细胞含有本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体；
优选地，所述基因工程化的免疫细胞表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
更优选地，所述免疫细胞为T细胞。
在本发明的具体实施方案中，所述基因工程化的免疫细胞为表达本发明第一方面所述嵌合抗原受体的T细胞。
本发明的第五方面提供了一种免疫细胞群体。
进一步，所述免疫细胞群体包含本发明第四方面所述的基因工程化的免疫细胞；
优选地，所述免疫细胞群体还包含不包含本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体的免疫细胞；
更优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
最优选地，所述免疫细胞为T细胞。
本发明的第六方面提供了一种用于治疗和/或预防肿瘤的生物制剂。
进一步，所述生物制剂含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的基因工程化的免疫细胞和/或本发明第五方面所述的免疫细胞群体；
优选地，所述生物制剂还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；
优选地，所述肿瘤为BCMA阳性肿瘤；
更优选地，所述肿瘤包括血液肿瘤、实体瘤、或其组合；
最优选地，所述血液肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；
最优选地，所述实体瘤包括胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌。
本发明的第七方面提供了一种用于治疗和/或预防肿瘤的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第四方面所述的基因工程化的免疫细胞、本发明第五方面所述的免疫细胞群体和/或本发明第六方面所述的生物制剂；
优选地，所述肿瘤为BCMA阳性肿瘤；
更优选地，所述肿瘤包括血液肿瘤、实体瘤、或其组合；
最优选地，所述血液肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；
最优选地，所述实体瘤包括胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌。
本发明的第八方面提供了一种用于制备本发明第四方面所述的基因工程化的免疫细胞的试剂盒。
进一步，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第二方面所述的核酸分子和/或本发明第三方面所述的载体。
本发明的第九方面提供了如下任一种方法：
(1)一种制备本发明第四方面所述的基因工程化的免疫细胞的方法，所述方法包括如下步骤：提供待改造的免疫细胞，将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体导入到所述免疫细胞内，获得所述基因工程化的免疫细胞；
优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
更优选地，所述免疫细胞为T细胞；
(2)一种刺激哺乳动物靶细胞群或组织产生免疫应答的方法，所述方法包括如下步骤：给哺乳动物施用有效量的本发明第四方面所述的基因工程化的免疫细胞和/或本发明第五方面所述的免疫细胞群体。
此外，本发明还提供了一种治疗BCMA阳性肿瘤患者的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用有效量的本发明第四方面所述的基因工程化的免疫细胞、本发明第五方面所述的免疫细胞群体、本发明第六方面所述的生物制剂和/或本发明第七方面所述的药物组合物。
本发明的第十方面提供了如下任一方面的应用：
(1)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的基因工程化的免疫细胞、本发明第五方面所述的免疫细胞群体、本发明第六方面所述的生物制剂、本发明第七方面所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用；
(2)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的基因工程化的免疫细胞、本发明第五方面所述的免疫细胞群体在制备用于治疗和/或预防肿瘤的生物制剂中的应用；
(3)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体在制备用于制备治疗和/或预防肿瘤的基因工程化的免疫细胞的试剂盒中的应用；
(4)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第八方面所述的试剂盒在制备用于治疗和/或预防肿瘤的基因工程化的免疫细胞中的应用；
优选地，所述肿瘤为BCMA阳性肿瘤；
更优选地，所述肿瘤包括血液肿瘤、实体瘤、或其组合；
最优选地，所述血液肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；
最优选地，所述实体瘤包括胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明提供了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞能够稳定表达靶向BCMA的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含能够靶向BCMA的抗体、铰链区和跨膜区、共刺激信号结构域和胞内信号传导结构域，所述抗体的氨基酸序列如SEQID NO:11所示，该抗体具有特异性结合BCMA蛋白的能力，采用该抗体制备得到的CAR-T细胞对BCMA阳性的靶细胞具有特异性的杀伤效果，可以用于治疗BCMA阳性B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤和浆细胞白血病等疾病，临床应用前景广阔。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为SDS-PAGE鉴定BCMA 10H1D7腹水抗体和BCMA 10H1D7上清抗体的结果图；
图2为本发明制备得到的BCMA 10H1D7抗体流式验证结果图；
图3为Ctrl-CAR和BCMA-CAR的结构示意图，其中，Anti-BCMA scFv为新筛选的抗人BCMA抗体(clone 10H1D7)，即本发明实施例1筛选得到的抗体；
图4为本发明所述的CAR-T细胞的制备流程图；
图5为流式检测CAR表达阳性率的结果图，在细胞体外培养扩增第10天，取2×105个细胞用于流式检测，用抗C-myc的一抗和Alexa Fluor 647标记的荧光二抗检测CAR的表达；
图6为ELISA实验检测BCMA-CAR-T细胞的细胞因子释放能力的结果图，取1×104个Ctrl-T或BCMA-CAR-T细胞分别与人多发性骨髓瘤U266细胞，以1:1的比例在U形底96孔板内共孵育24h，离心取上清，用ELISA方法检测靶细胞刺激后CAR-T细胞释放细胞因子的量；数据统计采用独立样本t检验(Independent-Samples T Test)，**P<0.01，***P<0.001；
图7为利用流式检测BCMA-CAR-T细胞对人多发性骨髓瘤细胞的杀伤效果的结果图，将1.5×105个人多发性骨髓瘤U266细胞分别与1.5×105个Ctrl-T细胞或BCMA-CAR-T细胞共孵育48h后，将细胞离心取出进行染色，利用流式细胞仪检测杀伤效果。
具体实施方式
本发明的发明人经过广泛而深入地研究，进行了大量的筛选，首次获得了一种靶向BCMA抗原嵌合抗原受体，并完成了所述嵌合型抗原受体在原代T细胞中的表达水平、体外活化能力及肿瘤细胞杀伤效能等层面的分析与鉴定，研究表明，本发明提供的嵌合抗原受体靶向BCMA阳性细胞，可以用于治疗BCMA阳性B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病或其他BCMA相关疾病。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常是指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向BCMA的抗原结合结构域。当本发明的CAR在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、促使肿瘤细胞的死亡或以其他方式影响肿瘤细胞，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。
对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
本发明的CAR中的胞内结构域包括HVEM胞内信号传导结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。优选地，本发明的CAR的结构包括EF1α启动子、hCD8信号肽(SP)、C-myc标签、本发明制备得到的抗BCMA抗体(Anti-BCMA scFv)、CD8铰链区和跨膜区、HVEM共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域，连接顺序如下：-[EF1α]-[hCD8信号肽(SP)]-[C-myc]-[Anti-BCMA scFv]-[CD8]-[HVEM]-[CD3ζ]-。
具体地，在本发明中选用的序列如下：所述抗BCMA抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示，所述CD8铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述HVEM共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述抗BCMA抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述CD8铰链区和跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示，所述HVEM共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)
如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“CART”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明提供的嵌合抗原受体T细胞，是指可用于将一种或多种抗原特异性移植到免疫效应细胞(诸如T细胞)的基因工程受体，所述CAR-T细胞可表达CAR。本发明涉及靶向BCMA嵌合抗原受体结构的构建、靶向BCMA嵌合抗原受体工程化T细胞的制备方法及其活性鉴定。
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明还提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。
本发明提供的核酸分子可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸分子可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarborLaboratory,New York)。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
生物制剂
本发明提供了一种含有本发明所述的基因工程化的免疫细胞(优选为CAR-T细胞)，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述生物制剂为液态制剂。优选地，所述生物制剂为注射剂。优选地，所述生物制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×102-1×1010个细胞/mL，更优地1×103-1×108个细胞/mL。
在一个实施方式中，所述生物制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的生物制剂优选配制用于静脉内施用。
在本发明的具体实施方案中，所述肿瘤是指BCMA阳性肿瘤，包括但不限于血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
在一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、或其组合。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、或其组合。
治疗性应用
本发明提供的CAR修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单来说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重程度，适当的剂量可由临床试验确定。
待施用的有效量的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(受试者)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的CAR修饰的T细胞的药物组合物可以以102至1010个细胞/kg体重的剂量，优选为102至109个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.ofMed.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明提供的生物制剂或药物组合物或CAR-T细胞通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明提供的生物制剂或药物组合物或CAR-T细胞优选为通过i.v.注射施用。生物制剂或药物组合物或CAR-T细胞可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括(但不限于)用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷、那他珠单抗、厄法珠单抗等。在进一步的实施方式中，本发明提供的生物制剂或药物组合物或CAR-T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明提供的生物制剂或药物组合物或CAR-T细胞与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。病人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×105个至1×1010个本发明经修饰的T细胞(BCMA-CAR-T细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1杂交瘤单克隆抗体制备
1、实验动物免疫
(1)抗原乳化：取0.05mg BCMA抗原用PBS稀释后与弗氏佐剂按体积比1:1(总体积0.8mL)混合后在4℃环境下乳化3-5min(取出搅拌器头，在装有水的容器口轻轻敲一下，让搅拌铁丝上粘有的乳化后的免疫原掉一滴到水里，其遇水不扩散时即已乳化好。如还有扩散现象，继续加长乳化时间)。确保使用最短的时间乳化好。
(2)第一次免疫用弗氏完全佐剂，后面加强免疫则用弗氏不完全佐剂。
(3)注射抗原：将乳化好的抗原转入1mL的注射器中，排除注射器中的气泡。泡沫化装冰袋保存(当天乳化，当天免疫)。从笼中取出待免疫的小鼠放在特制的固定架中，在背部进行多点皮下注射。注射时抚去注射处的小鼠毛并用酒精消毒暴露的皮肤，提起皮肤使其出现一三角形，将针头以相对皮肤15度的角度进针，注射深度为1-2cm，小心不要刺入肌肉中。
(4)免疫周期：每次免疫相隔2周。
(5)一共免疫3-5次。
(6)三免一周后取血检测抗体效价，如果效价到达了冲击免疫后摘眼球取血脱颈处死，取脾脏。
(7)一共免疫6只小鼠。
2、效价检测
(1)包被：用包被液CB将抗原BCMA稀释至2μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃过夜或37℃孵育2h。
(2)封闭：取出酶标板拍干孔内液体，5％脱脂牛奶封闭(PBS溶解)，200μL/孔加入酶标板，37℃孵育2h，TBS洗板3次。
(3)加一抗：将免疫血清按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000……进行倍比稀释(以空白血清做阴性对照)，每孔100μL，37℃孵育1h。TBS洗板3次。
(4)加二抗：加入HRP标记羊抗小鼠IgG(1:10000的稀释比例)，100μL/孔，37℃孵育40min，TBS洗板5次。
(5)显色：加TMB底物，90μL/孔，37℃避光5-20min。
(6)终止：加终止液，50μL/孔，酶标仪读数(波长450nm)，阳性反应的最大稀释度即为免疫小鼠的血清效价。
3、滋养细胞制备
(1)小鼠腹腔巨噬细胞制备
1)取8-10周Balb/C小鼠，摘眼球放血脱颈处死，将小鼠浸泡于75％酒精中消毒5min。
2)小鼠移入超净工作台并用灭过菌的针头将小鼠仰卧固定在垫有灭菌报纸的泡沫上，用剪刀镊子开腹部皮肤，钝性剥离充分暴露腹膜。
3)用5mL注射器吸取3-5mL DMEM注入腹腔内冲洗，将培养基吸出移至50mL离心管中。
(2)小鼠脾脏细胞制备
1)无菌剪开腹膜，暴露腹腔，剪去结缔组织分离脾脏，将其分成四段放置在200目分离网中央，对折分离网两次，用止血钳夹住分离网开口端，加入3-6mL DMEM，研磨，吹打混匀，吸出移至50mL离心管。
2)再次加入3-6mL DMEM，吹打混匀成单个脾细胞悬液，吸出移至50mL离心管。
(3)将巨噬细胞和脾脏细胞收集起来，1500rpm离心5min，弃上清，按一只小鼠1mL胎牛血清的量悬起细胞，4℃保存。
4、细胞融合
(1)SP2/0的活化与制备
1)融合前复苏SP2/0细胞，于10％的FBS的DMEM培养基中传代培养一周，细胞生长状态较好时，取细胞无菌操作DMEM培养基洗2次，1×106个细胞/只注射于小鼠背部皮下。大约8-10d能明显看到肿瘤，待肿瘤生长至直径1-3cm，对免疫合格鼠进行冲击免疫，3d后融合。
2)无菌剪开背部皮肤，剪下肿瘤块并剪成小块，移至200目过滤网中央放置在10cm皿中，加入5-10mL DMEM，研磨成单细胞悬液，全部吸出至50mL离心管内。
3)再加入5mL DMEM，吹打混匀，全部吸出至50mL离心管中。
4)再补加5mL DMEM，吹打混匀，全部吸出至50mL离心管中。
5)将20mL骨髓瘤细胞悬液沿管壁轻轻加入到预先加入有20mL淋巴细胞分离液的50mL离心管中，2000r/min离心15min，弃去上层细胞悬液后，将中层白色的骨髓瘤细胞悬液转移到另一50mL离心管中，用10mL DMEM培养基悬浮，1500r/min离心5min，洗细胞两次。弃去上清，用10mL DMEM培养基重悬骨髓瘤细胞，计数后备用。
(2)免疫脾细胞的制备
取免疫合格的Balb/C小鼠一只，摘除眼球放血完全后脱颈处死，收集血液并分离，血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同制备滋养细胞取脾脏的方法，分离并制备免疫脾细胞悬液。
(3)细胞融合
1)将1mL PEG和40mL DMEM培养基置于37℃、5％CO2培养箱预热。
2)骨髓瘤细胞和脾细胞的个数按1:3-1:10的比例混合，1500rpm离心5min，弃上清，吸干残留液体，轻轻敲打离心管，使细胞松散。
3)缓缓加入37℃预热的1mL PEG，在60秒内加完，再静置60秒。
4)向融合体系中加入40mL DMEM培养基以终止PEG的作用，先慢后快，边加边轻轻晃动离心管，第1min逐滴加入1mL(3sec/滴)，第2min再加2mL，最后加完剩下的7mL(5min内加完)。加完第一个10mL后，接着沿管壁补加DMEM培养基至40mL，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀。800rpm离心5min，弃上清。
5)用2-4mL胎牛血清悬起融合后的混合细胞，根据融合完的细胞量加入到含有滋养细胞、谷氨酸胺、双抗和HAT的25％胎牛血清的半固体培养基中，轻轻混匀。将混合好的半固体倒入3.5cm平皿内(2-3mL)，再将所有的皿放置在灭过菌的湿盒内，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)选择性培养
从融合当天算起为0d，前面3d尽量不要动平皿，只需注意细胞有没有污染，保持培养箱内环境稳定。在第7天，如果培养基变得较黄则可以在每皿中加0.5-0.8mL的HT完全培养基。一般细胞生长到第十天可以根据细胞集落大小将集落挑到96孔板内(每孔200μL含滋养细胞的HT完全培养基)培养，2-3d后，即可取细胞培养上清，同时用间接ELISA方法和间接竞争ELISA方法进行筛选。一般平皿里面的细胞会分2-3批挑出来培养检测。
5、亚克隆和亚克隆检测
(1)亚克隆
1)亚克隆前一天制备滋养细胞，在96孔板内铺好。
2)取需要亚克隆的细胞轻轻吹打，制成单细胞悬浮，加人计数板计数，计算细胞密度。
3)取100μL需要亚克隆的细胞，稀释至1×103个/mL。
4)5个/孔亚克隆浓度为1×103个/mL的细胞悬液中，取200μL加入至3.8mL培养基中混匀(加100μL至96孔板)，100μL/孔铺4条至含滋养细胞的96孔板。
5)0.5个/孔亚克隆混匀的4mL(5个/孔)的细胞悬液中，取700μL加入至6.3mL培养基中混匀(加入100μL至96孔板)。100μL/孔铺8条至含滋养细胞的96孔板。也可以只用1个/孔亚克隆，浓度为1×103个/mL的细胞悬液中，取50μL加入至4.95mL培养基中混匀，100μL/孔铺6条至含滋养细胞的96孔板。
(2)亚克隆检测
1)包被：用包被液CB将抗原稀释至2μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃过夜或37℃孵育2h。
2)封闭：取出酶标板拍干孔内液体，5％脱脂牛奶封闭(PBS溶解)，200μL/孔加入酶标板，37℃孵育2h，TBS洗板3次。
3)加样：按100μL/孔细胞上清加样，37℃孵育1h，TBS洗板3次。
4)加二抗：加入HRP标记羊抗小鼠IgG(1:10000的稀释比例)，100μL/孔，37℃孵育40min，TBS洗板5次。
5)显色：加TMB底物，90μL/孔，37℃避光20-30min。
6)终止：加终止液，50μL/孔，酶标仪读数(波长450nm)，OD值为2.0时对应的稀释值即为细胞的效价。
6、细胞冻存与复苏扩大培养
(1)冻存：细胞个数大于1×106个时冻存，1500rpm离心5min。使用DMSO与胎牛血清比例为1:9的冻存液来冻存细胞，每支细胞冻存管内放0.8-1mL。细胞冻存管放入室温的梯度冻存盒内，再直接放入-80℃过夜。取出梯度冻存盒内细胞，置于液氮罐长期保存。
(2)复苏：快速将细胞冻存管从液氮罐中取出，置37℃恒温水浴锅内快速摇晃至细胞融化。加入5mL DMEM培养基混匀，1200rpm离心5min，弃上清，加入20％的完全培养基，37℃、5％CO2的培养箱内培养，传代。
7、抗BCMA的单克隆抗体的制备和纯化
(1)抗BCMA的单克隆抗体的制备
1)小鼠腹腔注射液体石蜡或者不完全佐剂，0.5mL/只。
2)7-10天后，用无菌的PBS或DMEM基础培养基稀释杂交瘤细胞，使其浓度为1×106个/mL，每只小鼠用无菌注射器取1mL注入小鼠腹腔内。
3)间隔6天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时有紧张感，即可用无菌注射器腹水针采集腹水。
4)10000rpm离心2min，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清，-20℃保存。
(2)抗BCMA的单克隆抗体纯化
1)取亲和层析柱，水洗10倍柱床体积，乙酸钠缓冲液冲洗10倍柱床体积。
2)取血清，4℃、12000rpm离心10min，收集上清，过滤，与乙酸钠缓冲液混合。
3)以0.5mL/min的速度上Protein G柱，收集穿透，上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色。
4)用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床，搜集洗脱峰，迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性，水洗10倍柱床体积。
5)用10mL NaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃。
6)将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋透析过夜。
7)等12个小时后换液一次。取出样品，4℃12000rpm离心10min，收集上清，置于4℃保存，进行SDS-PAGE检测。
8、实验结果
抗体亚型测定的结果见表1，结果显示，本发明制备得到的BCMA 10H1D7抗体亚型为IgG1。BCMA 10H1D7腹水抗体和BCMA 10H1D7上清抗体的SDS检测结果见图1，结果显示，进行Pro G亲和纯化，得到BCMA 10H1D7腹水抗体用A280方法检测浓度为3.36mg/mL，BCMA10H1D7上清抗体用A280方法检测浓度为1.35mg/mL。本发明制备得到的BCMA10H1D7抗体流式验证结果图见图2，结果显示，BCMA 10H1D7腹水抗体结与细胞上清结果相差不大，可以作为最终的抗体，且本发明制备得到的BCMA 10H1D7抗体能够与细胞表面的BCMA蛋白特异性结合。
表1BCMA抗体亚型鉴定结果统计
Figure BDA0003830726800000131
对本发明制备得到的抗BCMA抗体进行测序的结果如下：
(1)BCMA抗体重链可变区BCMA-VH(HCVR)的氨基酸序列：
DVKLQVSGPELVKPGASVKMSCKASGFTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYFSPLNDGIKYNEKFKGKATVTSDKSPGTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSAYYRYDGGLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)；
其中，HCDR1的氨基酸序列：GFTFTSYV(SEQ ID NO:1)，HCDR2的氨基酸序列：FSPLNDGI(SEQ ID NO:2)，HCDR3的氨基酸序列：ARSAYYRYDGGLDY(SEQ ID NO:3)；
(2)BCMA抗体轻链可变区BCMA-VL(LCVR)的氨基酸序列：
DIELTQSPSSLAVSVGEKLTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQHYYSYPWTFGGGTKLELKR(SEQ ID NO:8)；
其中，LCDR1的氨基酸序列：QSLLNSGNQKNY(SEQ ID NO:4)，LCDR2的氨基酸序列：WAS(SEQ ID NO:5)，LCDR3的氨基酸序列：QHYYSYPWT(SEQ ID NO:6)；
(3)BCMA抗体重链可变区BCMA-VH(HCVR)的核苷酸序列：
GATGTGAAGTTGCAGGTGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCACATTCACTAGTTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATTTTAGTCCTCTCAATGATGGTATTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACAGTGACTTCAGACAAATCCCCCGGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAAGCGCCTACTATAGGTACGACGGGGGCTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:9)；
(4)BCMA抗体轻链可变区BCMA-VL(LCVR)的核苷酸序列：
GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAACTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATAGTGGCAATCAAAAGAATTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGATTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCACTATTATAGCTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAACTCAAACGG(SEQ ID NO:10)。
实施例2 BCMA-CAR的构建
在BCMA-CAR编码DNA序列的5’端依次加上限制性酶切位点Nde I(CATATG)、起始密码子(ATG)、hCD8信号肽(GCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG)和C-myc标签(GAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTG)的DNA序列，在3’端依次加上终止密码子(TAA)、限制性内切酶Spe I(ACTAGT)DNA序列。通过全基因合成编码上述DNA序列。将合成的DNA片段通过限制性内切酶位点Nde I和Spe I插入慢病毒载体pRRL中，构建pRRL-BCMA-CAR表达质粒。
构建得到的BCMA-CAR的结构示意图见图3，所述BCMA-CAR由EF1α启动子、hCD8信号肽(SP)、C-myc标签、本发明制备得到的抗BCMA抗体、CD8铰链区和跨膜区、HVEM共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域依次连接得到，其中，所述抗BCMA抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述CD8铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述HVEM共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述抗BCMA抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述CD8铰链区和跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示，所述HVEM共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。所述BCMA-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，所述BCMA-CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述hCD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述hCD8信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述C-myc标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，所述C-myc标签的核苷酸序列如SEQ IDNO:25所示。
实施例3 BCMA-CAR-T细胞的制备
1、包装慢病毒pRRL-BCMA-HVEM-CAR
(1)预处理培养皿：使用10％的多聚赖氨酸溶液5mL加入到15cm的细胞培养皿中均匀覆盖培养皿底部，于超净工作台中静置5min后回收，使用PBS冲洗，晾干；
(2)选择预先培养的293T细胞，确定状态良好，消化后计数，取1.8×107个铺板，置于培养箱孵育过夜；
(3)质粒转染前将PBS、质粒、PEI升至室温；
(4)准备转染试剂：从-20℃冰箱取出PEI(1μg/μL)，常温下复温至PEI完全溶解。从-20℃冰箱中取出质粒，室温解冻后，混匀(Vector质粒，packaging质粒delta8.9，envelope质粒VSVG)；
(5)准备PEI/DNA复合物(以下所用体积或质粒按照一个15cm的量，可等比例扩大)，①PEI混合物：用500μL PBS稀释75μL PEI(1μg/μL)；②DNA混合物：取500μL PBS至EP管中，分别加入27μg vector质粒，18μg packaging质粒，9μg VSVG质粒，移液枪上下吹打小心混匀；③一边轻轻涡旋质粒混合物，一边将PEI混合物加入其中，室温下静置15min；④将上述DNA/PEI复合物缓慢逐滴分散的加入到一个15cm培养皿中，立即“米”字轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃培养6小时后，将含有PEI的培养基去掉，更换为新鲜含1％丙酮酸那的DMEM完全培养基；
(6)转染24h后收集上清，换液，置于培养箱继续培养；
(7)将转染24h、48h、72h后收集的上清离心2000rpm，5min，彻底去除细胞碎片；
(8)使用20mL注射器吸取含有病毒液的培养基经0.45μm滤膜过滤，除菌；
(9)配平以后使用超速离心机离心，25000rpm，3小时；
(10)离心后，弃去上清，使用L500基础培养基重悬，放置于4℃过夜。使用EP管分装后于-80℃保存。
2、检测制备病毒的滴度
(1)使用状态良好的293T细胞铺24孔板，1×105个/孔，置于培养箱过夜培养；
(2)第二天按照预定慢病毒浓度梯度，分别加入1μL、2μL、4μL、8μL病毒液，添加助转染试剂Polybrene(终浓度8μg/mL)；
(3)第四天使用5mM EDTA消化293T细胞，PBS清洗；
(4)使用一抗c-myc抗体(使用2％FPBS 400倍稀释)避光孵育30min，2％FPBS清洗；
(5)使用二抗Alexa Fluor647(使用2％FPBS 800倍稀释)避光孵育30min，2％FPBS清洗；
(6)用200μL 1％甲醛重悬细胞，流式上机检测。计算病毒滴度；
(7)选取阳性率在10％-20％之间的浓度计算病毒滴度，公式：细胞数*阳性率/最适阳性率对应浓度。
3、T细胞的活化
从徐州医科大学附属医院收集健康供者的外周血，所有受试者均已签署知情同意书，分离外周血单个核细胞PBMC冻存备用。取上述制备的PBMC细胞悬液，将其接于10cm培养皿。于培养箱中静置2h以去除MDSC等贴壁细胞，收集悬浮细胞，计数。调整细胞密度，使用T细胞完全培养基将密度调整为1×106/mL。清洗磁珠，按照与细胞等量计算所需CD3/CD28磁珠体积，放置于磁力架上，使用基础培养基清洗CD3/CD28磁珠，清洗完成后使用完全培养基重悬磁珠。将磁珠与细胞混合吹打混匀。将磁珠与细胞的混合物接种于48孔板。
4、慢病毒感染
(1)抗人CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激T细胞24小时后，半量弃去培养基。分组为：Untreated、CAR-T组。从-80℃取出病毒，放置于冰上缓慢融化，按照MOI＝5加入慢病毒液，加入促转染试剂Polybrene，终浓度为5μg/mL；
(2)使用水平离心机离心，将离心机设置为升4降1、1500g，2h，放入培养箱过夜，第2日将每孔补充500μL对应的完全培养基；
(3)感染72h后，收集细胞400g离心5min。弃去上清，使用完全培养基重悬后，放置于磁力架上去除磁珠。继续培养至第10天，进行阳性率检测。
5、实验结果
Ctrl-CAR和BCMA-CAR的结构示意图见图3，CAR-T细胞的制备流程图见图4，流式检测CAR表达阳性率的结果图见图5，结果显示，BCMA-CAR-T细胞具有较高的CAR表达阳性率。
实施例4 ELISA实验检测BCMA-CAR-T细胞的细胞因子释放能力
1、实验方法
分别取1×104个Ctrl-T或BCMA-CAR-T细胞分别与人多发性骨髓瘤U266细胞以1:1的比例在U形底96孔板内共孵育24小时，离心取上清，用ELISA方法检测靶细胞刺激后CAR-T细胞释放IFN-γ、Granzyme B的量。
2、实验结果
结果显示，BCMA-CAR-T组与人多发性骨髓瘤U266细胞共孵育后，其细胞上清中细胞因子IFN-γ、Granzyme B的释放量显著优于Ctrl-T组，即本发明构建得到的BCMA-CAR-T细胞上清中分泌了较高的细胞因子IFN-γ、Granzyme B(见图6)。
实施例5流式检测BCMA-CAR-T对人多发性骨髓瘤细胞的杀伤效果
1、实验方法
将1.5×105个人多发性骨髓瘤U266细胞与1.5×105个BCMA-CAR-T细胞以效靶比1:1的比例混合，培养在24孔板中，放入培养箱中共孵育48h后，将细胞离心取出进行染色，利用流式细胞仪检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果。CD45+CD3+为CAR-T细胞，CD45-CD3-为靶细胞，并进行统计分析。
2、实验结果
结果显示，本发明构建得到的BCMA-CAR-T细胞治疗组对人多发性骨髓瘤U266细胞具有较好的杀伤效果，且显著优于Ctrl-T细胞对照组，也即含有CAR基因BCMA-CAR-T细胞对表达BCMA的细胞具有特异性的杀伤活性，与对照组相比差异显著，说明了本发明构建得到的BCMA-CAR-T细胞对BCMA阳性细胞具有更强的杀伤作用(见图7)，进一步表明了本发明构建得到的BCMA-CAR-T细胞能够用于BCMA相关疾病(例如：多发性骨髓瘤)的有效治疗中。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域为靶向BCMA蛋白的抗体；
优选地，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区HCDR：氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；
优选地，所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区LCDR：氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
更优选地，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
更优选地，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
最优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括铰链区和跨膜区、共刺激信号结构域、胞内信号传导结构域；
更优选地，所述铰链区和跨膜区包括下列分子的铰链区和跨膜区：CD8、4-1BB、IgG1、IgG4、PD-1、CD28、CD34、OX40、CD3ε；
最优选地，所述铰链区和跨膜区为CD8铰链区和跨膜区；
最优选地，所述CD8铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：HVEM、CD27、CD19、CD28、ICOS、CD4、CD8α、CD8β、CD40、4-1BB、OX40、DR3、CD2、GITR、CD30、TIM1、CD226、CD278；
最优选地，所述共刺激信号结构域为HVEM共刺激信号结构域；
最优选地，所述HVEM共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；
更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD278、CD21、CD22、FcεRI、FcRγ、FcRβ、CD4、CD5、CD8、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12、CD66d；
最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；
最优选地，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
最优选地，所述嵌合抗原受体由所述抗体、CD8铰链区和跨膜区、HVEM共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域依次连接得到；
最优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
2.一种编码权利要求1所述嵌合抗原受体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
3.一种包含权利要求2所述核酸分子的载体，其特征在于，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、转座子系统；
优选地，所述载体为慢病毒载体。
4.一种基因工程化的免疫细胞，其特征在于，所述基因工程化的免疫细胞含有权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体；
优选地，所述基因工程化的免疫细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
更优选地，所述免疫细胞为T细胞。
5.一种免疫细胞群体，其特征在于，所述免疫细胞群体包含权利要求4所述的基因工程化的免疫细胞；
优选地，所述免疫细胞群体还包含不包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体的免疫细胞；
更优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
最优选地，所述免疫细胞为T细胞。
6.一种用于治疗和/或预防肿瘤的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂含有权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的基因工程化的免疫细胞和/或权利要求5所述的免疫细胞群体；
优选地，所述生物制剂还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；
优选地，所述肿瘤为BCMA阳性肿瘤；
更优选地，所述肿瘤包括血液肿瘤、实体瘤、或其组合；
最优选地，所述血液肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；
最优选地，所述实体瘤包括胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌。
7.一种用于治疗和/或预防肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求4所述的基因工程化的免疫细胞、权利要求5所述的免疫细胞群体和/或权利要求6所述的生物制剂；
优选地，所述肿瘤为BCMA阳性肿瘤；
更优选地，所述肿瘤包括血液肿瘤、实体瘤、或其组合；
最优选地，所述血液肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；
最优选地，所述实体瘤包括胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌。
8.一种用于制备权利要求4所述的基因工程化的免疫细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的权利要求2所述的核酸分子和/或权利要求3所述的载体。
9.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)一种制备权利要求4所述的基因工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：提供待改造的免疫细胞，将权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体导入到所述免疫细胞内，获得所述基因工程化的免疫细胞；
优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
更优选地，所述免疫细胞为T细胞；
(2)一种刺激哺乳动物靶细胞群或组织产生免疫应答的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：给哺乳动物施用有效量的权利要求4所述的基因工程化的免疫细胞和/或权利要求5所述的免疫细胞群体。
10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的基因工程化的免疫细胞、权利要求5所述的免疫细胞群体、权利要求6所述的生物制剂、权利要求7所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用；
(2)权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的基因工程化的免疫细胞、权利要求5所述的免疫细胞群体在制备用于治疗和/或预防肿瘤的生物制剂中的应用；
(3)权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体在制备用于制备治疗和/或预防肿瘤的基因工程化的免疫细胞的试剂盒中的应用；
(4)权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求8所述的试剂盒在制备用于治疗和/或预防肿瘤的基因工程化的免疫细胞中的应用；
优选地，所述肿瘤为BCMA阳性肿瘤；
更优选地，所述肿瘤包括血液肿瘤、实体瘤、或其组合；
最优选地，所述血液肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；
最优选地，所述实体瘤包括胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116854825A (zh) * 2023-06-29 2023-10-10 徐州医科大学 靶向bcma的人源化嵌合抗原受体及其用途
CN116854825B (zh) * 2023-06-29 2024-03-01 徐州医科大学 靶向bcma的人源化嵌合抗原受体及其用途

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