CN116143943A - 一种靶向baffr嵌合抗原受体、car-t细胞及应用 - Google Patents

一种靶向baffr嵌合抗原受体、car-t细胞及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向BAFFR嵌合抗原受体、CAR‑T细胞及应用。本发明以BAFFR蛋白为靶点，从而成功制备一种靶向BAFFR的抗体，并进一步对其进行人源化设计获得人源化抗体，并构建二代CAR质粒载体，通过分离T细胞，用编码CAR的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向BAFFR的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，能够特异性识别和清除BAFFR阳性肿瘤细胞，特别是非霍奇金淋巴瘤，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种靶向BAFFR嵌合抗原受体、CAR-T细胞及应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向BAFFR嵌合抗原受体、CAR-T细胞及应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
淋巴瘤在新诊断的恶性肿瘤中占5％。淋巴瘤主要有两种类型：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。这些可以通过病理组织学进行鉴别，淋巴瘤的初步诊断是基于Reed-Sternberg细胞的存在与否。如果存在这些细胞，淋巴瘤归为霍奇金淋巴瘤；如果不存在这些细胞，淋巴瘤则归为非霍奇金淋巴瘤。事实上，90％的淋巴瘤都是非霍奇金淋巴瘤，包括一系列淋巴细胞增殖性恶性肿瘤，受影响的淋巴细胞异常增殖和在淋巴系统的某些部分积累。研究者通过细胞免疫表型检测来确定NHL是来自B细胞(85％的病例)还是来自T细胞和自然杀伤(NK)细胞(15％的病例)。通过病理组织学考虑其结构(滤泡性或弥漫性)和形态(小细胞或大细胞)。通过临床表现进行分类，当淋巴瘤细胞出现缓慢分裂时，NHL是低度或惰性的，这意味着NHL的发展持续时间较长，常见的惰性非霍奇金淋巴瘤有滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)；当淋巴瘤细胞以更快的速度分裂时，NHL是高级别或侵袭性的，最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤有弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、Burkitt淋巴瘤。
细胞活化因子受体(BAFFR)是一种B系标记物，仅在前体B细胞期之后和浆细胞期发育之前表达，包括恶性B细胞。BAFFR的表达是正常B细胞存活的关键。这些特征可能因此限制恶性B细胞通过下调来逃避BAFFR免疫治疗的能力。靶向CD19的CAR-T细胞为B细胞恶性肿瘤的治疗提供了有前途的选择。然而，由于抗原丢失导致的肿瘤复发会限制疗效。已有研究者开发了BAFFR CAR-T细胞，显示了对人淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病(ALL)株系的细胞毒性。并在体外和小鼠模型中测试了BAFFR CAR-T细胞治疗人类淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病，并与CD19 CAR-T细胞进行了比较。过继转移的BAFFR CAR-T细胞在单次治疗后根除了10天前建立的肿瘤异种移植物，并对CD19表达缺陷的异种移植物保持了疗效，包括CD19阳性淋巴瘤细胞背景中的CD19阴性变异。4例CD19靶向治疗后CD19抗原丢失的原发性复发ALL保留了BAFFR表达和活化的BAFFR，但没有CD19 CAR-T细胞。BAFFR CAR-T细胞可用于淋巴瘤治疗，其靶向还可能防止CD19抗原丢失变异的出现。
BAFFR符合理想靶抗原的特点，即在靶细胞表面高度一致性表达，在正常组织低表达，差异化的表达模式可减少脱靶(肿瘤外)毒性。因此，BAFFR被认为是非霍奇金淋巴瘤的合适靶标，用于开发CAR-T细胞免疫治疗。
发明内容
针对现有技术，本发明的目的在于提供一种靶向BAFFR嵌合抗原受体、CAR-T细胞及应用。本发明提供的抗BAFFR蛋白的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，通过靶向肿瘤细胞表面的BAFFR蛋白并激活T细胞下游的信号通路，赋予T细胞杀伤带有BAFFR靶点肿瘤细胞的能力，并且能够加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，可高效特异的治疗BAFFR阳性非霍奇金淋巴瘤。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种靶向BAFFR的嵌合抗原受体，其至少包含依次串联的信号肽、抗原结合结构域、嵌合受体跨膜区、共刺激信号传导域和信号传导结构域；
所述抗原结合结构域为抗BAFFR抗体；
其中，所述抗BAFFR抗体的氨基酸序列选自：
a1)如SEQ ID NO.13或15所示的氨基酸序列；或，
a2)如SEQ ID NO.13或15所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
根据本发明，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、结合BAFFR抗原的抗原结合结构域、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。
本发明的第二个方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包括编码上述靶向BAFFR的嵌合抗原受体的核苷酸。
所述核酸分子依次包括CD8α信号肽的编码基因序列、结合BAFFR抗原的抗原结合结构域的编码基因序列、CD8铰链区的编码基因序列、CD8跨膜区的编码基因序列、4-1BB共刺激信号传导结构域的编码基因序列和CD3ζ信号传导结构域的编码基因序列。
本发明的第三个方面，提供一种重组载体，所述重组载体包含第二方面所述的核酸分子。
本发明的第四个方面，提供一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞是由上述靶向BAFFR的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。本发明为BAFFR阳性肿瘤特别是非霍奇金淋巴瘤的CAR-T治疗提供了新的治疗手段。
具体的，所述CAR-T细胞可采用如下方法制备得到，如用慢病毒感染T细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述慢病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入慢病毒载体中得到的。
本发明的第五个方面，提供上述嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、CAR-T细胞在如下h1)-h4)中任一种或多种中的应用：
h1)制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品；
h2)治疗或辅助治疗肿瘤；
h3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；
h4)杀伤肿瘤细胞。
本发明的第六个方面，提供一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品，所述产品的活性成分可以为上述嵌合抗原受体或上述CAR-T细胞。
所述产品可以为药物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案以BAFFR蛋白为靶点，从而成功制备一种靶向BAFFR的抗体，并进一步对其进行人源化设计获得人源化抗体，并构建二代CAR质粒载体，通过分离T细胞，用编码CAR的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向BAFFR的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，能够特异性识别和清除BAFFR阳性肿瘤细胞，特别是非霍奇金淋巴瘤，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中质粒图谱Lenti-BAFFR-His-ek-huFc-puro；
图2为本发明实施例中SDS-PAGE图，其中lane M为蛋白MW marker，Lane 1为BAFFR-His-ek-huFc蛋白；
图3为本发明实施例中克隆17-B3-F10-B6与目的蛋白的结合图；
图4为本发明实施例中L1H1-scfv和H1L1-scfv的亲和力测试图；其中A为L1H1-scfv，B为H1L1-scfv；
图5为本发明实施例中CAR分子的表达效率图；
图6为本发明实施例中H1L1和L1H1的体外药效图；
图7为本发明实施例中给药后肿瘤的生长曲线图。
图8为本发明实施例中给药期间小鼠生存曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种靶向BAFFR的嵌合抗原受体，其至少包含依次串联的信号肽、抗原结合结构域、嵌合受体跨膜区、共刺激信号传导域和信号传导结构域；
所述抗原结合结构域为抗BAFFR抗体；
其中，所述抗BAFFR抗体的氨基酸序列选自：
a1)如SEQ ID NO.13或15所示的氨基酸序列；或，
a2)如SEQ ID NO.13或15所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加一般为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
本发明的又一具体实施方式中，所述信号肽为CD8α信号肽；
本发明的又一具体实施方式中，所述嵌合受体跨膜区为CD8跨膜区；
本发明的又一具体实施方式中，所述抗原结合结构域与嵌合受体跨膜区通过铰链区连接，所述铰链区为CD8铰链区；
本发明的又一具体实施方式中，所述共刺激信号传导域为4-1BB共刺激信号传导结构域；
本发明的又一具体实施方式中，所述信号传导结构域为CD3ζ信号传导结构域；
根据本发明，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、结合BAFFR抗原的抗原结合结构域、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种核酸分子，所述核酸分子包括编码上述靶向BAFFR的嵌合抗原受体的核苷酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述核酸分子依次包括CD8α信号肽的编码基因序列、结合BAFFR抗原的抗原结合结构域的编码基因序列、CD8铰链区的编码基因序列、CD8跨膜区的编码基因序列、4-1BB共刺激信号传导结构域的编码基因序列和CD3ζ信号传导结构域的编码基因序列。
在本发明的一个具体实施方式中，
所述CD8α信号肽的编码基因序列为如下b1)-b2)任一所示的基因：
b1)SEQ ID NO.17所示的DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述CD8α信号肽的DNA分子；
结合BAFFR抗原的抗原结合结构域的编码基因序列为如下c1)-c2)任一所示的基因：
c1)SEQ ID NO.14或16所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述结合BAFFR抗原的抗原结合结构域的DNA分子；
CD8铰链区的编码基因序列为如下d1)-d2)任一所示的基因：
d1)SEQ ID NO.18所示的DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述CD8铰链区的DNA分子；
CD8跨膜区的编码基因序列为如下e1)-e2)任一所示的基因：
e1)SEQ ID NO.19所示的DNA分子；
e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述CD8跨膜区的DNA分子；
4-1BB共刺激信号传导结构域的编码基因序列为如下f1)-f2)任一所示的基因：
f1)SEQ ID NO.20所示的DNA分子；
f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上4-1BB共刺激信号传导结构域的DNA分子；
CD3ζ信号传导结构域的编码基因序列为如下g1)-g2)任一所示的基因：
g1)SEQ ID NO.21所示的DNA分子；
g2)与g1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述CD3ζ信号传导结构域的DNA分子；
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码上述CD8α信号肽、结合BAFFR抗原的抗原结合结构域、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域全长或嵌合抗原受体的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
需要说明的是，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明上述编码靶向BAFFR的嵌合抗原受体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述嵌合抗原受体且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种重组载体，所述重组载体包含第二方面所述的核酸分子。
根据本发明，所述重组载体为病毒载体，所述病毒载体可为逆转录病毒载体或慢病毒载体；优选为慢病毒载体，所述重组载体是将上述嵌合抗原受体的核酸分子插入病毒中，得到表达上述嵌合抗原受体的重组病毒载体。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞是由上述靶向BAFFR的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。本发明为BAFFR阳性肿瘤特别是非霍奇金淋巴瘤的CAR-T治疗提供了新的治疗手段。
具体的，所述CAR-T细胞可采用如下方法制备得到，如用慢病毒感染T细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述慢病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入慢病毒载体中得到的。
本发明制备得到的CAR-T细胞在BAFFR阳性肿瘤特别是非霍奇金淋巴瘤表现出优异的杀伤毒性，并延长患癌动物生命，进一步提高了CAR-T细胞治疗肿瘤的安全性和有效性。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、CAR-T细胞在如下h1)-h4)中任一种或多种中的应用：
h1)制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品；
h2)治疗或辅助治疗肿瘤；
h3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；
h4)杀伤肿瘤细胞。
本发明提供的治疗或辅助治疗肿瘤的产品的活性成分为可以为上述嵌合抗原受体或上述CAR-T细胞。
上述任一所述应用或产品中，所述肿瘤为BAFFR阳性的肿瘤；所述BAFFR阳性的肿瘤包括但不限于非霍奇金淋巴瘤等非实体肿瘤。在本发明的一个具体实施例中，所述肿瘤为非霍奇金淋巴瘤，所述肿瘤细胞为Jeko-1淋巴瘤细胞。
本发明的第六个方面，提供一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品，所述产品的活性成分可以为上述嵌合抗原受体或上述CAR-T细胞。
所述产品可以为药物；当所述产品为药物时，所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。
所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体可为微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。所述可药用载体的递送载剂可为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肤、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌、噬菌体、黏粒或质粒载体。
所述药物还可与其他预防和/或治疗BAFFR阳性肿瘤的药物联用，其他预防和/或治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
所述药物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它预防和/或治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物的剂量。
本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1.BAFFR重组蛋白的制备
(1)BAFFR_huFc表达质粒的构建
体外合成人BAFFR的胞外段Ser7-Ala71(SEQ ID NO.1)基因(SEQ ID NO.2)，将该基因插入含有人IgG1重链恒定区的Fc段Asp104-Lys330的真核表达质粒中，中间以“6*His-enterokinase site(ek)”相连接，形成融合表达蛋白EPH_huFc(SEQ ID NO.3所示)，相对应的基因序列(SEQ ID NO.4所示)，质粒图谱如图1所示。
(2)BAFFR_huFc病毒包装
a.转染前一天，接种3×105/ml HEK293T细胞于10cm培养皿。
b.转染当天，HEK293T细胞汇合度达到70％左右,吸弃原有培养基，用PBS洗一遍，加入9mlDMEM不完全培养，置于37℃、5％ CO2培养箱，待用
C.准备PEI-DNA复合物：取1mL DMEM至一个1.5ml无菌离心管中，分别加入7.5μgBAFFR_huFc质粒、5.7μg pGP、3.75μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，加入50.75μL 1μg/μL PEI，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10-15min。
d.转染：将上述DNA-PEI复合物逐滴加入到一个10cm培养皿中，“米”字型轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％ CO2培养箱，培养6～8h后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基(DMEM+10％ FBS)。将培养皿置于37℃、5％ CO2培养箱，培养48h。
e.首次收毒：收集培养皿中的培养液至50mL无菌离心管中，置于4℃待用。沿培养皿边缘小心的加入10mL新鲜的完全培养基[DMEM+10％ FBS]，将培养皿置于37℃、5％ CO2培养箱，继续培养24h。将收集的病毒液。
d.二次收毒：收集培养皿中的培养液至首次收毒的50mL无菌离心管中，于4℃，6000x g过夜离心16h。
f.吸弃离心后上清，加入300ulPBS重悬，形成BAFFR_huFc病毒液。
(3)病毒感染表达BAFFR_huFc。
a.用CHO GROW CD1将CHO-S细胞密度调整为1×106/ml，接种于6孔板。
b.将BAFFR_huFc病毒液逐滴滴加到6孔板内，混匀，置于37℃、5％ CO2、130rpm震荡培养箱中培养。
c.24h后，收集六孔板内细胞培养液，200xg、25℃离心5min。
d.离心结束后，吸弃上清，加入2mL含有puromycine的CHO GROW CD1，重悬后转移至6孔板，置于37℃、5％CO2、130rpm摇床上培养箱中培养进行筛选(注意设置一个空白CHO-S细胞对照组)。筛选期间维持细胞密度1×106/ml。
f.对照孔内的细胞基本死亡，筛选结束。将CHO-S-BAFFR-His-ek-Fc2-Puro细胞株扩大培养，期间加入H410KJ CellTurbo feed1增强蛋白表达。连续培养表达4天，收集培养表达上清，用0.45μm针孔滤器过滤，形成过滤样品。
(4)采用protein A填料预装柱进行亲和纯化
a.平衡：PBS冲洗预装柱至UV曲线平衡。
b.上样：将进样管放入过滤样品内进行上样。
c.洗杂：上样结束后用PBS冲洗至曲线平衡；
d.洗脱：用甘氨酸缓冲液(PH3.0)进行洗脱，出峰收集蛋白液，立即用适量Tris-HCl(PH 9.0)溶液中和。
e.使用截流量为10KD的millipore超滤管进行蛋白洗脱液浓缩，使用超微量核酸蛋白检测仪OD280模块检测蛋白浓度。
f.取15ug跑SDS-PAGE，结果如图2所示。
2.使用噬菌体展示文库筛选针对BAFFR特异抗体
(1)使用BAFFR蛋白(切去huFc tag)免疫Balb/c小鼠，皮下多点免疫，取外周血测定抗体效价，免疫血清与BAFFR重组蛋白可以结合，且随着免疫血清的梯度稀释，OD值成梯度变化，符合建库要求，安排构建噬菌体展示库。
(2)采集小鼠的血液，提取RNA，制备cDNA样品后，PCR克隆抗体编码基因，构建噬菌体展示库。
(3)使用BAFFR重组蛋白抗原进行固相淘选，进行2-4轮的噬菌体淘选实验，每轮结束后计算input和output值，在第2轮开始对获取的单克隆噬菌体进行噬菌体ELISA。
a.用CBS按1μg/mL浓度包被BAFFR重组蛋白抗原，4℃过夜。
b.弃去抗原，用3％ MPBS室温封闭2h，此为Sample板；同时用MPBS封闭一块空白ELISA板，此为Negative control板。
c.弃去MPBS，用0.05％ PBST洗涤4次；用0.01％ PBST 1:1稀释单克隆噬菌体上清，每孔100μL，4℃孵育1h。
d.弃去一抗，用0.05％PBST洗涤5次；用0.05％的PBST按1:3000稀释anti-M13antibody-HRP，每孔100μL，4℃孵育1h。
f.弃去二抗，PBST洗涤5次；TMB 37℃显色15min，硫酸酸终止反应，读取OD450。
g.计算S/N值，挑选比值较大的样品进行Sanger测序。
h.获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息，进行序列比对，挑选CDR区域氨基酸序列不同的候选抗体。在候选抗体序列的N端和C端分别通过Overlap PCR引入CMV启动子、信号肽及hu IgG1 Fc标签，将纯化PCR产物瞬时转染293F细胞，收集培养基上清。
I.复苏1×106个处于对数生长期的CHO-K1-BAFFR重组细胞株，400xg，4℃离心5min。CHO-K1细胞株作为阴性对照组。弃上清后加入上述100uL培养基上清，4℃孵育30min后，加入1mL PBS洗涤细胞3次，然后用100uL PBS重悬细胞，加入5uL PE标记的Anti humanIgG抗体，室温避光孵育30分钟后，加入1mL PBS洗涤三次，最后用500uL PBS重悬细胞。通过流式细胞仪初步确定候选抗体与目的蛋白的结合情况。结果显示克隆17-B3-F10-B6的培养液可以与CHO-K1-BAFFR特异性结合，与CHO-K1不结合，确认克隆17-B3-F10-B6是BAFFR的特异性抗体。(图3)
17-B3-F10-B6鼠源重链氨基酸序列如(SEQ ID NO.5)所示，基因序列如(SEQ IDNO.6)；17-B3-F10-B6鼠源轻链氨基酸序列如(SEQ ID NO.7)所示，基因序列如(SEQ IDNO.8)。
3.抗体人源化设计
(1)将17-B3-F10-B6进行人源化，17-B3-F10-B6人源化重链氨基酸序列HM-VH1如(SEQ ID NO.9)所示，基因序列如(SEQ ID NO.10)；17-B3-F10-B6人源化轻链氨基酸序列HM-VL1如(SEQ ID NO.11)所示，基因序列如(SEQ ID NO.12)。
(2)检测亲和力，如图4所示，L1H1-scfv的KD＝2.394*10-8M，Kon＝2.76x105 M-1S-1，Koff＝6.609x10-3 S-1，信号呈浓度依赖性；H1L1-scfv抗体KD＝4.428*10-8M，Kon＝1.692x105 M-1S-1，Koff＝7.492x10-3 S-1，信号呈浓度依赖性，L1H1-scfv的亲和力约为H1L1-scfv亲和力的2倍。
4.CAR-T细胞的制备和抗肿瘤活性研究
将17-B3-F10-B6人源化序列HM-VH1和HM-VL1组成的H1L1-scfv和L1H1-scfv进行CAR-T细胞制备和抗肿瘤活性研究。
(1)靶向BAFFR的嵌合抗原受体慢病毒表达载体构建
以pCDH-EF1a质粒为载体，构建表达BAFFR抗体的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒，包括
pCDH-EF1a-H1L1-BBZ和pCDH-EF1a-L1H1-BBZ。
pCDH-EF1a-H1L1-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO.17)、scfv-H1L1(SEQ IDNO.14)、CD8铰链区(SEQ ID NO.18)、CD8跨膜区(SEQ ID NO.19)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ ID NO.20)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO.21)组成。
pCDH-EF1a-L1H1-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO.17)、scfv-H1L1(SEQ IDNO.16)、CD8铰链区(SEQ ID NO.18)、CD8跨膜区(SEQ ID NO.19)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ ID NO.20)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO.21)组成。
上述所有质粒经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到转染级别质粒，用于HEK293F悬浮细胞慢病毒包装实验。
(2)靶向BAFFR的嵌合抗原受体慢病毒制备
重组表达载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒等，我们所使用的原始重组表达载体为慢病毒载体。
a.用FreeStyle 293培养基将HEK293F细胞密度调整为4.5×106cells/mL，体积为包装体积的90％。暂置37.0℃大容量50振幅CO2叠加式恒温振荡器培养备用。
b.配制质粒/PEI复合物：准备2个无菌离心管，分别加入5％包装体积的FreeStyle293培养基。向第一支离心管中依次加入一定比例的pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pCDH-EF1a-CAR质粒，质粒总量180μg/100mL包装体积，轻轻混匀，室温孵育5min。向另一支离心管中加入PEI溶液，PEI用量(μg)＝质粒总量(μg)*3，轻轻混匀，室温孵育5min。
c.将上述孵育后的PEI稀释液加入到质粒稀释液中，并迅速充分混匀，垂直层流洁净工作台内室温孵育约12min。
d.转染：取出上述准备好的HEK293F细胞，边轻摇边加入制备好的质粒/PEI复合物，混匀，37.0℃、130rpm、振幅50.0mm、5.0％CO2培养过夜。
e.转染后约16-18h。加入OPM-CHO PFF06，体积为转染体系的10％，混匀，37.0℃、130rpm、振幅50.0mm、5.0％CO2培养过夜。
f.转染后约48h。3000×g、22.0℃离心15min，收集上清液病毒，用0.65μm针头滤器过滤。
g.核酸酶消化。按100U/mL向上述病毒液添加Super Nuclease溶液，上下颠倒5～8次混匀，4℃过夜处理约16h。
h.6000×g、4℃过夜离心约16h，弃上清。用1％包装体积DPBS(含10％人血白蛋白)重悬。取50ul病毒液检测感染滴度，剩余全部分装后置于-80℃储存。
i.将不同稀释梯度的病毒液感染293T细胞，48h后，用流式细胞术检测被感染的阳性细胞率，并换算为病毒液的感染滴度，以便后续转导T细胞。
(3)CART细胞的制备
一种含有上述重组表达载体的宿主细胞。我们用到的宿主细胞为人外周血T细胞或含有T细胞的细胞群。
a.外周血T细胞分离
将5mL抗凝血样品转移至一个15mL无菌离心管，离心力800×g、离心降速设为最低，将血样室温离心20min。吸弃血清层，向下层的红色外周血细胞层加入等体积的生理盐水，混匀。
向一个新的15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液，然后将生理盐水稀释后的血样沿管壁缓慢添加至淋巴细胞分离试剂的上层，离心力800×g，转速下降速度设为最低，室温离心30min。吸取白色单核细胞层吸至一个新的15mL无菌离心管中，加入等体积的生理盐水，混匀。离心力800×g，离心5min。吸弃上清，加入5mL生理盐水，混匀，取部分细胞悬液进行计数，流式细胞检测CD3+T细胞比例。
根据Dynabeads与CD3+T细胞数目比例为1:1，分离T细胞，取部分细胞悬液计数。
b.T细胞激活
加入T细胞生长培养基(含X-Vivo 15培养基、300IU/mL白介素2、10ng/mL白介素7、5ng/mL白介素15、5ng/mL白介素21)，调整T细胞密度1E6/mL。将细胞置于37℃、5％ CO2培养箱中培养40h。
c.T细胞培转导
从-80℃冰箱中，取出慢病毒，冰上解冻。
从培养箱中取出激活的T细胞，向培养器皿中加入polybrene至终浓度为6μg/mL，加入病毒液(MOI约50)，充分混匀，使用封口膜将培养器皿密封，800×g室温离心1h。
离心后，将培养器皿于37℃、5％ CO2的培养箱中，继续培养24h。
400×g离心10min，弃掉含有病毒的培养基上清，用新鲜T细胞生长培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的培养器皿中，继续培养。维持细胞密度在1-2x106/mL。
培养4天后，取部分细胞用流式细胞仪检测T细胞表面CAR分子的表达。离心收集制备的CAR-T细胞和NC-T细胞(对照组)，PBS洗涤一次后弃上清，加入BAFFR-huFc蛋白孵育30min；用PBS洗涤两次后弃上清，加入PE anti-human IgGFc抗体避光孵育30min；用PBS洗涤两次后弃上清，重悬，最后流式细胞仪检测流式细胞仪检测CAR阳性的T细胞比例。CAR分子的表达效率约30％。
(4)靶向BAFFR CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性
通过细胞毒实验判断BAFFR CART细胞的抗肿瘤活性。在比较UTD、H1L1、L1H1、CAR-T细胞的体外杀伤活性时，CAR T细胞的感染阳性率分别为33.04％、34.986％(图5)。
a.内源性表达BAFFR的Jeko-1-Luc细胞作为靶细胞，用RPMI1640完全培养基调整密度为5*105个/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5*104个/孔。
b.CAR-T细胞和UTD为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至合适密度，实验组按照效应细胞：靶细胞＝4:1，8:1的比例分别加入靶细胞孔内，100μL/孔。同时设置对照组为不加效应细胞组，即靶细胞萤光释放最大孔。每个比例设2个复孔。
c.放置37℃、5％ CO2培养箱中培养18h。
d.根据板布局，每孔转移100uL细胞悬液至全白酶标板，每孔加入100uL D-luciferin，混匀，全程避光操作，且动作要迅速，静置5min。用多功能酶标仪生物发光信号检测系统进行检测。细胞毒性计算公式为：％细胞毒性＝[(对照组-实验组)/对照组]*100。结果显示均有显著的抗肿瘤活性，综合看，H1L1和L1H1的抗肿瘤活性相当，且在E:T为4:1达到90％的杀伤毒性(优于CN 109311991 A和CN114761038A)，但在E:T为1:1时，L1H1的体外抗肿瘤活性稍优，图6。后续进行动物体内抗肿瘤效果评价。
5.CART与靶细胞共培养后IFN-γ分泌检测
a.Jeko-1-Luc细胞作为靶细胞(含BAFFR靶蛋白)，用RPMI1640完全培养基调整密度为5*105/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5*104个/孔。
b.CAR-T细胞和UTD(对照组)为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至2.5×106/mL，加入靶细胞孔内，100μL/孔，设3个复孔。
c.放置37℃、5％ CO2培养箱中培养18h。
d.准备ELISA板，并进行包被、封闭。
包被capture antibody：使用PBS稀释capture antibody至2μg/mL，96孔ELISA板，100μL/孔。4℃孵育过夜。
封闭：先用PBST洗板三次，再使用1％BSA-PBS室温封闭1h，300μL/孔。
e.将96孔细胞板置于离心机，800×g，室温离心5min，收集培养上清。
f.加样品：先用PBST洗板三次，再分别加入收集的培养上清和标准品【9.38pg/mL-600pg/mL】，100μL/孔，室温孵育2h。
g.加detection antibody：先用PBST洗板三次，再使用PBS稀释detectionantibody至125ng/mL，100μL/孔，室温孵育2h。
h.加Streptavidin-HRP B：先用PBST洗板三次，再使用PBS将Streptavidin-HRP B稀释40倍，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
i.加显色液：先用PBST洗板三次，再加入显色液，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
g.终止反应：加入2M H2SO4，50μL/孔，注意避光。
k.检测：用多功能酶标仪读取OD450，参考波长540nm.
分析数据，CAR-T组比UTD组明显增高，说明CAR-T在表达BAFFR的肿瘤细胞刺激下，能够分泌大量IFN-γ。
6.CART与靶细胞共培养后IL-2释放情况
a.Jeko-1-Luc细胞作为靶细胞(含BAFFR靶蛋白)，用RPMI1640完全培养基调整密度为5×105/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5×104个/孔。
b.CAR-T细胞和UTD(对照组)为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至2.5×106/mL，加入靶细胞孔内，100μL/孔，每个比例设3个复孔。
c.放置37℃、5％ CO2培养箱中培养18h。
d.准备ELISA板，并进行包被、封闭。
包被capture antibody：PBS稀释capture antibody至4μg/mL，96孔ELISA板，100μL/孔。4℃孵育过夜。
封闭：先用PBST洗板三次，再使用1％BSA-PBS室温封闭1h，300μL/孔。
e.将96孔细胞板置于离心机，800×g，室温离心5min，收集培养上清。
f.加样品：先用PBST洗板三次，再分别加入收集的培养上清和标准品【15.6pg/mL-1000pg/mL】，100μL/孔，室温孵育2h。
g.加detection antibody：先用PBST洗板三次，再使用PBS稀释detectionantibody至100ng/mL，100μL/孔，室温孵育2h。
h.加Streptavidin-HRP B：先用PBST洗板三次，再使用PBS将Streptavidin-HRP B稀释40倍，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
i.加显色液：先用PBST洗板三次，再加入显色液，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
g.终止反应：加入2M H2SO4，50μL/孔，注意避光。
k.检测：用多功能酶标仪读取OD450，参考波长540nm.
分析数据，CAR-T组比UTD组明显增高，说明CAR-T在表达BAFFR的肿瘤细胞刺激下，能够分泌大量IL-2。
(5)靶向BAFFR CAR-T细胞的动物体内抗肿瘤活性
NSG小鼠在NOD-SCID的基础上敲除Il2rg基因，是一种严重免疫缺陷小鼠，缺失成熟T、B、NK细胞，是人源化小鼠、异种移植、免疫重建的重要载体；对于研究人类造血干细胞、肿瘤发生与治疗、免疫缺陷疾病与体内免疫机制研究都具有重要意义。是目前国际公认的免疫缺陷程度较高、较适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。
a.收获对数生长期的Jeko-1-Luc细胞，用PBS重悬细胞，调整细胞密度为1.5×107/mL，将其与Matrigel基质胶1:1(v:v)混合。以200ul/只体积，接种于6～8周龄雌性NSG小鼠右侧前腋皮下，以建立胶质瘤异种移植小鼠模型。
b.每天观察小鼠的健康状况及成瘤情况，约14天后瘤体积达到100-300mm3。
c.将小鼠平均分5组，H1L1/L1H1/CD19(FMC63)/UTD/PBS，每组8只。每只小鼠尾静脉注射1×107个CART细胞进行单次治疗。
d.给药后，每天观察小鼠一般症状，共40天，实验终末安乐死处死小鼠并进行解剖。每隔3-4天测量Jeko-1-Luc移植瘤体积的大小，记录每组小鼠瘤体积的变化和存活情况，并绘制瘤体积随时间的生长曲线和小鼠存活曲线。结果显示与PBS或非工程化T细胞UTD对照组相比，用抗BAFF-R CAR-T细胞处理的小鼠具有显著的肿瘤清除率。另外，我们的CAR-T细胞的抗肿瘤作用与抗CD-19CAR-T处理组的抗肿瘤作用相当，但L1H1 CAR-T能更好平稳的控制肿瘤体积，一定程度说明L1H1 CART的药效较强或增殖存续性强，在第10天，Jeko-1-Luc移植瘤已基本消除(优于CN 109311991 A和CN114761038A)，图7。且在对照组UTD/PBS小鼠全部死亡时，只有H1L1/L1H1 CAR-T治疗组小鼠全部存活，说明靶向BAFFR CAR-T细胞在动物体内的抗肿瘤活性显著，图8。综合亲和力、体外抗肿瘤活性、体内抗肿瘤活性，因此优选L1H1 CAR-T继续进行后续临床前研究。
实施例中涉及的氨基酸及核苷酸序列：
(1)BAFFR蛋白序列
SLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQESVGAGAGEAA
(2)BAFFR核酸序列
TCTCTGAGAGGCAGAGATGCCCCTGCTCCTACACCTTGTGTGCCTGCCGAGTGCTTCGATCTGCTCGTGCGACATTGTGTGGCCTGCGGCCTGCTGAGAACCCCTAGACCTAAACCTGCCGGCGCTAGCTCTCCCGCTCCTAGAACAGCACTGCAGCCTCAAGAGTCTGTTGGAGCTGGTGCTGGCGAAGCTGCT
(3)BAFFR_huFc蛋白序列
SLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQESVGAGAGEAAGGGGSGDDDDKMDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
(4)BAFFR_huFc核酸序列
TCTCTGAGAGGCAGAGATGCCCCTGCTCCTACACCTTGTGTGCCTGCCGAGTGCTTCGATCTGCTCGTGCGACATTGTGTGGCCTGCGGCCTGCTGAGAACCCCTAGACCTAAACCTGCCGGCGCTAGCTCTCCCGCTCCTAGAACAGCACTGCAGCCTCAAGAGTCTGTTGGAGCTGGTGCTGGCGAAGCTGCTGGAGGCGGAGGATCTGGTGATGACGATGACAAGATGGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
(5)anti-huBAFFR单克隆抗体17-B3-F10-B6鼠源重链氨基酸序列
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCASLTTATAMDYWGQGTSVTVSS
(6)anti-huBAFFR单克隆抗体17-B3-F10-B6鼠源重链核酸序列
GAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTAGCCTGGTCAAGCCTAGCCAGACACTGAGCCTGACCTGTAGCGTGACCGGCGATAGCATCACAAGCGGCTACTGGAACTGGATCCGGAAGTTCCCCGGCAACAAGCTCGAGTACATGGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGATCAGCATCACCAGAGACACCAGCAAGAACCAGTACTACCTGCAGCTCAACAGCGTGACCACCGAGGATACCGCCACCTACTATTGTGCCAGCCTGACCACAGCCACCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACAGTGTCTAGT
(7)anti-huBAFFR单克隆抗体17-B3-F10-B6鼠源轻链氨基酸序列
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIK
(8)anti-huBAFFR单克隆抗体17-B3-F10-B6鼠源轻链核酸序列
GACATCGTGCTGACACAGAGCCCTGCTTCTCTGGCCGTGTCTCTGGGACAGAGAGCCACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTTGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAATCTGGAAAGCGGCATCCCTGCCAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAATATCCATCCTGTGGAAGAAGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCCTTCACCTTTGGAAGCGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
(9)anti-huBAFFR单克隆抗体17-B3-F10-B6人源化重链氨基酸序列
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLKLSSVTAADTAVYYCASLTTATAMDYWGQGTLVTVSS
(10)anti-huBAFFR单克隆抗体17-B3-F10-B6人源化重链核酸序列
GAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTAGCCTGGTCAAGCCTAGCCAGACACTGAGCCTGACCTGTAGCGTGACCGGCGATAGCATCACAAGCGGCTACTGGAACTGGATCCGGAAGTTCCCCGGCAACAAGCTCGAGTACATCGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGATCAGCATCACCAGAGACACCAGCAAGAACCAGTACTACCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCTCTCTGACCACCGCCACCGCCATGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACCGTGTCTAGT
(11)anti-huBAFFR单克隆抗体17-B3-F10-B6人源化轻链氨基酸序列
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIHPLQEEDVATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIK
(12)anti-huBAFFR单克隆抗体17-B3-F10-B6人源化轻链核酸序列
GACATCGTGCTGACACAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAATTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAATCTGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATTCACCCTCTGCAAGAGGAAGATGTGGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCCTTCACCTTTGGAAGCGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
(13)scfv-H1L1氨基酸序列
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLKLSSVTAADTAVYYCASLTTATAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIHPLQEEDVATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIK
(14)scfv-H1L1核酸序列
GAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTAGCCTGGTCAAGCCTAGCCAGACACTGAGCCTGACCTGTAGCGTGACCGGCGATAGCATCACAAGCGGCTACTGGAACTGGATCAGAAAGTTCCCCGGCAACAAGCTCGAGTACATCGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGATCAGCATCACCAGAGACACCAGCAAGAACCAGTACTACCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCTCTCTGACCACCGCCACCGCCATGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGATATTGTGCTGACACAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTTTCTCTGGGAGAAAGAGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGATGGCGACAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAATCTGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATTCACCCTCTGCAAGAGGAAGATGTGGCCACCTACTATTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCCTTCACATTTGGCAGCGGGACCAAGCTGGAAATCAAG
(15)scfv-L1H1氨基酸序列
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIHPLQEEDVATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLKLSSVTAADTAVYYCASLTTATAMDYWGQGTLVTVSS
(16)scfv-L1H1核酸序列
GACATCGTGCTGACACAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAATTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAATCTGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATTCACCCTCTGCAAGAGGAAGATGTGGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCCTTCACCTTTGGAAGCGGCACCAAGCTGGAAATCAAAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGTAGCGGTGGTGGTGGATCTGAAGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCCAGCCTGGTCAAGCCTAGCCAAACACTGAGCCTGACCTGTAGCGTGACCGGCGATAGCATCACAAGCGGCTACTGGAACTGGATCAGAAAGTTCCCCGGCAACAAGCTCGAGTACATCGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCTACTATAACCCTAGCCTGAAGTCCCGGATCAGCATCACCAGGGACACCAGCAAGAACCAGTACTACCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCTCTCTGACCACCGCCACAGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
(17)CD8α信号肽
atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggccc
(18)CD8铰链区
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT
(19)CD8跨膜区
ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT
(20)4-1BB
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG
(21)CD3ξ
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向BAFFR的嵌合抗原受体，其特征在于，其至少包含依次串联的信号肽、抗原结合结构域、嵌合受体跨膜区、共刺激信号传导域和信号传导结构域；
所述抗原结合结构域为抗BAFFR抗体；
其中，所述抗BAFFR抗体的氨基酸序列选自：
a1)如SEQ ID NO.13或15所示的氨基酸序列；或，
a2)如SEQ ID NO.13或15所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
2.如权利要求1所述的靶向BAFFR的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽为CD8α信号肽；
所述嵌合受体跨膜区为CD8跨膜区；
所述抗原结合结构域与嵌合受体跨膜区通过铰链区连接，所述铰链区为CD8铰链区；
所述共刺激信号传导域为4-1BB共刺激信号传导结构域；
所述信号传导结构域为CD3ζ信号传导结构域。
3.如权利要求1所述的靶向BAFFR的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、结合BAFFR抗原的抗原结合结构域、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1-3任一项所述靶向BAFFR的嵌合抗原受体的核苷酸。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子依次包括CD8α信号肽的编码基因序列、结合BAFFR抗原的抗原结合结构域的编码基因序列、CD8铰链区的编码基因序列、CD8跨膜区的编码基因序列、4-1BB共刺激信号传导结构域的编码基因序列和CD3ζ信号传导结构域的编码基因序列。
6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含第二方面所述的核酸分子；
所述重组载体为病毒载体，所述病毒载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。
7.一种CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞是由权利要求1-3任一项所述靶向BAFFR的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
8.权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体、权利要求4或5所述核酸分子、权利要求6所述重组载体、权利要求7所述CAR-T细胞在如下h1)-h4)中任一种或多种中的应用：
h1)制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品；
h2)治疗或辅助治疗肿瘤；
h3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；
h4)杀伤肿瘤细胞。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述肿瘤为BAFFR阳性的肿瘤；所述BAFFR阳性的肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤。
10.一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品，其特征在于，所述产品的活性成分为权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体或权利要求7所述CAR-T细胞。
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