CN101709084A - 优化的串连细胞因子及其在诱导多能性干细胞中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种优化的串连细胞因子及其将该细胞因子应用在诱导多能性干细胞中的方法。该细胞因子为Oct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2opt，其中，Oct4、F2A、Klf4、P2A和Sox2opt的基因序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示。F2A和P2A的基因序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。pMXs载体用于携带优化的串联基因。本发明使用的构建的串联细胞因子可以提高iPS的诱导效率，进而减少样本细胞的用量，简化实验操作，提高成功率，更加有利于iPS细胞在临床上的应用。

Description

优化的串连细胞因子及其在诱导多能性干细胞中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域的干细胞研究，具体涉及串连的密码子优化的人源细胞因子，并将该细胞因子用于iPS细胞(induced Pluripotent Stem cells)的诱导的技术。

背景技术

iPS(induced Pluripotent Stem cells)技术作为一个新兴的技术解决了胚胎干细胞的来源的限制，并绕开了伦理的约束，为再生医学研究的提供了新的希望。早期的iPS使用Oct3/4，K1f4，Sox2与Myc组合或Oct3/4，K1f4，Nanog与Lin28组合。为了简化试验操作，提高iPS效率以及提高iPS的安全性，人们对iPS诱导技术方面进行了诸多改进，主要可以分为以下几个方面：

1)减少细胞因子个数。Myc和K1f有导致细胞癌变的特性，使用较少的细胞因子将会有更高的安全性。实验证明可以使用Oct3/4和K1f4(Kim，J.B.et al，Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming withtwo factors.Nature 454(2008)，646-50.该文献中文名为，使用两个重编程细胞因子从小鼠神经干细胞中诱导多能干细胞。)，或者单独使用Oct3/4诱导出iPS(Kim，J.B.，et al.Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells.Cell 136(2009)，411-9.该文献中文名为，Oct4在成体神经干细胞中诱导的多能性。)

2)使用同一载体表达多个诱导因子。在做iPS诱导的过程中，同时转染或者感染多个诱导因子在实验操作上比较繁琐，特别使用质粒进行转染。多个研究小组使用串联的基因进行iPS诱导(Carey，B.W.，et al.Reprogramming ofmurine and human somatic cells using a single polycistronic vector.Proc Natl AcadSci USA 106(2009)，157-62.该文献中文名为，用单个多顺反子载体重编程小鼠和人体细胞。Gonzalez，F.，et al.Generation ofmouse-induced pluripotent stem cellsby transient expression of a single nonviral polycistronic vector.Proc Natl Acad SciUSA 106(2009)，8918-22.该文献中文名为，通过瞬时表达一个单个非病毒多顺反子载体来产生小鼠的iPS细胞。)。

3)使用安全的非整合诱导方式。如腺病毒，质粒，和蛋白形式的外源诱导因子。由于腺病毒载体不整合到细胞的基因组并具有感染多种细胞的能力，人们用腺病毒进行iPS诱导，但是此种方法得到的iPS诱导效率较低(Stadtfeld，M.，et al.Induced pluripotent stem cells generated without viral integration.Science322(2008)，945-9.该文献中文名为，产生非病毒整合的iPS细胞。)。这可能是由于腺病毒携带了太多的病毒基因所致。为了避免外源的细胞因子整合到细胞的基因组，人们也采取了多次转染质粒的方法来获得iPS细胞(Okita，K.，et al.Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.Science322(2008)，949-53.该文献中文名为，使用非病毒载体产生小鼠iPS细胞。)。为了彻底避免核酸引入，人们也开发了通过直接在细胞培养基中加入细胞因子蛋白来诱导iPS(Kim，D.，et al.Generation of human induced pluripotent stem cells bydirect delivery of reprogramming proteins.Cell Stem Cell 4(2009)，472-6.该文献中文名为，直接使用重编程蛋白产生人iPS细胞。Li，W.，et al.Generation of rat andhuman induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming andchemical inhibitors.Cell Stem Cell 4(2009)，16-9.该文献中文名为，综合使用基因重编程蛋白和化学抑制物产生大鼠和人iPS细胞。)，但是遇到同样的问题：iPS细胞的诱导效率较低。

4)结合辅助手段提高iPS效率。化学小分子药物丙戊酸(valproic acid(VPA))可以提高Oct3/4和Sox2的诱导效率(Huangfu，D.，et al.Induction of pluripotentstem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.NatBiotechnol 26(2008)，795-7.该文献中文名为，小分子化合物可以大大提高固定因子的多能干细胞诱导过程。)使用MicroRNA也可以提高iPS的诱导效率(Judsonet al.，Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency.NatBiotechnol 27(2009)，459-61.该文献中文名为，胚胎干细胞特异的microRNA提高诱导效率。)。

由此可见，iPS诱导技术呈现出多样性的特征。高效的iPS诱导系统是可以减少样本细胞的用量，简化实验操作，提高成功率，更加有利于iPS细胞在临床上的应用。

在同一个质粒上表达多个基因的策略有多种：1)使用多个启动子，每个启动子启动独立的编码框。这个策略的缺陷是：由于不同启动子的启动能力不同，并且重复串联的相同启动子之间的相互干扰导致两个启动子的表达效率都降低。2)在一个启动子内部使用内部核糖体进入位点(IRES)元件表达两个基因。IRES容易导致串联的表达框中的第二个基因表达水平低于第一个基因。3)在融合蛋白的连接位点引入蛋白酶切位点，利用细胞内的蛋白酶将串联蛋白切割成单个的功能蛋白，但是细胞内的蛋白酶酶切不充分，这个策略是最不常用。能够在蛋白水平实现自我剪切的蛋白酶元件的发现为串联基因的发现提供了新的可能性。

研究表明，一些正链病毒的基因组编码一个全长的融合蛋白，该融合蛋白没有活性。其中有一段2A短肽(18-22氨基酸)可以在融合蛋白中自我切割，产生单个独立的蛋白(参见如下文献：Szymczak AL，Workman CJ，Wang Y，VignaliKM，Dilioglou S，Vanin EF，Vignali DA(2004)Correction of multi-gene deficiencyin vivo using a single′self-cleaving′2A peptide-based retroviral vector.Naturebiotechnology 22：589-594；该文献中文名为使用单个基于2A短肽‘自剪切’的逆转录病毒载体可以在体内矫正多基因缺陷)。通过串联的2A序列可以实现多个基因的同时表达，其特点为，1)串联基因由同一个启动子转录产生单个长片段信使RNA(mRNA)用于表达融合蛋白，2)融合蛋白高效自我切割，切割后的蛋白可以行使其独立的功能，3)串联基因等物质的量表达，前后两个蛋白的表达量一致。

发明内容

为了提高iPS的诱导效率，本发明提供了一种优化的串连细胞因子并将该细胞因子用于诱导iPS中。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。本发明所采用的细胞因子包含Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt，所述Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。本发明使用人源Oct4，Sox2和Klf4基因，在优化的过程使用了人偏好的密码子，并去掉了潜在的内含子和外显子位点，我们称之为Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt。

优选的，所述Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因连接顺序由5’端到3’端依次为Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt。

优选的，所述优化的串连细胞因子还含有串联片段，所述串联片段为2A多肽，所述2A多肽包括F2A多肽和P2A多肽，所述F2A多肽和P2A多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

所述F2A多肽和P2A多肽的基因序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

所述优化的串连细胞因子为Oct4opt-F2A-Klf4opt-P2A-Sox2opt(命名为OKSopt)。其中，所述Oct4opt、F2A、Klf4opt、P2A和Sox2opt的基因序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：3、SEQID NO：7、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示。

本发明还提供了一种将上述优化的串连细胞因子应用在诱导多能性干细胞中的方法。

作为实验的对照，我们构建了基因子编码没有修改的原始基因序列，并且其连接方式与优化的序列保持一致，Oct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2命名为(OKS(N))。

为了验证优化的OKS在iPS诱导方面的效率提高效果，我们选择相应的表达载体来携带这三个串联基因。

优选的，选择逆转录病毒载体，特别是pMXs载体用于携带优化的串联基因，这是因为逆转录病毒载体可以在诱导了iPS细胞后可以有效的沉默。携带OKSopt的载体也包括腺病毒载体、慢病毒载体和质粒等其它多种形式的载体。

本发明使用的构建的串联OKSopt序列可以提高iPS的诱导效率，高效的iPS诱导系统是可以减少样本细胞的用量，简化实验操作，提高成功率，更加有利于iPS细胞在临床上的应用。本发明使用的串联OKSopt序列可以潜在的应用于人，猴，猪，马，牛，羊，狗，小鼠，大鼠等诸多种属哺乳动物原代细胞的iPS细胞诱导。

附图说明

图1是本发明中的串联三个因子的酶切鉴定图；

图2是本发明中的pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)酶切鉴定图；

图3是本发明中的pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)质粒包装成为逆转录病毒后的表达鉴定图；

图4是本发明所得到的iPS效率差异的统计图。

具体实施方式

下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例，根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1：优化的诱导因子基因序列的获得

根据人偏好的密码子编码，我们对四个细胞因子的编码序列进行了统计分析，在进行基因优化的同时，我们也去除了基因内部可能的内含子剪接位点，这个可以最大程度的保持mRNA的完整性，提高蛋白的表达水平。原始的编码序列与优化后的编码序列的差异见表1，表1所示为本发明中优化后与优化前序列使用的密码子差异比较。

表1

优化基因的序列见序列表，优化序列在商业化公司合成。连接到pMD 18T-simple载体(TaKaRa公司，大连)上：pT-Oct4opt-F2A-P2A，pT-Klf4opt，pT-Sox2opt。

实施例2：密码子未优化细胞因子的T载体构建

以Oct4(NCBI登录号为NM_002701.4)基因为模板，以hOct4(1+20)HS与hOct4(1077-22)BEI为引物，进行PCR，Tm＝63℃；以Klf4(NCBI登录号为NM_004235.4)基因为模板，以hKlf4(1+20)HS与hKlf4(1410-25)BEI为引物，进行PCR，Tm＝63℃；Sox2(NCBI登录号为NM_003106.2)基因为模板，以hSox2(1+25)HS与hSox2(951-22)BEI为引物，进行PCR，Tm＝63℃。

引物名称                      引物序列

hOct4(1+20)HS        GGAaagctactagtATGGCGGGACACCTGGCTTC

hOct4(1077-22)BEI    GATgaattctttaggatccGTTTGAATGCATGGGAGAGCCC

hKlf4(1+20)HS        GGAaagcttactagtATGGCTGTCAGCGACGCGCT

hKlf4(1410-25)BEI    GATgaattctttaggatccAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCG

hSox2(1+25)HS        GGAaagcttactagtATGTACAACATGATGGAGACGGAGC

hSox2(951-22)BEI     GATgaattctttaggatccCATGTGTGAGAGGGGCAGTGTG

在构建过程中使用了复能公司高保真PCR反应试剂。引物序列如上。

PCR反应体系的配制(50μl)：

Buffer(5×)：10μl

10×MgSO₄母液：5μl

dNTP(10μM)：1μl

模板：100ng

引物(20μM)：0.5μl/条

UltrapfuTaq酶：2U

H₂O：至50μl

PCR反应条件：

步骤198℃    1min

步骤298℃    10sec

步骤3Tm63℃  30sec

步骤472℃    30sec

步骤5回到步骤2共28个循环

步骤672℃    7min

步骤616℃    1h

PCR产物经过纯化后，插入到pMD18T-simple载体(TaKaRa公司，大连)中，分别得到pT-Oct4，pT-Klf4与pT-Sox2。

实施例3：串联因子的质粒构建

优化OKSopt序列的构建按如下步骤进行：

步骤1：pT-Oct4opt-F2A-P2A经过SpeI和BamHI酶切，回收质粒骨架，pT-Klf4opt也经SpeI和BamHI酶切，得到Klf4opt基因片段，连接得到pT-Oct4opt-F2A-Klf4opt-P2A。

步骤2：此质粒进一步经过NheI和EcoRI酶切，回收质粒骨架，pT-Sox2opt同样经过NheI和EcoRI得到Sox2opt基因片段，连接得到pT-Oct4opt-F2A-Klf4opt-P2A-Sox2opt(简写：pT-OKSopt)，酶切结果见图1，预期酶切后，得到的片段大小分别为3644bp，1760bp，932bp。图1中#1和#2分别为构建的两个独立的pT-OKSopt质粒克隆，由图1中#1和#2可知，酶切结果与预期一致，初步鉴定质粒构建正确。

非优化huOKS序列的构建：

步骤1：pT-Oct4opt-F2A-P2A经过XbaI和BglII酶切，回收质粒骨架，pT-Oct4也经SpeI和BamHI酶切，得到Oct4基因片段，连接得到pT-Oct4-F2A-P2A。

步骤2：pT-Oct4-F2A-P2A经过SpeI和BamHI酶切，回收质粒骨架，pT-Klf4也经SpeI和BamHI酶切，得到Klf4基因片段，连接得到pT-Oct4-F2A-Klf4-P2A。

步骤3：此质粒进一步经过NheI和EcoRI酶切，回收质粒骨架，pT-Sox2同样经过SpeI和EcoRI得到Sox2基因片段，连接得到pT-Oct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2(N)(简写：pT-OKS(N))。其酶切结果见图1，预期酶切后，得到的片段大小分别为3644bp，1760bp和932bp。图1中#7和#8分别为两个独立的pT-OKS(N)质粒克隆，由图1中#7和#8可知，酶切结果与预期一致，初步鉴定质粒构建正确。

实施例4：逆转录病毒载体pMXs-OKSopt和pMXs-OKS(N)的构建逆转录病毒载体质粒pMXs-Flag(Addgene公司)经过PmeI单酶切，酶切产物经过去磷酸化处理(NEB公司，具体参照说明书)。质粒骨架采用琼脂糖凝胶电泳回收。pT-OKSopt和pT-OKS(N)分别经EcoRV酶切，所得OKSopt和OKS(N)片段采用琼脂糖凝胶电泳回收，分别插入到线性化的平端pMX载体骨架，分别得到上述pMXs-OKSopt和pMXs-OKS(N)质粒。图2A是pMXs-OKSopt的酶切图，pMXs-OKSopt经过BgI II酶切后的预期片段大小为6791bp、1495bp，pMXs-OKSopt经过BamH I酶切的预期片段大小为5678bp、2608bp；由图2A可见，#2号克隆的样品酶切鉴定结果与预期结果一致，初步确定，pMXs-OKSopt质粒构建成功。图2B是pMXs-OKS(N)的酶切图，pMXs-OKS(N)经过Hind III和EcoR I酶切后，预期片段大小为4664bp、2588bp、921bp、116bp，pMXs-OKS(N)经过BamH I酶切的预期片段大小为4661、2596、1032bp；由图2B可见，#2，4，6为三管独立的pMXs-OKS(N)克隆样品，同时进行酶切，其酶切鉴定结果与预期结果一致，初步确定，pMXs-OKS(N)质粒构建成功。

实施例5：逆转录病毒的包装与基因表达鉴定与小鼠iPS的诱导

逆转录病毒的包装在293细胞中进行，按照标准的磷酸钙转染的方法得到，参见《分子克隆实验指南(第三版)》第16章。

包装的病毒按照相同的剂量感染MEF小鼠胚胎成纤维细胞，48小时后，收集细胞。基因表达进行Western Blot鉴定。使用抗Oct4和抗Sox2的抗体可以检测到基因的表达，结果见图3，图3是pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)质粒包装成为逆转录病毒后的表达鉴定图，图3中左边的图是检测Oct4的表达的比较结果图，右边的图是检测Sox2的表达的比较结果图。由图3可见，优化的Oct4和Sox2比非优化的Oct4和Sox2表达水平稍高。

MEF小鼠成纤维细胞的iPS诱导操作参照文献(Qin D，Li W，et al.Directgeneration of ES-like cells from unmodified mouse embryonic fibroblasts byOct4/Sox2/Myc/Klf4.Cell Res.17(2007)：959-62.该文献中文名为，使用Oct4/Sox2/Myc/Klf4直接从未修饰的小鼠胚胎成纤维细胞中直接产生干细胞样细胞。)。iPS实验过程联合使用了表达Myc(Addgene公司)的逆转录病毒。得到的iPS克隆经过计数，其实验结果见图4，图4是iPS效率差异的统计图，该图表明：优化的OKS可以明显地提高iPS效率。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<160>8

<210>1

<211>29

<212>F2A PRT

<400>1

Arg Ser Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu

1               5                   10                  15

Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

                                     25

<210>1

<211>22

<212>P2A PRT

<400>2

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe SerLeu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1               5                  10                  15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

            20

<210>1

<211>87

<212>F2A DNA

<400>3

agatctaaga ttgtggcccc tgtgaagcag accctgaact ttgacctgct gaagctggct    60

ggcgatgtgg agtccaaccc tggcccc                                        87

<210>1

<211>66

<212>P2A DNA

<400>4

ggatccggcg ccaccaactt ctccctgctg aagcaggctg gcgatgtgga ggagaaccct    60

gggccc                                                               66

<210>1

<211>1286

<212>HuOct4opt-F2A-P2A DNA

<400>5

gatatcaagc tttctagaat ggctggccat ctggcctctg actttgcctt ctctcctcct    60

cctggaggtg gaggcgatgg ccctggaggt cctgaacctg gctgggtgga ccccaggacc   120

tggctgtcct tccagggccc ccctggcggc cctggcattg gccctggcgt gggccctggc   180

tctgaggtct ggggcatccc cccatgccct cctccatatg agttctgtgg cggcatggcc   240

tactgtggcc ctcaagtggg agtgggactg gtgccccagg gcggcctgga gacctcccag   300

cctgagggcg aggctggcgt gggcgtggag tccaactctg atggcgcctc ccctgagcca   360

tgcacagtga cccctggcgc tgtgaagctg gagaaggaga agctggagca gaaccctgag   420

gagtcccagg acatcaaggc cctgcagaag gagctggagc agtttgccaa gctgctgaag     480

cagaagagga tcaccctggg ctacacccag gctgatgtgg gcctgaccct gggcgtgctg     540

tttggcaagg tcttctccca gaccaccatc tgcaggtttg aggccctgca gctgtccttc     600

aagaacatgt gcaagctgag gcccctgctg cagaagtggg tggaggaggc tgacaacaat     660

gagaacctgc aggagatttg caaggctgag accctggtgc aggccaggaa gaggaagagg     720

acctccattg agaaccgcgt gaggggcaac ctggagaacc tgttcctgca gtgccccaag     780

cccaccctgc agcaaatctc ccacattgcc cagcagctgg gcctggagaa ggatgtggtg     840

agggtctggt tctgcaacag gaggcagaag ggcaagaggt cctcctctga ctatgcccag     900

agggaggact ttgaggctgc tggctcccca ttctctggcg gccctgtctc cttccccctg     960

gcccctggcc cccactttgg cacccctggc tatggctccc cccacttcac agccctgtac    1020

tcctctgtgc cattccctga gggcgaggcc ttcccccctg tctctgtgac caccctgggc    1080

tcccccatgc actccaacag atctaagatt gtggcccctg tgaagcagac cctgaacttt    1140

gacctgctga agctggctgg cgatgtggag tccaaccctg gccccactag tgccggatcc    1200

ggcgccacca acttctccct gctgaagcag gctggcgatg tggaggagaa ccctgggccc    1260

gctagctaaa gaattctaaa gatatc                                         1286

<210>1

<211>1080

<212>HuOct4opt DNA

<400>6

atggctggcc atctggcctc tgactttgcc ttctctcctc ctcctggagg tggaggcgat      60

ggccctggag gtcctgaacc tggctgggtg gaccccagga cctggctgtc cttccagggc     120

ccccctggcg gccctggcat tggccctggc gtgggccctg gctctgaggt ctggggcatc     180

cccccatgcc ctcctccata tgagttctgt ggcggcatgg cctactgtgg ccctcaagtg     240

ggagtgggac tggtgcccca gggcggcctg gagacctccc agcctgaggg cgaggctggc     300

gtgggcgtgg agtccaactc tgatggcgcc tcccctgagc catgcacagt gacccctggc     360

gctgtgaagc tggagaagga gaagctggag cagaaccctg aggagtccca ggacatcaag     420

gccctgcaga aggagctgga gcagtttgcc aagctgctga agcagaagag gatcaccctg     480

ggctacaccc aggctgatgt gggcctgacc ctgggcgtgc tgtttggcaa ggtcttctcc     540

cagaccacca tctgcaggtt tgaggccctg cagctgtcct tcaagaacat gtgcaagctg     600

aggcccctgc tgcagaagtg ggtggaggag gctgacaaca atgagaacct gcaggagatt     660

tgcaaggctg agaccctggt gcaggccagg aagaggaaga ggacctccat tgagaaccgc     720

gtgaggggca acctggagaa cctgttcctg cagtgcccca agcccaccct gcagcaaatc     780

tcccacattg cccagcagct gggcctggag aaggatgtgg tgagggtctg gttctgcaac     840

aggaggcaga agggcaagag gtcctcctct gactatgccc agagggagga ctttgaggct     900

gctggctccc cattctctgg cggccctgtc tccttccccc tggcccctgg cccccacttt     960

ggcacccctg gctatggctc cccccacttc acagccctgt actcctctgt gccattccct    1020

gagggcgagg ccttcccccc tgtctctgtg accaccctgg gctcccccat gcactccaac    1080

<210>1

<211>1438

<212>HuKlf4opt DNA

<400>7

aagcttacta gtatggctgt ctctgatgcc ctgctgccat ccttctccac ctttgcctct      60

ggccctgctg gcagggagaa gaccctgagg caggctggcg cccccaacaa caggtggagg     120

gaggagctgt cccacatgaa gaggctgccc cctgtgctgc ctggcaggcc atatgacctg     180

gctgctgcca cagtggccac agacctggag tctggcggcg ctggcgctgc ctgtggcggc     240

tccaacctgg cccccctgcc caggagggag acagaggagt tcaatgacct gctggacctg     300

gacttcatcc tgtccaactc cctgacccat ccccctgagt ctgtggctgc cacagtctcc     360

tcctctgcct ctgcctcctc ctcctcctcc ccatcctcct ctggccctgc ctctgcccca     420

tccacctgct ccttcaccta ccccatcagg gctggcaatg accctggcgt ggcccctggc     480

ggcacaggcg gcggcctgct gtatggcagg gagtctgccc ccccccccac cgccccattc     540

aacctggctg acatcaatga tgtctcccca tctggcggct ttgtggctga gctgctgagg     600

cctgagctgg accctgtcta catccccccc cagcagcccc agccccctgg cggcggcctg     660

atgggcaagt ttgtgctgaa ggcctccctg tctgcccctg gctctgagta tggctcccca     720

tctgtgatct ctgtctccaa gggctcccct gatggctccc atcctgtggt ggtggcccca     780

tacaatggcg gcccccccag gacctgcccc aagatcaagc aggaggctgt ctcctcctgc     840

acccatctgg gcgctggccc ccccctgtcc aatggccaca ggcctgctgc ccatgacttc     900

cccctgggca ggcagctgcc atccaggacc acccccaccc tgggcctgga ggaggtgctg     960

tcctccaggg actgccatcc tgccctgccc ctgccccctg gcttccatcc ccatcctggc    1020

cccaactacc catccttcct gcctgaccag atgcagcccc aggtgccccc cctgcactac    1080

caggagctga tgccccctgg ctcctgcatg cctgaggagc ccaagcccaa gaggggcagg    1140

aggtcctggc ccaggaagag gacagccacc cacacctgtg actatgctgg ctgtggcaag    1200

acctacacca agtcctccca tctgaaggcc catctgagga cccacacagg cgagaagcca    1260

taccactgtg actgggatgg ctgtggctgg aagtttgcca ggtctgatga gctgaccagg    1320

cactacagga agcacacagg ccacaggcca ttccagtgcc agaagtgtga cagggccttc    1380

tccaggtctg accatctggc cctgcacatg aagaggcact ttggatccta aagaattc      1438

<210>1

<211>973

<212>HuSox2opt DNA

<400>8

aagcttgcta gcatgtacaa catgatggag acagagctga agccccctgg cccccagcag      60

acctctggcg gcggcggcgg caactccaca gctgctgctg ctggcggcaa ccagaagaac     120

tcccctgaca gggtgaagag gcccatgaat gccttcatgg tctggtccag gggccagagg     180

aggaagatgg cccaggagaa ccccaagatg cacaactctg aaatctccaa gaggctgggc     240

gctgagtgga agctgctgtc tgagacagag aagaggccat tcattgatga ggccaagagg     300

ctgagggccc tgcacatgaa ggagcatcct gactacaagt acaggcccag gaggaagacc     360

aagaccctga tgaagaagga caagtacacc ctgcctggcg gcctgctggc ccctggcggc     420

aactccatgg cctctggcgt gggcgtgggc gctggcctgg gcgctggcgt gaaccagagg     480

atggactcct atgcccacat gaatggctgg tccaatggct cctactccat gatgcaggac     540

cagctgggct acccccagca tcctggcctg aatgcccatg gcgctgccca gatgcagccc     600

atgcaccgct atgatgtctc tgccctgcag tacaactcca tgacctcctc ccagacctac     660

atgaatggct cccccaccta ctccatgtcc tactcccagc agggcacccc tggcatggcc     720

ctgggctcca tgggctctgt ggtgaagtct gaggcctcct cctccccccc tgtggtgacc     780

tcctcctccc actcccgcgc cccatgccag gctggcgacc tgagggacat gatctccatg     840

tacctgcctg gcgctgaggt gcctgagcct gctgccccat ccaggctgca catgtcccag     900

cactaccagt ctggccctgt gcctggcaca gccatcaatg gcaccctgcc cctgtcccac     960

atgtaaagaa ttc                                                        973

<210>1

<211>34

<212>hOct4(1+20)HS

<400>9

ggaaagctac tagtatggcg ggacacctgg cttc

<210>1

<211>41

<212>hOct4(1077-22)BEI

<400>10

gatgaattct ttaggatccg tttgaatgca tgggagagcc c

<210>1

<211>35

<212>hKlf4(1+20)HS

<400>11

ggaaagctta ctagtatggc tgtcagcgac gcgct

<210>1

<211>44

<212>hKlf4(1410-25)BEI

<400>12

gatgaattct ttaggatcca aaatgcctct tcatgtgtaa ggcg

<210>1

<211>40

<212>hSox2(1+25)HS

<400>13

ggaaagctta ctagtatgta caacatgatg gagacggagc

<210>1

<211>41

<212>hSox2(951-22)BEI

<400>14

gatgaattct ttaggatccc atgtgtgaga ggggcagtgt g

Claims (8)

1.一种优化的串连细胞因子，其特征在于，所述优化的串连细胞因子包含Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt，所述Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

2.根据权利要求1所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因连接顺序由5’端到3’端依次为Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt。

3.根据权利要求1所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述优化的串连细胞因子还含有串联片段，所述串联片段为2A多肽，所述2A多肽包括F2A多肽和P2A多肽，所述F2A多肽和P2A多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求3所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述F2A多肽和P2A多肽的基因序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

5.根据权利要求1所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述优化的串连细胞因子为Oct4opt-F2A-Klf4opt-P2A-Sox2opt。

6.根据权利要求5所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述Oct4opt、F2A、Klf4opt、P2A和Sox2opt的基因序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示。

7.权利要求1-6之一所述的优化的串连细胞因子在诱导多能性干细胞中的应用，其特征在于，所述优化的串连细胞因子选用逆转录病毒载体作为其载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述逆转录病毒载体为pMXs载体。

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