CN110964751A - 一种nampt慢病毒载体及其生物制剂与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NAMPT慢病毒载体及其生物制剂与应用，所述NAMPT慢病毒载体包含人的NAMPT基因，所述NAMPT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。这种慢病毒制剂在体外培养细胞及小鼠皮肤局部和全身应用实验中均表达并能提升细胞NAD+水平有影响。本发明还提供了表达hNAMPT基因的慢病毒载体的相关生物制剂，对应用后个体细胞中NAMPT酶表达量有提升，高表达NAMPT的细胞还会以胞囊小体的形式分泌NAMPT(eNAMPT)至循环系统，从而提高全身细胞NAD+水平，达到改善身体活动能力和抗衰老作用。
Description
技术领域
本发明属于基因治疗技术领域，更具体地，涉及一种NAMPT慢病毒载体及其生物制剂与应用。
背景技术
抗衰医学领域是当今生物科学领域一个重要的研究热点，自2015年哈佛医学院遗传学教授大卫·辛克莱尔首次确认β-烟酰胺单核苷酸的逆转衰老、延长寿命作用后，β-烟酰胺单核苷酸迅速成为生物技术领域的研究热点。2018年12月，日本庆应大学发现，β-烟酰胺单核苷酸甚至能够使失活的衰老干细胞重新获得分化能力，成功恢复其细胞活性。2019年6月，美国华盛顿大学医学院的Shin-ichiro Imai研究组在《Cell》期刊上发表了题为“Extracellular Vesicle-Contained eNAMPT Delays Aging and Extends Lifespan inMice”的论文，文中介绍了在对老年小鼠补充青年小鼠血浆的eNAMPT(细胞外烟酰胺磷酸核糖转移酶)后可使得平均剩余寿命仅剩2个月(相当于人类6年)的老年小鼠寿命延长到了4.6个月(人类13.8年)，整整延长了2.3倍，连外貌都明显年轻化。NAMPT是β-烟酰胺单核苷酸合成的限速酶，这一研究的重大意义在于，补充烟酰胺磷酸核糖转移酶比补充β-烟酰胺单核苷酸有更显著的抗衰老延长寿命的功效，为改善身体活动能力并延长寿命提供了另一种方式。然而，当前抗衰医学领域的新型产品为β-烟酰胺单核苷酸补充剂，需要长期持续服用补充；而eNAMPT是蛋白酶类，必须低温保存，生产纯化技术复杂成本高昂，需要长期反复静脉注射，根本无法推广使用。
发明内容
本发明第一个方面的目的，在于提供一种慢病毒载体。
本发明第二个方面的目的，在于提供一种慢病毒。
本发明第三个方面的目的，在于提供一种生物制剂。
本发明第四个方面的目的，在于提供本发明第二个方面所述慢病毒的制备方法。
本发明第五个方面的目的，在于提供一种系统性抗衰老注射剂。
本发明第六个方面的目的，在于提供一种皮肤抗衰老外用制剂。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种慢病毒载体，包含人的NAMPT基因，所述NAMPT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
根据本发明第一个方面所述的慢病毒载体，所述慢病毒载体由载体pGIPZ衍生而来。
本发明的第二个方面，提供一种慢病毒，包含本发明第一个方面所述的慢病毒载体。
本发明的第三个方面，提供一种生物制剂，包含本发明第二个方面所述的慢病毒。
本发明的第四个方面，提供本发明第二个方面所述慢病毒的制备方法，包括以下步骤：
将本发明第一个方面所述的慢病毒载体与辅助质粒共同转染宿主细胞进行慢病毒包装；
收集宿主细胞上清后，消化降解宿主细胞的游离核酸；
纯化去除宿主细胞碎片及宿主细胞蛋白，制得纯化后的慢病毒溶液，
所述纯化后的慢病毒溶液还可以制备成临床用生物制剂。
根据本发明第四个方面所述的方法，所述辅助质粒为pSPAX2.0和pMD2G；或提供慢病毒嗜其他宿主的质粒。
本发明的第五个方面，提供一种系统性抗衰老注射剂，由本发明第二个方面所述的慢病毒及药学上可接受的辅料组成。
根据本发明第五个方面所述的系统性抗衰老注射剂，所述注射剂按1×106～1×108TU/Kg体重静脉注射。
本发明的第六个方面，提供一种皮肤抗衰老外用制剂，由本发明第二个方面所述的慢病毒、人血清蛋白及药学上可接受的辅料组成。
根据本发明第六个方面所述的皮肤抗衰老外用制剂其特征在，所述慢病毒的含量为1×109TU/mL，所述人血清蛋白的含量为1％～5％。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供了一种表达人NAMPT基因的慢病毒载体，利用pGIPZ慢病毒骨架，将人NAMPT基因置于eIF1启动子控制之下，克隆在pGIPZXbaI/MluI位点，取代原慢病毒载体中CMV tGFP IRES shRNA基因片段得到重组质粒，phNAMPT(见附图1)。重组质粒phNAMPT经辅助质粒，pSPAX2.0和pMD2.G在293T细胞包装成慢病毒，离心浓缩纯化达到体内使用标准。该病毒颗粒制成生物制剂可以局部应用，如用于皮肤抗衰老，也可以系统性应用(静脉注射)而发挥整体抗衰老延长寿命作用。这种慢病毒制剂在体外培养细胞及小鼠皮肤局部和全身应用实验中均表达并能提升细胞NAD+水平有影响。
2.本发明提供表达hNAMPT基因的慢病毒载体的相关生物制剂，对应用后个体细胞中NAMPT酶表达量有提升，高表达NAMPT的细胞还会以胞囊小体的形式分泌NAMPT(eNAMPT)至循环系统，从而提高全身细胞NAD+水平，达到改善身体活动能力和抗衰老作用。
附图说明
图1phNAMPT慢病毒载体结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原料药物、试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的设备为本领域常规使用的设备。
实施例1phNAMPT慢病毒载体的构建
化学合成hNAMPT基因，利用基因密码的简并性对某些碱基进行置换，减少序列中潜在的回文结构以增加慢病毒生产滴度及在宿主细胞内的表达，碱基置换后的hNAMPT基因序列如SEQ ID NO：1所示。然后将hNAMPT基因序列插入慢病毒载体pGIPZXbaI/MluⅠ位点生成新的抗衰老慢病毒载体phNAMPT，如附图1所示。最后通过测序分析化学合成及重组质粒phNAMPT基因序列准确无误。
SEQ ID NO：1：
TCTAGACCTGTCCTCCGGCCCGAGATGAACCCCGCCGCCGAGGCCGAGTTCAACATCCTGCTGGCCACCGATAGCTACAAGGTGACCCACTACAAGCAGTACCCTCCCAACACCAGCAAGGTGTACAGCTACTTCGAGTGTCGCGAGAAGAAGACCGAGAACAGCAAGCTGAGGAAGGTGAAGTACGAAGAGACCGTGTTCTACGGCCTGCAGTACATCCTGAACAAGTACCTGAAGGGCAAGGTGGTGACCAAGGAGAAGATCCAGGAGGCCAAGGACGTGTACAAGGAGCACTTCCAGGACGACGTGTTCAACGAGAAGGGCTGGAACTACATCCTGGAGAAGTACGACGGCCACCTGCCAATCGAGATCAAGGCCGTGCCTGAGGGCTTCGTGATCCCTCGGGGCAATGTGCTGTTCACCGTGGAGAACACCGACCCCGAGTGCTACTGGCTGACAAATTGGATCGAGACCATCCTGGTGCAGTCCTGGTATCCCATCACAGTGGCCACCAACTCCCGCGAACAGAAGAAGATCCTGGCCAAGTACCTGCTGGAGACCAGCGGGAACCTGGACGGCCTGGAGTACAAGCTGCACGACTTCGGCTATAGAGGCGTGAGCTCCCAGGAAACAGCCGGCATCGGAGCCAGCGCCCATCTGGTGAATTTTAAGGGCACCGACACCGTGGCCGGGCTGGCTCTGATCAAGAAGTACTACGGAACCAAGGACCCTGTGCCCGGCTACTCTGTGCCTGCCGCCGAGCACTCCACCATCACAGCCTGGGGCAAGGACCACGAGAAGGATGCCTTCGAACACATCGTGACCCAGTTCAGCTCCGTGCCCGTGTCTGTGGTGAGCGACAGCTACGACATCTATAACGCCTGCGAGAAGATCTGGGGCGAGGATCTGCGCCACCTGATCGTGAGCCGGAGCACACAGGCCCCCCTGATCATTCGGCCTGACAGCGGGAACCCTCTGGACACCGTGCTGAAGGTGCTGGAGATTCTGGGCAAGAAGTTTCCCGTGACAGAGAATAGCAAGGGCTACAAGCTGCTGCCTCCCTACCTGAGAGTGATCCAGGGCGATGGCGTGGACATCAACACCCTGCAGGAGATCGTGGAGGGCATGAAGCAGAAGATGTGGAGCATCGAGAACATCGCCTTCGGCTCTGGCGGCGGCCTGCTGCAGAAGCTGACCAGGGACCTGCTGAATTGCTCCTTCAAGTGTAGCTACGTGGTGACCAACGGCCTGGGCATCAATGTGTTTAAGGACCCCGTGGCCGATCCCAATAAGAGATCCAAGAAGGGCAGACTGAGCCTGCACAGGACCCCCGCCGGCAACTTCGTGACCCTGGAGGAGGGCAAGGGCGACCTGGAGGAGTATGGCCAGGACCTGCTGCACACCGTGTTTAAGAACGGCAAGGTGACCAAGAGCTACAGCTTCGACGAGATCAGGAAGAACGCCCAGCTGAACATCGAGCTGGAGGCCGCCCACCACTGAGCTTTATGACTGGGTGACGCGT。
实施例2NAMPT慢病毒的包装
将实施例1中的慢病毒载体phNAMPT质粒DNA和辅助质粒(pSPAX2.0和pMD2G)DNA按优化比例共转染293T细胞进行慢病毒包装。其中pSPAX2.0质粒提供慢病毒包装所必需的逆转录酶，核蛋白和慢病毒RNA转运所必需的Rev；pMD2G质粒提供病毒包膜VSV-G以保证慢病毒广泛的宿主取向性(tropism)。在以后测试中，对这种假性宿主取向性(pseudotropism)要进一步选择优化。这种优化可以大大提高慢病毒的包装效率，保证phNAMPT慢病毒在局部应用或系统应用时可以最大限度地感染皮肤细胞或全身组织细胞。
实施例3NAMPT慢病毒的纯化
将实施例2中293T细胞培养72小时后，收集细胞上清液并测定慢病毒的滴度，经核酸酶消化降解游离的宿主细胞(293T细胞)DNA/RNA，经离心浓缩成粗制品，用磷酸缓冲液重悬浮慢病毒颗粒后测定慢病毒滴度；采用离子交换层析柱、蔗糖梯度离心等，进一步纯化以除去慢病毒粗制品中的杂蛋白及细胞膜碎片，达到体内应用临床级别，此时再次测定慢病毒滴度，计算慢病毒包装效率和各浓缩纯化步骤慢病毒的出产率。
其中，超速离心沉淀法
1.将Ultra-clearSW28离心管用70％乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟；
2.向每个离心管内加入2ml40％的蔗糖溶液，再缓慢加入2ml 20％的蔗糖溶液；
3.向每个Ultra-clearSW28离心管中加入约32ml浓缩后重悬的病毒上清液；
4. 4℃，25000rpm，超速离心2h，在蔗糖溶液交界处可见少量半透明白色聚集物；
5.用巴斯吸管小心吸出半透明白色聚集物；
6.透析除去蔗糖，分装置于-80℃保存。
PEG-8000浓缩法
PEG(聚乙二醇)是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。
1.使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
2.每20～30min混合一次，共进行3-5次；
3. 4℃放置过夜。
4. 4℃，4000g，离心20min；
5.吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
6.用不含钙和镁的冷PBS重悬沉淀(注意避免产生气泡)，-80℃保存。
病毒滴度测定
滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为：转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
可采用稀释计数法
1.第一天细胞准备：将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1*10^5/ml，加入96孔板，100ul/孔，为每个病毒准备10个孔，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
2.第二天加病毒：在EP管内做10倍梯度稀释，连续10个稀释度(10～10^-8)。吸取96孔板内原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。
3.第三天追加培养液：在每个孔内再加入100ul完全培养基，；利于细胞生长。
4.第五天观察结果并计算滴度：在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度(TU/ml)＝(X+Y*10)*1000/2/X孔的病毒液的含量(ul)。
或者定量PCR法
病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。每孔细胞为5*10^4个。
接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球技术板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5ug/ml polybrene的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1ul病毒加入到199ul的培养基中，在3个培养孔中分别加入0.5ul，5ul和50ul的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养基上清，换为500ul含DNaseI的新鲜培养基，在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。
用0.5ml 0.25％胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照所用DNA抽提试剂盒的说明抽提基因DNA。每个样品管中加入200ul洗脱液洗下DNA。用DNA定量试剂盒定量。基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。
准备PCR所需的试剂和样品，按照所用试剂的说明进行试剂配制。在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。
分别取5ul质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到各试验样孔中，每个样品重复一次。并留一孔加入5ul无菌水作为无模板对照。按照说明书对PCR仪进行PCR条件设定。
滴度的计算公式如下：
TU/ml＝(C*N*D*1000)/V。
其中：C＝平均每基因组整合的病毒拷贝数，
N＝感染时细胞的数量，
D＝病毒载体的稀释倍数，
V＝加入的稀释病毒的体积数。
实施例4NAMPT慢病毒注射剂的制备
将实施例3中纯化过的NAMPT慢病毒与常用注射剂辅料，
常用注射剂辅料(如5％人血清白蛋白可以增加hNAMPT慢病毒的稳定性)配成1×109TU/ml注射液，按1×108TU/kg静脉注射(此剂量有待临床试验进一步优化)，正如前面背景技术阐述，hNAMPT慢病毒终身只需注射一次即可有抗衰老延长寿命之功效。但hNAMPT慢病毒注射后生物学效果，比如抗衰老(体力、面容、头发、骨质疏松等)，延长寿命，体内生化指标eNAMPT水平及细胞内NAD+水平等则需长期观察检测才能获得。
抗衰老phNAMPT慢病毒稀释成1×109TU/mL并含有5％人血清白蛋白用安瓿封装，置于-80℃长期保存。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州益养生物科技有限公司
<120> 一种NAMPT慢病毒载体及其生物制剂与应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1522
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tctagacctg tcctccggcc cgagatgaac cccgccgccg aggccgagtt caacatcctg 60
ctggccaccg atagctacaa ggtgacccac tacaagcagt accctcccaa caccagcaag 120
gtgtacagct acttcgagtg tcgcgagaag aagaccgaga acagcaagct gaggaaggtg 180
aagtacgaag agaccgtgtt ctacggcctg cagtacatcc tgaacaagta cctgaagggc 240
aaggtggtga ccaaggagaa gatccaggag gccaaggacg tgtacaagga gcacttccag 300
gacgacgtgt tcaacgagaa gggctggaac tacatcctgg agaagtacga cggccacctg 360
ccaatcgaga tcaaggccgt gcctgagggc ttcgtgatcc ctcggggcaa tgtgctgttc 420
accgtggaga acaccgaccc cgagtgctac tggctgacaa attggatcga gaccatcctg 480
gtgcagtcct ggtatcccat cacagtggcc accaactccc gcgaacagaa gaagatcctg 540
gccaagtacc tgctggagac cagcgggaac ctggacggcc tggagtacaa gctgcacgac 600
ttcggctata gaggcgtgag ctcccaggaa acagccggca tcggagccag cgcccatctg 660
gtgaatttta agggcaccga caccgtggcc gggctggctc tgatcaagaa gtactacgga 720
accaaggacc ctgtgcccgg ctactctgtg cctgccgccg agcactccac catcacagcc 780
tggggcaagg accacgagaa ggatgccttc gaacacatcg tgacccagtt cagctccgtg 840
cccgtgtctg tggtgagcga cagctacgac atctataacg cctgcgagaa gatctggggc 900
gaggatctgc gccacctgat cgtgagccgg agcacacagg cccccctgat cattcggcct 960
gacagcggga accctctgga caccgtgctg aaggtgctgg agattctggg caagaagttt 1020
cccgtgacag agaatagcaa gggctacaag ctgctgcctc cctacctgag agtgatccag 1080
ggcgatggcg tggacatcaa caccctgcag gagatcgtgg agggcatgaa gcagaagatg 1140
tggagcatcg agaacatcgc cttcggctct ggcggcggcc tgctgcagaa gctgaccagg 1200
gacctgctga attgctcctt caagtgtagc tacgtggtga ccaacggcct gggcatcaat 1260
gtgtttaagg accccgtggc cgatcccaat aagagatcca agaagggcag actgagcctg 1320
cacaggaccc ccgccggcaa cttcgtgacc ctggaggagg gcaagggcga cctggaggag 1380
tatggccagg acctgctgca caccgtgttt aagaacggca aggtgaccaa gagctacagc 1440
ttcgacgaga tcaggaagaa cgcccagctg aacatcgagc tggaggccgc ccaccactga 1500
gctttatgac tgggtgacgc gt 1522
Claims (10)
1.一种慢病毒载体，包含人的NAMPT基因，所述NAMPT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体由载体pGIPZ衍生而来。
3.一种慢病毒，包含权利要求1或2所述的慢病毒载体。
4.一种生物制剂，包含权利要求3所述的慢病毒。
5.权利要求3所述慢病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1或2所述慢病毒载体与辅助质粒共同转染宿主细胞进行慢病毒包装；
收集宿主细胞上清后，消化降解宿主细胞的游离核酸；
纯化去除宿主细胞碎片及宿主细胞蛋白，制得纯化后的慢病毒溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述辅助质粒为pSPAX2.0和pMD2G，或提供慢病毒嗜其他宿主的质粒。
7.一种系统性抗衰老注射剂，由权利要求3所述慢病毒及药学上可接受的辅料组成。
8.根据权利要求7所述的系统性抗衰老注射剂，其特征在于，所述注射剂按1×106～1×108TU/Kg体重静脉注射。
9.一种皮肤抗衰老外用制剂，由权利要求3所述慢病毒、人血清蛋白及药学上可接受的辅料组成。
10.根据权利要求9所述的皮肤抗衰老外用制剂其特征在，所述慢病毒的含量为1×109TU/mL，所述人血清蛋白的含量为1％～5％。
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