CN1249244C

CN1249244C - 去除抗生素耐药性和/或使质粒稳定的方法,该方法构建的载体和转化的宿主细胞及其应用

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Publication number: CN1249244C
Application number: CN02812556.8A
Authority: CN
Inventors: 利夫·艾萨克森; 彼得·J·黑格; 法黑德·M·阿布达尔卡里姆
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-06-21
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2006-04-05
Anticipated expiration: 2022-06-19
Also published as: WO2003000881A2; ZA200309767B; EP1404847A2; US20040234984A1; ES2240758T3; DE60204317D1; DE60204317T2; WO2003000881A3; AU2002314183A1; ATE296354T1; CN1518599A; SE0102204D0; EP1404847B1

Abstract

本发明涉及用于除去抗生素耐药性和/或使质粒稳定的方法。本发明包括构建载体的步骤，所述载体含有为同向重复序列基因所包围的抗生素耐药性基因。此同向重复序列基因可以是一个必需基因或Rek-序列。在后一种情况中，载体中存在具有适宜启动子的必需基因。用所得的载体转化宿主细胞，之后去除宿主细胞中必需的染色体基因并去除细胞中载体内的抗生素耐药性基因。优选的必需基因是infA。本发明也涉及在宿主细胞内稳定维持载体的方法，在细胞中生产DNA的方法和在细胞中生产氨基酸，肽和蛋白的方法。而且，本发明还涉及已去除染色体必需基因，并含有下述载体的转化宿主细胞，该载体含有相应的必需基因，还可能含有一或多个所需的基因X。该载体不携带抗生素耐药性基因。本发明还包括从宿主获得的载体DNA在制备用于基因治疗的药物组合物，如疫苗中的用途。携带含有适宜基因X的载体的细菌可被用于大规模生产该基因的基因产物所针对的化合物。

Description

去除抗生素耐药性和/或使质粒稳定的方法，该方法构建的载体和转化的宿主细胞及其应用

技术领域

本发明涉及在宿主细胞中去除抗生素耐药性和/或使载体稳定的方法，以此作为生产载体DNA和/或重组蛋白的方法。本发明也包括转化的宿主细胞，其中染色体必需基因已被去除而且还包含含有此基因的载体。本发明还涉及根据本发明生产的载体DNA在制备包含缺乏任何抗生素耐药性基因的DNA的药物组合物中的用途。

背景技术

载体的稳定维持，特别是以高拷贝数稳定维持，对于由它制备DNA并表达蛋白是重要的。包含克隆的基因并已经被引入宿主，如细菌，的克隆载体，如质粒，是很容易在细菌培养时丢失的。这是因为在细胞分裂过程中无法控制载体在子代细胞中的分配。而且，该载体对细菌宿主是一个代谢负担。失去质粒的细菌通常比携带质粒的细菌生长更好并且数目更多。

无质粒分离子的累积是用于克隆和表达目的的基本复制子质粒的一个问题，因为它们不携带任何使其有序分布到子代细胞中的基因系统。这是大规模培养中在宿主细菌中维持表达质粒的一个主要的工业问题。已尝试一些方法来克服克隆质粒的分离不稳定性。

i)使用一些插入载体的抗生素耐药性基因并向生长培养基中加入相应的抗生素是质粒维持的最常用选择压力。除抗生素的经济成本外，由抗生素自身和工业废物中的耐药性基因造成的潜在环境危害是明显的。因为用于质粒选择的抗生素浓度在长期培养中由于稀释和/或生长细胞的酶降解经常降低，所以至今不能完全避免无质粒分离子的出现。

ii)已有人提出由协调操作的数个基因组成的天然稳定系统。应用此系统来稳定另一非必需的质粒可导致质粒体积增大(Mantile等，1999)，它会降低宿主的生长速率。这使得有可能筛选出生长较快于是在培养基中大量产生的质粒或无质粒的分离子(Weber等，1991)。

质粒携带的基因中的控制功能已用来指挥具有自杀功能的染色体基因。不含质粒的细胞不具有控制功能并会被杀死，从而建立了质粒稳定性(Boe等，1987)。

iii)已有人尝试对宿主细胞内编码缬氨酸-tRNA合成酶的必需基因valS进行遗传改变，来使细胞依赖于质粒所携带的相应野生型生长基因的存在而生长(Nilsson等，1987)。

此方法基于下述系统，其中具有温度敏感缺陷的编码必需蛋白缬氨酸-tRNA合成酶的基因valS存在于染色体中，而正常的野生型等位基因存在于质粒中。当温度升高时，细胞只有在含有野生型等位基因的载体存在时才能生长。

然而，因为染色体基因拷贝没有被去除，尽管被遗传修饰，质粒所携带的基因发生等位交换导致野生型染色体基因拷贝恢复的频率很高。因此，这些例子中的方法需要重组缺陷(recA^-)的菌株，它使宿主菌株生长不利。然而，抗生素耐药性基因存在于质粒中并且不发生缺失，使工业废物具有危害性。

iv)同样在一些其它情况中使质粒稳定不需要在培养时应用抗生素耐药性。

例如，有人已除去必需的大肠杆菌ssb基因的染色体拷贝并将它替换到质粒中(Porter等，1990)。然而，质粒上的耐药性基因并未被去除。

这些已知方法中的质粒的另一个问题是质粒的体积相当大。这是由于存在抗生素耐药性基因，并且用于建立质粒稳定性的基因构建体相当长。因而，插入任一要表达的所需基因会产生一个更大的质粒。从而存在以下风险：该质粒在生长培养基中不是很稳定，并且它对于宿主细胞的生长速度有负面效应。

美国专利5,972,708中描述了利用一种系统建立的质粒稳定性，该系统中质粒含有一个受染色体基因编码的抑制子控制的操纵子。该抑制子通过与此操纵子结合来被滴定(titrate)。在染色体中有细胞生长所必需的另一个基因，它受相同的抑制子控制。只要该质粒存在于细胞中，所述滴定效应会使必需的染色体基因表达。然而，如果失去了所述质粒和滴定效应，可通过抑制子遏止来关闭它。只要染色体上的耐药性基因未被去除，抗生素耐药性基因在环境中散布的风险就依然存在。

发明简述

本发明涉及在宿主细胞中去除抗生素耐药性和/或建立载体稳定性的方法。根据本发明可生产新的载体以对携带此载体的宿主细胞进行总体选择。通过除去必需基因的染色体拷贝并将它替换到质粒可获得此特性。结果是，只有携带质粒的细胞能生长，这使得宿主完全依赖于所述质粒。优选用小基因，如基因infA。所述基因infA编码的是翻译-起始因子1(IF1)，这是细胞生存力所必需的细胞内小因子(Cummings等，1994)。该质粒不包含任何抗生素基因，因此抗生素选择是不必要的，这为培养过程提供了很多方便并消除了显著的环境忧患。该方法尤其有利于在温室和自然界中生长的转基因植物借助植物细菌中的载体实现稳定，这其中不必考虑宿主的消除。

本发明方法可用于生产载体DNA和氨基酸，肽或蛋白，如重组蛋白。所述载体DNA可用于制备药物组合物或疫苗以用于基因治疗。它也包括转化的宿主细胞，该宿主细胞中染色体必需基因已被去除并且该细胞包含含有此基因的载体。

发明详述

根据本发明用于去除抗生素耐药性和/或建立质粒稳定性的方法，具有以下特征：

a)构建含有为同向重复序列基因所包围的抗生素耐药性基因的载体，其中同向重复序列基因可能是一个必需基因，

b)当所述重复序列基因并非必需基因时，另外向载体中插入必需基因和适宜此必需基因的启动子，

c)可以再插入一个多克隆位点，

d)用a)，b)或c)所获得的载体转染宿主细胞，

e)去除宿主细胞内的染色体必需基因，

f)体内去除抗生素耐药性基因。

步骤a)，b)和c)可以用任何顺序完成。

由长的核酸序列组成的载体不如由较短序列组成的载体稳定。更稳定的载体可以导致获得含有所需核酸序列的载体的更多拷贝。而且，含有长的核酸序列的载体会更频繁经历能破坏载体中DNA序列结构的突变。出于此原因，必需基因应尽可能小。

载体中核酸序列的总长度也依赖于可能插入所述载体中用于进行拷贝的所需DNA序列X的长度。对必需基因的选择还依赖于微生物，即载体所对应的宿主。因而不可能描述必需基因的最适长度。通常优选基因越短越好。

优选必需基因是编码翻译起始因子IF1的infA。infA基因的编码序列只包含213个bp。已证明含有infA基因而没有抗细菌的耐药性基因的被测载体会保持稳定。另外，载体中还有较多位置，它们可用于插入要表达的所需基因，和/或确保载体不会变得太大从而成为宿主细胞的沉重负担因而变得不稳定。

采用infA作为必需基因时，在携带载体的宿主中，必需IF1(翻译起始因子1)仅由质粒携带的infA⁺基因编码。因为IF1是细胞生存力所必需的细胞内蛋白(Cummings等，1994)，这使质粒在培养中高度稳定，而且无质粒分离子因为无互养效应而不能生长。

采用必需基因作为选择性标记，可以使载体构建中用到的编码抗生素耐药性的基因通过两种侧翼的同向重复序列(Rek序列)之间的重组而体内去除。插入了必需基因后，就可实现这一点。一旦构建出去除了染色体必需基因并且载体中具有相同必需基因的菌株，就不需要抗生素耐药性基因了。可以用必需基因序列作为载体内抗生素耐药性基因两侧的重复序列并忽略上述方法中的步骤b)。

“相同的必需基因”可被理解为与必需的染色体基因序列基本相同的基因序列被插入载体。可能存在一些不影响基因表达产物的差异，如涉及遗传密码简并性的差异，或者经过突变改变了基因产物但保留了活性的差异。

当从必需基因序列以外的其它序列中选出Rek序列时，可进行下述步骤：

a)构建含有为同向重复序列(可以是一种基因)所包围的抗生素耐药性基因的载体，

b)在载体中插入必需基因，适宜该必需基因的启动子及一个多克隆位点，

c)用b)所获得的载体转染宿主细胞，

d)去除宿主细胞内的染色体必需基因，

e)体内去除抗生素耐药性基因，

步骤a)和b)可以用相反的顺序完成。

适宜的启动子可使必需基因转录。所用的启动子实例为pTrc或infA启动子。

“包含”的用法据我们理解是包括但不限于。因此，可以存在其他未提到的基因。尤其是载体可携带一个所需的插入基因，该基因的复制不需要有抗生素存在时的生长。因此，可以将载体/宿主系统要拷贝，生产或表达的一或多个所需基因X插入载体。这可以在所述方法的任何步骤中完成，但不能在去除载体中抗生素耐药性基因的步骤之后，因为这样会导致无法选择携带所需基因的宿主。优选载体中插入一个多克隆位点。还可包括一或多个适于所需基因X转录的启动子如rrnB启动子。

可用所述方法去除染色体必需基因并替换至大肠杆菌中，并如Link等(1997)所述对基因替换进行选择。也可以通过M13mp(Blum等1989)质粒方法或通过PCR扩增之后转化线性DNA来除去染色体基因。

在本发明的多数应用中，抗生素耐药性基因通过两种侧翼同向重复之间发生本领域已知的体内同源重组来去除，其中一种同向重复序列被留在载体中。据我们理解重复序列是在相同方向重复的DNA序列。重复序列可以是任何可与抗生素耐药性基因一起被去除的序列。同向重复序列可以是必需基因，例如基因infA(图1B)或任何同向重复，例如图1A中的Rek。优选重复序列长度为至少150个碱基对，并且是通过PCR扩增抗生素耐药性基因下游的序列，并将它插入抗生素耐药性基因上游建立的。也可以合成Rek序列并用限制酶和聚合接头来创建两个Rek位点。

针对抗生素耐药性基因的去除进行的筛选可能不是必需的，因为最多约50％的非选择性宿主会在长时间内通过同向重复之间的重组过程自发失去它。然而这不依赖于该过程终产物的意向用途。

根据一个优选实施方案，当必需基因是infA而不是Rek序列时，具体完成如下步骤：

1.从质粒pBR322中去除氨苄青霉素耐药基因bla，得到pBR322-ΔAmp。这可以用长模板PCR技术或通过应用限制酶来完成。

2.将同向重复序列Rek放置在四环素耐药性基因tet基因的两侧，方法例如是通过PCR扩增tet基因下游的序列，特别是应用表格II中的引物序列Rek 1和3进行PCR扩增，然后将PCR扩增的DNA克隆到质粒中tet基因的上游。将基因infA克隆到商品化的pTrc-99A质粒中pTrc启动子之后，得到质粒pTrc99A-infA。

3.含有pTrc-启动子和infA基因的片段从质粒pTrc99A-infA中切下来。

4.在此片段上创建平端，并且通过平端连接将此片段克隆到pRK质粒中，将包含多克隆位点(MCS)和rrnB的启动子的片段连接到此质粒中，得到质粒pRK01。

5.从pMOSBlue-infA去除infA结构基因得到质粒pMOSBlue-ΔinfA。

6.根据Link等(1997)，将ΔinfA片段(带有infA结构基因的420bp上游序列和400bp下游序列)亚克隆到基因替换质粒pK03中，得到质粒pK03-ΔinfA。

7.用质粒pK01和质粒pK03-ΔinfA转化大肠杆菌菌株，例如MG 1655。

8.对基因替换的选择优选如Link等(1997)所述来完成，得到菌株如PF1A，它具有染色体缺失ΔinfA，和在tet基因两侧具有重复序列如Rek的质粒pRK01。

9.优选用对于infA两侧的染色体序列特异的引物确认infA的染色体缺失，并对染色体的这个部分进行PCR扩增和测序。

10.如果需要，将基因X插入质粒后可转化入适宜菌株如PF1A，并应用四环素耐药性来选择质粒。

11.可用镰刀菌酸选择经过同源重组并携带质粒pRK02，有或无基因X，失去了tet基因的菌株。

12.氨苄青霉素耐药性(bla基因)可用作X的模型基因。在菌株PF1A内，该基因可利用氨苄青霉素筛选而插入到pRK01或pRK02中，得到pRK-amp。具有pRK-amp的该菌株可在不进行氨苄青霉素筛选的情况中用来检查质粒稳定性。或者可如上面第9条所述，插入bla基因作为基因X的模型。

13.携带质粒的细菌可在无氨苄青霉素的条件中培养数代，之后检查来自单个细菌的菌落中bla基因的存在。

所述同向重复可以是必需基因自身。这两个重复促进了造成耐药性基因精确去除的同源重组(图1和图4B)。

通过此种技术，在重组后的终产物中不存在其它ReK序列，只有一个拷贝的必需基因重复序列。这样一来，相对于必需基因作为重复序列插入到抗生素耐药性基因两侧的情况，当必需基因被插入载体的一些其它位置时，该载体会较小。

当所述必需基因被用作Rek序列时，本发明的方法可包含如下步骤：

a)构建载体，该载体含有被由必需基因组成的同向重复序列基因所包围的抗生素耐药性基因，还包含至少一个适于必需基因并被置于合适位置的启动子和一个多克隆位点，

b)用a)所获得的载体转染宿主细胞，

c)去除宿主细胞内的染色体基因，

d)体内去除抗生素耐药性基因，

步骤a)和b)可以用相反的顺序完成。

当用infA基因作为必需基因和同向重复序列时，可进行如下具体步骤：

1.从质粒pBR322去除氨苄青霉素耐药性基因bla，得到pBR322-ΔAmp。

2.将infA基因及其启动子克隆到质粒pBR322-ΔAmp的tet基因上游。

3.将另一拷贝的infA基因插入质粒pBR322-ΔAmp的tet基因下游。

4.将含有一个多克隆位点(MCS)和rrnB的启动子的片段连接入该质粒，得到质粒pIF01。

5.从pMOSBlue-infA中去除infA结构基因得到质粒pMOSBlue-ΔinfA。

6.根据Link等(1997)所述，将ΔinfA片段(带有infA结构基因的420bp上游序列和400bp下游序列)亚克隆到基因替换质粒pK03中，得到质粒pK03-ΔinfA。

7.用质粒pIF01和质粒pK03-ΔinfA转化大肠杆菌菌株例如MG 1655。

8.对基因替换的选择优选如Link等(1997)所述来完成，得到菌株如PF1A，它具有染色体缺失ΔinfA，和在tet基因两侧具有诸如Rek等重复序列的质粒pRK01。

9.优选用对于infA两侧的染色体序列特异的引物确认infA染色体缺失，并对染色体的这个部分进行PCR扩增和测序。

10.可用镰刀菌酸选择经过同源重组并携带质粒pIF02，无tet基因的菌株。

11.通过将氨苄青霉素耐药性bla基因连接到质粒pIF02，再进入大肠杆菌菌株PF1A来确定稳定性。

12.在无氨苄青霉素的条件培养若干代，并且控制菌落中bla基因的存在。

当所述必需基因被用作重复序列并且当所述抗生素耐药性基因通过同源重组被去除时，需要只在幸存宿主的重复序列中存在适宜的启动子。

本发明也包括了在宿主细胞内维持载体的方法，该法包括在培养上述转化细胞的步骤，所用培养时间和培养条件足以允许该细胞生长。这可用于所需要的任何产物的良好产出。此类产物可以是插入基因或一些DNA例如基因，如质粒内基因所编码的蛋白。

如本文所用，″细胞生长″是指培养基中的细胞数量随时间增加，也可指细胞存活但培养基中细胞数量不再随时间增加也不随时间减少(稳态)。

本发明也包括生产带有插入基因的载体DNA的方法，该法包括在足够允许所述细胞生长的培养时间和培养条件中培养上述转化细胞，并从培养的细胞中分离带有插入基因的载体DNA。

可用本发明的此类方法生产载体DNA和携带治疗基因的DNA，用于基因治疗和通过DNA疫苗启动免疫应答。

因而，本发明也包括本发明生产的DNA在制备用于基因治疗的药物组合物如疫苗中的用途。

在这种情况，所需的基因可在哺乳动物的细胞，优选人的细胞内表达。这些基因的实例在本领域已知。如果需要，所需基因将不在宿主菌株中表达。宿主菌株为细菌时，通过包括与所需基因操作性连接的细菌启动子即可达到该目的。

本发明也包括生产生物代谢产物，如氨基酸及肽或蛋白的方法，该方法包括培养上述转化宿主细胞，所述细胞带有插入了经过适当选择的基因X的载体，所用培养时间和条件足以产生这些产物。优选，本方法还包括分离这些产物。

此方法可特别用于制备不容易通过合成或其它方法生产的生物代谢物如氨基酸和肽。

此蛋白可为任何蛋白，如重组蛋白和对人或动物有治疗益处的蛋白。

本发明也可用于高水平表达插入载体的基因。如果此类基因编码能合成并过度生产中间代谢的生物有机代谢物的酶，很多通常难于通过有机化学方法合成的代谢产物，反而可通过细菌菌株的大规模培养来生产。

本发明也涉及已去除了染色体必需基因的转化宿主细胞，此宿主细胞包含含有必需基因，并可能也含有所需基因X的载体。该细胞或载体不包含任何抗细菌耐药性的基因。所述必需基因可受适宜启动子的控制，包括它的天然启动子。

本发明可用的宿主细胞

本发明适用于带有能感染动物细胞如哺乳动物细胞，真核和原核细胞，如昆虫细胞，植物细胞，真菌的质粒或病毒的细菌。本发明也可用于酵母和多数细菌菌株，例如革兰氏阳性和阴性细菌菌株。

在一实施方案中，所述宿主细胞为革兰氏阴性或阳性的细菌细胞，例如大肠杆菌，如大肠杆菌菌株DH5α，MG1655和PF1A，也有其它，沙门氏菌例如鼠伤寒沙门氏杆菌，芽孢杆菌，链霉菌和乳杆菌。上述大肠杆菌菌株可在所有类型的培养基上生长。

本发明可用的革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌和沙门氏菌。

本发明可用的革兰氏阳性物种包括但不限于已含有高拷贝数量的质粒的芽孢杆菌，链霉菌，乳杆菌和乳球菌。可用于本发明乳球菌中的质粒例子是pNZ2123和pIL253(Simon等1988)。可用于本发明芽孢杆菌中的质粒例子是pC194，pUB110和pT181。

本发明可用酵母，因为酵母中可保留高拷贝数的质粒。这些质粒的实例包括拷贝数为每个细胞最多约100个拷贝的YRp质粒(基于自我复制序列(ARS))，和拷贝数为每个细胞50-100个拷贝的YEp质粒(基于2微米的环)(见Sikorski，1993；Ausubel等，1994)。

本发明特别适用于带有能感染植物的质粒或病毒或的细菌，如土壤杆菌。对植物细胞进行基因操作后，一般将它们用于自然界或温室中。因而，尤其不需要使用抗生素耐药性来维持这些宿主细胞中的载体。与用于生产重组蛋白或RNA或DNA的细菌宿主不同，不可能为了限制这些不需要的基因的散布而破坏植物宿主。

本发明可用的载体

可用任何与所用宿主相容的复制子，克隆载体或载体。

本发明所用的质粒必须具有与宿主匹配的质粒起点。本发明优选应用能允许该质粒在细胞中复制得到高拷贝数的质粒复制起点。

常用的复制起点之中，本发明可用pBR322(约20拷贝/细胞)和PRK02。也可用pUC(约200拷贝/细胞)。这些质粒的实例包括但不限于Vieira和Messing(1982，Gene，19(3)，259-268)和Yanisch-Perron等(1985，Gene，33(1)，103-119)所述的pBR322和pUC系列质粒。也可用噬菌体如噬菌体λ。

对于昆虫细胞可用杆状病毒。对于酵母，可用酵母表达载体，附加载体或质粒载体，整合载体和酵母人工载体如染色体YAC。

适合植物的载体例如根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒和Ti质粒衍生的载体系统。

在基因治疗中的用途

本发明生产的质粒DNA当含有治疗基因时，可用于基因治疗。治疗基因是可在哺乳动物细胞(优选人细胞)中表达、并编码对哺乳动物(优选人)有治疗益处的RNA，DNA或多肽的基因。这些基因的例子在本领域已知，包括但不限于具有不同来源、能在哺乳动物体内表达并产生对抗所生产的抗体的抗原性物质或疫苗的抗原。所述DNA可编码引起不同种类的过敏反应如枯草热，接触性变态反应等的物质。它也可编码来自传染性微生物如细菌，病毒，支原体等的蛋白。

所述DNA也可以是对多种疾病而言重要的基因，如β葡糖脑苷脂酶基因，布卢顿氏胸苷激酶基因，编码细胞因子(如TNF，白细胞介素1-12，干扰素(α，β，γ)，Fc受体，T-cell受体和p53)的基因。其它实例包括编码HIV抑制因子，例如用作天然蛋白的竞争性抑制因子的TAT或REV突变体的基因。所述质粒DNA也可包括标记基因，如药物抗性基因，β半乳糖苷酶基因，二氢叶酸还原酶基因，和氯霉素乙酰转移酶基因。

所述DNA或RNA可在活体内或活体外应用，所述应用中希望编码具有生理学重要性(如替换缺陷基因或增加有潜在益处的基因功能)的产物的治疗基因能对细胞进行长期遗传修饰并在疾病治疗中有效。

含有治疗基因的质粒DNA可用病毒或非病毒模式在活体内或活体外基因治疗中给药。给药模式在本发明中并非关键，可包括，用基因枪给药裸露DNA，受体介导的基因治疗，例如用脂质体/抗体复合物，和病毒载体。

例如，患病毒性疾病或遗传性疾病的患者可用本发明在活体内或活体外的方法治疗。例如，在活体内治疗时，本发明质粒DNA可通过摄入，注射，吸入或任何其它多种方法给药患者，优选为可生物用溶液或可药用传递载体的形式。给药剂量将因患者而异；″治疗有效剂量″将由所转移的遗传物质为任何风险或不良副作用所平衡的功能的增强水平而定。监测基因引入，基因表达的水平和/或编码产物的存在或水平有助于选择并调整给药剂量。通常，含有传递载体的组合物将会以单次剂量在10ng-100μg/kg体重的范围，优选在100ng-10μg/kg体重的范围给药，从而可以将治疗基因的至少一个拷贝传递到每个靶细胞。

活体外治疗也在本发明范畴内。从病人体内取出或由其它方式提供的细胞群，依照本发明用含有治疗基因的质粒转染，然后重新引入患者。如果引入适宜的Rek序列，以便得到位于转染质粒阳性选择(可以是，但不限于抗生素耐药性)所用到的基因侧翼的同向重复，那么同源序列间的重组将根据需要去除细胞中质粒内的选择性基因。

作为本发明活体外基因转移目标的细胞包括希望传递治疗基因的任何细胞，例如，免疫系统的细胞如T细胞，B细胞，和巨噬细胞，造血干细胞，以及树状突细胞。应用现有技术，经过富集后的干细胞可用于基因转移。或者，如本文所述，可以使未分离的造血干细胞和干细胞群易于摄取DNA。如果需要，质粒也可含有赋予位点非依赖性、组织特异性基因表达的序列，如PCT/GB88/00655所述。

本发明的新构建体有多项有利之处。它不含有任何抗生素耐药性从而不需要用抗生素来维持载体。因为不必要用抗生素进行选择而使得培养的费用便宜。耐受抗生素的细菌基因的散布会造成环境危害，而由于抗生素从培养的植物中释放又使这种危害变得更糟。而且，甚至在延长时间的培养后无质粒的细胞也不累积。本发明方法特别可用于去除抗生素耐药性基因并插入基因从而在植物细胞中生产重组基因产物。

IF1是一种只由71个氨基酸组成的小蛋白。这意味着携带infA的载体可保持小体积，这是可用于本发明的优选必需基因。这样一来，质粒对于细胞生长造成的代谢负担就会最小。此载体的体积小可使带有需要表达的基因的较大DNA片段被插入。本文构建的pRK-质粒体积小(3570碱基对)。与携带pRK质粒的亲代菌株MG1655相比，携带pRK质粒的PF1A在富集肉汤培养基和已知成分的M9培养基中的倍增时间，实际不受infA去除的影响(表III)。另外，在两种培养基中，培养终点时，两种菌株的细胞量是相同的(未显示)。

由于含有infA插入子的载体小，使得它不会阻碍生长。反而生长很正常(见实施例7)。同样，质粒和infA基因的体积小表明不需要的突变其出现频率非常低。当infA中出现突变，并造成所述基因产物(IF1)失活且破坏了质粒的复制时，所述细胞会停止生长并在培养中稀释。由于质粒小，可将相当大的所需基因插入到质粒中的DNA克隆盒中，而不会急剧减少质粒的拷贝数。

本方法可用于将现有生产菌株和质粒改造成本文所述的形式。所述系统会通过它的总体稳定性来消除潜在的工业培养问题，并通过消除抗生素耐药性基因在细菌群体之间转移的风险和杜绝发酵中抗生素的应用来消除环境问题。

本发明提出了一种将在构建的早期步骤中应用的抗生素耐药性基因去除的策略。这是可以实现的，因为载体含有围绕着初始载体中抗生素耐药性基因的同向重复(Rek序列)。因而，根据本发明，除去必需的染色体基因，在载体中插入相应的必需基因，并除去抗生素耐药性基因的这个系统，除了培养中的总体质粒稳定性这一长处之外，还为消除抗生素耐药性基因在环境中散布的风险提供了一种基本的方法。

所有本文引用的出版物都被引入作为参考。现通过实施例来阐述本发明，而所述实施例不对发明范围构成限制。

附图说明

图1

构建质粒的策略大纲：

A)pRK-质粒

a)初始的载体质粒为pRK01。四环素抗性基因的150bp下游序列的副本(Rek序列，白色箭头)被插入此基因上游，生成抗性基因侧翼的一个同向重复。

b)两个Rek序列间的同源重组，产生两个小质粒。

c)含有四环素抗性基因(tet)和单拷贝Rek序列的复制缺陷型质粒(pRK03)，带有infA⁺、ori、和单拷贝Rek序列的第二个复制质粒(pRK02)。

B)pIF-质粒

a)初始的载体质粒为pIF01。此质粒携带插入tet基因两侧的单拷贝infA基因，从而生成位于该抗性基因侧翼的同向重复。

b)两个infA序列间的同源重组，产生两个小质粒。

c)含有四环素抗性基因(tet)和单拷贝infA基因序列的复制缺陷型质粒(pIF03)，带有ori和单拷贝infA基因的第二个复制质粒(pIF02)。

图2

证实infA基因染色体拷贝的缺失的DNA分析

A)在经溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上，infA⁺和ΔinfA菌株的PCR-扩增的染色体infA区域。第1和15道是λHindIII DNA标记。第2，7，10和14道是infA⁺DNA。第3-6，8，9，11-13道是ΔinfA DNA。

B)第2道infA⁺DNA(上面的序列)和第3道ΔinfA DNA(下面的序列)的PCR-带的序列分析。

图3

1％琼脂糖凝胶上的pRK-质粒的DNA分析：

第1组：线性化pRK质粒。第1道：λHindIII DNA标记。第2道：pRK01(质粒的重组前状态)。第3和4道：pRK02(重组后)。

第II组：用限制酶EagI消化的第I组质粒，在tet⁺基因中有一个单一的限制性位点。第6道：用EagI处理过的pRK01。第7和8道：用EagI处理过的pRK02。

图4

pRK质粒的序列分析。测序引物Psgsl靶序列用Rek序列上游的箭头来指示：

A)pRK01的序列分析，质粒的重组前状态。

B)pRK02的序列分析，重组后状态。

具体实施方案

材料和方法：

细菌菌株和质粒：

本文所用细菌菌株和质粒见表I。

用大肠杆菌菌株DH5α作为常规转化所有质粒构建体的受体。用重组常用的野生型大肠杆菌K12菌株MG1655构建PF1A(MG1655-D infA)。

培养基和生长条件：

液态和固态培养基是基于LB培养基(1％细菌用胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl)和M9培养基(Miller，1992)(补充了0.2％葡萄糖和1mg/l硫胺素)作为已知成分培养基。需要时向培养基中加入抗生素以达到下述终浓度：氨苄青霉素200mg/l，四环素20mg/l和氯霉素20mg/l。如前文所述制备选择性LB/蔗糖和Tc^s平板(Link等，1997，Bochner等，1980；Maloy和Nunn，1981)

DNA操作/纯化和转化：

限制酶和T4 DNA连接酶来自New England Biolab(New England，Beverly，MA.，USA)。根据常规方法(Sambroch等，1989)按厂家说明进行DNA操作。用QIAGEN(Valencia，CA，USA)的QIAEXII凝胶提取试剂盒进行PCR产物的凝胶纯化。用Amersham Pharmacia biotech(Buckinghamshire，England)的pK酶-混合物，通过切割非-模板核苷酸突出端，来生产带有平末端的PCR产物。用Saveen(Malmo，Sweden)的JETPREP质粒微型制备试剂盒进行所有质粒的提取。质粒转化按照CaCl₂方法来完成(Sambroch等，1989)。

PCR扩增：

用于PCR扩增的引物如表II所列。

本发明用了两种PCR方法：a)用Perkin-Elmer(Norwalk，CO.，USA)的TaqDNA聚合酶进行短模板PCR扩增。PCR混合物的制备如前文所述(Abdulkarim等，1994)。b)用Boeringer Mannheim(Mannheim，Germany)的Expand^TM Long Template PCR系统进行长模板PCR扩增。根据说明书生产PCR混合物。

质粒和PCR产物的分析：

在溴化乙锭-TBE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上分析质粒和PCR产物。

infA的染色体拷贝的去除：

去除大肠杆菌菌株MG1655中infA基因染色体拷贝的方法包括，使用质粒pK03(表I)进行基因替换的方法，以及前文所述方法(Link等，1997)。

去除质粒携带的四环素抗性基因：

将含有质粒pRK01的菌株PF1A过夜培养，然后取10^-1和10^-2稀释物100μl涂布在Tc^s选择性平板(Maloy和Nunn，1981；Bochner等，1980)上。将平板在37℃培养48小时。

DNA测序：

用DNA测序试剂盒(Perkin-Elmer Biosystems)通过自动测序法(CyberGene-Huddinge，Sweden)进行DNA测序。

质粒稳定性的确定：

用经过pRK-amp转化的菌株PF1A来进行测量质粒稳定性的试验。将单菌落接种不含抗生素的LB培养基，取2ml培养物在37℃过夜生长。将饱和培养物在不含抗生素的新鲜LB培养基中稀释到10^-6，然后每24小时用新鲜LB培养基进行类似稀释，以维持连续培养。以不同间隔将100μl的稀释培养物标本涂在LB平板上，并在37℃过夜培养。将菌落影印至含有200mg/l氨苄青霉素的LB平板上，以检查所述质粒的存在。从多个独立的菌落进行质粒的小量制备。

生长速度测量：

在补充了0.2％葡萄糖和1mg/l硫胺素的液态LB或M9培养基上测量生长速度。将100μl的新鲜过夜培养物接种到300ml烧瓶内的20ml相同培养基中。在37℃对培养物通气并伴以剧烈振荡，生长之后，测量培养物光密度的增加相对于时间的函数。

实施例1

构建质粒(pRK01)

构建pBR322-ΔAmp质粒：

第一步，我们希望构建pBR322的一个衍生质粒，它去除了bla基因，但具有相同的复制起点(colEl)，类似的拷贝数，并以tet作为单个抗生素耐药性基因。为去除编码氨苄青霉素耐药性的完整bla基因，我们用长模板PCR技术(见材料与方法部分)扩增质粒pBR322而不是bla基因。使用下游引物AMPus，以及与bla基因上游区域互补的引物Psgsl(表II)。所得线性3.3kb片段(剩余的pBR322)用pK酶处理，进行平-末端连接，转化到感受态DH5α中。将转化子涂布在含20mg/l四环素的LB上。为证实bla基因的缺失，在含200mg/l氨苄青霉素的LB平板上筛选四环素耐药性菌落的Amp^s表型，之后对质粒pBR322-ΔAmp进行限制酶分析(未显示)。

实施例2

Rek片段：

第二步，我们希望在四环素抗性基因的每侧插入同向重复序列(称为Rek片段)图1A。该序列应作为同源重组目标，用于随后启动质粒上的完整tet基因通过两个相同Rek-序列间的同源重组而缺失。对tet基因下游的150bp序列进行PCR扩增，得到Rek序列。然后将相同的Rek片段克隆到质粒pBR322-Δamp中tet基因上游的EcoRI位点。

实施例3

克隆infA基因：

然后我们希望将infA⁺结构基因克隆到质粒中。用引物PH1A3和PH1A2(表II)从染色体DNA经PCR扩增infA⁺结构基因，将其克隆到MCS的NcoI和SmaI位点中，使它受质粒pTrc99A中诱导型pTrc启动子的控制(表I)。所得pTrc99A-infA⁺质粒然后用SphI限制酶消化。得到的包括lacI，pTrc启动子和infA⁺的SphI片段用pK酶处理，产生平-末端。将lacl⁺，infA⁺盒通过平-末端连接而亚克隆到质粒中(见图1A的策略大纲)。

实施例4

克隆MCS：

合成两个含有大肠杆菌rrnB启动子和数个限制性位点的互补的脱氧寡核苷酸(77个核苷酸长)。然后将这两个寡聚体在室温退火并克隆到所述质粒(图1A)的NdeI位点。

实施例5

构建菌株：

通过结合PCR技术和基因替换方法用两步法构建所述PF1A大肠杆菌菌株。为构建infA缺失型菌株，对包含infA⁺结构基因以及420bp上游区域和400bp下游区域的1120bp片段进行PCR扩增，将其克隆到pMOSBlue克隆载体中。然后以所得pMOSBlue-infA质粒为模板，用两种引物Deli1和Deli2进行第二轮PCR扩增(表II)。这些引物与围绕infA结构基因的区域互补，通过长模板PCR方法扩增该质粒的剩余部分，包括infA的上游和下游区域但不包括infA结构基因自身。将所得PCR片段连接，得到pMOSBlue-ΔinfA，将其转化到DH5α感受态细胞中。在制备质粒并用Sal I和BamH I消化后，将ΔinfA片段亚克隆到pK03中，产生pK03-ΔinfA(表I)。

第二步旨在缺失染色体infA基因。为此用到了基因替换方法。为了进行基因替换，含有质粒pRK01的菌株MG1655用质粒pK03-ΔinfA转化，在30℃涂布到含有四环素和氯霉素的LB平板上(见下面的实施例7)。在这个双重选择中，四环素选择pRK01而氯霉素选择pK03-ΔinfA。对基因替换事件的选择如前人所述(Link等，1997)。相应地；用30℃保温的LB-平板上的一个单菌落接种1ml含有四环素和氯霉素的LB。该培养物在30℃通气剧烈振摇1-2小时。取0.1ml样品涂布在含有四环素和氯霉素的LB平板上，进行双重选择。在43℃过夜培养这些平板。从这些平板中挑取1-5个菌落到1ml LB肉汤中并作系列稀释。每一稀释物取0.1ml样品涂布在含有5％(wt/vol.)蔗糖的LB平板上，在30℃过夜培养。将单菌落在LB/蔗糖平板上重新划线，然后通过筛选氯霉素敏感表型来筛选从染色体删除pK03者。

实施例6

确认染色体infA的缺失：

含有携带infA⁺结构基因的质粒pRK01并有ΔinfA染色体缺失的细菌(PF1A)，在缺乏四环素选择时的质粒维持方面应该是表观稳定的。同样的质粒在有infA⁺遗传背景的菌株中丢失的可能性应该很大。在LB/蔗糖平板上选择pK03(基因替换质粒)已从PF1A染色体删除(Link等，1997)的菌株之后，将氯霉素敏感菌落在不含四环素的LB平板上划线，之后在非选择性平板上再划线3-4次。在第3或第4轮划线后的单菌落中筛选质粒-携带的四环素耐药性表型。所有菌落均维持它们的Tet^r表型。最后，Tet^r菌落和亲代菌株(MG1655)的染色体infA区域用引物PTV5′和PH1A2进行PCR扩增。图2A的数据显示，数个Tet^r菌落的PCR带比亲代菌株的PCR带小约300bp。此差异与infA结构基因的大小十分吻合。并且，这两条带的DNA测序也证实了预计的缺失位点和缺失大小(图2B)。

实施例7

从所述质粒缺失四环素基因：

质粒携带的tet基因的缺失在含2mg/ml镰刀菌酸的选择性平板上进行(见材料与方法部分)。下一步我们希望确认质粒上tet基因的缺失是在生长中通过两条同向重复Rek序列的体内同源重组造成的。图3所示的数据表明来自Tet^s细胞的pRK02质粒(质粒的重组后状态：第3和第4道)比来自Tet^r细胞的pRK01质粒(第2道)(重组前)小大约1000个bp。并且，重组后状态(pRK02)中泳带的DNA序列显示，该质粒只含有一个Rek序列。此序列绕过(bypass)四环素基因并延续到质粒pRK02的lacI序列(图4B)。与此相比，重组前pRK01中的该序列贯穿tet基因，并且tet仍由两条Rek序列围绕(图4A)。

实施例8

稳定性检验和生长速度：

为测试质粒的稳定性，用来自pBR322的氨苄青霉素耐药性(bla)基因作为所需插入基因的模型。将它克隆到pRK02的多克隆位点(MCS)中，得到pRK-amp，将其转化到PF1A和它的亲代菌株MG1655中。在缺乏氨苄青霉素的条件中生长数代之后，将LB平板影印到氨苄青霉素平板，以便确定质粒的维持。如果所述质粒在PF1A菌株中是稳定的，菌落应保持氨苄青霉素耐药性。PF1A中的pRK-amp质粒在液态培养基中生长120代后，其在缺乏抗生素时稳定性是100％。与此相比，用pRK-amp转化的亲代MG1655细菌90％以上在50代后丢失了该质粒。该菌株是否生长在基本培养基或肉汤培养基中对获得此种稳定性是无关碍的。进一步，在两种培养基中带有稳定质粒的菌株的倍增时间与亲代菌株MG1655无差别(表III)，并且在两种培养基中这两种菌株在稳定期的细胞密度是相同的。

参考文献：

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表I.质粒和细菌菌株

质粒	基因型	参照及来源
质粒	基因型	参照及来源	pBR322pBR-ΔAmpPMOSBluePMOSBlue-infAPMOSBlue-ΔinfApK03pK03-ΔinfApTrc99ApTrc99A-infApRK01pRK02pRK-AmppIF01pIF02pIF-Amp	bla⁺，tet⁺tet⁺bla⁺，lacZ，fl起始区bla⁺，lacZ，fl起始区，inf4(带有infA结构基因的420个bp的上游序列和400个bp的下游序列)PMOSBlue-infA(-ΔinfA结构基因)cat，M13 ori，sacB，repA(ts)cat，M13 ori，sacB，repA(ts)ΔinfAbla⁺，laclq，pTrc启动子bla⁺，laclq，pTrc-infA⁺(结构基因)tet⁺，复制的Rek序列，infA⁺，laclq，MCS，rop，pBR ori.infA⁺，laclq，MCS，rop，Rek序列，pBR ori.pRK02，bla⁺(克隆进入MCS的结构基因)tet⁺，复制的infA基因，MCS，rop，pBR ori.infA⁺，MCS，rop，pBR ori.pIF02，bla⁺(克隆进入MCS的结构基因)	Amersham Pharmacia Biotech本发明Amarsham Pharmacia Biotech，本发明本发明Link等，1997本发明Amarsham Pharmacia Biotech本发明本发明本发明本发明本发明本发明本发明
细菌菌株DH5αMG1655PF1A	SupE44Δlacu169(φ80λαχZΔM15)hsdR recA1endA1 gyr A96 thi-1 relA1野生型菌株MG1655-ΔinfA	野生型菌株本发明

表II.引物及它们的相关序列

引物	序列	注释
引物	序列	注释	AmpusPsgs1Rek1Rek3PHIA3PHIA2PTV5′Deli1Deli2	CTGTCGGGCCCAGTTTACTCATATATACGTATCACGGGGCCCTTTCGTCTTCAAGATGAATG GAATTCGGCGGCACCAGGACC GAATTCTGCCCGACCAGAGGATT CCATGGCCAAAGAACATGTTCACTGCCGTACAGACAGAAACGGGATCCGCGCTTCTGGTATTCTGTTTTGGCCATCTAATCCTCTGGGGTGTCGCTGATTGTTTTACCGCCTGA	与bla⁺的下游区域互补与bla⁺的上游区域互补与Rek的上游序列互补下划线为EcoRI位点Rek序列的下游引物下划线为EcoRI位点infA结构基因的5′-端引物，下划线为NcoI位点infA结构基因的3′-端引物infA起始密码子的上游420个bp处的5′-端引物与infA的5′-端互补的缺失引物与infA的3′-端互补的缺失引物

表III

PF1A/pRK02和野生型MG1655/pRK02在富集肉汤培养基和已知成分M9

培养基中的倍增时间

菌株	LB倍增时间(分钟)	M9倍增时间(分钟)
菌株	LB倍增时间(分钟)	M9倍增时间(分钟)	PF1A/pRK02	31	82
MG1655/pRK02	32	82	PF1A/pRK02	31	82

序列表

<110>利夫.艾萨克森(Isaksson，Leif)

彼得.J.黑格(Hgg，Peter Jrgen)

法黑德.M.阿布达尔卡里姆(Abdulkarim，Farhad)

<120>新方法

<130>62870

<140>

<141>

<160>9

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：与PBR322中的bla+的下游区域互补

<400>1

ctgtcgggcc cagtttactc atatatac 28

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：与PBR322中的bla+的上游区域互补

<400>2

gtatcacggg gccctttcgt cttcaaga 28

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：与PBR322中具有EcoRIi位点的Rek序列上游互补

<400>3

tgaatggaat tcggcggcac 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：PBR322中具有EcoRIi位点的Rek序列的下游引物

<400>4

caggaccgaa ttctgcccga 20

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：E.coli MG1655的infA结构基因的5’-端引物

<400>5

ccagaggatt ccatggccaa agaa 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：E.coli MG1655的infA结构基因的5’-端引物

<400>6

catgttcact gccgtacaga caga 24

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：E.coli MG1655的infA起始密码子的上游420个bp处的

5’-端引物

<400>7

aacgggatcc gcgcttctgg tattctgt 28

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：与E.coli MG1655的infA的5’-端互补的缺失引物

<400>8

tttggccatc taatcctctg gggt 24

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：与E.coli MG1655的infA的3’-端互补的缺失引物

<400>9

gtcgctgatt gttttaccgc ctga 24

Claims

1.用于去除抗生素耐药性和/或使质粒稳定的方法，包括如下步骤：

a)构建含有为同向重复序列所包围的抗生素耐药性基因的载体，其中所述同向重复序列可以是没有互养效应的必需基因，

b)当所述重复序列并非所述必需基因时，另外向载体中插入所述必需基因和适宜此必需基因的启动子，

c)用a)或b)所得载体转染宿主细胞，

d)去除宿主细胞中的没有互养效应的染色体必需基因，

e)体内去除抗生素耐药性基因，

其中，步骤a)和b)可以用相反的顺序完成。

2.根据权利要求1的方法，包括如下步骤：

a)构建含有为同向重复序列所包围的抗生素耐药性基因的载体，

b)在该载体中插入没有互养效应的必需基因，适宜于该没有互养效应的必需基因的启动子及一个多克隆位点，

c)用b)所得载体转染宿主细胞，

d)去除宿主细胞中的没有互养效应的染色体必需基因，

e)体内去除抗生素耐药性基因，

其中，步骤a)和b)可以用相反的顺序完成。

3.根据权利要求1的方法，包含如下步骤：

a)构建含有为同向重复序列基因所包围的没有互养效应的抗生素耐药性基因的载体，所述同向重复序列由没有互养效应的必需基因组成，所述载体还包含至少一种适宜于该没有互养效应的必需基因的启动子和一个多克隆位点，

b)用a)所得载体转染宿主细胞，

c)去除宿主细胞中的染色体必需基因，

d)体内去除抗生素耐药性基因，

其中，步骤a)和b)可以用相反的顺序完成。

4.根据权利要求1-3任一的方法，其中所述没有互养效应的必需基因是infA。

5.根据权利要求1-4任一的方法，其中所述抗生素耐药性基因通过体内同源重组而去除。

6.根据权利要求1-5任一的方法，还包括插入多克隆位点的步骤，所述多克隆位点适于引入或包含一或多个启动子以及需要产生或表达的DNA序列。

7.根据权利要求1-6任一的方法，其特征还在于，在所述方法中体内去除抗生素耐药性基因之前的任何一步中，插入一或多个需要复制或表达的目的基因。

8.根据权利要求1-7任一的方法，还包括对去除了抗生素耐药性载体基因的宿主细胞进行选择的步骤。

9.在宿主细胞中维持载体的方法，包括在足够允许权利要求1-8任一的转化宿主细胞生长的条件下和时间内培养所述细胞。

10.产生DNA的方法，包括在足够允许权利要求1-8任一的转化宿主细胞生长的条件下和时间内培养所述细胞，并从所述培养细胞分离质粒DNA。

11.生产一或多种氨基酸，肽或蛋白的方法，包括在足够允许权利要求1-8任一的转化宿主细胞生长的条件下和时间内培养所述细胞，并从所述培养细胞分离氨基酸，肽或蛋白。

12.经转化的宿主细胞，

其特征在于缺失了一种不具有互养效应的细胞内染色体必需基因；

其特征还在于，它包含含有相同必需基因的至少一个拷贝的载体，

还可以含有所需基因X；

其特征还在于它不含有任何抗生素耐药性基因。

13.权利要求12的经转化的宿主细胞，其中所述不具有互养效应的细胞内染色体必需基因是infA。

14.根据权利要求12或13的经转化的宿主，其特征在于它是带有质粒或病毒的任何细菌细胞，所述质粒或病毒能感染动物细胞如哺乳动物细胞和昆虫细胞，植物细胞，真菌如酵母病毒，和细菌，例如土壤杆菌，大肠杆菌如大肠杆菌菌株DH5α，MG1655和PF1A。

15.载体DNA在制备用于基因治疗的药物组合物如疫苗中的用途，所述载体DNA得自权利要求1-9任一项，或权利要求11-14任一项生产的宿主细胞。