CN105849267A - 在宿主微生物中产生目的蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

在宿主微生物中产生目的蛋白质的方法，所述方法包括步骤：a)构建包含用于目的蛋白质的基因和功能性frr基因且无抗生素抗性基因的载体，b)用a)中获得的载体转化具有失活的染色体frr基因的宿主生物，c)在允许目的基因于宿主生物中表达的条件下培养b)中获得的经转化的宿主生物，和d)分离目的蛋白质。

Description

在宿主微生物中产生目的蛋白质的方法
本发明涉及在宿主微生物中重组产生目的蛋白质的新方法，所述新方法无需用于载体DNA存在和维持的抗生素选择压力。它也包括经转化的宿主细胞，其中已失活了染色体frr基因并且其包含含有功能性frr基因的载体。
现有技术
载体、特别地高拷贝数载体的稳定维持对于DNA的制备和自其表达的蛋白质的制备是重要的。包含克隆的基因并已经导入宿主如细菌中的克隆载体如质粒在细菌的培养期间易于丢失。这是因为在细胞分裂时载体不受控制地分配到子细胞。另外，对于细菌宿主而言，载体是代谢负担。与负荷有质粒的细菌比较，丢失了质粒的细菌通常生长得更好并表现在数量上有更多细菌。
无质粒分离体的积聚代表了用于克隆和表达目的的基础复制子质粒的问题，因为它们不携带任何用于有序分配至宿主子细胞的基因系统。这代表了在大规模培养期间于宿主细菌中维持表达质粒的主要工业问题。已经尝试了许多方法，以克服克隆质粒的分离不稳定性。
使用将某种抗生素抗性基因插入载体并添加相应的抗生素至生长培养基代表了用于质粒维持的最常见的选择压力。除了抗生素的经济上花费之外，在工农业废弃物中来自抗生素本身和抗性基因的潜在环境公害是明显的。没有完全地阻止无质粒分离体的出现，因为用于质粒选择的抗生素浓度在长期培养期间作为稀释和/或酶促降解的结果往往降低了。
US 2004/0234984涉及用于在宿主细胞中缺失抗生素抗性和/或创建载体稳定的方法。根据本发明，产生了新颖的载体，它对携带这种载体的宿主细胞给出总选择。这种特性通过缺失必需基因的染色体拷贝并用质粒中的代替它来获得。作为仅携带质粒的细胞能够生长的结果，使得宿主完全依赖于质粒。优选地使用小基因如基因infA。基因infA编码翻译起始因子1(IF1)，其是小的胞内因子且对于细胞存活是必需因子。所述质粒不包含任何抗生素基因并且抗生素选择因此不是必需的，这提供了在培养期间相当大的好处并消除了显著的环境担忧。对于待安置于温室和自然环境中的转基因植物而言，如果考虑到无需淘汰宿主，所述方法通过植物细菌中的载体来稳定化是尤其有利的。
Janosi等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.91,pp4249-4253,1994年5月)描述了核糖体释放因子－大肠杆菌中frr基因的产物–对于细菌生长是必需的。
Weixlbaumer等人(Nature Structural and Molecular Biology,第14卷,第8期,第733-737页,2007年8月)描述了结合至核糖体的核糖体再循环因子的晶体结构。
本发明的一个任务是提供用于在宿主微生物中重组产生目的蛋白质的方法，无需用于载体DNA存在和维持的抗生素选择压力。本发明的又一个任务是将宿主生物的生长与宿主生物中载体的存在以非常灵敏的方式关联，目的在于立即停止那些丢失了其载体的宿主生物生长。
发明描述
本发明的一个实施方案是用于在宿主微生物中产生目的蛋白质的方法，所述方法包括步骤：
a)构建包含用于目的蛋白质的基因和功能性frr基因且无抗生素抗性基因的载体，
b)用a)中获得的载体转化具有失活的染色体frr基因的宿主生物，
c)在允许目的基因于宿主生物中表达的条件下培养b)中获得的经转化的宿主生物，和
d)分离目的蛋白质。
本发明涉及在微生物中重组产生蛋白质。
对于本公开的发明，目的蛋白质(PoI)是10至约1000个，例如20至700个和特别地50至500个氨基酸通过肽键连接的氨基酸链。肽可以包含任何α-氨基酸，特别地蛋白原性氨基酸。
这些PoI可以是酶或非酶蛋白质。酶的实例是脂肪酶、脱氢酶、氧化酶、蛋白酶。非酶蛋白质的实例是具有抗微生物活性、特异结合某些表面、在结晶过程和粒子形成中的成核特性、晶体结构的控制、结合金属或金属离子、表面活性剂特性、乳化特性、稳定泡沫特性、影响细胞吸附的那些蛋白质。
目的蛋白质的基因(PoI基因)是编码PoI的多核苷酸序列。该多核苷酸序列可以通过已知的技术分离自基因组或通过DNA合成法合成。术语PoI基因广义地理解为除了编码PoI的部分之外还包括调节部分如启动子，其与PoI在它的原始遗传背景的表达相关。
适用于本发明的微生物宿主系统原则上是能够使本发明的核酸表达的任何生物。宿主生物是指例如细菌。
原核表达生物的非限制性例子是大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)等。
本发明涉及表达构建体，其包含在调节核酸序列遗传控制下的编码目的蛋白质的核酸序列，并涉及包含至少一个所述表达构建体的载体。本发明的此类构建体优选地包含特定编码序列5'上游的启动子和3'下游的终止子序列，以及任选地其他常见调节元件，其在每种情况下均与编码序列有效连接。
"有效连接"是指启动子、编码序列、终止子和任选地其他调节元件以每一所述调节元件在编码序列表达期间能够实施其目的功能的方式有序排列。可有效连接的序列的实例是靶向序列和增强子、多腺苷酸化信号等。其他调节元件包含选择标记、扩增信号、复制起点等。例如Goeddel,Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California(1990)中描述了合适的调节序列。
除了人工调节序列之外，天然调节序列仍可存在于实际结构基因的上游。该天然调节可以任选地通过遗传修饰关闭，由此增加或降低基因表达。但是，基因构建体也可以具有更简单的结构，即，结构基因上游没有插入额外的调节信号，且没有去除天然启动子及其调节。取而代之的是，突变天然调节序列使得不再发生调节，且增加或减少基因表达。基因构建体可以包含核酸序列的一个或多个拷贝。
可使用的启动子的例子是：cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子,它们有利地用在革兰氏阴性细菌中；以及革兰氏阳性启动子amy和SPO.sub.2。给出的特别优选是使用可诱导的启动子，例如，光可诱导的和特别地是温度可诱导的启动子，如P.sub.rP.sub.l启动子。原则上，可以使用任一天然启动子和它们的调节序列。此外，也可以有利地使用合成启动子。
所述调节序列旨在使得核酸序列和蛋白质以特定方式表达。取决于宿主生物，例如这可以意味着基因仅在诱导后表达或过量表达，或意味着基因立即表达和/或过量表达。
本文中给出的优选是能够积极地影响并由此增加或减少表达的调节序列或因子。因此，通过使用强的转录信号如启动子和/或"增强子"可能在转录水平有利地增强调节元件。此外，但是，也可能例如通过提高mRNA的稳定性来增强翻译。
通过融合合适的启动子至合适的编码核苷酸序列和终止或多腺苷酸化信号制备表达盒。为此目的，使用熟悉的重组和克隆技术，如使用例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)，以及T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)，以及Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience(1987)所述的重组和克隆技术。
为了在合适的宿主生物中表达重组核酸构建体或基因构建体，有利地将其插入宿主特异的载体，这使得基因在宿主中最佳地表达。载体为本领域技术人员熟知，并且可以在例如"Cloning Vectors"(Pouwels P.H.等人编辑,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中找到。将载体理解为除了质粒外，还包括本领域技术人员已知的任何其他载体，如噬菌体、转座子、IS元件、粘粒、和线性或环状DNA。
可以提及的合适的表达载体的实例是：常规的融合表达载体如pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene67:31-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和pRIT 5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，其中谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白和蛋白A分别融合至重组靶蛋白。
非融合蛋白表达载体是如pTrc(Amann等人，(1988)Gene 69:301-315)和pET 11d(Studier等人，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)60-89)。
核糖体再循环因子(frr)是在细菌细胞以及真核细胞器，特别地线粒体和叶绿体中发现的蛋白质。它发挥完成蛋白质合成后再循环利用核糖体的功能。最近的证据提议frr可能通过分裂核糖体为亚基，由此释放结合的mRNA来实现核糖体的再循环。在细菌(特别地大肠杆菌)中，丧失编码核糖体再循环因子的基因frr是有害的。
功能性frr基因是指能够在生物中互补失活或缺失的frr基因的功能的基因。它可以是宿主微生物的同源frr基因或是异源的frr基因或突变的frr基因。
失活的或被失活的基因尤其是被失活的frr基因是指不以功能性基因产物表达、尤其是不以核糖体再循环因子表达的基因，尤其是frr基因。能够以不同方式实现frr基因的失活，即，完全地或部分地缺失染色体中的frr基因或通过将额外的核苷酸或多核苷酸插入frr基因，以破坏该基因的可读框。失活基因的另一个可能性是导入终止密码子至可读框或缺失基因的控制元件如启动子区。本领域存在熟知的通过敲除或插入诱变来失活基因的方法。
大肠杆菌的frr基因编码185aa蛋白质。多肽序列可在NCBI(蛋白质)GI:16128165中找到。
具有功能性frr基因的用于转化宿主微生物的载体不具有抗生素抗性基因，因为无需抗生素抗性来选择携带该载体的宿主生物。
转化意指导入DNA如载体或辅助质粒至宿主微生物。能够通过已知的技术如磷酸钙沉淀或电穿孔来实现转化。
在微生物大肠杆菌中的重组工程能够如Zhang等人(Nature Genetics,20,123-128,1998)所述实施。
可以根据已知的方法培养和发酵重组微生物。例如，可将细菌在TB或LB培养基在20至40℃和pH 6至9繁殖。合适的培养条件在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中有详细描述。
如果目的蛋白质(PoI)不分泌入培养基，随后将细胞破环并从裂解物中通过已知的蛋白质分离方法回收产物。可以任选地通过高频率超声波、通过高压例如在法式压力小室中高压、通过渗透裂解(osmolysis)、通过去污剂、裂解酶或有机溶剂的作用、通过匀浆器或通过组合多种所列的方法破坏细胞。
可以使用已知的色谱法如分子筛色谱(凝胶过滤)如Q-琼脂糖凝胶色谱、离子交换色谱和疏水色谱和通过其他常规方法如超滤、结晶、盐析、透析和天然凝胶电泳纯化PoI。例如在Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden[原来的标题:The Tools of Biochemistry]，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，NewYork或在Scopes，R.，Protein Purification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin中描述了合适的方法。
此外，例如可以使用载体系统或寡核苷酸分离重组的PoI，其中所述寡核苷酸通过特定的核苷酸序列延伸cDNA并因此编码用于更简单纯化的经修饰的多肽或融合蛋白质。合适的此类修饰的实例是作为锚的"标签(tags)"，例如已知为6个组氨酸锚的修饰或能够被抗体识别为抗原的表位(例如在Harlow，E.和Lane，D.，1988，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)中描述。这些锚可以例如用于将蛋白质固定至固相支持物，例如，可被导入例如层析柱或可被用在微量滴定板或另一支撑物上的聚合物基质。
同时，这些锚也可以用于识别蛋白质。蛋白质还可通过使用常规的标志物如荧光染料、在底物反应后形成可检测反应产物的酶标志物、或放射性标志物来识别，所述常规的标志物单独使用或与所述锚组合使用，以衍生蛋白质。
本发明的另一实施方案是用于在宿主微生物中产生目的蛋白质的方法，所述方法包括步骤：
a)构建包含用于目的蛋白质的基因和功能性frr基因且无抗生素抗性基因的载体，
b)用a)中获得的载体转化具有失活的染色体frr基因且携带包含功能性frr基因和标志基因的辅助质粒的宿主生物，
c)用a)中获得的载体转化后，选择缺乏辅助质粒的宿主生物，
d)在允许目的基因于宿主生物中表达的条件下培养c)中获得的经转化的宿主生物，和
e)任选地分离目的蛋白质。
该实施方案的优点是具有失活的染色体frr基因的宿主生物是存活的，因为辅助质粒的互补作用。
当使用携带目的基因和功能性frr基因的新载体转化该宿主时，宿主在转化后即刻携带两种不同的载体：(i)辅助质粒和(ii)携带目的基因的载体，这两种载体能够互补失活的染色体frr基因。由于辅助质粒除了携带功能性frr基因之外还携带标志基因，这允许筛选标志物的缺乏或者存在，对该标志物或针对该标志物进行选择或反选择是可能的。因此，选择仅携带载体a)和不再有辅助质粒的经转化宿主生物是可能的。
本发明的另一实施方案是经转化的微生物宿主细胞，特征在于其染色体frr基因是失活的，且在于它包含含有至少一个功能性frr基因拷贝和目的基因的载体，和在于它不包含任何用于抗生素抗性的基因。
权利要求书中描述了本发明的其他实施方案。

Claims (6)

1.在宿主微生物中产生目的蛋白质的方法，所述方法包括步骤：
a)构建包含用于目的蛋白质的基因和功能性frr基因且无抗生素抗性基因的载体，
b)用a)中获得的载体转化具有失活的染色体frr基因的宿主生物，
c)在允许目的基因于宿主生物中表达的条件下培养b)中获得的经转化的宿主生物，和
d)分离目的蛋白质。
2.根据权利要求1的方法，其中具有失活的染色体frr基因的宿主生物携带包含功能性frr基因和标志基因的辅助质粒，和在用a)中获得的载体转化后，选择缺乏辅助质粒的宿主生物。
3.根据权利要求1的方法，其中载体上的frr基因与宿主生物是同源的。
4.根据权利要求1的方法，其中宿主生物是大肠杆菌。
5.根据权利要求1的方法，其中宿主生物中失活的染色体frr基因是通过基因缺失实现的。
6.经转化的微生物宿主细胞，特征在于其染色体frr基因是失活的，且在于它包含含有至少一个功能性frr基因拷贝和目的基因的载体，和在于它不包含任何用于抗生素抗性的基因。
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