KR101325411B1 - 두날리엘라 살리나 유래의 신규한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해양 미세조류 유래의 신규한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소에 관한 것으로서, 두날리엘라 살리나로부터 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 포스포에놀피루브산 카르복실화효소는 기존의 상기 효소와는 구별되는 신규한 단백질로서 우수한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 활성을 가지므로, 상기 효소는 유기산인 옥살로아세트산 또는 말산의 생산량을 높일 수 있고 이의 대량 생산이 가능한 형질전환체를 개발할 수 있으며 이산화탄소 저감 기술에도 응용 가능하여, 상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소, 바이오매스 및 이차대사산물의 생산성 극대화에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

두날리엘라 살리나 유래의 신규한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2{Novel phosphoenolpyruvate carboxylase 2 from Dunaliella salina}

본 발명은 신규한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 두날리엘라 살리나 유래의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2에 관한 것이다.

해양 미세조류는 해양 표면뿐만 아니라 심해에 이르기까지 무기 탄소의 유기화합물로의 고정 역할을 하는 매우 중요한 기능을 수행하고 있다. 해양 미생조류는 대기 중의 이산화탄소를 바이카보네이트(bicarbonate)로 전환할 수 있는 카보닉안하이드레이즈(carbonic anhydrase, CA)를 생체촉매로 이용하고, 이렇게 생성된 바이카보네이트는 식물보다 광합성과 이산화탄소 고정 효율이 훨씬 높은 포스포에놀피루브산 카르복실화효소(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)의 작용에 의해 유기산을 생성하게 된다. 즉, 상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소는 이산화탄소 용해시 발생되는 바이카보네이트를 사용하여 옥살로아세트산을 만드는 효소인 것이다. 상기 효소의 반응을 통해 흡수된 이산화탄소이 간접적으로 유기산으로 고정되는데, 상기 효소는 해양 미세조류뿐만 아니라 동물과 진균(fungi)류를 제외한 식물과 미생물에 널리 존재하고 있다.

포스포에놀피루브산 카르복실화효소는 탄소 고정 생물 반응의 중요한 열쇠로서 탄소 고정 효율을 높이려는 연구 목표와 잘 부합된다. 그동안 고등식물의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소의 유전자에 대한 연구는 많이 이루어져 있지만, 미세 조류에서는 몇 가지 대표 종에서만 연구가 이루어지고 있는 실정이다. 미세 조류 중에서는 담수 미세 조류인 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)에서 분리된 포스포에놀피루브산 카르복실화효소(CrPPC1 및 CrPPC2)의 유전자 특성이 보고된 바 있고(Mamedov et al., Plant J. 42(6), 832-843, 2005), 해양 미세 규조류인 타라시오시라 웨이스플로기(Thalassiosira weissflogii)에서 포스포에놀피루브산 카르복실화효소가 탄소 고정에 있어 상당히 의존적이라는 보고가 있을 뿐(Reinfelder et al., Plant Physiol. 135(4), 2106-11, 2004), 해양 미세 조류에 포스포에놀피루브산 카르복실화효소에 대해서는 유전학적 정보가 전혀 알려진 바 없다.

최근에 지구 온난화의 주요 요인인 이산화탄소를 효율적인 저감하고 부족한 식량 자원을 해결하기 위하여 이산화탄소의 효율적인 저감 방안과 식물 등에서 광합성 효율을 증진시키기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 대기 중의 이산화탄소로부터 생성된 바이카보네이트를 고정할 수 있는 기능이 있는 포스포에놀피루브산 카르복실화효소를 이용해 유기산(숙신산 등)을 생산하기 위하여 바이오매스 생산 증식을 위한 연구 및 대기 이산화탄소 저감을 위한 연구를 수행하고 있다. 따라서, 해양 미세조류에서 확보한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소를 이용하여 경제적인 이산화탄소 저감 시스템을 구축하고, 이산화탄소 저감에 사용된 미세조류의 바이오 디젤화로 대체 에너지를 개발할 수 있으며, 고농도 생물배양 시스템 구축으로 바이오매스 및 이차대사산물의 생산 극대화를 기대할 수 있다.

한편, 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)는 단세포 광합성 해양 미세조류로서 가느다랗고 둥근 모양을 하고 있다. 상기 두날리엘라 살리나는 배양이 용이하고 다양한 염 농도에서도 뛰어난 적응력을 나타내어 많은 연구가 진행되고 있는 해양 미세조류이다. 상기와 같은 이용 용이성에도 불구하고, 상기 두날리엘라 살리나 유래의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소에 대해서는 아직 그 유전학적 정보가 전혀 알려진 바 없다. 따라서, 해양 미세조류 종에서 이용가능성이 큰 두날리엘라 살리나 종으로부터 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 활성을 가지는 단백질을 확인하거나 상기 효소의 활성 개량이나 대량 생산 기술을 연구하는데 있어서, 상기 두날리엘라 살리나 유래의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소의 유전학적 정보가 확보될 필요가 있다.

본 발명의 목적은 해양 미세조류인 두날리엘라 살리나 유래의 신규한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소, 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다른 측면은 상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 코딩하는 유전자를 제공한다.

아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 또 다른 측면은 상기 유전자가 포함된 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 두날리엘라 살리나 유래의 신규한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2(DsPEPCase 2)는 대장균으로부터 얻을 수 있는 특정 유기산인 옥살로아세트산 또는 말산의 생산량을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 두날리엘라 살리나 유래 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2(DsPEPCase 2)의 대량 발현이 가능한 해양 미세조류 형질전환체 개발이 가능하며, 이산화탄소 저감 기술에도 응용 가능하므로, 상기 효소의 산업적 생산과 유기산 물질 생산에 효과적이다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 DsPEPCase2_5'쪽 절편(레인 2; 2.7 kb), 및 DsPEPCase2_3'쪽 절편(레인 3; 1.5kb)을 전기영동을 통해 확인한 도면이다.
도 2는 전장의 DsPEPCase 2가 삽입된 pTOP 벡터의 제조 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 제한효소 BamHⅠ가 처리된 선형의 pTOP-DsPEPCase2-5 DNA 절편(레인 2), 및 pTOP-DsPEPCase2-3 플라스미드에 BamHⅠ를 처리하여 분리한 DsPEPCase2-3 절편(레인 3)을 전기영동하여 확인한 도면이다.
도 4는 전장의 DsPEPCase 2가 삽입된 pTOP 벡터에 제한효소 PstⅠ을 처리하여 절단시킨 후 전기영동을 통해 확인한 도면이다.
도 5는 DsPEPCase 2의 유전자 구조를 나타낸 도면이다.
도 6은 DsPEPCase 2와 다른 생물체 유래의 PEPCase들의 상동성 및 유사도를 나타낸 도면이다.
도 7은 단백질 발현 벡터인 pColdI의 벡터맵 및 삽입된 전장 DsPEPCase 2의 위치를 나타내는 도면이다.
도 8은 DsPEPCase 2의 효소 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.

본 발명에서 일컫는 '포스포에놀피루브산 카르복실화효소'는 포스포에놀피루브산을 카르복실화시키는 효소를 의미하며, 'PEPCase'와 상호 혼용가능한 용어이고, 기원에 상관없이 모든 생물체에서 유래된 포스포에놀피루브산 카르복실화효소를 의미하며, 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 1과 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 모두 포함한다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2'는 'PEPCase 2'와 상호 혼용가능한 용어이고, 기원에 상관없이 모든 생물체에서 유래된 포스포에놀피루브산 카르복실화효소를 의미이다.

또한, 본 발명에서 일컫는 'DsPEPCase'는 특별히 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)로부터 유래한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소를 의미한다.

아울러, 본 발명에서 일컫는 'DsPEPCase 2'는 특별히 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)로부터 유래한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2 및 그 유전자

본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 암호화하는 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 유전자를 제공한다.

본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2는 해양 미세조류로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)로부터 유래한 것이 바람직하다.

본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 상기 효소는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 한 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체, 또는 단편일 수 있다. 상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 80% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 유전자는 서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 서열번호 2의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2는 바람직하게는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 암호화할 수 있는 한, 서열번호 2의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 코딩될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명자들은 해양 미세조류에서 유래한 신규한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 유전학적 정보를 규명하기 위하여, 해양 미세 녹조류인 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)로부터 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 암호화하는 유전자를 분리하여 클로닝하였다(도 1 내지 4 참조). 상기와 같이 분리된 효소의 염기서열과, 이에 의하여 코딩되는 아미노산의 서열을 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지고, 서열번호 2로 기재되는 염기 서열에 의하여 코딩되며, 도 5와 같은 유전자 구조를 가짐을 확인하였다. 또한, 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 아미노산 서열과 기존에 알려진 다른 생물체 유래의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소의 상동성을 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 서열번호 1로 이루어진 단백질은 동일한 두날리엘라 살리나 유래의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 1 및 다른 생물체 유래의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소들과 60% 이하의 낮은 상동성을 나타냄을 확인하였다(도 6 참조). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2는 신규한 서열의 효소임을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 신규한 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2로서 유용하게 이용될 수 있다.

2. 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 발현벡터 및 형질전환체

본 발명의 또 다른 측면은 상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 유전자가 포함된 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 유전자를 포함한다.

상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 발현벡터는 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 생산하고자하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.

상기 발현벡터는 벡터가 도입된 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 발현 단백질인 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2가 숙주세포에서 발현되면 그 활성을 나타내게 되므로, 숙주세포의 배양 배지에 바이카보네이트와 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP) 등의 상기 효소의 기질을 첨가함으로써, 별도의 선택마커 없이도 형질전환된 숙주세포의 선별이 가능하도록 할 수 있다.

또한, 상기 재조합 발현벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.

상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 암호화하는 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소 분비 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2가 생산될 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2 유전자를 pTOP 플라스미드에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다(도 2 참조). 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pTOP 이외에도 다양한 원핵세포용(pET 등) 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 발현벡터는 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 형질전환체에는 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터가 도입된다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주세포로 하여 본 발명의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였다.

상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2는 효소 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 대량생산을 용이하게 할 수 있다.

3. 포스포에놀피루브산 카르복실화효소의 생산 방법

아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 1) 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 배양된 형질전환체에서 상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2 유전자의 발현이 유도된 형질전환체의 배양물로부터 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 분리하는 단계를 포함하는 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 생산 방법을 제공한다.

상기 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 암호화하는 유전자의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자 또는 단백질 절단효소 인식부위가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 정제 또는 원래 형태의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 수득이 가능할 수 있다.

상기 단계 1)의 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다.

상기 단계 3)의 상기 배양에 의해 생성된 배양물로부터 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 포스포에놀피루브산 카르복실화효소는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 효소를 정제할 수 있다.

본 발명이 구체적인 실시예에서는 상기와 같이 정제된 단백질이 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 활성을 나타냄을 확인하였다(도 7 참조). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 생산 방법에 따라 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

두날리엘라 살리나( Dunaliella salina ) 유래의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2(DsPEPCase 2) 유전자의 5'쪽- 및 3'쪽-절편이 포함된 플라스미드의 제조

RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 방법으로 해양 미세조류인 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)에서 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2(DsPEPCase 2) 유전자의 5'쪽-절편이 포함된 플라스미드와 3'쪽-절편이 포함된 플라스미드를 각각 확보하였다.

<1-1> cDNA의 합성

우선 DsPEPCase 2 유전자 확보를 위한 프라이머를 제작하기 위하여, 본 연구실에서 보유하고 있던 두날리엘라 살리나와 근종인 두날리엘라 에피스(Dunaliella sp.)의 EST 데이터를 분석하여, 기존에 밝혀진 PEPCase 2와 유사한 정보를 나타내는 것을 선별하였다. 선별된 각 클론들을 유전자 분석하고. 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2(CrPPC 2)와의 유사도를 바탕으로 부분적인 유전정보를 확보하였다. 상기와 같이 확보된 유전 정보를 바탕으로 하기 표 1에 기재된 프라이머를 사용하여 두날리엘라 살리나에서 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 상기 RACE 방법에 사용된 cDNA는 상기 하기 표 1의 프라이머와 5'/3' RACE kit(Roche, 독일)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 합성하였다. 5'-RACE 방법의 경우, 먼저 두날리엘라 살리나에서 분리한 총 RNA로부터 서열번호 3의 PEPC2_sp1 프라이머을 이용하여 cDNA를 합성한 다음, 말단 말단전이효소(terminal transferase)를 이용하여 A 뉴클레오타이드를 결합시켜 A-테일링된 cDNA를 제조하였다. 또한, 3'-RACE 방법의 경우, 서열번호 4로 기재되는 올리고 dT 앵커 프라이머(oligo dT anchor primer)를 이용하여 cDNA를 제조하였다.

<1-2> DsPEPCase 2의 5'쪽-절편 및 3'쪽-절편의 제조

상기 실시예 <1-1>에서 합성한 cDNA를 주형으로 서열번호 4로 기재되는 올리고 dT 앵커 프라이머(oligo dT anchor primer), 서열번호 5로 기재되는 앵커 프라이머(anchor primer) 및 하기 표 2에 기재된 프라이머들을 이용하여 각각 PCR을 수행함으로써, DsPEPCase 2의 5'쪽-절편과 3'쪽-절편을 수득하였다. 하기 표 2에 기재된 프라이머들은 DsPEPCase 2 유전자만을 특이적으로 증폭하기 위하여 제작된 것으로서, 구체적으로 서열번호 6으로 기재되는 PEPC2_sp2 프라이머와 서열번호 4로 기재되는 올리고 dT 앵커 프라이머(또는 서열번호 8로 기재되는 PEPC2_Fw1 프라이머), 및 서열번호 7로 기재되는 PEPC2_sp3 프라이머와 서열번호 8로 기재되는 PEPC2_Fw1 프라이머를 이용하여 5'쪽-절편을 증폭하고, 전기영동을 통하여 그 크기(2.7 kb)를 확인하였다(도 1의 2번째 레인). 또한, 서열번호 9로 기재되는 PEPC2_sp4와 서열번호 5로 기재되는 앵커 프라이머를 이용하여 3'쪽-절편을 증폭하고, 전기영동을 통하여 그 크기(1.5 kb)를 확인하였다(도 1의 3번째 레인).

상기 DsPEPCase 2의 5'쪽-절편과 3'쪽-절편의 증폭을 위한 PCR 반응은 pfu plus 5X PCR master mix(엘피스바이오텍, 한국)를 사용하여 95℃에서 3분간 변성(denaturation)한 후, 95℃에서 20초간 변성(denaturation), 55℃에서 20초 간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1분간 신장(extension)하는 반응을 35회 반복 수행한 다음, 마지막 단계로 안정적인 신장을 위해 72℃에서 5분간 반응시킴으로써 수행되었다.

상기와 같이 증폭된 DsPEPCase 2의 5'쪽-절편과 3'쪽-절편을 1.0% 아가로즈 젤 상에서 확인하여 정제한 뒤, MG TOPcloner Blunt core kit(마크로젠, 한국)를 사용하여 클로닝 벡터인 pTOP Blunt V2에 각각 삽입함으로써, 재조합 플라스미드인 pTOP::DsPEPCase2_5'쪽-절편(pTOP-DsPEPCase2-5)과 pTOP::DsPEPCase2_3'쪽-절편(pTOP-DsPEPCase2-3)을 제조하였다. 그런 다음, 대장균 DH5α 컴피턴트 세포(E. coli DH5a competent cell)에 상기 두 재조합 플라스미드들을 각각 형질전환하여 두 종류의 형질전환된 균주를 제조하였다.

전장(full-length)의 DsPEPCase 2 유전자가 포함된 플라스미드의 제조

<2-1> 전장의 DsPEPCase 2 유전자가 삽입된 pTOP 벡터의 제조

상기 실시예 1에서 증폭한 DsPEPCase 2의 5'쪽- 및 3'쪽- 절편을 서로 연결하여 전장(full-length)의 DsPEPCase 2 유전자를 제조하였다.

먼저 두 DNA 절편에서 서로 겹치는 부위에 BamHⅠ 부위가 하나씩 존재하고, pTOP 벡터에도 PCR 절편이 삽입되는 클로닝 위치 바로 인근에 또한 BamHⅠ 부위가 존재하는 것을 확인하였다. 그런 다음, 도 2의 (a)와 같이 BamHI을 처리하여 원형의 pTOP-DsPEPCase2-5 플라스미드를 선형의 pTOP-DsPEPCase2-5 DNA 절편으로 만들고, 이를 전기영동하여 크기를 확인하였다(도 3의 2번째 레인). 또한, 도 2의 (b)와 같이 BamHI을 처리하여 원형의 pTOP-DsPEPCase2-3 플라스미드로부터 DNA 절편을 분리하고(상기와 같이 원형의 pTOP-DsPEPCase2-3 플라스미드에 BamHI을 처리하여 분리한 DNA 조각을 'DsPEPCase2-3 절편'이라 한다.), 이를 전기영동하여 크기를 확인하였다(도 3의 3번째 레인). 그런 다음, T4 라이게이즈 효소를 이용하여 상기 DsPEPCase2-3 절편을 상기 선형의 pTOP-DsPEPCase2-5 DNA 절편에 라이게이션(ligation)함으로써, 도 2의 (c)와 같이 전장의 DsPEPCase 2 유전자가 삽입된 pTOP 플라스미드(pTOP-DsPEPCase2-F)를 제조하였다. 상기와 같이 전장의 DsPEPCase 2 유전자가 삽입된 pTOP 플라스미드를 제한효소 PstI로 절단한 후 전기영동하여 절단된 조각의 크기를 확인함으로써, 상기 전장의 DsPEPCase 2 유전자가 상기 pTOP 벡터에 제대로 삽입되었음을 확인하였다(도 4).

<2-2> DsPEPCase 2 유전자의 핵산 및 아미노산 서열 분석

상기 실시예 <2-1>과 같이 DsPEPCase 2 유전자가 클로닝된 플라스미드부터 클로닝된 유전자의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 분석하였다.

그 결과, 상기 DsPEPCase 2는 각각 서열번호 2 및 서열번호 1로 기재되는 염기 서열 및 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다. 상기와 같은 결과로부터, 상기 DsPEPCase 2 유전자는 도 5와 같은 구조를 가짐을 알 수 있다.

DsPEPCase 2의 상동성 분석 및 효소 활성 확인

<3-1> DsPEPCase 2의 상동성 분석

상기 실시예 <2-2>에서 확인된 DsPEPCase 2의 아미노산 서열(서열번호 1)을 기존에 공지된 포스포에놀피루브산 카르복실화효소의 서열과 비교하였다.

그 결과, 상기 DsPEPCase는 기존에 알려진 다른 생물체 유래의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소와 상동성(Identity) 및 유사도(Similarity)가 낮은 것으로 확인되었다(도 6). 특히, 계통학적으로 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)와 매우 가까운 것으로 알려진 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2(CrPPC 2)와 비교하였을 때도 상동성과 유사도가 각각 56.0% 및 66.9%로 매우 낮게 측정되었다.

상기와 같은 결과로부터, 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina) 유래의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2는 새로운 아미노산 서열을 갖는 신규한 효소임을 알 수 있다.

<3-2> DsPEPCase 2의 효소 활성 확인

<3-2-1> DsPEPCase 2이 클로닝된 발현 벡터의 제조 및 형질전환

DsPEPCase 2 단백질을 분리하기 위하여, DsPEPCase 2의 단백질 코딩 서열을 콜드샥 발현 시스템(cold shock expression system)을 가지는 단백질 발현벡터 pColdI(다카라, 일본)에 삽입하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 전장의 DsPEPCase 2 유전자가 삽입된 pTOP 플라스미드를 주형으로, KpnI 제한효소 염기서열을 가지는 DsP2-KpnI_Fw 프라이머(서열번호 10)와 HindIII 제한효소 염기서열을 가지고 있는 DsP2-HindIII_Rv 프라이머(서열번호 11)를 이용하여 PCR을 수행함으로써, 양쪽 말단에 KpnI 과 HindIII 제한효소 염기서열을 가진 DsPEPCase 2 DNA 절편을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 DNA 절편을 제한효소 KpnI과 HindIII로 절단한 다음, 동일한 제한효소로 절단 pColdI 벡터에 라이게이션(ligation)하고(도 7), 대장균(E. coli Origami(DE3)(Novagen, 독일))에 형질전환하였다.

<3-2-2> 형질전환체 내에서 DsPEPCase 2의 발현 유도

상기 실시예 <3-2-1>과 같이 제조된 형질전환체는 엠피실린(ampicillin)에 저항성을 보이는 바, 상기 형질전환체를 엠피실린(50 μg/ml)이 들어있는 LB 배지에서 현탁하여 37 ℃에서 배양하였다. 상기와 같은 배양에 의해 수득된 형질전환체의 배양액은 OD600에서 0.4에서 0.5사이의 단계에서 30분간 15 ℃로 식힌 후(콜드(cold) 처리), 1 mM의 IPTG를 처리하고 현탁하면서, 15 ℃에서 24시간 동안 DsPEPCase 2 단백질의 발현을 유도하였다.

<3-2-3> DsPEPCase 2의 분리

상기 실시예 <3-2-2>와 같이 단백질의 발현이 유도된 대장균을 수확하고, lysis buffer(20 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.5M NaCl, 10 mM imidazole, 5% glycerol, 20 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 1 mM PMSF)로 재현탁한 후, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄함으로써, 세포 용해물(cell lysate)를 수득하였다. 상기와 같이 수득된 세포 용해물을 10,000Xg에서 30분간 원심분리하여 수득한 상층액을 His Taq 컬럼인 Ni-NTA 아가로즈(agarose)(QIAGEN, 독일)를 이용하여 6X His Taq이 융합된 DsPEPCase 2 단백질을 분리하였다. 이 때, DsPEPCase 2 단백질의 일루션(Elution)은 elution buffer(20 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.5 M NaCl, 300 mM imidazole, 5% glycerol, 20 mM KCl, 10 mM MgCl2)를 이용하였다.

<3-2-4> 형질전환체 내에서 DsPEPCase 2의 발현 여부 확인

상기 실시예 <3-2-2>와 같이 발현이 유도된 형질전환체에서 DsPEPCase 2의 발현이 유도되는지 여부를 확인하기 위하여, (1)상기 실시예 <3-2-1>에서 제조된 형질전환체에서 발현되는 전체 단백질, (2)상기 실시예 <3-2-1>에서 제조된 형질전환체에서 발현되는 수용성 단백질, (3)상기 실시예 <3-2-2>에서 발현이 유도된 형질전환체에서 발현되는 전체 단백질, (4)상기 실시예 <3-2-2>에서 발현이 유도된 형질전환체에서 발현되는 수용성 단백질, 및 (5)상기 실시예 <3-2-3>에서 His Taq 컬럼인 Ni-NTA 아가로즈에 붙지 않고 그냥 빠져나온 단백질을 각각 SDS-PAGE하여 분석하였다. 또한, 상기 실시예 <3-2-3>에서 일루션하여 수득한 1번째 내지 4번째 분획들도 함께 SDS-PAGE하였다.

그 결과, (3)단백질의 발현이 유도된 형질전환체에서 발현된 전체 단백질에서만 약 120 kDa 정도 크기의 단백질이 특별히 과발현되었다(도 8의 3번째 레인). 또한, (3)단백질의 발현이 유도된 형질전환체에서 과발현된 단백질은 His Taq 컬럼인 Ni-NTA 아가로즈에 흡착되고(도 8의 5번째 레인), 2번째 일루션 분획에서 일루션됨을 확인되었다(도 8의 7번째 레인). 상기와 같은 결과로부터, 상기 실시예 <3-2-2>과 같은 단백질 발현 유도에 의하여 His-Taq이 붙어 있는 DsPEPCase 2 단백질이 과발현되고, 상기 실시예 <3-2-3>에서 정제되어 분리되었음을 알 수 있다.

<3-2-4> DsPEPCase 2의 효소 활성 확인

상기 실시예 <3-2-3>에서 수득한 2번째 일루션 분획으로부터 정제 및 분리한 DsPEPCase 2 단백질이 포스포에놀피루브산 카르복실화 활성을 가지는지 확인하였다. 상기 활성의 측정은 커플링 효소(coulpling enzyme)를 이용하는 방법으로 수행되었다. 구체적으로, 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소에 의해 생성된 옥살로아세트산(oxaloacetic acid)는 다시 말레이트 디하이드로제나아제(malate dehydrogenase)에 의해 말산(malic acid)으로 변환되는데, 그 과정에서 NADH를 소모하는 반응이 일어난다. 상기와 같은 NADH 소모 반응에서, 소모되는 NADH의 양을 340 nm 파장에서의 흡광도 감소 변화 속도를 측정하여 분석하였다.

그 결과, 상기 실시예 <3-2-3>에서 분리한 DsPEPCase 2 단백질은 상온에서 상기 DsPEPCase 2 단백질 1 ㎎당 0.143 Units의 포스포에놀피루브산 카르복실화 활성을 나타내었다(도 8).

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2.
2. 제1항에 있어서, 상기 효소는 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina) 유래인 것을 특징으로 하는 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2.
3. 제1항의 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 코딩하는 유전자.
4. 제3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
6. 제5항의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
7. 제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
8. 제6항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
   상기 형질전환체의 배양물로부터 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2를 분리하는 단계를 포함하는 포스포에놀피루브산 카르복실화효소 2의 생산 방법.
   

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