JP2001503274A

JP2001503274A - 改良された発現ベクター

Info

Publication number: JP2001503274A
Application number: JP52185798A
Authority: JP
Inventors: シュルツ，ジョディ; ハーマンソン，ゲイリー
Original assignee: サイテルコーポレイション
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2001-03-13
Also published as: HUP0001650A3; ATE386126T1; US6117651A; CN1244214A; IL129843A0; EP0946711A1; AU718382B2; NZ335628A; KR20000068934A; CA2271230A1; EP0946711A4; HUP0001650A2; EP0946711B1; AU5252498A; DE69738514D1; WO1998020111A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、所望のポリペプチドをコードする異種核酸に作用可能に連結された二元細菌プロモーターを含んで成る単離された核酸構造体を提供する。前記構造体は、細菌細胞における所望のポリペプチドの高レベルでの発現のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】改良された発現ベクター発明の分野本発明は、改良されたベクター、及び細菌細胞における組換えタンパク質の発現のための発酵プロトコールに関する。本発明は、いづれかの所望するタンパク質、たとえばオリゴ糖の酵素的合成において有用な酵素の発現のために使用され得る。発明の背景生物学的活性ポリペプチド及びタンパク質の生成は、ヒト及び動物用医薬製剤、酵素及び他の特定の化学物質の製造のために経済的に重要である。発現宿主として細菌、真菌、哺乳類又は昆虫細胞を用いる組換え技法は、多量のポリペプチドを生成するための特に有用な手段である。所望するタンパク質の組換え生成は一般的に、タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に結合される場合、その遺伝子の発現を制御するシグナルを含む発現ベクターにより宿主細胞をトランスフェクトすることを包含する。細胞は、組換えタンパク質の発現のために適切な条件下で増殖される。発現制御シグナルは典型的には、プロモーターの下流に位置する遺伝子がRNAに転写される速度に影響を及ぼし、そして転写開始部位を決定するプロモーターを包含する。発現制御シグナルは、所望のタンパク質の生成のために使用される宿主細胞中で機能するよう選択される。たとえば、細菌Ｅ．コリ（E.coli）が通常、組換えタンパク質を高い収率で生成するために使用される。多くの文献が、タンパク質を組換え的に生成するためにＥ．コリ及び他の細菌を用いる方法を開示する（たとえば、アメリカ特許第4, 565,785号；第4,673,641号；第4,738,921号；第4,795,706号；及び第4,710,473 号を参照のこと）。商業的使用のために意図される、組換え的に生成されたタンパク質に関しては、特に、宿主細胞から所望のタンパク質の高レベルの発現を得ることが所望される。細胞当たり生成される所望のタンパク質の量を高めることにより、一定量の生成物を得るために増殖されるべき細胞の体積の減少により製造の費用を減じることができ、そしてまた、宿主細胞により生成される全タンパク質に対する所望の生成物の高い百分率のため、精製を促進することができる。従って、高レベルで所望のタンパク質を発現することができる発現制御シグナルの必要性が存在する。本発明はこの及び他の必要性を満たす。発明の要約本発明は、所望のポリペプチドをコードする異種（heterologous）核酸に作用可能に結合された二元（dual）細菌プロモーターを含んで成る単離された組換え核酸構造体を提供する。前記構造体は、細菌宿主細胞において所望するポリペプチドを高レベルで発現するために有用である。前記二元（dual）プロモーターは、tac−関連プロモーターに由来する第１成分、及びガラクトース代謝に関与する酵素又は複数の酵素をコードする細菌遺伝子又はオペロンから得られる第２プロモーター成分を含んで成る。多くのガラクトースプロモーターが第２プロモーター成分として使用され得；典型的なプロモーターはストレプトコーカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）に由来するUDPガラクトース−４− エピメラーゼ（UDPグルコース−４−エピメラーゼとしても知られている）プロモーターである。所望のポリペプチドをコードする異種核酸に作用可能に結合された二元（dual ）細菌プロモーターを包含する発現プロモーターがまた、本発明により提供される。前記発現ベクターはさらに、他の成分、たとえば選択マーカーを含むことができる。前記構造体はまた、Ｅ．コリ又は他の宿主細胞において機能する複製起点の配列を含むことができる。本発明の好ましい構造体、すなわちプラスミドpT GK（下記に詳細に説明される）は、1996年５月22日、受託番号98059として、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collec tion）に寄託された。本発明はまた、異種核酸に作用可能に結合される二元（dual）細菌プロモーター単位を含む組換え発現カセットを含む細菌細胞を提供する。前記発現カセットは、宿主細胞のゲノム中に組込まれ得、又は自律複製するプラスミド上に存在することができる。好ましい細菌細胞は、Ｅ．コリである。本発明はさらに、所望のポリペプチドを製造するための方法を提供する。前記方法は、異種核酸に作用可能に結合された二元細菌プロモーター単位を有する組換え発現カセットを含む細菌細胞を、前記異種核酸の発現を可能にする条件下で、適切な培地において培養することを包含する。典型的には、Ｅ．コリが宿主細胞として使用される。前記方法及び構造体は、細菌細胞において広範囲の種類のポリペプチドを発現するために使用され得る。典型的なポリペプチドは、ホルモン、成長因子、及び同様のもの、並びに炭水化物の合成において有用な酵素を包含する。そのような酵素は、CMP−シアル酸シンターゼ、UDP−グルコースピロホスホリラーゼ、アデニル化キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、シアル酸アルドラーゼ、UDP−GlcNAcピロホスホリラーゼ、及びミオキナーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを包含する。図面の簡単な説明図１は、プラスミドpPHCX2の地図である。図２は、リボソーム結合部位（シャイル−ダルガルノの配列）と本発明のベクターにおける組換え遺伝子の開始コドンとの間の空間を示す（配列番号２）。図３は、プラスミドpPHOX2／galE／Kanの地図である。図４は、プラスミドpTGKの地図である。このプラスミドは、pPHOX2／galE／Ka nと実質的に同じであるが、但しプロモーター領域の5’XbaＩ部位及びカナマイシン耐性遺伝子(Kan^r)におけるHindIII部位が欠失されている。図５Ａ及び５Ｂは、ATG開始コドンにより開始するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、発現されるべきDNAを増幅することによって、リボソーム結合部位と、本発明のベクターにおいて発現される遺伝子の開始コドンとの間の最適空間を維持できることを示す。図５Ａは、リボソーム結合部位(RBS)とプラスミドpTGKS(配列番号３）におけるSrfＩ制限部位との間の関係を示す。SrfＩによる消化は、ATG開始コドンにより開始するブラント(Blunt)末端化された組換え遺伝子が図５Ｂ（配列番号４）に示されるように連結され得るブラント末端を残す。図６は、示されるように（配列番号１）、pPHOX2配列により挟まれた本発明の二元tac−galプロモーターの１つの態様のヌクレオチド配列を示す。tac及びgal Eプロモーターの両者の−35及び−10コンセンサス配列が、発現のための組換え遺伝子を挿入するために有用であるXbaＩ及びHindIII部位の位置と共に示される。本発明の詳細な記載本発明は、所望のポリペプチドの組換え発現のための改良されたプロモーター及びベクターを提供する。本発明のプロモーター及びベクターは、細菌宿主、たとえばＥ．コリにおける組換えタンパク質の発現のために特に適切である。本発明のプロモーター及びベクターを用いて、高レベルの組換えタンパク質を得るための発酵プロトコールがまた提供される。定義この出願において必要とされる命名法及び一般的な実験方法の多くは、Sambro okなど.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd Ed.)，Vol．1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989に見出され得る。マニュアルは、この後、“Sambrookなど．”として言及される。特にことわらない限り、本明細書に使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。Single tonなど．(1994)Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，second edition，John Wiley and Sons（New York）は、本発明に使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書に記載される方法及び材料に類似するか又は同等のいづれかの方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明のためには、次の用語が下記に定義される。用語“核酸”とは、一本鎖形又は二本鎖形でのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、そして特に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドに類似する態様で核酸に対してハイブリダイズする天然のヌクレオチドの既知類似体を包含する。特にことわらない限り、特定の核酸配列は、その相補的配列を包含する。用語“作用可能に結合される”とは、核酸発現制御配列（たとえばプロモーター、シグナル配列、又は転写因子結合部位のアレイ）と第２核酸配列との間の機能的結合を意味し、ここで前記核酸制御配列は前記第２配列に対応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。用語“組換え”とは、細胞に関して使用される場合、細胞が異種核酸を発現し、又は異種核酸によりコードされるペプチド又はタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）の形では見出されない遺伝子を発現することができる。組換え細胞はまた、細胞の天然の形で見出される遺伝子を発現することができるが、しかしここで前記遺伝子は人工的手段により修飾され、そして細胞中に再導入される。 “異種配列”（heterologous sequence）又は“異種核酸”(heterologous nuc leic arid)とは、本明細書において使用される場合、外来性(foreign)源（又は種）に起因するものであり、又は同じ源に起因する場合、その元の形から修飾されている。従って、プロモーターに作用可能に連結される異種核酸は、プロモーターが由来する源とは異なる源からであり、又は同じ源に起因する場合、その元の形から修飾される。たとえば、UDPグルコース４−エピメラーゼ遺伝子プロモーターは、天然のUDPグルコース４−エピメラーゼ以外のポリペプチドをコードする構造遺伝子に結合され得る。異種配列の修飾は、たとえばプロモーターに作用可能に連結され得るDNAフラグメントを生成するために制限酵素によりDNAを処理することによって生じ得る。部位特定突然変異誘発のような技法もまた、異種配列を修飾するために有用である。 “組換え発現カセット”又は単純に“発現カセット”とは、そのような配列と適合できる宿主における構造遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる核酸要素により組換え的に又は合成的に生成される核酸構造体である。発現カセットは、少なくともプロモーター及び任意には、転写終結シグナルを包含する。典型的には、組換え発現カセットは、転写されるべき核酸（たとえば所望のポリペプチドをコードする核酸）、及びプロモーター（たとえばtacプロモーター成分及びgalプロモーター成分を含む二元プロモーター）を含む。発現に影響を及ぼすことにおいて必要な又は助けとなる追加の因子もまた、本明細書に記載されるように使用それ得る。たとえば、発現カセットはまた、宿主細胞からの発現されたタンパク質の分泌を指図するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列も含むことができる。用語“単離された”とは、その天然の状態で見出されるような材料に通常付随する成分を実質的に有さない材料に言及することを意味する。従って、単離されたタンパク質は、それらの現場環境と通常関係する材料を含まない。典型的には、本発明の単離されたタンパク質は、銀染色されたゲル上でのバンドの強度、又は純度を決定するための他の方法により測定される場合、少なくとも約80％の純度、通常少なくとも約90％の純度、そして好ましくは少なくとも約95％の純度である。本発明においては、ポリペプチドはトランスジェニック細胞から精製される。 UDPグルコース−４−エピメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．１．３．２）はまた、UDPガラクトース−４−エピメラーゼ及びホスホリブロースエピメラーゼとしても知られている。それらの用語は、本明細書において交換可能的に使用される。２種のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、それらの２種の配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が、最大の対応性のために一列に並べられる場合に同じである場合、“同一”であると言われる。比較のための配列の最適な一列整列は、Smith and Waterman，Adv．Appl．Math ．2：482（1981）の局部相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch，J ．Mol．Biol．48：443（1970）の相同性整合アルゴリズムにより、Pearson and Lipman，Proc．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.)85：2444(1988)の類似性方法についての研究により、それらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Packag e，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WIにおけるGAP，BES TFIT，FASTA及びTFASTA）のコンピューター化された実施により、又は診査により行なわれ得る。用語“実質的な同一性”とは、ポリペプチドに適用される場合、ポリペプチドが、約20〜約600個の残基、典型的には約50〜約500個の残基、通常約250〜300個の残基の比較窓に対する対照配列に対して、少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％又はそれ以上、同一である配列を含んで成ることを意味する。％同一性の値は、上記プログラムを用いて決定される。用語“実質的な同一性”又は“実質的な配列同一性”とは、核酸配列に適用されそして本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも20個のヌクレオチド位置の比較窓、時おり、少なくとも25〜50個のヌクレオチドの比較窓に対して対照配列を比較して、少なくとも85％、好ましくは少なくとも90〜95％、及びより好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含んで成り、ここで前記配列同一性の％は、欠失又は付加を包含するポリヌクレオチド配列に対して対照配列を比較することによって計算され、ここで前記欠失又は付加は比較窓に対する対照配列の合成20％又はそれ以下になる。対照配列は、大きな配列のサブセットであり得る。ヌクレオチド配列が実質的に同一であるもう１つの表示は、２種の分子が緊縮条件下でお互いに対してハイブリダイズするかどうかである。緊縮条件は、配列 −依存性であり、そして異なった環境下で異なるであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びpHでの特定の配列に関して、その熱溶融点（Ｔ_m ）よりも、約５℃〜約20℃、通常約10℃〜約15℃低く選択される。前記Ｔ_mは、標的配列の50％が、完全に適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。典型的には、緊縮条件は、塩濃度が約0.02モル濃度でpH７であり、そして温度が少なくとも約60℃である条件であろう。たとえば、標準的サザンハイブリダイゼーションにおいては、緊縮条件は、42℃で６×SSCによる初期洗浄、続いて、少なくとも約55℃、典型的には約60 ℃及びしばしば約65℃の温度で0.2×SSCによる１又は複数回の洗浄を包含するであろう。ヌクレオチド配列はまた、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、本発明のためには実質的に同一である。従って、１つの核酸配列が第２核酸配列と実質的に同じポリペプチドをコードする場合、それらの２つの核酸配列は、それらが遺伝子コードにより可能にされるサイレント置換のために緊縮条件でハイブリダイズしない場合でさえ、実質的に同一である（コドン縮重及び遺伝子コードの説明については、Darnellなど．(1990)Molecular Cell Biology ，Second Edition Scientific American Books，W.H．Freeman and Compony，Ne w Yorkを参照のこと）。タンパク質純度又は均質性は、当業界において良く知られている多くの手段、たとえばタンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いての染色に基づく可視化により示され得る。一定の目的のためには、高い分解能が必要とされ、そして精製のためには、IIPLC又は類似する手段が利用される。本発明の実施は、組換え核酸の構成、及びトランスフェクトされた細菌細胞における遺伝子の発現を包含する。それらの目的を達成するための分子クローニング技法は、当業界に知られている。組換え核酸、たとえば発現ベクターの構成のために適切な広範囲の種類のクローニング及びインビトロ増幅方法は、当業者に良く知られている。多くのクローニング試行を通して当業者を方向づけるのに十分なそれらの技法及び教授の例は、次の文献に見出される：Berger and Kimmel ，Guide to Molecualr Cloning Techniques，Methods in Enzymology volume 15 2 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；及びCurrent Protocols in Molecular Biology，F.M．Ausubelなど.，eds.，Current Protocols，a joint v enture between Greene Publishing Associates，Inc．and John Wiley & Sons ，Inc.，(1994 Supplement)（Ansubel）。インビトロ増幅方法、たとえばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Ｑβ−レプリカーゼ増幅及び他のRNAポリメラーゼ介入技法を通して当業者を方向づけるのに十分なプロトコールの例は、次の文献に見出される：Berg er，Sambrook，and Ausubel，as well as Mullisなど.(1987)アメリカ特許第4,6 83,202号；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications（Innisなど． eds）Academic Press Inc．San Diego，CA（1990）(Innis)：Arnbeim & Levinso n（October 1，1990）C & EN 36-47；The Journal Of NIH Research（1991）3,8 1-94；(Kwohなど．(1989)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86，1173；Guatelliなど．(1990)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，1874；Lomellなど．(1989)J．Clin． Chem．35，1826；Landegrenなど.，(1988)Science 241，1077-1080；Van Brunt （1990）Biotechnology 8，291-294；Wu and Wa llace，(1989)Gene 4，560；及びBatringerなど．(1990)Gene89，117。インビトロ増幅された核酸をクローニングするための改良された方法は、Wallaceなど., アメリカ特許第5,426,039号に記載されている。発明の記載本発明は、細菌細胞、たとえばＥ．コリにおいて組換え遺伝子を高レベルで発現するために有用である発現カセットを提供する。また、発現カセットを含むベクター、及び所望の異種タンパク質の発現を得るために発現カセットを用いるための発酵プロトコールが提供される。本発明の発現カセットは、所望の遺伝子生成物、典型的にはポリペプチドをコードする異種核酸に作用可能に連結された二元プロモーターを含む。前記二元プロモーターは、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードする遺伝子又は複数の遺伝子から得られるプロモーター成分（たとえばUDPガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子（galE）からのプロモーター）に結合されたtacプロモーター成分を含む。前記二元tac−galプロモーターは、いづれかの単独のプロモーターにより提供される発現レベルよりも高い発現レベルを提供する。その二元プロモーターは、発現レベルに対する相加効果よりも高い効果を有する相乗効果を有することができる。クローン化された遺伝子の高レベル発現を得るためには、発現カセットは、他の配列、たとえば翻訳開始及び転写／翻訳ターミネーター配列のためのリボソーム結合部位を含むことができる。構造体を含んで成る細胞の選択を可能にするためには、便利には、１又は複数の選択マーカー遺伝子（たとえは、抗生物質耐性遺伝子）が発現ベクターに含まれる。前記ベクターは、原核生物宿主、たとえば広い宿主範囲の原核生物におけるベクターのクローン化を可能にするための他の配列を含むことができる。当業者は、それらのベクター成分の個々がそれらの機能に対して実質的に影響を及ぼさないで、修飾され得ることを認識するであろう。本発明の二元プロモーターの１つの成分は、lac及びtrpプロモーターの組合せであるtacプロモーターである。tacプロモーターを含む発現ベクターの例は、pK K223−３であり(Brosins and Holy，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：6929(198 4))；このベクターは市販されている（Pharmacia Biotech．Inc.，Piscataway N J）。tacプロモーターの変異体、たとえばtrc(Amannなど.，Gene 69：301(1988) )はまた、本発明の二元プロモーターの第１成分として有用でもある。本発明の二元プロモーターの第２成分は、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードする１又は複数の遺伝子から得られるプロモーターである。細菌においては、そのような遺伝子はしばしば、他にきわめて接近して存在する１つよりも多くのgal遺伝子により集団化される。たとえば、ストレプトコーカス・サーモフィラスにおいては、UDPガラクトース−４−エピメラーゼ（galE；また、UDPグルコース−４−エピメラーゼとしても知られている）及びアルドース−１−エピメラーゼ（ムタロターゼ）（galM）をコードする遺伝子は、密接して連結される(P oolmanなど.，J．Bacteriol．172：4037-4047(1990))。Ｅ．コリにおいては、４個のgal遺伝子が連結される（galE，galT(UDPグルコースーヘキソース−１−ホスフェートウリジルイルトランスフェラーゼ）、galK（ガラクトキナーゼ）及び galM）（Bouffardなど.，J．Mol．Biol．244：269-278(1994))。同様に、クレブシエラ・プネウモニアエ(Klebsiella pneumoniae)のgalオペロンはまた、いくつかの遺伝子（galL，galT、及びgalKの順序で）を含み(Pengなど.，J．Biochem． 112：604-6 08(1992))、そしてヘモフィラス・インフルエンザエ(Hemophilus influenzae)の galオペロンは、単一のオペロンにgalT，galK及びgalMを順序良く含み(Maskell など.，Mol．Microbiol．6：3051-3063(1992))、そしてストレプトミセス・リビデンス(Streptomyces lividans)のgalオペロンは、galT，galE，galKの順序で遺伝子を有する(Adamsなど.，J．Bacteriol．170：203-212(1988))。ガラクトースオペロンは、１又は複数のプロモーターの制御下で発現される。たとえば、Ｓ．リビダンスのgalオペロンは、２種のプロモーター、すなわちガラクトース−誘発性であり、そしてgalT，galE及びgalK遺伝子の転写を方向づける１つのプロモーター（gal P1）、並びにgalE遺伝子のすぐ上流のオペロン内に位置し、そして構成的に発現される第２のプロモーター（gal P2）を含む。（Fornwaldなど.，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 84：2130-2134(1987)）。Ｅ．コリのgalオペロンはまた、誘発性プロモーターの他に、ga1E遺伝子の上流に位置する構成プロモーターを含む。好ましい態様においては、二元プロモーターは、細菌UDPガラクトース−４− エピメラーゼ（galE）遺伝子からのプロモーターを含む。ストレプトコーカス・サーモフィラスのUDPガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子（Poolmanなど.，J ．Bacteriol．172：4037-4047（1990）により記載される）は、本発明において有用であるプロモーターを得ることができる遺伝子の特定の例である。他の生物のUDPグルコース−４−エピメラーゼ遺伝子からのプロモーターは、プロモーターがＥ．コリ又は他の所望の細菌宿主において機能する限り、本発明において使用され得る。UDPグルコース−４−エピメラーゼをコードする遺伝子を有する典型的な生物は、Ｅ．コリ、Ｋ．プネウモニアエ、Ｓ．リビダンス、及びＥ．ステワルチ(E．tewartii)、並びにサルモネラ（Salmonella）及びストレプトコーカス属の種を包含する。 gal遺伝子及びそれらのプロモーターの単離は、当業者に良く知られている多くの技法により達成され得る。たとえば、下記に記載される例示されるUDPグルコース−４−エピメラーゼ遺伝子又はプロモーターに対して選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、他の生物から単離されるDNAにおける所望する遺伝子を同定するために使用され得る。相同遺伝子を同定するためのそのようなハイブリダイゼーション技法の使用は、当業界において良く知られており、そしてさらに記載される必要はない。得られるプロモーターは典型的には、下記に記載される典型的なグルコースエピメラーゼプロモーターに対して同一であり、又はそれに対して実質的な配列同一性を示す。あるいは、所望のプロモーターフラグメントのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、技術文献に記載されるような良く知られている技法により合成され得る。たとえば、Carruthersなど.，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Bio l．47：411-418(1982)及びAdamsなど.，J．Am．Chem．Soc．105：661（1983）を参照のこと。次に、相補的鎖を合成し、そして適切な条件下で前記鎖を一緒にアニーリングすることによって、又は適切なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いて相補的鎖を付加することによって、二本鎖DNAフラグメントを得ることができる。本発明の二元プロモーターを含んで成るtac及びgalプロモーターは、野生型細菌細胞におけるその対応するプロモーターに対して同一であり得、又は所望により、たとえばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換により修飾され得る。そのような修飾は、プロモーター機能のために必要であるプロモーター配列のそれらの部分を維持するであろう。たとえば、グラム陽性及びグラム陰性細菌のプロモーターのための−10及び−35のコンセンサス配列（たとえば、Gravesなど.，J．Bi ol．Chem．261：11409-11415(1986)；Singer and Berg，Genes & Genumes，Univ ersity Science Books，Mill Valley，CA，1991，pp．140-143を参照のこと）が、発現を得るために必要な程度、維持されるであろう。Ｅ．コリにおけるプロモーターの正しい機能のために重要であるヌクレオチドが、Singer and Berg，p14 3に示されている。プロモーター機能に対して必須ではないプロモーター配列の領域は、所望により、たとえばプロモーター領域に隣接して又はその領域内に、制限部位を挿入することによってクローニングを促進するために修飾され得る。 tac及びgalプロモーター成分の両者は一般的に、cAMP受容体タンパク質（CRP ，crp遺伝子の生成体である）のための結合部位を有するであろう。cAMPは、炭素源有効性のためのシグナルとして広く知られており、そしてそのレベルは、良好な炭素源（たとえばグルコース）上での細胞の増殖よりも高いcAMPレベルを誘導する不良な炭素源（たとえば、フルクトース、グリセロール、アセテート）上での細胞の増殖により明らかなように、細胞のエネルギー状態と反比例して相互関係している。cAMPは、CRPへの結合により遺伝子発現を調節する。この高い親和性結合は、ダイマー複合体におけるコンホメーション変化をもたらし、次に前記複合体は、RNAポリメラーゼの結合部位の上流の特定のDNA部位に結合することができる。転写は、少なくともgalオペロンの場合、RNAポリメラーゼからのＥσ⁷⁰ の初期結合（Ｋ_Bを高める）を促進することによって活性化される。本発明の二元プロモーターのtacプロモーター成分は一般的に、galプロモーター成分の上流に位置する。一般的に、２つのプロモーター成分が、約0.1〜２kb のDNAにより分離される。より好ましくは、約0.5〜1.5kbのDNAがそれらの２つのプロモーター成分を分離する。最とも好ましい態様においては、tacプロモーター成分は、galプロモーター成分の約１kb上流に位置する。２つのプロモーター成分を分離するDNA源は、DNAが遺伝子発現を妨げる配列、たとえば転写ターミネーターを含まない限り、特別に決定的ではない。たとえば、１つの態様においては、tacプロモーター成分は、galプロモーター成分の生来の５’フランキング領域から得られるDNAによりgalプロモーター成分から分離される。好ましい態様においては、Ｓ．サーモフィラスgalE遺伝子の５’フランキング領域からの約１kbのDNAが、galプロモーター成分からta cプロモーター成分を分離する。好ましい二元プロモーターのヌクレオチド配列は配列番号１に示される。示されるように、二元プロモーターは、pPHOX2発現ベクターのXbaＩ部位中に挿入され、XbaＩ部位の上流を破壊する。前記配列のヌクレオチド１〜146及び1490〜15 61は、pPHOX2からである。tacプロモーターの−35及び−10コンセンサス配列は、それぞれヌクレオチド362〜367及び384〜389で存在する。galEプロモーターコンセンサス配列は、ヌクレオチド1438〜1443（−35）及び1462〜1467（−10）で存在する。リボソーム結合部位(RBS)は、ヌクレオチド1483〜1488で見出される。二元プロモーターの下流で発現される遺伝子の挿入を促進するために、RBSに続いて、XbaＩ制限部位が存在し、そしてHindIII部位がXbaＩ部位のすぐ３’例のpPIIOX2配列に存在する。本発明のベクターはまた、１又は複数の選択された宿主細胞において独立してベクターの複製を可能にする核酸配列を含むことができる。一般的に、この配列は、宿主染色体DNAに無関係にベクターの複製を可能にする配列であり、そして複製の起点又は自主的に複製する配列を含む。たとえば、プラスミドpBR322からの複製の起点は、ほとんどのグラム−陰性細菌のために適切である。ベクターはまた、所望する構造体を担持する細菌細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含んで成る。それらの遺伝子は、選択培養培地において増殖する形質転換された宿主細胞の生存又は増殖のために必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターにより形質転換されていない宿主細胞は、培養培地において生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質又は他のトキシン、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする。あるいは、選択マーカーは、栄養要求欠乏を補足し、又は複合培地から入手できない必須の栄養素を供給するタンパク質、たとえばバシラスのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子をコードする。多くの選択マーカーが当業者に知られており、そしてたとえばSambrookなど.,前記に記載されている。所望のポリペプチドを発現するために二元tac−lacプロモーターを用いての使用のための好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性マーカーである（Vieira and Messing ，Gene 19：259（1982））。カナマイシン選択の使用は、たとえばアンピシリン選択に比べて好都合である。なぜなら、アンピシリンは培養培地においてβ−ラクタマーゼによりすばやく分解され、従って選択圧力が除去され、そしてベクターを含まない細胞による培養物の過剰増殖が可能になるからである。１又は複数の上記に列挙された成分を含む適切なベクターの構成は、上記に引用される文献に記載されるような標準的連結技法を用いる。単離されたプラスミド又はDNAフラグメントが切断され、調整され、そして必要とされるプラスミドを生成するために所望する形で再連結される。構成されるプラスミドにおける正しい配列を確かめるために、プラスミドが、標準的技法、たとえば制限エンドヌクレアーゼ消化により分析され、そして／又は既知の方法に従って配列決定される。多くの細菌宿主細胞が、本発明のベクターにより使用され得る。有用な細菌の例は、エスシュリチア(Escherichia)、エンテロバクター（Enterobacter）、アゾトバクター(Azotobacter)、エルウイニア(Erwinia)、ハシラス（Hacillus）、プソイドモナス(Pseudomonas)、クレブシエラ（Klebsielia）、プロテウス(Prot eus)、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、シゲラ（Shigella）、リゾビア（Rhizobia）、ビトレオシラ（Vitreoscilla）及びパラコカス（Para coccus）を包含する。適切なＥ．コリ宿主は、次の株を包含する：JM101，RP1， DII5α及び他のもの。それらの例は例示的であって、制限的ではない。使用される宿主細胞に依存して、形質転換は、そのような細胞に適切な標準的技法を用いて行なわれる。適切な技法は、塩化カルシウム、ポリエチレングリコール、又はエレクトロポレーションを用いるカルシウム処理を包含する。本発明はまた、所望のポリペプチドの高レベル発現を得るために二元tac−gal プロモーターを用いるための方法を提供する。宿主細胞が二元プロモーター発現カセットを含むベクターにより形質転換され、そして所望のポリペプチドの発現のために適切な条件下で培養培地において培養される。細胞が振盪フラスコ又は他の容器において増殖されるが、但しポリペプチドの大規模調製のためには、発酵槽における増殖が好ましい。最大レベルの発現を得るためには、所望のポリペプチドの高められた発現を誘発するために、ガラクトースが、増殖サイクルの適切な時間で栄養培地に添加される。たとえば、宿主細胞の増殖は炭素源としてフルクトース（0.25％の最終濃度）を含む培養培地において開始され得；細胞内cAMP（アデノシン−３’，５’−サイクリック−リン酸）濃度の上昇を引き起こす他の糖（たとえば、グリセロール、アセテート）がまた、炭素源としても使用され得る。培養が開始された約５〜６時間後、又は細胞が適切な密度（約３〜６Ａ₆₀₀）に達すると、フルクトース及びガラクトース（最終濃度３％のフルクトース、0.6％のガラクトース）の溶液が培地に添加される（発酵槽のためのフェド−バッチ（fed-batch)態様で）。ガラクトースは、本発明の二元tac−galプロモーター発現カセットからの発現のレベルを高める。フルクトース／ガラクトース溶液の供給速度は、培養物が細胞増殖により密になるにつれて、増殖サイクルの間、（段階的又は傾斜的な態様で）早められ得る。好ましくは、フルクトース／ガラクトース溶液が増殖サイクルの最後で供給される。本発明の二元プロモーターは、非常に高い収率での任意の所望するポリペプチド又はタンパク質の発現のために有用である。前記ポリペプチドは、細菌宿主細胞に対して相同であり、又は好ましくは、宿主細胞に対して異種であり得る。たとえば、二元プロモーターを用いて、非常に高いレベルで酵母、菌類、哺乳類及び植物タンパク質を発現することができる。本発明の二元プロモーターを用いて生成される多くのポリペプチドは、酵素的に活性であろう。一定のポリペプチド、たとえば活性のためにグリコシル化又は他の真核生物特異的プロセッシングを必要とするそれらのポリペプチドは細菌宿主細胞において活性形で生成され得ないが、それにもかかわらず、不活性ポリペプチドは、抗体、分子量マーカー及び同様のものの誘発のための免疫原として使用される。二元プロモーターを用いて発現することができる典型的な細菌ポリペプチドは、β−ラクタマーゼ、炭水化物代謝酵素、アルカリホスファターゼ、制限酵素、DN A及びRNAポリメラーゼ、リガーゼ、キナーゼ、エンド−及びエキソヌクレアーゼ、及び同様のものを包含する。典型的な真菌ポリペプチドは、リグニナーゼ、プロテアーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ及び同様のものを包含する。本発明の二元プロモーターを用いて細菌宿主細胞上において発現することができる典型的な哺乳類ポリペプチドは、ホルモン、たとえばインシュリン、成長ホルモン（ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを包含する）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−PA）、レニン、凝集因子、たとえば第VIII因子及び第IX因子、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、血清アルブミン、ホルモン又は成長因子のための受容体、インターロイキン、コロニー刺激因子、Ｔ−細胞受容体、MH Cポリペプチド、ウィルス抗原、グリコシルトランスフェラーゼ及び同様のものを包含する。この酵素リストは、本発明の二元プロモーターが二元プロモーターに作用可能に結合されるいづれかの核酸発現単位の転写を得るために有用であるので、典型的であって、限定的ではない。そのような発現単位は、ポリペプチドをコードするそれらの発現単位のみならず、また所望の生成物が核酸、たとえばアンチセンスRNAであるそれらの発現単位も包含する。ベクターは、炭水化物の酵素的合成において有用である酵素を発現するために特に有用である。炭水化物の酵素的合成の使用は、酵素により提供される実質的に完全な立体選択性及び結合特異性のために、化学的方法よりも利点を提供する（Itoなど.，Pure Appl．Chem.，65：753(1993)；アメリカ特許第5,352,670号及び第5,374,541号）。多くのグリコシルトランスフェラーゼサイクル（たとえばシアリルトランスフェラーゼサイクル、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクル、及びフコシルトランスフェラーゼサイクル）が、アメリカ特許第5,374,541 号及びWO9425615Aに記載されている。他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ichikawaなど.，J．Am．Chem ．Soc．114：9283(1992)；Wongなど.，J．Org．Chem．57：4343(1992)；DcLuca など.，J．Am．Chem．Soc．117：5869-5870(1995)；及びIchikawaなど.，Carboh ydrates and Carbohydrate Polymers，Yaltami，ed．(ATT，Press，1993)に記載されている。本発明の二元プロモーターを用いて発現することができる炭水化物の合成に有用な典型的な酵素は、CMP−シアル酸シンターゼ、UDPグルコースピロホスホリラーゼ、アデニル酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、シアル酸アルドラーゼ、UDP−GlcNAcピロホスホリラーゼ、ミオキナーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ネイセリアゴノルホエアエ（Neisseria gonorrhoeaeのlos遺伝子座によりコードされるグリコシルトランスフェラーゼ（たとえば国際出願WO96/100 86号を参照のこと）、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを包含する。それらの文献に記載され、そしてそれらのサイクルに使用されるいづれかの酵素は、本発明のベクターを用いて、組換え的に発現され得る。本発明の二元tac−galプロモーターを用いて生成され得る酵素を必要とするグリコシルトランスフェラーゼサイクルの典型的な例は、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルである。ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルのための反応媒体は好ましくは、ガラクトシルトランスフェラーゼの他に、ドナー基質、受容体糖及び二価金属カチオン、受容体糖１モル当たり少なくとも１モルのグルコース−１−リン酸を含んで成るドナー基質の再循環系、リン酸ドナー、リン酸ドナーからヌクレオチド二リン酸にリン酸を移行することができるキナーゼ、及び UTP及びグルコース−１−リン酸及び触媒量のUDPからUDP−グルコースを形成できるピロホスホリラーゼ、並びにUDP−ガラクトース−４−エピメラーゼを含むことであろう。ガラクトシルトランスフェラーゼは、このサイクルにおける主要酵素である。典型的なガラクトシルトランスフェラーゼは、β（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．No ．２．４．１．90、たとえばNarimatsuなど.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83 ：4720-4724（1986）を参照のこと）、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．No．２．４．１．151、たとえばDabkowskiなど.，Transplant Proc．25：2921(1993)及びYamamotoなど.，Nature 345：229-233(1990)を参照のこと）、及びα（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．No．２，４，１．38）を包含する。ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルに使用される他の酵素は、キナーゼ（たとえば、ピルビン酸キナーゼ）、エピメラーゼ（たとえば、UDP−ガラクトース−４−エピメラーゼ）、及びピロホスホリラーゼ（たとえば、グルコースピロホスホリラーゼ）を包含する。それらの酵素のすべてをコードするDNAは、本発明のベクターを用いて発現され得る。いくつかの態様においては、注目のポリペプチドをコードするDNAは、他のポリペプチド、好ましくは成熟ポリペプチドのＮ−末端で特定の切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドとの融合体として発現され得る。一般的に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得、又はそれはベクター中に挿入されるポリペプチドDNAの一部であり得る。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞により認識され、そして処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）配列であるべきである。生来のポリペプチドシグナル配列を認識せずそしてプロセシングしない細菌宿主細胞に関しては、シグナル配列が細菌シグナル配列により置換される。シグナル配列は、細胞から細胞外媒体中への所望のタンパク質の分泌を方向づけることによって、所望のポリペプチドの精製を促進することができる。原核細胞により生成されるポリペプチドは、必ずしも適切に折りたたむ(foldi ng)ことができない。Ｅ．コリからの精製の間、発現されたポリペプチドはまず変性され(denatured)、そして次に再生され(renatured)得る。これは、カオトロピック剤たとえばグアニジンHClに細菌的に生成されたタンパク質を溶解し、そして還元剤、たとえばβ−メルカプトエタノールによりシステイン残基のすべてを還元することによって達成され得る。次に、ポリペプチドが、遅い透析又はゲル濾過のいづれかにより再生される。アメリカ特許第4,511,503号を参照のこと。発現されたポリペプチドの検出は、ラジオイムノアッセイ、ウェスターンブロット技法、免疫沈殿法、又は活性アッセイのような当業界において知られている方法により達成される。Ｅ．コリからの精製は、アメリカ特許第4,511,503号に記載される方法に従って達成され得る。例次の例は、例示的であって、本発明を限定するものではない。例１ pTGK の構成 pPHOX2 ／galEの構成プラスミドpPHOX2（図１）は、リン酸レベルが非常に低くなる場合、遺伝子の転写をその制御下で高めるアルカリホスファターゼ遺伝子（phoA）のリン酸−飢餓誘導性プロモーターを含む。このプラスミドは、WO94/12636に記載されるようなphoAプロモーター及びrrnBリボソームターミネーター(pKK223−３から得られる；Pharmaci a Biotech)を含む。ストレプトコーカス・サーモフィラスのUDP−ガラクトース −４−エピメラーゼ遺伝子（galE）からのガラクトース誘導性プロモーター(Poo lmanなど.，J．Bacteriol．172：4037-4047(1990))及びtacプロモーターを、pPH OX2中に挿入した。発現プラスミドpTGKを、次のようにして構成した。まず、プラスミドpHP1／ta c（Poolmanなど.，J．Bacteriol．172：4037-4047（1990）に記載される）のフラグメントを、５’及び３’末端でpfuポリメラーゼ及びXbaＩプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した。増幅されたフラグメントは、ストレプトコーカス・サーモフィラスのUDPガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子（galE）(Poolmanなど.,前記)からのガラクトース−誘導性プロモーターの約１kb上流にtacプロモーターを含んだ。pHP1／tac上のプロモーターの上流のpB R322ベクター領域にハイブリダイズするように５’側プライマー（5'-GCTCTAGAC GATCCGTCCGGCGTA-3'（配列番号５））を設計し、そしてシャイン−ダルガルノリボソーム結合部位を含むgalEプロモーターの配列決定された領域にハイブリダイズするように３’側プライマー（5'-ATTCTAGACCTCCTTTCTCAGAAAAAACAATT-3'（配列番号６））を設計した。galEリボソーム結合部位と組換え遺伝子の開始コドンとの間の最適な空間を維持した（図２）。tac及びgalEプロモーターの両者を包含する増幅された1.3kbのDNAフラグメントをXbaＩにより消化し、そしてアルカリホスファターゼ遺伝子のリン酸−飢餓誘導性プロモーター（phoA，WO94/12636 に記載される）、及びrrnBリボソームターミネーター(pKK223−３から得られる；Pharmacia Biotech)を含んで成るXbaＩ−消化されたpPHOX2（図１）中に挿入した。二元tac−galEプロモーターの配向を、BamHＩ消化により調べた。得られるプラスミドをpPHOX2／galEと命名した。耐カナマイシン性遺伝子の付加 pPHOX2は、β−ラクタマーゼをコードするアンピシリン耐性遺伝子を有する。プラスミドを維持するためにアンピシリンを培養物に添加するが、しかしそれは β−ラクタマーゼによりすばやく分解され、その効能を失なう。組換えタンパク質（たとえばCMP−シアル酸シンターゼに関して）生産に対して強い選択圧力を有する細胞においては、プラスミドを有さない細胞の過剰増殖が生じる可能性がある。この問題を緩和するために、コードされたタンパク質が膜輸送系のレベルで使用するのでより強い選択性を付与するカナマイシン耐性(Kar^r)遺伝子を含むように、プラスミドを再構築した。プラスミドpUC4K（Vieira and Messing，Gene 19：259(1982)）からの1.3kbの Kan'遺伝子をEcoRＩにより切り出し、そしてpPHOX2／galEプラスミドのユニーク EcoRＩ部位中に挿入した。コロニーを、カナマイシン耐性により選択した。その得られるプラスミドを、pPHOX2／galE／Kam(図３)と命名する。クローニングの容易さのためのベクターの改良 pPHOX2／galE／Kanプラスミド中のXbaＩ及びHindIIIの複数制限部位は、組換え遺伝子がそれらの２つの部位を用いて挿入されるので、クローニングを抜けにくくしていた。従って、galEプロモーターフラグメントの５’末端でのXbaＩ部位及びKan^r遺伝子におけるHindIII部位を除去した。XbaＩ部位を欠失するために、pPHOX2/galEプラスミドをXbaＩにより部分消化し、そして線状化されたプラスミドを単離した。切断されたXbaＩ部位をクレノウポリメラーゼによりフィルインし、ブラントフラグメントを生成し、そして再連結した。コロニーを制限マッピングによりスクリーンし、５’XbaＩ部位を欠いているプラスミド（プラスミドpPHOX2／galEΔXba）を有するコロニーを同定した。同じアミノ酸コドン(AAA)を維持しながら制限部位を除去するようにHindIII（ AAGCTI）のAAGコドンを変化させるために、オリゴヌクレオチド（ATGCATAAACTTT TGCCATTCTCAC；ΔH3（配列番号７））を設計した。最初のPCR反応により、ΔH3 オリゴヌクレオチド及びＭ13前方向プライマー(New England Biolabs)を用いてプラスミドpUC4KからDNAを増幅し、620bpのフラグメントを生成した。第２のPCR 反応により、Ｍ13逆方向プライマー（New England Biolabs）及び第１のPCRからのフラグメントを用いてpUC4KからDNAを増幅し、1.3kbのフラグメントを生成した。第２フラグメントをさらに、前方向及び逆方向プライマーによるPCRにより増幅した。このフラグメントをEcoRＩ（及び非組換え体を切断するHindIII）により消化し、そしてプラスミドpPHOX2／galEΔXbaの部分的EcoRＩ消化物の単離された線状フラグメントに連結した。NheＩ／HindIII消化物を用いて、EcoRＩフラグメントの正しい挿入部位を決定した。pTGK（図４）と呼ばれるこのベクターを、1996年５月22日、American Type Culture Collectionに寄託し、そして受託番号98059を得た。pTGK ベクターの修飾多くの修飾を、pTGKベクターに対して行なうことができる。たとえば、ブラントPCRフラグメントのクローニング及び発現を促進するために、ベクターを修飾することができる。これを行なうために、pTGKをXbaＩにより消化し、そして末端をクレノウポリメラーゼによりフィルインする。CCC GGGオリゴヌクレオチドをブラント末端に連結し、プラスミドを再環状化し、この後、それをXbaＩにより消化し、非組換え体を除去した。CCCとGGGとの間をブラント末端切断するSrf Ｉ又はSmaＩによる消化は、ブラント末端をもたらし、これに、PCR又は他の方法により得られたブラント末端化されたフラグメントを連結することができる。開始コドンATGから始まるオリゴヌクレオチドをPCRのためのプライマーとして用いることにとよって、前記開始コドンと前記リボソーム結合部位との間の最適な空間を維持することができる（図５）。このベクターを、pTGKSと呼ぶ。例２二元tac−galプロモーターからの発現の分析この実験は、遺伝子の天然のプロモーター及びtacプロモーターを含むpHP1を用いて、Ｅ．コリにおけるＳ．サーモフィラスUDP−gal−４−エピメラーゼ遺伝子（galE）の発現を誘導するガラクトースの能力を試験した。pHP1を含むＥ．コリ株JM101を、下記に示されるようにして補充されたLB又はＭ９培地において一晩増殖させた。すべての培養物を撹拌しながら、37℃で一晩インキュベートし、そして約２〜３のＡ₆₀₀に等しい細胞密度を達成した。細胞を、定常期に達した後に収穫し、そしてFrench圧力細胞処理により粉砕した。UDP−ガラクトース− ４−エピメラーゼ活性を、Kalckarなど.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 45：177 6(1959)に記載のようにしてアッセイした。単位を、１分当たりに利用される基質のμモルとして定義する。表１に示されるこの実験の結果は、ガラクトースがＥ．コリにおけるエピメラーゼ遺伝子の発現を誘導することを示した。表１増殖培地Ｕ／ｌ，エピメラーゼ LB 850 LB，10mMのガラクトース 2000 Ｍ９，0.5％のフルクトース、１mMのガラクトース 2200 Ｍ９，0.5％のフルクトース、 10mMのガラクトース 3120 Ｍ９，１％のフルクトース、 10mMのガラクトース 3340 Ｍ９，1.2％のグリセロール、 10mMのガラクトース 2860 生来のgalE遺伝子以外の遺伝子の発現が、二元プロモーターの制御下にある場合、ガラクトースにより誘導できるかどうかを決定するために、本発明者は、Gl cNAcトランスフェラーゼをコードする遺伝子をpTGK中に挿入した。このベクターを用いて、フルクトース、フルクトースとグラクトース、又はグルコースのいづれかを炭素源として含むＭ９培地において増殖したＥ．コリJM101を形質転換した。表２に示されるように、発現レベルはGlcNAcＴに関しては、かなり低く；得られる高い実験誤差が、ガラクトース誘導性に関して、データを決定的でなくした。表２ pTGK／GlcNAcT Ｕ／ｌ,GlcNAcT Ｍ９，フルクトース 15 Ｍ９，フルクトース，ガラクトース 16 Ｍ９，グルコース 12tac プロモーターは発現レベルに対して有意な効果を有する tacプロモーターが二元tac−galプロモーターの制御下で遺伝子の発現に寄与するかどうかを決定するために、本発明者は、GlcNAcトランスフェラーゼ又はGa lトランスフェラーゼを発現する構造体からtacプロモーターを欠失させた(Gotsc hlich，E.C.，J．Exp．Med．180：2181-2190(1994))。galEプロモーターはすべての構造体に存在した。株をＭ９＋フルクトース＋ガラクトースにおいて増殖させ、そしてGlcNAc又はGalトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。表３に示される結果は、tacプロモーターが発現レベルに対して有意に寄与することを示す。表３Ａ．GlcNAcT構造体Ｕ／ｌ pTGK（Ptac，PgalE，Kan） 16 pGK（PgalE，Kan） 0.5 Ｂ．GalT構造体 pTGK（Ptac，PgalE，Kan） 7 pGK（PgalE，Kan） 3ピルビン酸キナーゼ発現レベルに対するgalE及びtacプロモーターの効果上記表２における比較的近い発現レベルは二元プロモーターの制御下でのハイブリド遺伝子の発現のガラクトース誘導性に関して統計学的に有意な結論を妨げるので、より高く発現された酵素（ピルビン酸キナーゼ）を、次の実験のために選択した。galEプロモーターを、ピルビン酸キナーゼ構造体を含むpTGKプラスミドから欠失させ、tacプロモーターのみを有するプラスミドを残した。対照として、本発明者は、同じ構造体を使用したが、但しそれは両プロモーターを有した。リボソーム結合部位及び空間は、両構造体において同一であった。表４に示されるそれらの実験の結果は、galEプロモーター領域の存在がピルビン酸キナーゼの発現に対して有意な効果を有することを示す。興味あることには、ガラクトース誘導が、galEプロモーターを欠いている構造体を包含する両構造体に関して観察された。表４Ｕ／ｌ，ピルビン酸キナーゼ Ptac Ptac ，galE Ｍ９，0.5％のフルクトース 1202 3167 Ｍ９，0.5％のフルクトース＋10mMのガラクトース 1902 4377 Ｍ９，0.5％のグルコース 1208 2625 もう１つの実験において、tacプロモーターを、ピルビン酸キナーゼ構造体から欠失させた。この構造体を用いて、Ｅ．コリを形質転換し、そして両プロモーター又はtacプロモーターのみを含む株と比較した。表５に示されるこの実験の結果は、tac及びgalEプロモーターの結合された寄与がそれらの個々の活性の合計よりも高いことを示す。ガラクトースの添加は、発現レベルを高める。表５Ｕ／ｌ，ピルビン酸キナーゼ pgalE Ptac Ptac ，galE Ｍ９，0.5％のフルクトース 403 1420 3181 Ｍ９，0.5％のフルクトース＋10mMのガラクトース 429 1839 3635 例３組換え遺伝子の発現Ｅ．コリ発現ベクターpTGKを用いて、多くの組換えタンパク質、たとえばＥ．コリからのCMP−シアル酸シンターゼ、バシラス・スブチリスからのUDP−グルコースピロホスホリラーゼ、Ｅ．コリからのアデニル酸キナーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラスからのピルビン酸キナーゼ、Ｅ．コリからのシアル酸アルドラーゼ、Ｅ．コリからのUDP−GlcNAcピロホスホリラーゼ、ウサギ筋肉ミオキナーゼ、ネイセリアβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びネイセリアＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを生成した。それらのタンパク質のすべてについて高い収率が得られた。たとえば、Kg細胞当たり10,000Ｕのウサギ筋肉ミオキナーゼが生成され、そしてKg細胞当たり3,500,000Ｕのピルビン酸キナーゼがpTGKから発現された。例４ pTGK を用いての細菌発酵プロトコール培地の調製１．２ｌのビーカーに次の成分を秤り取る： 60ｇのNa₃HPO₄ Sigma SO876 30ｇのKH₇PO₄ Sigma P5379 ５ｇのNaCl J.T．Baker 3628-05 50ｇの(NH₄)₂SO₄ J.T．Baker 0792R ２．１ｌの蒸留水を添加し、そして混合、溶解する。３．２ｌのビーカーに次の成分を秤り取る： 120ｇのNZAmine A Quest Intl． 50ｇの酵母抽出物 Difco ２mlのMazu PPG Chemical DF204 ４．１ｌの蒸留水を添加し、そして混合、溶解する。５．段階２及び４からの溶液を発酵槽（たとえば、New Brunswick BioFlow IV）に添加する。蒸留水により10ｌにする。６．発酵槽を60分間、蒸気配置の滅菌を用いてオートクレーブする。出入口を15分間、滅菌する。７．50％溶液のためにフルクトースを秤り取る： 400ｇのフルクトース Sigma F0127 ８．蒸留水により800mlにし、そして混合する。１ｌのボトルに移す。９．20％の溶液のためにガラクトースを秤り取る： 100ｇのガラクトース Sigma G0625 10．蒸留水により500mlにし、そして混合する。１ｌのボトルに移す。 11．0.5Ｍの溶液のためにMgSO₄を秤り取る：６ｇのMgSO₄ Sigma M7506 12．蒸留水により100mlにし、そして混合する。200mlのボトルに移す。 13．１Ｍの溶液のためにCsCl₂を秤り取る： 11ｇのCaCl₂ J.T．Baker 1311-01 14．蒸留水により100mlにし、そして混合する。200mlのボトルに移す。 15．次の成分を45分間オートクレーブ殺菌する： 50％のフルクトース（段階８） 20％のガラクトース（段階10） 0.5ＭのMgCl₂（段階12）１ＭのCaCl₂（段階14）１ｌのボトルは、フィードポンプ＃１のための管を設置された。 16．25mg／mlの溶液のためにカナマイシンを秤り取る： 0.5ｇのカナマイシン Sigma K4000 17．蒸留水により20mlにし、そして混合する。0.2ミクロン滅菌フィルターを通してフィルター滅菌する。 18．発酵器における培養物を接種する直前、FeSO₄を秤り取る： 1.0ｇのFeSO₄ Sigma F7002 19．蒸留水により10mlにし、そして混合する。0.2ミクロン滅菌フィルターを通してフィルター滅菌する。 20．フィードポンプ＃２に50％のNH₄OH溶液を接続する。新規Brunswick BioFlow IV Fermentorのための発酵器パラメーター１．必要なら、溶存酸素（D.O.）を検量する。開始D.O.は100％であるべきである。２．20％の設定値を有する比例内部誘導体（proportional integral derivatino ）（P.I.D.）にD.O.を設定する。３．300rpmの設定値を有するP.I.D.に撹拌を設定する。P.I.D.をD.O.設定に変え、そして800rpmで設定する。その800値は数秒で、300に逆戻りするであろう。これは300rpmで開始するよう撹拌を指図するが、しかし20％でD.O.を維持するためにrpmを800まで高めるであろう。４．6.8の設定値を有するP.I.D.にpHを設定する。５．フィード＃２を基本設定に設定する（フィードポンプ＃２は、NH₄OH添加を制御する）。６．37℃の設定値を有するP.I.D.に温度を設定する。７．4.3〜4.7ｌ／分の範囲内に通気を設定する。発酵槽の接種フィードボトルを調製する：１．600mlのフルクトース溶液及び300mlのガラクトース溶液を、オートクレーブ殺菌されたフィードボトルに添加する。発酵槽上のフィード＃１にボトルを接続する。２．増殖された接種物の600nmの吸光度を決定する。0.5mlのガラスキュベットにおいて、培養物を水に１／10に希釈する。水を含むブランク。３．次の成分を１ｌの無菌フラスコに添加する： 50mlのフルクトース、 10mlのMgSO₄、１mlのCaCl₂、 20mlのカナマイシン、 2.5mlのFeSO₄。冷却される場合、発酵器に添加する。４．発酵器に接種物を添加する。所望のタンパク質の発現本発明の二元プロモーターを用いて発酵槽において注目のタンパク質を得るために、細胞をまず、炭素源として少量のフルクトースを含む培地において増殖させる。接種の約５〜６時間後、細胞が増殖すると、ガラクトース及びフルクトースの溶液を、フェド−バッチ態様で培地中に供給する。供給速度を、培養物が細胞増殖により密になるにつれて、発酵の間（段階約又は傾斜的態様で）、早めることができる。炭素源のフィードを発酵の最後まで続ける。所望により、注目のポリペプチドを、培地（分泌されたタンパク質の場合）から、又は収穫された細胞から精製する。上記例は、例示的であって、本発明を限定するものではない。本発明の他の変異体は、当業者に容易に明らかであろう。本明細書に引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、引用により本明細書中に組込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．所望のポリペプチドをコードする異種核酸に作用可能に連結した、tacプロモーター成分及びgalプロモーター成分を含んで成る二元細菌プロモーターを含んで成る組換え核酸構造体。２．前記tacプロモーター成分がtrcプロモーターである請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。３．前記galプロモーター成分が細菌UDPガラクトース４−エピメラーゼプロモーターである請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。４．前記galプロモーター成分がストレプトコーカス・サーモフィラス（Strep tococcus thermophilus）由来である請求の範囲第３項記載の組換え核酸構造体。５．前記二元プロモーターが、それぞれtacプロモーター成分又はgalプロモーター成分のいづれかよりも高レベルの所望のポリペプチドの発現をもたらす請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。６．前記異種核酸が細菌ポリペプチドをコードする請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。７．前記異種核酸がネイセリア・ゴノルホエアエ（Neisseria gonorrhoea）の los遺伝子座から得られる請求の範囲第６項記載の組換え核酸構造体。８．前記異種核酸が哺乳類ポリペプチドをコードする請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。９．前記異種核酸が真菌類ポリペプチドをコードする請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。 10．前記異種核酸が植物ポリペプチドをコードする請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。 11．前記異種核酸がCMP−シアル酸シンセターゼをコードする請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。 12．前記異種核酸がUDP−グルコースピロホスホリラーゼをコードする請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。 13．前記異種核酸がアデニル酸キナーゼをコードする請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。 14．前記異種核酸がピルビン酸キナーゼをコードする請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。 15．前記異種核酸がシアル酸アルドラーゼをコードする請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。 16．前記異種核酸がUDP−GlcNAcピロホスホリラーゼをコード請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。 17．前記異種核酸がウサギ筋肉ミオキナーゼをコードする請求の範囲第１項記載の組換え核酸構造体。 18．選択マーカー、及び所望のポリペプチドをコードする異種核酸に作用可能に連結された、tacプロモーター成分及びgalプロモーター成分を含んで成る二元細菌プロモーターを含んで成る組換え核酸構造体を含んで成る発現ベクター。 19．前記選択マーカーがカナマイシン耐性遺伝子である請求の範囲第18項記載の発現ベクター。 20．Ｅ．コリ（E.coli）において機能する複製起点配列をさらに含んで成る請求の範囲第18項記載の発現ベクター。 21．受託番号98059としてAmerican Type Cultune Collectionに寄託されたプラスミドに対して実質的に同一であるプラスミド。 22．前記プラスミドが、受託番号98059としてAmerican Type Cultune Collect ionに寄託されたプラスミドに対して同一である請求の範囲第21項記載のプラスミド。 23．所望のポリペプチドをコードする異種核酸に作用可能に連結したストレプトコーカス・サーモフィラスUDPグルコース−４−エピメラーゼプロモーターを含んで成る組換え核酸構造体。 24．所望のポリペプチドをコードする異種核酸に作用可能に連結された、tac プロモーター成分及びgalプロモーター成分を含んで成る二元細菌プロモーターを含んで成る組換え発現カセットを含んで成る細菌細胞。 25．前記galプロモーター成分がストレプトコーカス・サーモフィラス（Strep tococcus thermophilus）からである請求の範囲第24項記載の細菌細胞。 26．Ｅ．コリである請求の範囲第24項記載の細菌細胞。 27．前記組換え発現カセットが自律複製するプラスミド上に位置する請求の範囲第24項記載の細菌細胞。 28．前記プラスミドがさらに、カナマイシン耐性遺伝子を含んで成る請求の範囲第27項記載の細菌細胞。 29．前記異種核酸がCMP−シアル酸シンセターゼをコードする請求の範囲第24 項記載の細菌細胞。 30．前記異種核酸がUDP−グルコースピロホスホリラーゼをコードする請求の範囲第24項記載の細菌細胞。 31．前記異種核酸がアデニル酸キナーゼをコードする請求の範囲第24項記載の細菌細胞。 32．前記異種核酸がピルビン酸キナーゼをコードする請求の範囲第24項記載の細菌細胞。 33．前記異種核酸がシアル酸アルドラーゼをコードする請求の範囲第24項記載の細菌細胞。 34．前記異種核酸がUDP−GlcNAcピロホスホリラーゼをコード請求の範囲第24項記載の細菌細胞。 35．前記異種核酸がウサギ筋肉ミオキナーゼをコードする請求の範囲第24項記載の細菌細胞。 36．前記異種核酸がネイセリア・ゴノルホエアエ（Neisseria gonorrhoea）の los遺伝子座から得られる請求の範囲第24項記載の細菌細胞。 37．所望のポリペプチドを製造するための方法であって、所望のポリペプチドをコードする異種核酸に作用可能に連結された、tacプロモーター成分及びgalプロモーター成分を含んで成る二元細菌プロモーターを含んで成る組換え発現カセットを含んで成る細菌細胞を、所望のポリペプチドの発現を可能にする条件下で、適切な培地において培養することを含んで成る方法。 38．前記galプロモーター成分がストレプトコーカス・サーモフィラス（Strep tococcus thermophilus）からである請求の範囲第37項記載の方法。 39．前記細菌細胞がＥ．コリ（E.coli）である請求の範囲第37項記載の方法。 40．前記細胞がカナマイシンを含む培地において培養される請求の範囲第37項記載の方法。 41．前記所望のポリペプチドの発現が培地におけるガラクトースの存在により誘導される請求の範囲第37項記載の方法。 42．前記異種核酸がUDP−グルコースピロホスホリラーゼをコードする請求の範囲第37項記載の方法。 43．前記異種核酸がアデニル酸キナーゼをコードする請求の範囲第37項記載の方法。 44．前記異種核酸がピルビン酸キナーゼをコードする請求の範囲第37項記載の方法。 45．前記異種核酸がシアル酸アルドラーゼをコードする請求の範囲第37項記載の方法。 46．前記異種核酸がUDP−GlcNAcピロホスホリラーゼをコード請求の範囲第37 項記載の方法。 47．前記異種核酸がウサギ筋肉ミオキナーゼをコードする請求の範囲第１項記載の方法。 48．前記異種核酸がCMP−シアル酸シンセターゼをコードする請求の範囲第37 項記載の方法。 49．前記異種核酸がネイセリア・ゴノルホエアエ（Neisseria gonorrhoea）の los遺伝子座から得られる請求の範囲第37項記載の方法。